CN105688282A - 一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜，采用如下的方法制备：1、角膜原材料获取； 2角膜支架制备；3、角膜支架深度修饰；4、角膜深度灭活去热原；5、角膜辐照灭菌，6、角膜内皮细胞的培养和种植；从而构建不同厚度深、浅板层生物人工角膜和全层生物人工角膜。植入后，能够迅速愈合、快速透明、保持屈光良好，恢复视力的同时美化眼球。本发明获得的生物人工角膜具有优良的力学性能及生物相容性，并且对于全层角膜基质支架种植内皮细胞后形成全层角膜植片，在体内可重塑，能在体诱导角膜缘干细胞生长和角膜上皮细胞生长，在此基础上快速透明，提高治疗效率和效果。可兼顾板层角膜移植和穿透性角膜移植的应用。

Description

一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体是关于一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜。
背景技术
据WHO最新统计，角膜盲已经成为仅次于白内障的第二大类致盲疾病，全球角膜盲患者超过5000万。国内角膜致盲患者达500多万，且每年新增10多万患者。病毒、真菌、细菌等各种感染、外伤、化学伤、烧伤等各种原因造成的角膜混浊或水肿而严重影响视力的病变，以及角膜溃疡范围较大、侵犯较深，久治不愈，药物治疗失败有穿孔危险或向中央侵犯的蚕食性角膜溃疡者，选择角膜移植，是彻底治疗、改善视力、提高生活质量的关键；先天性角膜变性、圆锥角膜、角膜基质变性也应当立即进行角膜移植手术；角膜肿瘤、角膜瘘、角膜葡萄肿患者可考虑角膜移植。然而国内活体角膜供应量每年仅有约5000枚。据统计我国角膜移植量每年约5000例得到有效治疗，供需存在严重缺口，大量的患者还在黑暗中等待。同种异体角膜移植虽然首次移植植片的5年存活率为82%，但二次移植时，其植片存活率显著下降，5年存活率仅53%和10年存活率41%。特别是在有新生血管的角膜上进行移植，其失败率达40%-70%。同时，异体角膜移植还存在病毒感染的潜在危险。基于此，角膜替代物研发能够改善供体不足的现状；降低免疫排斥率；降低潜在感染的机率。其意义重大，迫在眉睫。
自法国眼科医师PellierdeQuengsy于1789年首先提出将玻璃片植入混浊角膜以恢复视力以及Weber于1871年首次将一片水晶玻璃植入患者角膜，人工角膜的研究已有200余年的历史。至今，已有多种人工角膜应用于临床，如BostonKeratoprosthesis，OOPro,DDPro,S-KPro等。先后有多种材料应用于人工角膜的制备，其中光学区材料包括玻璃、塑料、石英、硅胶、PMMA、PHEMA等，光学区支撑材料包人工角膜多以无机材料，如玻璃、羟基磷灰石，有机材料，如硅凝胶、聚甲基丙烯酸甲酯，氟碳多聚体等材料制成，由于角膜组织对人工合成材料的排异反应等问题尚未最后解决，远期效果不佳，常造成移植处的房水渗漏及移植片的脱落，生物相容性较差、不能支持细胞生长等原因，移植后出现很多严重的并发症，如排斥反应、周边组织坏死、后发性内膜、青光眼等，加之人工角膜的制备及移植步骤的复杂，人工角膜移植术的开展受到很大限制。生物来源的材料，如羊膜、胶原、壳聚糖等制成的角膜虽然生物相容性改善，但是力学强度不佳，不能抵抗缝线牵拉容易脱落，缺少角膜天然构象，术后透明度差。羊膜在临床上的使用大多局限于角膜上皮的覆盖修复，想实现真正意义的角膜移植仍有差距。
目前国内外研制的各种种子细胞支架材料在角膜曲率及地形图、生物相容性、强度、降解率、透明性、同源性、抗原性及病原性等性能方面均存在着部分缺陷。猪角膜来源广泛，价格便宜，角膜厚度，地形图和屈光方面与人角膜极为相似，近来有猪角膜脱细胞基质问世，但是其移植后透明性差，透明所需时间长，角膜出现融解，角膜上皮愈合不良等弊端。提供一种与现有材料相比，来源丰富、生物相容性好、力学性能优良，尽可能保护天然角膜组织的板层结构不破坏，并且施行曲度精确切割，移植后透明速度快，透明度高，与正常角膜无缝对接，屈光和地形图无影响，主动诱导宿主细胞迁移促进植片快速细胞化，安全有效的生物人工角膜，能够用于临床上各种原因引起的角膜溃疡，经药物治疗无效，影响患者视力和美观的板层角膜移植，以及角膜穿孔的临时覆盖，争取获得全层角膜供体的时间。