DE69733292T2 - Verfahren zur in vitro Herstellung von Knochen - Google Patents
Verfahren zur in vitro Herstellung von Knochen Download PDFInfo
- Publication number
- DE69733292T2 DE69733292T2 DE69733292T DE69733292T DE69733292T2 DE 69733292 T2 DE69733292 T2 DE 69733292T2 DE 69733292 T DE69733292 T DE 69733292T DE 69733292 T DE69733292 T DE 69733292T DE 69733292 T2 DE69733292 T2 DE 69733292T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- cells
- culture medium
- matrix
- bone
- substrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 80
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 48
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 40
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims abstract description 14
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 claims description 16
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 16
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 claims description 14
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 claims description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 5
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000945 filler Substances 0.000 abstract description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 19
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 12
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N Glycerol 2-phosphate Chemical compound OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 12
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 11
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 9
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 9
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 9
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 9
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 8
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 8
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 8
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 8
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 8
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 7
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 229910052586 apatite Inorganic materials 0.000 description 6
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 6
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 6
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 6
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 6
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 6
- VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;fluoride;triphosphate Chemical compound [F-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 5
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 5
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 5
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical class CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004125 X-ray microanalysis Methods 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 230000001599 osteoclastic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 description 2
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 description 2
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 2
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000000987 azo dye Substances 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007978 cacodylate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001582 osteoblastic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000278 osteoconductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000005009 osteogenic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000000352 supercritical drying Methods 0.000 description 2
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 2
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 2
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 2
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000391 tricalcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019731 tricalcium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229940078499 tricalcium phosphate Drugs 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 229910000531 Co alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 229910000599 Cr alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 description 1
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 Polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 102000007591 Tartrate-Resistant Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010032050 Tartrate-Resistant Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 239000000316 bone substitute Substances 0.000 description 1
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000004568 cement Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000000788 chromium alloy Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000004053 dental implant Substances 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002745 epiphysis Anatomy 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 210000001145 finger joint Anatomy 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000002241 glass-ceramic Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004394 hip joint Anatomy 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000003746 surface roughness Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
- A61L27/3608—Bone, e.g. demineralised bone matrix [DBM], bone powder
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
- A61L27/3645—Connective tissue
- A61L27/365—Bones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3808—Endothelial cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3821—Bone-forming cells, e.g. osteoblasts, osteocytes, osteoprogenitor cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
- A61L27/3843—Connective tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1311—Osteocytes, osteoblasts, odontoblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/10—Mineral substrates
- C12N2533/18—Calcium salts, e.g. apatite, Mineral components from bones, teeth, shells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
Description
- Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur In-vitro-Produktion von Knochengewebe auf einem Substrat, das als ein Knochenimplantat verwendet werden kann.
- Hintergrund
- Das US-Patent 5,306,305 (= WO 95/19152) offenbart ein In-vitro-Verfahren zur Herstellung einer Implantatanordnung durch Auftragen eines Osteoblastenzellen enthaltenden Gels auf eine poröse Metalloberfläche und dann Inkubieren des Gels in einem Wachstumsmedium. Ein wiederholt erneuertes Minimalmedium (Minimal Essential Medium; MEM) wird für ungefähr 3 Wochen für die Zellvervielfachung verwendet, gefolgt von einem β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure enthaltenden Medium für weitere 1–2 Wochen. Die Zellen können aus den eigenen Knochenfragmenten des Patienten stammen. Das Gel (z. B. 0,5 % Gelatine) wird verwendet, um die Zellen auf der Substratoberfläche festzuhalten.
- US-A 5,226,914 ist auf ein Verfahren zur Reparieren von Bindegewebeschädigung gerichtet, worin vom Knochenmark abstammende Zellen wachsen gelassen werden, ohne eine Matrix auf einem Substrat herzustellen. Diese Zellen werden von dem Substrat entnommen und in einem undifferenzierten Zustand auf eine beschädigte Stelle (in vivo) aufgetragen.
- Die Seiten 23–29 in Biomaterials 1996, Band 17, Nr. 1, beziehen sich auf eine Beurteilung von Implantatmaterialien in einer Zellkultur. Es wird nicht vorgeschlagen, implantierbare Anordnungen herzustellen, welche eine durchgängige Matrix enthalten.
- Die DE-A-38 10 803 offenbart ein Verfahren zum Herstellen von lebenden Knochenersatzmaterialien durch das In-vitro-Kultivieren von autologen Knochenzellen aus menschlichen Knochenfragmenten in einem wiederholt erneuerten Kulturmedium, gefolgt von der Ablagerung der kultivierten Zellen in einer porösen Calciumphosphatmatrix und dem zusätzlichen Kultivieren. Das Kompositmaterial kann reimplantiert werden.
- Die WO 94/04657 offenbart ein bioaktives poröses Glas, das auf solch eine Weise vorbehandelt wird, dass es den pH-Wert eines in Kontakt mit dem Glas befindlichen Gewebemediums nicht erhöhen kann. Sie berichtet ebenfalls von dem Aussäen von Osteoblasten auf das vorbehandelte poröse Glas.
- Diese Verfahren des Standes der Technik der in-vitro-Produktion von Knochengewebe für Implantationszwecke wurden bis jetzt noch nicht zur Praxis gebracht, möglicherweise, da die Fixierung des resultierenden Implantates in dem Körper und folglich das Funktionieren des Implantates unzureichend sind wegen Begrenzungen in den Auftragungstechniken. Keine biologische Wirkung der Verwendung eines bestimmten Kulturverfahrens wurde im Stand der Technik beschrieben. Weiterhin machen diese Verfahren des Standes der Technik das Einführen eines Knochendefektes (eine Läsion) in dem Patienten notwendig, um die erforderlichen Knochenzellen zu erhalten.
- Zusammenfassung der Erfindung
- Es wurde nun herausgefunden, dass diese Nachteile durch ein Verfahren überwunden werden können, bei welchem anstelle von differenzierten Knochenzellen, wie Osteoblasten, undifferenzierte Zellen verwendet werden, um das Implantatsubstrat zu bedecken, und bei welchem diese Zellen mit einem flüssigen Kulturmedium inkubiert werden.
- Folglich betrifft die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur in-vitro-Produktion von Knochengewebe, umfassend die folgenden Schritte:
- (a) Aufbringen undifferenzierter Säugerzellen auf einem Substrat;
- (b) direktes Kontaktieren dieser Zellen mit einem Kulturmedium für eine ausreichende Zeit, um eine mineralisierte oder nicht mineralisierte Matrix herzustellen;
- (c) Entfernen des Substrates mit der Matrix aus dem Kulturmedium, worin das Substrat eine Metall-, eine Calciumphosphat- oder eine Polymeroberfläche ist.
