ES2238076T3 - Composiciones y procedimientos para matrices extracelulares secretadas de forma natural. - Google Patents

Abstract

La presente invención describe composiciones que contienen matrices humanas extracelulares secretadas naturalmente, los procedimientos de fabricación de estas matrices y el procedimiento de utilización de estas matrices. La matriz extracelular se obtiene haciendo crecer células en una estructura soporte tridimensional de manera que las células secretan una matriz extracelular. A continuación, las células se matan y eliminan de la estructura soporte, dejando únicamente la matriz extracelular sobre la estructura soporte. La matriz extracelular puede retirarse entonces del soporte, combinada con un vehículo adecuado farmacéuticamente aceptable e inyectarse en un área deficiente de tejido en la piel de un paciente.

Description

Composiciones y procedimientos para matrices extracelulares secretadas de forma natural.

La presente invención se refiere a las composiciones y procedimientos para el tratamiento y la reparación de los tejidos blandos y los defectos de la piel como arrugas y marcas. Más en particular, la invención se refiere a una composición inyectable de los componentes de la matriz extracelular humana y los procedimientos de preparación y uso de la misma. La preparación inyectable se obtiene de tejidos estromales vivos tridimensionales que se preparan in vitro.

Antecedentes de la invención

La idea de usar un material inyectable para el aumento y reparación del tejido blando se desarrolló poco después de la invención de la aguja hipodérmica. Se han inyectado varios productos en el cuerpo humano para la corrección de los tejidos blandos y los defectos de la piel que incluyen parafina, petrolato, aceites vegetales, lanolina, cera de abejas, y silicona. La silicona líquida inyectable se ha usado extensamente, sin embargo, debido a los efectos secundarios a largo plazo, como nódulos, celulitis recurrentes y úlceras en la piel que se están siguiendo ahora más estrechamente, el uso de la silicona inyectable está en declive. Es más, en el estado de Nevada es un delito grave usar silicona inyectable en humanos. Orange, Skin and Allergy News (1992) vol. 23, nº6, pág. 1. Más recientemente, el colágeno bovino ha ganado territorio como material inyectable para el aumento de tejidos blandos. El colágeno es la principal proteína estructural del cuerpo animal. Se han descrito al menos catorce tipos de colágeno en mamíferos. La característica común entre ellos es una hélice de triple hebra, que consiste en tres cadenas de polipéptidos, llamadas cadenas alfa. Todas las cadenas alfa tienen la misma configuración, pero difieren en la composición y secuencia de sus aminoácidos. Aunque esto lleva a diferentes tipos de cadenas alfa, sin embargo, todas tienen glicina en cada posición tres de la secuencia de aminoácidos. La glicina en cada posición tres permite la estructura helicoidal de las cadenas alfa. El colágeno tipo I se compone de dos cadenas alfa_{1}. y una cadena alfa_{2} y es el principal material extracelular de piel, tendones y huesos. Cuando los clínicos mencionan "colágeno", se refieren normalmente al colágeno tipo I. Ver tabla I, infra, para una lista detallada de colágenos tipo I-V y los tejidos en los que se encuentran.

El colágeno se ha usado como material de implante para reemplazar o aumentar el tejido conectivo duro o blando, como piel, tendones, cartílago, hueso e intersticio. Además, los implantes de colágeno se han usado con fines cosméticos durante algunos años ya que el colágeno puede ayudar a la multiplicación celular en el lugar de colocación. Los primeros implantes de colágeno eran a menudo masas sólidas de colágeno que se entrecruzaban con agentes químicos, radiación u otros medios para mejorar las propiedades mecánicas, disminuir la inmunogenicidad y/o incrementar la resistencia a la reabsorción. El colágeno utilizado estaba en distintas formas, que incluyen colágenos fibrilares entrecruzados y no entrecruzados, gelatinas, y similares y a veces se combinaba con otros componentes, como lubricantes, factores osteogénicos y similares, dependiendo del uso. Una desventaja importante de los implantes de colágeno entrecruzado sólido es la necesidad de implantación quirúrgica mediante incisión. Además, la ausencia de deformabilidad y flexibilidad son otras desventajas de los implantes de colágeno sólidos.

Oliver y col., Clinical Orthopaedics & Related Research (1976) 115:291-302; Br. J. Exp. Path. (1980) 61:544-549; y Conn. Tissue Res. (1981) 9:59-62 describen implantes hechos mediante el tratamiento de la piel con tripsina seguido del entrecruzamiento con un aldehído. Se comunicó que los implantes de colágeno sólido resultantes mantienen su masa original después de implantes prolongados. Un problema importante con estos implantes sólidos es que se deben implantar de forma quirúrgica. Otras desventajas es que no son tan deformables como los implantes inyectables y el gluta-
raldehído residual puede provocar que el implante pierda su flexibilidad debido al continuo entrecruzamiento in situ.

Schechter y col., Br. J. Plas. Surg. (1975) 28:198-202 desvelan piel entrecruzada con glutaraldehído que se bañó en L-alanina después del entrecruzamiento. El artículo postula que la exposición de la piel a L-alanina bloqueó los grupos reactivos residuales del aldehído, previniendo por lo tanto la liberación de las moléculas tóxicas generadas por estos grupos.

Una alternativa al implante quirúrgico del material colágeno sólido se desvela en la patente de EEUU nº 3949073. La patente de EEUU nº 3949073 describe el uso de soluciones de telopéptidos de colágeno bovino como material para implantes inyectable para aumentar los tejidos blandos. De acuerdo con la patente, el colágeno bovino se reconstituye antes de la implantación y forma una masa fibrosa de tejido cuando se implanta. La patente sugiere añadir partículas de microfibras de colágeno bovino insolubles para controlar la retracción de la masa fibrosa formada en el lugar del aumento. La forma de realización comercial del material descrito en la patente se compone de telopéptidos de colágeno bovino reconstituidos en salino que contiene una pequeña cantidad de anestésico local. Aunque es efectivo, el implante se retrae en volumen después de la implantación debido principalmente a la absorción de su componente fluido por el cuerpo. De este modo, si la consistencia del volumen es esencial, se requiere una inyección o inyecciones adicionales de material de implante suplementario. Esta composición específica tiene serios inconvenientes, por ejemplo, el colágeno es de una fuente bovina, no humana, y el procedimiento de preparación no sólo es lento y costoso sino que requiere la adición de microfibrillas.

La patente de EEUU nº 4424208 describe una dispersión inyectable de telopéptidos de colágeno bovino entrecruzado y fibras de telopéptidos de colágeno bovino reconstituidas en un vehículo acuoso que mostró una consistencia de volumen mejorada respecto al material de la patente de EEUU nº 3949073.

La patente de EEUU nº 4582640 desvela un implante inyectable mejorado respecto a las patentes de EEUU nº 3949073 y nº 4424208 en la que la mejora consiste en una consistencia de volumen y resistencia a la deformación física mejoradas, inyectabilidad mejorada comparada con la dispersión de la patente de EEUU nº 4424208 y que el colágeno bovino contiene sólo una única forma física de colágeno comparada con las dos formas físicas halladas en la patente de EEUU nº 4424208.

La patente de EEUU nº 4803075 describe composiciones de colágeno bovino que incluyen un material lubricante para aumentar la inyectabilidad a través de agujas de diámetro estrecho para la reparación de tejidos blandos.

A pesar de las ventajas y la utilidad global de los materiales para implantes de colágeno inyectable desveladas anteriormente, se han encontrado problemas asociados con la producción y la inyección de los materiales. Por ejemplo, para la reparación de los tejidos blandos, se han usado a menudo suspensiones de colágeno fibrilar mediante la inyección de la composición en el lugar a tratar a través de una aguja de calibre fino. El uso de colágeno fibrilar como primer material de matriz en composiciones para implantes de tejidos blandos y duros tiene varias limitaciones. La preparación de colágeno fibrilar adecuado para uso humano es relativamente lenta y cara. En particular, la extracción completa de las sustancias contaminantes y potencialmente inmunogénicas para producir telocolágeno es un procedimiento relativamente complejo y caro. Además, la persistencia, mantenimiento de la forma, cohesividad, estabilidad, elasticidad, resistencia e compresibilidad de las composiciones de colágeno fibrilar no son óptimas.