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的不足，提供一种具有良好生物相容性和力学性能的角膜移植替代物、能在体诱导宿主细胞迁移迅速实现细胞化，并且可以促进角膜缘干细胞增殖并生长分化为上皮细胞，加快上皮修复速度，实现植片快速愈合。特殊的屈光精密切割，使角膜替代物与自身角膜无缝对接，瘢痕轻微，美化眼球。植入后能够快速透明，恢复视力的同时兼顾美观。
为了实现上述目的本发明采用的技术方案是：一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜，采用如下方法制备：
（1）角膜原材料的获取，选取适于制备人工角膜的材料。
以上材料包括从新鲜猪眼球上取下的角膜，或以具有良好生物相容性及可降解特性的胶原为主体材料、由异种或同种组织提取的去除抗原后的生物胶原、复合壳聚糖、粘连蛋白及弹性材料。
（2）角膜支架的制备，将步骤（1）选取的材料利用切割或者纺织的方法制备板层角膜支架或/和全层角膜支架。
板层角膜支架的制备包括将新鲜猪眼球上取下的角膜置于人工前房，通过电动马达板层刀进行不同厚度的板层切割，或用激光板层刀环转进行切割和曲度加工，获得板层角膜片，然后进行去细胞处理；或所述板层角膜支架的制备包括，按重量百分比：50～70％生物胶原、12～18％复合壳聚糖、1～5％粘连蛋白、其余为弹性材料，用生物纺织技术进行纺织，制备符合要求的板层角膜支架。
全层角膜支架的制备包括将新鲜猪眼球上取下的角膜置于人工前房，通过激光板层刀环转进行切割和曲度加工，获得全层角膜，然后进行去细胞处理；或所述全层角膜支架的制备包括，按重量百分比：50～70％生物胶原、12～18％复合壳聚糖、1～5％粘连蛋白、其余为弹性材料，用生物纺织技术进行纺织，制备全层角膜支架。
（3）角膜支架深度修饰，将步骤（2）获得的板层角膜支架或/和全层角膜支架进行深度去抗原修饰或/和复合功能修饰。
深度去抗原修饰为：先用内毒素清除剂及表面活性剂对板层角膜支架或/和全层角膜支架的核酸酶进行预处理，并进行反复洗涤离心；采用核酸酶进行深度去抗原处理，处理温度37℃，处理时间30分钟，之后通过反复洗涤16-20次，去除试剂残留。
复合功能修饰为，在角膜支架中加入壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠，浓度均为2-10mg/mL，进行梯度交联，交联时间18-24小时，再放入2-4mg/mLSPDP溶液中作用2小时，用PBS洗涤3遍；之后在10mg/mLDTT溶液中作用30分钟；用PBS洗涤3遍，再配制2%(v/v)2mg/mL的SPDP，10ng/mL的EGF和20ng/mL的bFGF联合因子，或EGF浓度为10～20ng/mL、bFGF浓度为10～20ng/mL及NGF浓度为100～150ng/mL，或10～20ng/mL的EGF、10～20ng/mL的bFGF和100～150ng/mL的BDNF溶液，将角膜基质材料放入其中作用24小时。用PBS洗涤3遍。
（4）角膜深度灭活去热原，将步骤（3）处理后的板层角膜支架或/和全层角膜支架置于PH为9-12的碱溶液中，时间为20-60分钟，之后取出反复用低渗溶液洗涤，直至去除残留。
（5）角膜辐照灭菌，对步骤（4）处理后的板层角膜支架或/和全层角膜支架，采用电子加速器进行辐照灭菌，辐照剂量16-25kGy。
（6）角膜内皮细胞的培养和种植，取眼库中胎儿或婴儿、或20岁以下的捐献者的角膜，进行细胞培养，然后将细胞制备呈细胞悬液，种植到经步骤（5）灭菌的板层角膜支架或/和全层角膜支架上，待细胞贴壁30分钟后，将板层角膜支架或/和全层角膜支架置于生物反应器中培养48小时后，完成生物人工角膜待用。
采用本方法获得的生物人工角膜，是一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜。与现有的技术相比，具有如下优势：
