CN103656742A - 功能化视网膜色素上皮细胞移植片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种功能化视网膜色素上皮细胞移植片的制备方法，以纳米仿生Bruch’s膜作为视网膜色素上皮细胞载体，将视网膜色素上皮细胞接种到所述纳米仿生Bruch’s膜上，在低血清、低糖培养条件下复合培养，构建得到所述功能化视网膜色素上皮细胞移植片；其中，所述纳米仿生Bruch’s膜是将原料柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶溶于有机溶剂中形成静电纺丝溶液，利用静电纺丝法对前述静电纺丝溶液进行静电纺丝所制得的超薄多孔的柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米纤维膜。本发明制备方法得到的功能化RPE细胞移植片能有效避免传统方法出现的移植后RPE细胞易死亡、细胞极性错乱等问题，可广泛应用于细胞移植中。
Description
技术领域
本发明涉及再生医学组织工程领域，特别涉及一种功能化视网膜色素上皮细胞移植片的制备方法。
背景技术
年龄相关性黄斑变性(AMD)是世界范围内50岁以上常见的致盲疾病。其主要病因在于视网膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelium，RPE)的结构或功能的异常而最终引起视网膜光感受器细胞的凋亡进而导致神经视网膜发生不可逆的变性。随着我国老龄化程度的增加，该类疾病导致的不可治性失明正成为当前国民经济建设和社会发展的重大负担。然而目前对此病的大部分治疗(anti-VEGF药物等)均是针对并发症的措施，针对疾病晚期患者以及萎缩性(干性)AMD等毫无干预方法。
进行RPE移植是有望攻克难治性AMD的最有效途径之一。国内外多个课题组的研究结果证实将RPE细胞注射至视网膜色素变性动物或者患者的视网膜下腔后，能明显改善视功能(Schwartz，Steven D.，et a1.The Lancet，2012，379(9817)：713-720；Li，Y，et al.MolecularMedicine，2012，18：1312-9；Carr，A.J.，et al.PLoS ONE，2009，4(12)：e8152；)。将RPE细胞悬液移植到视网膜下腔后，细胞极易发生流失、凋亡、生长错位且极难维持细胞的极性。体内RPE是由RPE细胞在Bruch’s膜上彼此紧密连接形成的极性细胞单层组织。Bruch’s膜为RPE细胞提供生长的微环境并对RPE细胞功能的发挥起着非常重要的作用。已有研研究将人RPE细胞种植在聚氨酯、聚乳酸、聚羟基丁酸戊酯等人工合成材料及胶原、蚕丝素蛋白等天然生物材料制备的膜上构建RPE细胞移植片(Binder，S.，et al.British Journal of Ophthalmology，2011，95(4)：441-2)。尽管人工合成材料具有良好的可塑性及力学特性，但细胞亲和力不够，而天然生物材料富含细胞识别信号分子，但是力学性能不佳，均难满足临床应用。此外，要形成功能化的RPE细胞移植片，需要较长的时间，然而这些膜是否能够长时间支持RPE细胞功能的形成及是否会引起炎症相关基因的表达等问题在已有的研究中很少涉及。
发明内容
本发明克服现有技术的缺陷，提出了一种功能化视网膜色素上皮细胞移植片的制备方法，以静电纺丝法制得的超薄多孔柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米纤维仿生Bruch’s膜作为移植载体，将RPE细胞种植在该膜上，复合培养构建得到功能化RPE细胞移植片。本发明以纳米仿生Bruch’s膜作为视网膜色素上皮细胞载体，将视网膜色素上皮细胞接种到所述纳米仿生Bruch’s膜上，在低血清、低糖培养条件下复合培养，构建得到所述功能化视网膜色素上皮细胞移植片。
本发明中，进一步地，功能化视网膜色素上皮细胞移植片可根据需要裁剪成0.5-4mm2大小的移植单元。
本发明中，获得所述纳米仿生Bruch’s膜的方法为：将原料柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶溶于有机溶剂中形成静电纺丝溶液，利用静电纺丝法对前述静电纺丝溶液进行静电纺丝所制得的超薄的、多孔的、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米纤维膜。其中，原料柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶的质量为比1-5％∶65-85％∶10-30％。
本发明中，制备所述纳米仿生Bruch’s膜的方法为：
①.将柞蚕丝脱胶，再经溶解、透析、纯化和冷冻干燥后得到纯的柞蚕丝素蛋白；
