DE69634454T2

DE69634454T2 - Zusammensetzungen und Verfahren mit Bezug auf eine auf natürliche Weise sekretierte Matrix

Info

Publication number: DE69634454T2
Application number: DE69634454T
Authority: DE
Inventors: K. Gail NAUGHTON
Original assignee: Smith and Nephew PLC; TJ Smith and Nephew Ltd
Current assignee: Smith and Nephew PLC; TJ Smith and Nephew Ltd
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: JP3709487B2; JPH11507558A; WO1996039101A1; US5830708A; EP0967934B1; ATE290350T1; AU6260996A; EP0967934A1; NZ311313A; CA2223892A1; ES2238076T3; DE69634454D1; AU708090B2; EP0967934A4; KR19990022216A

Description

1. EINLEITUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung und Reparatur von Weichgewebe und Hautdefekten wie etwa Falten und Narben. Genauer gesagt bezieht sich die Erfindung auf eine injizierbare Zusammensetzung aus Komponenten der menschlichen extrazellulären Matrix und Verfahren zum Präparieren und Verwenden derselben. Das injizierbare Präparat wird aus dreidimensionalen lebendigen stromalen Geweben erhalten, die in vitro präpariert werden.
2. ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Die Idee der Verwendung eines injizierbaren Materials zur Augmentation und Reparatur von Weichgewebe wurde kurz nach der Erfindung der Nadel zur subkutanen Injektion entwickelt. Zur Korrektur von Weichgewebe und Hautdefekten sind verschiedene Produkte in den menschlichen Körper injiziert worden, einschließlich Paraffin, Petrolatum, Pflanzenölen, Lanolin, Bienenwachs und Silikon. Injizierbares flüssiges Silikon ist in großem Umfang verwendet worden, doch aufgrund langfristiger Nebenwirkungen wie etwa Knötchen, rezidivierender Zellulitis und Hautgeschwüren, welche nun genauer verfolgt werden, ist die Verwendung von injizierbarem Silikon im Rückgang begriffen. Im Staat Nevada ist es zudem eine Straftat, injizierbares Silikon für Menschen zu verwenden. Orange, Skin and Allergy News (1992), Bd. 23, Nr. 6, S. 1. In neuerer Zeit hat Rinderkollagen als injizierbares Material zur Augmentation von Weichgewebe weite Anwendung gefunden. Kollagen ist das extrazelluläre Hauptstrukturprotein des tierischen Körpers.
Mindestens vierzehn Typen von Säugetierkollagen sind beschrieben worden. Ihr gemeinsames Kennzeichen ist eine dreisträngige Helix, die aus drei Polypeptidketten, Alpha-Ketten genannt, besteht. Alle Alpha-Ketten weisen die gleiche Konfiguration auf, unterscheiden sich aber in der Zusammensetzung und der Sequenz ihrer Aminosäuren. Obwohl dies zu unterschiedlichen Typen von Alpha-Ketten führt, weisen sie doch alle in jeder dritten Position der Aminosäuresequenz Glycin auf. Das Glycin in jeder dritten Position ermöglicht die helikale Struktur der Alpha-Ketten. Typ-I-Kollagen ist aus zwei Alpha-Ketten und einer Alpha₂-Kette zusammengesetzt und das extrazelluläre Hauptmaterial von Haut, Sehnen und Knochen. Wenn Kliniker von „Kollagen" reden, meinen sie normalerweise Typ-I-Kollagen. Siehe Tabelle I, unten, für eine detaillierte Auflistung von Kollagentypen I–V und den Geweben, in denen sie vorkommen.
Kollagen ist als Implantatmaterial verwendet worden, um hartes oder weiches Bindegewebe wie etwa Haut, Sehnen, Knorpel, Knochen und Interstitium zu ersetzen oder zu verstärken. Zusätzlich dazu sind Kollagenimplantate über eine Reihe von Jahren für kosmetische Zwecke verwendet worden, da Kollagen das Einwachsen von Zellen an der Platzierungsstelle fördern kann. Frühe Kollagenimplantate waren häufig feste Kollagenmassen, die durch chemische Mittel, Strahlung oder andere Mittel quervernetzt wurden, um die mechanischen Eigenschaften zu verbessern, die Immunogenität zu verringern und/oder die Beständigkeit gegen Resorption zu erhöhen. Das benutzte Kollagen lag in einer Vielfalt von Formen vor, einschließlich quervernetzten und nicht quervernetzten fibrillären Kollagenen, Gelatinen und dergleichen, und wurde je nach Verwendung gelegentlich mit verschiedenen anderen Komponenten wie etwa Gleitmitteln, osteogenetischen Faktoren und dergleichen kombiniert. Ein großer Nachteil von festen, quervernetzten Kollagenimplantaten ist die Notwendigkeit chirurgischer Implantation mittels Einschnitt.
Zusätzlich sind der Mangel an Verformbarkeit und Elastizität andere Nachteile fester Kollagenimplantate.
Oliver et al., Clinical Orthopaedics & Related Research (1976) 115: 291–302; Br. J. Exp. Path. (1980) 61: 544–549; und Conn. Tissue Res. (1981) 9: 59–62 beschreiben Implantate, die durch Behandlung der Haut mit Trypsin, gefolgt von Quervernetzung mit einem Aldehyd, gefertigt wurden. Die resultierenden festen Kollagenimplantate wahrten Berichten zufolge ihre ursprüngliche Masse nach anhaltender Implantation. Ein Hauptproblem bei derartigen festen Implantaten liegt darin, dass sie chirurgisch implantiert werden müssen. Andere Nachteile liegen darin, dass sie nicht so verformbar wie injizierbare Implantate sind und restliches Glutaraldehyd bewirken kann, dass das Implantat seine Elastizität durch fortdauernde Quervernetzung in situ verliert.
Schechter et al., Br. J. Plas. Surg. (1975) 28: 198–202 offenbaren mit Glutaraldehyd quervernetzte Haut, die nach der Quervernetzung in L-Alanin getränkt wurde. Der Artikel postuliert, dass das Aussetzen der Haut gegenüber L-Alanin restliche reaktive Gruppen des Aldehyds blockierte, wodurch die Freisetzung toxischer Moleküle, die von derartigen Gruppen erzeugt werden, verhindert wurde.
Eine Alternative zu chirurgisch implantiertem festem Kollagenmaterial ist in U.S. Pat. Nr. 3,949,073 offenbart. U.S. Patent Nr. 3,949,073 beschreibt die Verwendung von Atelopeptid-Lösungen von Rinderkollagen als injizierbares Implantatmaterial zur Augmentation von Weichgewebe. Gemäß dem Patent wird das Rinderkollagen vor der Implantation rekonstituiert und bildet nach Implantation eine fibröse Gewebemasse. Das Patent empfiehlt die Zugabe von Partikeln unlöslicher Rinderkollagenmikrofibrillen, um die Schrumpfung der an der Augmentationsstelle gebildeten fibrösen Masse einzuschränken. Die gewerbliche Ausführungsform des in dem Patent beschriebenen Materials ist aus rekonstituiertem Atelopeptid-Rinderkollagen in Kochsalzlösung, die eine geringe Menge an lokalem Anästhetikum enthält, zusammengesetzt. Obwohl dieses Implantat wirksam ist, schrumpft sein Volumen nach der Implantation dennoch, hauptsächlich aufgrund der Absorption seiner Flüssigkeitskomponente in den Körper. Wenn die Volumenstetigkeit von wesentlicher Bedeutung ist, werden daher eine zusätzliche Injektion oder zusätzliche Injektionen ergänzenden Implantatmaterials erforderlich. Diese spezifische Zusammensetzung weist viele schwerwiegende Nachteile auf, z.B. stammt das Kollagen vom Rind und nicht vom Menschen, und der Präparationsvorgang dauert nicht nur lange und ist teuer, sondern erfordert auch den Zusatz von Mikrofibrillen.
U.S. Patent Nr. 4,424,208 beschreibt eine injizierbare Dispersion von quervernetztem Atelopeptid-Rinderkollagen und rekonstituierten Atelopeptid-Rinderkollagenfasern in einem wässrigen Träger, die gegenüber dem Material aus U.S. Pat. Nr. 3,949,073 eine verbesserte Volumenstetigkeit aufzeigte.
U.S. Patent Nr. 4,582,640 offenbart ein gegenüber U.S. Pat. Nr. 3,949,073 und 4,424,208 verbessertes injizierbares Implantat, dessen Verbesserung in einer verbesserten Volumenstetigkeit und Beständigkeit gegenüber physikalischer Verformung, in einer im Vergleich zur Dispersion von U.S. Pat. Nr. 4,424,208 verbesserten Injizierbarkeit und darin, dass das Rinderkollagen im Vergleich zu den in U.S. Pat. Nr. 4,424,208 gefundenen zwei physikalischen Formen nur eine einzelne physikalische Form von Kollagen enthält, besteht.
U.S. Patent Nr. 4,803,075 beschreibt Rinderkollagenzusammensetzungen, die ein Gleitmittelmaterial zur Verbesserung der Injizierbarkeit durch Nadeln mit engem Durchmesser zur Reparatur von Weichgewebe einschließen.
Trotz der Vorteile und der Gesamtnützlichkeit der oben offenbarten injizierbaren Kollagenimplantatmaterialien sind Probleme aufgetreten, die mit der Herstellung und Injektion der Materialien verbunden sind. Für die Weichgewebereparatur sind zum Beispiel häufig Suspensionen fibrillären Kollagens verwendet worden, indem die Zusammensetzung durch eine dünne Kanüle in eine Behandlungsstelle injiziert wurde. Die Verwendung fibrillären Kollagens als primäres Matrixmaterial in injizierbaren Implantatzusammensetzungen für Weich- und Hartgewebe weist mehrere Beschränkungen auf. Die Präparation von zur Verwendung beim Menschen geeignetem fibrillären Kollagen ist relativ zeitaufwendig und teuer. Im Besonderen ist die vollständige Entfernung von kontaminierenden und möglicherweise immunogenen Substanzen zur Herstellung von Atelokollagen eine relativ komplexe und teure Prozedur. Zudem sind die Persistenz, Formbeständigkeit, Kohäsion, Stabilität, Elastizität, Zähigkeit und Intrudierbarkeit der Zusammensetzungen des fibrillären Kollagens nicht optimal.
Zusätzlich zu den mit der Herstellung und Injektion des Kollagenimplantatmaterials verbundenen Problemen gibt es auch reichlich Probleme bei der eigentlichen Anwendung der oben erwähnten patentierten injizierbaren Implantate. So muss zum Beispiel, da die obigen patentierten Injektionsmittel Kollagen aus xenogenen Quellen, überlicherweise Rinderkollagen, beziehen, das Kollagen modifiziert werden, um seine Immunogenität zu reduzieren. Selbst bei modifiziertem Kollagen wirkt das Implantatmaterial noch immer recht immunogen auf einige Personen, die entweder schon von Natur aus allergisch sind oder im Lauf der Zeit eine allergische Reaktion gegen das Rinderkollagen entwickeln. Aufgrund dieser allergischen Reaktionen können die oben beschriebenen injizierbaren Kollagenimplantate an viele Personen nicht vergeben werden, während andere darauf beschränkt sind, nur drei Injektionen pro Jahr zu empfangen. Schwere allergische Reaktionen schließen Symptome rheumatoider Arthritis ein, während weniger schwere Reaktionen Röte und Anschwellen der Injektionsstelle einschließen, was zu einer dauerhaften Vernarbung führen kann. Aufgrund dieser schweren Nebenwirkungen werden die oben beschriebenen Kollageninjektionsmittel nicht mehr zur Lippenaugmentation verwendet. Ferner erscheinen die mit der Injektion von xenogenem Kollagen verbundenen Probleme so unlösbar, dass anstelle der Injektion von Kollagen biokompatible keramische Matrizen injiziert worden sind, um ähnliche Resultate zu erzielen, wie in U.S. Patent Nr. 5,204,382 beschrieben.
Zusammenfassend sei gesagt, dass aufgrund der Unzulänglichkeiten der oben beschriebenen injizierbaren Zusammensetzungen zur Reparatur von Weichgewebedefekten wie etwa mangelnder Persistenz, der Notwendigkeit wiederholter Injektionen und ernster Bedenken hinsichtlich adverser Reaktionen neuere injizierbare Materialien zur Augmentation von Weichgewebe benötigt werden.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf injizierbare Materialien zur Augmentation von Weichgewebe und auf Verfahren zur Verwendung und Fertigung derselben, welche die Unzulänglichkeiten injizierbaren Rinderkollagens und anderer injizierbarer Materialien des Stands der Technik, einschließlich Silikons, überwinden. Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten injizierbaren Materialien beinhalten Präparate der auf natürliche Weise abgesonderten extrazellulären Matrix sowie Präparate, die von auf natürliche Weise abgesonderter extrazellulärer Matrix stammen. Diese Präparate sind biokompatibel, biologisch abbaubar und dazu in der Lage, die Ablagerung von Bindegewebe, Angiogenese, Reepithelialisation und Fibroplasie zu fördern, was bei der Reparatur von Haut- und anderen Gewebedefekten nützlich ist. Diese Präparate der extrazellulären Matrix können verwendet werden, um Gewebedefekte durch Injektion an der Stelle des Defektes zu reparieren.
Die injizierbaren Präparate der vorliegenden Erfindung weisen gegenüber herkömmlichen injizierbaren Kollagenpräparaten, die zur Reparatur von Hautdefekten verwendet werden, viele Vorteile auf. Die Präparate der extrazellulären Matrix der vorliegenden Erfindung enthalten nur menschliche Proteine, so dass die Gefahr einer Immunantwort aufgrund fremder Proteine oder Peptide reduziert ist, insbesondere die Art von Immunantwort, die bei Rinderkollagen, das in herkömmlichen injizierbaren Kollagenpräparaten zu finden ist, beobachtet wird. Zusätzlich dazu sollten die injizierten Präparate der vorliegenden Erfindung größere Persistenz aufweisen, und selbst wenn mehrfache Injektionen erforderlich sind, sollten die Injektionen aufgrund der fehlenden Immunogenität nicht unter die „nicht mehr als drei Injektionen pro Jahr"-Regel für auf Rinderkollagen basierende Präparate fallen. Ein anderer von der vorliegenden Erfindung gebotener Vorteil liegt darin, dass die Präparate nativer extrazellulärer Matrix eine Mischung von Proteinen der extrazellulären Matrix enthalten, welche die Zusammensetzungen physiologisch normaler Bedingungen recht genau imitiert; beispielsweise liegen in einer extrazellulären Matrix, die aus Dermiszellen gewonnen wurde, Kollagene des Typs I und III, Hyaluronsäure sowie verschiedene Glykosaminoglykane und natürliche Wachstumsfaktoren vor. Viele dieser Proteine der extrazellulären Matrix und Wachstumsfaktoren sind im großen Umfang untersucht worden, und es wurde gezeigt, dass sie für die Wundheilung und Gewebewiederherstellung von entscheidender Bedeutung sind.
In einem anderen Aspekt der Erfindung können die Präparate in stark verbesserten Systemen zur In-vitro-Gewebekultur verwendet werden. In dieser Ausführungsform können dreidimensionale Rahmen, die mit einer auf natürliche Weise abgesonderten extrazellulären Matrix beschichtet sind, verwendet werden, um Zellen zu kultivieren, die die Anhaftung an einer Stütze erfordern um zu wachsen, aber die nicht an herkömmlichen Gewebekulturbehältern anhaften. Zusätzlich zur Kultivierung von Zellen auf einem beschichteten Rahmen kann die von den Zellen auf den Rahmen abgesonderte extrazelluläre Matrix gesammelt und verwendet werden, um Behälter zur Verwendung in der Gewebekultur zu beschichten. Die als Grundsubstrat dienende extrazelluläre Matrix kann es Zellen, die normalerweise nicht an herkömmliche Gewebekulturschalengrundsubstrate anhaften können, ermöglichen, anzuhaften und nachfolgend zu wachsen.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung richtet sich auf ein neuartiges Verfahren zum Bestimmen der Fähigkeit einer bestimmten Zelle zur Zelltaxis. Das Verfahren involviert das Beimpfen eines Endes eines dreidimensionalen Rahmens, der mit einer nativen extrazellulären Matrix beschichtet ist, mit dem fraglichen Zelltyp und das Messen der von der Zelle über den Rahmen zurückgelegten Entfernung im Zeitverlauf. Da die extrazelluläre Matrix von den Zellen auf natürliche Weise auf den Rahmen abgesondert wird, ist sie ein ausgezeichnetes In-vitro-Äquivalent für die im Körper zu findende extrazelluläre Matrix. Ein derartiger Assay kann zum Beispiel darüber aufklären, ob isolierte Tumorzellen metastasisch sind oder ob gewisse Immunzellen über den Rahmen migrieren oder sogar chemisch taxieren können, was angibt, dass die Zelle eine derartige Fähigkeit zur Zelltaxis aufweist.
3.1. DEFINITIONEN UND ABKÜRZUNGEN
Die hier verwendeten folgenden Begriffe weisen die angegebene Bedeutung auf:
Adhärenzschicht:

Zellen, die direkt an dem dreidimensionalen Rahmen anhaften oder indirekt damit verbunden sind, indem sie an Zellen anhaften, die ihrerseits direkt an der Matrix anhaften.

Pharmazeutisch akzeptabler Träger:

ein wässriges Medium mit physiologischer Isotonie und physiologischem pH-Wert, das andere Elemente wie etwa lokale Anästhetika und/oder flüssige Gleitmittel enthalten kann.

Stromale Zellen:

Fibroblasten mit oder ohne andere Zellen und/oder Elemente, die in lockerem Bindegewebe zu finden sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Endothelzellen, Perizyten, Makrophagen, Monozyten, Plasmazellen, Mastzellen, Adipozyten, Chondrozyten usw.

Dreidimensionaler Rahmen:

eine dreidimensionale Stütze, die aus beliebigem Material und/oder beliebiger Form zusammengesetzt ist, das/die es ermöglicht, (a) dass Zellen an ihm/ihr anhaften (oder das/die modifiziert werden kann, so dass Zellen an ihm/ihr anhaften können), und (b) dass Zellen in mehr als einer Schicht wachsen. Diese Stütze wird mit stromalen Zellen beimpft, um die lebende stromale Matrix zu bilden.

Lebendes stromales Gewebe:

ein dreidimensionaler Rahmen, der mit stromalen Zellen beimpft worden ist. Ob konfluent oder subkonfluent, erfindungsgemäße stromale Zellen wachsen und teilen sich fortlaufend. Das in vitro präparierte lebende stromale Gewebe ist die Quelle der Proteine der extrazellulären Matrix, die in den injizierbaren Formulierungen der Erfindung verwendet werden.

Die folgenden Abkürzungen weisen die angegebene Bedeutung auf:

EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
FBS: fötales Rinderserum
HBSS: Hanks ausgeglichene Salzlösung
HS: Pferdeserum
MEM: Minimalmedium
PBS: phosphatgepufferte Kochsalzlösung
RPMI: 1640 Roswell Park Memorial Institute Medium Nr. 1640 (GIBCO, Inc., Grand Island, N.Y.)
REM: Rasterelektronenmikroskopie

Die vorliegende Erfindung kann unter Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung, die Beispiele spezifischer Ausführungsformen und die angehängten Figuren, welche nur zum Zweck der Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung dargeboten werden, vollständiger verstanden werden.
4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. 1 ist eine Rasterelektronenaufnahme, die die Fibroblastenanhaftung an der dreidimensionalen Matrix und die Ausdehnung zellulärer Vorgänge über die Netzöffnung abbildet. Die Fibroblasten sondern aktiv Matrixproteine ab und befinden sich in dem angemessenen Stadium der Subkonfluenz, das vor der Beimpfung mit gewebespezifischen Zellen erhalten werden sollte.
2A–D. 2A–D sind Transmissionselektronen-Aufnahmen von Kollagen, das aus der extrazellulären Matrix, welche von in vitro gezüchtetem Dermisgewebe (2A–B) oder aus einer normalen Dermisprobe eines adulten Menschen (2C–D) präpariert wurde, isoliert wurde.
5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung involviert die Präparation und Verwendung einer injizierbaren Zusammensetzung der extrazellulären Matrix zur Behandlung von Hautdefekten. Die Proteine der extrazellulären Matrix stammen von einem lebenden stromalen Gewebe, das in vitro durch das Züchten von stromalen Zellen auf einem dreidimensionalen Rahmen präpariert wurde, was in einem Vielschichtzellkultursystem resultierte. Bei herkömmlichen Gewebekultursystemen werden die Zellen in einem Monolayer gezüchtet. Auf einer dreidimensionalen Rahmenstütze gemäß der vorliegenden Erfindung gezüchtete Zellen wachsen in mehreren Schichten, wobei sie eine zelluläre Matrix bilden. Dieses Matrixsystem gleicht sich im größeren Maß an physiologische Bedingungen an, die in vivo zu finden sind, als zuvor beschriebene Monolayer-Gewebekultursysteme. Das dreidimensionale Zellkultursystem kann zur Vermehrung unterschiedlicher Typen von stromalen Zellen und zur Bildung einer Reihe von unterschiedlichen stromalen Geweben verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Dermis, Knochenmarkstroma, Gliagewebe, Knorpel, um nur einige zu nennen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet das zuvor eingerichtete lebende stromale Gewebe stromale Zellen, die auf einem dreidimensionalen Rahmen oder Netzwerk gezüchtet werden. Die stromalen Zellen können Fibroblasten mit oder ohne zusätzliche Zellen und/oder Elemente, die hier vollständiger beschrieben werden, beinhalten. Die Fibroblasten und anderen Zellen und/oder Elemente, die das Stroma ausmachen, können von fötaler oder adulter Abkunft sein und können von zweckmäßigen Quellen wie etwa Haut, Leber, Pankreas usw. stammen. Derartige Gewebe und/oder Organe können durch eine angemessene Biopsie oder bei Autopsie erhalten werden. Tatsächlich können Leichenorgane verwendet werden, um eine großzügige Versorgung mit stromalen Zellen und Elementen bereitzustellen.
Nachdem die stromalen Zellen auf den dreidimensionalen Rahmen geimpft worden sind, vermehren sie sich auf dem Rahmen und produzieren Wachstumsfaktoren, Regulationsfaktoren und Proteine der extrazellulären Matrix, die auf der Stütze abgelagert werden. Das lebende stromale Gewebe unterhält die aktive Vermehrung der Kultur für lange Zeitspannen. Wachstums- und Regulationsfaktoren können zu der Kultur hinzugegeben werden, sind aber nicht nötig, da sie von der stromalen Stützmatrix produziert werden.
Die auf natürliche Weise abgesonderte extrazelluläre Matrix wird von dem dreidimensionalen Rahmen gesammelt und mit einem pharmazeutisch akzeptablen wässrigen Träger weiterverarbeitet und zur genauen Platzierung des Biomaterials in Gewebe wie etwa der Gesichtsdermis in einer Spritze platziert.
Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung, dass während des Wachstums menschlicher stromaler Zellen auf einem biologisch abbaubaren oder einem nicht biologisch abbaubaren dreidimensionalen Stützrahmen die Zellen auf dem dreidimensionalen Stützrahmen eine menschliche extrazelluläre Matrix synthetisieren und ablagern, wie sie in normalem menschlichen Gewebe hergestellt wird. Die extrazelluläre Matrix wird lokal von Zellen abgesondert und bindet nicht nur Zellen und Gewebe aneinander, sondern beeinflusst auch die Entwicklung und das Verhalten der Zellen, die sie berührt. Die extrazelluläre Matrix enthält verschiedene faserbildende Proteine, die in einem aus einem Netzwerk von Glykosaminoglykanketten zusammengesetzten hydratisierten Gel miteinander verwebt sind. Die Glykosaminoglykane sind eine heterogene Gruppe langer, negativ geladener Polysaccharidketten, die (mit der Ausnahme von Hyaluronsäure) kovalent an Protein gebunden sind, um Proteoglykanmoleküle zu bilden.
Die faserbildenden Proteine bestehen als zwei funktionale Typen: vornehmlich strukturell (Kollagene und Elastin) und vornehmlich adhäsiv (wie etwa Fibronektin und Laminin). Die fibrillären Kollagene (Typen I, II und III) sind seilartige, dreisträngige Helixmoleküle, die sich zu langen, kabelartigen Fibrillen in dem extrazellulären Raum zusammenlagern; diese wiederum können sich zu einer Vielfalt hochgradig geordneter Anordnungen gruppieren. Typ-IV-Kollagenmoleküle gruppieren sich zu einem lagenartigen Netz, das den Kern jeder Basallamina bildet. Elastinmoleküle bilden ein umfangreiches quervernetztes Netzwerk von Fasern und Lagen, die sich strecken und zurückspringen können, wodurch sie der Matrix Elastizität verleihen. Fibronektin und Laminin sind Beispiele großer adhäsiver Glykoproteine in der Matrix; Fibronektin ist in Bindegeweben weit verbreitet, wohingegen Laminin hauptsächlich in Basallaminae zu finden ist. Mittels ihrer mehreren Bindungsdomänen tragen derartige Proteine dazu bei, dass Zellen an der extrazellulären Matrix kleben und von ihr organisiert werden.
Zum Beispiel enthält eine auf natürliche Weise abgesonderte menschliche dermale extrazelluläre Matrix Kollagene des Typs I und III, Fibronektin, Tenascin, Glykosaminoglykane, saure und basische FGF, TGF-α und TGF-β, KGF, Decorin und verschiedene andere abgesonderte Proteine der menschlichen dermalen Matrix. Als auf natürliche Weise abgesonderte Produkte werden die verschiedenen Proteine der extrazellulären Matrix in den Mengen und Verhältnissen hergestellt, die denen ähneln, welche in vivo bestehen. Zudem unterhält das Wachstum der stromalen Zellen in drei Dimensionen die aktive Vermehrung von Zellen in der Kultur für viel längere Zeitspannen als Monolayer-Systeme. Das dreidimensionale System unterstützt ferner die Reifung, Differenzierung und Separation von Zellen in der Kultur in vitro zur Bildung von Komponenten adulter Gewebe, die den in vivo zu findenden Gegenstücken entsprechen. Auf diese Weise entspricht die von den Zellen in der Kultur geschaffene extrazelluläre Matrix besser nativen Geweben.
Obwohl die Antragsteller keinerlei Pflicht oder Obligation unterliegen, den Mechanismus, über den die Erfindung wirkt, zu erklären, kann eine Reihe von Faktoren, die dem dreidimensionalen Kultursystem inhärent sind, zu diesen Merkmalen des dreidimensionalen Kultursystems beitragen:

(a) Der dreidimensionale Rahmen bietet einen größeren Flächeninhalt für die Proteinanhaftung und demzufolge für die Adhärenz stromaler Zellen.
(b) Aufgrund der dreidimensionalen Beschaffenheit des Rahmens wachsen stromale Zellen im Gegensatz zu Zellen in Monolayer-Kulturen, die bis zur Konfluenz wachsen, Dichtehemmung aufzeigen und aufhören, zu wachsen und sich zu teilen, aktiv weiter. Die Produktion von Wachstums- und Regulationsfaktoren durch sich replizierende stromale Zellen kann teilweise für das Stimulieren der Vermehrung und das Regulieren der Differenzierung von Zellen in der Kultur verantwortlich sein.
(c) Der dreidimensionale Rahmen ermöglicht eine räumliche Verteilung zellulärer Elemente, die der in dem entsprechenden Gewebe in vivo zu findenden besser entspricht.
(d) Die Zunahme des möglichen Volumens für Zellwachstum in dem dreidimensionalen System kann die Einrichtung örtlich begrenzter Mikro-Umwelten, die den in vivo zu findenden nativen Gegenstücken entsprechen, ermöglichen.
(e) Die dreidimensionale Matrix maximiert Interaktionen zwischen den Zellen, indem sie ein größeres Potential zur Bewegung migratorischer Zellen wie etwa Makrophagen, Monozyten und möglicherweise Lymphozyten in der Adhärenzschicht ermöglicht.
(f) Es wurde erkannt, dass die Aufrechterhaltung eines differenzierten zellulären Phänotyps nicht nur Wachstums-/Differenzierungsfaktoren erfordert, sondern auch die angemessenen zellulären Interaktionen. Die vorliegende Erfindung bildet die Mikro-Umwelt des stromalen Gewebes wirksam nach.

Die dreidimensionale stromale Stütze, das Kultursystem selbst und seine Aufrechterhaltung, sowie verschiedene Verwendungen der dreidimensionalen Kulturen und der auf natürliche Weise abgesonderten extrazellulären Matrix werden in den Teilabschnitten unten detaillierter beschrieben. Lediglich zur leichteren Erklärung wird die detaillierte Beschreibung der Erfindung in die drei Abschnitte (i) Wachstum der dreidimensionalen stromalen Zellkultur, (ii) Isolierung der auf natürliche Weise abgesonderten menschlichen extrazellulären Matrix und (iii) Formulierung der isolierten extrazellulären Matrix zu Präparaten zur Injektion an der Stelle von Weichgewebedefekten unterteilt.
5.1. PRÄPARATION DES LEBENDEN STROMALEN GEWEBES IN VITRO
Die zur Kultivierung stromalen Gewebes verwendete dreidimensionale Stütze kann aus jedem Material und/oder von jeder Form sein, das/die

(a) es Zellen ermöglicht, an ihm/ihr anzuhaften (oder das/die modifiziert werden kann, so dass Zellen an ihm/ihr anhaften können), und
(b) es Zellen ermöglicht, in mehr als einer Schicht zu wachsen.