1、曲度吻合快速愈合：采用先进的角膜手术板层刀进行角膜的精密切割和曲度加工，最大限度的保持角膜本身的曲度，能够与自身角膜无缝吻合，愈合快，瘢痕轻微。
2、快速透明美化眼球：通过复合修饰，增加脱细胞角膜基质材料的力学强度，并有利于移植后的快速透明和长期滋润。能够快速诱导上皮细胞长入，并形成光滑的上皮层，缝合口迅速修复，肉眼无瘢痕，恢复视力的同时美化眼球。
3、促进角膜缘干细胞生长：通过复合生长因子联合组，能够诱导角膜缘干细胞增殖分化，加速上皮的生长和爬行，促进角膜支架迅速上皮化，加快愈合速度。
4、板层和穿透角膜移植兼顾：通过猪眼球或纺织技术，可以构建浅、深板层角膜支架和全层角膜支架，再通过体外培养种植内皮细胞的方法，可以获得适用于穿透性角膜移植的新型生物人工角膜。
5、安全便捷易于储存：深度去除免疫源性，有效灭活病毒，严格清除热原，保障动物源性产品的安全使用。使用简便，无需保存液，无需眼库等特殊设备，易于储存，保质期长。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的内容作进一步说明。
通过本方法构建的新型生物人工角膜，缝合轻度和拉伸强度优于同种移植角膜。其含水量，透光率也十分接近同种移植角膜。并且具有良好的生物相容性。无细胞毒性，无急性全身毒性，无慢性全身毒性，无遗传毒性。无致敏和眼刺激性，无热原，无菌，安全可靠。
下面举例进行说明，但本发明的应用不仅在于此。
实施例1——生物人工角膜的制备
步骤1、角膜的获取：角膜支架的获取可以采用以下两种形式：
方法一——选择新鲜猪眼球，取下角膜进行角膜支架的加工处理。
方法二——采用由具有良好生物相容性及可降解特性的胶原为主体材料，由异种或同种组织提取的去除抗原的生物胶原，复合壳聚糖，粘连蛋白及弹性材料，通过纺织技术形成模拟角膜天然板层的板层结构，并达到一定的力学强度。
步骤2、角膜支架的制备：包括板层角膜制备和全层角膜制备。
（1）板层角膜制备
①眼球前处理：将取下的眼球迅速用生理盐水冲洗三次，然后泡入5%的次氯酸钠溶液中5-10分钟，取出后用0.01M的PBS洗涤五次，每次5分钟，条件为低温摇床（80转/分）。沥干后分装冻存于-80℃冰箱。
②精密切割，曲度加工：常温下解冻后，修剪下角膜，保留一圈巩膜。将角膜片置于人工前房，通过电动马达板层刀进行不同厚度的板层精密切割，也可用激光板层刀，环转进行精密切割和曲度加工。厚度可以控制在200-500微米，每50微米一个间隔。
③温和去细胞，保护天然板层结构：将板层角膜片用低渗无毒无菌溶液梯度溶胀，溶胀后轻轻撕掉上皮层。加入Chaps溶液进行处理，处理温度37℃，高速振荡10小时以上。之后用PBS溶液洗涤三次，再加入SDS溶液进行处理，处理温度37℃，高速振荡10小时以上。继续洗涤16次，低温振荡洗涤。
（2）全层角膜制备
①眼球前处理：将取下的眼球迅速用生理盐水冲洗三次，然后泡入5%的次氯酸钠溶液中5-10分钟，取出后用0.01M的PBS洗涤五次，每次5分钟，条件为低温摇床（80转/分）。沥干后分装冻存于-80℃冰箱。
②精密切割，曲度加工：常温下解冻后，修剪下角膜，保留一圈巩膜。将角膜片置于人工前房，用激光板层刀精密环转进行精密切割和曲度加工，获得全层角膜。
③温和去细胞，保护天然板层结构：将板层角膜片用低渗无毒无菌溶液梯度溶胀，溶胀后轻轻撕掉上皮层。加入Chaps溶液进行处理，处理温度37℃，高速振荡10小时以上。之后用PBS溶液洗涤三次，再加入SDS溶液进行处理，处理温度37℃，高速振荡10小时以上。继续洗涤16次，低温振荡洗涤。得到保留前弹力层，基质层，后弹力层的角膜全层支架。
（3）采用上述步骤中方法二获取的角膜支架材料，可以根据不同厚度的需求，纺织出不同厚度角膜支架结构。将按重量百分比：50～70％生物胶原、12～18％复合壳聚糖、1～5％粘连蛋白、其余为弹性材料，通过先进的生物纺织技术进行纺织，保证角膜纺织片的力学强度与正常人体角膜相当。
步骤3、角膜支架深度修饰：
①深度去抗原修饰：先用内毒素清除剂及表面活性剂脱氧胆酸酶对核酸酶进行预处理，并进行反复洗涤离心。通过核酸酶进行深度去抗原处理，处理温度37℃，处理时间30分钟，之后通过反复洗涤16-20次，去除试剂残留。
