ES2648487T3

ES2648487T3 - Antagonistas de factor de crecimiento endotelial vascular y métodos para su uso

Info

Publication number: ES2648487T3
Application number: ES13720737.9T
Authority: ES
Inventors: Donald P. Bottaro; Fabiola CECCHI
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2013-04-26
Publication date: 2018-01-03
Anticipated expiration: 2033-04-26
Also published as: US20190177382A1; AU2013251375A1; DK2841087T3; US20150126446A1; US11434268B2; HK1205929A1; WO2013163606A1; PT2841087T; AU2013251375B2; CA2870769A1; US20170267735A1; EP2841087A1; US9550818B2; US10035833B2; CA2870769C; EP2841087B1

Abstract

Una variante de polipéptido de factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF) para su uso en un método para tratar una enfermedad, caracterizada por angiogénesis patológica, comprendiendo dicho método la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad farmacéuticamente eficaz de la variante de péptido de VEGF, comprendiendo la variante de polipéptido de VEGF un dominio de tirosina quinasa y un dominio de unión a heparan sulfato C-terminal, en donde dicha variante de polipéptido tiene una o más alteraciones de aminoácido con respecto a un polipéptido VEGF nativo en el dominio de unión a heparan sulfato C-terminal, en la que dicha variante del polipéptido se une a heparina con una afinidad menor que dicho VEGF nativo y en donde la variante de polipéptido se selecciona del grupo que consiste en: (1) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 25 en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 149, 150 y 185 de la SEQ ID NO: 25 es un aminoácido ácido, un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 123, 124 y 159 de la SEQ ID NO: 26 es un aminoácido ácido y un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 27 en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 13, 14 y 49 de la SEQ ID NO:27 es un aminoácido ácido; (2) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 13, 14 y 49 de la secuencia SEQ ID NO: 4 es un aminoácido ácido; la SEQ ID NO: 64, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 31, 32 y 67 de la secuencia SEQ ID NO: 64 es un aminoácido ácido; la SEQ ID NO:65, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 37, 38 y 73 de la secuencia SEQ ID NO: 65 es un aminoácido ácido, la SEQ ID NO:67, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 54, 55 y 90 de la secuencia SEQ ID NO:67 es un aminoácido ácido y la SEQ ID NO: 68, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 13, 14 y 49 de la secuencia SEQ ID NO: 68 es un aminoácido ácido; (3) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 47, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 149, 150 y 185 de la SEQ ID NO: 47 es un aminoácido ácido, la SEQ ID NO: 48, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 149, 150 y 185 de la SEQ ID NO: 8 es un aminoácido ácido, la SEQ ID NO: 49, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 167, 168 y 203 de la SEQ ID NO: 49 es un aminoácido ácido, la SEQ ID NO: 50, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 173, 174 y 209 de la SEQ ID NO: 50 es un aminoácido ácido, la SEQ ID NO: 51, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 190, 191 y 226 de la SEQ ID NO: 51 es un aminoácido ácido, la SEQ ID NO: 52, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 329, 330 y 365 de la SEQ ID NO: 52 es un aminoácido ácido, la SEQ ID NO: 53, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 329, 330 y 365 de la SEQ ID NO: 53 es un aminoácido ácido, la SEQ ID NO: 54, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 347, 348 y 383 de la SEQ ID NO: 54 es un aminoácido ácido, la SEQ ID NO: 55, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 353, 354 y 389 de la SEQ ID NO: 55 es un aminoácido ácido, la SEQ ID NO: 56, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 370, 371 y 406 de la SEQ ID NO: 56 es un aminoácido ácido, la SEQ ID NO:57, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 149, 150 y 185 de la SEQ ID NO: 57 es un aminoácido ácido, la SEQ ID NO: 58, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 149, 150 y 185 de la SEQ ID NO:58 es un aminoácido ácido y la SEQ ID NO: 59, en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 190, 191 y 226 de la SEQ ID NO: 59 es un aminoácido ácido; y (4) un polipéptido que tiene los aminoácidos en las posiciones identificadas en (1), (2) o (3) y que tiene al menos un 95 % de identidad con un polipéptido de (1), (2) o (3) y que es un antagonista competitivo de señalización de VEGF y angiogénesis, en donde el aminoácido ácido es E o D.