Además de los problemas asociados con la producción e inyección de los materiales para implantes de colágeno, también son abundantes los problemas con uso real de los implantes inyectables patentados anteriormente mencionados. Por ejemplo, ya que los anteriores inyectables patentados derivan de colágeno de fuentes xenogénicas, normalmente colágeno bovino, el colágeno debe modificarse para reducir su inmunogenicidad. Incluso con colágeno modificado, el material para implante es aún bastante inmunogénico para el cual algunas personas son alérgicas de forma natural o bien desarrollan una reacción alérgica al colágeno bovino con el tiempo. Debido a estas reacciones alérgicas los implantes de colágeno inyectable descritos anteriormente no se pueden administrar a mucha gente y otros están limitados a recibir sólo tres inyecciones al año. Las reacciones alérgicas graves incluyen síntomas de artritis reumatoide, mientras reacciones menos graves incluyen enrojecimiento e hinchazón del lugar de inyección que pueden llevar a marcas permanentes. Debido a estos graves efectos secundarios, los inyectables de colágeno descritos anteriormente se han dejado de usar para el aumento de labios. Además, los problemas asociados con la inyección de colágeno xenogénico parecen tan intratables que en lugar de colágeno inyectable, se han inyectado matrices cerámicas biocompatibles para lograr resultados similares como se describe en la patente de EEUU nº 5204382.

En resumen, debido a los defectos de las composiciones inyectables anteriormente descritas para la reparación de los defectos de los tejidos blandos, como la ausencia de persistencia, la necesidad de inyecciones repetidas y asuntos serios respecto a reacciones adversas, se necesitan nuevos materiales inyectables para el aumento de tejidos blandos.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a materiales inyectables para el aumento de tejidos blandos y procedimientos para el uso y fabricación de los mismos, que superan los defectos del colágeno inyectable bovino y otros materiales inyectables, incluida la silicona, de la técnica anterior. Los materiales inyectables usados de acuerdo con la presente invención comprenden preparaciones de matriz extracelular secretada de forma natural así como preparaciones derivadas de matrices extracelulares secretadas de forma natural. Estas preparaciones son biocompatibles, biodegradables y capaces de promover el depósito de tejido conectivo, angiogénesis, reepitelización y fibroplasia, que es útil en la reparación de los defectos de la piel y otros tejidos. Estas preparaciones de matriz extracelular se pueden usar para reparar los defectos de los tejidos mediante inyección en el lugar del defecto.

Las preparaciones inyectables de la presente invención tienen muchas ventajas respecto a las preparaciones de colágeno inyectable convencionales usadas para la reparación de los defectos de la piel. Las preparaciones de matriz extracelular de la presente invención contienen sólo proteínas humanas, por lo tanto, hay un riesgo reducido de una respuesta inmune debida a proteínas o péptidos extraños, especialmente el tipo de respuesta inmune vista con el colágeno bovino hallado en las preparaciones de colágeno inyectable convencionales. Además, las preparaciones para inyectar de la presente invención durarían más tiempo e incluso si se necesitaran múltiples inyecciones, las inyecciones no estarían sometidas a la regla de "no más de tres inyecciones al año" de las preparaciones basadas en colágeno bovino debido a la ausencia de inmunogenicidad. Otra ventaja proporcionada por la presente invención es que las preparaciones de matriz extracelular nativa contienen una mezcla de proteínas de la matriz extracelular que se parece mucho a las composiciones de las situaciones fisiológicas normales, por ejemplo, en una matriz extracelular derivada de células dérmicas, están presentes los colágenos tipo I y III, ácido hialurónico así como varios glucosaminoglicanos y factores de crecimiento naturales. Muchas de estas proteínas de matriz extracelular y factores de crecimiento se han estudiado ampliamente y se ha demostrado que son esenciales para la cicatrización de heridas y la restauración de los tejidos.

En otro aspecto de la invención, las preparaciones se pueden usar en sistemas altamente mejorados para cultivo de tejidos in vitro. En esta forma de realización, se pueden usar estructuras tridimensionales recubiertas por matriz extracelular secretada de forma natural para cultivar células que requieren la adhesión a un soporte para crecer pero no se adhieren a los recipientes para cultivos tisulares convencionales. Además de cultivar células sobre estructuras recubiertas, la matriz extracelular secretada por las células sobre las estructuras se puede recoger y usar para recubrir recipientes para usar en cultivos tisulares. La matriz extracelular, que actúa como un sustrato basal, puede permitir que células que normalmente son incapaces de unirse a los sustratos basales de las placas para cultivos tisulares convencionales se unan y por consiguiente crezcan.

Otra forma de realización más de la presente invención está dirigida a un nuevo procedimiento para la determinación de la taxis celular de una célula particular. El procedimiento incluye la inoculación de un extremo de una estructura tridimensional recubierta de matriz extracelular nativa en el tipo celular en cuestión y medir en el tiempo la distancia recorrida por la célula a través de la estructura. Debido a que la matriz extracelular se secreta de forma natural por las células de la estructura, es un excelente equivalente in vitro de la matriz extracelular hallada en el cuerpo. Un ensayo así puede, por ejemplo, informar de si las células tumorales aisladas son metastásicas o de si ciertas células inmunes pueden migrar o incluso ser atraídas quimiotácticamente a través de la estructura indicando, de este modo, que la célula tiene esta capacidad táctica.

Definiciones y abreviaturas

Los términos siguientes usados en la presente memoria descriptiva tendrán los significados indicados:

Capa adhesiva

Células unidas directamente a la estructura tridimensional o conectadas indirectamente mediante la unión a células que se unen por sí mismas directamente a la matriz.

Vehículo aceptable farmacéuticamente

Un medio acuoso a isotonicidad y pH fisiológicos y que puede contener otros elementos como anestésicos locales y/o lubricantes fluidos.

Células estromales

Fibroblastos con o sin otras células y/o elementos hallados en el tejido conectivo desprendido, que incluye pero no se limita a células endoteliales, pericitos, macrófagos, monocitos, células plasmáticas, mastocitos, adipocitos, condrocitos, etc.

Estructura tridimensional

Un soporte tridimensional compuesto por cualquier material y/o forma que (a) permite que las células se unan a él (o puede modificarse para permitir que las células se unan a él); y (b) permite que las células crezcan en más de una capa. Las células estromales se inoculan en este soporte para formar la matriz estromal viva.

Tejido estromal vivo

Una estructura tridimensional a la que se ha inoculado células estromales. Confluentes o subconfluentes, las células estromales de acuerdo con la invención continúan creciendo y dividiéndose. El tejido estromal vivo preparado in vitro es la fuente de las proteínas de la matriz extracelular usadas en las formulaciones inyectables de la invención.

Las siguientes abreviaturas tendrán los significados indicados:

\underline{EDTA}	ácido tetraacético de etiléndiamina
\underline{FBS}	suero bovino fetal
\underline{HBSS}	solución salina equilibrada de Hank
\underline{HS}	suero de caballo
\underline{MEM}	medio esencial mínimo
\underline{PBS}	salino tamponado con fosfato
\underline{RPMI \ 1640}	medio nº 1640 (GIBCO, Inc., Grand Island, NY) del Instituto Roswell Park Memorial
\underline{SEM}	microscopio electrónico de barrido.

La presente invención se puede entender mejor tomando como referencia la siguiente descripción detallada, ejemplos de formas de realización específicas y figuras anexas que se ofrecen sólo con el propósito de ilustrar y no como limitación.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. La figura 1 es una micrografía electrónica de barrido que representa la unión de los fibroblastos a la matriz tridimensional y la extensión de los procedimientos celulares a través de la apertura de la malla. Los fibroblastos secretan activamente proteínas de la matriz y están en la fase apropiada de subconfluencia que se debería obtener antes de inocular las células específicas del tejido.

Figura 2A-D. Las figuras 2A-D son micrografías electrónicas de transmisión de colágeno aislado de la matriz extracelular preparada de tejido dérmico crecido in vitro (figura 2A-B) o de una muestra dérmica normal de humano adulto (figura 2C-D).