Eine Reihe unterschiedlicher Materialien kann zur Bildung des Rahmens verwendet werden, wie etwa nicht biologisch abbaubare oder biologisch abbaubare Materialien. Nicht biologisch abbaubare Materialien schließen zum Beispiel Folgendes ein, sind aber nicht beschränkt auf: Nylon (Polyamide), Dacron (Polyester), Polystyrol, Polypropylen, Polyacrylate, Polyvinylverbindungen (z.B. Polyvinylchlorid), Polycarbonat (PVC), Polytetrafluorethylen (PTFE; Teflon), Thermanox (TPX) usw. Zusätzlich dazu kann auch biologisch abbaubares Material benutzt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Nitratzellulose, Baumwolle, Polyglykolsäure (PGA), Catgut, Zellulose, Gelatine, Dextran, Kollagen, Chitosan, Hyaluronsäure usw. Jedes dieser Materialien, biologisch abbaubar oder nicht biologisch abbaubar, kann zur Bildung eines dreidimensionalen Rahmens zu einem Netz verwebt werden. Alternativ dazu können die Materialien zur Bildung anderer Typen von dreidimensionalen Rahmen, beispielsweise von Schwämmen wie etwa Kollagenschwämmen, verwendet werden.
Gewisse Materialien wie etwa Nylon, Polystyrol usw. sind schlechte Substrate für die Zellanhaftung. Wenn diese Materialien als dreidimensionaler Stützrahmen verwendet werden, ist es ratsam, den Rahmen vor der Beimpfung mit stromalen Zellen vorzubehandeln, um die Anhaftung stromaler Zellen an dem Rahmen zu verbessern. Zum Beispiel können Nylonrahmen vor der Beimpfung mit stromalen Zellen mit 0,1 M Essigsäure behandelt und in Polylysin, FBS und/oder Kollagen inkubiert werden, um das Nylon zu beschichten. Polystyrol kann unter Verwendung von Schwefelsäure auf ähnliche Weise behandelt werden. Ein zweckmäßiges Nylonnetz, das gemäß der Erfindung verwendet werden kann, ist Nitex, ein Nylonfiltriernetz mit einer durchschnittlichen Porengröße von 210 μm und einem durchschnittlichen Durchmesser der Nylonfasern von 90 μm (Nr. 3-210/36, Tetko, Inc., N.Y.).
Fibroblasten beinhaltende stromale Zellen, die von adultem oder fötalem Gewebe stammen, werden mit oder ohne andere, unten beschriebene Zellen und Elemente auf den Rahmen geimpft. Diese Fibroblasten können von Organen wie etwa Haut, Leber, Pankreas usw. stammen, welche durch Biopsie, wo angemessen, oder bei Autopsie erhalten werden können. Tatsächlich können Fibroblasten recht einfach von jedem angemessenen Leichenorgan massenhaft erhalten werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können fötale Fibroblasten in großer Menge von der Vorhaut erhalten werden.
Fibroblasten lassen sich leicht isolieren, indem ein angemessenes Organ oder Gewebe, das als Quelle der Fibroblasten dienen soll, disaggregiert wird. Dies kann durch die Verwendung von dem Fachmann bekannten Techniken leicht erreicht werden. Das Gewebe oder Organ kann zum Beispiel mechanisch disaggregiert und/oder mit Verdauungsenzymen und/oder Chelatbildnern, die die Verbindungen zwischen Nachbarzellen schwächen, behandelt werden, was es möglich macht, das Gewebe in eine Suspension individueller Zellen ohne merkbaren Zellbruch zu dispergieren. Eine enzymatische Dissoziation kann durch das Zerkleinern des Gewebes und das Behandeln des zerkleinerten Gewebes mit einem beliebigen einer Reihe von Verdauungsenzymen, entweder allein oder in Kombination, erreicht werden. Diese schließen Trypsin, Chymotrypsin, Kollagenase, Elastase, Hyaluronidase, DNase, Pronase und/oder Dispase usw. ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Eine mechanische Zersetzung kann ebenfalls durch eine Reihe von Verfahren erreicht werden, welche die Verwendung von Mahlmitteln, Mixgeräten, Sieben, Homogenisatoren, Druckzellen oder Schallzersetzern, um nur einige zu nennen, einschließen, aber nicht auf diese beschränkt sind. Für eine Übersicht über Gewebedisaggregierungstechniken siehe Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2. Ausgabe, A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Kapitel 9, S. 107–126.
Nachdem das Gewebe auf eine Suspension individueller Zellen reduziert worden ist, kann die Suspension in Teilpopulationen fraktioniert werden, aus denen die Fibroblasten und/oder andere stromale Zellen und/oder Elemente erhalten werden können. Dies kann auch durch die Verwendung von Standardtechniken zur Zelltrennung einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Klonen und Selektion spezifischer Zelltypen, selektive Zerstörung nicht gewollter Zellen (negative Selektion), Trennung auf der Grundlage unterschiedlicher Zellagglutinierbarkeit in der gemischten Population, Gefrier-Auftau-Prozeduren, unterschiedliche Adhärenzeigenschaften der Zellen in der gemischten Population, Filtration, herkömmliche und Zonenzentrifugation, zentrifugale Elutriation (Gegenstromzentrifugation), Einheitsschweretrennung, Gegenstromverteilung, Elektrophorese und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung erreicht werden. Für eine Übersicht über Techniken zur klonalen Selektion und Zelltrennung siehe Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2. Ausgabe, A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Kapitel 11 und 12, S. 137–168.
Die Isolierung von Fibroblasten kann zum Beispiel wie folgt durchgeführt werden: Frische Gewebeproben werden gründlich gewaschen und in Hanks ausgeglichener Salzlösung (HBSS) zerkleinert, um Serum zu entfernen. Das zerkleinerte Gewebe wird 1–12 Stunden lang in einer frisch präparierten Lösung eines dissoziierenden Enzyms wie etwa Trypsin inkubiert. Nach einer derartigen Inkubation werden die dissoziierten Zellen suspendiert, durch Zentrifugation zum Niederschlag gebracht und auf Kulturschalen ausplattiert. Alle Fibroblasten werden vor anderen Zellen anhaften; daher können angemessene stromale Zellen selektiv isoliert und gezüchtet werden. Die isolierten Fibroblasten können dann bis zur Konfluenz gezüchtet, aus der konfluenten Kultur gehoben und auf den dreidimensionalen Rahmen geimpft werden, siehe Naughton et al., 1987, J. Med. 18 (3 u. 4): 219–250. Die Beimpfung des dreidimensionalen Rahmens mit einer hohen Konzentration stromaler Zellen, z.B. ungefähr 10⁶ bis 5 × 10⁷ Zellen/ml, resultiert in der Einrichtung der dreidimensionalen stromalen Stütze in kürzeren Zeitspannen.
Zusätzlich zu den Fibroblasten können andere Zellen hinzugegeben werden, um die die extrazelluläre Matrix herstellende dreidimensionale stromale Zellkultur zu bilden. Andere Zellen, die zum Beispiel in lockerem Bindegewebe zu finden sind, können zusammen mit Fibroblasten auf den dreidimensionalen Stützrahmen geimpft werden. Derartige Zellen schließen Endothelzellen, Perizyten, Makrophagen, Monozyten, Plasmazellen, Mastzellen, Adipozyten, Chondrozyten usw. ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Diese stromalen Zellen können leicht von angemessenen Organen wie etwa Haut, Leber usw. unter Verwendung bekannter Verfahren, wie etwa der oben erörterten, bezogen werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können stromale Zellen, die auf das bestimmte, zu kultivierende Gewebe spezialisiert sind, für die Herstellung einer gewebetypspezifischen extrazellulären Matrix zum Fibroblastenstroma hinzugegeben werden. So können zum Beispiel dermale Fibroblasten verwendet werden, um das dreidimensionale subkonfluente Stroma für die Herstellung einer hautspezifischen extrazellulären Matrix in vitro zu bilden. Alternativ dazu können stromale Zellen von hämatopoietischem Gewebe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, fibroblastische Endothelzellen, Makrophagen/Monozyten, Adipozyten und Retikulumzellen, zur Bildung des dreidimensionalen subkonfluenten Stromas für die Herstellung einer knochenmarkspezifischen extrazellulären Matrix in vitro verwendet werden, siehe unten. Hämatopoietische stromale Zellen können durch Zentrifugation bei niedriger Kraft, z.B. 3000 × g, leicht von der in Knochenmarksuspensionen gebildeten „Leukozytenmanschette" erhalten werden. Stromale Zellen der Leber können Fibroblasten, Kupffer-Zellen und vaskuläre Endothelzellen und Endothelzellen des Gallengangs einschließen. Auf ähnliche Weise können Gliazellen als Stroma verwendet werden, um die Vermehrung neurologischer Zellen und Gewebe zu unterstützen. Zu diesem Zweck können Gliazellen durch Trypsinisierung oder Kollagenaseverdauung embryonischen oder adulten Gehirns erhalten werden. Ponten und Westermark, 1980, in Federof, S., Hertz, L., Hrs., „Advances in Cellular Neurobiology", Bd. 1, New York, Academic Press, S. 209–227.
Für gewisse Verwendungen in vivo ist es vorzuziehen, die stromalen Zellen von den eigenen Geweben des Patienten zu erhalten. Das Wachstum von Zellen in Gegenwart des dreidimensionalen stromalen Stützrahmens kann ferner dadurch verbessert werden, dass dem Rahmen Proteine, z.B. Kollagene, elastische Fasern, Retikulumfasern, Glykoproteine; Glykosaminoglykane, z.B. Heparinsulfat, Chondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6-sulfat, Dermatansulfat, Keratansulfat usw.; eine zelluläre Matrix und/oder andere Materialien hinzugegeben werden oder die Rahmenstütze mit diesen beschichtet wird.
Nach der Beimpfung mit den stromalen Zellen wird der dreidimensionale Rahmen in einem angemessenen Nährmedium unter physiologischen Bedingungen, die für das Zellwachstum günstig sind, d. h. die Mitose, d. h. Zellteilung, begünstigen, inkubiert. Viele im Handel erhältliche Medien wie etwa RPMI 1640, Fishers, Iscoves, McCoys und dergleichen können zur Verwendung geeignet sein. Um die Vermehrungsaktivität zu maximieren, ist es wichtig, die dreidimensionale stromale Kultur während der Inkubationsperiode in dem Medium zu suspendieren oder schweben zu lassen. Zusätzlich dazu sollte die Kultur periodisch „versorgt" werden, um das verbrauchte Medium zu entfernen, freigesetzte Zellen aus der Population zu entfernen und frisches Medium hinzuzugeben.
Während der Inkubationsperiode wachsen die stromalen Zellen linear entlang dem dreidimensionalen Rahmen und hüllen ihn ein, bevor sie anfangen, in die Öffnungen des Rahmens hineinzuwachsen. Die Zellen werden zu einem angemessenen Grad gezüchtet, um die ausreichende Ablagerung von Proteinen der extrazellulären Matrix zu ermöglichen.
Die Öffnungen des Rahmens sollten von einer angemessenen Größe sein, um es den stromalen Zellen zu ermöglichen, sich über die Öffnungen zu strecken. Das Beibehalten aktiv wachsender stromaler Zeilen, die sich über den Rahmen strecken, verbessert die Herstellung von Wachstumsfaktoren, die von den stromalen Zellen produziert werden, und unterstützt somit langfristige Kulturen. Wenn die Öffnungen zu klein sind, erreichen die stromalen Zellen zum Beispiel möglicherweise schnell die Konfluenz, sind aber nicht in der Lage, einfach aus dem Netz auszuwandern. Gefangene Zellen können Dichtehemmung aufzeigen und die Herstellung der angemessenen Faktoren, die zum Unterstützen der Vermehrung und zum Aufrechterhalten langfristiger Kulturen nötig sind, einstellen. Sind die Öffnungen zu groß, können sich die stromalen Zellen nicht über die Öffnung strecken. Dies verringert ebenfalls die Herstellung der zum Unterstützen der Vermehrung und zum Aufrechterhalten langfristiger Kulturen nötigen angemessenen Faktoren seitens der stromalen Zellen. Wird ein Netztyp von Matrix verwendet, wie hier beispielhaft dargestellt, so haben wir herausgefunden, dass Öffnungen im Bereich von ungefähr 150 μm bis ungefähr 220 μm zufriedenstellend funktionieren. Je nach der dreidimensionalen Struktur und der Komplexität des Rahmens funktionieren andere Größen jedoch möglicherweise gleichermaßen gut. Tatsächlich funktioniert erfindungsgemäß jede Form oder Struktur, die es den stromalen Zellen ermöglicht, sich zu strecken und sich über längere Zeitspannen zu replizieren und zu wachsen.
