CN109464705A - 一种rpe细胞片及其应用和制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学技术领域，特别涉及一种RPE细胞片及其应用和制备方法。该RPE细胞片包括依次设置的角膜透镜、脉络膜毛细血管层和RPE细胞层；角膜透镜表面设置有血管网状凹槽，脉络膜毛细血管层填充于凹槽中。本发明RPE细胞片具有良好的生物兼容性以及低免疫排斥性，并且该细胞片在屏障、吞噬等功能检测方面优于其它方式构建的细胞片，因此通过移植该细胞片有望解决患有诸如老年性黄斑病变等视网膜变性疾病患者的视力问题；且角膜透镜来源丰富，因此是物美价廉的Bruch膜替代物。

Description

一种RPE细胞片及其应用和制备方法
技术领域
本发明涉及医学技术领域，特别涉及一种RPE细胞片及其应用和制备方法。
背景技术
血-视网膜屏障(BRB)分为血-视网膜内屏障(iBRB)和血-视网膜外屏障(oBRB)，其屏障功能是维持视网膜及视觉生理功能状态的重要基础。血-视网膜外屏障由成熟的视网膜色素上皮细胞(RPE)、有窗孔的脉络膜内皮细胞(ECs)和Bruch膜(一种位于两种细胞之间的高度组织性的基底膜)构成。视网膜色素上皮细胞(RPE)是位于Bruch膜和光感受器细胞间的单层色素上皮细胞，其主要作用是调节“视循环”和维持正常的视觉生理功能。一旦RPE细胞发生缺陷，感光细胞也不能正常代谢，视力就会很快衰退甚至丧失。RPE将来自脉络膜血管的营养物质及离子等经“筛选”或“加工处理”后源源不断的传递给视锥、视杆细胞，同时将光感受器细胞脱落的外节盘膜吞噬并消化吸收。生理状态下，RPE细胞自然贴附于Bruch膜。Bruch膜是一种高度组织化的，由弹性蛋白胶原、粘连蛋白和纤维连接蛋白组成的的基底膜，支持细胞的贴附、视网膜营养物质和代谢产物的转运。脉络膜血供丰富，可以营养视网膜外层，对维持RPE功能具有重要作用。且最近的研究表明，除了血液运输的作用外，ECs还具有指导实质细胞分化、再生和功能形成的作用，因此脉络膜内皮细胞(ECs)在oBRB建立中的调控作用是举足轻重的。
视网膜疾病，如年龄相关性黄斑变性(AMD)、色素性视网膜炎(RP，夜盲症)、糖尿病、动脉或静脉闭塞，甚至失明都是由于视网膜的退化和光感受器细胞的死亡。随着我国人口的老龄化的不断提高，AMD的发病率也越来越高。有研究显示早期AMD在中国的患病率为5.7％，相较于同样位于亚洲的印度(4.5％)与马来西亚(3.55％)，我国的早期AMD患病率为最高。因此AMD已对我国社会和经济的发展带来一定程度的威胁。AMD临床类型主要分为两种，一种为干性(萎缩性)，一种为湿性(新生血管性)。其中干性AMD主要是由于视网膜色素上皮细胞(RPE)功能退化或丧失而导致。大约10％的干性AMD会发展成为湿性AMD。湿性AMD是在RPE细胞片状丢失的基础上，进一步由于视网膜下纤维血管长入引发Bruch膜与视网膜分离，导致视力迅速丧失。
因此，未来最有希望治疗AMD的方式是RPE细胞疗法和视网膜黄斑部移植。细胞疗法是指直接将RPE细胞悬液注射进眼后段。但是当细胞经视网膜下注射后，细胞与细胞之间的排序无法控制。但正常的眼内RPE细胞是具有极性的、紧密连接的单层细胞，因此只有移植具有极性的单层RPE细胞才有可能提高其存活率并发挥功能。基于这个原因，研究者们开始利用组织工程的方式开始尝试体外构建具有功能的类RPE-Bruch膜复合体的组织工程片。这对恢复视网膜下间隙的解剖和功能对于治疗AMD具有更好的效果。一方面由于细胞片可在在体外形成具有极性、紧密连接屏障功能RPE片层，另一方面其形式也更接近于体内实际结构。除了用于治疗之外，体外构建的RPE细胞片还可以应用到其它方面，比如作为独特的组织工程细胞平台开展相关疾病研究、药物疗效鉴定、药物毒性和渗漏性检测等。
