CN108289965A - 氯离子通道的靶向表达及其使用方法 - Google Patents

氯离子通道的靶向表达及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明的某些实施方案提供一种治疗有需要的哺乳动物的可兴奋细胞相关的疾病或病状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的包含表达盒的载体，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子。

Description

氯离子通道的靶向表达及其使用方法
相关申请
本申请要求2015年10月1日提交的美国临时申请序列号62/235,914、2015年10月1日提交的美国临时申请序列号62/235,920、2016年3月4日提交的美国临时申请序列号62/303,907、以及2016年8月23日提交的美国临时申请序列号62/378,509的权益，所述申请以引用的方式并入本文。
背景
调节可兴奋细胞(例如神经元和肌肉细胞)的电生理反应的潜力可潜在地导致神经肌肉病状、疼痛以及与此类细胞的活性相关的其它病症的治疗。然而，由于因全身递送所致的广泛副作用的可能性，作用于内源性离子通道的配体的施用造成显著障碍。此外，局部作用的药剂(如银或辣椒素)具有不希望的副作用，并可能潜在导致永久损伤。先前已经显示通过配体门控阴离子通道的表达来调节神经元活性，其中使用谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)(一种在无脊椎动物中发现的烟碱类家族受体)的表达来沉默神经元(Slimko E.等人(2002)J Neurosci.22(17):7373-9)。GluCl可通过添加伊维菌素选择性地活化，伊维菌素是在低浓度下对内源性哺乳动物离子通道具有极小或没有影响的高效配体。然而，对于在脊椎动物、且特别是人患者中使用，这种方法造成产生针对这种外来蛋白的免疫应答的风险，从而导致潜在自身免疫性病症。为了克服免疫风险，以类似的方式使用人甘氨酸门控氯离子通道(GlyR)(Goss JR.等人(2010)Molecular Therapy 19(3):500-506；美国专利号8,957,036)。然而，与使用GluCl的情况一样(其中需要施用伊维菌素来活化所述通道)，GlyR通道的活化和随后的生理作用通过局部或全身施用激动剂(甘氨酸)来完成。甘氨酸在体内具有在26-245分钟范围内的短半衰期(Hahn R.(1993)Urol Res.21:289-91)，因此通过由美国专利号8,957,036所描述的方法和试剂维持用于治疗持续或慢性病状(如慢性疼痛、高眼压症或痉挛性张力亢进)的生理作用将需要重复注射或摄入大剂量的甘氨酸；或者开发并随后重复施用GlyR通道的选择性长半衰期合成激动剂。因此，需要用于长期调节可兴奋细胞的电生理学活性的另外的方法和试剂。此外，需要新的组合物和方法来治疗可兴奋细胞相关的疾病和病状。
发明概述
因此，本发明的某些实施方案提供用于调节可兴奋细胞的电生理学活性的方法和试剂。
本发明的某些实施方案提供一种用于调节(例如，体内调节)哺乳动物细胞的电生理学活性的载体，所述载体包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体氯离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子。
本发明的某些实施方案提供一种用于调节(例如，体内调节)哺乳动物细胞的电生理学活性的方法，所述方法包括使所述细胞(例如在体内)与包含表达盒的载体接触，所述表达盒包含与编码多聚体氯离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子。
本发明的某些实施方案提供包含表达盒的载体用于制备用于调节(例如，体内调节)哺乳动物细胞的电生理学活性的药物的用途，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子。
这种方法可涉及在哺乳动物(例如人)的可兴奋细胞中引起GlyR蛋白的外源性表达。此后，所述可兴奋细胞暴露于充当GlyR蛋白的激动剂的内源性甘氨酸。响应于内源性甘氨酸调节外源性GlyR蛋白(离子通道)可调节可兴奋细胞的电生理学活性，而无需施用受体的外源性激动剂或变构调节剂。
在本发明的某些实施方案中，离子通道的亚基可进行修饰以便形成组成型活性通道，在此情况下不再需要暴露于激动剂。所述方法可用于治疗可兴奋细胞相关的疾病或病状，如疼痛、高眼压症和痉挛状态。
因此，本发明的某些实施方案提供一种用于预防性或治疗性治疗可兴奋细胞相关的疾病或病状的载体，所述载体包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子。
本发明的某些实施方案提供一种治疗有需要的哺乳动物的可兴奋细胞相关的疾病或病状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物(例如人)施用有效量的包含表达盒的载体，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子。
本发明的某些实施方案提供包含表达盒的载体用于制备用于治疗有需要的哺乳动物的可兴奋细胞相关的疾病或病状的药物的用途，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子。
本发明的某些实施方案提供一种用于药物疗法中的载体，所述载体包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体氯离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子。
本发明的某些实施方案提供一种用于预防性或治疗性治疗可兴奋细胞相关的疾病或病状的药物组合物，所述药物组合物包含载体，所述载体包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子；以及药学上可接受的载体。
本发明的某些实施方案提供以下的组合：a)载体，所述载体包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子；和b)一种或多种其它治疗剂；所述组合用于预防性或治疗性治疗可兴奋细胞相关的疾病或病症。
本发明的某些实施方案提供一种试剂盒，所述试剂盒包括载体，所述载体包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子；包装材料；以及用于将所述载体施用至有需要的哺乳动物以治疗可兴奋细胞相关的疾病或病状的说明书。
附图简述
图1A-1B示出在配体不存在下GluCl受体的背景电导。图1A.来自GluCl WT的电流响应的实例。在没有电容补偿的情况下，全细胞电压钳制细胞在50ms内从-60mV斜升至+60mV。穿过膜的总电流Im是电容电流Ic和电阻电流IR的总和。图1B.对于所记录的细胞的数量(显示在括号中)，通过每种受体的平均电容标准化的背景电导。使用可溶性GFP作为模拟转染对照。
图2A-2F示出GluCl通道。图1A.结合有谷氨酸和IVM分子的修饰的GluClα-同聚通道(3RIF.pdb)的晶体结构(侧视图)。激动剂在亚基界面处结合；谷氨酸结合在细胞外结构域中，IVM结合在跨膜结构域的上半部分。图1B.GluCl通过谷氨酸和IVM差异活化。从在爪蟾卵母细胞中表达的异聚GluClαβ通道获得电生理学迹线。图1C.示出形成孔的亚基的对称布置的GluCl通道的顶视图。图1D、1E和1F.螺旋孔内衬M2结构域的残基。亮氨酸9'是高度保守的孔内衬残基。
图3示出人眼的解剖结构的某些方面。
图4示出具有一微米孔的柔性膜的数学模型，因为它变得更硬。使用通过孔的Poiseuille流的关系，当膜变得更硬时，水溶液的流动阻力显著改变。绘制三条曲线，每分钟来自2至3微升的流动。这个简单的实例表明，随着TM变得更硬，设施受到影响。
图5A-5B示出甘氨酸对表达GlyRα-亚基(hGlyRa1)的HEK-293细胞的膜电位的影响。图5A)甘氨酸对表达GlyRα-亚基(hGlyRa1)的HEK-293细胞的膜电位表现出剂量依赖性作用。图5B)对甘氨酸的反应不受牛磺酸(100μM)的存在影响。
图6示出甘氨酸对表达GlyRα-亚基(hGlyRa1)的HEK-293细胞的膜电位的剂量-反应曲线。在添加甘氨酸±牛磺酸后4.5分钟收集的数据表明，甘氨酸对HEK-293细胞GlyRα亚基(hGlyRa1)的膜电位具有剂量依赖性作用。牛磺酸对这些细胞的膜电位没有影响。拟合曲线表明，对甘氨酸的反应具有92μM的EC50浓度，其不受100μM牛磺酸(EC50＝43μM)的存在显著影响。
图7示出甘氨酸±牛磺酸对表达GlyRα-亚基(hGlyRa1)的HEK-293的膜电位的影响。在表达GlyRα-亚基(hGlyRa1)的HEK-293细胞中，基线膜电位(参见图5A-5B中在添加甘氨酸之前的前20秒)(基线)未通过添加牛磺酸(300μM)显著改变，但是当在处理后4.5分钟测量时通过添加甘氨酸(300μM)而改变。对甘氨酸(300μM)的处理后4.5分钟反应不受牛磺酸(100μM)的存在影响。
图8示出GTX-01在大鼠的神经性疼痛的SNI模型中的镇痛作用的时程。在第-1天测量基线评估且在第0天进行切断腓神经和胫神经的外科手术。所有大鼠在手术后第10天对机械刺激具有超敏反应(异常性疼痛)。在第10天施用GTX-01或对照载体。观察到与外周神经中基因治疗的病毒递送一致的异常性疼痛的时间依赖性逆转。数据点表示4只动物“GTX-01”和5只动物“对照”的平均值±SEM。**P<0.01，***P<0.001.
图9示出用GTX-01或对照载体处理的SNI大鼠的体重。在整个研究中测量并记录体重。未观察到用GTX-01与对照载体处理的动物的体重的差异。
图10示出伊维菌素对表达单独GluCl谷氨酸受体的野生型α-亚基的HEK-293细胞的膜电位呈现剂量依赖性作用。这证明可通过GluCl谷氨酸受体的α-亚基形成单体氯离子选择性通道。
图11示出在添加伊维菌素后4.5分钟收集的数据(如图10所示)表明伊维菌素对表达GluCl谷氨酸受体的单体野生型α-亚基的HEK-293细胞的膜电位具有剂量依赖性作用。对数据拟合曲线表明对伊维菌素的反应具有147nM的EC50浓度。
图12表明，在仅表达GluCl谷氨酸受体α-亚基的L9'A突变的HEK-293细胞中，基线膜电位(在添加伊维菌素之前的前20秒)被最大地改变并且等于在通过最大有效浓度的伊维菌素刺激时在表达GluCl谷氨酸受体的野生型α-亚基的细胞中所观察到的相等。在表达GluCl谷氨酸受体α-亚基的L9'A突变的细胞中，伊维菌素不增加超过在基线处测量的膜电位的变化。
图13示出GTX-01*在大鼠的神经性疼痛的SNI模型中的镇痛作用的时程。在第-1天测量基线评估且在第0天进行切断腓神经和胫神经的外科手术。所有大鼠在手术后第10天对机械刺激具有超敏反应(异常性疼痛)。在第10天施用GTX-01*或对照载体。观察到与外周神经中的基因疗法的病毒递送一致的异常性疼痛的时间依赖性逆转，到治疗后13天异常性疼痛的33％逆转，以及在处理后第22天和第35天的77％逆转。数据点表示6只动物(最终数据点上的5只动物)的平均值±SD。***P<0.001。
图14示出在手术后第46天施用加巴喷丁(100mg/kg:IP)时的反应。在先前用对照载体(对照)处理并且对机械刺激保持超敏的那些动物中，加巴喷丁使异常性疼痛反应在给药后1小时减少25％，并且在给药后2小时减少44％。在先前用GTX-01*处理的那些动物中，加巴喷丁对机械刺激的接近正常的反应没有影响。虚线表示在手术前在这些动物中测量的平均基线缩回阈值(参见图13)。数据点表示5只动物的平均值±SD。**P<0.01；***P<0.001。
图15示出在处理后第22天收获的来自GTX-01*处理的动物的DRG的免疫组织化学评估。在右图中，对于EYFP(通过GTX-01*递送的pFB-hSyn-GluCloptα-mEYFP-L9’A基因的产物)阳性染色的单独细胞体。类似地，在左图中，位于来自同一动物的爪的真皮层下方的神经末梢对于EYFP阳性染色。
图16示出未转染的、模拟转染的(模拟)或用GlyR受体通道的α-1亚基(hGlyRa1)转染的HEK-293细胞的活力，所述GlyR受体通道的α-1亚基形成由甘氨酸活化的活性Cl-通道。在转染后，将所述细胞在不含甘氨酸的培养基或含有甘氨酸(400μM)的DMEM中培养。使用台盼蓝染料排除在转染后72小时测量细胞活力。
图17示出未转染的、模拟转染的(模拟)或用野生型GluClα亚基(GluC1)或GluClα亚基的L9'A突变转染的HEK-293细胞的细胞活力，所述GluClα亚基的L9'A突变形成组成型活性Cl-通道(GluCl*)。使用台盼蓝染料排除在转染后48小时测量细胞活力。
图18A-18B示出在由正常健康供体的肺培养的平滑肌细胞中卡巴胆碱(Cch)诱导的细胞内Ca++的增加及福莫特罗(1μM)对其的拮抗作用。在用GluClα亚基L9'A突变(pFB-CMV-GluCloptα-mEYFP-L9’A)转染的来自两个供体的那些细胞中对Cch的反应降低。
图19A-19B示出由正常健康供体的肺培养的平滑肌细胞中组胺诱导的细胞内Ca++的增加。在用pFB-CMV-hGlyRa1-P2A-mEYFP-WT(野生型GlyRα-1亚基)转染并暴露于甘氨酸(100μm或1mM)的细胞中，组胺反应减弱。在不添加甘氨酸的情况下，在用pFB-CMV-hGlyRa1-P2A-mEYFP-L9'A(GlyRα-1亚基L9'A)转染的细胞中组胺反应也减弱。
图20示出培养物中的人DRG细胞的图像。在暴露于AAV6-hSyn-GFP后4天，神经元细胞(箭头)显示GFP的表达。GFP表达限于神经元细胞与神经胶质细胞。
发明详述
本发明的方法
本发明的某些实施方案提供一种调节可兴奋细胞的电生理学活性的方法。
本发明的某些实施方案还提供一种用于体内调节哺乳动物细胞的电生理学活性的方法，所述方法包括使所述细胞在体内与如本文所述的载体接触。
本发明的某些实施方案提供一种如本文所述的用于体内调节哺乳动物细胞的电生理学活性的载体。
本发明的某些实施方案提供如本文所述的载体用于制备用于体内调节哺乳动物细胞的电生理学活性的药物的用途。
如本文所用，术语“调节哺乳动物细胞的电生理学活性”是指细胞的膜电位的变化，所述变化是生物细胞的内部与外部之间的电位差。关于细胞的外部，膜电位的典型值在-40mV至-80mV的范围内。通过例如经由引入氯离子(Cl-)使细胞的内部更负(超极化)来增加此膜电位通过降低细胞电活化(去极化)的可能性而降低可兴奋细胞的活性。细胞的电生理学可使用本领域已知的技术来测量，例如使用本文描述的膜片钳程序或基于荧光的测定，其采用用于检测跨细胞膜的电压变化的FLIPR膜电位测定。
此类方法可涉及在哺乳动物(例如，人)的可兴奋细胞中引起多聚体离子通道的亚基(例如，甘氨酸受体(GlyR)的亚基)的外源性表达。在某些实施方案中，可兴奋细胞可暴露于离子通道的内源性激动剂(例如甘氨酸)。响应于内源性激动剂调节离子通道(包含外源性亚基)可调节可兴奋细胞的电生理学活性，而无需施用离子通道的外源性激动剂或变构调节剂。在某些实施方案中，所述亚基(例如GlyR或GluCl亚基)可包含至少一种在所述亚基多聚化时产生组成型活性离子通道的突变。在组成型活性离子通道的情况下，不再需要暴露于激动剂，并且将调节可兴奋细胞的电生理学活性而无需施用所述通道的外源性激动剂或变构调节剂。
如本文所述，可兴奋细胞可以是由于离子通道活化而经历其膜电位的波动的任何细胞。此类细胞可包括肌细胞、神经元等。在某些实施方案中，可兴奋细胞是眼睛的外周神经元、骨骼肌细胞或小梁网细胞。
如本文所用，术语“外源性”是指不在细胞(例如可兴奋细胞)中天然表达的蛋白质。例如，GlyR通常主要在脊髓和下脑内的细胞中表达。因此，即使在野生型GlyR蛋白(即，不同于突变蛋白)在例如外周神经元中表达时，其在此类细胞中的表达也是外源性的。此外，外源性表达可以是以比野生型表达显著更高的水平表达蛋白质。因此，如果作为诱导的结果而诱导细胞产生明显更多的蛋白质，那么诱导以低水平表达蛋白质的细胞中蛋白质的表达被认为是“外源性的”。还注意到GluCl蛋白不在哺乳动物中表达，因此它们的表达将被认为是外源性的。
本发明的某些实施方案提供一种如本文所述的用于药物治疗的载体。
本发明的某些实施方案提供一种治疗有需要的哺乳动物的可兴奋细胞相关的疾病或病状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的如本文所述的载体。
本发明的某些实施方案提供一种用于预防性或治疗性治疗可兴奋细胞相关的疾病或病状的本文所述的载体。
本发明的某些实施方案提供本文所述的载体用于制备用于治疗有需要的哺乳动物的可兴奋细胞相关的疾病或病状的药物的用途。
如本文所用，术语“可兴奋细胞相关的疾病或病状”是指基于阴离子(例如氯离子)通道和阳离子(例如钠)通道活性的净效应由可兴奋细胞的电生理学活性产生、与可兴奋细胞的电生理学活性相关或与可兴奋细胞的电生理学活性有关的任何疾病或病状。在某些实施方案中，所述疾病或病状可以是可兴奋细胞中异常电生理学活性(即，与未患这种疾病或病状的哺乳动物的可兴奋细胞中存在的电生理学活性相比)的结果。可兴奋细胞相关的疾病或病状是本领域已知的，并且包括例如疼痛(例如，慢性疼痛，例如关节疼痛或神经性疼痛)、炎症(例如，关节炎症)、高眼压症(例如，青光眼)以及痉挛性张力亢进(痉挛状态)。因此，在某些实施方案中，可兴奋细胞相关的疾病或病状是疼痛(例如，慢性疼痛，例如关节疼痛或神经性疼痛)、炎症(例如，关节炎症)、高眼压症(例如，青光眼)以及痉挛性张力亢进(痉挛状态)。
在某些实施方案中，所述方法还包括向所述哺乳动物施用一种或多种其它治疗剂(例如药剂)。因此，在某些实施方案中，所述方法还包括向所述哺乳动物施用一种或多种适用于治疗高眼压症(例如青光眼)的其它治疗剂(例如，药剂)。在某些实施方案中，所述一种或多种其它治疗剂是β阻断剂(例如噻吗洛尔)或缩瞳剂(例如毛果芸香碱)或碳酸酐酶抑制剂(例如乙酰唑胺)或拟交感神经药(例如地匹福林)或前列腺素类似物(例如拉坦前列素)或Rho激酶抑制剂。在某些实施方案中，所述方法还包括向所述哺乳动物施用一种或多种适用于治疗疼痛(例如慢性疼痛，例如关节疼痛或神经性疼痛)的其它治疗剂(例如，药剂)。在某些实施方案中，所述方法还包括向所述哺乳动物施用一种或多种适用于治疗炎症(例如，关节炎症)的其它治疗剂(例如，药剂)。在某些实施方案中，所述一种或多种其它治疗剂是非类固醇抗炎药(NSAID)(例如布洛芬)或类固醇。在某些实施方案中，所述方法还包括向所述哺乳动物施用一种或多种适用于治疗痉挛性张力亢进的其它治疗剂(例如药剂，如巴氯芬、苯并二氮杂丹曲林钠、咪唑啉或加巴喷丁)。在某些实施方案中，所述一种或多种其它治疗剂可选自免疫系统抑制剂、增强剂、抗生素(例如杀微生物剂或杀真菌剂)以及肾上腺素。
如本文所述，可用于本发明方法中的载体可包含表达盒，其中所述表达盒包含编码多聚体离子通道的亚基的核酸。在某些实施方案中，所述多聚体离子通道被内源性化合物活化。在其它实施方案中，所述多聚体离子通道是组成型活性的。因此，在某些实施方案中，不向所述哺乳动物施用离子通道的激动剂(例如甘氨酸)或变构调节剂。因此，在此类实施方案中，上述一种或多种其它治疗剂将不是离子通道的激动剂(例如甘氨酸)或变构调节剂。
如本文所用，术语“激动剂”是指可结合至受体/离子通道并活化所述受体/离子通道以产生生物应答的化学物质。例如，甘氨酸是GlyR激动剂。
如本文所用，术语“变构调节剂”是指可激动或拮抗(打开或关闭)离子通道的化学物质。因此，此术语涵盖激动剂和拮抗剂两者。例如，GlyR的激动剂包括甘氨酸、牛磺酸和β-丙氨酸，而GlyR的拮抗剂包括番木鳖碱。此外，所述术语涵盖间接影响(调节)在靶蛋白(例如受体)处的激动剂或反向激动剂的作用的物质。变构调节剂可结合至与正构激动剂结合位点不同的位点。通常它们诱导蛋白质结构内的构象变化。正向变构调节剂(PAM)或变构增强剂通过增强正构激动剂对靶蛋白的结合亲和力或功能功效而诱导正构激动剂作用的扩增。负调节剂(NAM)降低正构配体的作用，但在正构配体不存在下无活性。占据变构结合位点且功能中性的物质被称为沉默变构调节剂(SAM)。经典苯并二氮杂类是GABAA受体的众所周知的PAM。
在某些实施方案中，本发明的方法还可包括改变哺乳动物的饮食。在某些实施方案中，可改变饮食以增加或降低哺乳动物中内源性甘氨酸的水平。
用于治疗疼痛和炎症的方法
本发明的某些实施方案提供一种治疗有需要的哺乳动物(例如人患者)的疼痛(例如慢性疼痛，例如关节疼痛或神经性疼痛)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的如本文所述的载体。在某些实施方案中，所述方法可用于减轻疼痛的感觉。
本发明的某些实施方案还提供一种治疗有需要的哺乳动物(例如人患者)的炎症(例如关节炎症)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的如本文所述的载体。
本发明的某些实施方案提供如本文所述的载体用于制备用于治疗哺乳动物的疼痛或炎症的药物的用途。
本发明的某些实施方案提供一种如本文所述的用于治疗性治疗疼痛或炎症的载体。
据估计，高达1亿美国人患有慢性疼痛。在慢性疼痛中，很大一部分患者对目前的治疗不满意，从而突出用于此类病状的药物和非药物干预存在较大差距。疼痛可以是孤立的疼痛，或者疼痛可与特定疾病相关。疼痛可以与某些病状相关，如但不限于慢性手术后疼痛、神经瘤(如残肢神经瘤和莫顿氏神经瘤)、关节疼痛(包括骶髂疼痛、背痛和与任何已知人疾病相关的疼痛，所述疾病包括但不限于糖尿病、关节炎、心血管疾病、自身免疫性疾病、呼吸系统疾病(例如肺气肿)、感染性疾病(例如病毒或细菌感染)、神经系统疾病(例如阿尔茨海默氏病)、胃肠疾病、肝病、血液病症、过敏、内分泌疾病以及癌症。疼痛可与口腔癌(例如，舌癌和口癌)、咽癌、消化系统癌症(例如食道癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、肝癌、胆囊癌和胰腺癌)、呼吸系统癌症(例如，肺癌)、骨骼和关节癌症(例如，骨转移瘤、骨肉瘤)、软组织癌症、皮肤癌(例如黑色素瘤)、乳腺癌、生殖系统癌症(例如卵巢癌)、泌尿系统癌症(例如，膀胱癌、肾癌)、眼和眼眶癌症、脑和神经系统癌症(例如神经胶质瘤)或内分泌系统癌症(例如甲状腺癌)。癌症还可以是淋巴瘤(例如霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤或白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病等)。此外，慢性疼痛如但不限于中风后疼痛或与多发性硬化相关的疼痛、脊髓损伤、偏头痛、HIV相关的神经性疼痛、疱疹后神经痛、糖尿病性神经病、胰腺炎、炎性肠综合症、下背疼痛、纤维肌痛或由神经损害或损伤如术后疼痛(如在胸廓切开术后或在疝气修复后或截肢后的“残肢疼痛”中)引起的疼人、或由神经损伤如股外侧皮神经卡压(感觉异常性股痛)或其它情况引起的疼痛，由此疼痛由于因卡压、局部缺血或炎症所致的神经损伤引起。
为了治疗疼痛(例如慢性疼痛)，可使用与用于输送局部麻醉剂的那些类似的常规注射技术在疼痛部位递送如本文所述的载体。作为非限制性实例，皮内或皮下注射可用于治疗在诸如慢性手术后疼痛(CPSP)或疱疹后神经痛(PHN)的病状中由皮肤产生的疼痛。注射可直接到神经组织(如作为非限制性实例神经瘤)中以治疗诸如在截肢后出现的莫顿氏神经瘤或“残肢神经瘤”的病状。此外，作为非限制性实例，直接注射可以到神经纤维和神经干或神经节中以用于治疗局部疼痛，如糖尿病性神经病或与内脏癌相关的疼痛。治疗还可直接递送到关节中，以减轻与(作为非限制性实例)骨关节炎、外伤、衰老或炎症相关的疼痛。这些关节可包括但不限于小面关节、骶髂关节、膝关节、髋关节、肩关节、踝关节、腕关节、肘关节等。
使用如本文所述的载体治疗疼痛的能力可使用一系列动物模型如碘代乙酸单钠诱导的骨关节炎(MIA-OA)模型(Bove SE.等人(2003)Osteoarthritis and Cartilage 11(11):821-30；Schuelert N.和McDougall JJ.(2009)Neuroscience Letters 465(2):184-188；Combe R.等人(2004)Neuroscience Letters 370(2-3):236-240)或炎性疼痛模型如CFA-完全弗氏佐剂炎性疼痛模型(Fehrenbacher JC.等人(2012)Current Protocols inPharmacology 5.4.1-5.4.7,March 2012)来进行测试。还可使用神经性疼痛模型，如由神经损伤引起的神经性疼痛模型，例如Chung脊神经结扎模型(Chung JM.等人(2004)MethodsMol Med.99:35-45)、遗留神经损伤模型(Richner M.等人(2011)Journal of VisualizedExperiments 18(54):pii 3092)、Bennett慢性收缩神经损伤模型(Austin PJ.等人(2012)Journal of Visualized Experiments 13(61):pii 3393)或溶血磷脂酸模型(Inoue M.等人(2004)Nat Med.10(7):712-718；Ogawa K.等人(2012)Eur J Pain 16(7):994-1004)。
如本文所述，本发明的某些实施方案提供一种用于治疗有需要的哺乳动物的疼痛的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的如本文所述的载体。在此类实施方案中，所述载体可以是包含表达盒的病毒载体(例如AAV载体)，其中所述表达盒包含启动子和编码氯离子通道的亚基的核酸。在某些实施方案中，所述病毒载体是AAV6载体。在某些实施方案中，所述启动子是人突触素(hSyn)启动子。在某些实施方案中，所述核酸编码GlyR的亚基。在某些实施方案中，所述核酸编码氯离子通道的亚基，其中所述亚基包含至少一种突变，所述突变在所述亚基多聚化时产生组成型活性离子通道。在某些实施方案中，所述亚基是包含至少一种突变的GlyR亚基，所述突变在所述亚基多聚化时产生组成型活性GlyR通道。