Unterschiedliche Proportionen der verschiedenen Typen von Kollagen, die auf dem Rahmen abgelagert werden, können dadurch erzielt werden, dass der Rahmen mit unterschiedlichen gewebespezifischen Zellen beimpft wird. Für hämatopoietische Zellen sollte die Matrix zum Beispiel vorzugsweise die Kollagentypen III, IV und I in einem ungefähren Verhältnis von 6:3:1 in der anfänglichen Matrix enthalten. Für Haut werden vorzugsweise die Kollagentypen I und III in der anfänglichen Matrix abgelagert. Die Proportionen der abgelagerten Kollagentypen können durch das Selektionieren von Fibroblasten, die die angemessenen Proteine der extrazellulären Matrix produzieren, manipuliert oder verbessert werden. Dies kann durch die Verwendung monoklonaler Antikörper eines angemessenen Isotyps oder einer angemessenen Unterklasse erreicht werden, die zur Komplementaktivierung in der Lage sind und bestimmte Kollagentypen definieren. Diese Antikörper können in Kombination mit dem Komplement verwendet werden, um auf Fibroblasten, die den gewünschten Kollagentyp exprimieren, negativ zu selektionieren. Alternativ dazu kann das zum Beimpfen des Rahmens verwendete Stroma eine Mischung von Zellen sein, die die gewünschten angemessenen Kollagentypen synthetisieren. Die Verteilung und Herkunft der fünf Typen von Kollagen ist in Tabelle I gezeigt.
TABELLE I VERTEILUNG UND HERKUNFT DER FÜNF TYPEN VON KOLLAGEN
Auf diese Weise kann/können je nach den gewünschten Kollagentypen die angemessene(n) stromale(n) Zelle(n) ausgewählt werden, um den dreidimensionalen Rahmen zu beimpfen.
Die die dreidimensionale extrazelluläre Matrix herstellende Kultur der vorliegenden Erfindung bringt ein Vehikel zum Einführen von Genprodukten in vivo hervor. In gewissen Situationen kann es wünschenswert sein, eine extrazelluläre Matrix zu präparieren, die ein Produkt eines fremden Gens, einen Wachstumsfaktor, Regulationsfaktor usw. enthält. In derartigen Fällen können die Zellen genetisch manipuliert werden, um das Genprodukt oder geänderte Formen des Genproduktes zu exprimieren, die in der von den stromalen Zellen abgeschiedenen extrazellulären Matrix immobilisiert werden. Unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken kann zum Beispiel ein Gen von Interesse unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors gestellt werden. Das das Gen enthaltene rekombinante DNA-Konstrukt kann verwendet werden, um eine Wirtszelle zu transformieren oder zu transfizieren, welche geklont und dann klonal in dem dreidimensionalen Kultursystem verbreitet wird. Die Verwendung der dreidimensionalen Kultur in diesem Zusammenhang weist eine Reihe von Vorteilen auf. Zuerst wird, da die Kultur eukaryotische Zellen enthält, das Genprodukt in der Kultur richtig exprimiert und verarbeitet, um ein aktives Produkt zu bilden. Als Zweites kann die Anzahl transfizierter Zellen wesentlich erhöht werden, um von klinischem Nutzen, klinischer Relevanz und Brauchbarkeit zu sein. Die dreidimensionalen Kulturen der vorliegenden Erfindung ermöglichen die Expansion der Anzahl transfizierter Zellen und die Vervielfältigung (über Zellteilung) transfizierter Zellen.
Vorzugsweise sollten die verwendeten Expressionskontrollelemente die regulierte Expression des Gens berücksichtigen, so dass das Produkt in der Kultur im Überschuss synthetisiert werden kann. Der gewählte Transkriptionspromotor im Allgemeinen und Promotorelemente im Spezifischen hängen zum Teil von dem Typ des kultivierten Gewebes und der kultivierten Zellen ab. Es werden Zellen und Gewebe bevorzugt, die Proteine absondern können (z.B. diejenigen, die durch abundantes rauhes endoplasmatisches Retikulum und abundanten Golgikomplex gekennzeichnet sind).
Während der Inkubation der dreidimensionalen Kultur werden sich vermehrende Zellen von dem Rahmen freigesetzt. Diese freigesetzten Zellen können an den Wänden des Kulturbehälters festkleben, wo sie sich weiter vermehren und einen konfluenten Monolayer bilden können. Dies sollte verhindert oder minimiert werden, zum Beispiel dadurch, dass die freigesetzten Zellen während des Versorgens entfernt werden oder der dreidimensionale Rahmen in einen neuen Kulturbehälter überführt wird. Die Gegenwart eines konfluenten Monolayers in dem Behälter würde das Wachstum von Zellen in dem dreidimensionalen Rahmen und/oder der dreidimensionalen Kultur „abschalten". Die Entfernung des konfluenten Monolayers oder die Überführung der stromalen Kultur in frisches Medium in einem neuen Behälter stellt die Vermehrungsaktivität des dreidimensionalen Kultursystems wieder her. Eine derartige Entfernung oder derartige Überführungen sollten in jedem Kulturbehälter vorgenommen werden, der einen stromalen Monolayer mit mehr als 25 Konfluenz aufweist. Alternativ dazu kann das Kultursystem gerührt werden, um die freigesetzten Zellen vom Festkleben abzuhalten, oder statt der periodischen Versorgung der Kulturen könnte das Kultursystem so aufgesetzt werden, dass frisches Medium kontinuierlich durch das System fließt. Die Durchflussrate kann eingestellt werden, um sowohl die Vermehrung innerhalb der dreidimensionalen Kultur zu maximieren als auch von der Matrix freigesetzte Zellen auszuwaschen und zu entfernen, so dass sie nicht an den Wänden des Behälters festkleben und zur Konfluenz wachsen. In jedem Fall können die freigesetzten stromalen Zellen gesammelt und zur zukünftigen Verwendung kryokonserviert werden.
Nachdem die Fibroblasten auf den dreidimensionalen Rahmen geimpft worden sind, lässt sich ihre Adhärenz bald beobachten (z.B. innerhalb von Stunden), und innerhalb von Tagen beginnen die Fibroblasten damit, sich über die Rahmenöffnungen zu strecken. Diese Fibroblasten sind metabolisch aktiv, sondern extrazelluläre Matrix ab und bilden schnell ein Dermisäquivalent, das aus aktiven Fibroblasten und Kollagen besteht.
1 veranschaulicht die Fähigkeit der Fibroblasten, sich zwischen den auf natürliche Weise abgesonderten Kollagenbündeln selbst zu parallelen Schichten anzuordnen. Diese Fibroblasten zeigen eine hohe Rate an Zellteilung und Proteinabsonderung auf.
5.2. ENTFERNUNG DER EXTRAZELLULÄREN MATRIX VON DEM RAHMEN
Nachdem die Zellen auf den Rahmen geimpft und unter für das Zellwachstum günstigen Bedingungen kultiviert worden sind, so dass eine gewünschte Menge an extrazellulärer Matrix auf den dreidimensionalen Rahmen abgesondert worden ist, werden die Zellen getötet, und die auf natürliche Weise abgesonderte extrazelluläre Matrix wird weiter verarbeitet.
Dies involviert zunächst das Töten der Zellen und das Entfernen der getöteten Zellen und jeglicher Zellreste von dem dreidimensionalen Rahmen. Dieser Vorgang wird auf eine Reihe unterschiedlicher Weisen durchgeführt. Zum Beispiel können die Zellen durch Blitzgefrieren des lebenden stromalen, in vitro präparierten Gewebes in flüssigem Stickstoff ohne ein Kryokonservierungsmittel getötet werden. Eine andere Weise, Zellen zu töten, ist es, den beimpften dreidimensionalen Rahmen mit sterilem Wasser zu spülen, so dass die Zellen als Reaktion auf den osmotischen Druck zerbersten. Nachdem die Zellen getötet worden sind, können zum Beispiel die Zellmembranen zersetzt und die Zellreste durch Ausspülen mit einem milden Waschmittel wie etwa mit EDTA, CHAPS oder einem zwitterionischen Waschmittel entfernt werden, gefolgt von der Behandlung mit einem Kryoschutzmittel wie etwa DMSO, Propylenglykol, Butandiol, Raffinose, Polyvinylpyrrolidon, Dextran oder Saccharose, und der Verglasung in flüssigem Stickstoff. Alternativ dazu kann der Rahmen einer enzymatischen Verdauung und/oder Extraktion mit Reagenzien, die die Zellmembranen auflösen und die Entfernung von Zellinhalten ermöglichen, unterworfen werden. Beispiele von Waschmitteln schließen nicht ionische Waschmittel (zum Beispiel TRITON X-100, Octylphenoxypolyethoxyethanol (Rohm und Haas); BRIJ-35, ein Polyethoxyethanol-laurylether (Atlas Chemical Co.), TWEEN 20, ein Polyethoxyethanol-sorbitan-monolaureat (Rohm und Haas), LUBROL-PX oder Polyethylen-laurylether (Rohm und Haas)) und ionische Waschmittel (zum Beispiel Natriumdodecylsulfat, sulfatierten höheren aliphatischen Alkohol, sulfoniertes Alkan und sulfoniertes Alkylaren, das 7 bis 22 Kohlenstoffatome in einer verzweigten oder nicht verzweigten Kette enthält) ein. Enzyme können ebenfalls verwendet werden und Nucleasen (zum Beispiel Desoxyribonuclease und Ribonuclease), Phospholipasen und Lipasen einschließen. Ein Vorteil der Verwendung eines Ausspülens mit einem milden Waschmittel liegt darin, dass es die membrangebundenen Proteine löslich macht, welche häufig stark antigen sind.
Sobald die Zellen getötet und die Zellreste entfernt worden sind, kann das Sammeln der auf natürliche Weise abgesonderten menschlichen extrazellulären Matrix auf eine Vielfalt von Weisen erreicht werden, je nach dem, ob der dreidimensionale Rahmen aus einem biologisch abbaubaren oder einem nicht biologisch abbaubaren Material zusammengesetzt ist. Wenn der Rahmen zum Beispiel aus nicht biologisch abbaubarem Material zusammengesetzt ist, kann die extrazelluläre Matrix von einer nicht biologisch abbaubaren Stütze entfernt werden, indem der dreidimensionale Rahmen einer Beschallung und/oder Hochdruck-Wasserstrahlen und/oder mechanischem Schaben und/oder einer milde Behandlung mit Waschmitteln und/oder Enzymen ausgesetzt wird, um die anhaftende extrazelluläre Matrix vom Rahmen zu entfernen.
Wenn die extrazelluläre Matrix auf einem biologisch abbaubaren dreidimensionalen Rahmen abgelagert ist, kann die extrazelluläre Matrix nach dem Töten und Entfernen der Zellen und Zellreste beispielsweise dadurch wiedergewonnen werden, dass der Rahmen einfach in einer Lösung abgebaut wird, d. h. dass sich der Rahmen auflöst, wodurch die extrazelluläre Matrix befreit wird. Wenn die biologisch abbaubare Stütze aus einem Material zusammengesetzt ist, das injiziert werden kann, wie die extrazelluläre Matrix selbst, kann zusätzlich dazu der gesamte, mit der extrazellulären Matrix beschichtete Rahmen zur Injektion in Spritzen verarbeitet werden. Wenn ferner die extrazelluläre Matrix auf einer biologisch abbaubaren Stütze abgelagert ist, kann die Matrix mit denselben Verfahren entfernt werden, als ob die Matrix auf einer nicht biologisch abbaubaren Stütze abgelagert worden wäre, d. h. dadurch, dass der dreidimensionale Rahmen einer Beschallung und/oder Hochdruck-Wasserstrahlen und/oder mechanischem Schaben und/oder einer milden Behandlung mit Waschmitteln und/oder Enzymen ausgesetzt wird, um die anhaftende extrazelluläre Matrix vom Rahmen zu entfernen. Keiner dieser Entfernungsvorgänge ist daraufhin entworfen, die von den Zellen hergestellte, auf natürliche Weise abgesonderte menschliche extrazelluläre Matrix zu beschädigen oder zu denaturieren.
5.3. FORMULIERUNG UND VERWENDUNG INJIZIERBARER PRÄPARATE