Description

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la interrupción dirigida.

Los factores de crecimiento de unión a HS promueven el crecimiento de tumor, angiogénesis y metástasis en diversos cánceres humanos. Además de la estrategia que se describe en el presente documento, los miméticos HS de oligosacárido y los fragmentos de heparina modificada pueden actuar como antagonistas de unión de HS. Sin embargo, la complejidad de los glicosaminoglicanos (GAG) de HS supone un desafío para el desarrollo de agentes potentes y selectivos y las frecuentes alteraciones en la composición HS GAG en tumores puede hacer que dichos agentes sean menos competitivos para la unión a ligando. En cambio, las sustituciones contrarias a los restos de unión HS críticas en un ligando de proteína que sería sino de tipo silvestre son fáciles de introducir, no se ven afectadas por la composición HS GAG de tumor y son inherentemente una ruta selectiva. Estas características indican que el enfoque de los autores de la invención constituye una vía conveniente y práctica para el desarrollo de factores de crecimiento de unión a HS, en particular, VEGF 165.

En un aspecto, la presente invención proporciona nuevas variantes de VEGF. En particular, la invención se refiere a variantes del Factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A). VEGF-A es un regulador esencial de la angiogénesis normal durante la embriogénesis y la edad adulta y participa en la angiogénesis patológica en muchas enfermedades, entre las que se incluyen muchas formas prevalentes de cáncer. Tal como se conoce en la técnica, la señalización de VEGF-A se mide a través de los receptores de la superficie de la célula tirosina quinasa VEGFR1 (Flt-1) y VEGFR2 (Flk-1, KDR). El empalme diferencial de VEGF-A pre-ARNm tiene como resultado la expresión de múltiples isoformas VEGF-A, cuyas formas más abundantes en los seres humanos son VEGF121, VEGF 165 y VEGF 189. Todas las isoformas contienen los mismos sitios de unión para VEGFR1 y VEGFR2, pero difieren en su capacidad para unirse a heparan sulfato de proteoglicanos (HSP) que están presentes de forma ubicua en la matriz extracelular y en las superficies de la célula diana, debido a la presencia o ausencia de dos dominios de unión a heparina (HBD) básicos codificados por los exones 6 y 7. VEGF 121 carece de HBD y es libremente difusible en el espacio extracelular, mientras que VEGF 165 (SEQ ID NO: 3) y VEGF 189 presentan una unión a HSP de afinidad moderada y alta afinidad, respectivamente, lo que limita la movilidad de estas isoformas en compartimentos ricos en HSP. El péptido codificado por el exón 7 también contiene restos que permiten la unión de VEGF 165 a l co-receptor de VEGF, NRP1.

En una realización, la presente invención se refiere a variantes de VEGF 165. La SEQ ID NO: 2 presenta el precursor de la isoforma 1 del Factor de crecimiento endotelial vascular A de Homo sapiens. Esta forma es de 191 aminoácidos de longitud. Se escinde una secuencia de señal para formar la isoforma 2 del factor 1 de crecimiento endotelial vascular maduro Homo sapiens SEQ ID NO: 3. Se puede hacer referencia a la SEQ ID NO: 3 como "VEGF 165" y es de 165 aminoácidos de longitud. Se hace referencia también a VEGF 165, tanto en el presente documento como en otros, como VEGF 165 nativo, VEGF 165 maduro y similares. La SEQ ID NO: 4 es la región carboxilo terminal de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 y corresponde a los restos 111-165 de SEQ ID NO: 3 y se define por un sitio de escisión de plasmina. Se puede hacer referencia conjuntamente a las SEQ ID NO: 2-4 como secuencias VEGF 165; se puede hacer referencia a ellas también como “secuencias de aminoácido VEGF nativas” o “VEGF nativas” o “polipéptido VEGF nativo”. Es posible también hacer referencia a ellos como “secuencias de aminoácido de VEGF nativos” o “VEGF 165 nativos” o polipéptidos de VEGF 165 nativos”.

Las variantes de VEGF descritas en el presente documento representan secuencias de VEGF 165 que han sido modificadas de acuerdo con la invención. Dichas variante comprenden al menos un polipéptido que tiene un dominio de unión a heparina modificado. Se puede hacer referencia a estos polipéptidos como variante de VEGF de los polipéptidos, variante de una secuencia de aminoácidos VEGF, variantes de VEGF 165, variantes de secuencias de aminoácido de VEGF 165, variante de polipéptidos de VEGF 165 y similares. Se puede hacer referencia asimismo a las variantes de VEGF descritas en el presente documento como “polipéptidos de la presente invención” o “variantes de VEGF de la presente invención”, “secuencias de VEGF de la presente invención” y similares.

Una proteína de “secuencia nativa” comprende la secuencia de aminoácidos de una proteína tal como se encuentra en la naturaleza, p.ej., en un ser humano. La proteína de secuencia nativa puede obtenerse por medios recombinantes u otros medios sintéticos o se pueden aislar desde una fuente nativa.

Los términos “aminoácido” y “aminoácidos” se refieren a L-α-aminoácidos de origen natural. Se pretende que esta definición incluya norleucina, ornitina y homocisteína. Los aminoácidos se identifican o bien por la designación de una sola letra o bien por la de tres letras, del siguiente modo: Asp (D) ácido aspártico, Thr (T) treonina, Ser (S) serina, Glu (E) ácido glutámico, Pro (P) prolina, Gly (G) glicina, Ala (A) alanina, Cys (C) cisteína, Val (V) valina, Met

(M) metionina, Ile (I) isoleucina, Leu (L) leucina, Tyr (Y) tirosina, Phe (F) fenilalanina, His (H) histidina, Lys (K) lisina Arg (R) arginina, Trp (W) triptófano, Gln (Q) glutamina, Asn (N) asparagina.

La presente invención, se refiere en parte a variantes de VEGF que tienen una o más sustituciones en el dominio de unión a heparina de restos de aminoácido de carga negativa (p.ej. ácido) para el resto de aminoácido arginina en ciertas posiciones específicas en un polipéptido VEGF, tal como se describe en el presente documento. Los polipéptidos VEGF apropiados con los que se pueden crear variantes, se explican en el presente documento e incluyen isoformas de VEGF empalmadas alternamente humanos de 121, 145, 165, 183, 189 y 206 aminoácidos de longitud y especies ortólogas de VEGF. En el presente documento se describen los restos arginina específicos para

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"Angiogénesis" se define como la promoción del crecimiento de nuevos vasos capilares de la sangre desde el endotelio existente. La contribución de la expresión de VEGF elevada y su ruta de señalización se ha asociado con angiogénesis patológica en prácticamente todos los carcinomas estudiados, así como enfermedades oftálmicas neovasculares, como degeneración macular relacionada con la edad y retinopatía. Los polipéptidos de la invención se pueden utilizar para tratar estos trastornos.