一个成功的RPE细胞片应具备组织工程三要素：种子细胞，培养系统和支架材料。除了高活性的种子细胞之外，构建组织工程RPE细胞片还需要合适的支架材料。支架材料可以有效的保证细胞的黏附性以及在移植时可以确保细胞以正确的方向面对光感受器细胞。
基于类RPE-Bruch的多种优势，许多实验室先后开展了各类模仿Bruch膜的研究，试图通过各种生物的或合成的材料来取代Bruch膜作为RPE细胞片的支架。
目前基于Bruch膜替代物的研究主要有两类：一类是人工合成高分子生物材料，包括聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚癸二酸甘油酯(PGS)、聚交酯酸(PLGA)、Parylene.C等。多聚材料具有物化特性可控的优点，但同时也由于其生物体内降解会引起炎症反应、细胞附着于材料上的低效性及无法控制细胞-生物材料间交互作用等缺点，不能广泛推广。另一类支架材料是天然有机材料，如晶状体囊膜、角膜后弹力层、羊膜等。但由于天然材料供体有限，限制了其应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种RPE细胞片及其应用和制备方法。该RPE细胞片具有良好的生物兼容性以及低免疫排斥性，且来源丰富。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种RPE细胞片，该RPE细胞片包括依次设置的角膜透镜、脉络膜毛细血管层和RPE细胞层；
角膜透镜表面设置有血管网状凹槽，脉络膜毛细血管层填充于凹槽中。
本发明主要利用全飞秒手术后眼内取出的角膜基质层(透镜)以及高活性的人视网膜色素上皮细胞(RPE)或多能干细胞来源的RPE(iPS-RPE)构建RPE-Bruch膜片层，从而提供可用于移植的RPE-Bruch膜片层。由于天然材料相较于人工材料具有良好的生物兼容性以及低免疫排斥性，并且该细胞片在功能(屏障功能、吞噬功能等)检测方面优于其它方式构建的细胞片，因此通过移植该细胞片有望解决患有诸如老年性黄斑病变等视网膜变性疾病患者的视力问题。
本发明采用全飞秒激光手术后从人角膜组织中取出的薄层组织(角膜透镜)作为载体材料，源于其具有天然的机械性能和很好的生物相容性。透镜的成分与Bruch膜具有很高的相似性：他们都含有I型和II型胶原、黏连层蛋白、纤连蛋白、弹力蛋白等成分。除此之外不同于羊膜，角膜透镜来源很多且平时多作为医疗废弃物，因此是物美价廉的Bruch膜替代物。
AMD病人在视网膜受损的同时，往往也会出现脉络膜毛细血管萎缩和闭塞，使视网膜供血不足。现有技术往往只构建了单层RPE片，未构建脉络膜层。移植后，患者由于脉络膜血管处于病理状态，移植的RPE细胞片由于供血不足仍然不能发挥正常功能。通过构建类脉络膜层，可为构建的RPE组织工程片提供有效的血液供应，这进一步提高了所构建的RPE片在移植后的存活和发挥功能的成功率。类RPE-Bruch-脉络膜复合体从眼部结构来说，也更契合患者病理结构的修复。
目前的组织工程皮肤在临床应用受限、移植成功率不高的一个重要原因是缺乏血管结构，移植早期不能及时建立血运。血管构建策略目前主要分为两类。第一类是基于内皮细胞等去构建新的血管，在这个过程中生长因子也有促进新生血管的作用。第二类是基于支架技术，包括天然生物衍生的支架和人工合成支架。但直接在支架材料上体外构建毛细血管网是困难的，单独接种血管内皮细胞并不能形成管状结构。本发明利用高能量飞秒激光或物理切割的方法，使透镜具有三维血管支架结构，不但为内皮细胞等的生长提供了一个有利的空间，也为植入的细胞分泌细胞外基质并最终形成相应的组织或器官提供了一个良好的环境。通过高能量飞秒激光，本发明可以进行巧妙的三维设计，这种高分辨率制造技术和三维设计也可用来精确控制细胞排列和血管生成。
在本发明中，角膜透镜为脱细胞后的角膜透镜。
作为优选，RPE细胞层中的RPE细胞在角膜透镜上的细胞密度为1200～1800个/mm2。
本发明还提供了该RPE细胞片在制备治疗年龄相关性黄斑变性移植材料中的应用。
本发明还提供了一种RPE细胞片的制备方法，其制备方法包括：对角膜透镜进行切割，在角膜透镜上形成血管网状凹槽，在凹槽中接种脐静脉血管内皮细胞，培养3～7天后得到脉络膜毛细血管层；
将RPE细胞接种于有脉络膜毛细血管层的角膜透镜上，培养7～10天，得到RPE细胞片。
作为优选，脐静脉血管内皮细胞为人脐静脉血管内皮细胞。
在本发明提供的实施例中，在凹槽中接种脐静脉血管内皮细胞，培养5天后得到脉络膜毛细血管层。
在本发明提供的实施例中，将RPE细胞接种于有脉络膜毛细血管层的角膜透镜上，培养7天。
作为优选，角膜透镜为脱细胞后的角膜透镜；脱细胞后的角膜透镜的制备方法为：将角膜薄层组织置于氯化钠溶液中，震荡40～50h；加入DNA酶和RNA酶，震荡40～50h；清洗。
在本发明提供的实施例中，脱细胞后的角膜透镜的制备方法为：将角膜薄层组织置于氯化钠溶液中，震荡48h；加入DNA酶和RNA酶，震荡48h；清洗。
作为优选，氯化钠溶液的浓度为1.2～1.8M。
在本发明提供的实施例中，氯化钠溶液的浓度为1.5M。
作为优选，DNA酶的浓度为2～8U/mL。
在本发明提供的实施例中，DNA酶的浓度为5U/mL。
作为优选，RNA酶的浓度为20～80μg/mL。
在本发明提供的实施例中，RNA酶的浓度为50μg/mL。
作为优选，RPE细胞为经过诱导多功能干细胞条件培养基培养后的RPE细胞。
作为优选，经过诱导多功能干细胞条件培养基培养后的RPE细胞的制备方法为：收集诱导多功能干细胞培养上清液，与含有10％FBS的DMEM/F12培养基混合，得到条件培养基；在条件培养基中培养RPE细胞2～4天。
在本发明提供的实施例中，在条件培养基中培养RPE细胞3天。
作为优选，条件培养基中，诱导多功能干细胞培养上清液与含有10％FBS的DMEM/F12培养基的体积比为1：2。
作为优选，脐静脉血管内皮细胞的接种密度为200～300个/mm2。
作为优选，RPE细胞的接种密度为400～600个/mm2。
作为优选，RPE细胞为诱导多功能干细胞经诱导培养得到的RPE细胞。
作为优选，RPE细胞片的制备方法如下：
在全飞秒激光术后，将角膜中切削一个凸透镜形状的角膜薄层组织取出，存放于生理盐水中或甘油中；
用PBS冲洗后放于1.2～1.8MNaCl溶液中，每24小时更换一次，共震荡40～50小时；
用2～8U/mlDNAse和20～80μg/mL RNAse震荡40～50小时；
用PBS清洗70～80小时，每24小时换一次液，得到角膜透镜；
通过高能量飞秒激光或物理切割方法对透镜进行切割，在透镜上获得形状类似血管网的凹槽；在有凹槽的透镜上接种HUVEC，培养3～7天后获得类似脉络膜的毛细血管片；
收集50％～80％融合的iPS细胞上清，以1/2的比例加入到DMEM/F12+10％FBS的普通培养基中培养RPE细胞2～4天；经此过程培养的RPE细胞同普通培养基培养的细胞相比，其形态呈典型的六边形或铺路石状；