②复合功能修饰：将角膜支架中加入壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠，浓度均为2-10mg/mL，进行梯度交联，交联时间18-24小时，再放入2-4mg/mLagentN-succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate(SPDP)溶液中作用2小时，用PBS洗涤3遍。之后在10mg/mLDTT溶液中作用30分钟。用PBS洗涤3遍再配制2%(v/v)2mg/mLSPDP连接10ng/mL的EGF和20ng/mL的bFGF联合因子，或EGF浓度为10～20ng/mL、bFGF浓度为10～20ng/mL及NGF浓度为100～150ng/mL，或10～20ng/mL的EGF、10～20ng/mL的bFGF和100～150ng/mL的BDNF溶液，将角膜基质材料放入其中作用24小时。用PBS洗涤3遍。
采用步骤2中（3）的方法纺织角膜直接采用本步骤中的复合功能修饰法。
步骤4、角膜深度灭活去热原：将经过深度修饰的角膜支架置于PH为10的碱溶液中，时间为30分钟，之后取出反复用低渗溶液洗涤，直至去除残留。
步骤5、辐照灭菌：采用电子加速器进行辐照灭菌，辐照剂量16-25kGy。辐照可以灭活细菌、病毒，同时也使异种蛋白变性失活，进一步降低免疫源性。
步骤6、角膜内皮细胞的培养和种植：
通过伦理委员会批准，取眼库中胎儿或婴儿、或20岁以下的捐献者的角膜，用5%的次氯酸钠和双链霉素处理角膜5分钟，之后用生理盐水洗涤5次。将角膜剪成小片，内皮面朝上，加入0.05%胰蛋白酶消化15-20分钟。之后将内皮面朝下贴于24孔板的孔中，每个2-3小片，加入含有10%的胎牛血清的EGM培养基，培养基中再加入10～20ng/mL的VEGF、10～20ng/mL的bFGF、10～20ng/mL的EGF以及0.05‰～0.15‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐、0.05‰～0.15‰的氨基葡萄糖盐酸盐，每孔的每片角膜下滴入50uL的培养基，置于细胞培养箱30分钟后，每孔加入500uL培养基，继续培养2天后换液，间隔两天换液，培养到第7天再次用0.05%胰蛋白酶消化贴壁细胞，终止后制备呈细胞悬液，并种植到通过以上步骤处理后的全层角膜支架的后弹力层的Descemet氏膜上，或纺织获得的角膜支架上，种植密度2000-3000个/mm2.待细胞贴壁30分钟后，将角膜支架置于生物反应器中培养48小时后待用。
实施例2——兔角膜浅板层移植
一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜，按实施例1步骤1方法一或方法二获取的角膜，通过步骤2进行板层角膜支架的构建，通过步骤3进行角膜支架的修饰，通过步骤4进行灭活，步骤5进行辐照灭菌后，用于兔角膜浅板层移植。
挑选健康的新西兰大白兔，3个月龄，性别不限。术前1～2天用左氧氟沙星滴眼液，每天3次，每次1-2滴。全身麻醉后，缝线或开睑器开睑，上、下直肌固定缝线。根据角膜病变范围选择环钻，一般用7～7.5mm环钻钻取植床。一般选比移植片小0.25mm的环钻，钻通植床并剪下病变角膜。植片准备：将200um、300um生物人工角膜取出后置于清洁的培养皿中，滴加生理盐水覆盖角膜，10分钟后钻去植片。钻取移植片：将角膜片内皮面朝上置于切割枕上，以锋利的环钻压切下角膜植片。固定植片，把植片放置在移植孔上，10-0尼龙缝线在12、6、3、9点固定。间断缝合16针。术毕滴左氧氟沙星滴眼液2滴、3分钟后滴地塞米松滴眼液2滴后，包眼。手术过程严格无菌。术后7天通过荧光素染色观察上皮生长良好，上皮细胞在植片植床吻合口排序规则。术后14天角膜开始透明，术后21天角膜进一步透明，术后1月角膜透明程度十分接近正常角膜。无排次反应，无炎症反应。术后2月裂隙灯检测，角膜透明，植片植床之间瘢痕轻微，角膜厚度正常，前房深度正常。术后检测眼压正常，超声检测角膜厚度正常。术后3月取材做冰冻切片，HE染色，茜素红染色后激光共聚焦观察。可见角膜上皮生长良好，角膜基质细胞长入，角膜天然板层结构保持良好。术后6月角膜清澈透明。