Una enfermedad caracterizada por angiogénesis patológica incluye cualquier enfermedad o proceso patológico que se caracteriza por un crecimiento no deseable de nuevos vasos sanguíneos en el organismo. Por lo tanto, se pueden usar los polipéptidos de la presente invención para tratar estados patológicos como crecimiento de tumor yen enfermedades neoplásicas que implican una neurovascularización anormal. Por consiguiente, entre los ejemplos de trastornos caracterizados por angiogénesis patológicas que se pueden tratar mediante la presente invención se incluyen, sin limitarse a ellas, enfermedades neoplásicas, incluyendo sin limitarse a ellas, tumores sólidos y angiogénesis excesiva, que implica por ejemplo vascularización y/o inflamación, como aterosclerosis, artritis reumatoide (AR), glaucoma neovascular, retinopatía proliferativa, incluyendo retinopatía diabética proliferativa, degeneración macular, degeneración macular relacionada con la edad, degeneración macular húmeda, hemangiomas, angiofibromas y psoriasis. Otros ejemplos no exhaustivos de enfermedades angiogénicas no neoplásicas son retinopatía del prematuro (fibroplasía retrolental), rechazo a injerto córneo, diabetes melitus dependiente de insulina, esclerosis múltiple, miastenia gravis, enfermedad de Crohn, nefritis autoinmune, cirrosis biliar primaria, pancreatitis aguda, rechazo de aloinjerto, inflamación alérgica, dermatitis de contacto y reacciones de hipersensibilidad retardada, enfermedad intestinal inflamatoria, choque séptico, osteoporosis, osteoartritis, defectos cognitivos inducidos por inflamación neuronal, síndrome de Osler-Weber, restenosis e infecciones fúngicas, parasitarias y víricas, incluyendo infecciones por citomegalovirus. Las afecciones y enfermedades en las que la angiogénesis persistente y descontrolada tiene un papel se engloban bajo el término enfermedades asociadas angiogénicas o dependientes angiogénicas.

Las enfermedades neoplásicas para su tratamiento incluyen cáncer y/o cáncer metastásico. Una lista parcial de cánceres para tratar con los polipéptidos de la presente invención incluyen tumores sólidos, como carcinomas, derivados de células epiteliales, incluyendo de mama, próstata, pulmón, páncreas y colon; sarcomas que se generan desde el tejido conectivo, tales como cáncer de huesos, linfoma y leucemias, que se generan desde células hematopoyéticas; tumores de células germinales como cáncer de testículo y cáncer ovárico y blastomas derivados de tejido precursor o embriónico. Dichos tumores incluyen tumores benignos o malignos (p.ej., de hígado, riñón, vejiga, mama, gástrico, ovárico, colorrectal, próstata, pancreático, pulmón, vulva, tiroides, carcinomas hepáticos; sarcomas; glioblastomas y diversos tumores de cabeza y de cuello); leucemias y malignidades linfoides; otros trastornos como por ejemplo neurológicos, gliales, de los astrocitos, del hipotálamo y otros trastornos glandulares, de macrófagos, epiteliales, estrómicos y blastocélicos; y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos.

La identificación de dicha enfermedad entra dentro de la capacidad y el conocimiento de las personas especializadas en la técnica. Por ejemplo, es adecuado administrar los anticuerpos de receptor de VEGF de la presente invención a individuos humanos que o bien padecen una enfermedad neoplásica o angiogénica clínicamente significativa o bien están en riesgo de desarrollar síntomas clínicamente significativos. Un profesional clínico especializado en la técnica podrá determinar fácilmente, por ejemplo, mediante el uso de pruebas clínicas, un examen físico y la historia médica/familiar, si el individuo es candidato de dicho tratamiento.

Las composiciones de la presente invención pueden ser útiles asimismo como agentes de formación de imágenes moleculares para VEGFR. Las composiciones de la presente invención se puede utilizar para unir la molécula diana (VEGFR, por ejemplo) y marcarla con una fracción que la hace visible para una modalidad de formación de imágenes en particular. Las marcas comúnmente utilizadas incluyen radionúclidos, moléculas fluorescentes e iones paramagnéticos, así como nanopartículas, liposomas y macroburbujas, todos ellos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los agentes de formación de imágenes moleculares que incluyen las composiciones de la presente invención pueden ser útiles en el diagnóstico y/o evaluación de una enfermedad caracterizada por angiogénesis patológica, tal como se describe en el presente documento.