- Detaillierte Beschreibung der Erfindung
- Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Substrates mit einer darauf wachsen gelassenen Matrix bereit, welches bevorzugt für die Bereitstellung von Last tragenden Implantaten, einschließlich Gelenkprothesen wie künstlichen Hüftgelenken, Kniegelenken und Fingergelenken, und Maxillofacial-Implantaten wie Dentalimplantaten verwendet werden kann. Es kann ebenfalls für spezielle chirurgische Einrichtungen wie Spacer oder Knochenfüllstoffe, z. B. für die Verwendung bei der Erhöhung, Verklebung oder Wiederherstellung von Knochendefekten oder von beschädigtem oder verlorenem Knochen verwendet werden. Knochenbildung kann durch Variation in der Mineralisierung sowohl durch induktive als auch durch konduktive Vorgänge optimiert werden. Eine Kombination der Bereitstellung eines Last tragenden Implantates (vorzugsweise mit einer wie oben beschriebenen Matrix überzogen) mit einem Knochenfüllstoff, umfassend eine wie beschriebene Matrix, stellt ein vorteilhaftes Verfahren gemäß der Erfindung dar.
- Das Verfahren der Erfindung ist ebenfalls sehr geeignet hinsichtlich Revisionschirurgie, das heißt, wenn frühere chirurgische Einheiten ersetzt werden müssen.
- Undifferenzierte Zellen sind pluripotente Zellen, die sich in einem frühen Stadium der Spezialisierung befinden, das heißt, welche ihre endgültige Funktion jetzt noch nicht haben und sich immer noch in dem Vorgang der Proliferation befinden. Insbesondere sind dies Zellen, die sich bis jetzt noch nicht differenziert haben zu z. B. Osteoblasten oder Osteoclasten. Solche Zellen sind besonders Blutzellen und Zellen, die im Knochenmark anwesend sind. Besonders geeignete undifferenzierte Zellen sind Knochenmarkzellen, einschließlich hämatopoetische Zellen und insbesondere Stromazellen. Die Knochenmarkzellen und insbesondere die Stromazellen wurden dann als sehr wirksam bei dem Knochen produzierenden Vorgang befunden, wenn sie aus ihrer Ursprungsumgebung entnommen werden.
- Die undifferenzierten Zellen können direkt auf das Substrat in Schritt (a) aufgetragen werden oder sie können vorteilhafterweise in der Abwesenheit des Substrates multipliziert werden, bevor sie auf das Substrat aufgetragen werden. Bei der letzteren Weise sind die Zellen immer noch im Großen und Ganzen nach der Multiplikation undifferenziert und auf sie wird für die Zwecke der Erfindung immer noch Bezug genommen als undifferenziert. In Schritt (b) wird den Zellen ermöglicht, zu differenzieren. Differenzierung kann durch die Anwesenheit geeigneter Induktoren, wie Glucocorticoide, z. B. Dexamethason, induziert oder verstärkt werden.
- Die Verwendung undifferenzierter Zellen stellt etliche Vorteile bereit. Erstens bringt ihre geringere Differenzierung eine höhere Proliferationsrate mit sich und erlaubt es, dass die letztliche Funktionalität besser gelenkt und kontrolliert werden kann. Ferner erzeugt das Kultivieren dieser Zellen nicht nur die erforderliche Knochenmatrix, welche organische und anorganische Bestandteile enthält, sondern resultiert auch in der Anwesenheit von etlichen Faktoren in dem Kulturmedium und in der Matrix, die für das Wachstum des Gewebes und für die Anpassung an existierendes lebendes Gewebe essenziell sind. Ebenfalls kann das Kulturmedium eine Quelle für aktive Faktoren wie Wachstumsfaktoren sein, die in Verbindung mit dem Implantationsvorgang verwendet werden sollen. Weiterhin sind solche undifferenzierten Zellen oftmals in größeren Mengen und bequemer als z. B. reife Knochenzellen zugänglich und sie zeigen eine geringere Sterblichkeit während der Genesung. Es können Matrizes mit einer Stärke von 100 μm als ein Ergebnis der Verwendung undifferenzierter Zellen hergestellt werden.
- Die zu verwendenden Zellen können allogene Zellen sein, es wird jedoch oftmals bevorzugt werden, Zellen zu verwenden, die aus demselben Patienten stammen, für welchen das Implantat vorgesehen ist, das heißt autologe Zellen.
- Das Substrat, auf welches die undifferenzierten Zellen aufgetragen und kultiviert werden kann, kann ein Metall wie Titan, eine Kobalt/Chrom-Legierung oder Edelstahl, eine bioaktive Oberfläche wie Calciumphosphat, Polymeroberflächen wie Polyethylen und Ähnliches sein. Obwohl weniger bevorzugt, können silikathaltige Materialien, wie Glaskeramiken, ebenfalls als ein Substrat verwendet werden. Am bevorzugtesten sind Metalle, wie Titan und Calciumphosphate, obwohl sogar Calciumphosphat nicht ein unentbehrlicher Bestandteil des Substrates ist. Das Substrat kann porös oder nicht porös sein.
- Die Zellen können mit einer Rate von z. B. 103 bis 106 pro cm2, insbesondere 104 bis 2 105 Zellen pro cm2 aufgetragen werden.
- Das in Schritt (b) des Verfahrens gemäß der Erfindung zu verwendende Kulturmedium kann ein gewöhnliches bekanntes Kulturmedium, wie MEM (Minimalmedium; Minimum Essential Medium), sein. Vorteilhafterweise kann das Medium ein konditioniertes Medium sein. In diesem Zusammenhang wird unter einem konditionierten Medium ein Medium verstanden, worin ähnliche Zellen zuvor inkubiert worden sind, wodurch das Medium dazu gebracht wird, Faktoren zu enthalten, die für das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung wichtig sind.
- Die Zellen werden solange kultiviert, bis eine ausreichende Matrixschicht erzeugt worden ist, z. B. eine Matrixschicht mit einer Dicke von wenigstens 0,5 μm, insbesondere von 1 bis zu 100 μm, noch genauer von 10–50 μm. Die Zellen können mit dem Kulturmedium für z. B. 2–15 Wochen, insbesondere 4–10 Wochen, in Kontakt stehen.
- Die Produktion der Matrix, wenn sie auf ein Substrat aufgetragen wird, resultiert in einem kontinuierlichen oder quasi-kontinuierlichen Überzug, der das Substrat zu wenigstens 50 %, insbesondere zu wenigstens 80 % seiner Oberfläche bedeckt.
- Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Herstellung aktiver Faktoren, wie Wachstumsfaktoren, umfassend die folgenden Schritte:
- (a) Auftragen undifferenzierter Säugerzellen, insbesondere Knochenzellen, noch genauer Stromazellen, auf ein Substrat;
- (b) direktes Kontaktieren dieser Zellen mit einem Kulturmedium für eine ausreichende Zeit, um Wachstumsfaktoren zu produzieren;
- (c) Entfernen des Substrates mit der Matrix aus dem Kulturmedium;
- (d) Wiedergewinnen der aktiven Faktoren aus dem Kulturmedium.