滑液(SF)中(尤其是在发炎关节的滑液中)也存在显著水平的甘氨酸和牛磺酸。先前的研究已经证明从患有活动性关节炎病状的患者中提取的SF中兴奋性氨基酸(EAA)和其它神经递质的水平升高(Appelgren A.等人(1991)Scand J Dent Res.99:519-521；Larsson J.等人(1991)Scand J Rheumatol.20:326-335；McNearney T.等人(2000)JRheumatol.27:739-745)。另外的研究已经报道与正常对照相比，患有类风湿性关节炎的患者中血浆氨基酸(AA)水平升高(Trang LE.等人(1985)Scand J Rheumatol.14:393-402)。增加的SF EAA水平的来源尚不清楚，但可能性包括局部细胞产生、神经源性渗出物或血液或血浆跨滑膜的被动扩散。SF EAA在症状性关节病中的浓度升高及其与SF RANTES和MIP1-α浓度的报道的关联表明局部炎性关节过程而非血浆的被动扩散决定SF EAA浓度(McNearney T.等人(2004)Clin Exp Immunol.137:621-627)。为了评估这一点，McNearney和Westlund同时从14例最近死亡的尸体和9例患有活动性关节炎的患者的膝盖抽取血浆和滑液，并测量EAA和其它AA的水平以评估区室SF:血浆浓度比(McNearney T.和Westlund K.(2013)Int J Clin Exp Pathol.6(3):492-497)。他们的数据显示，在非关节炎样品中，平均SF:甘氨酸和牛磺酸的血浆浓度比分别是-2.11和-1.57。然而，在患有莱特尔综合征的患者中，平均SF:甘氨酸的血浆浓度比在SF中比血浆中高大约2倍。除甘氨酸升高外，SF谷氨酸的水平在此患者中也显著升高7.5倍。
活动性关节炎中SF Glu和Asp浓度升高的来源是未知的，但可能的候选物包括血浆、来自关节囊中的滑膜细胞或骨细胞的局部产生或来自神经纤维的局部分泌。可能预期，由于小生理分子通常处于血浆与滑液之间的完全平衡状态，所以SF Glu和Asp将基于大小与血浆完全平衡(McCarty D.Arthritis和Allied Conditions.Koopman WJ.编辑Baltimore:Williams and Wilkins,1997；第81-102页)。然而，来自无临死前关节炎的尸体的样品具有与其它9种AA相比显著降低的EAA SF:血浆浓度比。SF Glu与Asp的显著更大的区室比差异表明血浆不是SF EAA的唯一或甚至主要来源。较高SF：在具有临死前关节炎的一具尸体和一些具有活动性炎性关节炎过程的患者中的血浆浓度比也支持以下假设：SFEAA浓度反映关节中的局部生理过程。这些兴奋性氨基酸的最可能的来源可能是从供应关节的初级传入神经末梢的刺激释放，如同物质P释放到关节中一样(Yaksh TL.等人(1988)Peripheral release of substance P from primary afferents.Proceedings from theVth World Congress on Pain.Dubner R编辑,Gebhart GF.Bond MR.Amsterdam:Elsevier,第51-54页)。来自正常大鼠的SF EAA值表明，在活动性关节炎不存在下，低值可能是生理性的，并且在发炎关节中升高(Lawand NB.等人(2000)Pain 86:69-74；LawandNB.等人(1997)Eur J Pharmacol.324:169-177)。先前的研究已经证实在猴的供应发炎关节的正中关节神经中增加的Glu免疫反应性(Westlund KN.等人(1992)Brain Res Rev.17:15-27)。因此，假定谷氨酸也可能被神经纤维释放到关节中是合理的。在大鼠的高岭土/角叉菜胶诱导的关节炎模型中，用关节内利多卡因预处理消除了SF Glu的预期增加，其减少从外周神经的神经递质释放(Lawand NB.等人(2000))。局部谷氨酸和天冬氨酸可结合并活化局部骨细胞、软骨细胞和滑膜细胞上的外周受体，以增强或保持局部炎症和病理(SkerryTM.和Genever PG.(2001)Trends Pharmacol Sci.22:174-181；Lawand NB.等人(1997)EurJ Pharmacol.324:169-177；Flood S.等人(2007)Arthritis Rheum.56:2523-2534；Gu Y.等人(2002)Calcif Tissue Intl.70:194-203；Laketic-Ljubojevic I.等人(1999)Bone25:631-637；McNearney TA.等人(2010)Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.298:R584-598；Ramage L.等人(2008)Osteoarthritis Cartilage 16:1576-1584)。因此，合理预期支配发炎关节的局部传入神经的超极化不仅减轻疼痛，而且可通过减少促炎介质向关节的释放来减轻炎症。
治疗高眼压症的方法
本发明的某些实施方案提供一种治疗有需要的哺乳动物(例如，人患者)的高眼压症(例如青光眼)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的如本文所述的载体。在某些实施方案中，所述施用使得哺乳动物的眼内压降低。
本发明的某些实施方案提供如本文所述的载体用于制备用于治疗哺乳动物的高眼压症的药物的用途。
本发明的某些实施方案提供一种如本文所述的用于治疗性治疗高眼压症的载体。
青光眼是世界上失明的第二大原因，并且到2020年，患病率预计增加至全球5860万，且美国340万。青光眼大致可分成两大类：开角型和闭角型(closed-angle)(或闭角型(angle closure))青光眼。参考图3，示出描绘人眼特征的解剖图。关于青光眼，“角”是指虹膜与角膜之间的空间，流体(房水(AH))必须流动通过所述空间以经由小梁网(TM)从眼中排出。闭角型青光眼可能突然出现并且通常是痛苦的；视力丧失可迅速进展，但不适常常导致患者在永久性损伤发生之前寻求医疗照顾。开角型慢性青光眼倾向于以较慢速率进展，并且患者可能没有注意到他们已经失明，直到疾病显著进展。开角型青光眼的确切病因仍不清楚。然而，大多数青光眼患者的主要危险因素和治疗焦点是眼内压(IOP)升高，即高眼压症(OHT)。由于视网膜神经纤维层中的细胞损失所致的视野逐渐丧失是OHT的直接结果。视力丧失可对患者的生活质量和行动能力(如驾驶能力)产生负面影响，这具有严重负面宏观经济影响。本发明主要涉及治疗开角型青光眼中的OHT。
IOP主要由房水维持，房水由眼睛的睫状体产生。当睫状体产生房水时，它首先流入后房(由晶状体和虹膜界定)。房水然后通过虹膜的瞳孔流入前房(由虹膜和角膜界定)。从这里房水流动流过TM，以经由施勒姆管(SC)进入正常体循环。在人眼中，SC每分钟转移平均大约3μl房水。因此，通过AH的合成与排出之间的微妙平衡来维持眼内压。OHT的主要机制是通过小梁网或葡萄膜巩膜路径的流出减少。主要流出途径是经由TM，其也对房水的流出阻力具有最大贡献，并且是本发明的治疗焦点。
青光眼管理的现代目标是避免青光眼损伤和神经损伤，并为患者保留视野和总体生活质量，副作用最小。筛查青光眼通常作为标准眼科检查的一部分进行，其中应包括经由眼压计测量IOP。
IOP可用药物(通常是滴眼剂)降低。已经使用了几种不同类别的药物，每种类别中具有几种不同的药物。通常这些药物中的每种的治疗作用可能受局部和全身副作用的限制。如果出现副作用，患者通常必须愿意耐受所述副作用，或与治疗医师沟通以改善药物治疗方案。在青光眼患者中，不良药物依从性和随访一直被视为视力丧失的主要原因(Nordstrom BL.等人(2005)Am J Ophthalmol.140:598)。
已经进行激光手术和常规手术来治疗OHT，特别是对于先天性青光眼患者来说。虽然他们具有高成功率，但这些手术通常只是一种临时解决方案，需要定期(例如每两年一次)进行重复治疗。在大多数情况下，仍然需要药物来控制和维持术后IOP。然而，手术可减少所需的药物的量。
因此，仍然需要用于治疗OHT的稳健且可靠的疗法。例如，通过减少TM的细胞对AH外流的液压阻抗来松弛所述细胞以降低IOP的治疗方法。
在传统概念中，小梁网是惰性组织，没有其自身的调控性质。在这一概念中，流出阻力的调控由睫状肌决定。然而，在过去二十年中所做的工作已经证实，除了被睫状肌被动扩张之外，小梁网还具有其自身的收缩性质，并且这种结构的收缩和松弛可在松弛降低眼内压的意义上影响眼流出。充足的证据支持小梁网具有平滑肌样性质的理论。此外，小梁网细胞表达大量转运蛋白、通道和受体，其中许多已知调控平滑肌收缩力。已经显示小梁网可被诱导以响应于药理学试剂如乙酰胆碱和内皮素收缩和松弛(Lepple-Wienhues A.等人(1991)Exp Eye Res.53(1):33-38；Stumpff F.和Wiederholt M.(2000)Ophthalmologica._214(1):33-53)。在细胞水平上，这与质膜的去极化和细胞内钙的增加相结合。细胞内Ca2+的这种增加是通过从内质网释放Ca2+介导的，而且是经由L型电压门控Ca2+通道的开口介导的细胞外Ca2+流入。这种效应可通过L型电压门控通道阻断剂硝苯地平阻断(Stumpff F.和Wiederholt M.(2000)Ophthalmologica._214(1):33-53)。另一方面，小梁网的松弛似乎与maxi-K通道的刺激结合，从而诱导超极化和L型钙通道的闭合(Stumpff F.等人(1999)Invest Ophthalmol Vis Sci.40(7):1404-1417；Stumpff F.和Wiederholt M.(2000)Ophthalmologica._214(1):33-53)。
TM的松弛将带来小梁网的更大顺应性,如例如使用原子力显微镜(AFM)所测量。已经显示以这种方式测量的杨氏模量(顺应性的量度)与小梁网的流动阻力相关。正常眼中小梁网的小管旁(JCT)区域的杨氏模量是1.1至6.5kPa，而在青光眼的JCT中杨氏模量是100至250kPa，如图4中所示(美国专利申请公布US 2013/0184318 A1)。
本文描述了引起TM细胞松弛的机制。这些机制通过减少细胞内钙的可用性或通过减弱细胞利用活化细胞内可收缩元件所必需的细胞内钙的能力来降低TM细胞的收缩性。
鉴于TM与平滑肌细胞之间的相似性，尤其是L型电压门控Ca2+通道提供维持收缩所需的细胞内Ca2+的作用，似乎在一些情况下平滑肌细胞可用作TM细胞的药理学性质的模型。因此，预期通过Cl-的流入和气道平滑肌的随后松弛(Yim PD.等人(2011)The FASEBJournal 25(5):1706-1717)并如实施例8(图18和19)中所示的细胞超极化将预测TM细胞的类似超极化将导致TM的松弛。
使用上述技术在小梁网细胞的表面上表达的组成型活性通道的使用与配体或光活化通道相比具有显著优势(美国专利#US20150217133A1)。配体和光活化的通道的活性取决于配体的可用性和浓度或光的辐照度级。配体活化的通道依赖于配体的效力和药代动力学(PK)性质。配体对目标组织的可及性(特别是眼中的问题)、配体的局部游离浓度以及配体在组织内的驻留时间都是配体门控通道的活性模式的关键决定因素。视蛋白仅在被光子活化时是活性的，因此在弱光时间段期间(例如在夜间)，所述通道不是活性的。化学或物理活化剂的依赖性对组成型活性通道不是问题，并且生理作用在所有条件下将持续存在，并且不需要患者服用任何药物。在OHT和POAG的情况下，这是非常重要的优点，因为这些患者之中的依从性估计介于30％与70％之间。在视蛋白的情况下，在白天对于大多数患者来说光充足，但在夜间，他们可能将不得不使用常规药物治疗来维持低于21mmHg的IOP。在配体门控通道的情况下，这些易于产生相同的递送、代谢和清除的PK问题以及复杂化并限制基于常规药理学的疗法的使用的副作用。
本文提供利用组织特异性递送和细胞选择性表达编码外源性遗传物质(即，离子通道的亚基)(作为非限制性实例，如组成型活性氯离子通道的亚基)的基因以在不使用化学或物理刺激的情况下使TM细胞内的可收缩元件松弛的方法。TM的松弛将导致TM组织结构的渗透性增加，从而导致液压阻抗降低，并由此降低高IOP以控制OHT。
将选择的外源性物质递送至哺乳动物(例如，人患者)的眼睛可遵循一个或多个范例，如下文所述的那些，其可利用人眼相对于其它系统和/或结构的独特解剖定位/通路。正在Buie LK.等人(2010)(Invest Ophthalmol Vis Sci.,51；1:236-48)中所描述，眼睛流出路径的细胞的位置、形态学和生理学本身适合于有效的基因递送。由于房水的自然流动，递送到前房中的基因可优先到达小梁网。一旦载体到达小梁网，小梁网细胞层之间和周围的流体的生理流动模式可为转移分子提供更长的接触时间并且可促进它们进入细胞。
包含有待在靶向解剖结构的细胞中表达的外源性受体遗传物质的本文所述的载体的递送可涉及用一种或多种构型的注射器或其它装置注射，包括但不限于内部局部注射或施加(即，通常在如经由内窥镜技术的手术通路之后，注射到与解剖结构的目标部分相关联的组织结构的表面上，或注射在解剖结构本身上)。下文将更详细地探讨这些注射配置中的每种。
可利用前房内施用或施加至组织结构表面来递送遗传物质(即本文所述的载体)。在这种局部施加或暴露后，重组载体能够通过组织扩散并感染细胞。使用悬浮在凝胶中的载体溶液已经增加了病毒载体的局部施加的功效。在一个实施方案中，载体可悬浮在凝胶中并施加至组织表面，或放置在与目标组织相同的解剖空间中。可使用腹腔镜技术来实现内部局部施加，其中可通过眼睛的外层和其它相关的组织结构来形成一个或多个小切口以允许手术器械(照相机、针、工具等)的插入。针可在前房内插入(如通过照相机或其它成像装置(如裂隙灯生物显微镜或手术显微镜)可视化)。在所有情况下，可将载体与凝胶混合(例如由Abbott以商品名“Healon”出售的产品，或由Alcon以商品名“Viscoat”出售的产品)，且然后喷雾到、涂抹到或注射到相关组织的表面上。例如，可使用含有1x 1011vg的AAV的大约0.1mL盐水的剂量来覆盖每个1cm2区域。这些范围是说明性的，并且针对使它们与靶向TM细胞配对的每种载体来测试剂量。
在局部施加的一个具体实例中，可通过在显微镜观察下使用针在眼前房内局部施加载体溶液或凝胶来解决高眼压症，以实现光遗传物质向相关细胞的转移。可将所述载体作为快速浓注到前房的房水中或在TM附近的多个部位直接或局部施加以尽可能多地覆盖可用的TM表面，目的是感染TM的细胞。或者，可在前房内放置装有病毒的凝胶塞，并允许在数小时过程内洗脱病毒。然而，所述塞应被放置为使得它不会显著阻塞TM。在另一替代实施方案中，可插入病毒洗脱的小梁栓以获得相似的作用。可使用Alcon的眼用平衡盐溶液(例如BSS)来制备载体注射液。
在滴注局部麻醉剂如丙美卡因(由Alcon作为Alcaine出售)之后可进入前房，并且可插入眼睑窥镜，如Storz的Seibel 3-D眼睑窥镜，以允许针注射到前房中。或者，代替针注射，可通过使用锋利刺形刀片，如ASICO的MIP钻石刀在颞上缘进行穿刺术。可排出一定量的房水，并且可使用例如经由穿刺术引入到AC中的25至30号前房套管(如Storz的钝尖Knolle前房冲洗套管)进行载体注射。或者，移置的房水可经由穿刺术术中排放。
本文描述的载体(例如编码如本文描述的野生型或修饰的氯离子通道的亚基)及其递送至小梁网的能力可使用一系列动物模型来进行测试，如测量对正常实验室动物如大鼠、小鼠或兔的眼内压的治疗作用。此类测量可使用眼压计在有意识的或镇静的动物中进行。或者，可使用高眼压症的模型来测量治疗作用。一种这样的模型通过每日三次向眼睛施用0.5％乙酸泼尼松龙持续3或4周来产生(Gerometta R.等人(2008)InvestigativeOphthalmology&Visual Science 50(2):669-73)。
如本文所述，本发明的某些实施方案提供一种用于治疗有需要的哺乳动物的高眼压症的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的如本文所述的载体。在此类实施方案中，所述载体可以是包含表达盒的病毒载体(例如AAV)，其中所述表达盒包含启动子和编码氯离子通道的亚基的核酸。在某些实施方案中，所述表达载体是scAAV2病毒载体。在某些实施方案中，所述启动子是基质Gla蛋白(MGP)启动子。在某些实施方案中，所述核酸编码氯离子通道的亚基，其中所述亚基包含至少一种突变，所述突变在所述亚基多聚化时产生组成型活性离子通道。在某些实施方案中，所述亚基是包含至少一种突变的GlyR亚基，所述突变在所述亚基多聚化时产生组成型活性GlyR通道。
用于治疗痉挛性张力亢进的方法
本发明的某些实施方案提供一种治疗有需要的哺乳动物(例如人患者)的痉挛性张力亢进(痉挛状态)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的如本文所述的载体。
本发明的某些实施方案提供如本文所述的载体用于制备用于治疗哺乳动物的痉挛性张力亢进(痉挛状态)的药物的用途。
本发明的某些实施方案提供一种如本文所述的用于治疗性治疗痉挛性张力亢进(痉挛状态)的载体。
痉挛状态是某些肌肉不断收缩的病状。这种收缩导致肌肉僵硬或紧张，并可能干扰正常的运动、言语和步态。痉挛状态通常由控制自主运动的大脑或脊髓部分的损伤引起。所述损伤引起神经系统与肌肉之间的信号平衡的变化。这种不平衡导致肌肉活动增加。痉挛状态不利地影响肢体的肌肉和关节，并且对成长中儿童尤其有害。
痉挛状态影响全球超过估计1200万人。约80％的脑瘫(CP)患者具有不同程度的痉挛状态。估计美国有500,000人患有某种形式的CP，这相当于约400,000人患有某种程度的CP相关的痉挛状态。约80％的多发性硬化症(MS)患者具有不同程度的痉挛状态。估计美国有400,000MS患者，这相当于约320,000患者具有某种程度的MS相关的痉挛状态。其它可能引起痉挛状态的病状包括：创伤性脑损伤(TBI)、脊髓损伤(SCI)、由于缺氧所致的脑损伤、中风、脑炎、脑膜炎、肾上腺脑白质营养不良、肌萎缩性侧索硬化(卢伽雷氏病(Lou Gehrig's disease))以及苯丙酮尿症。
痉挛状态可与肌肉紧绷感一样轻微，或可能严重至足以产生疼痛、无法控制的四肢痉挛；最常见的是腿和手臂。痉挛状态还可产生关节内部和周围的疼痛或紧张感，并可引起下背痛。痉挛状态的不良作用包括：肌肉僵硬，从而引起运动不够精确和使某些任务难以执行；肌肉痉挛，从而引起无法控制的且经常疼痛的肌肉收缩；腿的不自主交叉；肌肉和关节畸形；肌肉疲劳；抑制纵向肌肉生长；抑制肌肉细胞中的蛋白质合成。这些可导致额外的并发症，如：尿道感染、慢性便秘、发热或其它全身疾病和压疮。
存在几种类型的可用治疗，所述治疗可共有以下共同目标：缓解痉挛状态的病征和症状；减少肌肉收缩的疼痛和频率；改善步态、卫生、日常生活和易于护理；减少看护者的挑战，如穿衣、喂食、运输和洗澡；改善涉及物体的自主运动功能，如伸手去拿、抓住、移动和释放；使儿童能够更正常的肌肉生长。这些治疗选择包括物理和职业治疗；口服药物如：巴氯芬、苯并二氮类、丹曲林钠、咪唑啉以及加巴喷丁。手术选择也可用，其包括鞘内注射巴氯芬(ITB)泵和选择性背根切断术(SDR)。
肉毒杆菌毒素(BTA)(也被称为肉毒杆菌素注射剂)通过使痉挛肌麻痹在少量使用时已被证明是有效的。基于痉挛状态模式仔细确定注射部位。当肉毒杆菌素被注射到肌肉中时，乙酰胆碱的释放被阻断，从而导致过度活跃肌肉的松弛。注射通常在几天内生效，但仅持续约12-16周，直到新神经末梢长回并且受影响的肌肉恢复。可施用的注射的次数存在限制。
用于治疗痉挛状态的选择因此受到限制，因此需要较低侵入性、更有效且患者友好的治疗。
为了治疗痉挛状态，可向哺乳动物(例如人患者)施用有效量的本文所述的载体。例如，可使用多针注射将载体直接递送到受影响的肌肉群中。在手术过程中，小电极通过胶带附着至受影响的肌肉区域上的患者皮肤上。所述电极附接至肌电图机(EMG)。EMG用于在注射前确认针位置，以确保鉴定正确的肌肉。医生然后将要求患者移动肌肉群。如果患者无法做到这一点，则医生将为患者进行运动范围移动。这有助于他或她从注射中获得最大益处。使用附接至EMG机器的小针将载体注射到肌肉中。医生可将少量的载体注射到沿肌肉群或许多肌肉群内的多个位置中。这有助于使治疗的益处最大化。在某些实施方案中，待递送的载体可如Childers等人所描述进行定制，以引起靶向骨骼肌肉群的全部或部分(Childers M.等人(2014)Sci Transl Med.6(220):220ra210)或支配靶向肌肉群的全部或一些运动神经的超极化，如由Towne等人(Towne C.等人(2010)Gene Therapy 17(1):141-6)所描述。将基于所使用的载体的类型(例如，AAV载体亚型的类型)以及包含在表达盒中的启动子的类型来确定肌肉或神经元细胞的靶向。
本文描述的载体治疗痉挛状态的能力可在多种动物模型中进行测试。例如，可将本发明的载体注射到选定的肌肉群中，并且在4-6周的时间段之后，可在整个动物中(Fertuck HC.等人(1775)J Cell Biol.66,209-13)或者通过除去目标肌肉和其相关的运动神经来测量肌肉响应于神经刺激的功能并测量对体外电神经刺激的反应(Franco JA.(2014)J.Vis.Exp.(91),e51948,doi:10.3791/51948)。
在某些实施方案中，所述载体被设计成靶向运动神经以治疗痉挛状态。在这种情况下，所述载体可以是AAV载体(例如，AAV6或AAV2)。在某些实施方案中，所述载体是AAV6载体。在某些实施方案中，载体包含表达盒，其中所述表达盒包含启动子和编码氯离子通道的亚基的核酸。在某些实施方案中，所述启动子是人突触素(hSyn)启动子。在某些实施方案中，所述核酸编码GlyR氯离子通道的亚基。在某些实施方案中，所述亚基是包含至少一种突变的GlyR亚基，所述突变在所述亚基多聚化时产生组成型活性GlyR通道。
在某些实施方案中，所述载体被设计成靶向骨骼肌细胞以治疗痉挛状态。在这种情况下，所述载体可以是AAV载体。在某些实施方案中，所述载体是AAV8载体。在某些实施方案中，所述载体是AAV9载体。在某些实施方案中，载体包含表达盒，其中所述表达盒包含启动子和编码氯离子通道的亚基的核酸。在某些实施方案中，所述启动子是人巨细胞病毒(“CMV”)启动子。在某些实施方案中，所述启动子是鸡β-肌动蛋白(“CBA”)启动子。在某些实施方案中，所述启动子是CAG或肌肉特异性结蛋白启动子。在某些实施方案中，所述核酸编码GlyR氯离子通道的亚基。在某些实施方案中，所述亚基是包含至少一种突变的GlyR亚基，所述突变在所述亚基多聚化时产生组成型活性GlyR通道。在某些实施方案中，所述载体是AAV8载体，其包含表达盒，其中所述表达盒包含肌肉特异性结蛋白启动子和编码GlyR的亚基的核酸，其中所述GlyR亚基包含至少一种在所述亚基多聚化时产生组成型活性GlyR通道的突变。
表达盒
如本文所述的载体可用于本发明的方法中。此类载体可包含编码多聚体离子通道的亚基的表达盒。
在某些实施方案中，表达盒包含编码多聚体离子通道的亚基的核酸，其中所述亚基能够形成(例如通过多聚化)活性离子通道。在某些实施方案中，所述亚基通过与一种或多种另外的亚基多聚化而形成活性离子通道。在某些实施方案中，所述一种或多种另外的亚基是内源表达的。在某些实施方案中，所述一个或多个另外的亚基是重组表达的。在某些实施方案中，所述多聚体离子通道是同聚体。在某些实施方案中，所述多聚体离子通道是异聚体。
如本文所用，术语“多聚体”是指包含多个亚基的离子通道，所述亚基可以是相同的(同聚的)或不同的(异聚的)。下文讨论具体类型的多聚体离子通道，以及它们的各种亚基和构象。如本文所用，术语“多聚化”是指缔合以形成功能性离子通道的亚基，所述亚基可以是相同的或不同的并且可以是内源性的或重组表达的。
在某些实施方案中，所述离子通道是氯离子通道/用作氯离子通道(例如选择性氯离子通道)。因此，在某些实施方案中，所述核酸编码多聚体氯离子通道的亚基。
在某些实施方案中，所述离子通道是钾通道/用作钾通道(例如选择性钾通道)。因此，在某些实施方案中，所述核酸编码多聚体钾通道的亚基。
离子通道及其亚基
本发明的方法可利用如本文所述的载体。此类载体可包含编码多聚体离子通道的亚基的表达盒。例如，这些载体可用于将多聚体离子通道靶向表达至哺乳动物中的特定细胞，从而调节细胞(例如可兴奋细胞)的电生理学活性。例如，这种调节可产生生理作用(例如，改变感觉神经元的电导以减轻疼痛)。
以下表1包括Cys环受体(即多聚体离子通道)、其亚基及其配体的非限制性列表。这些离子通道/亚基可用于本文所述的方法中。因此，在某些实施方案中，所述离子通道包含以下表1中描述的至少一种亚基。因此，在某些实施方案中，所述表达盒包含编码选自表1中所述的亚基的亚基的核酸。
在某些实施方案中，所述多聚体离子通道是甘氨酸受体(GlyR)。在某些实施方案中，编码的亚基选自由以下各项组成的组：GlyR的α-1亚基、α-2亚基和α-3亚基、α-4亚基和β亚基。在某些实施方案中，GlyR亚基可与一种或多种另外的亚基多聚化，所述一种或多种另外的亚基可以是相同的或不同的并且可以是内源性的或重组表达的。在某些实施方案中，编码的亚基是GlyR的α-1亚基(GlyRa1)。在某些实施方案中，GlyRa1是人GlyRa1(hGlyRa1)。GlyR亚基是本领域已知的；以下包括各种GlyR亚基序列的登录号以及特定的GlyR亚基序列。