实施例3——犬角膜深板层移植
一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜，按实施例1步骤1方法一或方法二获取的角膜，通过步骤2进行板层角膜支架的构建，通过步骤3进行角膜支架的修饰，通过步骤4进行灭活，步骤5进行辐照灭菌后，用于狗角膜深板层移植。
挑选健康的比格犬，3个月龄，性别不限。术前1～2天用左氧氟沙星滴眼液，每天3次，每次1-2滴。全身麻醉后缝线或开睑器开睑，上、下直肌固定缝线。根据角膜病变范围选择环钻，一般用7～7.5mm环钻钻取植床。一般选比移植片小0.25mm的环钻，根据不同角膜厚度钻出不同深度的角膜植床。植片准备：将生物人工角膜400um、450um取出后置于清洁的培养皿中，滴加生理盐水覆盖角膜，10分钟后钻去植片。钻取移植片：将角膜片内皮面朝上置于切割枕上，以锋利的环钻压切下角膜植片。固定植片，把植片放置在移植孔上，10-0尼龙缝线在12、6、3、9点固定。间断缝合16针。术毕滴左氧氟沙星滴眼液2滴、3分钟后滴地塞米松滴眼液2滴后，包眼。手术过程严格无菌。术后7天通过荧光素染色观察上皮生长良好，上皮细胞在植片植床吻合口排序规则。术后14天角膜开始透明，术后21天角膜进一步透明，术后1月角膜透明程度十分接近正常角膜。无排次反应，无炎症反应。术后2月裂隙灯检测，角膜透明，植片植床之间瘢痕轻微，角膜厚度正常，前房深度正常。术后检测眼压正常，超声检测角膜厚度正常。术后3月取材做冰冻切片，HE染色，茜素红染色后激光共聚焦观察。可见角膜上皮生长良好，角膜基质细胞长入，角膜天然板层结构保持良好。术后6月角膜清澈透明。
实施例4——犬穿透性角膜移植
一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜，按实施例1步骤1方法一获取的角膜，通过步骤2进行全层角膜支架的构建，通过步骤3进行角膜支架的修饰，通过步骤4进行灭活，步骤5进行辐照灭菌后，步骤6进行角膜内皮细胞的培养和种植后，用于狗角膜穿透性移植。
挑选健康的比格犬，3个月龄，性别不限。术前1～2天用左氧氟沙星滴眼液，每天3次，每次1-2滴。全身麻醉后缝线或开睑器开睑，上、下直肌固定缝线。根据角膜病变范围选择环钻，一般用7～7.5mm环钻钻取植床。一般选比移植片小0.25mm的环钻，钻通植床并剪下病变角膜。植片准备：将全层生物人工角膜取出后置于清洁的培养皿中，滴加生理盐水覆盖角膜，10分钟后使用。钻取移植片：将角膜片内皮面朝上置于切割枕上，以锋利的环钻压切下角膜植片。固定植片，把植片放置在移植孔上，10-0尼龙缝线在12、6、3、9点固定。间断缝合16针。重建前房，从植片缘注入生理盐水或消毒空气，以减少虹膜前粘、植片混浊，以达到水密为好。散光检查，使用角膜散光盘在显微镜下，调整缝线松紧度。术毕滴左氧氟沙星滴眼液2滴、3分钟后滴地塞米松滴眼液2滴后，包眼。手术过程严格无菌。术后7天通过荧光素染色观察上皮生长良好，上皮细胞在植片植床吻合口排序规则。术后1月角膜开始透明，术后6月角膜透明程度十分接近正常角膜。无排次反应，无炎症反应。术后6月裂隙灯检测，角膜透明，植片植床之间瘢痕轻微，角膜厚度正常，前房深度正常。术后检测眼压正常，超声检测角膜厚度正常。术后3月取材做冰冻切片，HE染色，茜素红染色后激光共聚焦观察。可见角膜上皮生长良好，角膜基质细胞长入，角膜天然板层结构保持良好。
实施例5——兔穿透性角膜移植
一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜，按实施例1步骤1方法一获取的角膜，通过步骤2进行全层角膜支架的构建，通过步骤3进行角膜支架的修饰，通过步骤4进行灭活，步骤5进行辐照灭菌后，步骤6进行角膜内皮细胞的培养和种植后，用于兔角膜穿透性移植。