- Die im Schritt (a) aufgetragenen Zellen können undifferenzierte Zellen sein, die direkt als solche aufgetragen werden, oder sie können Zellen sein, welche vor Schritt (a) in einem Kulturmedium ohne das Substrat multipliziert worden sind.
- Diese aktiven Faktoren umfassen Wachstumsfaktoren und andere Substanzen, die in die Knochenbildung und -remodellierung, Zellproliferation und Zelladhäsion verwickelt sind. Diese Faktoren können vorteilhafterweise in Verbindung mit einem Implantationsvorgehen verwendet werden, worin die aktiven Faktoren, möglicherweise gemeinsam mit anderen Bestandteilen des Kulturmediums, dem Patienten verabreicht werden, um das Funktionieren und die Adaptation des Implantates zu verstärken. Die Verwendung autologer Zellen wird bei diesem Vorgehen bevorzugt.
- Das Verfahren der Erfindung kann unter Befolgung der Prinzipien und Vorgänge, wie in den folgenden allgemeinen Beispielen beschrieben, durchgeführt werden.
- Beispiele
- Beispiel 1
- Rattenknochenmarkzellen-(RBMC-)Kulturtechnik
- Die Rattenknochenmarktechnik ermöglicht die Produktion einer knochenähnlichen mineralisierten Matrix auf etlichen Substraten.
- Kurz, Knochenmarkzellen werden aus den Femura junger erwachsener männlicher Ratten isoliert und werden für bis zu 4 Wochen kultiviert, um knochenähnliches Gewebe herzustellen. Das verwendete Kulturmedium umfasst α-Minimalmedium, ergänzt mit fötalem Kälberserum, Antibiotika, Ascorbinsäure, β-Glycerophosphat und Dexamethason. Bei diesem System sind die letzten drei Bestandteile essenziell für die Produktion von knochenähnlichem Gewebe. Ascorbinsäure ist erforderlich für die Collagensynthese und für die Osteogenese in vitro. Weiterhin wurde gezeigt, dass Ascorbinsäure ATPase und alkalische Phosphataseaktivitäten und Proteinsynthese in den Kulturen osteoblasten-ähnlicher Zellen reguliert. β-Glycerophosphat wird als eine Quelle organischer Phosphationen verwendet, welches deshalb wichtig ist für die Mineralisierung. Falls kein β-Glycerophosphat hinzugefügt wird, wird eine im Großen und Ganzen nicht mineralisierte Matrix gewonnen. Dexamethason, ein synthetisches Glucocorticoid, induziert die Proliferation und Enddifferenzierung osteogener Zellen.
- Ab ungefähr 2 Wochen entwickeln sich undurchsichtige, dreidimensional mineralisierte, knotenförmige Strukturen. Diese Knötchen können makroskopisch identifiziert werden und werden mit der Zeit dichter, größer und undurchsichtiger.
- SEM-Beobachtungen zeigen die Anwesenheit mineralisierter Collagenfasern zusammen mit globulären, auf der Oberfläche der Substrate abgeschiedenen Strukturen. Die globulären Strukturen haben einen Durchmesser von annähernd 0,2–1 μm und es wurde von ihnen gezeigt, dass sie mineralisiert sind und knochenspezifische Proteine (z. B. Osteopontin) enthalten. Das Ergebnis ist in
1 gezeigt. - Der osteogene Charakter des Rattenknochenmarkzellenkultursystems wurde unter Verwendung einer Anzahl von Kriterien, wie unten ausgeführt, gut charakterisiert:
- (i) Die zelluläre und extrazelluläre Matrix in den Knötchen haben mit Knochengewebe ähnliche morphologische und ultrastrukturelle Eigenschaften.
- (ii) Mit diesem Knötchen in Verbindung stehende Zellen färben intensiv mit dem Enzym alkalische Phosphatase, was eine Eigenschaft osteoblastischer Zellen ist.
- (iii) Die Knötchen sind positiv für Färbung nach Von Kossa (Phosphat) und mit Alizarinrot (Calcium).
- (iv) Die CaP-Globuli fusionieren, um eine Zementlinie zu bilden, die reich an Glycosaminoglycanen ist.
- (v) Collagenfasern haben eine Periodizität von 64–67 nm, welche an Collagen Typ I erinnert, das ebenfalls in Knochen anwesend ist.
- (vi) Ultrastrukturell ist die Mineralisation aus nadelförmigen, knochenähnlichen Kristallen zusammengesetzt.
- (vii) Röntgenstrahlmikroanalyse
(XRMA) zeigt die Anwesenheit von Ca und P (siehe
2 ). - (viii) Mit der Zeit exprimieren die Kulturen ein alkalisches Phosphatase/DNS-Spitzenverhältnis ungefähr um den Tag 12 herum, was charakteristisch für osteogene Rattenkulturen ist.
- (ix) Von der Osteocalcin-(Knochenprotein-)Herstellung wurde
gezeigt, dass sie am Tag 4 beginnt (siehe
3 ). - Zusammenfassend wurde basierend sowohl auf morphologischen als auch auf immunhisto/cyto-chemischen Daten basierend der osteogene Charakter der Technik gezeigt.
- Beispiel 2
- Menschliche Knochenmarkkultur-(HBMC-)Technik
- Menschliche Knochenmarkzellen können unter ähnlichen Bedingungen kultiviert werden, wie jene, die für die Rattenknochenmarkzellkulturtechnik beschrieben worden sind. Anstelle der Verwendung von fötalem Kälberserum in dem Kulturmedium ist die Verwendung von autologem Serum (aus dem Donorpatienten) oder synthetischem Serum gleichwertig möglich. Bis heute hat die Charakterisierung ebenfalls die osteogene Kapazität dieses Kultursystems gezeigt, wie unten umrissen:
- – Nach annähernd 4 Wochen entwickeln sich " Knötchen", die ausgedehnter und weniger ausgeprägt sind als jene, die in einer Standard-RBMC-Kultur gesehen werden.
- – SEM-Beobachtungen
zeigen die Anwesenheit von auf der Oberfläche der Substrate abgelagerten
mineralisierten Collagenfasern und globulären Strukturen. Die globulären Strukturen
haben einen Durchmesser von annähernd
1–2 μm und ähneln den
in Rattenknochenmarkzellkulturen gesehenen Phosphatglobuli (obwohl
sie etwas größer sind
als jene, die in der RBMC-Kultur beobachtet wurden). Allgemein fehlt
die globuläre
Schicht und wird ebenfalls in Verbindung mit mineralisierten Collagenfasern
gesehen. Das Ergebnis ist in
4 gezeigt. - – Ähnlich zu den RBMC-Kulturen färben diese Knötchen positiv mit alkalischer Phosphatase, Calcium und Phosphat.
- – Mit der Zeit exprimieren die Kulturen ein Spitzenverhältnis von alkalischer Phosphatase/DNS ungefähr um den Tag 20 herum, wobei diese letzte Expression mit dem verzögerten Einsetzen der Mineralisierung in der HBMC korreliert.