在某些实施方案中，所述多聚体离子通道是γ-氨基丁酸受体(GABAAR)。在某些实施方案中，所述多聚体离子通道是GABAA-ρ受体(GABAC)。在某些实施方案中，所述编码的亚基选自由以下各项组成的组：GABRA1(α1)、GABRA2(α2)、GABRA3(α3)、GABRA4(α4)、GABRA5(α5)、GABRA6(α6)、GABRB1(β1)、GABRB1(β2)、GABRB1(β3)、GABRG1(γ1)、GABRG2(γ2)、GABRG3(γ3)、GABRD(δ)、GABRE(ε)、GABRP(π)、GABRQ(θ)、GABRR1(ρ1)、GABRR2(ρ2)以及GABRR3(ρ3)。)。GABAAR亚基是本领域已知的；各种人GABAAR亚基序列的登录号包括：GABRA1(NM_000806)、GABRA2(NM_000807)、GABRA3(NM_000808)、GABRA4(NM_000809)、GABRA5(NM_000810)、GABRA6(NM_000811)、GABRB1(NM_000812)、GABRB2(NM_021911)、GABRB3(NM_000814)、GABRG1(NM_173536)、GABRG2(NM_198904)、GABRG3(NM_033223)、GABRD(NM_000815)、GABRE(NM_004961)、GABRP(NM_014211)、GABRQ(NM_018558)、GABRR1(NM_002042)、GABRR2(NM_002043)以及GABRR3(NM_001105580)。
在某些实施方案中，所述多聚体离子通道是谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)。在某些实施方案中，编码的亚基选自由以下各项组成的组：α1、α2A、α2B、GBR2A(α3A)、GBR2B(α3B)以及β。如上文所论述，GluC1蛋白不在哺乳动物中表达，并且可在没有免疫赦免的组织中引起免疫应答。因此，在本发明的某些方法中，包含表达盒的载体(其中所述表达盒包含编码GluCl的亚基的核酸)可被靶向免疫赦免细胞，包括但不限于中枢神经系统(包括脑和脊髓)和眼睛。GluCl亚基是本领域已知的；各种GluCl亚基序列的登录号包括：GluClα(AY195802.1)和GluClβ(AY195803.1)。
在某些实施方案中，所述亚基包含至少一种突变(即，突变蛋白亚基；例如与相应的野生型亚基相比)。在某些实施方案中，编码的亚基与相应的野生型亚基具有约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
“野生型”或“天然存在的”或“天然的”是指在自然界中发现的没有任何已知突变的正常基因、蛋白质或生物体。因此，“野生型亚基”是指在自然界中发现的没有任何已知突变的正常亚基。相应的亚基将是指相同类型和物种的亚基，例如与野生型hGlyRa1相比的突变型hGlyRa1。
在某些实施方案中，所述亚基包含至少一种突变，所述至少一种突变使得离子通道的激动剂敏感性增强(例如，与相应的野生型离子通道相比)。
在某些实施方案中，所述离子通道可通过内源性激动剂/配体活化。
在某些实施方案中，编码的亚基包含至少一种突变，所述至少一种突变在所述亚基多聚化时产生组成型活性离子通道。下文将进一步详细地讨论此类组成型活性离子通道。
表1.
表1.Cys环配体门控离子通道的成员及其各自的亚基及其氨基酸配体。所列出的通道是Cys环配体门控离子通道的氯离子选择性成员。GlyR的成人形式是异聚α1β受体，其被认为具有三个α1亚基和两个β亚基或四个α1-亚基和一个β亚基的化学计量学。五个亚基可以不同方式组合以形成GABAA通道。产生GABA门控离子通道的最低要求是包含α-亚基和β-亚基两者，但脑中最常见的类型是包含两个α、两个β和γ(α1β2γ2)的五聚体。GluCl通道是由α-亚基和β-亚基组成的五聚体结构。α亚基和β亚基的比例并不固定，但通常分别由2或3个α亚基与互补的3或2个β亚基组成。在GlyR和GluCl的情况下，α-亚基能够在哺乳动物细胞系中形成功能性同-五聚体受体。
甘氨酸受体(GlyR)
GlyR是介导中枢神经系统(CNS)中的快速神经传递的配体门控离子移变受体的烟碱类超家族的成员。在GlyR的情况下，甘氨酸(约100μM的EC50)或其它激动剂的结合导致这种阴离子选择性通道的瞬时门控。在成人中，据信GlyR通常具有2个α亚基和3个β亚基的化学计量学(Rajendra S.等人(1997).Pharmacol Ther.73(2):121-46)。然而，仅人α1亚基的异源表达足以重构具有与天然通道的药理学性质基本上相同的药理学性质的活性甘氨酸门控通道(Sontheimer H.等人(1989)Neuron 2(5):1491-1497；Jensen AA.和KristiansenU.(2004)Biochemical Pharmacology 67(9):1789-1799)。因此，为了用于本发明的方法中，GlyR蛋白可以是GlyR的野生型亚基(例如，α1、α2、α3、α4或β)。在某些实施方案中，GlyR亚基可以是哺乳动物GlyR亚基。在某些实施方案中，与相应的野生型GlyR亚基相比，GlyR亚基可包含一种或多种突变(即，所述核酸可编码GlyR亚基的突变蛋白)。GlyR蛋白被充分表征(Rajendra S.等人(1997).Pharmacol Ther.73(2):121-46)，并且编码来自哺乳动物物种的许多亚基的序列在遗传数据库中索引或以其它方式获得。例如，与GlyR的α1亚基相关的序列可在NCBI登录号NM—000171(人)、NM—020492(小鼠)和NM—013133(大鼠)下找到。与GlyR的α2亚基相关的序列可在NCBI登录号NM—002063(人)、CR450343(cDNA)(人))、NM—183427(小鼠)以及NM—012568(大鼠)下找到。与GlyR的α3亚基相关的序列可在NCBI登录号NM—006529(人)、NM—001042543(人)、BC036086(人)、NM—080438(小鼠)、AY230204(小鼠)、AF362764(小鼠)以及NM—053724(大鼠)下找到。与GlyR的α4亚基有关的序列可在NCBI登录号NM—010297(小鼠)和BC110630(小鼠)下找到。与GlyR的β亚基相关的序列可在NCBI登录号NM—000824(人)、NM—010298(小鼠)和NM—053296(大鼠)下找到。
除了野生型GlyR亚基外，具有改变的活性的GlyR亚基的突变形式(突变蛋白)也是已知的，并且可用于本发明的背景中。在此方面，与相应的野生型GlyR亚基(即，突变蛋白GlyR亚基)相比，所述核酸可编码包含一种或多种突变的GlyR亚基。例如，GlyR蛋白的某些突变蛋白产生改变的离子通道性质，如产生阳离子离子通道(例如，Δ250A251E:KeramidasA.等人(2002)J.Gen.Physiol.119,393-410)。已知其它突变蛋白，所述突变蛋白缺乏锌增强或锌抑制的位点(Hirzel K.等人(2006)Neuron 52:679-690)、对变构调节剂(例如，麻醉增强)的亲和力(Hemmings HC.等人(2005)Trends Pharmacol.Sci.26,503-10)或对配体的亲和力(Rajendra S.等人,(1995)Neuron 14,169-175；Schrnieden V.等人(1993)Science262,256-258)。GlyR亚基的突变还可选择性地改变离子渗透(例如，阴离子或阳离子选择性通道)，并重新设计受体亚基的配体结合口袋以识别独特的药理剂。例如，为了改变GlyR蛋白对特定配体的敏感性和选择性，可在GlyRα1亚基中进行点突变，所述点突变预期使剂量反应曲线向左或向右移位(即，对甘氨酸的特异性更低或更高)。
可使用本领域已知的任何合适的方法来产生突变形式的亚基(例如，GlyR)。此类方法包括例如定点诱变、通过PCR的随机诱变、DNA的接头扫描诱变以及化学诱变(参见例如，Ausubel等人,编辑,Short Protocols in Molecular Biology,第5版,John Wiley&Sons,Inc.(2002))。
一旦在来自本文描述的载体的靶细胞中表达，GlyR亚基就可多聚化以在细胞(例如可兴奋细胞)的表面上形成通道。这些通道可通过外周循环甘氨酸(内源性甘氨酸)活化。已报道甘氨酸的血液浓度是大约230–330μM。具体地说，正常成年男性中242.0+/-44.0μM，且正常成年女性中258.0+/-64.0μM(Geigy Scientific Tables,第8修订版,第93页.C.Lentner编辑,West Cadwell,N.J.:Medical education Div.,Ciba-GeigyCorp.Basel,Switzerland c1981-1992)；在正常两个性别的成人中329.9+/-105.6μM(Psychogios N.等人(2011)PLoS One 6(2):e16957)；在正常成年男性中212.4+/-57.4μM(Grant SL.等人(2006)J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.844(2):278-82)；在正常两个性别的成人中230.0μM(178.0-282.0μM)(Cynober LA.(2002)Nutrition18(9):761-6)；在正常两个性别的成人中325.4+/-126.8μM(Psychogios N.等人(2011)PLoS One 6(2):e16957)。
基于1)已经在人血液中报道的以上甘氨酸水平；2)观察到在关节炎关节中甘氨酸的水平是血液中的大约2倍(McNearney T.和Westlund K.(2013)Int J Clin ExpPathol.6(3):492-497)；以及3)观察到仅由α-亚基的表达形成的GlyR的甘氨酸敏感性(ED50＝85 to 100μM)(Sontheimer H.等人(1989)Neuron 2(5):1491-1497；Jensen AA.和Kristiansen U.(2004)Biochemical Pharmacology 67(9):1789-1799)，可以设想，如果用甘氨酸受体的α亚基转染神经元传入神经，则神经元细胞的生理学可通过由于Cl-经由被内源性甘氨酸活化的甘氨酸受体的流入所致的膜电位的变化而改变。
组成型活性离子通道
如上所述，在某些实施方案中，多聚体离子通道可以是组成型活性离子通道(例如，组成型活性GlyR或GluCl)。因此，组成型活性离子通道可用于本发明的方法中(例如以调节可兴奋细胞的活性并治疗可兴奋细胞相关的疾病或病状，如慢性疼痛、高眼压症或痉挛状态)。
因此，在本发明的某些实施方案中，表达盒包含编码多聚体离子通道(例如单体或异聚体离子通道)的亚基的核酸，其中所述亚基包含至少一种突变(即，突变蛋白亚基)，所述至少一种突变在所述亚基多聚化时产生组成型活性离子通道。在某些实施方案中，所述组成型活性离子通道充当氯离子通道。在某些实施方案中，所述组成型活性离子通道充当钾通道。
如本文所用，术语“组成型活性离子通道”是指连续活化且不需要暴露于激动剂(例如，化学或生物)或物理活化剂(例如压力、热量或光)或使细胞活化以获得的细胞的电生物学状态的离子通道。测量离子通道的活性的测定是本领域已知的。在某些实施方案中，在实施例中描述的测定可用于确定离子通道是否被组成型活化。因此，在利用组成型活性离子通道的此类实施方案中，将不向哺乳动物施用激动剂或变构调节剂。
作为非限制性实例，秀丽隐杆线虫谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)的某些突变已被证明是组成型活性或渗漏性的。当在细胞膜中表达时，这些突变(其中一些列于表2中并且其活性在图1中描述)产生由氯离子携带的基础电导。
表2
表2.将GluCl通道中α-亚基的M2结构域中的亮氨酸9'残基取代为具有最小侧链的氨基酸(丙氨酸或甘氨酸)产生具有与WT受体显著不同的最大背景电导的组成型开放通道。具有β-分支侧链的三种L9'突变体(异亮氨酸、缬氨酸或苏氨酸)确实平均具有比WT受体大的背景电导，但是对于采样的细胞数目，所述增加不是统计上显著的。
在组成型活性氯离子通道将用于本发明的方法中以调节可兴奋细胞的电活性的实施方案中，作为非限制性实例，可使用修饰的谷氨酸门控氯离子(GluCl)通道。GluCl氯离子电流由传统的神经递质谷氨酸和半合成的抗蠕虫药伊维菌素(IVM)进行门控。修饰的同聚GluCl通道的分辨率晶体结构揭示了这些激动剂中的每种的结合位点位置(图2A，2B)。谷氨酸在位于两个亚基的界面处细胞外结构域中的经典神经递质结合位点处结合。伊维菌素在独立的非常规位点处结合，从而也在两个相邻亚基的界面处插入跨膜螺旋的上部外围处。通道的结构坐标代表明确界定的孔隙内衬残基的侧链内的开孔构象(图2C，2D)。一个孔隙内衬残基亮氨酸9'(L9')位于M2跨膜结构域的中间。L9'在Cys环受体家族的亚基中高度保守，并且已被提议用作疏水性通道门(图2E，2F)(Unwin N.(1993)J Mol Biol.229:1101–1124；Miyazawa A.等人(2003)Nature 423:949–955；Beckstein O.和Sansom MS.(2006)Phys Biol.3:147–159)。
GluCl通道中α-亚基的M2结构域中高度保守的亮氨酸9'残基被突变为七种其它残基L9'I、F、V、A、G、S、T中的每一种(其中L9'亮氨酸残基分别被异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代)(参见表2)。转染的HEK293细胞在全细胞构型中被电压钳制而无电容补偿。在配体不存在下，在50ms内使电压从-60mV连续斜升至+60mV。图1A中示出WT电流响应的一个实例。背景电导从电阻电流斜坡的斜率测量并通过每种受体的平均膜电容标准化，所述平均膜电容可从电容电流偏移计算。GluCl WT和WT-XFP受体显示出与模拟转染的对照无差异的最小背景电导(图1B)。具有最小侧链的两种L9'突变L9'A和L9'G具有与WT受体显著不同的最大背景电导。(Frazier SJ.(2012)Optimization of theGluCl/IVM Neuronal Silencing Tool via Protein Engineering.PhD Thesis,California Institute of Technology)。
如上所述，通过L9'处的氨基酸取代将野生型GluCl通道转化为具有自发通道活性的通道或组成型开放通道或Cl-孔的实例意图作为示例性实施方案。可设计并测试类似的修饰以转化Cys环受体家族中的任何通道，且特别是甘氨酸受体(GlyR)氯离子通道，GABAA和GABAC受体，但更通常来自任何生物有机体的任何离子通道。显示导致氯离子通道的自发打开、从而产生组成型活性通道的GABAA和GABAC受体的α、β、γ和ρ-亚基的一些保守氨基酸的突变的具体实例在表3中进行了描述。
表3
受体 亚基 突变 参考
GABAA β L259S Thompson等人,1999
GABAC ρ T314A Pan等人,1997
GABAC ρ L317A Pan等人,1997
GABAC ρ L301A Chang和Weiss.1998
GABAC ρ L301G Chang和Weiss,1998
GABAC ρ L301S Chang和Weiss,1998
GABAC ρ L301T Chang和Weiss,1998
GABAC ρ L301V Chang和Weiss,1998
GABAC ρ L301Y Chang和Weiss,1998
GABAA α L263S Chang和Weiss,1999
GABAA β L259S Chang和Weiss,1999
GABAA γ L274S Chang和Weiss,1999
表3.已经证明通道孔内的亮氨酸和酪氨酸残基的突变导致GABAA和GABAC受体的自发活性增加，从而产生组成型活性氯离子通道。(Chang Y.和Weiss DS.(1999)BiophysJ.77:2542–2551；Thompson SA.等人(1999)Br J Pharmacol.127:1349–1358；Chang Y.和Weiss DS.(1998)Mol Pharmacol.53:511–523；Pan ZH.等人(1997)Proc Natl Acad SciUSA 94:6490–6495)。
因此，在某些实施方案中，组成型活性离子通道是组成型活性GluCl离子通道。在某些实施方案中，所述亚基是α-亚基，其中所述α-亚基可多聚化以形成组成型活性GluCl离子通道。在某些实施方案中，所述亚基在亚基的M2结构域中包含至少一种突变，如表2中所述。在某些实施方案中，所述至少一种突变是如表2中所述的L9'A或L9'G。
在某些实施方案中，所述组成型活性离子通道是组成型活性GlyR。在某些实施方案中，所述亚基是α-亚基(例如α-1)，其中所述α-亚基可多聚化以形成组成型活性GlyR离子通道。在某些实施方案中，所述亚基在亚基的M2结构域中包含至少一种突变，如表2中所述。在某些实施方案中，所述至少一种突变是如表2中所述的L9'A或L9'G。
在某些实施方案中，所述组成型活性离子通道是组成型活性GABAA受体。在某些实施方案中，所述组成型活性离子通道是组成型活性GABAC受体。在某些实施方案中，所述亚基是α-、β-或γ-亚基，并且其中所述α-、β-或γ-亚基可多聚化以形成组成型活性GABAA受体。在某些实施方案中，所述亚基是ρ-亚基，并且其中所述ρ-亚基可多聚化以形成组成型活性GABAC受体。在某些实施方案中，所述亚基包含至少一种如表3中所述的突变。因此，在某些实施方案中，编码的亚基是在L263处具有至少一种突变(例如L263S)的GABAAα-亚基、在L259处具有至少一种突变(例如L259S)的GABAAβ-亚基、在L274处具有至少一种突变(例如L274S)的GABAAγ-亚基或在T314处具有至少一种突变(例如T314A)、在L317处具有至少一种突变(例如L317A)或在L301处具有至少一种突变(例如L301A、L301G、L301S、L301T、L301V、L301Y)的GABACρ-亚基。另外，也可在来自其它类型的离子通道的亚基中进行相应的突变；这类相应的氨基酸可由本领域技术人员使用序列比对程序来鉴定。
启动子
在某些实施方案中，本文所述的表达盒还可包含启动子。在某些实施方案中，所述启动子可操作地连接至核酸。所述启动子可进行选择以驱动目标细胞组内的离子通道亚基的表达。这可赋予目标组织特异性。因此，在某些实施方案中，所述启动子是组织特异性启动子。
例如，如果靶细胞类型是神经元，如将是疼痛(感觉神经元)或痉挛状态(运动神经元)的治疗的情况那样，所选启动子可以是泛神经元人突触素-1启动子(Syn1或hSyn)(IyerSM.等人(2014)Nature Biotechnology 32(3):274-278)。或者，可使用普遍存在的启动子，如人巨细胞病毒(“CMV”)启动子或鸡β-肌动蛋白(“CBA”)启动子，所述启动子中的每种都不是神经特异性的，并且所述启动子中的每种都已安全地用于神经退行性疾病的基因治疗试验中。
例如，当靶向骨骼肌细胞以用于治疗痉挛状态时，例如可使用人巨细胞病毒(“CMV”)启动子、鸡β-肌动蛋白(“CBA”)启动子或肌肉特异性结蛋白启动子(Childers M.等人(2014)Sci Transl Med.6(220):220ra210；Falk DJ.等人(2015)Molecular Therapy—Methods&Clinical Development 2:15007)。
当靶向小梁网(TM)以用于治疗高眼压症时，之前已经使用来自基质Gla蛋白(MGP)基因的启动子片段证明了经由AAV介导的基因转移至流出途径的TM细胞中的靶向基因表达(Gonzalez P.等人(2004)Invest Ophthalmol Vis Sci.45:1389-1395)。还已经使用壳多糖酶3样1(Ch3L1)基因的5'启动子区域实现了选择性靶向，其中表达特异性地针对TM的最外前部和后部区域(Liton PB.等人(2005)Invest Ophthalmol Vis Sci.46:183-190)。此外，已经公开了小梁网的许多基因谱分析研究，从而为小梁网细胞选择性启动子提供了另外的替代构型(Gonzalez P.等人,(2000)Invest Ophthalmol Vis Sci.41:3678-3693；Wirtz,等人(2002)Invest Ophthalmol Vis Sci.43:3698-3704；Tomarev,等人(2003)Invest Ophthalmol Vis Sci.44:2588-2596；Liton,等人(2006)Mol Vis.12:774-790；Fan,等人(2008)Invest Ophthalmol Vis Sci.49:1886-1897；Fuchshofer,等人(2009)ExpEye Res.88:1020-1032；Paylakhi,等人(2012)Mol Vis.18:241-254；Liu,等人(2013)Invest Ophthalmol Vis Sci.54:6382-6389)。
因此，在某些实施方案中，所述启动子可以是如本文所述的任何启动子。在某些实施方案中，所述启动子是可调控的启动子。在某些实施方案中，所述启动子是组成型启动子。
在某些实施方案中，所述启动子选自由以下各项组成的组：人突触素-1启动子(Syn1或hSyn)、人巨细胞病毒(“CMV”)启动子、鸡β-肌动蛋白(“CBA”)启动子、肌肉特异性结蛋白启动子、基质Gla蛋白(MGP)启动子或其片段以及壳多糖酶3样1(Ch3L1)基因的5'启动子区域。
在某些实施方案中，所述启动子是被设计成将离子通道/亚基的表达限于特定细胞类型的选择性启动子。因此，在某些实施方案中，所述启动子是被设计成将离子通道/亚基(例如，组成型活性离子通道)的表达限于小梁网的细胞和/或与房水的排出相关的其它细胞的选择性启动子。在某些实施方案中，所述启动子是被设计成将离子通道/亚基(例如，组成型活性离子通道)的表达限于神经元细胞(例如人突触素启动子(hSyn))的选择性启动子。在某些实施方案中，所述启动子是被设计成将离子通道/亚基(例如，组成型活性离子通道)的表达限于肌肉细胞的选择性启动子(例如结蛋白启动子)。
在某些实施方案中，所述表达盒还包含标记基因(例如，编码荧光蛋白的基因，例如GFP或YFP)。
在某些实施方案中，所述表达盒还包含与核酸序列可操作地连接的表达控制序列(例如，增强子)。用于将序列可操作地连接在一起的表达控制序列和技术是本领域中熟知的。
细胞
本发明的某些实施方案提供一种包含本文所述的表达盒的细胞。在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，如位于眼睛中的细胞(例如，小梁网细胞)、位于外周神经系统中的细胞(例如，伤害性感受传入神经元细胞)或肌肉细胞。在某些实施方案中，所述表达盒包含在载体中。在某些实施方案中，所述载体是腺病毒、慢病毒、腺相关病毒(AAV)、脊髓灰质炎病毒、HSV或基与鼠Maloney的病毒载体。在某些实施方案中，所述载体是AAV6病毒载体。
载体
可使用任何合适的方法来在哺乳动物(例如哺乳动物细胞，如可兴奋细胞)中引起或诱导离子通道亚基(例如，氯离子通道如GlyR或GluCl的亚基)的外源性表达。例如，可将药剂施用至哺乳动物，所述药剂活化编码来自可兴奋细胞的基因组的亚基的基因的转录。然而，通常，离子通道亚基的外源性表达通过基因转移技术引起或诱导。
因此，本发明的某些实施方案提供一种包含本文所述的表达盒的载体。此外，某些实施方案提供使本文所述的载体接触可兴奋细胞/将本文所述的载体引入可兴奋细胞(例如，哺乳动物可兴奋细胞)。某些实施方案还包括将本文所述的载体施用至哺乳动物(例如以用于在可兴奋细胞中表达)。
任何合适的载体都可用于将本文所述的表达盒引入哺乳动物细胞(例如可兴奋细胞)中。合适载体的实例包括质粒、脂质体、分子缀合物(例如转铁蛋白)和病毒。
在某些实施方案中，所述载体是病毒载体。病毒表达系统具有与高感染/拷贝数组合的快速和多功能实施的双重优点，以用于目标解剖结构中的稳健表达水平。病毒表达技术(如包括递送编码包装在重组病毒载体内的所需启动子-蛋白质序列的DNA的那些)已经在哺乳动物中成功地用于有效转染目标解剖结构。它们将遗传物质递送至靶细胞的细胞核，从而诱导此类细胞产生所需的蛋白质，例如离子通道如GluCl、GlyR的亚基，或其它氯离子通道蛋白。在离子通道的情况下，这些蛋白质然后被转运至细胞膜。
合适的病毒载体包括例如逆转录病毒载体、基于疱疹病毒的载体和基于细小病毒的载体(例如基于腺相关病毒(AAV)的载体、AAV-腺病毒嵌合载体和基于腺病毒的载体)。在某些实施方案中，所述载体是腺病毒、慢病毒、腺相关病毒(AAV)、自互补AAV(scAAV)、脊髓灰质炎病毒、HSV或基于鼠Maloney的病毒载体。在某些实施方案中，所述载体是AAV载体。在某些实施方案中，所述载体是对于特定类型的靶向可兴奋细胞具有已知趋向性的AAV载体。在某些实施方案中，所述AAV载体选自由以下各项组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9和rAAV2/6。在某些实施方案中，所述载体是AAV6病毒载体。
如本文所述，本发明的载体可包含表达盒，其中所述表达盒包含编码多聚体离子通道的亚基(例如，GlyR或GluCl的亚基)的核酸。在某些实施方案中，所述表达盒还可包含选择性启动子，所述选择性启动子仅驱动所需细胞群中的蛋白质的表达。在接种皮肤、肌肉、关节、眼睛或其它外周部位上的部位后，病毒载体(例如AAV)感染一种或多种细胞(例如可兴奋细胞)，其促进所述感染的细胞内编码的蛋白质(例如，GlyR或GluCl的亚基)的表达。然而，因为此类载体通常是复制缺陷型的，所以它们不在细胞内复制来传播至其它区域。因此，如果使用具有选择性趋向性的AAV载体来递送编码亚基的核酸，则可选择接种位点以使治疗靶向哺乳动物的预先选定的区域。