将条件培养基培养的RPE细胞或iPS细胞诱导的RPE细胞接种到角膜透镜上再次培养7～10天，构成RPE细胞片。
在本发明提供的实施例中，RPE细胞片的制备方法如下：
在全飞秒激光术后，将角膜中切削一个凸透镜形状的角膜薄层组织取出，存放于生理盐水中或甘油中；
用PBS冲洗3次放于1.5M NaCl溶液中，每24小时更换一次，共震荡48小时；
用5U/mlDNAse和50μg/mL RNAse震荡48小时；
用PBS清洗72小时，每24小时换一次液，得到角膜透镜；
通过高能量飞秒激光或物理切割方法对透镜进行切割，在透镜上获得形状类似血管网的凹槽；在有凹槽的透镜上接种HUVEC，培养3～7天后获得类似脉络膜的毛细血管片；
收集50％-80％融合的iPS细胞上清，以1/2的比例加入到DMEM/F12+10％FBS的普通培养基中培养RPE细胞3天；经此过程培养的RPE细胞同普通培养基培养的细胞相比，其形态呈典型的六边形或铺路石状；
将条件培养基培养的RPE细胞或iPS细胞诱导的RPE细胞接种到角膜透镜上再次培养7～10天，构成RPE细胞片。
本发明提供了一种RPE细胞片及其应用和制备方法。该RPE细胞片包括依次设置的角膜透镜、脉络膜毛细血管层和RPE细胞层；角膜透镜表面设置有血管网状凹槽，脉络膜毛细血管层填充于凹槽中。本发明具有的技术效果为：
本发明主要利用全飞秒手术后眼内取出的角膜透镜以及高活性的RPE细胞或多能干细胞来源的RPE构建RPE-Bruch膜片层，从而提供可用于移植的RPE-Bruch膜片层。由于天然材料相较于人工材料具有良好的生物兼容性以及低免疫排斥性，并且该细胞片在功能(屏障功能、吞噬功能等)检测方面优于其它方式构建的细胞片，因此通过移植该细胞片有望解决患有诸如老年性黄斑病变等视网膜变性疾病患者的视力问题；
本发明采用全飞秒激光手术后从人角膜组织中取出的薄层组织(角膜透镜)作为载体材料，源于其具有天然的机械性能和很好的生物相容性。透镜的成分与Bruch膜具有很高的相似性：他们都含有I型和II胶原、黏连层蛋白、纤连蛋白、弹力蛋白等成分。除此之外不同于羊膜，角膜透镜来源很多且平时多作为医疗废弃物，因此是物美价廉的Bruch膜替代物；
除上述生物材料为本发明特点之外，构建本发明视网膜色素细胞片中的RPE细胞，是经过调整的诱导多功能干细胞条件培养基(induced pluripotentstemcells-derivedconditioned medium，iPS-CM)处理过后的RPE细胞。相较于其它方法培养的RPE细胞，本方法培养的RPE细胞具有更好的极性、增殖、抗凋亡、屏障功能能力。再将此细胞接种在角膜透镜上从而构建成类RPE-Bruch膜复合结构。相较于虽然传统的体外模型(如在细胞培养皿或transwell上培养的单层RPE细胞)，利用本方法构建的细胞片模型更能模拟RPE-脉络膜系统中细胞之间的综合相互作用，为深入研究RPE细胞在体内环境中的生长、分化和功能提供一种实验平台，为探索AMD的发病机制及大规模新治疗药物的筛选提供可能，同时也可作为潜在的修复视网膜外屏障的再生移植治疗手段。
除了使用条件培养基培养RPE细胞外，本发明还利用人工诱导多功能干细胞(iPSC)使其在透镜上直接分化为RPE构建RPE-Bruch膜复合结构。iPSC可以来源于患者自身的成体细胞，因此iPS-RPE同透镜构建的RPE-Bruch具有更低的免疫排斥性。
基于脉络膜在维持RPE功能方面的重要作用，在构建单层RPE细胞片的基础上，本申请同时构建脉络膜毛细血管层。AMD病人在视网膜受损的同时，往往也会出现脉络膜毛细血管萎缩和闭塞，使视网膜供血不足。通过构建类脉络膜层，可为构建的RPE组织工程片提供有效的血液供应，这进一步提高了所构建的RPE片在移植后的存活和发挥功能的成功率。类RPE-Bruch-脉络膜复合体从眼部结构来说，也更契合患者病理结构的修复。