- Beispiel 3
- Osteoclastenkulturen auf Calciumphosphat-(CaP-)Substraten
- Ziel
- Das Ziel dieser Untersuchung war, den Einfluss von von Osteoblasten abgeleiteten Faktoren auf die osteoblastische Resorption zu untersuchen.
- Materialien und Methoden
- Experimenteller Ansatz: Die Kulturen wurden in zwei Gruppen aufgeteilt: (i) CaP nur mit Osteoblasten und (ii) CaP mit Osteoblasten, gefolgt von Osteoclasten.
- Zubereitung der Calciumphosphatproben: Sämtliche Calciumphosphatproben wurden poliert, um eine ähnliche Oberflächenrauigkeit zu ergeben, und wurden gereinigt und sterilisiert vor der Verwendung.
- Osteoblastenkulturen: Knochenmarkzellen wurden von jungen Raten wie folgt isoliert: Die Femura wurden präpariert, gut gewaschen und die Epiphysen wurden entfernt. Das Knochenmark wurde anschließend aus der Markhöhle unter Verwendung einer Spritze mit einer daran befestigten Subkutannadel herausgespült, gefüllt mit Alpha-Minimalmedium, ergänzt mit 15 % fötalem Rinderserum, Antibiotika, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 10–8 M Dexamethason und 1 M β-Glycerophosphat. Die Zellsuspension wurde dann auf den Proben ausgesät und wurde für 18 Tage kultiviert.
- Osteoclastenkulturen: Knochenmarkzellen wurden aus den Femura junger Ratten, wie oben beschrieben, in Medium ohne hinzugefügtes Dexamethason isoliert.
- Fixierung: Nach der Kulturperiode wurden die Vertiefungen 3-mal in PBS bei 37 °C gewaschen, gefolgt von der Fixierung in 2 % Paraformaldehyd/2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer, pH 7,4, bei 4 °C. Nachfolgend wurden sie in destilliertem Wasser gewaschen vor der TRAP-Färbung.
- Tartratresistente saure Phosphatase (TRAP): Tartratresistente saure Phosphatase wurde unter Verwendung einer Modifikation des durch Barka (1) beschriebenen Azofarbstoffverfahrens nachgewiesen, bei welchem 3,9 mg/ml Weinsäure zu der Inkubationslösung hinzugefügt wurde. Nach dem Färben wurden die Proben gut in destilliertem Wasser gewaschen und, wo möglich, wurde die Zellmultischicht entfernt; dies erleichterte die Sichtbarmachung der TRAP-+ve-Zellen. Die Proben wurden anschließend für Rasterelektronenmikroskopie vorbereitet.
- Rasterelektronenmikroskopie: Proben wurden durch abgestufte Ethanolreihen dehydriert und der kritischen Punkttrocknung mit CO2 unterzogen. Alle Proben wurden mit zerstäubtem Gold vor der Untersuchung überzogen.
- Ergebnisse
- Osteoclastenkulturen: Osteoclasten (TRAP-positive Zellen) wurden bei den verschiedenen Materialien gesehen, obwohl Resorption der zu Grunde liegenden Substrate nicht beobachtet wurde.
- Osteoblasten, gefolgt von Osteoclastenkulturen: Osteoclasten waren auf den Materialien vorhanden und es wurde eine Resorption der durch die Osteoblasten gebildeten mineralisierten Matrix gesehen. In dem Fall von bei 600 °C gesintertem Hydroxyapatit und Tricalciumphosphat (TCP) wurde die Resorption der zu Grunde liegenden Substrate ebenfalls beobachtet.
- Schlussfolgerungen
- Dieses Beispiel zeigt, dass Osteoblasten in der Lage sind, gewisse Calciumphosphate zu resorbieren, jedoch nur, wenn Osteoblasten zuerst auf den Substraten kultiviert werden. Dies legt eine Konditionierung der Substratoberflächen nahe, durch Faktoren, die durch Osteoblasten hergestellt werden, welche eine stimulierende Wirkung auf die Osteoclastenaktivität haben.
- Beispiel 4
- Osteoclastenkulturen auf Apatit, vorbehandelt mit osteoblasten-konditioniertem Medium
- Ziel
- Das Ziel dieses Experimentes war, die Wirkung von mit Osteoblasten konditioniertem Medium auf die osteoclastische Resorption einer Apatitschicht zu untersuchen. Nach der Kulturperiode wurde die Anzahl tartratresistenter, für saure Phosphatase positiver Zellen (Osteoclasten) quantifiziert und die Proben wurden untersucht, um zu sehen, ob die osteoclastische Resorption der Apatitschicht geschehen war.
- Materialien und Methoden
- Vorbehandlung einer Apatitschicht mit konditioniertem oder Kontrollmedium: Sterile Proben wurde in mit Osteoblasten konditioniertem Medium für annähernd 16 Stunden inkubiert vor der Osteoclastenkultur. Kontrollproben wurden ebenfalls in nicht konditioniertem Medium (Alpha-Minimalmedium) für 16 Stunden inkubiert.
- Osteoclastenkultur: Eine Osteoclastenkultur aus neu geborenen Hühnchen wurde an beiden Probensätzen durchgeführt. Die Osteoclasten wurde in Alpha-Minimalmedium, ergänzt mit 10 % FCS und 10–6 M PGE2 (Prostaglandin E2), für 48 Stunden bei 37 °C kultiviert.
- Fixierung: Nach der Kulturperiode wurden die Vertiefungen 3-mal in PBS bei 37 °C gewaschen, gefolgt von der Fixierung in 1,5 Glutaraldehyd in 0,14 M Natriumcacodylatpuffer, pH 7,4, bei 4 °C für 15–30 Minuten. Nachfolgend wurden sie in destilliertem Wasser vor der TRAP-Färbung gewaschen.
- Tartratresistentes saures Phosphat (TRAP) wurde unter Verwendung einer Modifikation des von Barka (1) beschriebenen Azofarbstoffverfahrens detektiert, bei welchem 3,9 mg/ml Weinsäure zu der Inkubationslösung hinzugefügt wurde. Nach dem Färben wurden die Proben gut in destilliertem Wasser gewaschen und, wo möglich, wurde die Zellmultischicht entfernt: Dies erleichterte die Sichtbarmachung der TRAP-+ve-Zellen. Photomikrographien wurden dann aufgenommen und die Proben wurden nachfolgend für die Rasterelektronenmikroskopie vorbereitet.
- Rasterelektronenmikroskopie: Die Proben wurden durch eine abgestufte Ethanolreihe dehydriert und am kritischen Punkt von CO2 getrocknet. Alle Proben wurden mit zerstäubtem Gold vor der Untersuchung überzogen.
- Ergebnisse
- Unter Verwendung von Auflichtmikroskopie wurden TRAP-positive Zellen sowohl bei den behandelten als auch bei den Kontrollproben beobachtet; die Anzahl TRAP-positiver Zellen wurde gezählt, wobei die Ergebnisse für das konditionierte Medium ungefähr 220 und für das nicht konditionierte Kontrollmedium ungefähr 25 betrug.
- Unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie wurde Resorption des Apatits deutlich sowohl bei den behandelten als auch bei den Kontrollproben gesehen. Obwohl die Anzahl der Resorptionslakunen nicht quantifiziert wurde, hatte man den Eindruck, dass mehr auf den mit konditioniertem Medium behandelten Proben vorhanden waren.
- Schlussfolgerungen
- Dieses Experiment zeigte, dass es eine signifikante Zunahme in der Anzahl der Osteoclasten auf der Apatitschicht nach der Vorbehandlung mit Medium, das mit Osteoblasten konditioniert worden war, gibt (siehe
5 ). Dieser Unterschied legt die Anwesenheit eines Osteoclasten stimulierenden Faktors, hergestellt von Osteoblasten, in dem konditionierten Medium nahe. - Beispiel 5
- Implantation eines Komposits aus porösem Hydroxyapatit und kultivierten Rattenknochenmarkzellen
- Einführung
- Fischer-344-Rattenknochenmarkzellen, kultiviert auf einem porösen Hydroxyapatitsubstrat, wurden subkutan in andere Fischer-344-Individuen implantiert. Der Zweck dieser Untersuchung war, die osteokonduktive und osteoinduktive Fähigkeit des gewonnenen Komposits zu beurteilen.
- Materialien und Methoden
- Hydroxyapatitscheiben: Poröse Hydroxyapatitblöcke (8·2·2 mm), gesintert bei 1300 °C für 96 Stunden.
- Ratten: Implantation in 7 Wochen alte männliche Fischer-Albino-Ratten (ungefähr 250 bis 300 g).
- Kulturprotokoll: Rattenknochenmarkzellen wurden auf und in den Hydroxyapatitscheiben für 4 Wochen gemäß dem früher beschriebenen Verfahren kultiviert. Rattenknochenmarkzellen wurden isoliert und in 75 m2-Kolben übertragen und kultiviert (geschätzte Ausbeute 1,5·106 Zellen pro Kolben). Nach 7 Tagen wurden die Zellen mit Trypsin behandelt, gezählt und auf dem Hydroxyapatit und den Kontrollen mit 1–2·105 Zellen pro cm2 ausgesät. In den Konstrukten wurden Zellen für 4 Wochen vor der Implantation kultiviert.
- Implantationsvorgehen: Die Konstrukte wurden subkutan in den Rücken der Ratten implantiert. Nach 4 Wochen Implantation wurden die Tiere getötet und die Proben wurden in Glutaraldehyd fixiert.
- Beurteilungsvorgehen: Die Proben wurden auf 100 % Ethanol dehydriert und wurden dann in Methylmethacrylatlösung eingebettet oder der Kritischen Punkt-Trocknung unterzogen. Die Proben wurden durch Lichtmikroskopie oder Rückstreuungs- und reguläre Elektronenmikroskopie untersucht.
- Kontrollen: Als Kontrollen wurden Hydroxyapatitblöcke verwendet, die in Gewebekulturmedium für 4 Wochen ohne Zellen inkubiert worden waren, welche dann ähnlich wie die Konstrukte implantiert worden sind. Es wurden ebenfalls Zellen auf den Hydroxyapatitblöcken für einen Zeitraum von 8 Wochen kultiviert und nicht in Ratten implantiert.
- Ergebnisse
- Es wurde festgestellt, dass sich nach 4 Wochen Gewebekultur in den Hydroxyapatitblöcken Matrix durch die Zellen auf der Oberfläche des Konstruktes und in seinen Poren gebildet hatte. Ein Teil der Matrix war kalzifiziert. Nach 8 Wochen Kultur war diese Matrixbildung hervorstechender und es wurden ca. 50 μm dicke Matrizes gewonnen. Ferner war die Verkalkung ausgedehnter. Hydroxyapatitblöcke, die nicht mit kultivierten Zellen inkubiert worden waren, zeigten keine Matrixbildung.
- Nach 4 Wochen Implantation zeigten die Kontrollhydroxyapatitblöcke (ohne kultivierte Zellen) keine Knochenbildung auf ihrer Oberfläche. Nur fibröses Gewebe und Exudat konnten beobachtet werden. Die Situation für die Konstrukte (mit kultivierten Zellen und Matrix) war wesentlich verschieden davon. Insbesondere in den Poren konnten deutliche Anzeichen von Knochenbildung beobachtet werden. Diese Knochenbildung war deutlich verschieden von der Matrixbildung, wie sie in Kultur beobachtet werden konnte, sowohl was den 4-wöchigen als auch den 8-wöchigen Kulturzeitraum betraf. Knochenbildung geschah gemäß der Bonding-Osteogenesetheorie, was die osteokonduktive Natur der kultivierten Matrix anzeigt.
- Beispiel 6
- Osteoblastenkulturen auf in vitro gebildeter mineralisierter extrazellulärer Matrix
- Das Ziel dieses Experimentes war, die Wirkung von in vitro gebildeter, extrazellulärer Matrix auf die alkalische Phosphataseaktivität kultivierter Osteoblasten zu untersuchen.
- Materialien und Methoden
- Zubereitung von Zellsuspensionen: Knochenmarkzellen wurden aus den Femura junger erwachsener Fischer-Ratten isoliert und wurden bis nahe zur Konfluenz kultiviert (annähernd 7 Tage) in einem α-Minimalmedium, das 15 % fötales Rinderserum, Antibiotika, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml Ascorbinsäure und 10–8 M Dexamethason enthielt. Die Zellen wurden dann kurz in steriler phosphatgepufferter Salzlösung gespült und wurden mit 0,25 % Trypsin behandelt, um die Zellen von der Kulturoberfläche abzulösen. Die Zellsuspensionen wurden vereinigt und in einem Burker-Turk-Hämocytometer gezählt.
- Stadium 1: Die Zellen für das erste Stadium des Experimentes wurden isoliert und wie oben beschrieben zubereitet. Die Zellen wurden in 12 Vertiefungen aufweisende Gewebekulturplatten mit einer Dichte von 1·104 Zellen/cm2 ausgesät und wurden in einem ähnlichem Medium für 4 Wochen kultiviert, um eine mineralisierte extrazelluläre Matrix zu erzeugen. Das Medium wurde 3-mal pro Woche erneuert. Nach der anfänglichen Kulturperiode wurden sämtliche Vertiefungen 3-mal mit steriler PBS gespült und wurden dann bei –20 °C für wenigstens 24 Stunden gelagert (um die Zellpopulation abzutöten), bis sie für das zweite Stadium des Experimentes benötigt wurden.
