DE69733292T2 - Verfahren zur in vitro Herstellung von Knochen - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur In-vitro-Produktion von Knochengewebe auf einem Substrat, das als ein Knochenimplantat verwendet werden kann.
  • Hintergrund
  • Das US-Patent 5,306,305 (= WO 95/19152) offenbart ein In-vitro-Verfahren zur Herstellung einer Implantatanordnung durch Auftragen eines Osteoblastenzellen enthaltenden Gels auf eine poröse Metalloberfläche und dann Inkubieren des Gels in einem Wachstumsmedium. Ein wiederholt erneuertes Minimalmedium (Minimal Essential Medium; MEM) wird für ungefähr 3 Wochen für die Zellvervielfachung verwendet, gefolgt von einem β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure enthaltenden Medium für weitere 1–2 Wochen. Die Zellen können aus den eigenen Knochenfragmenten des Patienten stammen. Das Gel (z. B. 0,5 % Gelatine) wird verwendet, um die Zellen auf der Substratoberfläche festzuhalten.
  • US-A 5,226,914 ist auf ein Verfahren zur Reparieren von Bindegewebeschädigung gerichtet, worin vom Knochenmark abstammende Zellen wachsen gelassen werden, ohne eine Matrix auf einem Substrat herzustellen. Diese Zellen werden von dem Substrat entnommen und in einem undifferenzierten Zustand auf eine beschädigte Stelle (in vivo) aufgetragen.
  • Die Seiten 23–29 in Biomaterials 1996, Band 17, Nr. 1, beziehen sich auf eine Beurteilung von Implantatmaterialien in einer Zellkultur. Es wird nicht vorgeschlagen, implantierbare Anordnungen herzustellen, welche eine durchgängige Matrix enthalten.
  • Die DE-A-38 10 803 offenbart ein Verfahren zum Herstellen von lebenden Knochenersatzmaterialien durch das In-vitro-Kultivieren von autologen Knochenzellen aus menschlichen Knochenfragmenten in einem wiederholt erneuerten Kulturmedium, gefolgt von der Ablagerung der kultivierten Zellen in einer porösen Calciumphosphatmatrix und dem zusätzlichen Kultivieren. Das Kompositmaterial kann reimplantiert werden.
  • Die WO 94/04657 offenbart ein bioaktives poröses Glas, das auf solch eine Weise vorbehandelt wird, dass es den pH-Wert eines in Kontakt mit dem Glas befindlichen Gewebemediums nicht erhöhen kann. Sie berichtet ebenfalls von dem Aussäen von Osteoblasten auf das vorbehandelte poröse Glas.
  • Diese Verfahren des Standes der Technik der in-vitro-Produktion von Knochengewebe für Implantationszwecke wurden bis jetzt noch nicht zur Praxis gebracht, möglicherweise, da die Fixierung des resultierenden Implantates in dem Körper und folglich das Funktionieren des Implantates unzureichend sind wegen Begrenzungen in den Auftragungstechniken. Keine biologische Wirkung der Verwendung eines bestimmten Kulturverfahrens wurde im Stand der Technik beschrieben. Weiterhin machen diese Verfahren des Standes der Technik das Einführen eines Knochendefektes (eine Läsion) in dem Patienten notwendig, um die erforderlichen Knochenzellen zu erhalten.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es wurde nun herausgefunden, dass diese Nachteile durch ein Verfahren überwunden werden können, bei welchem anstelle von differenzierten Knochenzellen, wie Osteoblasten, undifferenzierte Zellen verwendet werden, um das Implantatsubstrat zu bedecken, und bei welchem diese Zellen mit einem flüssigen Kulturmedium inkubiert werden.
  • Folglich betrifft die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur in-vitro-Produktion von Knochengewebe, umfassend die folgenden Schritte:
    • (a) Aufbringen undifferenzierter Säugerzellen auf einem Substrat;
    • (b) direktes Kontaktieren dieser Zellen mit einem Kulturmedium für eine ausreichende Zeit, um eine mineralisierte oder nicht mineralisierte Matrix herzustellen;
    • (c) Entfernen des Substrates mit der Matrix aus dem Kulturmedium, worin das Substrat eine Metall-, eine Calciumphosphat- oder eine Polymeroberfläche ist.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Substrates mit einer darauf wachsen gelassenen Matrix bereit, welches bevorzugt für die Bereitstellung von Last tragenden Implantaten, einschließlich Gelenkprothesen wie künstlichen Hüftgelenken, Kniegelenken und Fingergelenken, und Maxillofacial-Implantaten wie Dentalimplantaten verwendet werden kann. Es kann ebenfalls für spezielle chirurgische Einrichtungen wie Spacer oder Knochenfüllstoffe, z. B. für die Verwendung bei der Erhöhung, Verklebung oder Wiederherstellung von Knochendefekten oder von beschädigtem oder verlorenem Knochen verwendet werden. Knochenbildung kann durch Variation in der Mineralisierung sowohl durch induktive als auch durch konduktive Vorgänge optimiert werden. Eine Kombination der Bereitstellung eines Last tragenden Implantates (vorzugsweise mit einer wie oben beschriebenen Matrix überzogen) mit einem Knochenfüllstoff, umfassend eine wie beschriebene Matrix, stellt ein vorteilhaftes Verfahren gemäß der Erfindung dar.
  • Das Verfahren der Erfindung ist ebenfalls sehr geeignet hinsichtlich Revisionschirurgie, das heißt, wenn frühere chirurgische Einheiten ersetzt werden müssen.
  • Undifferenzierte Zellen sind pluripotente Zellen, die sich in einem frühen Stadium der Spezialisierung befinden, das heißt, welche ihre endgültige Funktion jetzt noch nicht haben und sich immer noch in dem Vorgang der Proliferation befinden. Insbesondere sind dies Zellen, die sich bis jetzt noch nicht differenziert haben zu z. B. Osteoblasten oder Osteoclasten. Solche Zellen sind besonders Blutzellen und Zellen, die im Knochenmark anwesend sind. Besonders geeignete undifferenzierte Zellen sind Knochenmarkzellen, einschließlich hämatopoetische Zellen und insbesondere Stromazellen. Die Knochenmarkzellen und insbesondere die Stromazellen wurden dann als sehr wirksam bei dem Knochen produzierenden Vorgang befunden, wenn sie aus ihrer Ursprungsumgebung entnommen werden.
  • Die undifferenzierten Zellen können direkt auf das Substrat in Schritt (a) aufgetragen werden oder sie können vorteilhafterweise in der Abwesenheit des Substrates multipliziert werden, bevor sie auf das Substrat aufgetragen werden. Bei der letzteren Weise sind die Zellen immer noch im Großen und Ganzen nach der Multiplikation undifferenziert und auf sie wird für die Zwecke der Erfindung immer noch Bezug genommen als undifferenziert. In Schritt (b) wird den Zellen ermöglicht, zu differenzieren. Differenzierung kann durch die Anwesenheit geeigneter Induktoren, wie Glucocorticoide, z. B. Dexamethason, induziert oder verstärkt werden.
  • Die Verwendung undifferenzierter Zellen stellt etliche Vorteile bereit. Erstens bringt ihre geringere Differenzierung eine höhere Proliferationsrate mit sich und erlaubt es, dass die letztliche Funktionalität besser gelenkt und kontrolliert werden kann. Ferner erzeugt das Kultivieren dieser Zellen nicht nur die erforderliche Knochenmatrix, welche organische und anorganische Bestandteile enthält, sondern resultiert auch in der Anwesenheit von etlichen Faktoren in dem Kulturmedium und in der Matrix, die für das Wachstum des Gewebes und für die Anpassung an existierendes lebendes Gewebe essenziell sind. Ebenfalls kann das Kulturmedium eine Quelle für aktive Faktoren wie Wachstumsfaktoren sein, die in Verbindung mit dem Implantationsvorgang verwendet werden sollen. Weiterhin sind solche undifferenzierten Zellen oftmals in größeren Mengen und bequemer als z. B. reife Knochenzellen zugänglich und sie zeigen eine geringere Sterblichkeit während der Genesung. Es können Matrizes mit einer Stärke von 100 μm als ein Ergebnis der Verwendung undifferenzierter Zellen hergestellt werden.
  • Die zu verwendenden Zellen können allogene Zellen sein, es wird jedoch oftmals bevorzugt werden, Zellen zu verwenden, die aus demselben Patienten stammen, für welchen das Implantat vorgesehen ist, das heißt autologe Zellen.
  • Das Substrat, auf welches die undifferenzierten Zellen aufgetragen und kultiviert werden kann, kann ein Metall wie Titan, eine Kobalt/Chrom-Legierung oder Edelstahl, eine bioaktive Oberfläche wie Calciumphosphat, Polymeroberflächen wie Polyethylen und Ähnliches sein. Obwohl weniger bevorzugt, können silikathaltige Materialien, wie Glaskeramiken, ebenfalls als ein Substrat verwendet werden. Am bevorzugtesten sind Metalle, wie Titan und Calciumphosphate, obwohl sogar Calciumphosphat nicht ein unentbehrlicher Bestandteil des Substrates ist. Das Substrat kann porös oder nicht porös sein.
  • Die Zellen können mit einer Rate von z. B. 103 bis 106 pro cm2, insbesondere 104 bis 2 105 Zellen pro cm2 aufgetragen werden.
  • Das in Schritt (b) des Verfahrens gemäß der Erfindung zu verwendende Kulturmedium kann ein gewöhnliches bekanntes Kulturmedium, wie MEM (Minimalmedium; Minimum Essential Medium), sein. Vorteilhafterweise kann das Medium ein konditioniertes Medium sein. In diesem Zusammenhang wird unter einem konditionierten Medium ein Medium verstanden, worin ähnliche Zellen zuvor inkubiert worden sind, wodurch das Medium dazu gebracht wird, Faktoren zu enthalten, die für das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung wichtig sind.
  • Die Zellen werden solange kultiviert, bis eine ausreichende Matrixschicht erzeugt worden ist, z. B. eine Matrixschicht mit einer Dicke von wenigstens 0,5 μm, insbesondere von 1 bis zu 100 μm, noch genauer von 10–50 μm. Die Zellen können mit dem Kulturmedium für z. B. 2–15 Wochen, insbesondere 4–10 Wochen, in Kontakt stehen.
  • Die Produktion der Matrix, wenn sie auf ein Substrat aufgetragen wird, resultiert in einem kontinuierlichen oder quasi-kontinuierlichen Überzug, der das Substrat zu wenigstens 50 %, insbesondere zu wenigstens 80 % seiner Oberfläche bedeckt.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Herstellung aktiver Faktoren, wie Wachstumsfaktoren, umfassend die folgenden Schritte:
    • (a) Auftragen undifferenzierter Säugerzellen, insbesondere Knochenzellen, noch genauer Stromazellen, auf ein Substrat;
    • (b) direktes Kontaktieren dieser Zellen mit einem Kulturmedium für eine ausreichende Zeit, um Wachstumsfaktoren zu produzieren;
    • (c) Entfernen des Substrates mit der Matrix aus dem Kulturmedium;
    • (d) Wiedergewinnen der aktiven Faktoren aus dem Kulturmedium.
  • Die im Schritt (a) aufgetragenen Zellen können undifferenzierte Zellen sein, die direkt als solche aufgetragen werden, oder sie können Zellen sein, welche vor Schritt (a) in einem Kulturmedium ohne das Substrat multipliziert worden sind.
  • Diese aktiven Faktoren umfassen Wachstumsfaktoren und andere Substanzen, die in die Knochenbildung und -remodellierung, Zellproliferation und Zelladhäsion verwickelt sind. Diese Faktoren können vorteilhafterweise in Verbindung mit einem Implantationsvorgehen verwendet werden, worin die aktiven Faktoren, möglicherweise gemeinsam mit anderen Bestandteilen des Kulturmediums, dem Patienten verabreicht werden, um das Funktionieren und die Adaptation des Implantates zu verstärken. Die Verwendung autologer Zellen wird bei diesem Vorgehen bevorzugt.
  • Das Verfahren der Erfindung kann unter Befolgung der Prinzipien und Vorgänge, wie in den folgenden allgemeinen Beispielen beschrieben, durchgeführt werden.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Rattenknochenmarkzellen-(RBMC-)Kulturtechnik
  • Die Rattenknochenmarktechnik ermöglicht die Produktion einer knochenähnlichen mineralisierten Matrix auf etlichen Substraten.
  • Kurz, Knochenmarkzellen werden aus den Femura junger erwachsener männlicher Ratten isoliert und werden für bis zu 4 Wochen kultiviert, um knochenähnliches Gewebe herzustellen. Das verwendete Kulturmedium umfasst α-Minimalmedium, ergänzt mit fötalem Kälberserum, Antibiotika, Ascorbinsäure, β-Glycerophosphat und Dexamethason. Bei diesem System sind die letzten drei Bestandteile essenziell für die Produktion von knochenähnlichem Gewebe. Ascorbinsäure ist erforderlich für die Collagensynthese und für die Osteogenese in vitro. Weiterhin wurde gezeigt, dass Ascorbinsäure ATPase und alkalische Phosphataseaktivitäten und Proteinsynthese in den Kulturen osteoblasten-ähnlicher Zellen reguliert. β-Glycerophosphat wird als eine Quelle organischer Phosphationen verwendet, welches deshalb wichtig ist für die Mineralisierung. Falls kein β-Glycerophosphat hinzugefügt wird, wird eine im Großen und Ganzen nicht mineralisierte Matrix gewonnen. Dexamethason, ein synthetisches Glucocorticoid, induziert die Proliferation und Enddifferenzierung osteogener Zellen.
  • Ab ungefähr 2 Wochen entwickeln sich undurchsichtige, dreidimensional mineralisierte, knotenförmige Strukturen. Diese Knötchen können makroskopisch identifiziert werden und werden mit der Zeit dichter, größer und undurchsichtiger.
  • SEM-Beobachtungen zeigen die Anwesenheit mineralisierter Collagenfasern zusammen mit globulären, auf der Oberfläche der Substrate abgeschiedenen Strukturen. Die globulären Strukturen haben einen Durchmesser von annähernd 0,2–1 μm und es wurde von ihnen gezeigt, dass sie mineralisiert sind und knochenspezifische Proteine (z. B. Osteopontin) enthalten. Das Ergebnis ist in 1 gezeigt.
  • Der osteogene Charakter des Rattenknochenmarkzellenkultursystems wurde unter Verwendung einer Anzahl von Kriterien, wie unten ausgeführt, gut charakterisiert:
    • (i) Die zelluläre und extrazelluläre Matrix in den Knötchen haben mit Knochengewebe ähnliche morphologische und ultrastrukturelle Eigenschaften.
    • (ii) Mit diesem Knötchen in Verbindung stehende Zellen färben intensiv mit dem Enzym alkalische Phosphatase, was eine Eigenschaft osteoblastischer Zellen ist.
    • (iii) Die Knötchen sind positiv für Färbung nach Von Kossa (Phosphat) und mit Alizarinrot (Calcium).
    • (iv) Die CaP-Globuli fusionieren, um eine Zementlinie zu bilden, die reich an Glycosaminoglycanen ist.
    • (v) Collagenfasern haben eine Periodizität von 64–67 nm, welche an Collagen Typ I erinnert, das ebenfalls in Knochen anwesend ist.
    • (vi) Ultrastrukturell ist die Mineralisation aus nadelförmigen, knochenähnlichen Kristallen zusammengesetzt.
    • (vii) Röntgenstrahlmikroanalyse (XRMA) zeigt die Anwesenheit von Ca und P (siehe 2).
    • (viii) Mit der Zeit exprimieren die Kulturen ein alkalisches Phosphatase/DNS-Spitzenverhältnis ungefähr um den Tag 12 herum, was charakteristisch für osteogene Rattenkulturen ist.
    • (ix) Von der Osteocalcin-(Knochenprotein-)Herstellung wurde gezeigt, dass sie am Tag 4 beginnt (siehe 3).
  • Zusammenfassend wurde basierend sowohl auf morphologischen als auch auf immunhisto/cyto-chemischen Daten basierend der osteogene Charakter der Technik gezeigt.
  • Beispiel 2
  • Menschliche Knochenmarkkultur-(HBMC-)Technik
  • Menschliche Knochenmarkzellen können unter ähnlichen Bedingungen kultiviert werden, wie jene, die für die Rattenknochenmarkzellkulturtechnik beschrieben worden sind. Anstelle der Verwendung von fötalem Kälberserum in dem Kulturmedium ist die Verwendung von autologem Serum (aus dem Donorpatienten) oder synthetischem Serum gleichwertig möglich. Bis heute hat die Charakterisierung ebenfalls die osteogene Kapazität dieses Kultursystems gezeigt, wie unten umrissen:
    • – Nach annähernd 4 Wochen entwickeln sich " Knötchen", die ausgedehnter und weniger ausgeprägt sind als jene, die in einer Standard-RBMC-Kultur gesehen werden.
    • – SEM-Beobachtungen zeigen die Anwesenheit von auf der Oberfläche der Substrate abgelagerten mineralisierten Collagenfasern und globulären Strukturen. Die globulären Strukturen haben einen Durchmesser von annähernd 1–2 μm und ähneln den in Rattenknochenmarkzellkulturen gesehenen Phosphatglobuli (obwohl sie etwas größer sind als jene, die in der RBMC-Kultur beobachtet wurden). Allgemein fehlt die globuläre Schicht und wird ebenfalls in Verbindung mit mineralisierten Collagenfasern gesehen. Das Ergebnis ist in 4 gezeigt.
    • – Ähnlich zu den RBMC-Kulturen färben diese Knötchen positiv mit alkalischer Phosphatase, Calcium und Phosphat.
    • – Mit der Zeit exprimieren die Kulturen ein Spitzenverhältnis von alkalischer Phosphatase/DNS ungefähr um den Tag 20 herum, wobei diese letzte Expression mit dem verzögerten Einsetzen der Mineralisierung in der HBMC korreliert.
  • Beispiel 3
  • Osteoclastenkulturen auf Calciumphosphat-(CaP-)Substraten
  • Ziel
  • Das Ziel dieser Untersuchung war, den Einfluss von von Osteoblasten abgeleiteten Faktoren auf die osteoblastische Resorption zu untersuchen.
  • Materialien und Methoden
  • Experimenteller Ansatz: Die Kulturen wurden in zwei Gruppen aufgeteilt: (i) CaP nur mit Osteoblasten und (ii) CaP mit Osteoblasten, gefolgt von Osteoclasten.
  • Zubereitung der Calciumphosphatproben: Sämtliche Calciumphosphatproben wurden poliert, um eine ähnliche Oberflächenrauigkeit zu ergeben, und wurden gereinigt und sterilisiert vor der Verwendung.
  • Osteoblastenkulturen: Knochenmarkzellen wurden von jungen Raten wie folgt isoliert: Die Femura wurden präpariert, gut gewaschen und die Epiphysen wurden entfernt. Das Knochenmark wurde anschließend aus der Markhöhle unter Verwendung einer Spritze mit einer daran befestigten Subkutannadel herausgespült, gefüllt mit Alpha-Minimalmedium, ergänzt mit 15 % fötalem Rinderserum, Antibiotika, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 10–8 M Dexamethason und 1 M β-Glycerophosphat. Die Zellsuspension wurde dann auf den Proben ausgesät und wurde für 18 Tage kultiviert.
  • Osteoclastenkulturen: Knochenmarkzellen wurden aus den Femura junger Ratten, wie oben beschrieben, in Medium ohne hinzugefügtes Dexamethason isoliert.
  • Fixierung: Nach der Kulturperiode wurden die Vertiefungen 3-mal in PBS bei 37 °C gewaschen, gefolgt von der Fixierung in 2 % Paraformaldehyd/2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer, pH 7,4, bei 4 °C. Nachfolgend wurden sie in destilliertem Wasser gewaschen vor der TRAP-Färbung.
  • Tartratresistente saure Phosphatase (TRAP): Tartratresistente saure Phosphatase wurde unter Verwendung einer Modifikation des durch Barka (1) beschriebenen Azofarbstoffverfahrens nachgewiesen, bei welchem 3,9 mg/ml Weinsäure zu der Inkubationslösung hinzugefügt wurde. Nach dem Färben wurden die Proben gut in destilliertem Wasser gewaschen und, wo möglich, wurde die Zellmultischicht entfernt; dies erleichterte die Sichtbarmachung der TRAP-+ve-Zellen. Die Proben wurden anschließend für Rasterelektronenmikroskopie vorbereitet.
  • Rasterelektronenmikroskopie: Proben wurden durch abgestufte Ethanolreihen dehydriert und der kritischen Punkttrocknung mit CO2 unterzogen. Alle Proben wurden mit zerstäubtem Gold vor der Untersuchung überzogen.
  • Ergebnisse
  • Osteoclastenkulturen: Osteoclasten (TRAP-positive Zellen) wurden bei den verschiedenen Materialien gesehen, obwohl Resorption der zu Grunde liegenden Substrate nicht beobachtet wurde.
  • Osteoblasten, gefolgt von Osteoclastenkulturen: Osteoclasten waren auf den Materialien vorhanden und es wurde eine Resorption der durch die Osteoblasten gebildeten mineralisierten Matrix gesehen. In dem Fall von bei 600 °C gesintertem Hydroxyapatit und Tricalciumphosphat (TCP) wurde die Resorption der zu Grunde liegenden Substrate ebenfalls beobachtet.
  • Schlussfolgerungen
  • Dieses Beispiel zeigt, dass Osteoblasten in der Lage sind, gewisse Calciumphosphate zu resorbieren, jedoch nur, wenn Osteoblasten zuerst auf den Substraten kultiviert werden. Dies legt eine Konditionierung der Substratoberflächen nahe, durch Faktoren, die durch Osteoblasten hergestellt werden, welche eine stimulierende Wirkung auf die Osteoclastenaktivität haben.
  • Beispiel 4
  • Osteoclastenkulturen auf Apatit, vorbehandelt mit osteoblasten-konditioniertem Medium
  • Ziel
  • Das Ziel dieses Experimentes war, die Wirkung von mit Osteoblasten konditioniertem Medium auf die osteoclastische Resorption einer Apatitschicht zu untersuchen. Nach der Kulturperiode wurde die Anzahl tartratresistenter, für saure Phosphatase positiver Zellen (Osteoclasten) quantifiziert und die Proben wurden untersucht, um zu sehen, ob die osteoclastische Resorption der Apatitschicht geschehen war.
  • Materialien und Methoden
  • Vorbehandlung einer Apatitschicht mit konditioniertem oder Kontrollmedium: Sterile Proben wurde in mit Osteoblasten konditioniertem Medium für annähernd 16 Stunden inkubiert vor der Osteoclastenkultur. Kontrollproben wurden ebenfalls in nicht konditioniertem Medium (Alpha-Minimalmedium) für 16 Stunden inkubiert.
  • Osteoclastenkultur: Eine Osteoclastenkultur aus neu geborenen Hühnchen wurde an beiden Probensätzen durchgeführt. Die Osteoclasten wurde in Alpha-Minimalmedium, ergänzt mit 10 % FCS und 10–6 M PGE2 (Prostaglandin E2), für 48 Stunden bei 37 °C kultiviert.
  • Fixierung: Nach der Kulturperiode wurden die Vertiefungen 3-mal in PBS bei 37 °C gewaschen, gefolgt von der Fixierung in 1,5 Glutaraldehyd in 0,14 M Natriumcacodylatpuffer, pH 7,4, bei 4 °C für 15–30 Minuten. Nachfolgend wurden sie in destilliertem Wasser vor der TRAP-Färbung gewaschen.
  • Tartratresistentes saures Phosphat (TRAP) wurde unter Verwendung einer Modifikation des von Barka (1) beschriebenen Azofarbstoffverfahrens detektiert, bei welchem 3,9 mg/ml Weinsäure zu der Inkubationslösung hinzugefügt wurde. Nach dem Färben wurden die Proben gut in destilliertem Wasser gewaschen und, wo möglich, wurde die Zellmultischicht entfernt: Dies erleichterte die Sichtbarmachung der TRAP-+ve-Zellen. Photomikrographien wurden dann aufgenommen und die Proben wurden nachfolgend für die Rasterelektronenmikroskopie vorbereitet.
  • Rasterelektronenmikroskopie: Die Proben wurden durch eine abgestufte Ethanolreihe dehydriert und am kritischen Punkt von CO2 getrocknet. Alle Proben wurden mit zerstäubtem Gold vor der Untersuchung überzogen.
  • Ergebnisse
  • Unter Verwendung von Auflichtmikroskopie wurden TRAP-positive Zellen sowohl bei den behandelten als auch bei den Kontrollproben beobachtet; die Anzahl TRAP-positiver Zellen wurde gezählt, wobei die Ergebnisse für das konditionierte Medium ungefähr 220 und für das nicht konditionierte Kontrollmedium ungefähr 25 betrug.
  • Unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie wurde Resorption des Apatits deutlich sowohl bei den behandelten als auch bei den Kontrollproben gesehen. Obwohl die Anzahl der Resorptionslakunen nicht quantifiziert wurde, hatte man den Eindruck, dass mehr auf den mit konditioniertem Medium behandelten Proben vorhanden waren.
  • Schlussfolgerungen
  • Dieses Experiment zeigte, dass es eine signifikante Zunahme in der Anzahl der Osteoclasten auf der Apatitschicht nach der Vorbehandlung mit Medium, das mit Osteoblasten konditioniert worden war, gibt (siehe 5). Dieser Unterschied legt die Anwesenheit eines Osteoclasten stimulierenden Faktors, hergestellt von Osteoblasten, in dem konditionierten Medium nahe.
  • Beispiel 5
  • Implantation eines Komposits aus porösem Hydroxyapatit und kultivierten Rattenknochenmarkzellen
  • Einführung
  • Fischer-344-Rattenknochenmarkzellen, kultiviert auf einem porösen Hydroxyapatitsubstrat, wurden subkutan in andere Fischer-344-Individuen implantiert. Der Zweck dieser Untersuchung war, die osteokonduktive und osteoinduktive Fähigkeit des gewonnenen Komposits zu beurteilen.
  • Materialien und Methoden
  • Hydroxyapatitscheiben: Poröse Hydroxyapatitblöcke (8·2·2 mm), gesintert bei 1300 °C für 96 Stunden.
  • Ratten: Implantation in 7 Wochen alte männliche Fischer-Albino-Ratten (ungefähr 250 bis 300 g).
  • Kulturprotokoll: Rattenknochenmarkzellen wurden auf und in den Hydroxyapatitscheiben für 4 Wochen gemäß dem früher beschriebenen Verfahren kultiviert. Rattenknochenmarkzellen wurden isoliert und in 75 m2-Kolben übertragen und kultiviert (geschätzte Ausbeute 1,5·106 Zellen pro Kolben). Nach 7 Tagen wurden die Zellen mit Trypsin behandelt, gezählt und auf dem Hydroxyapatit und den Kontrollen mit 1–2·105 Zellen pro cm2 ausgesät. In den Konstrukten wurden Zellen für 4 Wochen vor der Implantation kultiviert.
  • Implantationsvorgehen: Die Konstrukte wurden subkutan in den Rücken der Ratten implantiert. Nach 4 Wochen Implantation wurden die Tiere getötet und die Proben wurden in Glutaraldehyd fixiert.
  • Beurteilungsvorgehen: Die Proben wurden auf 100 % Ethanol dehydriert und wurden dann in Methylmethacrylatlösung eingebettet oder der Kritischen Punkt-Trocknung unterzogen. Die Proben wurden durch Lichtmikroskopie oder Rückstreuungs- und reguläre Elektronenmikroskopie untersucht.
  • Kontrollen: Als Kontrollen wurden Hydroxyapatitblöcke verwendet, die in Gewebekulturmedium für 4 Wochen ohne Zellen inkubiert worden waren, welche dann ähnlich wie die Konstrukte implantiert worden sind. Es wurden ebenfalls Zellen auf den Hydroxyapatitblöcken für einen Zeitraum von 8 Wochen kultiviert und nicht in Ratten implantiert.
  • Ergebnisse
  • Es wurde festgestellt, dass sich nach 4 Wochen Gewebekultur in den Hydroxyapatitblöcken Matrix durch die Zellen auf der Oberfläche des Konstruktes und in seinen Poren gebildet hatte. Ein Teil der Matrix war kalzifiziert. Nach 8 Wochen Kultur war diese Matrixbildung hervorstechender und es wurden ca. 50 μm dicke Matrizes gewonnen. Ferner war die Verkalkung ausgedehnter. Hydroxyapatitblöcke, die nicht mit kultivierten Zellen inkubiert worden waren, zeigten keine Matrixbildung.
  • Nach 4 Wochen Implantation zeigten die Kontrollhydroxyapatitblöcke (ohne kultivierte Zellen) keine Knochenbildung auf ihrer Oberfläche. Nur fibröses Gewebe und Exudat konnten beobachtet werden. Die Situation für die Konstrukte (mit kultivierten Zellen und Matrix) war wesentlich verschieden davon. Insbesondere in den Poren konnten deutliche Anzeichen von Knochenbildung beobachtet werden. Diese Knochenbildung war deutlich verschieden von der Matrixbildung, wie sie in Kultur beobachtet werden konnte, sowohl was den 4-wöchigen als auch den 8-wöchigen Kulturzeitraum betraf. Knochenbildung geschah gemäß der Bonding-Osteogenesetheorie, was die osteokonduktive Natur der kultivierten Matrix anzeigt.
  • Beispiel 6
  • Osteoblastenkulturen auf in vitro gebildeter mineralisierter extrazellulärer Matrix
  • Das Ziel dieses Experimentes war, die Wirkung von in vitro gebildeter, extrazellulärer Matrix auf die alkalische Phosphataseaktivität kultivierter Osteoblasten zu untersuchen.
  • Materialien und Methoden
  • Zubereitung von Zellsuspensionen: Knochenmarkzellen wurden aus den Femura junger erwachsener Fischer-Ratten isoliert und wurden bis nahe zur Konfluenz kultiviert (annähernd 7 Tage) in einem α-Minimalmedium, das 15 % fötales Rinderserum, Antibiotika, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml Ascorbinsäure und 10–8 M Dexamethason enthielt. Die Zellen wurden dann kurz in steriler phosphatgepufferter Salzlösung gespült und wurden mit 0,25 % Trypsin behandelt, um die Zellen von der Kulturoberfläche abzulösen. Die Zellsuspensionen wurden vereinigt und in einem Burker-Turk-Hämocytometer gezählt.
  • Stadium 1: Die Zellen für das erste Stadium des Experimentes wurden isoliert und wie oben beschrieben zubereitet. Die Zellen wurden in 12 Vertiefungen aufweisende Gewebekulturplatten mit einer Dichte von 1·104 Zellen/cm2 ausgesät und wurden in einem ähnlichem Medium für 4 Wochen kultiviert, um eine mineralisierte extrazelluläre Matrix zu erzeugen. Das Medium wurde 3-mal pro Woche erneuert. Nach der anfänglichen Kulturperiode wurden sämtliche Vertiefungen 3-mal mit steriler PBS gespült und wurden dann bei –20 °C für wenigstens 24 Stunden gelagert (um die Zellpopulation abzutöten), bis sie für das zweite Stadium des Experimentes benötigt wurden.
  • Stadium 2: Die Zellen aus dem ersten Stadium des Experimentes wurden isoliert und, wie oben beschrieben, zubereitet und wurden dann wie folgt ausgesät:
    • (i) 12 Vertiefungen aufweisende Platten mit in vitro gebildeter extrazellulärer Matrix. n = 6 (Platten im Stadium 1 zubereitet). Die Platten mit Matrix wurden aus der –20°C-Lagerung entfernt, auf Raumtemperatur erwärmt, 3-mal mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung gespült und anschließend mit α-MEM: Die Zellen wurden dann mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen/cm2 ausgesät und wurden für 1, 4, 6, 8, 11, 12, 13, 14 und 15 Tage kultiviert. Als eine Kontrolle wurde eine Platte mit Matrix für 15 Tage nur in Medium kultiviert (das heißt ohne Zellen).
    • (ii) 12 Vertiefungen aufweisende Kontrollgewebekulturpolystyrolplatten ohne Matrix. n = 6. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen/cm2 ausgesät und wurden für 1, 4, 6, 8, 11, 12, 13, 14 und 15 Tage kultiviert.
  • Bei jeder Zeitperiode wurde eine Platte von jeder Kulturgruppe in PBS gespült und bei –20 °C für wenigstens 24 Stunden gelagert. Am Ende der Kulturperiode wurden sämtliche Platten hinsichtlich DNS- und alkalische Phosphataseaktivität-(APA)-Analyse untersucht. Das APA/DNS-Verhältnis wurde dann berechnet und grafisch dargestellt.
  • Ergebnisse
  • In Stadium 1 dieses Experimentes wurde eine reiche mineralisierte extrazelluläre Matrix in sämtlichen Vertiefungen nach 4-wöchiger Kulturdauer gebildet. Eine reiche mineralisierte extrazelluläre Matrix wurde ebenfalls in Stadium 2 gebildet, es war jedoch nicht möglich, morphologisch zu beurteilen, ob es einen Unterschied zwischen den beiden experimentellen Gruppen gab. DNS- und alkalische Phosphataseanalyse zeigten jedoch einen deutlichen Unterschied. DNS-Analyse zeigte ähnliche Zellzahlen für beide Gruppen (6a), wohingegen die alkalische Phosphataseaktivität signifikant höher für die Zellen war, die auf der in vitro gebildeten extrazellulären Matrix kultiviert worden waren (6b). Für beide Gruppen wurde die alkalische Phosphatasespitzenaktivität pro Zelle am Tage 11 gesehen, obwohl eine signifikant höhere Aktivität bei der Anwesenheit der in vitro gebildeten extrazellulären Matrix gesehen wurde (6c).
  • Schlussfolgerung
  • Knochenmarkzellen, die auf einer in vitro produzierten Knochenmatrix kultiviert worden sind, haben eine signifikant höhere Aktivität als jene, die auf Gewebekulturpolystyrol kultiviert worden sind. Die Anwesenheit dieser Matrix kann deshalb die Aktivität von und die Knochenbildung durch osteogene Zellen triggern.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt eine SEM-Fotografie von in vitro gebildetem Knochen, zusammengesetzt aus Ca-P-Globuli und Collagen (Rattenknochenmarkkultur).
  • 2 zeigt eine Röntgenstrahlmikroanalyse der Knochenmarkkultur: P zeigt Phosphor und CA zeigt Calcium an: die kleineren Elemente stammen von der Messvorrichtung.
  • 3 ist eine grafische Darstellung der Osteocalcinfreisetzung über die Zeit im Kulturmedium aus verschiedenen kristallinen Hydroxyapatitsubstraten.
  • 4 zeigt eine SEM-Fotografie von in vitro gebildetem Knochen, zusammengesetzt aus Ca-P-Globuli und Collagen (menschliche Knochenmarkkultur).
  • 5 zeigt grafisch die Anzahl an Osteoclasten auf Apatitsubstraten mit und ohne konditioniertem Medium, mit und ohne PGE2.
  • 6a ist eine Grafik, die den DNS-Gehalt (Anzahl an Zellen) einer Knochenmarkzellkultur auf Gewebekulturpolystyrol (–-Matrix) und in vitro gebildeter Knochenmatrix (+-Matrix) zeigt.
  • 6b ist eine Grafik, die die alkalische Phosphataseaktivität (APA) von Knochenmarkzellkultur auf Gewebekulturpolystyrol (–-Matrix) und in vitro gebildeter Knochenmatrix (+-Matrix) zeigt.
  • 6c ist eine Grafik, die das APA/DNS-Verhältnis von Knochenmarkzellkultur auf Gewebekulturpolystyrol (–-Matrix) und in vitro gebildeter Knochenmatrix (+-Matrix) zeigt.

Claims (10)

  1. Verfahren zur in vitro-Produktion von Knochengewebe, umfassend die Schritte: (a) Aufbringen undifferenzierter Säugerzellen auf ein Substrat; (b) direktes Kontaktieren der Zellen mit einem Kulturmedium für ausreichende Zeit, um eine kontinuierliche mineralisierte oder un-mineralisierte Matrix mit einer Dicke von mindestens 0,5 μm zu erzeugen; und (c) Entfernen des Substrats mit der Matrix aus dem Kulturmedium, worin das Substrat ein Metall, ein Calciumphosphat oder eine Polymeroberfläche ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die undifferenzierten Säugerzellen Knochenmarkszellen, insbesondere Stromazellen sind.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Zellen autologe Zellen sind.
  4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin in Schritt (a) die Zellen mit einer Rate von 103 bis 106 Zellen pro cm2 aufgebracht werden.
  5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das in Schritt (b) verwendete Kulturmedium ein konditioniertes flüssiges Kulturmedium ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das in Schritt (b) verwendete Kulturmedium durch vorherige Exposition an lebensfähige Knochenmarkszellen konditioniert ist.
  7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Zellen in Schritt (b) mit dem Kulturmedium solange in Kontakt gebracht werden, bis eine Matrixschicht von 1–100 μm erzeugt worden ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Zellen in Schritt (b) mit dem Kulturmedium solange in Kontakt gebracht werden, bis eine Matrixschicht von 10–50 μm erzeugt worden ist.
  9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Zellen in Schritt (b) mit dem Kulturmedium für mindestens zwei Wochen in Kontakt gebracht werden.
  10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Bereitstellung von Belastung tragenden Implantaten, Gelenkprotesen, Maxillofazialimplantaten oder speziellen chirurgischen Geräten.
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