②.取柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶，溶解于有机溶剂中，室温下，磁力搅拌器上搅拌过夜。得到柞蚕丝素蛋白∶聚己内酯∶明胶(质量百分比为1-5∶65-85∶10-30)电纺液；优选地，柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶在所述静电纺丝溶液中的质量比为5％∶85％∶10％。
③.所述原料柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶三种原料的质量总和与所述有机溶剂的体积比为10％-30％。优选地，柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶三种原料的质量总和与所述有机溶剂的体积比为25％。
④.将2中电纺液装入注射器中，装上0.6-1.2的钝性针头，调整针头到接收器的距离10-20cm，调节电压在10-30KV，纺丝液挤出速度控制在0.5-3mL/h；
⑤.在静电场中制备纳米仿生Bruch’s膜；
⑥.获得的所述纳米仿生Bruch’s膜置于通风厨或恒温鼓风干燥箱中1-4小时，使残留的有机试剂完全挥发，得到所述超薄多孔柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米纤维仿生Bruch’s膜。该纳米仿生Bruch’s膜纤维直径可控制在50-500nm，纤维膜中的孔径可在100-4000nm范围内调节，膜厚度2-200μm；
本发明中，所述纳米仿生Bruch’s膜在接种视网膜色素上皮细胞之前的预处理为：将所述纳米仿生Bruch’s膜置入6孔板中，加入75％乙醇浸泡，然后除去乙醇，缓冲液浸泡后晾干；具体步骤包括：
①纳米仿生Bruch’s膜置入6孔板中，加入75％乙醇浸泡30-120min后；
②吸除乙醇，超净台上待乙醇完全挥发；
③加入PBS或HBSS缓冲液浸泡纳米仿生Bruch’s膜2次；
④超净台上晾干后用于细胞接种。
本发明中，所述接种RPE细胞到视网膜色素上皮细胞载体上的方法为：所述视网膜色素上皮细胞体外培养(DMEM/F12+10％+1％青链霉素)至细胞融合后，以0.05％胰蛋白酶-EDTA消化，取密度为1×106/mL的视网膜色素上皮细胞悬液400μL至所述纳米仿生Bruch’s膜的表面，将所述视网膜色素上皮细胞悬液涂布均匀，移至二氧化碳培养箱中培养；补加培养基(DMEM/F12+10％胎牛血清+1％青链霉素)继续培养；待所述视网膜色素上皮细胞融合成单层时，更换低糖低血清培养基继续培养。
本发明中，视网膜色素上皮细胞为原代分离或各种干细胞分化来的视网膜色素上皮细胞或经基因修饰的视网膜色素上皮细胞。所述干细胞是胚胎干细胞、诱导多能干细胞、各种成体干细胞、以及采用治疗性克隆技术制备的干细胞等。
本发明中，所述低糖低血清培养基为在含1g/L葡萄糖和110mg/L丙酮酸钠的DMEM基础培养基中添加1％胎牛血清与1％青链霉素，每周换液2次。
本发明还提供一种功能化视网膜色素上皮细胞移植片，其包括：纳米仿生Bruch’s膜、以及接种在所述纳米仿生Bruch’s膜上的视网膜色素上皮细胞；其中，所述纳米仿生Bruch’s膜作为视网膜色素上皮细胞载体。其中，所述功能化视网膜色素上皮细胞移植片是按本发明方法制备得到的。
本发明采用具有生物活性的超薄、多孔的柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米纤维仿生Bruch’s膜作为RPE细胞移植载体。该移植载体采用富含RGD细胞识别模序的柞蚕丝素蛋白与力学性能优异的聚己内酯，同时共混富含亲水基团的明胶，实现了材料间优势互补，克服了传统单独人工材料或天然材料的不足缺陷，使得制备的仿生膜既有很好的细胞亲和性，同时具有很好的力学性能。此外，应用静电纺丝技术，仿生天然RPE细胞生存的细胞外基质三维网状、多孔结构(Bruch’s膜)，既利于营养物质、化学信号分子的传递，同时也利于细胞代谢废物的排出。
本发明制备方法是一种将人视网膜色素上皮细胞与仿生超薄多孔柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米纤维膜复合培养，体外构建功能化视网膜色素上皮移植单层的方法。
本发明功能化RPE细胞移植片中，作为载体的仿生Bruch’s膜不仅能支持RPE细胞的粘附、增殖，不引起明显的炎症反应，而且能促进RPE细胞微观结构及形貌的形成，神经营养因子的极性分泌及对猪视网膜光感受器外节的吞噬。本发明功能化RPE细胞移植片能有效避免传统仅仅移植RPE细胞悬液后RPE细胞易死亡，细胞极性错乱等问题，为RPE细胞的移植提供了新的思路。
本发明功能化视网膜色素上皮细胞移植片，在植入经典视网膜变性动物模型--RCS大鼠视网膜下腔间隙2周后，不引起免疫排斥反应，且发现移植片上RPE细胞仍大量存活，细胞呈单层极性分布。与传统的仅仅注射RPE细胞悬液到视网膜下腔(2周后细胞大量减少，细胞分布杂乱)表明采用功能化RPE移植片治疗视网膜色素变性疾病上显著优于传统的RPE细胞悬液移植。
附图说明
图1表示RPE细胞分别在各纳米仿生Bruch’s膜及细胞培养板上的粘附能力，其中，A表示RPE细胞种植在细胞培养板(TCP)上；B表示RPE细胞种植在聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜上；C表示RPE细胞种植于柞蚕丝素/聚己内酯复合纳米仿生Bruch’s膜上；D表示RPE细胞种植于柞蚕丝素/聚己内酯/明胶复合纳米仿生Bruch’s膜上。
图2表示RPE细胞分别在各纳米仿生Bruch’s膜及TCP上的增殖能力比较。
图3表示RPE细胞分别与各纳米仿生Bruch’s膜复合培养2周后的色素上皮衍生因子(PEDF)的极性分泌。
图4表示RPE细胞分别与各纳米仿生Bruch’s膜复合培养2周后RPE重要基因表达。
图5表示RPE细胞分别与各纳米仿生Bruch’s膜复合培养2周后炎症相关因子表达。
图6表示BV-2细胞分别与各纳米仿生Bruch’s膜复合培养24小时后炎症因子表达差异。
图7表示RPE细胞与柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜复合培养4周后SEM图。A表示RPE细胞微观形貌，细胞间形成紧密连接(3000倍)；B表示RPE细胞上表面微绒毛显微结构(10000倍)
图8表示RPE细胞分别与柞蚕丝素/聚己内酯/明胶复合纳米仿生Bruch’s膜复合培养4周后吞噬猪光感受器细胞外节的能力。其中，A.RPE细胞在TCP上；B.RPE细胞在柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜上。其中，浅灰色为细胞核，白色为吞噬的FITC-ROS。
图9RPE细胞与柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜(B)及TCP(A)复合培养4周后免疫荧光染色观察ZO-1表达。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。基于实施例对本发明进行更详细的说明，但这些实施例并不对本发明造成任何限定。
实施例1 制备超薄多孔柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米纤维仿生Bruch’s膜制备方法包括以下步骤：
1.柞蚕丝处理：将柞蚕丝脱胶，再经溶解、透析、纯化和冷冻干燥后得到纯的柞蚕丝素蛋白；
2.配制电纺溶液：称取柞蚕丝素蛋白0.125g，聚己内酯2.125g，明胶0.25g于50mL锥形瓶中，加入10mL98％的甲酸溶液，室温下，磁力搅拌过夜，得静电纺丝溶液；
3.电纺过程：将电纺液装入注射器中，注射器配置直径0.6mm的钝性针头，在电压12-20kv，收集距离10-20cm，挤出速度1-5mL/h的条件下电纺；优选电压18kv，收集距离15cm，挤出速度2mL/h；
4.后期处理：电纺完成后，将电纺膜放置在通风橱中1-4小时，待残余有机溶剂完全挥发；
5.得到超薄多孔柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米纤维仿生Bruch’s膜。
此外，称取2.5g聚己内酯，按照上述1-4的方法，制备超薄多孔聚己内酯纳米纤维仿生Bruch’s膜。
此外，称取0.125g柞蚕丝素蛋白，2.375g聚己内酯，按照上述1-4的方法，制备超薄多孔柞蚕丝素蛋白/聚己内酯复合纳米纤维仿生Bruch’s膜。
实施例2 本发明中的纳米仿生Bruch’s膜预处理；细胞种植、培养；以及本发明功能化视网膜色素上皮细胞移植片的制备
进一步研究实施例1制备得到的纳米仿生Bruch’s膜作为RPE细胞移植载体。在与细胞复合培养前必须对其进行消毒等预处理。此外，对细胞种植密度、方式及细胞培养条件等因素也进行了优化。
1、上述实施例1制得的超薄多孔纳米仿生Bruch’s膜的消毒等使用前预处理：将超薄多孔纳米仿生Bruch’s膜裁剪成2×2cm2大小的膜片，并将其放入培养皿中。75％乙醇浸泡30-120min后，吸除乙醇，超净台上待乙醇完全挥发，加入PBS或HBSS缓冲液浸泡两次。
2、细胞种植：RPE细胞经胰蛋白酶消化，计数，以1×106/mL密度接种RPE细胞400μL至上述超薄多孔纳米仿生Bruch’s膜表面，将细胞悬液涂布均匀，小心移至二氧化碳培养箱中培养4小时。
3、增加培养基：4小时后，补加培养基1-2mL，继续培养；
5、低血清培养：待细胞长满膜表面、细胞间形成紧密链接后，去原培养基，换成低血清、低糖培养基(血清浓度1％，葡萄糖浓度1g/L，110mg/L的丙酮酸钠)，待其形成紧密连接后，细胞呈多边形(ZO-1染色阳性，图9)，并表现出典型的体内RPE细胞功能(神经营养因子极性分泌(图3)、吞噬光感受器外节(图8)等)后，即得到本发明功能化视网膜色素上皮细胞移植片。
实施例3 本发明中RPE细胞在各纳米仿生Bruch’s膜上的粘附能力评价
按照如下步骤研究各纳米仿生Bruch’s膜对细胞粘附能力的影响，如图1所示。
1.按照实施例2中的步骤2，3，4操作，将RPE细胞接种到各纳米仿生Bruch’s膜(分别为聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜)及对照TCP上，24小时后去培养基，PBS或HBSS洗涤4次，去除未粘附的细胞；
2.倒置显微镜下观察细胞粘附，如图1所示，其中，A表示RPE细胞种植在TCP上，B表示RPE细胞种植在聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜上，C表示RPE细胞种植于柞蚕丝素蛋白/聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜上，D表示RPE细胞种植于柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜上。实验结果表明，与细胞培养板、聚己内酯膜、或柞蚕丝素蛋白/聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜比较，本发明功能化视网膜色素上皮细胞移植片中RPE细胞接种在柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜上的粘附能力明显较强。
实施例4 本发明中RPE细胞在各纳米仿生Bruch’s膜的增殖能力评价
RPE细胞种植到各纳米仿生Bruch’s膜上后能否在迅速促进细胞增殖至关重要，按照如下方法对RPE细胞分别在各纳米仿生Bruch’s膜(分别为聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜)及细胞培养板(TCP)上的增殖能力进行了评价。
1.将上述各纳米仿生Bruch’s膜裁剪成直径6mm大小的圆形小片，置入96孔板的孔中，按照实施例2中步骤1所描述的方法进行消毒；
2.分别在上述各纳米仿生Bruch’s膜上种植RPE细胞，密度为1×104/mL，每孔100μL细胞悬液，隔天换液。
3.细胞在上述各纳米仿生Bruch’s膜上培养7天，每隔一天采用WST-1细胞增殖检测试剂盒对细胞增殖能力进行评价，实验结果如图2所示，显示RPE细胞在聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜均能生长、增殖。实验结果表明，本发明功能化视网膜色素上皮细胞移植片中RPE细胞在柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米仿生Bruch’s膜上的增殖速率显著高于其他仿生Bruch’s膜及细胞培养板(TCP)。
实施例5 本发明中RPE细胞与各纳米仿生Bruch’s膜复合培养2周后色素上皮衍生因子(PEDF)的极性分泌
天然RPE细胞位于Bruch’s膜上排列成单层，且能极性分泌色素上皮衍生因子(PEDF)，本实施例对RPE细胞在不同仿生膜上复合培养后是否能极性分泌PEDF进行检测：
1.仿生膜处理：将各纳米仿生Bruch’s膜(聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜)裁剪成直径与24孔板孔径大小一致的圆形小片，置入24孔的Transwell板上室底部，按照实施例2中步骤1所描述的方法进行消毒；
2.细胞种植：分别以1×105/mL密度接种RPE细胞400μL至上述各纳米仿生Bruch’s膜表面及组织培养板中，将细胞悬液涂布均匀，小心移至二氧化碳培养箱中培养4小时；
3.更换培养基：吸除原培养基，在Transwell上室中加入低血清、低糖培养基100μL，下室加入600μL培养基，每三天更换培养基一次；
4.复合培养2周后，分别回收上、下室培养基，采用色素上皮衍生因子(PEDF)ELISA检测试剂盒分别对上、下室PEDF浓度进行检测。实验结果如图3所示，RPE细胞分别在柞蚕丝素蛋白/聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜培养2周后均能极性分泌PEDF因子，且上室显著高于下室。而将RPE细胞分别与聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、组织培养板复合培养2周后，上下室PEDF浓度没有显著差异，即未能极性分泌PEDF因子。实验表明，本发明功能化视网膜色素上皮细胞移植片中，RPE细胞种植在柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜上培养后极性分泌PEDF因子的效果显著。
实施例6 本发明中RPE细胞与各纳米仿生Bruch’s膜复合培养2周后，RPE细胞重要基因表达
仿生Bruch’s膜能否支持RPE细胞重要基因的正常表达直接关系到该仿生Bruch’s膜能否用于后期的移植。本实施例对不同仿生膜(聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜)及TCP对RPE细胞重要基因表达的影响进行检测，以TCP为对照组，步骤如下：
1.仿生膜处理：分别将上述各仿生膜裁剪成直径与6孔板孔径大小一致的圆形小片，置入六孔板底部，按照实施例2中步骤1所描述的方法进行消毒；
2.细胞种植：分别以1×106/mL密度接种RPE细胞400μL至上述各纳米仿生Bruch’s膜表面，将细胞悬液涂布均匀，小心移至二氧化碳培养箱中培养4小时；
3.更换培养基：吸除原培养基，在每个板孔中加入低血清、低糖培养基2mL，每3天更换培养基一次；
4.去原培养基，PBS洗涤2次，0.05％EDTA-胰蛋白酶溶液消化细胞，收集细胞；
5.加入Trizol，将细胞裂解，提取总RNA；
6.利用cDNA合成试剂盒合成第一链，利用RT-PCR技术比较RPE细胞在各组仿生膜及TCP上复合培养后的RPE重要基因及炎症相关基因表达；
实验结果如图4所示，表明RPE细胞分别在聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜上复合培养2周后均能正常表达其重要基因。实验表明，本发明功能化视网膜色素上皮细胞移植片中，RPE细胞种植在柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜上培养后能正常表达其重要基因。
实施例7 本发明中RPE细胞及BV-2细胞(小胶质细胞)与仿生Bruch’s膜复合培后，炎症因子的表达
目前报道的多数细胞移植载体均未涉及是否能引起炎症因子表达量的显著增加，而这一点关系到后面移植实验成败。本实施例将RPE细胞及在炎症反应中其重要作用的小胶质细胞(BV-2细胞)与不同仿生Bruch’s膜(聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜)及TCP复合培养，RT-PCR和Real Time PCR等方法检测炎症因子的表达：
1.仿生膜处理：分别将上述各仿生膜裁剪成直径与6孔板孔径大小一致的圆形小片，置入六孔板底部，按照实施例2中步骤1所描述的方法进行消毒；
2.细胞种植：分别以1×106/mL密度接种RPE细胞或BV-2细胞400μL至上述与不同仿生Bruch’s膜(聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜)及TCP复合培养，将细胞悬液涂布均匀，小心移至二氧化碳培养箱中培养4小时；
3.更换培养基：吸除原培养基，在每个板孔中加入正常细胞培养基(含10％血清，4.5g/L的葡萄糖)2mL，37℃的二氧化碳培养箱中过夜；
4.培养24小时后，去原培养基，PBS洗涤2次，0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液消化BV-2细胞，收集BV-2细胞；
5.培养2周后，去原培养基，PBS洗涤2次，0.05％0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液消化RPE细胞，收集RPE细胞；
6.加入Trizol，将细胞裂解，提取总RNA；
7.利用cDNA合成试剂盒合成第一链，利用RT-PCR技术比较RPE细胞在各组仿生膜及TCP上复合培养后炎症相关基因表达；
8.利用cDNA合成试剂盒合成第一链，利用Real-Time PCR技术比较BV-2细胞在各组仿生膜及对照组(TCP)上复合培养24小时后的炎症相关基因(CCL-20，IL-6，IL-12，TNF-α，MCP-1)表达；
实验结果如图5所示，表明RPE细胞在聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜上复合培养2周后均不引起RPE细胞炎症因子表达量的增加。
如图6所示，实验结果表明BV-2细胞在聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯纳米仿生Bruch’s膜、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜上复合培养24小时后炎症因子的表达量并未发生显著改变，和对照组类似。此外，TNF-α基因的表达量有所下调。实验结果表明，本发明功能化视网膜色素上皮细胞移植片中RPE细胞在柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜上复合培养后，炎症因子的表达量并未发生显著改变。
实施例8 本发明中RPE细胞与柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜复合培养4周后扫描电子显微镜(SEM)观察细胞形貌
RPE细胞在体内Bruch’s膜上紧密排列成单细胞层，细胞上表面有微绒毛等超微结构。本实施例将RPE细胞与柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜复合培养后观察是否能形成体内RPE细胞的超微结构，步骤如下：
1.按照实施例2中步骤将RPE细胞与柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜复合后，低血清、低糖培养基培养4周；
2.吸除原培养基，PBS洗涤RPE细胞-仿生Bruch’s膜复合体4次；
3.4℃预冷的2.5％戊二醛溶液中固定4小时(4℃冰箱中进行)；
4.吸除固定液，PBS洗涤2次；
5.采用二氧化碳超临界方法对RPE细胞-仿生Bruch’s膜复合体进行干燥处理；
6.利用真空喷镀设备对RPE细胞-仿生Bruch’s膜复合体表面进行喷金处理；
扫描电子显微镜下观察，结果如图7所示，RPE细胞在柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜上融合成单层，细胞呈典型的多边形貌，细胞间形成紧密连接，细胞的上表面出现微绒毛结构。图7中，图A表示RPE细胞与柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜复合培养4周后扫描电子显微镜图(×3000)；图B表示RPE细胞与柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜复合培养4周后扫描电子显微镜图(×10000)。
实施例9 本发明中RPE细胞与柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜复合培养4周后吞噬猪光感受器细胞外节的能力评价
RPE细胞在体内Bruch’s膜上紧密排列成单细胞层，吞噬功能是RPE细胞重要的生理功能，RPE细胞能吞噬脱落的光感受器细胞外节盘膜，这对光感受器细胞外节的更新及维持正常的视觉功能至关重要。本实施例按照以下步骤评价RPE细胞在柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜上复合培养后吞噬功能。
1.按实施例2中步骤分别将RPE细胞与柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜及TCP复合后，低血清、低糖培养基培养4周；
2.屠宰场获取新鲜猪眼球，分离视网膜光感受器细胞外节(ROS)，利用异硫氰酸荧光素(FITC)标记外节，得到FITC-ROS；
3.将FITC-ROS于柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米仿生Bruch’s膜及组织培养板上的细胞37℃的二氧化碳培养箱中孵育4小时；
4.为了去除未被RPE细胞吞噬FITC-ROS的假阳性干扰，加入0.2％的台盼蓝溶液(PBS配置)孵育10min，淬灭未被吞噬的FITC-ROS；
5.采用DAPI对细胞核进行染色；
6.倒置荧光显微镜下观察RPE细胞对FITC-ROS的吞噬情况。
实验结果如图8所示，RPE细胞在柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜上，表明本发明中RPE细胞在柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米仿生Bruch’s膜上培养2周后能吞噬FITC-ROS(图8B)，且与RPE细胞在TCP上(图8A)比较，吞噬效果较好。
实施例10 本发明中RPE细胞与柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜复合培养4周后ZO-1蛋白免疫荧光染色
天然RPE细胞之间形成紧密连接，细胞表达ZO-1蛋白，细胞呈多边形。本实施例检测RPE细胞与纳米仿生Bruch’s膜复合培养四周后ZO-1表达，及细胞形貌。
1.按实施例2中步骤分别将RPE细胞与柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜及TCP复合后，低血清、低糖培养基培养4周；
2.去培养基，PBS或HBSS缓冲液洗涤3次，每次5min；
3.4％多聚甲醛固定30min，去多聚甲醛，PBS或HBSS缓冲液洗涤3次，每次5min；
4.0.1％Triton X-100(PBS稀释)处理10min；
5.5％山羊血清37℃封闭1h；添加抗ZO-1抗体，4℃孵育过夜；
6.PBS洗涤3次，每次5min；加TRITC标记的荧光二抗，37℃孵育2小时；
7.PBS洗涤3次，每次5min，封片剂封片。
8.荧光倒置显微镜下观察；
9.结果如图9所示，RPE细胞在柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜(图B)及TCP上(图A)复合培养4周后均形成紧密连接，细胞呈多边形，ZO-1阳性表达。与TCP相比，RPE细胞在柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶纳米仿生Bruch’s膜上排列更为紧密，细胞多边形貌更为规则。
实施例11 功能化RPE细胞移植片移植治疗视网膜色素变性疾病动物模型研究
1.按照实施例2中所述制备功能化人RPE细胞移植片，根据实验需要进行裁剪，本实验中采用2mm×2mm大小的RPE细胞移植片。
2.取5只30天龄的RCS大鼠(天然视网膜色素变性动物模型)经氯胺酮(60mg/kg)麻醉，1％硫酸阿托品散瞳，0.5％地卡因局部麻醉鼠眼。行外路法经平坦部作三切口玻璃体切割，在每只大鼠的颞上方网膜下注射生理盐水，形成局部视网膜脱离，采用植入器将功能化的RPE细胞移植片植入RCS大鼠视网膜下间隙，对照眼采用传统的RPE细胞悬液注入RCS大鼠视网膜下间隙，其他操作与实验组一致。术后结膜下注射地塞米松注射液，持续1周。
3.植入后2周，对大鼠实施安乐死，取眼球在4％多聚甲醛中固定过夜，PBS中浸泡两次，每次5分钟，30％蔗糖脱水48小时。
4.OCT包埋，进行冰冻切片。
5.进行HE染色，病理分析。
6.结果显示，移植片周围未出现明显的毒性反应及排斥反应。
7.利用抗人细胞的抗体(Anti-Nuclei Antibody)对切片进行免疫染色，发现移植片上RPE细胞仍大量存活，细胞呈单层极性分布；但对照眼阳性细胞大量减少，且分布不均，RPE细胞未表现出明显的极性。该结果显示，采用功能化RPE移植片治疗视网膜色素变性疾病上显著优于传统的RPE细胞悬液移植。
Claims (9)
1.一种功能化视网膜色素上皮细胞移植片的制备方法，其特征在于，以纳米仿生Bruch’s膜作为视网膜色素上皮细胞载体，将视网膜色素上皮细胞接种到所述纳米仿生Bruch’s膜上，在低血清、低糖培养条件下复合培养，构建得到所述功能化视网膜色素上皮细胞移植片；其中，所述纳米仿生Bruch’s膜是将原料柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶溶于有机溶剂中形成静电纺丝溶液，利用静电纺丝法对前述静电纺丝溶液进行静电纺丝所制得的超薄多孔的柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米纤维膜。
2.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，所述功能化视网膜色素上皮细胞移植片可根据需要裁剪成0.5-4mm2大小的移植单元。
3.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，所述接种的方法为：所述视网膜色素上皮细胞体外培养至细胞融合后，以0.05％胰蛋白酶-EDTA消化，取密度为1×106/mL的视网膜色素上皮细胞悬液400μL至所述纳米仿生Bruch’s膜的表面，将所述视网膜色素上皮细胞悬液涂布均匀，移至二氧化碳培养箱中培养；补加培养基继续培养；待所述视网膜色素上皮细胞融合成单层时，更换低糖低血清培养基继续培养。
4.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，所述柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶的质量为比1-5％∶65-85％∶10-30％。
5.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，在接种视网膜色素上皮细胞之前，所述纳米仿生Bruch’s膜的预处理为：将所述纳米仿生Bruch’s膜置入细胞培养板或细胞培养皿中，加入75％乙醇浸泡，然后除去乙醇，PBS或HBSS缓冲液浸泡后晾干。
6.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，所述视网膜色素上皮细胞为原代分离的或干细胞分化的或经基因修饰的视网膜色素上皮细胞。
7.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，所述低糖低血清培养基为在含1g/L葡萄糖和110mg/L丙酮酸钠的DMEM基础培养基中添加1％胎牛血清与1％青链霉素。
8.一种功能化视网膜色素上皮细胞移植片，其特征在于，其包括：纳米仿生Bruch’s膜、以及种植在所述纳米仿生Bruch’s膜上的视网膜色素上皮细胞；其中，所述纳米仿生Bruch’s膜作为视网膜色素上皮细胞的载体。
9.一种按权利要求1中所述方法制备得到的功能化视网膜色素上皮细胞移植片。
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