- Stadium 2: Die Zellen aus dem ersten Stadium des Experimentes wurden isoliert und, wie oben beschrieben, zubereitet und wurden dann wie folgt ausgesät:
- (i) 12 Vertiefungen aufweisende Platten mit in vitro gebildeter extrazellulärer Matrix. n = 6 (Platten im Stadium 1 zubereitet). Die Platten mit Matrix wurden aus der –20°C-Lagerung entfernt, auf Raumtemperatur erwärmt, 3-mal mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung gespült und anschließend mit α-MEM: Die Zellen wurden dann mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen/cm2 ausgesät und wurden für 1, 4, 6, 8, 11, 12, 13, 14 und 15 Tage kultiviert. Als eine Kontrolle wurde eine Platte mit Matrix für 15 Tage nur in Medium kultiviert (das heißt ohne Zellen).
- (ii) 12 Vertiefungen aufweisende Kontrollgewebekulturpolystyrolplatten ohne Matrix. n = 6. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen/cm2 ausgesät und wurden für 1, 4, 6, 8, 11, 12, 13, 14 und 15 Tage kultiviert.
- Bei jeder Zeitperiode wurde eine Platte von jeder Kulturgruppe in PBS gespült und bei –20 °C für wenigstens 24 Stunden gelagert. Am Ende der Kulturperiode wurden sämtliche Platten hinsichtlich DNS- und alkalische Phosphataseaktivität-(APA)-Analyse untersucht. Das APA/DNS-Verhältnis wurde dann berechnet und grafisch dargestellt.
- Ergebnisse
- In Stadium 1 dieses Experimentes wurde eine reiche mineralisierte extrazelluläre Matrix in sämtlichen Vertiefungen nach 4-wöchiger Kulturdauer gebildet. Eine reiche mineralisierte extrazelluläre Matrix wurde ebenfalls in Stadium 2 gebildet, es war jedoch nicht möglich, morphologisch zu beurteilen, ob es einen Unterschied zwischen den beiden experimentellen Gruppen gab. DNS- und alkalische Phosphataseanalyse zeigten jedoch einen deutlichen Unterschied. DNS-Analyse zeigte ähnliche Zellzahlen für beide Gruppen (
6a ), wohingegen die alkalische Phosphataseaktivität signifikant höher für die Zellen war, die auf der in vitro gebildeten extrazellulären Matrix kultiviert worden waren (6b ). Für beide Gruppen wurde die alkalische Phosphatasespitzenaktivität pro Zelle am Tage 11 gesehen, obwohl eine signifikant höhere Aktivität bei der Anwesenheit der in vitro gebildeten extrazellulären Matrix gesehen wurde (6c ). - Schlussfolgerung
- Knochenmarkzellen, die auf einer in vitro produzierten Knochenmatrix kultiviert worden sind, haben eine signifikant höhere Aktivität als jene, die auf Gewebekulturpolystyrol kultiviert worden sind. Die Anwesenheit dieser Matrix kann deshalb die Aktivität von und die Knochenbildung durch osteogene Zellen triggern.
- Beschreibung der Figuren
-
1 zeigt eine SEM-Fotografie von in vitro gebildetem Knochen, zusammengesetzt aus Ca-P-Globuli und Collagen (Rattenknochenmarkkultur). -
2 zeigt eine Röntgenstrahlmikroanalyse der Knochenmarkkultur: P zeigt Phosphor und CA zeigt Calcium an: die kleineren Elemente stammen von der Messvorrichtung. -
3 ist eine grafische Darstellung der Osteocalcinfreisetzung über die Zeit im Kulturmedium aus verschiedenen kristallinen Hydroxyapatitsubstraten. -
4 zeigt eine SEM-Fotografie von in vitro gebildetem Knochen, zusammengesetzt aus Ca-P-Globuli und Collagen (menschliche Knochenmarkkultur). -
5 zeigt grafisch die Anzahl an Osteoclasten auf Apatitsubstraten mit und ohne konditioniertem Medium, mit und ohne PGE2. -
6a ist eine Grafik, die den DNS-Gehalt (Anzahl an Zellen) einer Knochenmarkzellkultur auf Gewebekulturpolystyrol (–-Matrix) und in vitro gebildeter Knochenmatrix (+-Matrix) zeigt. -
6b ist eine Grafik, die die alkalische Phosphataseaktivität (APA) von Knochenmarkzellkultur auf Gewebekulturpolystyrol (–-Matrix) und in vitro gebildeter Knochenmatrix (+-Matrix) zeigt. -
6c ist eine Grafik, die das APA/DNS-Verhältnis von Knochenmarkzellkultur auf Gewebekulturpolystyrol (–-Matrix) und in vitro gebildeter Knochenmatrix (+-Matrix) zeigt.
Claims (10)
- Verfahren zur in vitro-Produktion von Knochengewebe, umfassend die Schritte: (a) Aufbringen undifferenzierter Säugerzellen auf ein Substrat; (b) direktes Kontaktieren der Zellen mit einem Kulturmedium für ausreichende Zeit, um eine kontinuierliche mineralisierte oder un-mineralisierte Matrix mit einer Dicke von mindestens 0,5 μm zu erzeugen; und (c) Entfernen des Substrats mit der Matrix aus dem Kulturmedium, worin das Substrat ein Metall, ein Calciumphosphat oder eine Polymeroberfläche ist.
- Verfahren nach Anspruch 1, worin die undifferenzierten Säugerzellen Knochenmarkszellen, insbesondere Stromazellen sind.
- Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Zellen autologe Zellen sind.
- Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin in Schritt (a) die Zellen mit einer Rate von 103 bis 106 Zellen pro cm2 aufgebracht werden.
- Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das in Schritt (b) verwendete Kulturmedium ein konditioniertes flüssiges Kulturmedium ist.
- Verfahren nach Anspruch 5, worin das in Schritt (b) verwendete Kulturmedium durch vorherige Exposition an lebensfähige Knochenmarkszellen konditioniert ist.
- Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Zellen in Schritt (b) mit dem Kulturmedium solange in Kontakt gebracht werden, bis eine Matrixschicht von 1–100 μm erzeugt worden ist.
- Verfahren nach Anspruch 7, worin die Zellen in Schritt (b) mit dem Kulturmedium solange in Kontakt gebracht werden, bis eine Matrixschicht von 10–50 μm erzeugt worden ist.
- Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Zellen in Schritt (b) mit dem Kulturmedium für mindestens zwei Wochen in Kontakt gebracht werden.
- Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Bereitstellung von Belastung tragenden Implantaten, Gelenkprotesen, Maxillofazialimplantaten oder speziellen chirurgischen Geräten.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP96200553 | 1996-03-01 | ||
EP96200553 | 1996-03-01 | ||
EP96202536 | 1996-09-09 | ||
EP96202536 | 1996-09-11 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE69733292D1 DE69733292D1 (de) | 2005-06-23 |
DE69733292T2 true DE69733292T2 (de) | 2006-04-27 |
Family
ID=26142564
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE69733292T Expired - Fee Related DE69733292T2 (de) | 1996-03-01 | 1997-03-03 | Verfahren zur in vitro Herstellung von Knochen |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6152964A (de) |
AT (1) | ATE295875T1 (de) |
CA (1) | CA2198978A1 (de) |
DE (1) | DE69733292T2 (de) |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5635386A (en) * | 1989-06-15 | 1997-06-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods for regulating the specific lineages of cells produced in a human hematopoietic cell culture |
DE69714035T2 (de) | 1997-08-14 | 2003-03-06 | Sulzer Innotec Ag, Winterthur | Zusammensetzung und Vorrichtung zur Reparatur von Knorpelgewebe in vivo bestehend aus Nanokapseln mit osteoinduktiven und/oder chondroinduktiven Faktoren |
US20020034819A1 (en) * | 1998-02-23 | 2002-03-21 | Alan K. Smith | Human lineage committed cell composition with enhanced proliferative potential, biological effector function, or both; methods for obtaining same; and their uses |
US6811776B2 (en) * | 2000-12-27 | 2004-11-02 | The Regents Of The University Of Michigan | Process for ex vivo formation of mammalian bone and uses thereof |
DE10013223C2 (de) * | 2000-03-13 | 2002-07-18 | Co Don Ag | Verfahren zur in vitro-Herstellung von dreidimensionalem, vitalem Knorpel- oder Knochengewebe und dessen Verwendung als Transplantationsmaterial |
US20020114795A1 (en) | 2000-12-22 | 2002-08-22 | Thorne Kevin J. | Composition and process for bone growth and repair |
US20030119771A1 (en) * | 2001-08-22 | 2003-06-26 | Rompaey Luc Van | Modulators of bone homeostasis identified in a high-throughput screen |
WO2003041568A2 (en) * | 2001-11-15 | 2003-05-22 | University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey | A three-dimensional matrix for producing living tissue equivalents |
FR2833610B1 (fr) * | 2001-12-14 | 2007-01-26 | Natural Implant | Construits cellulaires cultives in vitro, preparation et utilisations |
US7622562B2 (en) | 2002-06-26 | 2009-11-24 | Zimmer Orthobiologics, Inc. | Rapid isolation of osteoinductive protein mixtures from mammalian bone tissue |
US7113320B2 (en) * | 2003-02-06 | 2006-09-26 | Evans & Sutherland Computer Corporation | GLV based fiber optic transmitter |
WO2004111643A2 (fr) * | 2003-06-11 | 2004-12-23 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Modeles de systeme osseux |
US8181472B2 (en) * | 2005-03-17 | 2012-05-22 | Electrolux Home Products, Inc. | Electronic refrigeration control system |
US7749555B2 (en) * | 2006-01-25 | 2010-07-06 | Medtronic, Inc | Modification of chemical forces of bone constructs |
US7718616B2 (en) | 2006-12-21 | 2010-05-18 | Zimmer Orthobiologics, Inc. | Bone growth particles and osteoinductive composition thereof |
DE102007005946A1 (de) * | 2007-02-01 | 2008-08-14 | Stiftung Caesar | Therapeutische Zusammensetzung und Verwendung einer zellfreien Substanz |
US20110129866A1 (en) * | 2007-11-14 | 2011-06-02 | Osteosphere, Llc | Novel tissue culture platform for screening of potential bone remodeling agents |
US20100055078A1 (en) * | 2008-08-15 | 2010-03-04 | The Government of the U.S.A, as represented by the Department of Veterans Affairs | Methods of making a transplantable bone repair system using multipotent stem cells |
IL204116A (en) | 2010-02-23 | 2013-10-31 | Sheltagen Medical Ltd | Three-dimensional implant for the bones and method of production |
WO2012048275A2 (en) | 2010-10-08 | 2012-04-12 | Caridianbct, Inc. | Configurable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system |
AU2011329054B2 (en) | 2010-11-15 | 2015-05-28 | Zimmer Orthobiologics, Inc. | Bone void fillers |
JP6612227B2 (ja) | 2013-11-16 | 2019-11-27 | テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド | バイオリアクターにおける細胞増殖 |
EP3122866B1 (de) | 2014-03-25 | 2019-11-20 | Terumo BCT, Inc. | Passives ersetzen von medien |
JP6830059B2 (ja) | 2014-09-26 | 2021-02-17 | テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド | スケジュール化された細胞フィーディング |
US9238090B1 (en) | 2014-12-24 | 2016-01-19 | Fettech, Llc | Tissue-based compositions |
WO2017004592A1 (en) | 2015-07-02 | 2017-01-05 | Terumo Bct, Inc. | Cell growth with mechanical stimuli |
JP7034949B2 (ja) | 2016-05-25 | 2022-03-14 | テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド | 細胞の増殖 |
US11104874B2 (en) | 2016-06-07 | 2021-08-31 | Terumo Bct, Inc. | Coating a bioreactor |
US11685883B2 (en) | 2016-06-07 | 2023-06-27 | Terumo Bct, Inc. | Methods and systems for coating a cell growth surface |
US11624046B2 (en) | 2017-03-31 | 2023-04-11 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
CN110612344B (zh) | 2017-03-31 | 2023-09-12 | 泰尔茂比司特公司 | 细胞扩增 |
GB2619893A (en) | 2021-03-23 | 2023-12-20 | Terumo Bct Inc | Cell capture and expansion |
Family Cites Families (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4352887A (en) * | 1979-10-29 | 1982-10-05 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Method and article for culturing differentiated cells |
US4314380A (en) * | 1980-09-26 | 1982-02-09 | Koken Co., Ltd. | Artificial bone |
US4485096A (en) * | 1982-02-26 | 1984-11-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Tissue-equivalent and method for preparation thereof |
US5628781A (en) * | 1985-06-06 | 1997-05-13 | Thomas Jefferson University | Implant materials, methods of treating the surface of implants with microvascular endothelial cells, and the treated implants themselves |
US4963489A (en) * | 1987-04-14 | 1990-10-16 | Marrow-Tech, Inc. | Three-dimensional cell and tissue culture system |
US5266480A (en) * | 1986-04-18 | 1993-11-30 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Three-dimensional skin culture system |
US5124316A (en) * | 1986-11-14 | 1992-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | Method for periodontal regeneration |
US5041138A (en) * | 1986-11-20 | 1991-08-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Neomorphogenesis of cartilage in vivo from cell culture |
US4846835A (en) * | 1987-06-15 | 1989-07-11 | Grande Daniel A | Technique for healing lesions in cartilage |