Descripción detallada de la invención

Una forma de realización de la presente invención incluye la preparación y uso de una composición de matriz extracelular inyectable para el tratamiento de los defectos de la piel. Las proteínas de la matriz extracelular derivan de un tejido estromal vivo preparado in vitro mediante el crecimiento de células estromales en una estructura tridimensional que da como resultado un sistema de cultivo celular multicapa. En los sistemas de cultivos tisulares convencionales, se hacía crecer a las células en una monocapa. Las células crecidas en un soporte tridimensional, de acuerdo con la presente invención, crecen en múltiples capas, formando una matriz celular. Este sistema de matriz se aproxima a las condiciones fisiológicas halladas in vivo en mayor grado que los sistemas de cultivos tisulares monocapa descritos anteriormente. El sistema de cultivo celular tridimensional es aplicable a la proliferación de diferentes tipos de células estromales y a la formación de varios tejidos estromales diferentes, que incluyen pero no se limitan a la dermis, estroma de la médula ósea, tejido de glía, cartílago, por nombrar algunos.

De acuerdo con la presente invención, el tejido estromal vivo preestablecido comprende células estromales crecidas en una estructura o red tridimensional. Las células estromales pueden comprender fibroblastos con o sin células adicionales y/o elementos descritos mejor en la presente memoria descriptiva. Los fibroblastos y otras células y/o elementos que comprende el estroma pueden ser de origen fetal o adulto, y pueden derivar de fuentes adecuadas como la piel, hígado, páncreas, etc. Estos tejidos y/u órganos se pueden obtener mediante biopsias adecuadas o por autopsia. De hecho, los órganos de cadáveres se pueden usar para proporcionar un generoso aporte de células y

\hbox{elementos
estromales.}

Una vez inoculadas en la estructura tridimensional, las células estromales proliferarán en la estructura, y elaborarán factores de crecimiento, factores de regulación y proteínas de matriz extracelular que se depositan en el soporte. El tejido estromal vivo sostendrá la proliferación activa del cultivo durante largos períodos de tiempo. Se pueden añadir factores de crecimiento y reguladores al cultivo, pero no son necesarios ya que son elaborados por la matriz estromal de soporte.

La matriz extracelular secretada de forma natural se recoge de la estructura tridimensional y se procesa con un vehículo acuoso aceptable farmacéuticamente y se coloca en una jeringuilla para la colocación precisa del biomaterial en los tejidos, como la dermis facial.

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que durante el crecimiento de las células estromales humanas en una estructura tridimensional de soporte biodegradable o no biodegradable, las células sintetizan y depositan una matriz extracelular humana en la estructura tridimensional de soporte como la producida en el tejido humano normal. La matriz extracelular se secreta localmente por las células y no sólo une células y tejidos sino que también estimula el desarrollo y comportamiento de las células con las que contacta. La matriz extracelular contiene varias proteínas que forman fibras intercaladas en un gel hidratado compuesto por una red de cadenas de glucosaminoglicanos. Los glucosaminoglicanos son un grupo heterogéneo de cadenas de polisacáridos largas cargadas negativamente, que (excepto el ácido hialurónico) que se unen covalentemente a las proteínas para formar moléculas de proteoglicanos.

Las proteínas que forman fibras son de dos tipos funcionales: principalmente estructurales (colágenos y elastina) y principalmente adhesivas (como fibronectina y laminina). Los colágenos fibrilares (tipos I, II y III) son similares a cuerdas, moléculas helicoidales de triple hebra que se agrupan en fibrillas similares a cables largos en el espacio extracelular; éstas en cambio pueden reagruparse en diversos conjuntos altamente ordenados. Las moléculas de colágeno tipo IV se reordenan en una malla similar a una lámina que forma el núcleo de todas las membranas basales. Las moléculas de elastina forman una red entrecruzada extensa de fibras y láminas que pueden estirarse y encogerse, dando elasticidad a la matriz. La fibronectina y la laminina son ejemplos de glicoproteínas adhesivas grandes de la matriz; la fibronectina está ampliamente distribuida en los tejidos conectivos, mientras la laminina se halla principalmente en la lámina basal. A través de sus múltiples dominios de unión, estas proteínas ayudan a las células a adherirse y organizarse en la matriz extracelular.

Como ejemplo, una matriz extracelular dérmica humana secretada de forma natural contiene colágenos tipo I y tipo III, fibronectina, tenascina, glucosaminoglicanos, FGF ácido y básico, TGF-\alpha y TGF-\beta, KGF, decorina y otras proteínas de matriz dérmica humana secretadas de forma natural. Como los productos secretados de forma natural, las proteínas de matriz extracelular se producen en cantidades y razones similares a las que existen in vivo. Además, el crecimiento de las células estromales en tres dimensiones sostendrá la proliferación activa de las células en cultivo durante períodos de tiempo mucho más largos que los sistemas monocapa. Además, el sistema tridimensional soporta la maduración, diferenciación, y segregación de las células en cultivo in vitro para formar componentes de tejidos adultos análogos a los equivalentes hallados in vivo. De este modo, la matriz extracelular creada por las células en cultivo son más análogas a los tejidos nativos.

Aunque los solicitantes no están bajo el deber o la obligación de explicar el mecanismo mediante el que funciona la invención, varios factores inherentes del sistema de cultivo tridimensional pueden contribuir a estas características del sistema de cultivo tridimensional:

(a)

La estructura tridimensional proporciona mayor área de superficie para la unión de las proteínas, y por consiguiente, para la adherencia de las células estromales.

(b)

Debido a la tridimensionalidad de la estructura, las células estromales continúan creciendo activamente a diferencia de las células de los cultivos monocapa, que crecen hasta confluir, mostrando inhibición por contacto, y cesando de crecer y dividirse. La elaboración de factores de crecimiento y reguladores por las células estromales en replicación puede ser parcialmente responsable de estimular la proliferación y regular la diferenciación de las células en cultivo.

(c)

La estructura tridimensional permite una distribución espacial de los elementos celulares que se parece más a la hallada en el tejido equivalente in vivo.

(d)

El incremento en el volumen potencial del crecimiento celular del sistema tridimensional puede permitir la creación de microambientes parecidos a los equivalentes nativos hallados in vivo.

(e)

La matriz tridimensional maximiza las interacciones célula-célula permitiendo mayor potencial de movimiento de las células migratorias, como los macrófagos, monocitos y posiblemente linfocitos de la capa adhesiva.

(f)

Se ha reconocido que el mantenimiento de un fenotipo celular diferenciado requiere no sólo factores de crecimiento/diferenciación sino también interacciones celulares apropiadas. La presente invención recrea en efecto el microambiente del tejido estromal.

El soporte estromal tridimensional, el sistema de cultivo, y su mantenimiento, así como varios usos de los cultivos tridimensionales y de la matriz extracelular secretada de forma natural se describen con más detalle en las subsecciones posteriores. Solamente para facilitar la explicación, la descripción detallada de la invención se divide en tres secciones, (i) crecimiento del cultivo celular estromal tridimensional, (ii) aislamiento de la matriz extracelular humana secretada de forma natural, y (iii) formulación de la matriz extracelular aislada en preparaciones para inyectar en el lugar de los defectos tisulares blandos.

Preparación del tejido estromal vivo in vitro

El soporte tridimensional usado para cultivar tejido estromal puede ser de cualquier material y/o forma que:

(a)

permite que las células se unan a él (o se puede modificar para permitir que las células se unan a él); y

(b)

permite que las células crezcan en más de una capa.

Se pueden usar varios materiales diferentes para formar la estructura, como materiales no biodegradables o biodegradables. Por ejemplo, los materiales no biodegradables incluyen pero no se limitan a: nailon (poliamidas), dacron (poliésteres), poliestireno, polipropileno, poliacrilatos, compuestos de polivinilo (por ejemplo, cloruro de polivinilo), policarbonato (PVC), politetrafluoretileno (PTFE; teflon), termanox (TPX), etc. Además, los materiales biodegradables también se pueden utilizar, que incluyen pero no se limitan a: nitrocelulosa, algodón, ácido poliglicólico (PGA), suturas de tripa de gato, celulosa, gelatina, dextrano, colágeno, chitosán, ácido hialurónico, etc. Cualquiera de estos materiales, bio- o no biodegradables, se pueden tejer en una malla para formar una estructura tridimensional. Por otra parte, los materiales se pueden usar para formar otros tipos de estructuras tridimensionales, por ejemplo, esponjas, como esponjas de colágeno.