挑选健康的新西兰大白兔，3个月龄，性别不限。术前1～2天用左氧氟沙星滴眼液，每天3次，每次1-2滴。全身麻醉后缝线或开睑器开睑，上、下直肌固定缝线。根据角膜病变范围选择环钻，一般用7～7.5mm环钻钻取植床。一般选比移植片小0.25mm的环钻，钻通植床并剪下病变角膜。植片准备：将全层生物人工角膜取出后置于清洁的培养皿中，滴加生理盐水覆盖角膜，10分钟后使用。钻取移植片：将角膜片内皮面朝上置于切割枕上，以锋利的环钻压切下角膜植片。固定植片，把植片放置在移植孔上，10-0尼龙缝线在12、6、3、9点固定。间断缝合16针。重建前房，从植片缘注入生理盐水或消毒空气，以减少虹膜前粘、植片混浊，以达到水密为好。散光检查，使用角膜散光盘在显微镜下，调整缝线松紧度。术毕滴左氧氟沙星滴眼液2滴、3分钟后滴地塞米松滴眼液2滴后，包眼。手术过程严格无菌。术后7天通过荧光素染色观察上皮生长良好，上皮细胞在植片植床吻合口排序规则。术后1月角膜开始透明，术后6月角膜透明程度十分接近正常角膜。无排次反应，无炎症反应。术后6月裂隙灯检测，角膜透明，植片植床之间瘢痕轻微，角膜厚度正常，前房深度正常。术后检测眼压正常，超声检测角膜厚度正常。术后3月取材做冰冻切片，HE染色，茜素红染色后激光共聚焦观察。可见角膜上皮生长良好，角膜基质细胞长入，角膜天然板层结构保持良好
实施例6——板层生物人工角膜用于角膜穿孔的临时覆盖
一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜，按实施例1步骤1方法一获取的角膜，通过步骤2进行板层角膜支架的构建，通过步骤3进行角膜支架的修饰，通过步骤4进行灭活，步骤5进行辐照灭菌后，用于兔或狗角膜穿透性移植的覆盖治疗。
实施例7——板层生物人工角膜用于上皮损伤的覆盖修复治疗
一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜，按实施例1步骤1方法一获取的角膜，通过步骤2进行板层角膜支架的构建，通过步骤3进行角膜支架的修饰，通过步骤4进行灭活，步骤5进行辐照灭菌后，用于兔或狗角膜上皮因各种因素受损的覆盖，促进角膜上皮生长愈合。
实施例8—一用于治疗临床上角膜化脓性感染、角膜混浊等浅层病变的浅板层角膜移植
一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜，按实施例1步骤1方法一获取的角膜，通过步骤2进行板层角膜支架的构建，通过步骤3进行角膜支架的修饰，通过步骤4进行灭活，步骤5进行辐照灭菌后，治疗角膜化脓性感染累及角膜浅板层的角膜溃疡、营养不良性角膜混浊、角膜变性等。
实施例9——用于治疗临床上角膜溃疡、圆锥角膜等深层病变的深板层角膜移植
一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜，按上述步骤1方法一获取的角膜，通过步骤2进行板层角膜支架的构建，通过步骤3进行角膜支架的修饰，通过步骤4进行灭活，步骤5进行辐照灭菌后，治疗角膜化脓性感染累及角膜深板层的角膜溃疡、角膜瘢痕达角膜深层，角膜肿瘤、圆锥角膜等。
实施例10——用于治疗临床上角膜穿孔、圆锥角膜等穿透性全层角膜移植一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜，按上述步骤1方法一获取的角膜，通过步骤2进行全层角膜支架的构建，通过步骤3进行角膜支架的修饰，通过步骤4进行灭活，步骤5进行辐照灭菌后，步骤6进行角膜内皮细胞的培养和种植后，治疗各种原因引起的角膜穿孔、圆锥角膜等的全层角膜移植。

Claims (6)

1.一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜，其特征在于，采用如下方法制备：
（1）角膜原材料的获取，选取适于制备人工角膜的材料；
（2）角膜支架的制备，将步骤（1）选取的材料利用切割或者纺织的方法制备板层角膜支架或/和全层角膜支架；
（3）角膜支架深度修饰，将步骤（2）获得的板层角膜支架或/和全层角膜支架进行深度去抗原修饰或/和复合功能修饰；
（4）角膜深度灭活去热原，将步骤（3）处理后的板层角膜支架或/和全层角膜支架置于PH为9-12的碱溶液中，时间为20-60分钟，之后取出反复用低渗溶液洗涤，直至去除残留；
（5）角膜辐照灭菌，对步骤（4）处理后的板层角膜支架或/和全层角膜支架，采用电子加速器进行辐照灭菌，辐照剂量16-25kGy；