La variante de polipéptidos de la presente invención útil en los métodos de la presente invención incluye los siguientes polipéptidos: un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 25 en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 149, 150, y 185 de la SEQ ID NO: 25 es un aminoácido ácido, un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 123, 124 y 159 de la SEQ ID NO: 26 es un aminoácido ácido y un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 27 en la que el aminoácido de al menos una de las posiciones 13, 14 y 49 de la SEQ ID NO: 27 es un aminoácido ácido.

La variante de polipéptidos de la presente invención útil en los métodos de la presente invención incluye también: un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 25 en la que el aminoácido en las posiciones 149, 150 y 185 de la SEQ ID NO: 25 es un aminoácido ácido, un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido en las posiciones 123, 124 y 159 de la SEQ ID NO: 26 es un aminoácido ácido y un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 27 en la que el aminoácido en las posiciones 13, 14 y 49 de la SEQ ID NO:27 es un aminoácido ácido.

La variante de polipéptidos de la presente invención útil en los métodos de la presente invención incluye también: un

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monocatenaria de un plásmido o bacteriófago que contiene la secuencia de ADN sin alterar o nativa del polipéptido diana. Tras la hibridación, se utiliza una ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena complementara entera de la matriz que se incorpora así al cebador de oligonucleótido y codificará la alteración seleccionada en el ADN del polipéptido diana. Generalmente, se utilizan oligonucleótidos de al menos 25 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo tendrá de 12 a 15 nucleótidos que son completamente complementarios para la matriz en cada lado del nucleótido que codifica la mutación. Esto asegura que se hibriden los oligonucleótidos apropiadamente con la molécula matriz de ADN monocatenario. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente aplicando las técnicas conocidas en la especialidad, tales como las descritas por Crea et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos., 75: 5765 (1978)). La matriz de ADN monocatenario puede generarse también por desnaturalización del ADN del plásmido bicatenario (u otro) utilizando las técnicas convencionales.

Para la alteración de la secuencia de ADN nativa (para generar variantes de la secuencia de aminoácido, por ejemplo), se hibrida el oligonucleótido con la matriz monocatenaria en condiciones de hibridación adecuadas. A continuación, se añade una enzima de polimerización de ADN, normalmente, un fragmento Kenow de ADN polimerasa 1, para sintetizar la cadena complementaria de la matriz utilizando el oligonucleótido como cebador para la síntesis. Se forma así una molécula heterohíbrida, tal que una cadena de ADN codifica la forma mutada del polipéptido diana y la otra cadena (la matriz original) codifica la secuencia sin alterar nativa del polipéptido diana. A continuación, se transforma esta molécula heterohíbrida en una célula huésped adecuada, normalmente, una procariota como E. coli JM101. Después de cultivar las células, se colocan en placas de agarosa y se rastrean utilizando el cebador de oligonucleótido radiomarcado con fosfato-32 para identificar colonias bacterianas que contienen el ADN mutado. A continuación, se extrae la región mutada y se coloca en un vector apropiado para la producción de proteína, generalmente, un vector de expresión del tipo empleado normalmente para la transformación de un huésped apropiado.

El método que se acaba de describir se puede modificar, de manera que se cree una molécula homohíbrida en la que ambas cadenas del plásmido contiene la(s) mutación(es). Las modificaciones son las siguientes: se hibrida el oligonucleótido monocatenario con la matriz monocatenaria tal como se ha descrito. Se combina una mezcla de tres desoxirribonucleótidos, desoxirriboadenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP) y desoxiribotimidina (dTTP) con una tio-desoxirribocitosina modificada denominada dCTP-(aS) (que se puede obtener de Amersham Corporation). Se añade esta mezcla al complejo de matriz-oligonucleótido. Tras la adición de ADN polimerasa a esta mezcla, se genera una cadena de ADN idéntica a la matriz, a excepción de las bases mutadas. Además, la nueva cadena de ADN contendrá dCTP-(aS) en lugar de dCTP, que sirve para protegerla de la digestión de endonucleasa de restricción.

Una vez mellada la cadena de la matriz del heterohíbrido bicatenario con una enzima de restricción apropiada, la cadena de la matriz puede digerirse con ExoIII nucleasa u otra nucleasa apropiada pasada la región que contiene el (los) sitio(s) que se van a mutar. Después, se detiene la reacción para dejar una molécula que es solamente parcialmente monocatenaria. A continuación, se forma un homohíbrido de ADN bicatenario completo utilizando ADN polimerasa en presencia de los cuatro desoxirribonucleótido trifosfatos, ATP y ADN ligasa. Esta molécula homohíbridos se puede transformar entonces en una célula huésped adecuada como E. coli JM101, tal como se ha descrito.

El ADN que codifica las variantes de polipéptido diana en los que se va a sustituir más de un aminoácido se pueden generar a través de una de una serie de formas. Si los aminoácidos están localizados muy próximos en la cadena de polipéptido, se pueden mutar simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifica todas las sustituciones de aminoácido deseadas. Sin embargo, si los aminoácidos están localizados a cierta distancia uno de otros (separados más de aproximadamente diez aminoácidos), es más difícil generar un solo nucleótido que codifique todos los cambios deseados. En su lugar, se puede emplear uno de dos métodos alternativos.

En el primer método, se genera un oligonucleótido por separado para cada aminoácido que se va a sustituir. A continuación, se hibridan los oligonucleótidos con el ADN matriz monocatenario simultáneamente y la segunda cadena del ADN que se sintetiza desde la matriz codificará todas las sustituciones de aminoácido deseadas.

El método alternativo implica dos o más rondas de mutagénesis para producir el mutante deseado. La primera ronda es como se ha descrito para los mutantes simples: se utiliza ADN de tipo silvestre para la matriz, se hibrida un oligonucleótido que codifica las primeras sustituciones de aminoácido deseadas) con esta matriz y a continuación, se genera la molécula de ADN heterohíbrido. La segunda ronda de mutagénesis utiliza el ADN mutado producido en la primera ronda de mutagénesis como matriz. Por tanto, esta matriz contiene ya una o más mutaciones. El oligonucleótido que codifica la(s) sustitución(es) de aminoácido deseada(s) adicional(es) se hibrida después con esta matriz y la cadena resultante del ADN codifica ahora las mutaciones de la primera y segunda ronda de mutagénesis. Se puede utilizar el ADN resultante como matriz en una tercera ronda de mutagénesis, y así sucesivamente.

La mutagénesis por PCR también es adecuada para obtener variantes de aminoácido del polipéptido diana. Aunque la siguiente explicación se refiere a ADN, debe entenderse que la técnica también se puede aplicar con ARN. La técnica de PCR se refiere generalmente al siguiente procedimiento (véase Erlich, supra, el capítulo de R. Higuchi, p.

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huésped, de manera que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza altos niveles de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Los sistemas de expresión transitorios que comprenden un vector de expresión adecuado y una célula huésped permiten la identificación positiva conveniente de los polipéptidos codificados por ADN clonados, así como el rápido rastreo de dichos polipéptidos en busca de propiedades biológicas y fisiológicas deseada. Por lo tanto, los sistemas de expresión transitorios son particularmente útiles en invención para fines de identificación de análogos y variantes del polipéptido diana que tienen una actividad de tipo polipéptido diana.

En Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); Levinson et al.; las patentes europeas EP 117.060; y EP 117.058 se describen otros métodos, vectores y células huésped adecuados para su adaptación para la síntesis del polipéptido diana en el cultivo de células de vertebrado recombinantes. Un plásmido útil en particular para la expresión del polipéptido diana en cultivo de células de mamífero es pRK5 (patente europea publicada No. 307.247) o pSVI6B.

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de los vectores del presente documento son procariotas, levadura o eucariotas superiores, tal como se han descrito. Entre las procariotas adecuadas se incluyen eubacterias como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, como por ejemplo, E. coli, Bacilli como B. subtilis, especies psedomonas como P. aeruginosa, Salmonella typhimurium o Serratia marcescans. Un huésped de cloración de E. coli preferente es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque son adecuadas otras cepas como E. coli B, E. coli 1776 (ATCC 31,537) y E. coli W3110 (ATCC 27,325). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de exhaustivos. Preferentemente, la célula huésped deberá secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Alternativamente, son adecuados métodos in vitro de clonación, p.ej., PCR u otras reacciones de la polimerasa de ácido nucleico.

Además de los procariotas, son huéspedes adecuados también microbios eucariotas como hongos o levaduras filamentosos para vectores que codifican el polipéptido diana. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadero común, es la más utilizado entre los microorganismos huésped eucariotas inferiores. No obstante, existen otros géneros, especies y cepas disponibles comúnmente y útiles en el presente documento, tales como Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 (1981); patente europea EP 139.383 publicada el 2 de mayo de 1985), huéspedes Kluyveromyces (patente estadounidense. No. 4.943.529) como p.ej., K. lactis (Louvencourt et al., J. bacteriol., 737 (1983)), K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans y K. marxianus, yarrowia (patente europea EP 402.226), Pichia pastoris (patente europea EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol.,

28: 265-278 (1988)), Candida, Trichoderma reesia (patente europea EP 244.234), Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 76: 5259-5263 (1979)) y hongos filamentosos como p.ej., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (el documento WO 91/00357 publicado el 10 de enero, 1991) y huéspedes de Aspergillus como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biofis. Res. Commun., 112: 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 81: 1470-1474 (1984)) y A. Niger (Kelly and Hynes, EMBO J. 4: 475-479 (1985)).

Las células huésped adecuadas para la expresión del polipéptido diana se derivan de organismos multicelulares. Dichas células huésped son capaces de actividades de glicosilación y de procesamientos complejos. En principio, se puede trabajar con cualquier cultivo de células eucariotas superiores, ya sea de cultivos de vertebrados o invertebrados. Entre los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas baculovirales y las variantes y las células huésped de insecto permisivas correspondientes de huéspedes como células huésped de Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y bombyx mori. Véase, p.ej., Luckow et al., Bio/Technology 6: 47-55 (1988); Miller et al., in genetic Engineering, Setlow, J. K. et al., eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; y Maeda et al., Nature, 315: 592-594 (1985). Varias de estas cepas virales son de dominio público, p.ej., la variante L-1 de Autographa califórnica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV y este tipo de virus se pude utilizar como el virus del presente documento de acuerdo con la presente invención, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. Se pueden utilizar como huéspedes cultivos de células de plantas de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco. Normalmente, las células vegetales se transfectan por incubación con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que ha sido manipulada previamente para contener el ADN del polipéptido diana. Durante la incubación del cultivo de células de planta con A. tumefaciens, se transfiere el ADN que codifica el polipéptido diana al huésped de la célula de planta, para su transfección y para que en condiciones apropiadas exprese el ADN del polipéptido diana. Asimismo, están disponibles secuencias reguladoras y de señal compatibles con las células de planta, tales como el promotor de nopalina sintasa y las secuencias de señalización de poliadenilción. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1: 561 (1982). Asimismo, los segmentos ADN aislados de la región en dirección 5’ del gen T-DNA 780 son capaces de activar o incrementar los niveles de transcripción de genes expresables en la planta en un tejido vegetal que contiene ADN recombinante. Véase la patente europea EP 321.196 publicada el 21 de junio de 1989.

Sin embargo, se ha centrado el interés principalmente en células de vertebrados y la propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un procedimiento de rutina en los últimos años (Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors (1973)). Entre los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles se incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea células de riñón embriónicas humanas (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en

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Claims

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