Ciertos materiales, como el nailon, poliestireno, etc., son sustratos pobres para la unión celular. Cuando se usan estos materiales como estructura de soporte tridimensional, es aconsejable pretratar la estructura antes de la inoculación de células estromales para aumentar la unión de las células estromales a la estructura. Por ejemplo, antes de la inoculación de células estromales, se pueden tratar las estructuras de nailon con ácido acético 0,1 M, e incubarse en polilisina, FBS, y/o colágeno para recubrir el nailon. El poliestireno se puede tratar de forma similar usando ácido sulfúrico. Una malla de nailon adecuada que se puede usar de acuerdo con la invención es Nitex, una malla de filtración de nailon que tiene un tamaño de poro medio de 210 \mum y un diámetro de fibra de nailon medio de 90 \mum (#3-210/36, Tetko, Inc., N.Y.).

Se inoculan en la estructura células estromales que comprenden fibroblastos derivados de tejido adulto o fetal, con o sin otras células y elementos descritos posteriormente. Estos fibroblastos pueden derivar de órganos, como la piel, hígado, páncreas, etc., que se pueden obtener mediante biopsia, cuando es apropiado, o por autopsia. De hecho, los fibroblastos se pueden obtener en cantidad convenientemente de cualquier órgano de cadáver adecuado. En una forma de realización preferida, se pueden obtener fibroblastos fetales en gran cantidad del prepucio.

Los fibroblastos se pueden aislar fácilmente mediante la disgregación de órganos o tejidos adecuados que van a servir como fuente de fibroblastos. Esto se puede conseguir fácilmente usando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, el tejido u órgano se puede disgregar mecánicamente y/o tratarse con enzimas digestivas y/o agentes quelantes que debilitan las conexiones entre las células vecinas haciendo posible dispersar el tejido en una suspensión de células individuales sin rotura celular apreciable. La disociación enzimática se puede conseguir mediante el picado del tejido y el tratamiento del tejido picado con alguna de las enzimas digestivas solas o en combinación. Éstas incluyen pero no se limitan a tripsina, quimotripsina, colagenasa, elastasa, hialuronidasa, DNasa, pronasa, y/o dispasa, etc. La disrupción mecánica también se puede conseguir mediante varios métodos que incluyen pero no se limitan al uso de picadoras, licuadoras, coladores, homogenizadores, células de presión, o INSONATORS por nombrar algunos. Para una revisión de las técnicas de disgregación de tejidos, ver Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, 2ª edición, A.R. Liss, Inc., Nueva York, 1987, capítulo 9, pág. 107-126.

Una vez que el tejido se ha reducido a una suspensión de células individuales, la suspensión se puede fraccionar en subpoblaciones de las que se pueden obtener los fibroblastos y/u otras células estromales y/o elementos. Esto también puede conseguirse usando técnicas estándar para la separación celular que incluyen, pero no se limitan a, la clonación y selección de tipos celulares específicos, destrucción selectiva de las células no deseadas (selección negativa), separación basada en la aglutinabilidad celular diferencial en la población mezclada, procedimientos de congelación-descongelación, propiedades de adherencia diferenciales de las células de la población mezclada, filtración, centrifugación convencional y zonal, elutriación centrífuga (centrifugación contra-flujo), separación por unidad de gravedad, distribución contracorriente, electroforesis y ordenación celular activada por fluorescencia. Para una revisión de la selección clonal y las técnicas de separación celular, ver Freshney, Culture of Animal Cells, A manual of Basic Techniques, 2ª edición, A.R. Liss, Inc., Nueva York, 1987, capítulos 11 y 12, pág 137-168.

El aislamiento de los fibroblastos, por ejemplo, se puede llevar a cabo como sigue: muestras de tejido fresco se lavan y se pican bien en una solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) para extraer el suero. El tejido picado se incuba de 1-12 horas en una solución recién preparada de una enzima disociadora como la tripsina. Después de esta incubación, las células disociadas se suspenden, sedimentan mediante centrifugación y se colocan en placas de cultivo. Todos los fibroblastos se unirán antes que otras células, por lo tanto, se pueden aislar selectivamente y hacer crecer a las células estromales adecuadas. Se puede hacer crecer entonces a los fibroblastos aislados por confluencia, se recogen del cultivo confluente y se inoculan en la estructura tridimensional, ver Naughton y col., 1987, J. Med. 18(3&4):219-250. La inoculación de células estromales a alta concentración en la estructura tridimensional, por ejemplo, aproximadamente 10^{6} a 5 x 10^{7} células/ml, dará como resultado la creación de soportes estromales tridimensionales en períodos de tiempo más cortos.

Además de los fibroblastos, se pueden añadir otras células para formar el cultivo celular estromal tridimensional productor de matriz extracelular. Por ejemplo, se pueden inocular en la estructura de soporte tridimensional otras células halladas en el tejido conectivo desprendido junto con los fibroblastos. Estas células incluyen, pero no se limitan a, células endoteliales, pericitos, macrófagos, monocitos, células plasmáticas, mastocitos, adipocitos, condrocitos, etc. Estas células estromales pueden derivar fácilmente de órganos adecuados como la piel, hígado, etc., usando los métodos conocidos, como los discutidos anteriormente.

En una forma de realización de la presente invención, se pueden añadir al estroma de fibroblastos células estromales que se especializan en el tejido que se va a cultivar para la producción de una matriz extracelular específica del tipo de tejido. Por ejemplo, se pueden usar los fibroblastos dérmicos para formar el estroma subconfluente tridimensional para la producción de matriz extracelular específica de la piel in vitro. Por otra parte, se pueden usar células estromales del tejido hematopoyético que incluyen, pero no se limitan a, fibroblastos, células endoteliales, macrófagos/monocitos, adipocitos y células reticulares para formar el estroma subconfluente tridimensional para la producción de una matriz extracelular específica de médula ósea in vitro, ver infra. Las células estromales hematopoyéticas se pueden obtener fácilmente de la "célula mononuclear de cultivo" formada en las suspensiones de médula ósea mediante centrifugación con baja fuerza, por ejemplo, 3000x g. Las células estromales del hígado pueden incluir fibroblastos, células de Kupffer, y células endoteliales vasculares y del conducto biliar. De forma similar, se pueden usar células gliales como estroma para soportar la proliferación de células y tejidos neurológicos. Las células gliales para este propósito se pueden obtener mediante tripsinización o digestión con colagenasa de cerebros embrionarios o adultos. Ponten y Westermark, 1980, In Federof, S. Hertz, L., eds, "Advances in Cellular Neurobiology", vol. 1, Nueva York, Academic Press, pág. 209-227.

Para ciertos usos in vivo se prefiere obtener las células estromales de los propios tejidos del paciente. El crecimiento de las células en presencia de la estructura de soporte estromal tridimensional se puede aumentar más mediante la adición a la estructura, o el recubrimiento de la estructura con proteínas, por ejemplo, colágenos, fibras elásticas, fibras reticulares, glucoproteínas; glucosaminoglicanos, por ejemplo, heparán sulfato, condroitín-4-sulfato, condroitín-6-sulfato, dermatán sulfato, queratán sulfato, etc.; una matriz extracelular y/u otros materiales.

Después de la inoculación de las células estromales, la estructura tridimensional se incuba en un medio nutriente adecuado bajo condiciones fisiológicas favorables para el crecimiento celular, es decir, estimulación de la mitosis, es decir, la división celular. Muchos medios disponibles comercialmente como RPMI 1640, medios de Fisher, de Iscove, de McCoy, y similares pueden ser adecuados para usar. Es importante que el cultivo estromal tridimensional esté suspendido o se deje flotar en el medio durante el periodo de incubación para maximizar la actividad proliferativa. Además, al cultivo se le debe "alimentar" periódicamente para extraer el medio consumido, despoblar las células liberadas, y añadir medio fresco.

Durante el período de incubación, las células estromales crecerán linealmente y envolverán la estructura tridimensional antes de comenzar a crecer en las aperturas de la estructura. Se hace crecer a las células en un grado adecuado para permitir la deposición adecuada de proteínas de matriz extracelular.