Sobald die auf natürliche Weise abgesonderte extrazelluläre Matrix gesammelt worden ist, wird sie weiter verarbeitet. Die extrazelluläre Matrix kann zu feinen Partikeln homogenisiert werden, so dass sie durch eine chirurgische Nadel gehen kann. Homogenisierung ist im Fach wohl bekannt, beispielsweise durch Beschallung. Des Weiteren kann die extrazelluläre Matrix ohne die Verwendung chemischer Quervernetzungsmittel wie etwa Glutaraldehyd, die giftig sind, durch Gammabestrahlung quervernetzt werden. Die Gammabestrahlung sollte mindestens 20 Mrad betragen, um das Material zu sterilisieren, da alle Bakterien, Pilze und Viren bei 0,2 Mrad zerstört werden. Vorzugsweise kann die extrazelluläre Matrix mit 0,25 bis 2 Mrad bestrahlt werden, um die extrazelluläre Matrix zu sterilisieren und querzuvernetzen.
Ferner können die Mengen und/oder Verhältnisse der Kollagene und anderer Proteine eingestellt werden, indem vor der Platzierung des Materials in eine Spritze extrazelluläre Matrizen, die von anderen Zelltypen abgesondert wurden, gemischt werden. Zum Beispiel können biologisch aktive Substanzen wie etwa Proteine und Arzneimittel in die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Freisetzung oder kontrollierten Freisetzung dieser aktiven Substanzen nach der Injektion der Zusammensetzung inkorporiert werden. Beispielhafte biologisch aktive Substanzen können Gewebewachstumsfaktoren wie etwa TGF-β und dergleichen einschließen, die die Heilung und Gewebereparatur an der Stelle der Injektion begünstigen.
Die endgültige Formulierung der wässrigen Suspension der auf natürliche Weise abgesonderten menschlichen extrazellulären Matrix involviert typischerweise das Einstellen der Ionenstärke der Suspension auf Isotonie (d. h. ungefähr 0,1 bis 0,2) und auf physiologischen pH (d. h. ungefähr pH 6,8 bis 7,5) und das Hinzugeben eines lokalen Anästhetikums wie etwa Lidocain (gewöhnlich mit einer Konzentration von ungefähr 0,3 Gew.-%), um den lokalen Schmerz bei Injektion zu reduzieren. Die endgültige Formulierung enthält typischerweise auch ein flüssiges Gleitmittel wie etwa Maltose, das von dem Körper toleriert werden muss. Beispielhafte Gleitmittelkomponenten schließen Glycerol, Glykogen, Maltose und dergleichen ein. Organische Polymergrundmaterialien wie etwa Polyethylenglykol und Hyaluronsäure, sowie nicht fibrilläres Kollagen, vorzugsweise sukzinyliertes Kollagen, können ebenfalls als Gleitmittel dienen. Derartige Gleitmittel werden im Allgemeinen verwendet, um die Injizierbarkeit, Intrudierbarkeit und Dispersion des injizierten Biomaterials an der Stelle der Injektion zu verbessern und die Menge des Ausschießens durch das Modifizieren der Viskosität der Zusammensetzungen zu verringern. Diese endgültige Formulierung ist definitionsgemäß die verarbeitete extrazelluläre Matrix in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Die Matrix wird anschließend zur genauen Platzierung der Matrix an der Stelle des Gewebedefektes in einer Spritze oder einem anderen Injektionsapparat platziert. Bei Formulierungen zur Dermisaugmentation bedeutet der Begriff „injizierbar", dass die Formulierung aus Spritzen mit einem so geringen Kaliber wie 25 unter normalen Bedingungen, unter normalem Druck, ohne wesentliches Ausschießen ausgegeben werden kann. Das Ausschießen kann bewirken, dass die Zusammensetzung aus der Spritze ausläuft, statt in das Gewebe injiziert zu werden. Für diese genaue Platzierung sind so feine Kanülen wie Nr. 27 (200 μm i. D.) oder sogar Kanüle Nr. 30 (150 μm i. D.) wünschenswert. Die maximale Partikelgröße, die durch derartige Nadeln extrudiert werden kann, ist eine komplexe Funktion aus mindestens den Folgenden: maximale Partikelabmessung, Längenverhältnis (Länge:Breite) der Partikel, Partikelfestigkeit, Oberflächenrauigkeit der Partikel und verwandte Faktoren, die die Adhäsion von Partikeln aneinander, die viskoelastischen Eigenschaften der Suspensionsflüssigkeit und die Durchflussrate durch die Nadel beeinflussen. in einer newtonschen Flüssigkeit suspendierte steife kugelige Perlen stellen den einfachsten Fall dar, während fibröse oder verzweigte Partikel in einer viskoelastischen Flüssigkeit wahrscheinlich komplexer sind.
Die oben beschriebenen Schritte des Vorgangs zum Präparieren injizierbarer, auf natürliche Weise abgesonderter menschlicher extrazellulärer Matrix werden vorzugsweise unter sterilen Bedingungen und unter Verwendung sterilen Materials durchgeführt. Die verarbeitete extrazelluläre Matrix in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger kann intradermal oder subkutan injiziert werden, um Weichgewebe zu verstärken, um angeborene Anomalien, erworbene Defekte oder kosmetische Defekte zu reparieren oder zu korrigieren. Beispiele derartiger Zustände sind angeborene Anomalien wie hemifaziale Mikrosomie, Jochbein- und Jochbogenhypoplasie, einseitige Mammahypoplasie, Pectus excavatum, Pectoralisaplasie (Poland-Anomalie) und velopharyngeale Insuffizienz nach Gaumenspaltenoperation oder submucöser Gaumenspalte (als retropharyngeales Implantat); erworbene Defekte (posttraumatisch, postoperativ, postinfektiös) wie etwa eingesunkene Narben, subkutane Atrophie (z.B. nach diskoidalem Lupus erythematosus); keratotische Läsionen, Enophthalmie im enukleierten Auge (auch Pancoast-Syndrom), Aknevernarbung des Gesichts, lineare Sklerodermie mit subkutaner Atrophie, Sattelnasenverformung, Romberg-Syndrom und einseitige Stimmbandlähmung; und kosmetische Defekte wie Glabellafalten, tiefe Nasolabialfalten, periorale Landkartenfältchen, eingefallene Wangen und Mammahyplasie. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch in innere Gewebe wie etwa die Gewebe, die Körpersphinkter definieren, injiziert werden, um derartige Gewebe zu verstärken.
Verschiedene Musterausführungsformen der Erfindung sind in den Abschnitten unten beschrieben. Lediglich zum Zweck der Beschreibung und nicht als Beschränkung wird das dreidimensionale Kultursystem der Erfindung auf der Grundlage der Typen von Gewebe und Zellen, die in verschiedenen Systemen verwendet werden, beschrieben. Diese Beschreibungen schließen spezifisch Knochenmark, Haut, Epithelzellen und Knorpel ein, ohne darauf beschränkt zu sein, aber es versteht sich ausdrücklich, dass das dreidimensionale Kultursystem mit anderen Typen von Zellen und Geweben verwendet werden kann. Die Erfindung ist auch mittels Beispielen veranschaulicht, die die für jedes beschriebene System erzeugten kennzeichnenden Daten vorführen.
BEISPIELE
6. BEISPIEL: DREIDIMENSIONALES STROMALES HAUTKULTURSYSTEM
Die Teilabschnitte unten beschreiben das dreidimensionale Kultursystem der Erfindung für die Kultivierung unterschiedlicher stromaler Zellen in vitro. Kurz gesagt wurden Fibroblastenkulturen auf einem Nylonnetz, das zuvor sterilisiert worden war, eingerichtet. Innerhalb von 6–9 Tagen Inkubation begannen die adhärenten Fibroblasten, in die Netzöffnungen zu wachsen, und lagerten parallele Bündel Kollagen ab. Indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung monoklonaler Antikörper zeigte hauptsächlich Typ-I-Kollagen mit etwas Typ III.
6.1. EINRICHTUNG DES DREIDIMENSIONALEN STROMAS AUS HAUTFIBROBLASTEN
Hautfibroblasten wurden durch Zerkleinern von Dermisgewebe, Trypsinisierung über 2 Stunden und Trennung von Zellen in eine Suspension durch physikalische Mittel isoliert. Fibroblasten wurden in 25 cm² großen Falcon-Gewebekulturschalen bis zur Konfluenz gezüchtet und mit RPMI 1640 (Sigma, MO) versorgt, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), Fungizon, Gentamicin und Penicillin/Streptomycin versetzt war. Fibroblasten wurden durch milde Trypsinisierung gehoben und die Zellen wurden auf ein Nylonfiltrationsnetz ausplattiert, dessen Fasern ungefähr 90 μm im Durchmesser betragen und in einem Kreuzgewebe mit einer Netzöffnung von 210 μm (Tetko, Inc. NY) gruppiert sind. Das Netz wurde mit einem milden Säurebad vorbehandelt und in Polylysin und FBS inkubiert. Eine Adhärenz der Fibroblasten wurde binnen 3 Stunden beobachtet, und Fibroblasten begannen binnen 5–7 Tagen nach anfänglicher Beimpfung, sich über die Netzöffnungen zu strecken. Diese Fibroblasten waren metabolisch aktiv, sonderten eine extrazelluläre Matrix ab und bildeten schnell ein Dermisäquivalent, das aus aktiven Fibroblasten und Kollagen bestand. 1 ist eine Rasterelektronenaufnahme, die die Fibroblastenanhaftung und die Ausdehnung zellulärer Vorgänge über die Netzöffnung abbildet.
6.2 EINRICHTUNG DER DREIDIMENSIONALEN STROMALEN KNOCHENMARKKULTUREN
Knochenmark wurde von mehreren Stellen auf dem hinteren Beckenkamm von in hämatologischer Sicht normalen adulten Freiwilligen abgesaugt, nachdem ihre Einverständniserklärung erhalten worden war. Proben wurden in heparinisierten Röhrchen gesammelt und in 8 ml RPMI 1640-Medium, das mit 10% FBS und 5–10% HS aufbereitet und mit Hydrocortison, Fungizon und Streptomycin versetzt war, suspendiert. Die Zellhaufen wurden disaggregiert und in Aliquots von 5 × 10⁶ nukleierten Zellen aufgeteilt.
Als dreidimensionaler Rahmen wurde ein Nylonfiltrationsgitter (Nr. 3-210/36, Tetko Inc., NY) verwendet, um alle stromalen Zellkulturen, die in den Beispielen unten beschrieben werden, zu stützen. Das Gitter bestand aus Fasern, die im Durchmesser 90 μm betrugen und in ein Kreuzgewebemuster mit Sieböffnungen von 210 μm gruppiert waren. Stromale Zellen wurden unter Verwendung des in Abschnitt 6.1. beschriebenen Protokolls beimpft. Die Adhärenz und das nachfolgende Wachstum der stromalen Elemente wurde unter Verwendung von inverser Phasenkontrastmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie (REM) überwacht.
6.3 PRÄPARATION DER DREIDIMENSIONALEN ORALEN EPITHELIALEN STROMALEN MUKOSAMATRIX
Proben von oralem Mukosagewebe wurden von orthodontischen chirurgischen Proben erhalten. Das Gewebe wurde dreimal mit frischem MEM, das Antibiotika (2 ml antibiotischer antimykotischer Lösung von GIBCO, Kat. Nr. 600-5240 AG; und 0,01 ml Gentamicinlösung von GIBCO Kat. Nr. 600-5710 AD pro 100 cm³ MEM) enthielt, gewaschen, in kleine Stücke zerschnitten, dann mit 0,02% EDTA (Gewicht/Volumen) gewaschen. 0,25% Trypsin (in PBS ohne Ca⁺⁺ oder Mg⁺⁺) wurde hinzugegeben; nach wenigen Sekunden wurden die Gewebestücke entfernt und in frisches Trypsin (in PBS ohne Ca⁺⁺ oder Mg⁺⁺) platziert und über Nacht bei 4°C kalt gestellt. Die Gewebe wurden entfernt und in eine frische Trypsinlösung platziert und vorsichtig gerührt, bis die Zellen eine Einzelzelllösung zu bilden schienen. Die Einzelzelllösung wurde dann in MEM, das 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum enthielt, verdünnt und bei 1400 × g 7 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und der epitheliale Mukosazellen enthaltene Niederschlag wurde in ein Ansatzmedium platziert. Das Medium bestand aus DMEM mit 2% Ultroser G, 1 × L-Glutamin, 1 × nicht essentiellen Aminosäuren, Penicillin und Streptomycin. Die Zellen wurden auf einem dreidimensionalen Rahmen angesetzt. Die dreidimensionale stromale Kultur wurde unter Verwendung oraler Fibroblasten und 8 mm × 45 mm großen Stücken eines Nylonfiltrationsgitters (Nr. 3-210/36, Tetko Inc., NY) erzeugt. Das Netz wurde 30 Minuten lang in 0,1 M Essigsäure getränkt und 1 Stunde lang mit 10 mM Polylysinlösung behandelt. Die Netze wurden in eine sterile Petrischale platziert und mit 1 × 10⁶ oralen Fibroblasten, die wie oben beschrieben in DMEM-Vollmedium gesammelt worden waren, beimpft. Nach 1–2 Stunden Inkubation bei 5% CO₂ wurden die Netze in ein 25 cm² großes Corning-Gewebekulturgefäß platziert und mit zusätzlichen 5 ml Medium geschwemmt, und es wurde ihnen ermöglicht, bei Versorgung in Abständen von 3 Tagen Subkonfluenz zu erreichen. Kulturen wurden in DMEM-Voltmedium bei 37°C und 5% CO₂ in einer befeuchteten Atmosphäre gehalten und alle 3 Tage mit frischem Medium versorgt.