附图说明
图1为实验例1和对比例1的细胞片的免疫荧光染色结果；
图2为实验例1和对比例1的细胞片的扫描电子显微镜检测结果；
图3为实验例1和对比例1的细胞片细胞的免疫荧光染色结果；
图4为实验例1和对比例1的细胞片的细胞密度；
图5为实验例1和对比例1的细胞片的EdU阳性细胞比例。
具体实施方式
本发明公开了一种RPE细胞片及其应用和制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
角膜透镜：由于全飞秒激光在治疗过程中会在角膜夹层中切削一个凸透镜形状的角膜薄层组织，之后用特制的工具把已制作好的夹层组织取出。这个薄薄的夹层称之角膜透镜。
Bruch膜(玻璃膜，布鲁赫膜，Bruch's membrane)是指位于脉络膜毛细血管层与视网膜视部色素上皮间薄薄的一层膜状结构。
RPE：视网膜色素上皮细胞。
FBS：胎牛血清。
iPS细胞/iPSC：诱导性多能干细胞或诱导多功能干细胞。
本发明提供的RPE细胞片及其应用和制备方法中所用材料、试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
本实施例RPE细胞片的制备方法如下：
1.飞秒手术后角膜透镜材料本身及脱细胞后作为支架材料方法如下：
1.1在全飞秒激光术后，将角膜中切削一个凸透镜形状的角膜薄层组织取出，存放于生理盐水中或甘油中。
1.2用PBS冲洗3次放于1.5MNaCl溶液中，每24小时更换一次，共震荡48小时。
1.3用5U/mlDNAse和50μg/mL RNAse震荡48小时。
1.4用PBS清洗72小时，每24小时换一次液。
2.利用人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)构建类脉络膜-Bruch膜复合结构：
2.1通过高能量飞秒激光或刀片对透镜进行切割，在透镜上获得形状类似血管网的凹槽。
2.2在有凹槽的透镜上接种HUVEC，培养5天后获得类似脉络膜的毛细血管片。
3.利用iPS条件培养液培养的RPE细胞或iPS来源的RPE细胞构建组织工程片方法如下：
3.1收集50％-80％融合的iPS细胞上清，以1/2的比例加入到DMEM/F12+10％FBS的普通培养基中培养RPE细胞3天。经此过程培养的RPE细胞同普通培养基培养的细胞相比，其形态呈典型的六边形或铺路石状。
3.2将条件培养基培养的RPE细胞或iPS细胞诱导的RPE细胞接种到脱细胞后的透镜上再次培养7天，构成RPE细胞片。
对比例1
利用聚碳酸酯(polycarbonate membrane，PC)膜构建RPE细胞片是利用Transwell培养板小室底部PC膜构建RPE细胞片。
与透镜相比，PC膜为人工合成材料，易于操作；但其生物相容性差，移植后容易产生排斥反应，且RPE细胞形态及表型容易发生改变，导致RPE细胞片无法具有正常的生理功能。
对比例2
利用羊膜构建RPE细胞片，是通过EDTA或机械手段从哺乳动物胎盘分离出绒毛膜并进行相应处理，随后在羊膜上接种RPE细胞构建RPE细胞片。
与透镜相比，虽然羊膜也具有较好的生物相容性，但其透明性不够、早期载体融解、降解时间长、机械强度差、导致传染性疾病的传播和不能构建复层角膜组织等。
对比例3
利用胶原膜构建RPE细胞片是将RPE细胞重悬接种到胶原膜后构键RPE细胞片。
与透镜相比，胶原膜仅含胶原，缺少纤连蛋白等，其稳定性较差，机械强度小，降解快。