Las aperturas de la estructura deberían ser de un tamaño apropiado para permitir que las células estromales se estiren a través de las aperturas. Mantener células estromales creciendo activamente que se estiran a través de la estructura aumenta la producción de factores de crecimiento que se elaboran por las células estromales, y por tanto, soportarán cultivos a largo plazo. Por ejemplo, si las aperturas son muy pequeñas, las células estromales pueden lograr confluir rápidamente pero ser incapaces de salir fácilmente de la malla. Las células atrapadas pueden mostrar inhibición por contacto y cesar la producción de los factores adecuados necesarios para soportar la proliferación y mantener los cultivos a largo plazo. Si las aperturas son demasiado grandes, las células estromales son incapaces de estirarse a través de la apertura. Esto también disminuirá la producción de las células estromales de los factores adecuados necesarios para soportar la proliferación y mantener los cultivos a largo plazo. Cuando se usa una matriz de tipo malla, como se pone de ejemplo en la presente memoria descriptiva, se ha encontrado que las aperturas que oscilan entre aproximadamente 150 \mum y aproximadamente 220 \mum servirán satisfactoriamente. Sin embargo, dependiendo de la conformación y lo intrincado de la estructura, otros tamaños pueden servir igualmente. De hecho, cualquier forma o conformación que permita que las células estromales se estiren y continúen replicándose y creciendo durante largos períodos de tiempo servirá de acuerdo con la presente invención.

Se pueden lograr proporciones diferentes de varios tipos de colágeno depositados en la estructura mediante la inoculación de diferentes células específicas de tejido a la estructura. Por ejemplo, para las células hematopoyéticas, la matriz debería contener preferentemente colágenos tipo III, IV y I en una razón aproximada de 6:3:1 de la matriz inicial. Para la piel, se depositan preferentemente colágenos tipo I y III en la matriz inicial. Las proporciones de los tipos de colágeno depositados se pueden modificar o aumentar mediante la selección de fibroblastos que elaboran las proteínas de matriz extracelular adecuadas. Esto se puede conseguir usando anticuerpos monoclonales de un isotipo o subclase adecuado que son capaces de activar el complemento, y que definen tipos particulares de colágeno. Estos anticuerpos en combinación con el complemento se pueden usar para seleccionar negativamente los fibroblastos que expresan el tipo de colágeno deseado. Por otra parte, el estroma usado para inocular la estructura puede ser una mezcla de células que sintetizan los tipos de colágeno adecuados deseados. La distribución y orígenes de los cinco tipos de colágeno se muestran en la tabla I.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA I

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1

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Por lo tanto, dependiendo de los tipos de colágeno deseados, se puede(n) seleccionar la(s) célula(s) estromal(es) adecuada(s) para inocular en la estructura tridimensional.

La matriz extracelular tridimensional que produce el cultivo de la presente invención permite ser un vehículo para la introducción de los productos génicos in vivo. En ciertas situaciones, puede ser deseable preparar una matriz extracelular que contiene un producto génico extraño, factor de crecimiento, factor regulador, etc. En estos casos, las células se pueden programar genéticamente para expresar el producto génico, o alterarse las formas del producto del gen que están inmovilizadas en la matriz extracelular extendida por las células estromales. Por ejemplo, usando técnicas de ADN recombinante, se puede colocar un gen de interés bajo el control de un promotor inducible. El constructo de ADN recombinante que contiene el gen se puede usar para transformar o transfectar una célula huésped que se clona y luego se expande clonalmente en el sistema de cultivo tridimensional. El uso del cultivo tridimensional en este aspecto tiene varias ventajas. En primer lugar, ya que el cultivo comprende células eucariotas, el producto génico se expresará y procesará adecuadamente en el cultivo para formar un producto activo. En segundo lugar, el número de células transfectadas se puede aumentar sustancialmente para ser de valor, relevancia y utilidad clínica. Los cultivos tridimensionales de la presente invención permiten la expansión de las células transfectadas y la amplificación (vía división celular) de las células transfectadas.

Preferentemente, los elementos de control de la expresión usados deberían permitir la expresión regulada del gen de modo que el producto se pueda sobresintetizar en cultivo. El promotor transcripcional elegido, en general, y los elementos promotores específicamente, dependen, en parte, del tipo de tejido y células cultivados. Se prefieren las células y los tejidos que son capaces de secretar proteínas (por ejemplo, los caracterizados por abundante retículo endoplásmico rugoso y aparato de Golgi).

Durante la incubación del cultivo tridimensional, las células en proliferación se liberan de la estructura. Estas células liberadas pueden pegarse a las paredes del recipiente de cultivo donde pueden continuar proliferando y formar una monocapa confluente. Esto se debería prevenir o minimizar, por ejemplo, mediante la extracción de las células liberadas durante la alimentación, o mediante la transferencia de la estructura tridimensional a un nuevo recipiente de cultivo. La presencia de una monocapa confluente en el recipiente "detendrá" el crecimiento de las células de la estructura y/o cultivo tridimensional. La extracción de la monocapa confluente o la transferencia del cultivo estromal a un medio fresco de un nuevo recipiente restablecerá la actividad proliferativa del sistema de cultivo tridimensional. Esta extracción o transferencia se debería hacer en cualquier recipiente de cultivo que tenga una monocapa estromal que exceda el 25% de confluencia. Por otra parte, el sistema de cultivo se puede agitar para prevenir que las células liberadas se peguen, o en su lugar alimenten periódicamente los cultivos, el sistema de cultivo se podría establecer de modo que el medio fresco fluyera continuamente por el sistema. La velocidad de flujo se puede ajustar a la máxima proliferación del cultivo tridimensional, y a lavar y extraer las células liberadas de la matriz, de modo que no se pegarán a las paredes del recipiente y crecerán hasta la confluencia, en cualquier caso, las células estromales liberadas se pueden recoger y crioconservar para usos futuros.

Una vez inoculados en la estructura tridimensional, la adherencia de los fibroblastos se ve rápidamente (por ejemplo, en horas) y los fibroblastos empiezan a estirarse a través de las aperturas de la estructura en días. Estos fibroblastos son activos metabólicamente, secretan matriz extracelular y forman rápidamente un equivalente dérmico que consiste en fibroblastos activos y colágeno.

La figura 1 ilustra la capacidad de los fibroblastos para ordenarse en capas paralelas entre los haces de colágeno secretados de forma natural. Estos fibroblastos muestran una rápida velocidad de división celular y secreción de proteínas.

Extracción de la matriz extracelular de la estructura

Después que las células se han inoculado en la estructura y cultivado bajo condiciones que favorecen el crecimiento celular, de modo que se secreta la cantidad deseada de matriz extracelular en la estructura tridimensional, se matan las células y se procesa la matriz extracelular secretada de forma natural.

Esto incluye primero matar las células y extraer las células muertas y cualquier resto celular de la estructura tridimensional. Este procedimiento se lleva a cabo de varias maneras diferentes. Por ejemplo, se puede matar las células mediante la congelación instantánea del tejido estromal vivo preparado in vitro en nitrógeno líquido sin un crioconservador. Otra manera de matar las células es irrigar la estructura tridimensional inoculada con agua destilada, de modo que las células estallen en respuesta a la presión osmótica. Una vez que se ha matado las células, se puede, por ejemplo, romper las membranas celulares y extraer los restos celulares mediante un lavado con un detergente suave, como EDTA, CHAPS o un detergente bipolar, seguido de un tratamiento con un crioprotector como DMSO, propilenglicol, butanodiol, rafinosa, pirrolidona de polivinilo, dextrano o sacarosa y vitrificado en nitrógeno líquido. Por otra parte, la estructura puede estar sujeta a digestión enzimática y/o extracción con reactivos que rompen las membranas celulares y permiten la extracción de los contenidos celulares. Los ejemplos de detergentes incluyen detergentes no iónicos (por ejemplo, TRITON X-100, octilfenoxi polietanol, (Rohm y Haas); BRIJ-35, un éter de laurilo de polietoxietanol (Atlas Chemical Cc.), TWEEN 20, un monolaureato de sorbitano de polietoxietanol (Rohm y Haas), LUBROL-PX, o éter de laurilo de polietileno (Rohm y Haas)); y detergentes iónicos (por ejemplo, dodecilsulfato de sodio, alcohol alifático superior sulfatado, alcano sulfonado y alquilareno sulfonado que contiene 7 a 22 átomos de carbono en una cadena ramificada o no ramificada). También se pueden usar enzimas y pueden incluir nucleasas (por ejemplo, deoxirribonucleasa y ribonucleasa), fosfolipasas y lipasas. Una ventaja de usar un lavado con detergente suave es que disolverá las proteínas unidas a la membrana, que a menudo son altamente antigénicas.

Una vez que se han matado las células y se han extraído los restos celulares, se puede conseguir la colección de la matriz extracelular humana secretada de forma natural de varias formas que dependen de si la estructura tridimensional se compone de un material que es biodegradable o no biodegradable. Por ejemplo, si la estructura se compone de un material no biodegradable, se puede extraer la matriz extracelular de un soporte no biodegradable sometiendo la estructura tridimensional a sonicación y/o chorros de agua a alta presión y/o al despedazamiento mecánico y/o a tratamiento suave con detergentes y/o enzimas para extraer la matriz extracelular unida de la estructura.

Si la matriz extracelular se deposita en una estructura tridimensional biodegradable, después de la muerte y extracción de las células y restos celulares, se puede recuperar la matriz extracelular, por ejemplo, simplemente permitiendo que se degrade la estructura en una solución, es decir, permitir a la estructura disolverse, dejando libre así la matriz extracelular. Además, si el soporte biodegradable se compone de un material que se puede inyectar, como la misma matriz extracelular, se puede procesar la estructura entera recubierta con matriz extracelular en jeringas para inyección. Además, si la matriz extracelular se deposita en un soporte biodegradable, la matriz se puede extraer mediante los mismos procedimientos que si la matriz se hubiera depositado en un soporte no biodegradable, es decir, sometiendo la estructura tridimensional a sonicación y/o chorros de agua a alta presión y/o despedazamiento mecánico y/o tratamiento suave con detergentes y/o enzimas para extraer la matriz extracelular unida de la estructura. Ninguno de estos procedimientos de extracción se diseña para dañar y/o desnaturalizar la matriz extracelular humana secretada de forma natural producida por las células.

Formulación y uso de las preparaciones inyectables

Una vez que se ha recogido la matriz extracelular secretada de forma natural, se procesa. La matriz extracelular se puede homogeneizar en finas partículas, de modo que puedan pasar a través de una aguja quirúrgica. La homogenización es conocida en la materia, por ejemplo, mediante sonicación. Además, la matriz extracelular se puede entrecruzar mediante radiación gamma sin el uso de agentes de entrecruzamiento químicos, como el glutaraldehído, que son tóxicos. La radiación gamma debería ser de un mínimo de 20 M rads para esterilizar el material, ya que todas las bacterias, hongos, y virus se destruyen a 0,2 M rads. Preferentemente, se puede irradiar la matriz extracelular de 0,25 a 2 M rads para esterilizar y entrecruzar la matriz extracelular.

Además, las cantidades y/o razones de los colágenos y las otras proteínas se pueden ajustar mediante la mezcla de las matrices extracelulares secretadas por otros tipos celulares antes de colocar el material en una jeringuilla. Por ejemplo, se pueden incorporar en las composiciones de la presente invención sustancias biológicamente activas, como proteínas y fármacos, para la liberación o liberación controlada de estas sustancias activas después de la inyección de la composición. Las sustancias biológicamente activas de ejemplo pueden incluir factores de crecimiento de tejidos, como TGF-\beta, y similares que promueven la cicatrización y la reparación del tejido en el lugar de la inyección.

La formulación final de la suspensión acuosa de la matriz extracelular humana secretada de forma natural incluirá normalmente el ajuste de la fuerza iónica de la suspensión a la isotonicidad (es decir, aproximadamente 0,1 a 0,2) y al pH fisiológico (es decir, aproximadamente pH 6,8 a 7,5) y la adición de un anestésico local, como la lidocaína, (habitualmente a concentración de aproximadamente 0,3% en peso) para reducir el dolor local con la inyección. La formulación final también contendrá normalmente un lubricante fluido, como maltosa, que el cuerpo debe tolerar. Los componentes lubricantes de ejemplo incluyen glicerol, glucógeno, maltosa y similares. Los materiales con base de polímeros orgánicos, como polietilenglicol y acido hialurónico así como colágeno no fibrilar, preferentemente colágeno succinilado, también pueden actuar como lubricantes. Estos lubricantes se usan generalmente para mejorar la inyectabilidad, introducción y dispersión del biomaterial inyectado en le lugar de la inyección y para disminuir la cantidad de pinchazos mediante la modificación de la viscosidad de las composiciones. Esta formulación final es por definición la matriz extracelular procesada en un vehículo aceptable farmacéuticamente.

La matriz se coloca por consiguiente en una jeringuilla u otro aparato para inyección para una colocación precisa de la matriz en el lugar del defecto del tejido. En el caso de las formulaciones para aumento dérmico, El término "inyectable" significa que la formulación se puede dispensar de jeringuillas que tienen un diámetro de 25 bajo condiciones normales bajo presión normal sin pinchazo sustancial. El pinchazo puede producir que la composición rebose de la jeringa al inyectarla en el tejido. Para esta colocación específica, se desean agujas de 27 de diámetro (200 \mu ID) o incluso 30 de diámetro (150 \mu ID). El tamaño de partícula máximo que se puede extrudir a través de estas agujas será una función compleja de al menos: dimensión máxima de las partículas, razón de aspecto de las partículas (longitud:anchura), rigidez de las partículas, superficie rugosa de las partículas y factores relacionados que afectan a las partículas: adhesión de las partículas, las propiedades viscoelásticas del fluido para suspensión, y la velocidad de flujo a través de la aguja. Las gotas esféricas rígidas suspendidas en un fluido Newtoniano representan el caso más simple, ya que las partículas fibrosas o ramificadas de un fluido viscoelástico probablemente son más complejas.

Las etapas descritas anteriormente del procedimiento para la preparación de la matriz extracelular humana secretada de forma natural se llevan a cabo preferentemente bajo condiciones estériles usando materiales estériles. La matriz extracelular procesada en un vehículo aceptable farmacéuticamente se puede inyectar de forma intradérmica o subcutánea para aumentar el tejido blando, para reparar o corregir anomalías congénitas, defectos adquiridos o defectos cosméticos. Ejemplos de estas dolencias son las anomalías congénitas como la microsomía hemifacial, hipoplasia malar y cigomática, hipoplasia mamaria unilateral, pectus excavatum, agenesia de pectoral (anomalía de Poland) e incompetencia velofaríngea secundaria a la reparación de la fisura del paladar o a la fisura submucosa del paladar (como un implante retrofaríngeo); defectos adquiridos (post-traumáticos, post-quirúrgicos, post-infecciosos) como marcas hundidas, atrofia subcutánea (por ejemplo, secundaria a lupus eritematoso discoide), lesiones queratósicas, enoftalmos en el ojo no nucleado (también síndrome del sulcus superior), punteado de acné de la cara, esclerodermia lineal con atrofia subcutánea, deformidad en silla de montar de la nariz, enfermedad de Romberg y parálisis de cuerda vocal unilateral; y defectos cosméticos como líneas de expresión de la frente, surco nasolabial profundo, arrugas periorales, pómulos hundidos e hipoplasia mamaria. Las composiciones de la presente invención también se pueden inyectar en tejidos internos, como los tejidos que delimitan los esfínteres corporales para aumentar estos tejidos.

Varias formas de realización de las muestras de la invención se describen en las secciones posteriores. Sólo para los propósitos de la descripción, y no como limitación, el sistema de cultivo tridimensional de la invención se describe basado en el tipo de tejido y células usados en varios sistemas. Estas descripciones incluyen específicamente pero no se limitan a médula ósea, piel, células epiteliales, y cartílago pero se entiende claramente que el sistema de cultivo tridimensional se puede usar con otros tipos de células y tejidos. La invención se ilustra también mediante ejemplos, que demuestran los datos característicos generados por cada sistema descrito.

Ejemplos

Ejemplo

Sistema de cultivo estromal tridimensional de piel

Las subsecciones posteriores describen el sistema de cultivo tridimensional de la invención para el cultivo de diferentes células estromales in vitro. Brevemente, los cultivos de fibroblastos se establecen en mallas de nailon que previamente se han esterilizado. En 6-9 días de incubación, los fibroblastos adhesivos empiezan a crecer en las aperturas de la malla y a depositarse en hebras de colágeno paralelas. La inmunofluorescencia indirecta que usa anticuerpos monoclonales mostró predominantemente colágeno de tipo I con algo de tipo III también.

Establecimiento del estroma tridimensional de fibroblastos de la piel

Los fibroblastos de la piel se aíslan mediante el picado del tejido dérmico, la tripsinización durante 2 horas, y la separación de las células en una suspensión mediante medios físicos. Se hizo crecer a los fibroblastos por confluencia en placas para cultivo tisular de Falcon de 25 cm^{2} y se alimentaron con RPMI 1640 (Sigma, MO) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), fungizona, gentamicina, y penicilina/estreptomicina. Los fibroblastos se separaron mediante tripsinización suave y las células se colocaron en mallas de filtración de nailon, las cuales son de aproximadamente 90 \mum de diámetro y se ensamblan en un tejido cuadrado con una apertura de malla de 210 \mum (Tetko, Inc., NY). La malla se pretrató en un lavado con ácido suave y se incubó en polilisina y FBS. Se vio la adherencia de los fibroblastos a las 3 horas, y los fibroblastos empezaron a estirarse a través de las aperturas de la malla a los 5-7 días de la inoculación inicial. Estos fibroblastos eran activos metabólicamente, secretaron matriz extracelular, y formaron rápidamente un equivalente dérmico que consiste en fibroblastos activos y colágeno. La figura 1 es una micrografía electrónica de barrido que representa la unión de los fibroblastos y los procedimientos de extensión celular a través de la apertura de la malla.

Establecimiento de los cultivos estromales tridimensionales de médula ósea

La médula ósea se aspiró de múltiples lugares de la cresta ilíaca posterior de voluntarios adultos hematológicamente normales después de haberse obtenido el consentimiento informado. Los especímenes se recogieron en tubos heparinizados y se suspendieron en 8 ml de medio RPMI 1640 que se acondicionó con 10% de FBS y 5-10% de HS y se suplementó con hidrocortisona, fungizona y estreptomicina. Los grupos de células se disgregaron y dividieron en porciones alícuotas de 5 x 10^{6} células nucleadas.

Se usó una pantalla de filtración de nailon (#3-210/36, Tetko Inc., NY) como estructura tridimensional para soportar todos los cultivos de células estromales descritos en los ejemplos posteriores. La pantalla consistía en fibras, que eran de 90 \mum de diámetro, ensambladas en un patrón de tejido cuadrado con aperturas de 210 \mum. Las células estromales se inocularon usando los protocolos descritos en la sección 6.1. La adherencia y crecimiento posterior de los elementos estromales se monitorizó usando un microscopio de contraste de fase invertido y un microscopio electrónico de barrido (SEM).

Preparación de la matriz estromal tridimensional de epitelio de la mucosa oral

Las muestras del tejido de la mucosa oral se obtuvieron de especímenes de ortodoncia quirúrgicos. El tejido se lavó tres veces con MEM fresco que contiene antibióticos (2 ml de solución antimicótica antibiótica de GIBCO, cat. #600-5240 AG; y 0,01 ml de solución de gentamicina de GIBCO cat. #600-5710 AD por cada 100 cc de MEM), cortado en trozos pequeños, lavados luego con EDTA 0,02% (peso/volumen). Se añadió tripsina 0,25% (en PBS sin Ca^{+++} o Mg^{++}; después de unos segundos, los trozos de tejido se extrajeron y se colocaron en tripsina fresca (en PBS sin Ca^{+++} o Mg^{++}) y se refrigeraron a 4ºC durante la noche. Se extrajeron los tejidos y se colocaron en una solución de tripsina fresca, y se agitaron suavemente hasta que pareció que las células formaban una suspensión de células únicas. La suspensión de células únicas se diluyó luego en MEM que contiene 10% de suero bovino fetal inactivado con calor y centrifugado a 1400x g durante 7 minutos. Se decantó el sobrenadante y el sedimento que contiene las células epiteliales de la mucosa se colocó en medio de siembra. El medio consistía en DMEM con 2% de Ultrosen G, 1 X L-glutamina, 1 X aminoácidos no esenciales, penicilina y estreptomicina. Las células se sembraron en una estructura tridimensional. El cultivo estromal tridimensional se generó usando fibroblastos orales y trozos de pantalla de filtración de nailon de 8 mm x 45 mm (#3-210/36, Tetko Inc., NY). La malla se bañó en ácido acético 0,1 M durante 30 minutos y se trató con una suspensión de polilisina 10 mM durante 1 hora. Las mallas se colocaron en una placa de petri estéril y se les inocularon 1 X 10^{6} fibroblastos orales recogidos como se describe anteriormente en medio DMEM completo. Después de 1-2 horas de incubación a 5% de CO_{2} las mallas se colocaron en un matraz para cultivo tisular de Corning de 25 cm^{2}, puestas a flote con 5 ml de medio adicionales, y se les permitió alcanzar la subconfluencia, alimentándose a intervalos de 3 días. Los cultivos se mantuvieron en medio DMEM completo a 37ºC y 5% de CO_{2} en una atmósfera húmeda y se alimentaron con medio fresco cada
3 días.

Establecimiento del cultivo tridimensional de células estromales endoteliales de pequeños vasos

Las células endoteliales de pequeños vasos aisladas del cerebro de acuerdo con el método de Larson y col., 1987, Microvasc. Res. 34:184 se cultivaron in vitro usando matraces para cultivo tisular T-75. Las células se mantuvieron con una combinación de medio modificado de Dulbecco/medio Hams F-12 (la solución está disponible como mezcla 1:1). El medio se suplementó con 20% de suero de ternero fetal inactivado con calor (FCS), glutamina, y antibióticos. Las células se sembraron en concentración de 1 x 10^{6} células por lado, y alcanzaron el estado de confluencia en una semana. Las células se revisaron una vez a la semana y, además, se alimentaron una vez a la semana con DMEM/Hams F-12 que contiene FCS, glutamina y antibióticos como se ha descrito. Para revisar las células, se aclararon los matraces dos veces con 5 ml de PBS (sin Ca^{+++} o Mg^{++}) y se tripsinizaron con 3 ml de tripsina 0,05% y EDTA 0,53 mM. Las células sedimentaron, se resuspendieron y se probó su viabilidad mediante exclusión con azul de tripano, se sembraron y alimentaron con 25 ml del anteriormente mencionado medio suplementado DMEM/Hams F-12. Se usa un ensayo con antígenos relacionados con el factor VIII, Grulnik y col., 1977, Ann. Int. Med. 86:598-616, para identificar positivamente las células endoteliales, y se usó la tinción de plata para identificar los complejos de uniones estrechas, específicos sólo del endotelio de pequeño vaso.

La malla de la pantalla de filtración de nailon (#3-210/36, Tetko Inc., NY) se preparó esencialmente como se describe anteriormente. La malla se bañó en una solución de ácido acético (1 ml de ácido acético glacial más 99 ml de agua destilada) durante treinta minutos, se aclaró con cantidades abundantes de agua destilada y luego se metió en el autoclave. Las mallas se recubrieron con 6 ml de suero bovino fetal por malla de 8 x 8 cm y se incubaron toda la noche. Las mallas luego se apilaron, en tres alturas, y se sembraron 3 x 10^{7} células endoteliales de pequeño vaso (cultivadas como se ha descrito) en la pila, y se incubaron durante tres horas a 37ºC a 5% de CO_{2} en una atmósfera húmeda. Las mallas inoculadas se alimentaron con 10 ml de medio DMEM/Hams F-12 cada 3-4 días hasta que se alcanzó la completa confluencia (aproximadamente en dos semanas).

Establecimiento del cultivo celular estromal tridimensional de condrocitos

El cartílago se segó de las superficies articulares de las uniones humanas. Los trozos de cartílago se digirieron con colagenasa (0,2% peso/volumen) en medio completo (DMEM con 10% de suero bovino fetal, glutamina, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, 50 \mug/ml de ascorbato y 35 \mug/ml de gentamicina) durante 20 horas a 37ºC. Los condrocitos liberados se hacen girar, se resuspenden en medio completo, se cuentan y se colocan 1 x 10^{6} por matraz T-150. Las células se revisaron de forma rutinaria a la confluencia (cada 5-7 días).

Se esterilizó una malla de ácido poliglicólico (1 mm de diámetro x 2 mm de espesor) mediante óxido de etileno o tratamiento haz de electrones y se bañan durante la noche en medio completo. La malla se sembró en 6 placas con 3-4 x 10^{6} células por malla en un volumen total de 10 \muL y se incubaron durante 3-4 horas a 37ºC en un incubador de cultivos tisulares. En este momento, se añaden 5 ml de medio. La malla sembrada se incubó toda la noche. Se añadieron 5 ml de medio al día siguiente. El medio se cambió tres veces por semana hasta que se alcanzó la confluencia.

Ejemplo Composición de la matriz extracelular

La matriz extracelular se ha caracterizado por varios procedimientos analíticos para determinar su contenido de proteínas de matriz, cada valor es la media de al menos dos determinaciones independientes. La matriz contenía colágenos tipo I y tipo III, fibronectina, tenascina, glucosaminoglicanos sulfatados, decorina y otras proteínas de matriz extracelular humanas secretadas. Además, las proteínas de matriz secretadas se hallaron en toda la estructura de soporte tridimensional. La matriz extracelular contenía una cantidad de proteínas totales de 292 mg/cm^{2} \pm 0,06; la fibronectina se presentaba a 3,4 mg/cm^{2} \pm 1,2; y la tenascina a 1,7 mg/cm^{2} \pm 0,6. Tanto la fibronectina como la tenascina mostraron las distribuciones de peso molecular esperadas en inmunotransferencias.

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Contenido de colágeno de la matriz extracelular

El contenido de colágeno de la matriz extracelular se determinó usando el ensayo de Sirius Red. La unión de Sirius Red F3BA en una solución saturada de ácido pícrico se ha usado ampliamente para estimar la deposición de colágeno fibroso. Bedossa y col., 1989, Digestion 44(1):7-13; Finkelstein y col., 1990, Br. J. Ophthalmol. 74(5):280-282; James y col., 1990, Liver 10(1): 1-5. La especificidad de la unión de Sirius Red al colágeno se basa principalmente en su uso como tinción histológica. En hígados de ratas con varios grados de fibrosis colestásica, el contenido de colágeno medido mediante unión de Sirius Red muestra una fuerte correlación con el contenido de hidroxiprolina. Walsh y col., 1992, Analyt. Biochem. 203:187-190. Además, la tinción histológica con Sirius Red es birrefringente, lo que indica una unión direccional relacionada con la orientación de las fibras de colágeno. Sirius Red es conocido por unir otras proteínas aparte de los colágenos clásicos que contienen triples hélices similares al colágeno, como el componente C1 del complemento. También se han hallado algunas uniones escasas a la albúmina sérica, aunque los experimentos de control que usan albúmina sérica bovina estándar no muestran interferencias con el ensayo. Se estima que la interferencia representa menos del 2% de la señal de colágeno de la matriz extracelular y el uso del ensayo de Sirius Red proporciona un procedimiento reproducible para medir colágenos. La matriz extracelular contenía un contenido de colágeno de 0,61 mg/cm^{2} \pm 0,09. Además, los colágenos I y III mostraron las distribuciones de peso molecular deseadas en inmunotransferencias.

Fibras de colágeno visualizadas por microscopio electrónico

El colágeno derivado del tejido dérmico crecido in vitro y el colágeno derivado de una muestra dérmica humana de adulto normal se procesaron y visualizaron mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM). Brevemente, los respectivos colágenos se pesaron y colocaron en un tubo de centrifugación de 50 ml estéril con 30 ml de tampón Tris 0,05 M, pH 8,0. Después de mezclarse durante dos horas en un vibrador, se extrajo el tampón Tris y el espécimen se colocó en un cilindro de homogenización junto con 30 ml de tampón Tris 0,05 M fresco. La mezcla se homogeneizó durante 30 segundos en tampón solo y después se rompe durante otros 30 segundos tras la adición de un agente dispersante como se describe en las patentes de EEUU nº 4969912 y 5332802. La temperatura se mantuvo a 5-10ºC durante el procedimiento de disrupción mecánica. El agente dispersante se añadió en concentración de 0,05% (peso húmedo del colágeno). La preparación homogeneizada se centrifugó a 3500 rpm durante 6 minutos para separar el material colágeno dispersado del material aún no dispersado. El residuo no dispersado se trató otra vez con agente dispersante al 0,05% (peso húmedo del colágeno) y se homogeneizó durante otros 30 segundos para romperse. La dispersión se centrifugó otra vez para recuperar el material colágeno dispersado que se añadió a la primera recupera-
ción.

La dispersión de colágeno se filtró a través de un filtro de 100 micras, se centrifugó a 3500 rpm y el sedimento se lavó 3 veces con tampón fosfato 0,004 M, pH 7,4. La última centrifugación se hizo a 10000 rpm para aglutinar el sedimento de colágeno. Las muestras se recogieron luego para el TEM. Como se muestra en las figuras 2A-D, las fibras de colágeno aisladas de la matriz extracelular preparada de tejido dérmico crecido in vitro (figuras 2A-B) o de dermis humana adulta normal (figuras 2C-D) parecen idénticas en cuanto a las fibras de colágeno intacto con el bandeado de colágeno típico y la periodicidad normal en ambas preparaciones.

Glucosaminoglicanos presentes en la matriz extracelular

Se ha demostrado que los glucosaminoglicanos desempeñan varios papeles estructurales y funcionales en el cuerpo y su presencia en la matriz extracelular secretada es importante. La tabla II enumera varios ejemplos de glucosaminoglicanos que se hallan en la matriz extracelular así como su importancia funcional en la dermis normal.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA II

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Además se halló que la matriz extracelular contiene un total de 2,8 mg/cm^{2} \pm 0,1 de glucosaminoglicanos.

Factores de crecimiento presentes en la matriz extracelular

Las células que producen y depositan la matriz extracelular expresan también varios factores de crecimiento diferentes. Los factores de crecimiento son importantes en la matriz extracelular por dos razones. Durante el crecimiento y el depósito de la matriz extracelular, los factores de crecimiento segregados de forma natural ayudan a controlar la proliferación y actividad celular. Además, los factores de crecimiento permanecen unidos a la matriz extracelular. Se han determinado varios factores de crecimiento que se expresan durante el depósito de la matriz.

Se ha evaluado la expresión de los factores de crecimiento mediante la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) del ARN total. Brevemente, se extrajo el ARN de las células en crecimiento mediante una precipitación SDS y un procedimiento de partición con disolvente orgánico. El ARN se transcribió usando una transcriptasa inversa superior e iniciadores hexámeros al azar. El mismo grupo de transcriptasa inversa se usó para la detección de todos los factores de crecimiento. La PCR se realizó bajo condiciones estándar, usando 4 \muL de transcriptasa inversa, que corresponde a 200 ng de ARN en un volumen total de 20 \muL.

Basándose en este ensayo, están presentes FGF ácidos y básicos, TGF-\alpha y TGF-\alpha\beta, y transcripciones de ARNm de KGF así como otros como se muestra en la tabla III, que incluyen PDGF, anfirregulina, HBEGF, IGF, SPARC y VEGF. De éstos, se piensa que PDGF y TGF-\beta3 están involucrados en la regulación de la proliferación celular y el depósito de la matriz en el cultivo, ya que TGF-\beta1, HBEGF, KGF, SPARC, VEGF y decorina se depositan en la matriz. La anfirregulina, IGF-1, IGF-2 e IL-1 no se expresaron a la sensibilidad usada en estos experimentos.

TABLA III

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Claims (5)

1. Un procedimiento para la producción de una estructura tridimensional recubierta por matriz extracelular secretada de forma natural que comprende las etapas de:

(a)

cultivo de células en una estructura tridimensional bajo condiciones favorables para el crecimiento celular durante un período de tiempo predeterminado de modo que se secreta una matriz extracelular en la estructura inoculada que crea una estructura recubierta;

(b)

muerte de las células y

(c)

extracción de las células y los restos celulares.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la estructura tridimensional es un material seleccionado del grupo que consiste en poliamida, poliéster, poliestireno, polipropileno, poliacrilatos, compuestos de polivinilo, policarbonato, politetrafluoretileno, termanox, nitrocelulosa, algodón, ácido poliglicólico, material de sutura de tripa de gato, celulosa, gelatina, chitosán, ácido hialurónico y dextrano.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la estructura tridimensional tiene espacios de poro de aproximadamente 150 \mum a aproximadamente 220 \mum.

4. El procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la matriz extracelular se secreta por células específicas de tejido seleccionadas del grupo que consiste en fibroblastos, osteoblastos, odontoblastos, condrocitos, células epiteliales, células del músculo liso, células de la retina, células endoteliales, células estromales o combinaciones de las mismas.

5. Un procedimiento para la producción de una matriz extracelular secretada de forma natural que comprende llevar a cabo las etapas (a), (b) y (c) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y luego (d) recoger la matriz extracelular depositada en la estructura recubierta.