（6）角膜内皮细胞的培养和种植，取眼库中胎儿或婴儿、或20岁以下的捐献者的角膜，进行细胞培养，然后将细胞制备呈细胞悬液，种植到经步骤（5）灭菌的板层角膜支架或/和全层角膜支架上，待细胞贴壁30分钟后，将板层角膜支架或/和全层角膜支架置于生物反应器中培养48小时后，完成生物人工角膜待用。
2.根据权利要求1所述一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜，其特征在于：所述适于制备人工角膜的材料包括从新鲜猪眼球上取下的角膜，或以具有良好生物相容性及可降解特性的胶原为主体材料、由异种或同种组织提取的去除抗原后的生物胶原、复合壳聚糖、粘连蛋白及弹性材料。
3.根据权利要求2所述一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜，其特征在于：所述板层角膜支架的制备包括将新鲜猪眼球上取下的角膜置于人工前房，通过电动马达板层刀进行不同厚度的板层切割，或用激光板层刀环转进行切割和曲度加工，获得板层角膜片，然后进行去细胞处理；或所述板层角膜支架的制备包括，按重量百分比：50～70％生物胶原、12～18％复合壳聚糖、1～5％粘连蛋白、其余为弹性材料，用生物纺织技术进行纺织，制备符合要求的板层角膜支架。
4.根据权利要求2所述一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜，其特征在于：所述全层角膜支架的制备包括将新鲜猪眼球上取下的角膜置于人工前房，通过激光板层刀环转进行切割和曲度加工，获得全层角膜，然后进行去细胞处理；或所述全层角膜支架的制备包括，按重量百分比：50～70％生物胶原、12～18％复合壳聚糖、1～5％粘连蛋白、其余为弹性材料，用生物纺织技术进行纺织，制备全层角膜支架。
5.根据权利要求1到4任一项所述一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜，其特征在于：所述深度去抗原修饰为：先用内毒素清除剂及表面活性剂对板层角膜支架或/和全层角膜支架的核酸酶进行预处理，并进行反复洗涤离心；采用核酸酶进行深度去抗原处理，处理温度37℃，处理时间30分钟，之后通过反复洗涤16-20次，去除试剂残留。
6.根据权利要求1到4任一项所述一种在体诱导细胞化并快速透明的新型生物人工角膜，其特征在于：所述复合功能修饰为，在角膜支架中加入壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠，浓度均为2-10mg/mL，进行梯度交联，交联时间18-24小时，再放入2-4mg/mLSPDP溶液中作用2小时，用PBS洗涤3遍；之后在10mg/mLDTT溶液中作用30分钟；用PBS洗涤3遍。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106039403A (zh) * 2016-07-15 2016-10-26 青岛三帝生物科技有限公司 具有生物活性的角膜修复植片的制备方法和角膜修复植片
CN111110921A (zh) * 2019-12-23 2020-05-08 中国海洋大学 一种组织工程后板层角膜的体外构建方法
CN112168425A (zh) * 2020-04-13 2021-01-05 广东佳悦美视生物科技有限公司 一种人工角膜后板的制备方法
CN115227874A (zh) * 2021-04-22 2022-10-25 北京百利康生化有限公司 一种眼科用植片及其制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1473551A (zh) * 2003-08-07 2004-02-11 中山大学中山眼科中心 一种人工组织工程化的生物角膜
CN1985778A (zh) * 2005-12-20 2007-06-27 广州知光生物科技有限公司 生物型人工角膜
CN101433478A (zh) * 2007-11-14 2009-05-20 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种全层生物角膜及其构建方法和用途
CN101757690A (zh) * 2010-02-05 2010-06-30 陕西瑞盛生物科技有限公司 一种制备组织工程角膜的方法
CN101947144A (zh) * 2010-09-29 2011-01-19 厦门大学 一种板层组织工程角膜支架及其制作方法与应用
CN104189957A (zh) * 2014-09-11 2014-12-10 中国海洋大学 利用新鲜猪角膜制备组织工程角膜载体支架的方法及应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1473551A (zh) * 2003-08-07 2004-02-11 中山大学中山眼科中心 一种人工组织工程化的生物角膜
CN1985778A (zh) * 2005-12-20 2007-06-27 广州知光生物科技有限公司 生物型人工角膜
CN101433478A (zh) * 2007-11-14 2009-05-20 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种全层生物角膜及其构建方法和用途
CN101757690A (zh) * 2010-02-05 2010-06-30 陕西瑞盛生物科技有限公司 一种制备组织工程角膜的方法
CN101947144A (zh) * 2010-09-29 2011-01-19 厦门大学 一种板层组织工程角膜支架及其制作方法与应用
CN104189957A (zh) * 2014-09-11 2014-12-10 中国海洋大学 利用新鲜猪角膜制备组织工程角膜载体支架的方法及应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUAN YE ET AL: "Chitosan-modified, collagen-based biomimetic nanofibrous membranes as selective cell adhering wound dressing in the treatment of chemically burned corneas", 《JOURNAL OF MATERIALS CHEMISTRY B》 *
KHAOW TONSOMBOON ET AL: "Composite electrospun gelatin fiber-alginate gel scaffolds for mechanically robust tissue engineered cornea", 《JOURNAL OF THE MECHANICAL BEHAVIOR OF BIOMEDICAL MATERIALS》 *
朱婉萍: "《甲壳素及其衍生物的研究与应用》", 30 November 2014 *
朱志忠: "《实用眼表病学》", 31 March 2004 *
杨利国: "《酶免疫测定技术》", 31 July 1998 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106039403A (zh) * 2016-07-15 2016-10-26 青岛三帝生物科技有限公司 具有生物活性的角膜修复植片的制备方法和角膜修复植片
CN106039403B (zh) * 2016-07-15 2019-12-03 广州尤尼智康生物科技有限公司 具有生物活性的角膜修复植片的制备方法和角膜修复植片
CN111110921A (zh) * 2019-12-23 2020-05-08 中国海洋大学 一种组织工程后板层角膜的体外构建方法
CN112168425A (zh) * 2020-04-13 2021-01-05 广东佳悦美视生物科技有限公司 一种人工角膜后板的制备方法
CN115227874A (zh) * 2021-04-22 2022-10-25 北京百利康生化有限公司 一种眼科用植片及其制备方法

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