6.4 EINRICHTUNG DER DREIDIMENSIONALEN KULTUR STROMALER ENDOTHELZELLEN KLEINER ADERN
Endothelzellen kleiner Adern, die nach dem Verfahren von Larson et al., 1987, Microvasc. Res. 34: 184, aus dem Gehirn isoliert worden waren, wurden in vitro unter Verwendung von T-75-Gewebekulturgefäßen kultiviert. Die Zellen wurden in einer Kombination aus Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium/Hams-F-12-Medium gehalten (die Lösung ist als eine 1:1 Mischung erhältlich). Das Medium war mit 20% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS), Glutamin und Antibiotika versetzt. Die Zellen wurden in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Gefäß angesetzt und erreichten innerhalb einer Woche einen konfluenten Zustand. Die Zellen wurden einmal pro Woche passiert und zusätzlich einmal pro Woche mit DMEM/Hams-F-12, das wie beschrieben FCS, Glutamin und Antibiotika enthielt, versorgt. Um die Zellen zu passieren, wurden die Gefäße zweimal mit 5 ml PBS (ohne CA⁺⁺ oder Mg⁺⁺) ausgespült und mit 3 ml 0,05% Trypsin und 0,53 mM EDTA trypsiniert. Die Zellen wurden zum Niederschlag gebracht, resuspendiert und durch Trypanblau-Exklusion auf Lebensfähigkeit getestet, angesetzt und mit 25 ml des oben erwähnten versetzten DMEM/Hams-F-12-Mediums versorgt. Ein Faktor VIII verwandter Antigenassay, Grulnick et al., 1977, Ann. Int. Med. 86: 598–616, wurde verwendet, um Endothelzellen positiv zu identifizieren, und Silberfärbung wurde verwendet, um Verschlusskontakt-Komplexe, die nur für das Endothel kleiner Adern spezifisch sind, zu identifizieren.
Ein Nylonfiltrationsgitternetz (Nr. 3-210/36, Tetko, Inc., NY) wurde im Wesentlichen wie oben beschrieben präpariert. Das Netz wurde dreißig Minuten lang in einer Essigsäurelösung (1 ml Eisessig plus 99 ml destilliertes H₂O) getränkt, mit reichlich destilliertem Wasser ausgespült und dann autoklaviert. Die Netze wurden mit 6 ml fötalem Rinderserum pro 8 × 8 cm Netz beschichtet und über Nacht inkubiert. Die Netze wurden dann zu dritt gestapelt, und auf dem Stapel wurden 3 × 10⁷ Endothelzellen kleiner Adern (kultiviert wie beschrieben) angesetzt und drei Stunden lang bei 37°C unter 5% CO₂ in einer befeuchteten Atmosphäre inkubiert. Die beimpften Netze wurden alle 3–4 Tage mit 10 ml DMEM/Hams-F-12-Medium versorgt, bis eine vollständige Konfluenz erreicht worden war (nach ungefähr zwei Wochen).
6.5 EINRICHTUNG DER DREIDIMENSIONALEN ZELLKULTUR STROMALER CHONDROZYTEN
Knorpel wurde von Gelenkflächen menschlicher Gelenke entnommen. Die Knorpelstücke wurden 20 Stunden lang bei 37°C mit Kollagenase (0,2% Gewicht/Volumen) in Vollmedium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, Glutamin, nicht essentiellen Aminosäuren, Natriumpyruvat, 50 μm/ml Ascorbat und 35 μm/ml Gentamicin) verdaut. Freigewordene Chondrozyten wurden abgeschleudert, in Vollmedium resuspendiert, gezählt und mit 1 × 10⁶ Zellen pro T-150-Gefäß ausplattiert. Bei Konfluenz wurden die Zellen routinemäßig passiert (alle 5–7 Tage).
Ein Polyglykolsäurenetz (1 mm Durchmesser × 2 mm dick) wurde durch Behandlung mit Ethylenoxid oder Elektronenstrahl sterilisiert und über Nacht in Vollmedium vorgetränkt. Das Netz wurde in 6-Lochplatten mit 3–4 × 10⁶ Zellen pro Netz in einem Gesamtvolumen von 10 μl angesetzt und 3–4 Stunden lang bei 37°C in einem Gewebekulturinkubator inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden 1,5 ml Medium hinzugegeben. Das angesetzte Netz wurde über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag wurden 5 ml Medium hinzugegeben. Das Medium wurde dreimal pro Woche gewechselt, bis Konfluenz erreicht wurde.
7. BEISPIEL: ZUSAMMENSETZUNG DER EXTRAZELLULÄREN MATRIX
Die extrazelluläre Matrix ist durch eine Reihe analytischer Verfahren charakterisiert worden, um ihren Gehalt an Matrixproteinen zu bestimmen, wobei jeder Wert der Durchschnitt mindestens zweier unabhängiger Bestimmungen ist. Die Matrix enthielt Typ-I- und Typ-III-Kollagene, Fibronektin, Tenascin, sulfatierte Glykosaminoglykane, Decorin und verschiedene andere abgesonderte Proteine der menschlichen extrazellulären Matrix. Zusätzlich dazu waren die abgesonderten Matrixproteine über den ganzen dreidimensionalen Stützrahmen zu finden. Die extrazelluläre Matrix enthielt eine Gesamtproteinmenge von 292 mg/cm² ± 0,06; Fibronektin lag mit 3,4 mg/cm² ± 1,2 und Tenascin mit 1,7 mg/cm² ± 0,6 vor. Sowohl Fibronektin als auch Tenascin zeigten auf Immunoblots die erwarteten Verteilungen der Molekülmasse.
7.1. KOLLAGENGEHALT DER EXTRAZELLULÄREN MATRIX
Der Kollagengehalt der extrazellulären Matrix wurde unter Verwendung des Siriusrot-Assays bestimmt. Die Bindung von Siriusrot F3BA in gesättigter Pikrinsäurelösung ist im weiten Umfang verwendet worden, um die Ablagerung von fibrotischem Kollagen abzuschätzen. Bedossa et al., 1989, Digestion 44 (1): 7–13; Finkelstein et al., 1990, Br. J. Opthalmol. 74 (5): 280–282; James et al., 1990, Liver 10 (1): 1–5. Die Spezifität der Siriusrotbindung an Kollagen basiert weitgehend auf seiner Verwendung als histologisches Färbemittel. Bei Rattenlebern mit verschiedenen Graden an cholestatischer Fibrose zeigt der durch Siriusrotbindung gemessene Kollagengehalt eine enge Korrelation mit dem Hydroxyprolingehalt. Walsh et al., 1992, Analyt. Biochem. 203: 187–190. Zusätzlich dazu ist die histologische Färbung mit Siriusrot doppeltbrechend, was eine richtungsgebundene Bindung andeutet, die zu der Ausrichtung der Kollagenstränge in Beziehung steht. Bekanntermaßen bindet sich Siriusrot an andere Proteine als die klassischen Kollagene, die kollagenartige dreifache Helices enthalten, wie etwa die Komplementkomponente C1. Eine geringfügige Bindung an Serumalbumin wurde ebenfalls beobachtet, obwohl Kontrollexperimente, die Rinderserumalbumin als Standard verwendeten, keine Störung des Assays zeigten. Schätzungsweise stellt die Störung weniger als 2% des Kollagensignals in der extrazellulären Matrix dar, und die Verwendung des Siriusrot-Assays ergibt ein reproduzierbares Verfahren zur Messung von Kollagenen. Die extrazelluläre Matrix enthielt einen Kollagengehalt von 0,61 mg/cm² ± 0,09. Des Weiteren zeigten die Kollagene I und III auf den Immunoblots die erwarteten Verteilungen der Molekülmasse.
7.2. MIT ELEKTRONENMIKROSKOPIE SICHTBAR GEMACHTE KOLLAGENFASERN
Aus dem in vitro gezüchteten Dermisgewebe stammendes Kollagen und Kollagen, das von einer normalen Dermisprobe eines adulten Menschen stammte, wurden verarbeitet und mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) sichtbar gemacht. Kurz gesagt wurden die Kollagene jeweils gewogen und mit 30 ml 0,05 M Tris-Puffer, pH-Wert 8,0, in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen platziert. Nach zweistündigem Mischen auf einem Gelenkschüttler wurde der Tris-Puffer entfernt und die Probe zusammen mit 30 ml frischem 0,05 M Tris-Puffer in einen Homogenisierungszylinder platziert. Die Probe wurde 30 Sekunden lang allein in Puffer und im Anschluss an die Zugabe eines Dispergiermittels in zwei 30-Sekunden-Schüben homogenisiert, wie in den U.S. Patenten Nr. 4,969,912 und 5,332,802 beschrieben. Während des mechanischen Zersetzungsvorgangs wurde die Temperatur auf 5–10°C gehalten. Das Dispergiermittel wurde in einer Konzentration von 0,05% (Feuchtgutmasse des Kollagens) hinzugegeben. Das homogenisierte Präparat wurde 6 Minuten lang bei 3500 U/min zentrifugiert, um das dispergierte Kollagenmaterial von dem noch nicht dispergierten Material zu trennen. Der nicht dispergierte Rest wurde wiederum mit Dispergiermittel von 0,05% (Feuchtgutmasse des Kollagens) behandelt und in zwei 30-Sekunden-Schüben homogenisiert. Die Dispersion wurde wiederum zentrifugiert, um das dispergierte Kollagenmaterial wiederzugewinnen, das zu der ersten Wiedergewinnung hinzugegeben wurde.
Die Kollagendispersion wurde durch einen 100-Mikrometer-Filter gefiltert und bei 3500 U/min zentrifugiert, und der Niederschlag wurde 3 Mal mit 0,004 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,4, gewaschen. Die letzte Zentrifugation wurde bei 10 000 U/min vorgenommen, um den Kollagenniederschlag zu verdichten. Dann wurden Proben für die TEM gesammelt. Wie in 2A–D gezeigt, erschienen die Kollagenfasern, die entweder von der aus in vitro gezüchtetem Dermisgewebe präparierten extrazellulären Matrix (2A–B) oder von normaler Dermis eines adulten Menschen (2C–D) isoliert worden waren, zueinander identisch, insoweit dass in beiden Präparaten intakte Kollagenfasern mit typischen Kollagenbändern und normaler Periodizität auftraten.
7.3. IN DER EXTRAZELLULÄREN MATRIX VORHANDENE GLYKOSAMINOGLYKANE
Es hat sich gezeigt, dass Glykosaminoglykane im Körper eine Vielfalt struktureller und funktioneller Rollen spielen, und ihre Anwesenheit in der abgesonderten extrazellulären Matrix ist wichtig. Tabelle II führt eine Reihe von Beispielen von Glykosaminoglykanen, deren Vorhandensein in der extrazellulären Matrix festgestellt wurde, sowie ihre funktionelle Bedeutung in der normalen Dermis auf.
TABELLE II
Ferner stellte sich heraus, dass die extrazelluläre Matrix insgesamt 2,8 mg/cm² ± 0,1 sulfatierte Glykosaminoglykane enthielt.
7.4. IN DER EXTRAZELLULÄREN MATRIX VORHANDENE WACHSTUMSFAKTOREN
Die Zellen, die die extrazelluläre Matrix herstellten und ablagerten, exprimierten auch eine Reihe unterschiedlicher Wachstumsfaktoren. Wachstumsfaktoren sind in der extrazellulären Matrix aus zwei Gründen wichtig. Während des Wachstums und der Ablagerung der extrazellulären Matrix tragen auf natürliche Weise angesetzte Wachstumsfaktoren dazu bei, Zellvermehrung und -aktivität zu regeln. Ferner bleiben die Wachstumsfaktoren an der extrazellulären Matrix haften. Die Expression einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren während der Ablagerung der Matrix wurde festgestellt.
Die Expression von Wachstumsfaktoren wurde durch eine Polymerasekettenreaktion reverser Transkripte (RT-PCR) von Gesamt-RNA untersucht. Kurz gesagt wurde RNA durch eine Prozedur der SDS-Fällung und Verteilung mit organischem Lösungsmittel aus den wachsenden Zellen extrahiert. Die RNA wurde unter Verwendung der reversen Transkriptase Superscript und zufälligen Hexamer-Primern transkribiert. Derselbe Ansatz von reversem Transkript wurde zum Nachweis aller Wachstumsfaktoren verwendet. Die PCR wurde unter Standardbedingungen durchgeführt, wobei 4 μl reverses Transkript verwendet wurden, was 200 ng RNA in einem Gesamtvolumen von 20 μl entsprach.
Auf der Basis dieses Assays lagen mRNA-Transkripte von saurem und basischem FGF, TGF-α und TGF-β und KGF vor, sowie verschiedener anderer in Tabelle III gezeigter, einschließlich PDGF, Amphiregulin, HBEGF, IGF, SPARC und VEGF. Es wird angenommen, dass unter diesen PDGF und TGF-β3 in die Regulierung der Zellvermehrung und Matrixablagerung in der Kultur involviert sind, während TGF-β1, HBEGF, KGF, SPARC, VEGF und Decorin in der Matrix abgelagert werden. Amphiregulin, IGF-1, IGF-2 und IL-1 wurden nicht in dem Maßstab der in diesen Experimenten verwendeten Empfindlichkeit exprimiert. TABELLE III
Fortsetzung von TABELLE III
Fortsetzung von TABELLE III

^• Bei einigen Präparaten wird eine geringe Menge an PDGF-B-Kette beobachtet.

Claims

Ein Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen Rahmens, der mit einer auf natürliche Weise abgesonderten extrazellulären Matrix beschichtet ist, das die folgenden Schritte beinhaltet: (a) Kultivierung von Zellen auf einem dreidimensionalen Rahmen für eine vorbestimmte Zeitspanne unter Bedingungen, die für Zellwachstum günstig sind, so dass eine extrazelluläre Matrix auf den beimpften Rahmen abgesondert wird, wodurch ein beschichteter Rahmen geschaffen wird; (b) Töten der Zellen und (c) Entfernen der Zellen und Zellreste.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der dreidimensionale Rahmen ein Material ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyamid, Polyester, Polystyrol, Polypropylen, Polyacrylaten, Polyvinylverbindungen, Polycarbonat, Polytetrafluorethylen, Thermanox, Nitratzellulose, Baumwolle, Polyglykolsäure, Catgut-Material, Cellulose, Gelatine, Chitosan, Hyaluronsäure und Dextran besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der dreidimensionale Rahmen Porenräume von ungefähr 150 μm bis ungefähr 220 μm aufweist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die extrazelluläre Matrix von gewebespezifischen Zellen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Fibroblasten, Osteoblasten, Odontoblasten, Chondrozyten, Epithelzellen, glatten Muskelzellen, Retina-Zellen, Endothelzellen, stromalen Zellen oder Kombinationen davon besteht, abgesondert wird.
Verfahren zur Herstellung einer auf natürliche Weise abgesonderten extrazellulären Matrix, das das Durchführen von Schritten (a), (b) und (c) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und dann (d) das Sammeln der extrazellulären Matrix, die sich auf dem beschichteten Rahmen abgelagert hat, beinhaltet.