US4904259A (en) * | 1988-04-29 | 1990-02-27 | Samuel Itay | Compositions and methods for repair of cartilage and bone |
US5197985A (en) * | 1990-11-16 | 1993-03-30 | Caplan Arnold I | Method for enhancing the implantation and differentiation of marrow-derived mesenchymal cells |
US5226914A (en) * | 1990-11-16 | 1993-07-13 | Caplan Arnold I | Method for treating connective tissue disorders |
FR2670215B1 (fr) | 1990-12-10 | 2000-10-13 | Lignees de cellules immortalisees et leurs applications, notamment a la production de cellules differenciees. | |
FR2679250B1 (fr) * | 1991-07-19 | 1995-07-13 | Inoteb | Utilisation de carbonate de calcium poreux comme materiau support de culture in vitro de cellules eucaryotes. |
GB9125052D0 (en) * | 1991-11-26 | 1992-01-22 | Isis Innovation | Culture of bone cells |
CA2142282A1 (en) * | 1992-08-13 | 1994-03-03 | Paul Ducheyne | Bioactive material template for in vitro synthesis of bone tissue |
US5541106A (en) * | 1993-04-05 | 1996-07-30 | Desmos, Inc. | Cell matrix stimulated attachment and hemidesmosome assembly |
US5522895A (en) | 1993-07-23 | 1996-06-04 | Rice University | Biodegradable bone templates |
JP2984176B2 (ja) | 1993-12-30 | 1999-11-29 | 新田ゼラチン株式会社 | 骨髄細胞の培養方法、培養用混合物および硬組織欠損部への移植用材料 |
US5972703A (en) * | 1994-08-12 | 1999-10-26 | The Regents Of The University Of Michigan | Bone precursor cells: compositions and methods |
US5707962A (en) * | 1994-09-28 | 1998-01-13 | Gensci Regeneration Sciences Inc. | Compositions with enhanced osteogenic potential, method for making the same and therapeutic uses thereof |
HU222040B1 (hu) * | 1994-11-08 | 2003-04-28 | Cellfactors Plc | Eljárás humán porc, csont és neurális sejtvonalak előállítására |
US5688531A (en) * | 1994-12-23 | 1997-11-18 | Ramot University Authority For Applied Research And Industrial Development, Ltd. | Method for regulating bone forming cells |
ES2238077T3 (es) * | 1995-11-16 | 2005-08-16 | Case Western Reserve University | Induccion condrogenica in vitro de celulas madre mesenquimatosas humanas. |
IT1282207B1 (it) * | 1995-11-20 | 1998-03-16 | Fidia Advanced Biopolymers Srl | Sistemi di coltura di cellule staminali di midollo osseo umano in matrici tridimensionali costituiti da esteri dell'acido ialuronico |
JP2000503542A (ja) * | 1996-01-16 | 2000-03-28 | デピュイ オーソピーディック,インコーポレイテッド | 造血及び非造血組織からの前駆細胞の分離及び in vivo 骨及び軟骨再生におけるそれらの使用 |
WO1997039104A1 (en) * | 1996-04-17 | 1997-10-23 | Osiris Therapeutics, Inc. | Cryopreservation and extensive subculturing of human mesenchymal stem cells |
EP2105138A3 (de) * | 1996-04-19 | 2013-06-05 | Osiris Therapeutics, Inc. | Regeneration und Augmentation von Knochen mit Hilfe von mesenchymalen Stammzellen |
-
1997
- 1997-03-03 US US08/810,266 patent/US6152964A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-03 CA CA002198978A patent/CA2198978A1/en not_active Abandoned
- 1997-03-03 AT AT97200620T patent/ATE295875T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-03-03 DE DE69733292T patent/DE69733292T2/de not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-07-21 US US09/621,178 patent/US6299650B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-06-08 US US09/877,169 patent/US20010032016A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69733292D1 (de) | 2005-06-23 |
CA2198978A1 (en) | 1997-09-01 |
US6299650B1 (en) | 2001-10-09 |
US6152964A (en) | 2000-11-28 |
ATE295875T1 (de) | 2005-06-15 |
US20010032016A1 (en) | 2001-10-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69733292T2 (de) | Verfahren zur in vitro Herstellung von Knochen | |
DE69626560T2 (de) | Laminare Knochengrundlage für das Knorpelwachstum | |
DE68904800T2 (de) | Zusammensetzung fuer das ausbessern von knorpel und knochen und verfahren fuer ihre zubereitung als skelett-gewebe-implantat. | |
DE69634454T2 (de) | Zusammensetzungen und Verfahren mit Bezug auf eine auf natürliche Weise sekretierte Matrix | |
DE60028070T2 (de) | Transplantatmaterial und ein herstellungsverfahren dafür | |
DE69626035T2 (de) | Ein biologisches material, das eine wirksame kultur von knochenmarkstammzellen, die teilweise oder vollständing in bindegewebszellen differenziert sind, enthält, und eine dreidimensionale, bioverträgliche und biologische abbaubare matrix, die aus einen hyaluronsäurederivat besteht | |
DE69227103T2 (de) | Implantierbare gewebegrundlage und verfahren zur reduzierung der immunogenität | |
EP1265986B1 (de) | Verfahren zur in vitro-herstellung von dreidimensionalem, vitalem knorpel- oder knochengewebe | |
DeBruijn et al. | Bone induction by implants coated with cultured osteogenic bone marrow cells | |
DE60207198T2 (de) | Transplantate für die wiederherstellung von osteochondralen schäden | |
DE60128933T2 (de) | Verfahren zur behandlung eines patienten mit einem kultivierten bindegewebe-konstrukt | |
US4609551A (en) | Process of and material for stimulating growth of cartilage and bony tissue at anatomical sites | |
DE60029566T2 (de) | In-vitro herstellung von transplantierbarem knorpelgewebe | |
EP1385449A2 (de) | Biologisch funktionalisierte, metabolisch induktive implantatoberflächen | |
DE60016288T2 (de) | Isolierung von vorläuferzellen und deren verwendung zum wiederaufbau von bindegewebe | |
DE10026789B4 (de) | Knorpelersatz und Verfahren zu dessen Herstellung | |
DE60017757T2 (de) | Humanisierte biomaterialien enthaltend monozyten oder makrophagen, ein verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendungen | |
DE102006012162A1 (de) | Knochen Reparaturmaterial unter Verwendung einer Knorpelzelle mit dem Potenzial für Hypertrophie und ein Gerüst | |
DE68918043T2 (de) | Knochenersatzmaterial und Knochenzement. | |
DE102006060331A1 (de) | Neues, durch einen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestelltes zellfun ktionsregulierendes Mittel | |
EP0798374B1 (de) | Verfahren zur in vitro Herstellung von Knochen | |
EP2419152A2 (de) | Implantat und therapeutische zusammensetzung zur behandlung von schäden und/oder erkrankungen im bereich des menschlichen und/oder tierischen stütz- und bewegungsapparates | |
EP1232203B1 (de) | 3d-matrix zur herstellung von zelltransplantaten | |
DE112016001386B4 (de) | Kohlenstoffpartikel und Komposite derselben für die Regeneration von Skelettmuskelgewebe und Weichgewebe | |
DE112008001641T5 (de) | Reparatur und Behandlung von Knochendefekt unter Verwendung von einem durch hypertrophierungsfähige Chondrozyten hergestellten Wirkstoff und Gerüst |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: OCTOPLUS SCIENCES B.V., LEIDEN, NL |
|
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |