CN112175907A - 血视网膜外屏障模型及其构建方法，构建该模型采用的培养基组合 - Google Patents

血视网膜外屏障模型及其构建方法，构建该模型采用的培养基组合 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别涉及血视网膜外屏障模型及其构建方法，构建该模型采用的培养基组合。本发明提供了一种人iPSC分化而来的无支架材料一体oBRB模型的构建方法。主要步骤为：首先将iPSC通过3D培养的方式诱导拟胚体中胚层细胞球，然后细胞球包埋入胶原I，诱导其形成血管网络片。再将iPSC来源的RPE细胞接种到血管网片上，共同培养一段时间，使其形成一个整体结构。本发明将iPSC分化技术与组织工程化技术相结合，更好地模拟了血‑视网膜外屏障结构，并且提供一种获得oBRB模型新的研究途径，为干细胞治疗AMD等疾病提供了新的替代方式。

Description

血视网膜外屏障模型及其构建方法，构建该模型采用的培养 基组合
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及血视网膜外屏障模型及其构建方法，构建该模型采用的培养基组合。
背景技术
血-视网膜屏障(BRB)，由内屏障和外屏障组成。视网膜毛细血管内皮及其连接形成血视网膜内屏障(iBRB)；脉络膜毛细血管层与视网膜色素上皮细胞(RPE)构成血视网膜外屏障(oBRB)。其主要功能是通过RPE细胞之间的紧密连接形成。RPE为单层排列的六边形细胞，其底膜有褶皱有利于运输，并组成Bruch膜的内层。Bruch膜的组成成分一部分是由RPE合成，另一部分是由脉络膜细胞合成。除RPE作为视网膜选择性通透屏障外，Bruch膜也对某些大分子形成屏障。脉络膜毛细血管层虽然是窗孔形，不能形成屏障，但脉络膜毛细血管病变、增生会直接破坏RPE的屏障功能，故被看作外屏障复合体之一。如图1所示。
oBRB一旦遭到破坏将引起多种视力疾病，如老年性黄斑病变(AMD)，糖尿病视网膜黄斑水肿等。为此体外产生一个类似的复杂的血视网膜模型，可用于眼屏障功能的检查以及用于潜在治疗药物的筛选，药物毒性检测等研究。并且一个有效的oBRB模型将减少实验动物的需求，成为研究年龄性相关疾病，如AMD，有效的研究和临床治疗工具。
随着干细胞治疗研究的推进，用干细胞体外分化为眼组织各类细胞并用于研究和临床治疗的项目也逐年增多。用干细胞尤其是人诱导多能干细胞(iPSC)分化来的细胞构建oBRB也是近期研究的方向之一。但目前多见于仅分化为RPE细胞作为研究外屏障的模型，不能代表全部oBRB的结构，因此亦不能反映出oBRB各组分之间的相互作用与交互影响。
通过组织工程构建的方法可以组建复合的三层oBRB模型，一般有以下方法：
1、共培养的方法，即血管内皮细胞培养在底层培养皿中，通过上层加装培养室，如transwell等，来培养视网膜色素上皮细胞(RPE)，使二者处于同一培养环境中。但此种模型中，虽然两种细胞处于同一环境中，但并不能形成一个整体结构，这与人体内组织不同，为此不能综合反映oBRB各结构之间的相互影响且无法用于oBRB整体移植治疗。如图2所示。
2、生物或聚合材料作为细胞支撑物，在材料两面分别接种细胞。此种模型虽然能够形成整体，但两层细胞之间毕竟有异物材料存在，存在生物不相容性的风险。如图3所示。
况且上述模型通常只有RPE细胞是由iPSC细胞分化得来，脉络膜血管网是使用血管内皮细胞(HUVEC)代表。两种细胞来源不同，不能精准构建病人来源的oBRB模型。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了血视网膜外屏障模型及其构建方法，构建该模型采用的培养基组合。本发明利用人诱导多能干细胞(iPSC)定向分化为脉络膜毛细血管层和RPE细胞，以此体外组成oBRB模型。此模型忠实的模拟了血视网膜外屏障的形态和结构。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了培养基组合，包括第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基和第五培养基；
所述第一培养基包括：mTeSR1+(25～50)μM Y27632(MCE公司)；
所述第二培养基包括：DMEM+6μM CHIR99021；
所述第三培养基包括：DMEM+(10～30)ng/ml BMP4+(30～100)ng/ml VEGF-A+(10～100)ng/ml bFGF；
所述第四培养基包括：DMEM+(30～100)ng/ml VEGF-A+(30～100)ng/ml bFGF；
所述第五培养基包括：高糖DMEM+50μMβ-硫基乙醇+1×非必须氨基酸+20％血清替代物(KSR)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述第五培养基还包括10～20mM烟酰胺，1×B27，Activin A或2～5μM CHIR99021中的一种或两者以上的混合物。
在本发明的一些具体实施方案中，还包括第六培养基，所述第六培养基包括：高糖DMEM+4％KSR。
基于上述研究，本发明还提供了所述的培养基组合在iPSC诱导分化血管网、iPSC诱导分化RPE和/或构建血视网膜外屏障模型中的应用。
本发明还提供了血视网膜外屏障模型的构建方法，包括如下步骤：
步骤1、取融合度70％～80％的iPSC消化成单细胞，依次采用所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基培养，获得单孔细胞球；
步骤2、取步骤1获得的单孔细胞球与冷冻的I型胶原混合，铺板培养，凝固后将包埋细胞的I型胶原取出，置于两个载体之间，吸干水分，弃载体，转移至培养装置中，经所述第四培养基培养，组建血管网；
步骤3、融合度达60％～80％的iPSC细胞经所述第五培养基培养，获得RPE细胞；
步骤4、取步骤3获得的RPE细胞接种到步骤2获得的所述血管网，经所述第六培养基培养，获得血视网膜外屏障模型。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中单细胞的接种密度为2x105～5x105，所述培养为：于37℃，5％O2,5％CO2培养7d。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中单孔细胞球与冷冻的I型胶原的比例为4x105～10x105/(1～2)ml；所述铺板培养的条件为37℃培养20～40min；经所述第四培养基培养的时间为20d。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中iPSC细胞经所述第五培养基培养具体为：高糖DMEM添加50μMβ-硫基乙醇，1×非必须氨基酸和20％血清替代物(KSR)，于0～7天添加10～20mM烟酰胺，1×B27；于8～14天改为添加50～100ng/ml Activin A，于15～21天改为添加2～5μM CHIR99021。
本发明还提供了所述的构建方法获得的血视网膜外屏障模型。
本发明还提供了所述的血视网膜外屏障模型在制备检测眼屏障功能的制剂、制备筛选治疗视力疾病药物的制剂、制备预防和/或治疗视力疾病的药物、制备检测药物毒性的制剂中的应用。
本发明提供了一种人iPSC分化而来的无支架材料一体oBRB模型的构建方法。主要步骤为：首先将iPSC通过3D培养的方式诱导拟胚体中胚层细胞球，然后细胞球包埋入胶原I，诱导其形成血管网络片。再将iPSC来源的RPE细胞接种到血管网片上，共同培养一段时间，使其形成一个整体结构。本发明将iPSC分化技术与组织工程化技术相结合，更好地模拟了血-视网膜外屏障结构，并且提供一种获得oBRB模型新的研究途径，为干细胞治疗AMD等疾病提供了新的替代方式。
本发明的有益效果包括但不限于：
1.整体性和可移植性：相较于传统的体外模型，本发明构建的oBRB是完整一体化，能够更好的模拟脉络膜，Bruch膜，RPE层三者之间综合相互作用，为深入研究oBRB提供了更完善的实验平台。同时，正是因为该模型是整体的片状结构，具有直接用于临床移植修复的可能性。(参照图7)
2.该模型各细胞组分全部由干细胞分化得来。这意味着可以构建患者来源的疾病oBRB模型。如取某位AMD患者的体细胞，重编程为iPSC后，诱导分化构建该模型。这比传统体外通过化学或物理方法诱导疾病模型能够更好体现患者疾病特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示血-视网膜屏障(BRB)的结构；
图2示共培养方法构建的模型示意图；
图3示生物或聚合材料作为细胞支撑物，在材料两面分别接种细胞构建的模型示意图；
图4示RT-PCR验证iPSC-RPE结果；
图5示构建完成的oBRB片；其中，A示构建成功的oBRB片正面RPE细胞层；B示构建成功的oBRB片反面血管网胶原层；C示通过共聚焦显微镜拍摄染色后的oBRB片，红色六边形为RPE细胞轮廓，绿色线性是血管；D示通过共聚焦显微镜拍摄染色后的oBRB片侧面照；
图6示冰冻切片后，免疫荧光鉴定构建的oBRB片；
图7示单层胶原片移植；其中，A示HE染色显示移植的胶原片在兔视网膜下无明显不良反应或纤维化具有很好的生物相容性；B示吲哚菁绿成像(ICG)亦显示移植的胶原片在兔视网膜下无明显不良反应或纤维化具有很好的生物相容性；C示为A图的局部发大图；D示B图的局部放大图。
具体实施方式
本发明公开了血视网膜外屏障模型及其构建方法，构建该模型采用的培养基组合，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：血-视网膜屏障(BRB)，由内屏障和外屏障组成。视网膜毛细血管内皮及其连接形成血视网膜内屏障(iBRB)；脉络膜毛细血管层与视网膜色素上皮细胞(RPE)构成血视网膜外屏障(out–BRB，oBRB)。
本发明提供的血视网膜外屏障模型及其构建方法，构建该模型采用的培养基组合中所用原料与试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 iPSC诱导分化血管网
将融合度70％～80％的iPSC消化成单细胞，接种到低粘附6孔板中培养，接种密度2×105，37℃，5％O2，5％CO2培养。所涉及的培养基有3种，按照时间顺序依次更换使用包括培养基1(mTeSR1+25μM Y2)；培养基2：(DMEM+6μM CHIR99021)；培养基3(DMEM+20ng ml- 1BMP4+60ng ml-1VEGF-A+50ngml-1bFGF)。
7天后，将培养的单孔细胞球用移液器转移到2ml离心管中弃掉上清。在离心管中加入1.5ml冷冻胶原I混匀，用吸管迅速将混合物转移到新的6孔板中，摇晃铺满孔底放入37℃培养箱中20分钟，使其凝固。之后从培养箱中取出，倒扣到尼龙膜上，上层再覆盖一层尼龙膜。上下两层垫好滤纸，并用力压8分钟，吸干水分。之后去掉尼龙膜，将包埋好的胶原片贴到六孔板中，并覆盖培养基4(DMEM+60ng ml-1VEGF-A+60ng ml-1bFGF)，约20天后细胞在胶原中自发组建为血管网。
实施例2 iPSC诱导分化血管网
将融合度70％～80％的iPSC消化成单细胞，接种到低粘附6孔板中培养，接种密度5×105，37℃，5％O2，5％CO2培养。所涉及的培养基有3种，按照时间顺序依次更换使用包括培养基1(mTeSR1+50μM Y2)；培养基2：(DMEM+6μM CHIR99021)；培养基3(DMEM+10ng ml- 1BMP4+100ng ml-1VEGF-A+10ng ml-1bFGF)。
7天后，将培养的单孔细胞球用移液器转移到2ml离心管中弃掉上清。在离心管中加入2ml冷冻胶原I混匀，用吸管迅速将混合物转移到新的6孔板中，摇晃铺满孔底放入37℃培养箱中40分钟，使其凝固。之后从培养箱中取出，倒扣到尼龙膜上，上层再覆盖一层尼龙膜。上下两层垫好滤纸，并用力压10分钟，吸干水分。之后去掉尼龙膜，将包埋好的胶原片贴到六孔板中，并覆盖培养基4(DMEM+30ng ml-1VEGF-A+100ng ml-1bFGF)，约20天后细胞在胶原中自发组建为血管网。
实施例3 iPSC诱导分化血管网
将融合度70％～80％的iPSC消化成单细胞，接种到低粘附6孔板中培养，接种密度3×105，37℃，5％O2，5％CO2培养。所涉及的培养基有3种，按照时间顺序依次更换使用包括培养基1(mTeSR1+35μM Y2)；培养基2：(DMEM+6μM CHIR99021)；培养基3(DMEM+30ng ml- 1BMP4+30ng ml-1VEGF-A+100ng ml-1bFGF)。
7天后，将培养的单孔细胞球用移液器转移到2ml离心管中弃掉上清。在离心管中加入1ml冷冻胶原I混匀，用吸管迅速将混合物转移到新的6孔板中，摇晃铺满孔底放入37℃培养箱中30分钟，使其凝固。之后从培养箱中取出，倒扣到尼龙膜上，上层再覆盖一层尼龙膜。上下两层垫好滤纸，并用力压5分钟，吸干水分。之后去掉尼龙膜，将包埋好的胶原片贴到六孔板中，并覆盖培养基4(DMEM+100ng ml-1VEGF-A+30ng ml-1bFGF)，约20天后细胞在胶原中自发组建为血管网。
实施例4 iPSC诱导分化RPE
将培养融合度达60％～80％的iPSC细胞更换RPE诱导分化培养基，所述的诱导分化培养基为：在高糖DMEM添加50μMβ-硫基乙醇，1×非必须氨基酸和20％血清替代物(KSR)。除此之外，在0～7天添加10mM烟酰胺，1×B27；8～14天改为添加80ng/ml Activin A，在15～21天改为添加3μM CHIR99021。
实施例5 iPSC诱导分化RPE
将培养融合度达60％～80％的iPSC细胞更换RPE诱导分化培养基，所述的诱导分化培养基为：在高糖DMEM添加50μMβ-硫基乙醇，1×非必须氨基酸和20％血清替代物(KSR)。除此之外，在0～7天添加20mM烟酰胺，1×B27；8～14天改为添加50ng/ml Activin A，在15～21天改为添加5μM CHIR99021。
实施例6 iPSC诱导分化RPE
将培养融合度达60％～80％的iPSC细胞更换RPE诱导分化培养基，所述的诱导分化培养基为：在高糖DMEM添加50μMβ-硫基乙醇，1×非必须氨基酸和20％血清替代物(KSR)。除此之外，在0～7天添加15mM烟酰胺，1×B27；8～14天改为添加100ng/ml Activin A，在15～21天改为添加2μM CHIR99021。
实施例7构建oBRB
利用rt-PCRDE的方法鉴定实施例4获得的iPSC分化的RPE细胞，发现RPE标志性基因如Mitf、EMMPRIN、RPE65、tyrosinase、bestrophin等均高表达，而iPSC特异性基因如OCT4、Nanog则成阴性表达(图4)。将验证过后的iPSC-RPE以2×104～4×104孔接种到实施例1获得的iPSC-血管网片上，添加2ml高糖DMEM+4％KSR的培养基。共同培养2周后，使其结合成整体，体式显微镜下可见构建的oBRB片前后面未分离，是整理形态，且同zo-1(RPE细胞标志物)，CD31(血管内皮细胞标志物)荧光染色后，可见上层是呈六边形的PRE细胞(红色)，下层呈管状的血管网细胞(绿色)(图5)。
实施例8形态学鉴定
将实施例7构建好的组织片，放入树脂胶中，冷冻凝固后，用冰冻切片机切片，切片厚度为10-20mm。将切片用4％多聚甲醛固定20分钟，PBS洗3次后，用3％FBS,1％BSA,0.5％Triton X-100和0.5％Tween封闭2小时。分别加入以1:200稀释后的小鼠抗人ZO-1(ThermoFisher)，兔抗人CD31(abcom)及兔抗人laminin(Novus)4℃过夜孵育。之后加入相应的荧光二抗进行免疫荧光双标染色。用荧光显微镜查看，上层为RPE细胞形态，中层纤黏连蛋白标记物为阳性(Bruch膜成分之一)，下次为血管网形态，表明oBRB形态构建成功(图6)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.培养基组合，其特征在于，包括第一培养基、第二培养基、第三培养基、第四培养基和第五培养基；
所述第一培养基包括：mTeSR1+(25～50)μM Y27632；
所述第二培养基包括：DMEM+6μM CHIR99021；
所述第三培养基包括：DMEM+(10～30)ng/ml BMP4+(30～100)ng/ml VEGF-A+(10～100)ng/mlbFGF；
所述第四培养基包括：DMEM+(30～100)ng/ml VEGF-A+(30～100)ng/ml bFGF；
所述第五培养基包括：高糖DMEM+50μMβ-硫基乙醇+1×非必须氨基酸+20％血清替代物(KSR)。
2.如权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述第五培养基还包括10～20mM烟酰胺，1×B27，Activin A或2～5μM CHIR99021中的一种或两者以上的混合物。
3.如权利要求1或2所述的培养基组合，其特征在于，还包括第六培养基，所述第六培养基包括：高糖DMEM+4％KSR。
4.如权利要求1至3任一项所述的培养基组合在iPSC诱导分化血管网、iPSC诱导分化RPE和/或构建血视网膜外屏障模型中的应用。
5.血视网膜外屏障模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、取融合度70％～80％的iPSC消化成单细胞，依次采用所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基培养，获得单孔细胞球；
步骤2、取步骤1获得的单孔细胞球与冷冻的I型胶原混合，铺板培养，凝固后将包埋细胞的I型胶原取出，置于两个载体之间，吸干水分，弃载体，转移至培养装置中，经所述第四培养基培养，组建血管网；
步骤3、融合度达60％～80％的iPSC细胞经所述第五培养基培养，获得RPE细胞；
步骤4、取步骤3获得的RPE细胞接种到步骤2获得的所述血管网，经所述第六培养基培养，获得血视网膜外屏障模型。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤1中单细胞的接种密度为2x105～5x105，所述培养为：于37℃，5％O2,5％CO2培养7d。
7.如权利要求5或6所述的构建方法，其特征在于，步骤2中单孔细胞球与冷冻的I型胶原的比例为4x105～10x105/(1～2)ml；所述铺板培养的条件为37℃培养20～40min；经所述第四培养基培养的时间为20d。
8.如权利要求5至7任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤3中iPSC细胞经所述第五培养基培养具体为：高糖DMEM添加50μMβ-硫基乙醇，1×非必须氨基酸和20％血清替代物(KSR)，于0～7天添加10～20mM烟酰胺，1×B27；于8～14天改为添加50～100ng/ml ActivinA，于15～21天改为添加2～5μM CHIR99021。
9.如权利要求5至8任一项所述的构建方法获得的血视网膜外屏障模型。
10.如权利要求9所述的血视网膜外屏障模型在制备检测眼屏障功能的制剂、制备筛选治疗视力疾病药物的制剂、制备预防和/或治疗视力疾病的药物、制备检测药物毒性的制剂中的应用。
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