试验例1形态学检测
将实验例1的RPE细胞片和对比例1的RPE-PC膜组织工程片进行形态学检测，免疫荧光染色和扫描电子显微镜检测结果见图1和图2。
与对比例RPE-PC膜相比，实施例类RPE-Bruch-脉络膜复合体上的RPE细胞与生理状态相似，呈紧密、类六边形的上皮样形态，且细胞含丰富的微绒毛与纤毛。而对比例RPE-PC膜组织工程片上的RPE细胞形态发生病理性改变，细胞体积变大，形态发生不规则改变，且细胞缺乏微绒毛或纤毛。
试验例2增殖情况检测
检测实验例1的RPE细胞片和对比例1的RPE-PC膜组织工程片的细胞增殖情况，试验结果见图3、图4和图5。
与对比例RPE-PC膜相比，实施例类RPE-Bruch-脉络膜复合体上的RPE细胞密度大，Edu阳性细胞比例高，说明细胞增殖快。而对比例RPE-PC膜组织工程片上的RPE细胞密度较小，Edu阳性细胞比例较低，说明细胞增殖较慢。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种RPE细胞片，其特征在于，包括依次设置的角膜透镜、脉络膜毛细血管层和RPE细胞层；
所述角膜透镜表面设置有血管网状凹槽，所述脉络膜毛细血管层填充于凹槽中。
2.根据权利要求1所述的RPE细胞片，其特征在于，所述角膜透镜为脱细胞后的角膜透镜。
3.根据权利要求1或2所述的RPE细胞片，其特征在于，所述RPE细胞层中的RPE细胞在角膜透镜上的细胞密度为1200～1800个/mm2。
4.如权利要求1至3中任一项RPE细胞片在制备治疗年龄相关性黄斑变性移植材料中的应用。
5.一种RPE细胞片的制备方法，其特征在于，对角膜透镜进行切割，在角膜透镜上形成血管网状凹槽，在凹槽中接种脐静脉血管内皮细胞，培养3～7天后得到脉络膜毛细血管层；
将RPE细胞接种于有脉络膜毛细血管层的角膜透镜上，培养7～10天，得到RPE细胞片。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述角膜透镜为脱细胞后的角膜透镜；所述脱细胞后的角膜透镜的制备方法为：将角膜薄层组织置于氯化钠溶液中，震荡40～50h；加入DNA酶和RNA酶，震荡40～50h；清洗。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述氯化钠溶液的浓度为1.2～1.8M，DNA酶的浓度为2～8U/mL，RNA酶的浓度为20～80μg/mL。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述RPE细胞为经过诱导多能干细胞条件培养基培养后的RPE细胞；所述经过诱导多能干细胞条件培养基培养后的RPE细胞的制备方法为：收集诱导多能干细胞培养上清液，与含有10％FBS的DMEM/F12培养基混合，得到条件培养基；在所述条件培养基中培养RPE细胞2～4天；
所述条件培养基中，诱导多能干细胞培养上清液与含有10％FBS的DMEM/F12培养基的体积比为1：2。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述脐静脉血管内皮细胞的接种密度为200～300个/mm2，所述RPE细胞的接种密度为400～600个/mm2。
10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述RPE细胞为诱导多功能干细胞经诱导培养得到的RPE细胞。
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