作为非限制性实例，在GlyR氯离子通道构型的情况下，通常病毒载体将包装可称为“GlyR氯离子通道表达盒”的物质，其将包含编码GlyR氯离子通道的亚基的DNA和将被选择以驱动GlyR氯离子通道蛋白的表达的启动子。在腺相关病毒(AAV)的情况下，目标基因(在此实施例中GlyR氯离子通道亚基)可呈仅具有一个活性氯离子通道表达盒的单链构型。
在GluCl或GlyR氯离子通道构型并将表达盒包装在AAV载体内的情况下，可使用若干构型。AAV是含有由反向末端重复序列侧接的4.7kb单链(ss)DNA的缺陷型细小病毒。它们需要辅助腺病毒用于感染，并且其基因组编码用于复制和包装所需的AAV蛋白。在进入细胞时，病毒ss DNA通过宿主酶转化成具有转录活性的双链DNA。重组AAV载体通过转基因表达盒置换编码两种其病毒蛋白的DNA，且因此不含任何开放的病毒阅读框。这种置换允许大约4.5kb(4500个碱基对(bp))的转基因插入物大小(Buie LK.等人(2010)Invest OphthalmolVis Sci.51；1:236-48)。基于以下基因编码序列大小，可包装至AAV病毒载体中的包含编码GluCl和GlyR亚基的核酸的表达盒的实例在以下示出：GluCl(下文所描述的通道)的α和β亚基是大约1400bp；GlyRα亚基是约1200bp；人突触素(hSyn))启动子的基因编码序列大小是大约500bp；并且常用的表达报道分子单体黄色荧光蛋白(mYFP)的大小是720bp。
表达盒的实例包括GluCl
1.hSyn启动子+GluCl-α亚基(约2Kb)
2.hSyn启动子+GluCl-β亚基(约2Kb)
3.hSyn启动子+GluCl-α亚基+mYFP(约2.7Kb)
4.hSyn启动子+GluCl-β亚基+mYFP(约2.7Kb)
5.hSyn启动子+GluCl-α亚基+hSyn启动子+GluCl-β亚基(约4Kb)
以及可能：
6.hSyn启动子+GluCl-α亚基+hSyn启动子+GluCl-β亚基+mYFP(约4.7Kb)
表达盒的实例包括GlyR
1.hSyn启动子+GlyR-α亚基(约1.7Kb)
2.hSyn启动子+GlyR-α亚基+mYFP(约2.4Kb)
在自互补的AAV(scAAV)结构中，在序列方面彼此互补并通过发夹环连接的表达盒的两个拷贝被封装在病毒包膜内。所述scAAV被认为更稳定并且尤其是在一些细胞，例如小梁网细胞中表现出更高的表达水平。scAAV表达盒的大小从初始4.5kb减小至2.2kb(BuieLK.等人(2010)Invest Ophthalmol Vis Sci.51；1:236-48)。鉴于scAAV的大小限制，可将GluCl表达盒构型1或2(以上)和可能的3或4(以上)包装到scAAV病毒载体中。然而，GlyR表达盒构型1或2(以上)中的任一个可被包装到scAAV病毒载体中。
在以上表达盒的上述描述中，使用GluCl和GlyR受体作为非限制性实例。可设计并使用类似的表达盒来转染GABAA和GABAC受体。另外，基因产物的表达可通过病毒的不同血清型(由病毒衣壳或外壳蛋白赋予)靶向；不同的血清型显示不同的组织趋向性。例如，病毒(例如AAV)病毒可被设计成靶向特定细胞类型(例如，感觉神经元，例如伤害性感受神经元)。
病毒已被用于靶向中枢神经系统和外周两者中的许多组织结构和系统。例如，基因转移至伤害感受器是用于管理慢性疼痛的有希望的策略，从而允许转基因在神经系统中的限制性位点处表达，并且由此选择性地靶向疼痛相关途径而不引发脱靶效应。
基因转移至伤害性感受神经元已通过病毒方法和非病毒方法两者实现。已经经由脂质体(Meuli-Simmen C.等人(1999)Hum Gene Ther.10:2689-700)、电穿孔(Lin CR.等人(2002)Neurosci Lett.317:1-4)和通过高渗稀释剂(Milligan ED.等人(2006)Pain 126:294-308)通过外周或直接注射至中枢神经系统递送来将驱动蛋白质表达的质粒DNA递送至感觉神经元。这些方法的主要缺点是它们导致瞬时蛋白质表达持续不超过两周。或者，病毒可用于驱动更长的转基因表达。病毒介导的基因递送的功效主要取决于递送方法的类型和所用病毒的类型。腺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、慢病毒和腺相关病毒(AAV)已被报道通过多种递送途径将转基因递送至伤害性感受途径，所述递送途径包括皮下(Wilson SP.等人(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96:3211-6；Goss,JR.等人(2010)Molecular Therapy 19(3):500-506；美国专利号：US 8,957,036)、肌内(Ghadge GD.等人(1995)Gene Ther.2:132-7)、神经内(Palmer JA.等人(2000)J Virol.74:5604-18)、鞘内(Storek B.等人(2006)Mol Pain 2:4；Storek B.等人,(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105:1055-60、脊柱内(Pezet S.等人(2006)Mol Ther.13:1101-9；Meunier A.等人(2008)J NeurosciMethods 167:148-59、直接背根神经节注射(Xu Y.等人(2003)Hum Gene Ther.14:897-906)以及还有在HSV的情况下病毒的局部施加(Antunes Bras JM.等人(1998)JNeurochem.70:1299-303；Zhang G.等人(2008)Anesthesiology 108:305-13。虽然这些研究已在有利的位点处产生了转基因表达并且伴随疼痛相关行为的减少，但是转导概况并未经常被表征。这在利用在细胞外环境中起作用的分泌的转基因研究中是常见的，如脑啡肽、内吗啡肽和白细胞介素，其中仅需要少量转导的细胞来将转基因递送至受影响的细胞邻域并调节疼痛感知(Mata M.等人(2008).Curr Gene Ther.8:42-8)。
在2009年，Towne等人评估了作为基因转移工具以靶向参与小鼠慢性疼痛的产生和发展的细胞机制的重组AAV(rAAV)血清型6。由于其广泛的组织趋向性、有效和稳定的转导(>数年)、低免疫原性和体内感染有丝分裂后细胞的能力，所以rAAV是强大的基因转移载体(Mandel RJ.等人(2006)Mol Ther.13:463-83)。血清型6载体(rAAV2/6)是选自小鼠中的先前实验中静脉内递送后的感觉纤维转导的观察结果(Towne C.等人(2008)Mol Ther.16:1018-25)和在直接注入中枢神经系统后对神经元的高趋向性(Azeredo da Silveira S.等人(2009)Hum Mol Genet.18:872-87)。Towne等人通过各种施用途径递送rAAV2/6并且精确绘制并比较在背根神经节(DRG)和脊髓内获得的转导概况(Towne C.等人(2009)MolecularPain 5(1):52)。评估了重组AAV血清型6(rAAV2/6)将基因递送至DRG神经元的能力。此外，通过五种不同的施用途径进行的伤害感受器的转导在小鼠中进行了表征。将表达rAAV2/6的绿色荧光蛋白(eGFP)直接注射到坐骨神经中以剂量依赖性方式导致达30％的L4DRG神经元的eGFP阳性细胞的转导。超过90％的转导细胞是中小型神经元(<700μm2)，主要与伤害性感受神经元的标志物共定位，并且在脊髓背角浅层中具有eGFP阳性中央末端纤维。转导的效率和概况与小鼠遗传背景无关。鞘内施用rAAV2/6产生最高水平的转导(约60％)并具有与伤害性感受神经元类似的大小轮廓和共定位。鞘内施用还在宫颈和胸部水平下转导DRG神经元，并在神经性疼痛的小鼠模型中产生相当水平的转导。皮下和肌内递送在L4DRG中产生低水平的转导。同样，经由尾静脉注射递送导致DRG内相对较少的eGFP阳性细胞，然而，在所有椎体水平下观察到这种转导并且对应于大的非伤害性感受细胞类型。从这些数据他们得出结论，rAAV2/6是用于将转基因递送至小鼠的伤害性感受神经元的有效载体。此外，转导概况的表征可促进基因转移研究以剖析神经性疼痛背后的机制。
这些研究后来得到了Iyer等人在2014年的支持，Iyer等人再次使用AAV6作为递送载体来用兴奋性或抑制性视蛋白选择性地转移小鼠中的传入神经伤害感受器神经以分别响应于光产生或抑制疼痛感觉(Iyer SM.等人(2014)Nature Biotechnology 32(3):274-278)。这些研究表明使用特定的AAV血清型可选择性地靶向特定的神经元群体。在这种情况下，使用AAV6选择性地靶向疼痛感觉神经元。这些研究还表明，AAV6可在皮下和肌内递送后被伤害性感受传入神经吸收。这强烈表明局部注射到疼痛部位中(如在用于慢性关节疼痛的皮内或关节内注射的情况下)是AAV-载体基因疗法的可行途径，以特异性地且选择性地转染局部支配疼痛区域或关节而不影响来自同一肢体的其它神经元介导的感觉(例如触觉)或所述肢体中的运动活动的伤害感受性神经。
这种方法的总体结果将类似于经由皮内、皮下或关节内途径递送的局部麻醉剂的非常持久(可具有多年的持续时间)的麻醉作用。当前，通常的做法是将局部麻醉剂注射到皮肤或关节内，例如注射在骶髂关节-也称为骶髂关节块中(Rupert M.等人(2009)PainPhysician 12(2):399-418)。
在另一个实施方案中，基因产物(例如，离子通道亚基)可靶向眼内的结构。已经成功利用了慢病毒和腺相关病毒(AAV)载体来将基因引入小鼠、大鼠和灵长类动物眼睛中(Borrás T.等人(2002)Invest Ophthalmol Vis Sci.43(8):2513-2518)。此外，这些一直是良好耐受的，并且在相对较长的时间段内高度表达，没有报道的不良反应，从而为长期治疗模式提供机会。
病毒已被用于靶向许多组织结构和系统，包括但不限于睫状上皮细胞、睫状肌视网膜神经节细胞以及小梁网细胞。迄今为止，至少六种传递系统已针对将基因递送至相关组织或细胞的能力进行了测试。这些包括腺病毒(Ad)、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、慢病毒(LV；猫免疫缺陷病毒[FIV]和人免疫缺陷病毒[HIV])、脂质体(LP)以及裸DNA。在这些之中，AAV由于其安全性而可能是优选的载体。然而，文献报道表明，与传统的含AAV的单链DNA相比，自互补的AAV可在感染TM细胞方面更有效。因此，在遗传物质将在小梁网中表达以治疗高眼压症的某些实施方案中，病毒载体可以是自互补的AAV2(scAAV2)。这种载体已显示在小鼠和灵长类动物的眼睛中的小梁网细胞中靶向绿色荧光蛋白(GFP)并实现绿色荧光蛋白的长期表达方面是有效的(Buie LK.等人(2010)Invest Ophthalmol VisSci.51；1:236-48)。
如本文所讨论的，本发明的载体(例如，包含含有编码GlyR或GluCl亚基的核酸的表达盒)可用于治疗痉挛状态。在某些实施方案中，可根据需要使亚基的表达靶向肌肉或运动神经元或两者以产生所需的作用。例如，在运动神经元中表达遗传物质以用于治疗痉挛性张力亢进(痉挛状态)的情况下，所述载体可以是注射到待松弛的肌肉或肌肉的神经肌肉接点处的AAV6载体。这种载体已显示在非人灵长类的运动神经元细胞中靶向绿色荧光蛋白(GFP)并实现绿色荧光蛋白的长期表达方面是有效的(Towne C.等人(2010)Gene Therapy17(1):141-6)。例如，在亚基在骨骼肌中表达以治疗痉挛性张力亢进(痉挛状态)的情况下，所述载体可以是AAV类型1、3或5(Chao H.(2000)Molecular Therapy 2(6):619-23)或AAV8(Childers M.等人(2014).Sci Transl Med.6(220):220ra210)或AAV9(Falk DJ.等人(2015)Molecular Therapy—Methods&Clinical Development 2:15007)中的一种。这些载体已显示在NOD/SCIOD小鼠的骨骼肌细胞中靶向犬因子IX并实现犬因子IX的长期表达方面是有效的。所述载体将被直接注射到待治疗的肌肉中。
载体制备和施用
在已经产生了本文所述的载体后，可纯化所述载体。可通过任何合适的方法，如通过密度梯度纯化、通过色谱技术或有限稀释纯化来完成载体纯化以增强载体在组合物中的浓度。具体的纯化技术是本领域的技术人员已知的并且将根据载体类型(例如，病毒的类型，如AAV的类型)而变化。
在本发明的某些实施方案中，所述载体是病毒载体，如AAV载体。一般来说，当足够的病毒可被递送至细胞群体以确保所述细胞面对预定数量的病毒时，病毒载体是最有用的。因此，本发明提供一种包含病毒载体(例如AAV载体)的原液，优选均质原液。病毒原液(例如AAV原液)的制备和分析是本领域中熟知的。病毒原液在滴度方面变化较大，这主要取决于病毒基因型以及用于制备它们的方案和细胞系。在某些实施方案中，这种原液具有至少约105个噬菌斑形成单位(pfu)，如至少约106pfu或甚至更具体地至少约107pfu的病毒滴度。在更具体的实施方案中，滴度可以是至少约108pfu，或至少约109pfu。在某些实施方案中，原液是至少约1010pfu或至少约1011pfu的高滴度原液。
本发明另外提供一种包含本文所述的载体(vector)(例如AAV载体)和载体(carrier)的组合物。所述组合物的载体可以是用于所述载体(vector)的任何合适的载体(carrier)。所述载体通常将是液体，但也可以是固体，或液体组分与固体组分的组合。期望载体是药学上可接受的(例如生理学或药理学上可接受的)载体(例如，赋形剂或稀释剂)。药学上可接受的载体是熟知的并且容易获得。载体的选择将至少部分由特定载体和用于施用组合物的特定方法来确定。所述组合物还可包含任何其它合适的组分，特别是用于增强组合物和/或其最终用途的稳定性。因此，存在本发明的组合物的广泛多种合适制剂。以下制剂和方法仅仅是示例性的并且绝不是限制性的。
如上文所讨论的，本文描述的载体可被配制为药物组合物，并且以适于所选施用途径的各种形式施用至哺乳动物宿主(如人患者)，所述施用途径是口服或通过静脉内、肌肉内、局部或皮下途径实现的肠胃外施用途径。
所述载体可经由皮内、皮下、神经内、肌肉内或前房内输注或注射施用。用于局部(区域)注射或肠胃外施用的制剂包括水性和非水性等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和致使制剂与预定接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂以及防腐剂。可于水中制备载体的溶液，任选地与无毒表面活性剂混合。还可于甘油、液体聚乙二醇、三乙酸甘油酯及其混合物中以及于油中制备分散液。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。所述制剂可以单剂量或多剂量密封容器，如安瓿和小瓶形式呈现，并且可储存于冷冻干燥(冻干)的条件下，仅需在使用前即刻添加无菌液体赋形剂(例如水)以供注射。即时注射溶液和悬浮液可从先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
适用于注射或输注的药物剂型可包括无菌水溶液或分散液或任选地囊封于脂质体中的包含载体的无菌粉末，所述载体适合于临时制备无菌可注射或可输注溶液或分散液。在所有情况下，最终剂型应该在制造和存储条件下处于无菌、流体和稳定状态。液态载体或媒介物可以是溶剂或液态分散介质，其包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其适合的混合物。适当的流动性可例如通过形成脂质体、在分散液的情况下维持所需粒度或使用表面活性剂加以维持。对微生物作用的防止可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，将优选的是包括等渗剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
无菌可注射溶液是通过将在适当溶剂中的所需量的载体与以上列举的各种其它成分(根据需要)合并，随后进行灭菌来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术产生活性成分加存在于先前无菌过滤溶液中的任何额外所需成分的粉末。
本发明载体也可与药学上可接受的载体如惰性稀释剂一起局部施用。对于局部施用，本发明载体可以纯形式来施加，即在它们处于液态时施加。然而，将通常合乎需要的是将它们与皮肤病学上可接受的载体组合，以组合物或制剂形式施用至皮肤，所述载体可以是液体。
有用的液体载体包括水、醇或二醇或水-醇/二醇掺混物，其中本发明载体可任选地借助于无毒表面活性剂在有效水平下溶解或分散于所述载体中。可添加如芳香剂及额外抗微生物剂的佐剂以便使给定用途的性质最优化。所得液体组合物可通过用于浸渍绷带和其它敷料的吸收垫施用，或使用泵型喷雾器或气雾剂喷雾器喷射于受影响的区域上。
诸如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯类、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物质的增稠剂也可与液态载体一起使用，以便形成用于直接施加至使用者的皮肤的可涂敷糊剂、凝胶剂、软膏剂、皂剂等。
可用于向皮肤递送本发明载体的有用皮肤学组合物的实例为本领域所已知；例如参见Jacquet等人(美国专利号4,608,392)、Geria(美国专利号4,992,478)、Smith等人(美国专利号4,559,157)以及Wortzman(美国专利号4,820,508)。
本文所述的载体的有用剂量可通过在动物模型中对比它们的体外活性与体内活性来确定。用于将小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人的方法为本领域所已知；例如参见Nathwani AC.等人(2011)Mol Ther.19:876–885；Nathwani AC.等人(2014)N Engl JMed.371(21):1994–2004。
为在治疗中使用所需的载体的量将随施用途径、所治疗病状的性质以及患者的年龄和状况变化，并且将最终由主治医师或临床医师酌定。
所需剂量可方便地以单个剂量提供或以适当时间间隔施用的分次剂量提供，例如以每天两次、三次、四次或更多次亚剂量提供。亚剂量本身可进一步分成例如多个独立的松散间隔的施用；如多次滴入眼中。
如本文所讨论的，载体可与其它治疗剂或生物活性剂，例如适用于治疗可兴奋细胞相关的疾病或病状(如疼痛、炎症、高眼压症或痉挛性张力亢进)的其它药剂组合施用。此外，免疫系统抑制剂、增强剂、抗生素或肾上腺素可与本文所述的载体组合施用。因此，在一个实施方案中，本发明还提供一种包含如本文所述的载体、至少一种其它治疗剂或生物活性剂以及药学上可接受的稀释剂或载体的组合物。例如，可存在适用于治疗特定适应症的治疗因子。控制炎症的因子(如布洛芬或类固醇)可以是所述组合物的一部分，以减轻与体内施用载体相关的肿胀和炎症以及生理痛苦。可用组合物方法施用免疫系统抑制剂以减少对载体本身的任何免疫应答或与病症相关的任何免疫应答。或者，免疫增强剂可包含在组合物中以上调人体对疾病的天然防御。可存在抗生素，即杀微生物剂和杀真菌剂以降低与基因转移程序和其它病症相关的感染风险。另外药理活性剂如肾上腺素可添加至制剂中以诱导血管收缩并减少用于局部麻醉剂的AAV从注射部位的清除。本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如本文所述的载体、至少一种其它治疗剂或生物活性剂、包装材料以及用于将如本文所述的载体和其它治疗剂/生物活性剂施用于动物以治疗可兴奋细胞相关的疾病或病状的说明书。
本发明的某些实施方案
实施方案1.一种用于体内调节哺乳动物细胞的电生理学活性的载体，所述载体包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道(例如，氯离子通道)的亚基的核酸可操作地连接的启动子。
实施方案2.一种用于体内调节哺乳动物细胞的电生理学活性的方法，所述方法包括使所述细胞与包含表达盒的载体接触，所述表达盒包含与编码多聚体离子通道(例如，氯离子通道)的亚基的核酸可操作地连接的启动子。
实施方案3.一种用于预防性或治疗性治疗可兴奋细胞相关的疾病或病状的载体，所述载体包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子。
实施方案4.一种治疗有需要的哺乳动物的可兴奋细胞相关的疾病或病状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的包含表达盒的载体，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子。
实施方案5.如实施方案1至4中任一项所述的载体或方法，其中所述亚基能够通过与一种或多种另外的亚基多聚化而形成多聚体离子通道。
实施方案6.如实施方案1至5中任一项所述的载体或方法，其中治疗是在不存在施用激动剂或变构调节剂的情况下进行；其中不向所述哺乳动物施用所述多聚体离子通道的激动剂或变构调节剂；和/或其中所述哺乳动物细胞不与外源性激动剂或外源性变构调节剂接触。
实施方案7.如实施方案6所述的载体或方法，其中所述激动剂是甘氨酸。
实施方案8.如实施方案1至7中任一项所述的载体或方法，其中所述多聚体离子通道由内源性激动剂活化。
实施方案9.如实施方案1至8中任一项所述的载体或方法，其中所述核酸编码氯离子通道的亚基。
实施方案10.如实施方案9所述的载体或方法，其中所述核酸编码甘氨酸受体(GlyR)、γ-氨基丁酸受体(GABAAR)或谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)的亚基。
实施方案11.如实施方案10所述的载体或方法，其中所述核酸编码GlyR的亚基。
实施方案12.如实施方案11所述的载体或方法，其中所述编码的GlyR亚基选自由以下各项组成的组：α-1亚基、α-2亚基和α-3亚基、α-4亚基以及β亚基。
实施方案13.如实施方案12所述的载体或方法，其中所述编码的GlyR亚基是GlyR的α-1亚基(GlyRa1)。
实施方案14.如实施方案13所述的载体或方法，其中所述编码的GlyR亚基是人GlyRa1(hGlyRa1)。
实施方案15.如实施方案10所述的载体或方法，其中所述核酸编码GABAAR的亚基。
实施方案16.如实施方案15所述的载体或方法，其中所述核酸编码GABAA-ρ受体的亚基。
实施方案17.如实施方案15所述的载体或方法，其中所述编码的GABAAR亚基选自由以下各项组成的组：GABRA1(α1)、GABRA2(α2)、GABRA3(α3)、GABRA4(α4)、GABRA5(α5)、GABRA6(α6)、GABRB1(β1)、GABRB1(β2)、GABRB1(β3)、GABRG1(γ1)、GABRG2(γ2)、GABRG3(γ3)、GABRD(δ)、GABRE(ε)、GABRP(π)、GABRQ(θ)、GABRR1(ρ1)、GABRR2(ρ2)以及GABRR3(ρ3)。
实施方案18.如实施方案10所述的载体或方法，其中所述核酸编码GluCl的亚基。
实施方案19.如实施方案18所述的载体或方法，其中所述编码的GluCl亚基选自由以下各项组成的组：α1、α2A、α2B、GBR2A(α3A)、GBR2B(α3B)以及β。
实施方案20.如实施方案1至19中任一项所述的载体或方法，其中与相应的野生型亚基相比，所述编码的亚基包含至少一种突变。
实施方案21.如实施方案20所述的载体或方法，其中包含所述突变型亚基的多聚体离子通道是组成型活性的。
实施方案22.如实施方案20所述的载体或方法，其中与相应的野生型多聚体离子通道相比，包含所述突变型亚基的多聚体离子通道具有增强的激动剂敏感性。
实施方案23.如实施方案20至22中任一项所述的载体或方法，其中与相应的野生型亚基相比，所述编码的亚基包含M2跨膜结构域并且所述至少一种突变位于所述M2跨膜结构域中。
实施方案24.如实施方案23所述的载体或方法，其中与相应的野生型亚基相比，所述至少一种突变位于亮氨酸9'残基处。
实施方案25.如实施方案24所述的载体或方法，其中与野生型亚基相比，所述至少一种突变是L9’A或L9’G。
实施方案26.如实施方案20至22中任一项所述的载体或方法，其中与相应的野生型亚基相比，所述编码的亚基是GABAAα-亚基，其中所述至少一种突变位于L263处；GABAAβ-亚基，其中所述至少一种突变位于L259处；GABAAγ-亚基，其中所述至少一种突变位于L274处；或GABACρ-亚基，其中所述至少一种突变位于T314、L317或L301处。
实施方案27.如实施方案20至26中任一项所述的载体或方法，其中所述编码的亚基与相应的野生型亚基具有介于约80％序列同一性至约99％序列同一性之间。
实施方案28.如实施方案27所述的载体或方法，其中所述编码的亚基与相应的野生型亚基具有至少90％序列同一性。
实施方案29.如实施方案28所述的载体或方法，其中所述编码的亚基与相应的野生型亚基具有至少95％序列同一性。
实施方案30.如实施方案29所述的载体或方法，其中所述编码的亚基与相应的野生型亚基具有约99％序列同一性。
实施方案31.如实施方案1至30中任一项所述的载体或方法，其中所述启动子是可调控的启动子。
实施方案32.如实施方案1至30中任一项所述的载体或方法，其中所述启动子是组成型启动子。
实施方案33.如实施方案1至30中任一项所述的载体或方法，其中所述启动子是组织特异性启动子。
实施方案34.如实施方案1至30中任一项所述的载体或方法，其中所述启动子选自由以下各项组成的组：人突触素-1启动子(Syn1或hSyn)、人巨细胞病毒(“CMV”)启动子、鸡β-肌动蛋白(“CBA”)启动子、肌肉特异性结蛋白启动子、基质Gla蛋白(MGP)启动子或其片段以及壳多糖酶3样1(Ch3L1)基因的5'启动子区域。
实施方案35.如实施方案1至34中任一项所述的载体或方法，其中所述载体是病毒载体。
实施方案36.如实施方案35所述的载体或方法，其中所述病毒载体是腺病毒、慢病毒、腺相关病毒(AAV)、自互补AAV(scAAV)、脊髓灰质炎病毒、HSV或基于鼠Maloney的病毒载体。
实施方案37.如实施方案36所述的载体或方法，其中所述病毒载体是AAV载体。
实施方案38.如实施方案37所述的载体或方法，其中所述AAV载体选自由以下各项组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9以及rAAV2/6。
实施方案39.如实施方案38所述的载体或方法，其中所述载体是AAV6载体。
实施方案40.如实施方案36所述的载体或方法，其中所述载体是scAAV载体。
实施方案41.如实施方案40所述的载体或方法，其中所述scAAV载体是scAAV2载体。
实施方案42.如实施方案3至41中任一项所述的载体或方法，其中所述可兴奋细胞相关的疾病或病状是疼痛、炎症、高眼压症或痉挛性张力亢进。
实施方案43.如实施方案42所述的载体或方法，其中所述可兴奋细胞相关的疾病是疼痛。
实施方案44.如实施方案43所述的载体或方法，其中所述疼痛是慢性疼痛。
实施方案45.如实施方案43或44所述的载体或方法，其中所述疼痛是关节疼痛或神经性疼痛。
实施方案46.如实施方案42所述的载体或方法，其中所述可兴奋细胞相关的疾病或病状是炎症。
实施方案47.如实施方案46所述的载体或方法，其中所述炎症是关节炎症。
实施方案48.如实施方案42至47中任一项所述的载体或方法，其中所述载体是AAV6载体，所述启动子是人突触素(hSyn)启动子，并且所述核酸编码GlyR亚基。
实施方案49.如实施方案48所述的载体或方法，其中所述GlyR亚基包含至少一种突变，所述至少一种突变在所述亚基多聚化时产生组成型活性GlyR。
实施方案50.如实施方案42所述的载体或方法，其中所述可兴奋细胞相关的疾病或病状是高眼压症。
实施方案51.如实施方案50所述的载体或方法，其中所述可兴奋细胞相关的疾病或病状是青光眼。
实施方案52.如实施方案50或51所述的载体或方法，其中所述载体是scAAV2载体，所述启动子是基质Gla蛋白(MGP)启动子，并且所述核酸编码GlyR亚基。
实施方案53.如实施方案52所述的载体或方法，其中所述GlyR亚基包含至少一种突变，所述至少一种突变在所述亚基多聚化时产生组成型活性GlyR。
实施方案54.如实施方案42所述的载体或方法，其中所述可兴奋细胞相关的疾病或病状是痉挛性张力亢进。
实施方案55.如实施方案54所述的载体或方法，其中所述载体是AAV2或AAV6载体，所述启动子是人突触素(hSyn)启动子，并且所述核酸编码GlyR亚基。
实施方案56.如实施方案55所述的载体或方法，其中所述GlyR亚基包含至少一种突变，所述至少一种突变在所述亚基多聚化时产生组成型活性GlyR。
实施方案57.如实施方案54所述的载体或方法，其中所述载体是AAV8或AAV9载体，所述启动子是人巨细胞病毒(“CMV”)启动子、鸡β-肌动蛋白(“CBA”)启动子或CAG或肌肉特异性结蛋白启动子，并且所述核酸编码GlyR亚基。
实施方案58.如实施方案57所述的载体或方法，其中所述GlyR亚基包含至少一种突变，所述至少一种突变在所述亚基多聚化时产生组成型活性GlyR。
实施方案59.如实施方案57或58所述的载体或方法，其中所述载体是AAV8载体，并且所述启动子是肌肉特异性结蛋白启动子。
实施方案60.如实施方案4至59中任一项所述的方法，其还包括向所述哺乳动物施用一种或多种其它治疗剂。
实施方案61.如实施方案60所述的方法，其中所述一种或多种其它治疗剂是适用于治疗疼痛、炎症、高眼压症和/或痉挛性张力亢进的药剂。
实施方案62.如实施方案60所述的方法，其中所述一种或多种其它治疗剂不是所述多聚体离子通道的激动剂或变构调节剂。
实施方案63.如实施方案62所述的方法，其中所述一种或多种其它治疗剂不是甘氨酸。
实施方案64.一种用于预防性或治疗性治疗可兴奋细胞相关的疾病或病状的药物组合物，所述药物组合物包含载体，所述载体包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子；以及药学上可接受的载体。
实施方案65.一种以下各项的组合：a)载体，所述载体包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子；以及b)一种或多种其它治疗剂；所述组合用于预防性或治疗性治疗可兴奋细胞相关的疾病或病症。
实施方案66.如实施方案65所述的组合，其中所述一种或多种其它治疗剂是适用于治疗疼痛、炎症、高眼压症和/或痉挛性张力亢进的药剂。
实施方案67.如实施方案65所述的组合，其中所述一种或多种另外的治疗剂不是所述多聚体离子通道的激动剂或变构调节剂。
实施方案68.如实施方案67所述的组合，其中所述一种或多种另外的治疗剂不是甘氨酸。
实施方案69.一种试剂盒，所述试剂盒包括载体，所述载体包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子；包装材料；以及用于将所述载体施用至有需要的哺乳动物以治疗可兴奋细胞相关的疾病或病状的说明书。
实施方案70.如实施方案69所述的试剂盒，其还包括一种或多种其它治疗剂。
实施方案71.一种包含表达盒的载体用于制备用于治疗有需要的哺乳动物的可兴奋细胞相关的疾病或病状的药物的用途，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子。
实施方案72.一种用于药物疗法中的载体，所述载体包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体氯离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子。
实施方案73.一种治疗有需要的哺乳动物的疼痛、炎症、高眼压症或痉挛性张力亢进的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的包含表达盒的载体，其中所述表达盒包含与编码GlyR的亚基(例如，GlyRa1，例如hGlyRa1))的核酸可操作地连接的启动子。
实施方案74.一种治疗有需要的哺乳动物的疼痛、炎症、高眼压症或痉挛性张力亢进的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的包含表达盒的载体，其中所述表达盒包含与编码GluCl的亚基(例如，GluCl的α亚基)的核酸可操作地连接的启动子。
实施方案75.如实施方案73或74所述的方法，其中不向所述哺乳动物施用激动剂或变构调节剂。
实施方案76.如实施方案73至75中任一项所述的方法，其中所述编码的亚基包含至少一种突变。
实施方案77.一种核酸，所述核酸包含编码甘氨酸受体(GlyR)的α-亚基的序列，其中所述α-亚基包含至少一种突变，所述至少一种突变在所述亚基多聚化时产生组成型活性GlyR。
实施方案78.如实施方案77所述的核酸，其中GlyR的所述编码的α-亚基选自由以下各项组成的组：α-1亚基、α-2亚基和α-3亚基以及α-4亚基。
实施方案79.如实施方案77所述的核酸，其中GlyR的所述编码的α-亚基是GlyR的人α-亚基。
实施方案80.如实施方案79所述的核酸，其中GlyR的所述编码的α-亚基是GlyR的α-1亚基(GlyRa1)。
实施方案81.如实施方案79所述的核酸，其中GlyR的所述编码的α-亚基是人GlyRa1(hGlyRa1)。
实施方案82.如实施方案77至81中任一项所述的核酸，其中GlyR的所述编码的α-亚基包含M2跨膜结构域并且所述至少一种突变位于所述M2跨膜结构域中(如与GlyR的相应野生型α-亚基相比)。
实施方案83.如实施方案82所述的核酸，其中所述至少一种突变位于亮氨酸9'残基处(如与GlyR的相应野生型α-亚基相比)。
实施方案84.如实施方案82所述的核酸，其中，所述至少一种突变在表2中描述。
实施方案85.如实施方案82所述的核酸，其中所述至少一种突变是L9’A或L9’G(如与GlyR的相应野生型α-亚基相比)。
实施方案86.如实施方案82所述的核酸，其中所述至少一种突变是L9’A。
实施方案87.如实施方案82所述的核酸，其中所述核酸包含与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的序列。
实施方案88.如实施方案87所述的核酸，其中所述核酸包含与SEQ ID NO:2具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
实施方案89.如实施方案87所述的核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO:2。
实施方案90.如实施方案87所述的核酸，其中所述核酸由SEQ ID NO:2组成。
实施方案91.一种多肽，其由本文所述的核酸编码。
实施方案92.一种表达盒，其包含与本文所述的核酸可操作地连接的启动子。
实施方案93.如实施方案92所述的表达盒，其中所述启动子是可调控的启动子。
实施方案94.如实施方案92所述的表达盒，其中所述启动子是组成型启动子。
实施方案95.如实施方案92所述的表达盒，其中所述启动子是组织特异性启动子。
实施方案96.如实施方案92所述的表达盒，其中所述启动子选自由以下各项组成的组：人突触素-1启动子(Syn1或hSyn)、人巨细胞病毒(“CMV”)启动子、鸡β-肌动蛋白(“CBA”)启动子、肌肉特异性结蛋白启动子、基质Gla蛋白(MGP)启动子或其片段以及壳多糖酶3样1(Ch3L1)基因的5'启动子区域。
实施方案97.如实施方案92所述的表达盒，其中所述启动子是人突触素-1启动子(hSyn)。
实施方案98.一种载体，其包含本文所述的表达盒(例如，如实施方案92至97中任一项所述)。
实施方案99.如实施方案98所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
实施方案100.如实施方案99所述的载体，其中所述病毒载体是腺病毒、慢病毒、腺相关病毒(AAV)、自互补AAV(scAAV)、脊髓灰质炎病毒、HSV或基于鼠Maloney的病毒载体。
实施方案101.如实施方案100所述的载体，其中病毒载体是AAV载体。
实施方案102.如实施方案101所述的载体，其中所述AAV载体选自由以下各项组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9以及rAAV2/6。
实施方案103.如实施方案102所述的载体，其中所述载体是AAV6载体。
实施方案104.一种药物组合物，其包含本文所述的载体(例如，如实施方案98至103中任一项所述)和药学上可接受的载体。
实施方案105.一种病毒原液，其包含如本文所述的载体。
本发明的载体(例如，如实施方案98至103中任一项所描述)可用于本文所述的本发明的方法中。
以下示出人GlyRa1亚基的DNA和蛋白质序列。对于每种均显示野生型序列和L9'A突变体序列两者。此外，还包括M2结构域的序列。
核酸序列
人GlyRa1野生型
*L9'残基的密码子以粗体显示。
人GlyRa1 L9’A突变蛋白
*L9'A残基的密码子以粗体显示。
蛋白质翻译
人GlyRa1野生型
*M2区域加下划线且L'9残基以粗体显示。
野生型人GlyRa1的M2区域
*L'9残基以粗体和下划线显示。
人GlyRa1 L9’A突变蛋白
*M2区域加下划线且L'9A残基以粗体显示。
L9’A突变型人GlyRa1的M2区域
*L'9A残基以粗体和下划线显示。
某些定义
术语“核酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，其由含有糖、磷酸盐以及为嘌呤或嘧啶的碱基的单体(核苷酸)组成。除非具体限定，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参照核酸类似的结合性质并且以与天然发生核苷酸类似的方式代谢。除非另外指示，否则一个特定核酸序列也隐含地涵盖其经过保守性修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指示的序列。具体地，简并密码子取代可通过产生序列来实现，其中一个或多个选择的(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人(1991)Nucl.AcidsRes.,19:508；Ohtsuka等人(1985)JBC,260:2605；Rossolini等人(1994)Mol.Cell.Probes,8:91。“核酸片段”是给定核酸分子的一部分。大多数生物体中的脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)参与将DNA中所含的信息转移到蛋白质中。术语“核苷酸序列”是指可以是单链或双链的DNA或RNA的聚合物，其任选含有能够并入DNA或RNA聚合物中的合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸片段”、“核酸序列或区段”或“多核苷酸”也可与基因、cDNA、DNA和由基因编码的RNA互换使用。
当涉及本发明的核酸分子、序列或片段时，“部分”或“片段”当与其它序列连接以用于表达时是指具有至少80个核苷酸、更优选至少150个核苷酸、且仍然更优选至少400个核苷酸的序列。如果不用于表达，则“部分”或“片段”是指对应于本发明的核酸分子的核苷酸序列的至少9个、优选12个、更优选15个、甚至更优选至少20个连续核苷酸，例如探针和引物(寡核苷酸)。
术语“蛋白”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用。
本发明涵盖分离的或基本上纯化的核酸或蛋白质组合物。在本发明的上下文中，“分离的”或“纯化的”DNA分子或“分离的”或“纯化的”多肽是除其天然环境外存在且因此不是天然产物的DNA分子或多肽。分离的DNA分子或多肽可以纯化形式存在或可存在于非天然环境中，例如像转基因宿主细胞。例如，“分离的”或“纯化的”核酸分子或蛋白质或其生物活性部分当通过重组技术产生时基本上不含其它细胞物质或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。在一个实施方案中，“分离的”核酸不含在所述核酸所源自的生物体的基因组DNA中天然地位于所述核酸侧翼的序列(即，位于所述核酸的5'和3'末端的序列)。例如，在不同的实施方案中，分离的核酸分子可包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然地位于所述核酸所源自的细胞的基因组DNA中的核酸分子的侧翼。基本上不含细胞物质的蛋白质包括具有少于约30％、20％、10％、5％(按干重计)的污染蛋白质的蛋白质或多肽的制剂。当本发明的蛋白质或其生物活性部分重组产生时，优选培养基占化学前体或非目标蛋白质化学品的少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)。所公开的核苷酸序列和蛋白质的片段和变体或由其编码的部分长度蛋白质也包括在本发明中。“片段”或“部分”是指全长或少于全长的编码多肽或蛋白质的核苷酸序列或多肽或蛋白质的氨基酸序列。
“天然存在的”或“野生型”用于描述可在自然界中发现的与人工产生不同的物体。例如，可从自然中的来源分离并且不通过人在实验室中有意修饰的存在于生物(包括病毒)中的蛋白质或核苷酸序列是天然存在的。
分子的“变体”是与天然分子的序列基本相似的序列。对于核苷酸序列，变体包括由于遗传密码的简并性而编码天然蛋白质的相同氨基酸序列的那些序列。诸如这些的天然存在的等位基因变体可使用熟知的分子生物学技术来鉴定，例如用聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体核苷酸序列还包括合成衍生的核苷酸序列，如例如通过使用编码天然蛋白质的定点诱变产生的那些核苷酸序列以及编码具有氨基酸取代的多肽的那些核苷酸序列。一般来说，本发明的核苷酸序列变体将与天然(内源性)核苷酸序列具有至少40％、50％、60％至70％，例如优选71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％至79％，通常至少80％，例如81％-84％，至少85％，例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％至98％序列同一性。
特定核酸序列的“保守修饰的变化”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸序列，或当核酸序列并不编码氨基酸序列时是指基本上相同的序列。由于遗传编码的简并性，大量功能性相同的核酸编码任一给定多肽。例如，密码子CGT、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG都编码氨基酸丙氨酸。因此，在精氨酸被密码子特异化的每个位置上，还可将所述密码子变为所描述的任一对应的密码子，而不改变编码的蛋白质。此类氨基酸变化是“沉默变化”，它们是“保守修饰变化”的一个种类。除非另外指出，否则本文描述的编码多肽的每种核酸序列还描述了每种可能的沉默变化。技术人员应当认识到，核酸中的每个密码子(除了ATG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子)可被修饰以通过标准技术产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个“沉默变化”在每个描述的序列中是固有的。
“重组DNA分子”是DNA序列的组合，所述DNA序列使用重组DNA技术和用于将DNA序列连接在一起的程序连接在一起，所述程序如例如Sambrook和Russell,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring HarborLaboratory Press(第3版，2001)中所描述。
术语“异源DNA序列”、“外源DNA区段”或“异源核酸”各自是指源自特定宿主细胞外源的序列，或者如果来自相同来源，则从其原始形式修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包括对特定宿主细胞而言是内源性的但已被修饰的基因。所述术语还包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多个拷贝。因此，所述术语是指对细胞来说外源或异源，或与细胞同源但位于宿主细胞核酸中通常不存在元件的位置中的DNA区段。表达外源DNA区段以产生外源多肽。
“同源”DNA序列是与它被引入其中的宿主细胞天然相关联的DNA序列。
“野生型”是指在自然界中发现的无任何已知突变的正常基因或生物体。
“基因组”是指生物体的完整遗传物质。
“载体”被定义为特别包括呈双链或单链线性或环状形式的任何病毒载体、质粒、粘粒、噬菌体或二元载体，其可以是或可以不是可自我传播或可动员的，并且可通过整合到细胞基因组中转化原核或真核宿主或存在于染色体外(例如具有复制起点的自主复制质粒)。
“克隆载体”通常含有一个或少量的限制性内切核酸酶识别位点，在所述位点处可以可测定的方式插入外源DNA序列而不损失载体的基本生物功能，以及适合用于鉴定和选择用克隆载体转化的细胞的标记基因。标记基因通常包括提供四环素抗性、潮霉素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。
如本文所用的“表达盒”是指能够指导特定核苷酸序列在合适宿主细胞中表达的DNA序列，所述DNA序列包含与可操作地连接至终止信号的目标核苷酸序列可操作地连接的启动子。它通常还包含正确翻译核苷酸序列所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但是也可编码目标功能性RNA，例如反义RNA或种非翻译RNA，以有义或反义方向。包含目标核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，这意味着它的至少一种组分相对于它的至少一种其它组分是异源的。表达盒还可以是一种天然存在但一直以适用于异源表达的重组形式获得的表达盒。表达盒中的核苷酸序列的表达可在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，所述启动子仅在宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时起始转录。在多细胞生物体的情况下，启动子还可以是对特定组织或器官或发育阶段特异性的。
此类表达盒将包含与目标核苷酸序列连接的本发明的转录起始区。这种表达盒配备有多个限制位点，所述限制位点用于插入目标基因以便处于调控区的转录调控之下。表达盒可另外含有选择标记基因。
术语“RNA转录物”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列的转录产生的产物。当RNA转录物是DNA序列的完美互补拷贝时，其被称为初级转录物，或者其可以是源自初级转录物的转录后加工的RNA序列并被称为成熟RNA。“信使RNA”(mRNA)是指没有内含子并且可被细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”是指与mRNA互补并源自mRNA的单链或双链DNA。
“调控序列”和“适合的调控序列”各自是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调控序列包括增强子、启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化信号序列。它们包括天然序列和合成序列以及可以是合成序列和天然序列的组合的序列。如上所述，术语“合适的调控序列”不限于启动子。然而，适用于本发明的一些合适的调控序列将包括但不限于组成型启动子、组织特异性启动子、发育特异性启动子、诱导型启动子以及病毒启动子。
“5'非编码序列”是指位于编码序列5'(上游)的核苷酸序列。它存在于起始密码子上游的完全加工的mRNA中，并且可影响初级转录物加工成mRNA、mRNA稳定性或翻译效率(Turner等人(1995)Mol.Biotech.3:225)。
“3'非编码序列”是指位于编码序列3'(下游)的核苷酸序列，并且包括聚腺苷酸化信号序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其它序列。聚腺苷酸化信号的特征通常在于影响向mRNA前体的3'端添加聚腺苷酸束。
术语“翻译前导序列”是指基因的处于启动子与编码序列之间的DNA序列部分，它被转录至RNA中并且存在于翻译起始密码子上游(5')的完全加工的mRNA中。翻译前导序列可影响初级转录物至mRNA的加工、mRNA稳定性或翻译效率。
术语“成熟”蛋白质是指没有其信号肽的翻译后加工的多肽。“前体”蛋白质是指mRNA翻译的初级产物。“信号肽”是指多肽的氨基末端延伸，其与形成前体肽的多肽一起翻译并且是其进入分泌途径所需的。术语“信号序列”是指编码信号肽的核苷酸序列。
“启动子”是指通常在其编码序列上游(5')的核苷酸序列，所述核苷酸序列通过提供对RNA聚合酶和正确转录所需的其它因子的识别来控制编码序列的表达。“启动子”包括向其添加调控元件以控制表达的最小启动子，其是由TATA盒和其它用于指定转录起始位点的序列构成的短DNA序列。“启动子”还指包括最小启动子加上能够控制编码序列或功能性RNA的表达的调控元件的核苷酸序列。这种类型的启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，后者通常被称为增强子。因此，“增强子”是能够刺激启动子活性并且可以是启动子的固有元件或被插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件的DNA序列。启动子可全部源自天然基因，或者由来源于自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或者甚至由合成DNA区段组成。启动子还可含有参与蛋白质因子的结合的DNA序列，所述蛋白质因子响应于生理或发育条件控制转录起始的有效性。
“起始位点”是围绕作为转录序列的一部分的第一个核苷酸的位置，其也被定义为位置+1。关于此位点，所述基因及其控制区域的所有其它序列都被编号。下游序列(即3'方向上的另外的蛋白质编码序列)被命名为正，而上游序列(大部分在5'方向上的控制区域)被命名为负。
在不存在上游活化的情况下无活性或启动子活性大大降低的启动子元件(特别是TATA元件)被称为“最小或核心启动子”。在存在合适的转录因子的情况下，最小启动子起到允许转录的作用。因此，“最小或核心启动子”仅由转录起始所需的所有基本元件组成，例如TATA盒和/或起始子。
“组成型表达”是指使用组成型或调控型启动子的表达。“有条件的”和“调控的表达”是指受调控启动子控制的表达。
“可操作地连接的”是指单核酸片段上核酸序列的缔合，以使得一个核酸序列的功能受另一个的影响。例如，如果两条序列被定位为使得调控DNA序列影响编码DNA序列的表达(即，所述编码序列或功能性RNA处于启动子的转录控制之下)，则调控DNA序列被称为与编码RNA或多肽的DNA序列“可操作地连接”或“缔合”。编码序列可以有义或反义取向可操作地连接至调控序列。
“表达”是指内源基因、转基因在细胞中的转录和/或翻译，以及有义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定累积。在反义构建体的情况下，表达可仅指反义DNA的转录。表达也可指蛋白质的产生。
“转录终止片段”是指含有一个或多个能够终止转录的调控信号(如聚腺苷酸化信号序列)的核苷酸序列。转录终止片段的实例是本领域已知的。
“翻译终止片段”是指含有一个或多个能够终止翻译调控信号(如所有三个框架中的一个或多个终止密码子)的核苷酸序列。翻译终止片段在编码序列5'末端的起始密码子邻近或附近的插入将导致不翻译或不正确的翻译。通过位点特异性重组切割翻译终止片段将在编码序列中留下不干扰使用起始密码子正确翻译的位点特异性序列。
术语“顺式作用序列”和“顺式作用元件”是指其功能要求它们在同一分子上的DNA或RNA序列。
术语“反式作用序列”和“反式作用元件”是指其功能不需要它们在同一分子上的DNA或RNA序列。
使用以下术语来描述两个或更多个序列(例如，核酸、多核苷酸或多肽)之间的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比较窗”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”，以及(e)“基本同一性”。
(a)如本文所用，“参考序列”是用作序列比较的基础的定义序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，作为全长cDNA、基因序列或肽序列的区段，或完整cDNA、基因序列或肽序列。
(b)如本文所用，“比较窗”提及序列的连续且指定的区段，其中所述比较窗中的序列与参考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即，空位)以用于两个序列的最佳比对。一般来说，比较窗的长度是至少20个连续核苷酸，并且任选地可以是30个、40个、50个、100个核苷酸或更长。本领域技术人员应了解，为了避免由于在序列中包含空位而导致与参考序列的高相似性，通常引入空位罚分并将其从匹配数目中扣除。
比对用于比较的序列的方法是本领域中熟知的。因此，任何两个序列之间的同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。此类数学算法的非限制性实例是Myers和Miller(1988)CABIOS,4:11的算法；Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法；Needleman和Wunsch,(1970)JMB,48:443的同源性比对算法；Pearson和Lipman,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444的相似性搜索方法；Karlin和Altschul,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2264的算法，如在Karlin和Altschul,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873中进行了修改。
这些数学算法的计算机实现可用于比较序列以确定序列同一性。此类实现包括但不限于：PC/基因程序中的CLUSTAL(可从Intelligenetics,Mountain View,California获得)；威斯康辛遗传学软件包版本8(可从Genetics Computer Group(GCG),575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA获得)中的ALIGN程序(2.0版)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA以及TFASTA。使用这些程序的比对可使用默认参数执行。CLUSTAL程序由Higgins等人(1988)Gene73:237；Higgins等人(1989)CABIOS 5:151；Corpet等人(1988)Nucl.AcidsRes.16:10881；Huang等人(1992)CABIOS 8:155；以及Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.24:307详细描述。ALIGN程序是基于上述Myers和Miller的算法。Altschul等人(1990)JMB,215:403；Nucl.Acids Res.,25:3389(1990)的BLAST程序是基于上述Karlin和Altschul算法。
用于执行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心可公开获得的(可在万维网ncbi.nlm.nih.gov/获得)。这种算法涉及首先通过鉴别查询序列中长度为W的短词来鉴别高评分序列对(HSPs)，所述短词在与数据库序列中具有相同长度的词比对时匹配或满足某些正值的阈值分数T。-T被称为邻近字串分数阈值。这些初始邻近字串命中充当种子来启动搜索，以寻找含有它们的较长HSP。所述字命中随后在两个方向沿每个序列尽可能远地延伸，只要可提高累积比对分数。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分数。当累积比对分数从它的最大达到值降低了数量X；由于累积一个或多个负得分的残基比对而使累积分数趋于0或0以下；或者到达任一序列的末端时，停止所述字串命中在每个方向上的延伸。
除计算百分比序列同一性外，BLAST算法还执行两个序列之间的相似性的统计分析。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小总和概率(P(N))，其提供两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的将偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸序列与参考核酸序列的比较中，最小和概率小于约0.1、更优选地小于约0.01并且最优选地小于约0.001，则认为测试核酸序列与参考序列相似。
为了获得用于比较目的的空位比对，可利用如在Altschul等人(1997)NucleicAcids Res.25:3389中描述的空位BLAST(在BLAST 2.0中)。或者，PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)可用于执行迭代搜索，所述搜索检测分子之间的远缘关系。参见Ausubel等人，同上文。当利用BLAST、空位BLAST、PSI-BLAST时，可使用相应程序(例如对于核苷酸序列BLASTN，对于蛋白质BLASTX)的默认参数。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、截止值为100、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10以及BLOSUM62评分矩阵作为默认值。参见万维网ncbi.nlm.nih.gov。还可通过目视检查手动进行比对。
出于本发明的目的，可使用具有其默认参数的BlastN程序(版本1.4.7或更高版本)或任何等效程序来进行用于确定与另一序列的序列同一性百分比的序列的比较。“等效程序”意图是以下任何序列比较程序，所述程序针对所研究的任何两个序列、当与由优选程序所产生的相应比对相比时产生比对，所述比对具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配以及相同的序列同一性百分比。
(c)如本文所用，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”参照当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基的指定百分比，如通过序列比较算法或通过目视检查所测量。当参考蛋白质使用序列同一性百分比时，应认识到不相同的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代，且因此不改变分子的功能特性。当序列在保守取代方面不同时，可向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性质。因此类保守取代而不同的序列被说成具有“序列相似性”或“相似性”用于进行这种调整的手段是本领域的技术人员熟知的。通常这涉及将保守取代评分为部分而不是完全错配，从而提高序列同一性百分比。因此，例如，在相同氨基酸被给予分数1并且非保守性取代被给予分数零的情况下，保守性取代被给与零与1之间的分数。例如，如在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,California)中所实施来计算保守性取代的评分。
(d)如本文所用，“序列同一性百分比”是指通过在比较窗上比较两个最优对准的序列所确定的值，其中比较窗中的序列的部分可相较于参考序列(其不包含添加或缺失)包含添加或缺失(即空位)以用于两个序列的最优比对。通过如下方法计算该百分比：确定两个序列中的相同核酸碱基或氨基酸残基所在的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗中的总位置数并且将结果乘以100而产生序列一致性百分比。
(e)(i)术语序列的“基本同一性”是指使用所描述的比对程序中的一种，使用标准参数，多核苷酸包含与参考序列相比具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，至少90％、91％、92％、93％或94％，以及至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。本领域的普通技术人员将会认识到，可对这些值进行适当地调整以便通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等来确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。出于这些目的，氨基酸序列的基本同一性通常是指至少70％、至少80％、90％、至少95％的序列同一性。
核苷酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下是否彼此杂交(参见下文)。通常，对于在限定离子强度和pH下的特定序列，严格条件被选择为低于热熔点(Tm)约5℃。然而，取决于如本文中另外限定的所需严格度，严格条件包括在约1℃至约20℃范围内的温度。如果它们编码的多肽基本上相同，则在严格条件下不彼此杂交的核酸仍然是基本上相同的。例如，当使用遗传密码允许的最大密码子简并性而生成核酸的拷贝时，可发生这种情况。两个核酸序列基本上相同的一个指示是当由第一核酸编码的多肽与由第二核酸编码的多肽发生免疫交叉反应时。
(e)(ii)在肽背景下的术语“基本同一性”表示在指定比较窗内，肽包含与参考序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、至少90％、91％、92％、93％或94％、或95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。最佳比对使用Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法进行。两个肽序列基本上相同的指示是一种肽与针对第二肽产生的抗体发生免疫反应。因此，肽与第二肽基本上相同，例如，在两种肽仅因保守取代而不同的情况下。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，把测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如上所述，两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。短语“特异性杂交至”是指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(例如全细胞)DNA或RNA中时，在严格条件下分子仅与所述特定核苷酸序列的结合、双链体化或杂交。“基本上结合”是指探针核酸与靶核酸之间的互补性杂交，并且涵盖可通过降低杂交介质的严格性以实现所需的靶核酸序列检测而适应的较小错配。
在核酸杂交实验(如Southern和Northern杂交)的背景下“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列在较高温度下特异性杂交。热熔点(Tm)是50％的靶序列与完全匹配的探针进行杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。特异性通常取决于杂交后的洗涤，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度以及温度。对于DNA-DNA杂合体，可从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267的方程粗略估计Tm；Tm 81.5℃+16.6(对数M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中的鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是杂合体的长度(单位为碱基对)。对于每1％错配，Tm降低约1℃；因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件以便杂交至具有所需同一性的序列。例如，如果寻找具有>90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。一般来说，将严格条件选择为比特定序列及其补体在限定的离子强度和pH下的Tm低约5℃。然而，极端严格条件可利用在低于Tm 1℃、2℃、3℃或4℃下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可利用在低于Tm 6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下的杂交和/或洗涤；低严格条件可利用在低于Tm 11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下的杂交和/或洗涤。使用所述方程、杂交和洗涤组成以及所需的温度，本领域的普通技术人员应了解，杂交和/或洗涤溶液严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致温度小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高温度。对核酸杂交的广泛指导见于Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology Hybridization with Nucleic Acid Probes,第2章第I部分"Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays"Elsevier,New York(1993)中。一般来说，高严格杂交和洗涤条件被选择为比特定序列在限定离子强度和pH下的Tm低约5℃。
高严格洗涤条件的一个实例是在72℃下0.15M NaCl持续约15分钟。严格洗涤条件的一个实例是在65℃下0.2X SSC洗涤15分钟(参见Sambrook,以下针对SSC缓冲液的说明)。经常，高严格性洗涤之前会先进行低严格性洗涤，以除去背景探针信号。对于例如多于100个核苷酸的双链体的示例性中等严格性洗涤是在45℃下以1X SSC进行15分钟。对于例如多于100个核苷酸的双链体的示例性低严格性洗涤是在40℃下以4-6X SSC持续15分钟。对于短探针(例如，约10至50个核苷酸)，严格条件通常涉及小于约1.5M，更优选在pH 7.0至8.3下约0.01至1.0M的Na离子浓度(或其它盐类)，并且对于较长探针(例如，>50个核苷酸)温度通常是至少约30℃和至少约60℃。还可通过加入去稳定剂如甲酰胺来实现严格条件。一般来说，比在特异性杂交测定中对于不相关的探针观察到的高2X(或更高)的信噪比表明检测到特异性杂交。如果它们编码的蛋白质基本上相同，则在严格条件下不彼此杂交的核酸仍然是基本上相同的。例如，当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性而生成核酸的拷贝时，发生这种情况。
极严格条件被选择为等于特定探针的Tm。用于互补核苷酸序列(其在DNA或RNA印迹中在过滤器上具有超过100个互补残基)的杂交的严格条件的一个实例是50％甲酰胺，例如在37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交以及在60℃至65℃下在0.1X SSC中洗涤。示例性低严格条件包括在37℃下用30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液进行杂交、以及在50℃至55℃下在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中等严格条件包括在37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中进行杂交、以及在55℃至60℃下在0.5X至1X SSC中洗涤。
“变体”多肽意图是通过对天然蛋白质的N末端和/或C末端缺失(所谓的截短)或添加一个或多个氨基酸；在天然蛋白质中的一个或多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸；或在天然蛋白质中的一个或多个位点取代一个或多个氨基酸而来源于天然蛋白质的多肽。此类变体可由于例如遗传多态性或由人操纵而产生。用于此类操纵的方法是本领域中通常已知的。
因此，本发明的多肽可以各种方式改变，所述方式包括氨基酸取代、缺失、截短以及插入。用于此类操纵的方法是本领域中通常已知的。例如，可通过在DNA中的突变制备多肽的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域中熟知的。参见例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488；Kunkel等人(1987)Meth.Enzymol.154:367；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra(1983)Techniques in Mol.Biol.(MacMillan Publishing Co.，以及其中引用的参考文献。不影响目标蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可见于Dayhoff等人,Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.1978)的模型中。保守性取代(如用具有类似性质的另一个氨基酸交换一个氨基酸)是优选的。
因此，本发明的基因和核苷酸序列包括天然存在的序列以及突变体形式。同样，本发明的多肽涵盖天然存在的蛋白质以及其变化和修饰形式。此类变体将继续拥有所需的活性。在某些实施方案中，本文涵盖的多肽序列的缺失、插入和取代可能不会产生多肽特征的根本变化。然而，当在这样做之前难以预测取代、缺失或插入的确切作用时，本领域的技术人员将会理解，所述作用将通过常规筛选测定来评估。
改变、添加或缺失所编码序列中的单一氨基酸或较小百分比的氨基酸(通常小于5％、更通常小于1％)的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变化”，其中所述改变导致用化学相似的氨基酸取代氨基酸。提供功能上相似的氨基酸的保守性取代表是本领域中熟知的。以下五组各自含有可彼此进行保守取代的氨基酸：脂肪族：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳香族：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫的：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。此外，改变、添加或缺失所编码序列中的单一氨基酸或少量氨基酸的个别取代、缺失或添加也是“保守修饰的变化”。
术语“转化”是指将核酸片段转移到宿主细胞的基因组中，从而产生遗传上稳定的遗传。含有转化的核酸片段的宿主细胞被称为“转基因”细胞，并且包含转基因细胞的生物体被称为“转基因生物体”。
“转化的”、“转基因的”、“转导的”和“重组的”是指其中引入了异源核酸分子的宿主细胞或生物体。核酸分子可稳定整合到本领域中通常已知的基因组中，并公开于Sambrook和Russell(同上)中。还参见Innis等人,PCR Protocols,Academic Press(1995)；和Gelfand,PCR Strategies,Academic Press(1995)；以及Innis和Gelfand,PCR MethodsManual,Academic Press(1999)。已知的PCR方法包括但不限于使用配对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。例如，“转化的”、“转化体”和“转基因”细胞已经经历了转化过程，并且含有整合至其染色体中的外源基因。术语“未转化的”是指尚未经历转化过程的正常细胞。
就治疗疾病状态/病状而言，术语“治疗有效量”是指单独或包含在药物组合物中的载体的当以单剂量或多个剂量施用时能够对疾病状态/病状的任何症状、方面或对特征具有任何可检测的积极作用的量。所述作用无需是绝对有益的。
术语“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施，其中目的是为了预防或减轻不希望的生理学变化或病症。出于本发明的目的，有益的或所需的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进程的延缓或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分缓解或是全部缓解)，无论是可检测或是不可检测。“治疗”还可指与未接受治疗时期望的存活相比延长存活。需要治疗的那些包括已患有病状或病症的那些以及易于患上病状或病症的那些或打算预防病状或病症的那些。
本发明的方法可应用于哺乳动物(例如哺乳动物的可兴奋细胞)以及其它脊索动物门(例如，鸟类、爬行类、两栖类、骨和软骨鱼类等)，包括人、常见实验室哺乳动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猪、猴、猿等)和兽医动物如猫、狗、猪、马、牛、绵羊等。
实施例
本发明的某些实施方案现在将通过以下非限制性实施例加以说明。
实施例1
目的
所述研究的目的是确定在HEK-293细胞中在β-亚基(单体表达)不存在下单独表达hGlyRa1是否可形成对天然激动剂甘氨酸和/或牛磺酸有反应的功能通道。
材料
在此研究中使用含有荧光标记的人甘氨酸受体亚基α1的完整编码序列和单体增强型黄色荧光蛋白(mEYFP)同种型a的质粒载体pFB-CMV-hGlyRa1-P2A-mEYFP(GenScript)。合成基因pFB-CMV-hGlyRa1-P2A-mEYFP由合成寡核苷酸和/或PCR产物组装。将所述片段插入pcDNA3.1(+)中。从转化的细菌纯化质粒DNA并通过UV光谱测定浓度。通过测序验证最终构建体。
基因名称：pFB-CMV-hGlyRa1-P2A-mEYFP
基因大小：1374bp
载体主链：pcDNA3.1(+)
克隆位点：BamHI/AscI
细胞
人胚肾(HEK)293细胞购自ATCC(#CRL-1573)。将细胞在补充有10％FBS(Gibco#26140)、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素(Gibco#15140)和1mM丙酮酸钠(Gibco#11360)的杜氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM；Gibco#11965)中，并在37℃和5％CO2下维持在湿润培养箱中。当汇合时，将细胞每3至4天以1:5或1:10的传代比率传代。
方法的描述
细胞培养
对于FlexStation测定，将HEK-293细胞以20,000个细胞/孔、以100μl/孔的接种体积接种在黑色侧面/透明底96孔成像板(BD Falcon#353219)中。为了转染，将750μl Opti-MEM(Gibco 31985-070)中的16μg总DNA与750μl Opti-MEM中的30μl ExpressFect混合，预温育20分钟，且然后以15μl/孔添加至含有100μl新鲜培养基的细胞。在接种后24小时转染细胞并在转染48小时后测定。在37℃/5％CO2下4-6小时温育期后将转染混合物从培养物中移除，并用补充有L-谷氨酰胺(Gibco 25030-081)的新鲜不含甘氨酸的培养基(Gibco12360-038)替代。
膜电位测量
使用FLIPR膜电位测定试剂盒、BLUE制剂(Molecular Devices,#R8042)的基于荧光的测定用于检测跨细胞膜的电压变化。根据包装文献制备染料负载缓冲液。具体地说，将一小瓶BLUE试剂的内容物用5ml的1x测定缓冲液溶解，然后用另一5ml的1x测定缓冲液洗涤小瓶，以得到总体积10ml的染料负载缓冲液。将染料负载缓冲液的未使用部分储存在-20℃下并在5天内使用。对于功能测定，将培养基从细胞中移除并用50μl不含甘氨酸的MEM替代。然后将细胞负载50μl蓝色染料负载缓冲液并在37℃/5％CO2下温育40分钟。使用由SoftMaxPro数据采集和分析软件(Molecular Devices)操作的FlexStation 3多模式台式微板读数器检测信号。激发和发射波长分别设定在530nm和565nm，发射截止值为550nm。板读取在30℃下在‘低PMT'设置下进行。前20秒测量的基础荧光的运行时间对于甘氨酸诱导的信号是300秒。其它FlexStation参数包括130μl的移液器高度、100μl的初始孔体积、50μl的转移体积(因此，3x制备药物浓度)以及2(对应于约31μl/sec)的转移速率设置。
在hGlyRa1转染的细胞中产生甘氨酸和牛磺酸的浓度/反应曲线。所使用的甘氨酸和牛磺酸浓度为1、3、10、30、100、300、1000μM。在100μM牛磺酸存在下也产生甘氨酸的剂量反应曲线。将甘氨酸和牛磺酸以10mM原液溶解于DMSO中，并在-20℃下以0.3mM等分部分储存。使用含有0.1％DMSO的具有20mM HEPES(pH 7.4)的1x HBSS制备用于FlexStation测定的甘氨酸和牛磺酸浓缩物。
实验处理
将细胞用以下质粒转染：人甘氨酸受体亚基α1同种型a(hGlyRa1)(pFB-CMV-hGlyRa1-P2A-mEYFP)。以下激动剂用于刺激GlyRα亚基：甘氨酸(Sigma#G2879)或牛磺酸(Sigma#T0625)。
对数据执行的计算或操作的描述
原始FlexStation信号从SoftMax Pro 5导出为‘.txt’文件，并使用MicrosoftExcel 2008和Origin 7.0离线分析。
统计学
合并的数据显示为平均值±SEM。
结果
在表达GlyRα-亚基(hGlyRa1)的细胞中，不存在膜电位的受刺激的变化(图5A-5B，图7)，它们也不对膜电位随牛磺酸浓度的增加的任何变化(1μM至1mM)做出反应(图6，图7)。在这些细胞中，添加增加浓度的甘氨酸(1μM至1mM)导致膜电位的剂量依赖性变化(图5A-5B)，其中EC50为92μM并且EC100为大约300μM(图6)。由于存在牛磺酸(100μM)，对甘氨酸的反应未受显著影响(EC50＝43μM)。这些数据与先前由Sontheimer H.等人((1989)Neuron 2(5):1491-1497)(EC50＝100μM)以及Jensen AA.和Kristiansen U.((2004)BiochemicalPharmacology 67(9):1789-1799)(EC50＝82μM)使用类似测定报道的数据非常一致。
这些数据还表明，这些单体通道可通过存在于人血浆中的正常内源性甘氨酸水平(242-258μM)活化(Geigy Scientific Tables,第8修订版,第93页.C.Lentner编辑,WestCadwell NJ.:Medical Education Div.,Ciba-Geigy Corp.Basel,Switzerland c1981-1992)。
当在神经元细胞中表达时，在HEK-293细胞中测量的膜电位的这些变化预期导致超极化，这是由于经由通过GlyRα-亚基的单体表达形成的Cl-选择性通道引起的Cl-离子的流入和受体随后暴露于内源性激动剂甘氨酸所致。已报道牛磺酸是αβ-多聚体GlyR的部分激动剂，但在这些研究中对单体通道没有直接作用或影响甘氨酸反应。牛磺酸以141-162μM的浓度存在于人血浆中(Geigy Scientific Tables,第8修订版,第93页.C.Lentner编辑,West Cadwell,NJ.:Medical Education Div.,Ciba-Geigy Corp.Basel,Switzerlandc1981-1992)。
结论
甘氨酸受体α-亚基(hGlyRa1)在HEK-293细胞中的单体表达形成功能性氯离子通道，所述功能性氯离子通道对存在于正常人血浆中的浓度的甘氨酸有反应。
实施例2
目的
为了测量正常雄性大鼠血浆中存在的甘氨酸水平并确定大鼠是用于评估在经由病毒载体递送至伤害性感受神经元并随后通过内源性甘氨酸活化时GlyRa1的镇痛功效的适合物种。
方法
将来自6只成年雄性Sprague Dawley大鼠的血液收集到K2EDTA上。将样品离心并分离血浆且冷冻保存并运输。
一旦解冻并且血浆蛋白沉淀，就使用LC/MS/MS系统(AB Sciex API-4000Q阱质谱仪和具有Thermo二氧化硅100x 2.1mm HPLC柱的Shimazu 20A HPLC)测量大鼠血浆样品中甘氨酸的浓度。使用MRM扫描的阳性ESI电离(m/z,76/48)。此方法的校准范围是10至5000ng/mL。
结果
雄性大鼠血浆中的血浆甘氨酸水平在13.8至23.0μg/mL(184–307μM)的范围内，平均值为240.9±45.2μM(平均值±SD)。
结论
存在于大鼠血浆中的甘氨酸的水平类似于正常成年男性中报道的242.0±44.0μM和正常成年人女性中的258.0±64.0μM(Geigy Scientific Tables,第8修订版,第93页.C.Lentner编辑,West Cadwell,NJ.:Medical Education Div.,Ciba-Geigy Corp.Basel,Switzerland c1981-1992)。当在外周组织中表达时，大鼠血浆中的甘氨酸水平在活化单体GlyRa1通道的适合范围内，所述单体GlyRa1通道具有92μM的EC50和大约300μM的EC100(图6)。
基于大鼠和人血浆中甘氨酸水平的相似性，大鼠是用于评估当经由病毒载体递送至伤害性感受神经元递送并随后通过内源性甘氨酸活化时GlyRa1的镇痛功效的合适物种。
实施例3
目的
为了评估GTX-01减轻慢性神经性疼痛的大鼠模型中的痛觉过敏/异常性疼痛反应的有效性。
材料
病毒载体
处理由使用AAV递送的基因治疗DNA序列组成。所述基因治疗由以下组分组成：
●腺相关病毒(血清型6)–AAV6
●人突触素启动子–hSyn
●编码GlyR受体的α-1亚基-GlyRa1的DNA
●绿色荧光蛋白–GFP
所述载体由Goleini,Inc.设计、克隆并合成，并由Virovec,Inc.(Hayward,CA)使用BAC-至-AAV技术包装到AAV6中，所述技术利用杆状病毒表达系统在不含血清的条件下在昆虫细胞中产生AAV载体。
活性处理：(GTX-01)AAV6-hSyn-GlyRa1。所述病毒以含有9.41e13病毒颗粒/mL的水溶液的形式提供并施用。
对照处理：(对照)AAV6-hSyn-GFP。所述病毒以含有2.22e13病毒颗粒/mL的水溶液的形式提供并施用。
动物
体重在182g与227g之间的9只雄性Sprague-Dawley大鼠(Envigo,Hayward,CA)进行如下文所述的手术以建立神经性疼痛的SNI模型。所有动物均通过尾标记单独鉴定，所述尾标记将定期重新标记。在整个研究过程中，允许动物随意获取食物和水。
方法
遗留神经损伤(SNI)模型–外科手术
在异氟烷麻醉下，将大腿外侧表面上的皮肤切开，并通过股二头肌直接取得截面，从而暴露坐骨神经及其三个末端分支：腓肠神经、腓总神经和胫神经。SNI手术包括胫神经和腓总神经的轴突切断术和结扎，从而留下完整腓肠神经。将腓总神经和胫神经用5.0丝紧密结扎并在结扎远端切开，从而移除2±4mm的远端神经残端。非常小心以避免任何接触或拉伸完整腓肠神经。将肌肉和皮肤分两层封闭(Decosterd I.和Woolf C.(2000)Pain 87(2):149-158)。在目前的研究中，这被认为是第0天。
测试机械超敏反应
测试仅在昼夜周期的白天部分期间(06:00-18:00h)进行。将大鼠放置在高金属丝网平台上的倒置塑料笼中，所述平台允许爪完全接近。行为适应大约15分钟，直到笼探索和主要理毛活动停止。测试的区域是腓肠神经分布中足底左后爪的外侧区域，从而避免不太敏感的隆凸(脚垫)。用一系列具有对数递增刚度(0.41、0.70、1.20、2.00、3.63、5.50、8.50和15.10g)的8根von Frey细丝(Stoelting)中的1根触碰爪。von Frey细丝垂直于足底表面呈现足够的力以引起对爪的轻微弯曲，并保持大约6-8秒。刺激以几秒的间隔呈现，从而允许对先前刺激的任何行为反应的可视解析度。如果爪迅速缩回，则注意到积极反应。在拔除头发后立即退缩也被认为是积极反应。行走被认为是模棱两可的反应，并且在此类情况下重复刺激。基于对正常未操作的大鼠的观察结果，选择15.10g细丝(更小小鼠体重的约10％)的截止值作为测试的上限，因为更硬的细丝倾向于使整个肢体举起而不是弯曲，从而显著改变刺激的性质(Chaplan S.等人(1994)J Neurosci Methods 53(1):55-63)。
在手术前一天(第-1天)，测试动物对机械刺激的基线反应(机械敏感性)。在手术后10天时，将所有动物都重新测试其机械敏感性。
在手术后第10天，用对照载体或GTX-01处理动物。在全身麻醉(异氟烷)下，将GTX-01或对照载体以皮下注射的20μL(2x 10μL注射液)的体积分别以1.88e12和4.44e11载体基因组的剂量施用到左后爪垫的侧面区域中。
在处理后第14、21、29、36、44和51天(手术后第24、31、39、46、54和61天)，重新评估动物的机械敏感性。对于所有这些测量值，将操作员对动物的身份设盲。
实验处理(2)
向多组动物给予以下处理中的一种：
●GTX-01：4只动物接受2x 10μL/爪的AAV6病毒制剂，估计浓度为9.41e13病毒颗粒/mL。所述病毒携带编码pFB-hSyn-GlyRa1的DNA
●对照：5只动物接受2x 10μL/爪的AAV6病毒制剂，估计浓度为2.22e13病毒颗粒/mL。所述病毒携带编码hSyn-GFP的DNA。
对数据执行的计算或操作的描述
使用Dixon(Dixon,WJ.(1980)Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.20:441-462；ChaplanS.等人(1994)J Neurosci Methods 53(1):55-63)的上调方法测定50％缩回阈值。在这个范例中，测试是在系列中间用2.0克细丝开始的。无论是上升还是下降，刺激总是以连续的方式呈现。在对最初选择的细丝不存在爪缩回反应的情况下，提供更强的刺激；在爪缩回的情况下，选择下一个较弱的刺激。根据Dixon，通过这种方法计算最佳阈值需要在紧邻50％阈值的6次反应。由于阈值未知，因此可在从任一方向接近阈值时生成类似反应的串。因此，虽然注意到所有反应，但是直到第一次跨过反应阈值时才开始关键6个数据点的计数，此时跨越阈值的2次反应被回顾性地指定为6个系列中的前2次反应。基于大鼠的反应，对刺激的持续呈现的顺序上下的四次额外反应构成所述系列的其余部分。因此，使用此范例收集的实际反应的数量可从最少4次(在顺序爪缩回的情况下，在递减范围2.0-0.4g:阈值中的4根细丝低于实际刺激的范围)至最多9次(在第五次递增刺激呈现时在15.1g下发生的第一次缩回的情况下，随后引发4次额外的反应，从而假定缩回继续在15.1g或以下发生)变化。在观察到对刺激组的耗尽的持续积极或负面反应的情况下，分别指定15.00g和0.25g的值。由此产生的积极反应和消极反应的模式使用惯例制表，X＝缩回；0＝不缩回，并且使用基于Chaplan版本的Dixon升降法的算法对50％反应阈值进行插值(Chaplan S.等人(1994)JNeurosci Methods 53(1):55-63；Dixon WJ.(1980)Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.20:441-462)。
使用未配对的学生t检验分析在处理后第14、21、29、36、44和51天对照组与GTX-01处理组之间对机械刺激的反应差异以获得统计学显著性。
结果
GTX-01组显示显著镇痛，如通过在处理后第29天(P<0.001)、第36天(P<0.001)、第44天(P<0.001)和第51天(P<0.01)的缩回阈值增加所测量。在表4和图8中显示两组，对照(n＝5)和GTX-01(n＝4)的数据。
表4.
天(处理后) 对照 GTX-01
0(-10) 11.9±4.6 14.6±6.4
10(0) 2.2±0.8 2.7±1.8
24(14) 2.2±1.8 4.4±3.6
31(21) 4.4±2.0 6.3±2.8
39(29) 3.3±0.5 9.0±1.9***
46(36) 2.7±1.5 11.0±0.9***
54(44) 2.7±0.8 9.7±2.2***
61(51) 2.7±1.8 9.6±1.4**
表4.在第0天经历胫神经和腓总神经的轴突切断术和结扎、从而留下完整腓肠神经(遗留神经损伤)并在第10天用对照病毒(对照)或GTX-01处理的大鼠的机械阈值(g)。机械阈值(g)数据呈现为5只动物(对照)和4只动物GTX-01的平均值±标准偏差(SD)。使用未配对的学生t检验分析对照组和GTX-01组的统计显著性。显著差异通过**P<0.01或***P<0.001表示。
取得第-1天的基线数据以表示正常或100％镇痛，并且在第10天给予以表示0％镇痛，则GTX-01在施用GTX-01后第29、36、44和51天的平均镇痛作用分别是52％、70％、59％和58％。
在整个研究中测量并记录体重。未观察到用GTX-01与对照载体处理的动物的体重的差异(图9)。
结论
单独施用GTX-01而不施用任何其它试剂在大鼠慢性神经性疼痛的SNI模型中产生显著且持久的镇痛作用。这与高斯JR等人(2010)Molecular Therapy 19(3):500-506和美国专利号：US 8,957,036报道的数据有所区别并与之形成对比，其中他们描述仅在受体激动剂(甘氨酸)以注射液形式施用到疼痛部位如“福尔马林注射足部的足底表面”或经由颈静脉全身施用以处理间质性膀胱炎的模型时GlyRa1的病毒递送及其随后表达后的镇痛。
实施例4.
目的
所述研究的目的是确定在HEK-293细胞中在β-亚基(单体表达)不存在下单独L9'A突变型GluClα-亚基的表达是否能够形成组成型活性氯离子通道(指定为GluCl*)。
材料
在所述研究中使用质粒载体GluCLoptbetmFYPY182F(Life Technologies)，其含有荧光标记的秀丽隐杆线虫GluClα-亚基的完全优化的编码序列。增强型黄色荧光蛋白(YFP)插入位于细胞内M3-M4环内。合成基因GluCLoptbetmFYPY182F由合成寡核苷酸和/或PCR产物组装。将所述片段插入pcDNA3.1(+)中。从转化的细菌纯化质粒DNA并通过UV光谱测定浓度。通过测序验证最终构建体。
名称：大肠杆菌K12(dam+dcm+tonA rec-)基因名称：GluCLoptbetmFYPY182F
基因大小：2043bp
载体主链：pcDNA3.1(+)
克隆位点：HindIII/XhoI
定点诱变
使用QuikChange II XL定点诱变试剂盒(Agilent Technologies#200522)与PfuTurbo DNA聚合酶(Agilent Technologies#600250)，使用以下正向引物和反向引物进行亮氨酸9'突变：5’–CC CTG GGC GTG ACC ACC CTG xxx AC–3’和5’–GC GGA CTG AGC GGTCAT GGT xxx CA–3’，其中‘xxx’表示突变型Leu9'密码子。对于GluCl*，Leu9'被突变为Ala。所有突变均通过DNA测序确认。
细胞
人胚肾(HEK)293细胞购自ATCC(#CRL-1573)。将细胞在补充有10％FBS(Gibco#26140)、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素(Gibco#15140)和1mM丙酮酸钠(Gibco#11360)的杜氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM；Gibco#11965)中，并在37℃和5％CO2下维持在湿润培养箱中。当汇合时，将细胞每3至4天以1:5或1:10的传代比率传代。
方法的描述
细胞培养
对于FlexStation测定，将HEK-293细胞以20,000个细胞/孔、以100μl/孔的接种体积接种在黑色侧面/透明底96孔成像板(BD Falcon#353219)中。为了转染，将750μl DMEM中的16μg总DNA与750μl DMEM中的30μl ExpressFect混合，预温育20分钟，且然后以15μl/孔添加至含有100μl新鲜培养基的细胞。在接种后24小时转染细胞并在转染48小时后测定。在37℃/5％CO2下4-6小时温育期后将转染混合物从培养物中移除，并用新鲜培养基替代。
膜电位测量
使用FLIPR膜电位测定试剂盒、BLUE制剂(Molecular Devices,#R8042)的基于荧光的测定用于检测跨细胞膜的电压变化。根据包装文献制备染料负载缓冲液。具体地说，将一小瓶BLUE试剂的内容物用5ml的1x测定缓冲液溶解，然后用另一5ml的1x测定缓冲液洗涤小瓶，以得到总体积10ml的染料负载缓冲液。将染料负载缓冲液的未使用部分储存在-20℃下并在5天内使用。对于功能测定，将培养基从细胞中移除并用50μl DMEM替代。然后将细胞负载50μl蓝色染料负载缓冲液并在37℃/5％CO2下温育40分钟。使用由SoftMax Pro数据采集和分析软件(Molecular Devices)操作的FlexStation 3多模式台式微板读数器检测信号。激发和发射波长分别设定在530nm和565nm，发射截止值为550nm。板读取在30℃下在‘低PMT'设置下进行。前20秒测量的基础荧光的运行时间对于伊维菌素诱导的信号是300秒。其它FlexStation参数包括230μl的移液器高度、100μl的初始孔体积、50μl的转移体积(因此，3x制备药物浓度)以及2(对应于约31μl/sec)的转移速率设置。
在GluCl*和野生型转染的细胞两者中均产生伊维菌素的浓度/反应曲线。所使用的伊维菌素浓度是1、3、10、30、100、300、1000nM。将伊维菌素以10mM原液溶解于DMSO中，并在-20℃下以0.3mM等分部分储存。使用含有0.1％DMSO的具有20mM HEPES(pH 7.4)的1xHBSS制备用于FlexStation测定的伊维菌素浓缩物。
实验处理
将细胞用以下质粒中的一种转染：
●pFB-CMV-GluCloptα-mEYFP-L9’L(野生型)(GluCLoptbetmFYPY182F)
●pFB-CMV-GluCloptα-mEYFP-L9’A(GluCl*)
以下激动剂用于刺激转染的细胞
●伊维菌素(Sigma#18898)
对数据执行的计算或操作的描述
原始FlexStation信号从SoftMax Pro 5导出为‘.txt’文件，并使用MicrosoftExcel 2008和Origin 7.0离线分析。
统计学
合并的数据显示为平均值±SEM。
结果
在表达野生型GluClα-亚基的细胞中，不存在膜电位的不受刺激的变化(图10)。添加增加浓度的伊维菌素导致膜电位的剂量依赖性变化(图10)，其中EC50为147nM(图11)。
在表达L9'A突变型GluClα-亚基(GluCl*)的细胞中，基线膜电位被最大地改变(图12)。响应于1μM伊维菌素，反应与在野生型GluClα亚基中观察到的反应幅度相似(图10)。向表达GluCl*的细胞添加增加剂量的伊维菌素不会增加膜电位的变化(图12)。
当在神经元细胞中表达时，在HEK-293细胞中测量的膜电位的这些变化预期导致超极化，这是由于经由通过GluClα-亚基的单体表达形成的Cl-选择性通道引起的Cl-离子的流入和受体激动剂伊维菌素的随后随后施加所致。神经元细胞中GluClα-亚基的L9'A突变的单体表达预期形成组成型活性Cl-，其预计导致神经元组织的永久超极化而不添加激动剂。
结论
HEK-293细胞中秀丽隐杆线虫GluCl谷氨酸受体α-亚基的L9'A突变的单体表达形成功能性和组成型活性氯离子通道。
实施例5
目的
此研究的目的是评估GTX-01*减轻慢性神经性疼痛的大鼠模型中的痛觉过敏/异常性疼痛反应的有效性。
材料
处理由使用AAV递送的基因治疗DNA序列组成。所述基因治疗由以下组分组成：
●腺相关病毒(血清型6)–AAV6
●人突触素启动子–hSyn
●编码GluCl*-具有L9'A突变的GluCl受体的α-亚基的DNA以产生组成型开放通道。pFB-hSyn-GluCloptα-mEYFP-L9’A
●增强型黄色荧光蛋白–EYFP
所述载体由Goleini,Inc.设计、克隆并合成，并由Virovec,Inc.(Hayward,CA)使用专有BAC-至-AAV技术包装到AAV6中，所述技术利用杆状病毒表达系统在不含血清的条件下在昆虫细胞中产生AAV载体。
活性处理：GTX-01*
AAV6-hSyn-GluCloptα-mEYFP-L9'A。所述病毒以含有9.79e13病毒颗粒/mL的水溶液的形式提供并施用。
对照处理：对照
AAV6-hSyn-EYFP所述病毒以含有2.22e13病毒颗粒/mL的水溶液的形式提供并施用。
在研究结束时，所述动物接受加巴喷丁(100mg/kg:IP)(Sigma Aldrich,G154))。
动物
从如下所述进行外科手术的21只动物的初始群体中选择两组重量介于200与250g(6-7周龄)的6只雄性Sprague-Dawley大鼠(Envigo,Hayward,CA)以建立神经性疼痛的SNI模型。动物是基于其在手术后10天的机械敏感性进行选择。所选择的12只动物对机械刺激具有相似的超敏反应。将12只选择的动物根据它们的机械敏感性排序并且替代地分配至“处理”和“对照”组以创建对机械刺激具有类似超敏反应的2个“平衡”动物组。所有动物均通过尾标记单独鉴定，所述尾标记将定期重新标记。在整个研究过程中，允许动物随意获取食物和水。
方法
研究按照AfaSci机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行。
方法的描述
遗留神经损伤(SNI)模型–外科手术：
在异氟烷麻醉下，将大腿外侧表面上的皮肤切开，并通过股二头肌直接取得截面，从而暴露坐骨神经及其三个末端分支：腓肠神经、腓总神经和胫神经。SNI手术包括胫神经和腓总神经的轴突切断术和结扎，从而留下完整腓肠神经。将腓总神经和胫神经用5.0丝紧密结扎并在结扎远端切开，从而移除2±4mm的远端神经残端。非常小心以避免任何接触或拉伸完整腓肠神经。将肌肉和皮肤分两层封闭(Decosterd I.和Woolf C.(2000)Pain 87(2):149-158)。在目前的研究中，这被认为是第0天。
测试机械超敏反应：
测试仅在昼夜周期的白天部分期间(06:00-18:00h)进行。将大鼠放置在高金属丝网平台上的倒置塑料笼中，所述平台允许爪完全接近。行为适应大约15分钟，直到笼探索和主要理毛活动停止。测试的区域是腓肠神经分布中足底左后爪的外侧区域，从而避免不太敏感的隆凸(脚垫)。用一系列具有对数递增刚度(0.41、0.70、1.20、2.00、3.63、5.50、8.50和15.10g)的8根von Frey细丝(Stoelting)中的一根触碰爪。von Frey细丝垂直于足底表面呈现足够的力以引起对爪的轻微弯曲，并保持大约6-8秒。刺激以几秒的间隔呈现，从而允许对先前刺激的任何行为反应的可视解析度。如果爪迅速缩回，则注意到积极反应。在拔除头发后立即退缩也被认为是积极反应。行走被认为是模棱两可的反应，并且在此类情况下重复刺激。基于对正常未操作的大鼠的观察结果，选择15.10g细丝(更小小鼠体重的约10％)的截止值作为测试的上限，因为更硬的细丝倾向于使整个肢体举起而不是弯曲，从而显著改变刺激的性质(Chaplan S.等人(1994)J Neurosci Methods 53(1):55-63)。
在手术前一天(第-1天)，测试动物对机械刺激的基线反应(机械敏感性)。在手术后10天时，将所有动物都重新测试其机械敏感性。
在手术后第10天，选择具有最大机械超敏反应的12只动物以用于用对照载体或GTX-01*处理。在全身麻醉(异氟烷)下，将GTX-01*或对照载体以皮下注射的20μL(2x 10μL注射液)的体积分别以1.96e12和4.44e11载体基因组的剂量施用到左后爪垫的侧面区域中。
在处理后第13、22和35天(手术后第23、32和45天)，重新评估动物的机械敏感性。对于所有这些测量值，将操作员对动物的身份设盲。
在处理后第22天(手术后第32天)，将来自对照组和GTX-01*处理组中的每种的一只动物安乐死，并收获组织且如下所述进行加工。
在处理后第36天(手术后第46天)，向动物给予加巴喷丁(100mg/kg:IP)。在加巴喷丁施用后1小时和2小时，评估动物对机械刺激的敏感性。
组织收获：
在处理后第22天且在第36天实验结束时，通过施用异氟烷使动物安乐死，随后进行胸廓切开术。收获左侧背根神经节(L4、L5和L6)、左侧腓肠神经和左后爪，并在4％多聚甲醛中在4℃下固定14天，且然后转移至20％蔗糖中至少24小时。随后将组织冷冻切片并使用共焦显微镜针对组织学评估染色。使用针对YFP的第一抗体来鉴定pFB-hSyn-GluCloptα-mEYFP-L9’A基因的表达。
实验处理
向多组动物给予以下处理中的一种：
GTX01*-6只动物接受2x 10μL/爪的AAV6病毒制剂，估计浓度为9.79e13病毒颗粒/mL。所述病毒携带编码pFB-hSyn-GluCloptα-mEYFP-L9’A的DNA
对照-6只动物接受2x 10μL/爪的AAV6病毒制剂，估计浓度为2.22e13病毒颗粒/mL。所述病毒携带编码hSyn-EYFP的DNA
排除参数：
没有动物从所述研究中排除。在研究期间没有动物死亡。
对数据执行的计算或操作的描述
使用Dixon的升降法(Chaplan S.等人(1994)J Neurosci Methods 53(1):55-63；Dixon WJ.(1980)Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.20:441-462)确定50％缩回阈值。在这个范例中，测试是在系列中间用2.0克细丝开始的。无论是上升还是下降，刺激总是以连续的方式呈现。在对最初选择的细丝不存在爪缩回反应的情况下，提供更强的刺激；在爪缩回的情况下，选择下一个较弱的刺激。根据Dixon，通过这种方法计算最佳阈值需要在紧邻50％阈值的6次反应。由于阈值未知，因此可在从任一方向接近阈值时生成类似反应的串。因此，虽然注意到所有反应，但是直到第一次跨过反应阈值时才开始关键6个数据点的计数，此时跨越阈值的2次反应被回顾性地指定为6个系列中的前2次反应。基于大鼠的反应，对刺激的持续呈现的顺序上下的四次额外反应构成所述系列的其余部分。因此，使用此范例收集的实际反应的数量可从最少4次(在顺序爪缩回的情况下，在递减范围2.0-0.4g:阈值中的4根细丝低于实际刺激的范围)至最多9次(在第五次递增刺激呈现时在15.1g下发生的第一次缩回的情况下，随后引发4次额外的反应，从而假定缩回继续在15.1g或以下发生)变化。在观察到对刺激组的耗尽的持续积极或负面反应的情况下，分别指定15.00g和0.25g的值。由此产生的积极反应和消极反应的模式使用惯例制表，X＝缩回；0＝不缩回，并且使用基于Chaplan版本的Dixon升降法的算法对50％反应阈值进行插值(Chaplan S.等人(1994)JNeurosci Methods 53(1):55-63；Dixon WJ.(1980)Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.20:441-462)。
使用未配对的学生t检验分析在处理后第13、22和35天对照组与GTX-01*处理组之间对机械刺激的反应差异以获得统计学显著性。使用未配对的学生t检验通过将加巴喷丁给药后第1小时和第2小时与处理前值进行比较来分析对加巴喷丁的反应的统计显著性。
结果
在第-1天，选择用于研究的动物的基线缩回阈值具有6.24±0.09g(对照组)和6.27±0.09g(GTX-01*组)的平均值。在手术后第10天，选择用于对照载体和GTX-01*处理的动物的缩回阈值分别是1.40±0.18g和1.51±0.14g。在对照载体或GTX-01*施用后第13天，缩回阈值分别是1.58±0.28g和3.07±0.68g(P<0.001)。到处理后第22天，对照组的缩回阈值基本在1.69±0.17g保持不变，而GTX-01*组的GTX-01*缩回阈值进一步增加至5.18±0.74g(P<0.001)。在测试的最终时间点(处理后35天)，在对照组中存在对机械刺激的超敏反应的轻微损失(2.53±0.40g)，而GTX-01*组维持对机械刺激的接近正常水平的敏感性水平(5.21±0.43g)(P<0.001)(图13)。
如果第-1天的基线数据表示正常或100％镇痛，并且在第10天给予表示0％镇痛，则在处理后第13、22和35天，GTX-01*的镇痛作用分别代表正常的33％、77％和77％。
在手术后第46天，加巴喷丁(100mg/kg:IP)降低先前已经施用“对照载体”的动物中的机械超敏反应。那些动物在给药前、给药后1小时和2小时的缩回阈值分别是2.46±0.49g、3.44±0.36g(P<0.01)和4.15±0.19g(P<0.001)(图14)。在先前用GTX-01*处理的那些动物中，加巴喷丁对机械刺激的接近正常的反应没有影响(图14)。
在处理后第22天收获的来自GTX-01*处理的动物的DRG的免疫组织化学评估显示针对EYFP(通过GTX-01*递送的pFB-hSyn-GluCloptα-mEYFP-L9’A基因的产物)阳性染色的个体细胞体(图15)。类似地，位于来自同一动物的爪的真皮层下方的神经末梢针对EYFP阳性染色(图15)。这些数据表明病毒被注射部位的神经末梢吸收，转运至DRG中的细胞体，并且所述基因产物在神经末梢中成功表达。
结论
单独施用GTX-01*在大鼠慢性神经性疼痛的SNI模型中产生显著且持久的镇痛作用。
实施例6
目的
此研究的目的是确定HEK-293细胞中人甘氨酸受体亚基α1同种型a(hGlyRa1)的单体表达是否对细胞活力具有影响。
方法
人胚肾(HEK)293细胞购自ATCC(#CRL-1573)。将细胞在补充有10％FBS(Gibco#26140)、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素(Gibco#15140)和1mM丙酮酸钠(Gibco#11360)的杜氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM；Gibco#11965)中，并在37℃和5％CO2下维持在湿润培养箱中。当汇合时，将细胞每3至4天以1:5或1:10的传代比率传代。然后将细胞以20,000个细胞/孔，以100μl/孔的接种体积接种在透明96孔培养板中。在培养24小时后，将细胞模拟转染或用hGlyRa1(pFB-CMV-hGlyRa1-P2A-mEYFP-WT)转染。为了转染，将750μl Opti-MEM(Gibco 31985-070)中的16μg总DNA与750μl Opti-MEM中的30μl ExpressFect混合，预温育20分钟，且然后以15μl/孔添加至含有100μl新鲜培养基的细胞。在37℃/5％CO2下4-6小时温育期后将转染混合物从培养物中移除，并用补充有L-谷氨酰胺(Gibco 25030-081)的新鲜DMEM(含有400μM甘氨酸)或新鲜不含甘氨酸的培养基(Gibco 12360-038)替代。将一半未转染的、模拟转染的和转染的细胞在DMEM(含有400μM甘氨酸)中培养，而另一半在不含甘氨酸的培养基中培养。在72小时后，使用台盼蓝染料排除作为细胞活力的标记来测量细胞活力。在双目显微镜下，分别计数未染色的(活的)和染色的(非存活的)细胞。针对每种情况评估五个单独孔。
结果
在不存在和存在甘氨酸的情况下未转染的细胞分别具有94.6％和95.6％的平均细胞活力。模拟转染的细胞在不存在甘氨酸的情况下具有93.8％的平均细胞活力，并且在存在甘氨酸的情况下具有92.8％的平均细胞活力。hGlyRa1的单体表达在不存在甘氨酸(92.0％的细胞存活)或存在甘氨酸的情况下不影响细胞活力，所述甘氨酸活化由α亚基形成的单体氯离子通道(94.0％的细胞存活)(图16)。
结论
在HEK-293细胞中甘氨酸受体通道的α亚基(hGlyRa1)的单体表达和随后暴露于甘氨酸72小时对细胞活力没有影响。
实施例7
目的
此研究的目的是确定在HEK-293细胞中GluClα亚基的L9'A突变的单体表达是否对细胞活力具有任何影响。
方法
人胚肾(HEK)293细胞购自ATCC(#CRL-1573)。将细胞在补充有10％FBS(Gibco#26140)、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素(Gibco#15140)和1mM丙酮酸钠(Gibco#11360)的杜氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM；Gibco#11965)中，并在37℃和5％CO2下维持在湿润培养箱中。当汇合时，将细胞每3至4天以1:5或1:10的传代比率传代。然后将细胞以20,000个细胞/孔，以100μl/孔的接种体积接种在透明96孔培养板中。在培养24小时后，将细胞模拟转染或用GluCl(pFB-CMV-GluCloptα-mEYFP-WT)或GluCl*(pFB-CMV-GluCloptα-mEYFP-L9’A)的α-亚基转染。为了转染，将750μl Opti-MEM(Gibco 31985-070)中的16μg总DNA与750μlOpti-MEM中的30μl ExpressFect混合，预温育20分钟，且然后以15μl/孔添加至含有100μl新鲜培养基的细胞。在37℃/5％CO2下4-6小时温育期后将转染混合物从培养物中移除，并用新鲜培养基替代。在48小时后，使用台盼蓝染料排除作为细胞活力的标记来测量细胞活力。在双目显微镜下，分别计数未染色的(活的)和染色的(非存活的)细胞。针对每种情况(未转染的、模拟转染的、GluCl和GluCl*)评估五个单独孔。
结果
未转染的和模拟转染的细胞分别具有94.8％和92.8％的平均细胞活力。GluCl野生型α-亚基的单体表达不影响细胞活力(91.8％的细胞存活)。形成组成型活性Cl-通道的GluClα亚基的L9'A突变(GluCl*)的单体表达对细胞活力没有显著影响(94.0％的细胞存活)(图17)。
结论
在HEK-293细胞中GluClα亚基的L9'A突变的单体表达对细胞活力没有影响。
实施例8
目的
为了评估在人平滑肌细胞中在添加毒蕈碱受体激动剂卡巴胆碱后，GluCl受体α亚基L9'A突变体和甘氨酸受体α-1亚基突变体(L9'A)对游离细胞内Ca++的作用。
方法
人呼吸道平滑肌(HASM)细胞来源于从国家疾病研究交流中心(Philadelphia,PA,USA)和国际医学发展协会(Edison,NJ,USA)获得的气管。将细胞在补充有10％FBS、100UmL-1青霉素、0.1mg mL-1链霉素和2.5mg mL-1两性霉素B的汉姆氏(Ham's)F-12培养基中培养，并且每72小时更换此培养基。使用在传代1-5代期间的次培养物中的HASM细胞，因为这些细胞保留天然收缩蛋白的表达。HASM细胞来源于健康正常供体。
GluCl受体
细胞来源于两个个体供体(HSAM-N030116K/1和N082715/3)的气管。使它们生长至约80％汇合，然后用pFB-CMV-GluCloptα-mEYFP-L9’A(GluCl受体αL9'A突变体)转染或无转染72小时。将细胞血清饥饿24小时并用Fluo 8钙敏感染料负载1小时，之后用卡巴胆碱(10μM)刺激。在用卡巴胆碱(10μM)刺激之前用福莫特罗(1μM，10分钟)刺激单独的孔。此研究中的所有温育和刺激均在含甘氨酸的组织培养基中进行。
Gly受体
使来自两个单独供体(HASM-N070112/3和N082112/3)的气管的细胞生长至约80％汇合，然后用pFB-CMV-hGlyRa1-P2A-mEYFP-WT(野生型GlyRα-1亚基)、pFB-CMV-hGlyRa1-P2A-mEYFP-L9'A(GlyRα-1亚基L9'A)转染或无转染72小时。将细胞血清饥饿24小时并用Fluo 8钙敏感染料负载1小时，之后用组胺刺激。在用组胺(1μM)刺激之前，将用pFB-CMV-hGlyRa1-P2A-mEYFP-WT转染的细胞与甘氨酸(100μM或1mM)一起预温育1小时。未将甘氨酸添加至用pFB-CMV-hGlyRa1-P2A-mEYFP-L9'A转染的细胞中。此研究中的所有温育和刺激均在不含甘氨酸的Kreb缓冲液中进行。来自两项研究的所有数据均以相对荧光单位表示。
结果
GluCl受体的结果在图18A-18B中示出。具体地说，在添加毒蕈碱受体激动剂卡巴胆碱后存在游离细胞内Ca++的增加。在细胞N030116K/1中，反应非常迅速并且比来自第二供体N082715/3的细胞中的反应更平缓。福莫特罗(β-肾上腺素受体激动剂和已知的平滑肌松弛剂)拮抗卡巴胆碱诱导的细胞内Ca++的增加。用组成型活性GluClα亚基L9'A突变(pFB-CMV-GluCloptα-mEYFP-L9’A)转染的细胞也显示由卡巴胆碱诱导的细胞内Ca++的减少。这在来自两个供体的细胞中观察到。这一观察结果与Frazier(2012)的观察结果一致：这种突变产生组成型活性氯离子通道，所述组成型活性氯离子通道导致细胞的超极化，其进而将衰减电压依赖性Ca++(L型)通道的打开，从而降低细胞内Ca++的水平。
GlyR的结果在图19A-19B中示出。具体地说，在添加组胺后存在游离细胞内Ca++的增加。在细胞N082112/3中，反应非常迅速并且比来自供体N070112/3的细胞中的反应更平缓。在甘氨酸(100μm或1mM)存在下用pFB-CMV-hGlyRa1-P2A-mEYFP-WT(野生型GlyRα-1亚基)转染的细胞中，组胺诱导的细胞内Ca的增加受到拮抗。在用pFB-CMV-hGlyRa1-P2A-mEYFP-L9'A(GlyRα-1亚基L9'A)转染的来自两个供体的细胞中，在不存在甘氨酸的情况下观察到组胺反应的等效拮抗作用。
结论
GluClα亚基L9'A突变体的观察结果与Frazier(2012)的观察结果一致：这种突变产生组成型活性氯离子通道，所述组成型活性氯离子通道导致细胞的超极化，其进而将衰减电压依赖性Ca++(L型)通道的打开，从而降低细胞内Ca++的水平。
这些关于GlyR的数据与以下假设一致：GlyRα-1亚基L9'A形成组成型活性氯离子通道，所述组成型活性氯离子通道导致细胞的超极化，其进而将衰减电压依赖性Ca++(L型)通道的打开，从而降低细胞内Ca++的水平。
实施例9
目的
为了评估AAV6在培养物中转导人神经元细胞的能力。
方法
在解剖显微镜下，将验尸后从供体收集的人背根神经节(hDRG)清除掉多余的脂肪、结缔组织和神经根。然后将神经节切成小片。将这些片在0.25％胶原酶P和0.1％分散酶I的酶混合物中消化并在37℃下温育18小时。在消化后，用汉克氏平衡盐溶液将细胞洗掉酶溶液。
在纯化后，将解离的细胞接种到组织培养皿上。在接种之前，将所述皿用10μg/ml聚L-赖氨酸和1型鼠尾胶原蛋白处理。将细胞维持在补充有B-27补充物(Invitrogen)、1％青霉素/链霉素、0.4mM L-谷氨酰胺、2.5g/L葡萄糖和1％胎牛血清的Neurobasal-A培养基(Invitrogen)中。
一旦培养的细胞已经稳定(4-5天)，就将它们用AAV6-hSyn-GFP转导，以2.2e11vg/mL的浓度添加至细胞中，并与所述细胞接触最少6小时。在荧光显微镜下每2-3天检查细胞以检查GFP表达。通过数字图像记录观察结果。
结果
在暴露于AAV6神经元细胞后4天显示GFP蛋白的强表达(图20)。GFP的表达在所有神经元细胞中都不可见，这与小鼠中的先前研究一致，所述先前研究表明AAV6对较小伤害性感受神经元显示选择性(Towne C.等人(2009)Molecular Pain 5(1):52)。神经胶质细胞也不表达GFP。这种选择性水平可部分归因于AAV6趋向性，并且肯定受使用允许神经元选择性表达GFP的hSyn启动子的影响。
结论
这些数据表明AAV6能够在培养中转导人神经元细胞。这一观察结果表明，如在啮齿动物中所证实的，AAV6在注射到外周时将转导注射区域中的伤害性感受神经元，并且能够递送可影响那些神经元的生理学的基因。这些观察结果与使用AAV6向外周伤害性感受神经元递送内源活化或组成型活性氯离子通道以防止来自外周的疼痛信号传递至人脊髓的概念一致。
按如下程度以引用的方式并入本文所引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利：如同每一个参考文献都个别地和具体地表示为以引用的方式并入本文并且其全部内容都进行了陈述。
在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)，术语“一个/种(a/an)”和“所述”以及类似指代物的使用意图解释为涵盖单数和复数两者，除非在本文另外地指示或明显地与上下文矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)，除非另外地注解。除非本文另外指明，否则本文中值范围的列举仅仅意图用作个别地表示属于所述范围的各单独值的简要方法，并且犹如本文个别描述地那样将各单独值并入到说明书中。可以按任何合适的顺序执行本文所描述的所有方法，除非在此另外地指示或另外明显地与上下文矛盾。本文所提供的任何以及全部实施例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅意图更好地说明本发明并且除非另外要求，否则不会对本发明的范围施加限制。本说明书中的语言不应解释为将任何非要求的要素指示为实践本发明所必需。
本文中描述了本发明的优选实施方案，其包括为发明者所知用来执行本发明的最佳模式。阅读上述说明书后那些优选实施方案的变型对于本领域普通技术人员可变得明显。发明者希望技术人员适当地采用此类变体，并且发明者意图以其它方式而不是如本文所特别描述的来实施本发明。因此，本发明包括在随附的适用法律允许的权利要求中叙述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另有指示或或与上下文明显矛盾，否则在其所有可能变化形式的上述要素的任何组合都涵盖在本发明内。

Claims (80)

1.一种载体，其包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子，所述载体用于预防性或治疗性治疗可兴奋细胞相关的疾病或病状。
2.一种治疗有需要的哺乳动物的可兴奋细胞相关的疾病或病状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的包含表达盒的载体，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子。
3.如权利要求1或2所述的载体或方法，其中所述亚基能够通过与一种或多种另外的亚基多聚化而形成多聚体离子通道。
4.如权利要求3所述的载体或方法，其中治疗是在不存在施用激动剂或变构调节剂的情况下进行；或其中不向所述哺乳动物施用所述多聚体离子通道的激动剂或变构调节剂。
5.如权利要求4所述的载体或方法，其中所述激动剂是甘氨酸。
6.如权利要求3所述的载体或方法，其中所述多聚体离子通道由内源性激动剂活化。
7.如权利要求1或2所述的载体或方法，其中所述核酸编码氯离子通道的亚基。
8.如权利要求7所述的载体或方法，其中所述核酸编码甘氨酸受体(GlyR)、γ-氨基丁酸受体(GABAAR)或谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)的亚基。
9.如权利要求8所述的载体或方法，其中所述核酸编码GlyR的亚基。
10.如权利要求9所述的载体或方法，其中所述编码的GlyR亚基选自由以下各项组成的组：α-1亚基、α-2亚基、α-3亚基、α-4亚基以及β亚基。
11.如权利要求10所述的载体或方法，其中所述编码的GlyR亚基是GlyR的α-1亚基(GlyRa1)。
12.如权利要求11所述的载体或方法，其中所述编码的GlyR亚基是人GlyRa1(hGlyRa1)。
13.如权利要求8所述的载体或方法，其中所述核酸编码GABAAR的亚基。
14.如权利要求13所述的载体或方法，其中所述核酸编码GABAA-ρ受体的亚基。
15.如权利要求13所述的载体或方法，其中所述编码的GABAAR亚基选自由以下各项组成的组：GABRA1(α1)、GABRA2(α2)、GABRA3(α3)、GABRA4(α4)、GABRA5(α5)、GABRA6(α6)、GABRB1(β1)、GABRB1(β2)、GABRB1(β3)、GABRG1(γ1)、GABRG2(γ2)、GABRG3(γ3)、GABRD(δ)、GABRE(ε)、GABRP(π)、GABRQ(θ)、GABRR1(ρ1)、GABRR2(ρ2)以及GABRR3(ρ3)。
16.如权利要求8所述的载体或方法，其中所述核酸编码GluCl的亚基。
17.如权利要求16所述的载体或方法，其中所述编码的GluCl亚基选自由以下各项组成的组：α1、α2A、α2B、GBR2A(α3A)、GBR2B(α3B)以及β。
18.如权利要求1或2所述的载体或方法，其中与相应的野生型亚基相比，所述编码的亚基包含至少一种突变。
19.如权利要求18所述的载体或方法，其中包含所述突变型亚基的多聚体离子通道是组成型活性的。
20.如权利要求18所述的载体或方法，其中与相应的野生型多聚体离子通道相比，包含所述突变型亚基的多聚体离子通道具有增强的激动剂敏感性。
21.如权利要求18至20中任一项所述的载体或方法，其中与相应的野生型亚基相比，所述编码的亚基包含M2跨膜结构域并且所述至少一种突变位于所述M2跨膜结构域中。
22.如权利要求21所述的载体或方法，其中与相应的野生型亚基相比，所述至少一种突变位于亮氨酸9'残基处。
23.如权利要求22所述的载体或方法，其中与相应的野生型亚基相比，所述至少一种突变是L9’A或L9’G。
24.如权利要求18或19所述的载体或方法，其中与相应的野生型亚基相比，所述编码的亚基是GABAAα-亚基，其中所述至少一种突变位于L263处；GABAAβ-亚基，其中所述至少一种突变位于L259处；GABAAγ-亚基，其中所述至少一种突变位于L274处；或GABACρ-亚基，其中所述至少一种突变位于T314、L317或L301处。
25.如权利要求18所述的载体或方法，其中所述编码的亚基与相应的野生型亚基具有约80％序列同一性至约99％序列同一性。
26.如权利要求25所述的载体或方法，其中所述编码的亚基与相应的野生型亚基具有约90％序列同一性至约99％序列同一性。
27.如权利要求26所述的载体或方法，其中所述编码的亚基与相应的野生型亚基具有约95％序列同一性至约99％序列同一性。
28.如权利要求27所述的载体或方法，其中所述编码的亚基与相应的野生型亚基具有约99％序列同一性。
29.如权利要求1或2所述的载体或方法，其中所述启动子是可调控的启动子。
30.如权利要求1或2所述的载体或方法，其中所述启动子是组成型启动子。
31.如权利要求1或2所述的载体或方法，其中所述启动子是组织特异性启动子。
32.如权利要求1或2所述的载体或方法，其中所述启动子选自由以下各项组成的组：人突触素-1启动子(Syn1或hSyn)、人巨细胞病毒(CMV)启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、肌肉特异性结蛋白启动子、基质Gla蛋白(MGP)启动子或其片段以及壳多糖酶3样1(Ch3L1)基因的5'启动子区域。
33.如权利要求1或2所述的载体或方法，其中所述载体是病毒载体。
34.如权利要求33所述的载体或方法，其中所述病毒载体是腺病毒、慢病毒、腺相关病毒(AAV)、自互补AAV(scAAV)、脊髓灰质炎病毒、HSV或基于鼠Maloney的病毒载体。
35.如权利要求34所述的载体或方法，其中所述病毒载体是AAV载体。
36.如权利要求35所述的载体或方法，其中所述AAV载体选自由以下各项组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9以及rAAV2/6。
37.如权利要求36所述的载体或方法，其中所述载体是AAV6载体。
38.如权利要求34所述的载体或方法，其中所述载体是scAAV载体。
39.如权利要求38所述的载体或方法，其中所述scAAV载体是scAAV2载体。
40.如权利要求1或2所述的载体或方法，其中所述可兴奋细胞相关的疾病或病状是疼痛、炎症、高眼压症或痉挛性张力亢进。
41.如权利要求40所述的载体或方法，其中所述可兴奋细胞相关的疾病是疼痛。
42.如权利要求41所述的载体或方法，其中所述疼痛是慢性疼痛。
43.如权利要求41所述的载体或方法，其中所述疼痛是关节疼痛或神经性疼痛。
44.如权利要求40所述的载体或方法，其中所述可兴奋细胞相关的疾病或病状是炎症。
45.如权利要求44所述的载体或方法，其中所述炎症是关节炎症。
46.如权利要求41至45中任一项所述的载体或方法，其中所述载体是AAV6载体，所述启动子是人突触素(hSyn)启动子，并且所述核酸编码GlyR亚基。
47.如权利要求46所述的载体或方法，其中所述GlyR亚基包含至少一种突变，所述至少一种突变在所述亚基多聚化时产生组成型活性GlyR。
48.如权利要求40所述的载体或方法，其中所述可兴奋细胞相关的疾病或病状是高眼压症。
49.如权利要求48所述的载体或方法，其中所述可兴奋细胞相关的疾病或病状是青光眼。
50.如权利要求48或49所述的载体或方法，其中所述载体是scAAV2载体，所述启动子是基质Gla蛋白(MGP)启动子，并且所述核酸编码GlyR亚基。
51.如权利要求50所述的载体或方法，其中所述GlyR亚基包含至少一种突变，所述至少一种突变在所述亚基多聚化时产生组成型活性GlyR。
52.如权利要求40所述的载体或方法，其中所述可兴奋细胞相关的疾病或病状是痉挛性张力亢进。
53.如权利要求52所述的载体或方法，其中所述载体是AAV2或AAV6载体，所述启动子是人突触素(hSyn)启动子，并且所述核酸编码GlyR亚基。
54.如权利要求53所述的载体或方法，其中所述GlyR亚基包含至少一种突变，所述至少一种突变在所述亚基多聚化时产生组成型活性GlyR。
55.如权利要求52所述的载体或方法，其中所述载体是AAV8或AAV9载体，所述启动子是人巨细胞病毒(CMV)启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或CAG或肌肉特异性结蛋白启动子，并且所述核酸编码GlyR亚基。
56.如权利要求55所述的载体或方法，其中所述GlyR亚基包含至少一种突变，所述至少一种突变在所述亚基多聚化时产生组成型活性GlyR。
57.如权利要求55或56所述的载体或方法，其中所述载体是AAV8载体，并且所述启动子是肌肉特异性结蛋白启动子。
58.如权利要求2所述的方法，其还包括向所述哺乳动物施用一种或多种其它治疗剂。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述一种或多种其它治疗剂是用于治疗疼痛、炎症、高眼压症和/或痉挛性张力亢进的药剂。
60.如权利要求58所述的方法，其中所述一种或多种其它治疗剂不是所述多聚体离子通道的激动剂或变构调节剂。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述一种或多种其它治疗剂不是甘氨酸。
62.一种用于预防性或治疗性治疗可兴奋细胞相关的疾病或病状的药物组合物，所述药物组合物包含载体，所述载体包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子；以及药学上可接受的载体。
63.一种以下各项的组合：a)载体，所述载体包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子；以及b)一种或多种其它治疗剂；所述组合用于预防性或治疗性治疗可兴奋细胞相关的疾病或病症。
64.如权利要求63所述的组合，其中所述一种或多种其它治疗剂是用于治疗疼痛、炎症、高眼压症和/或痉挛性张力亢进的药剂。
65.如权利要求63所述的组合，其中所述一种或多种另外的治疗剂不是所述多聚体离子通道的激动剂或变构调节剂。
66.如权利要求65所述的组合，其中所述一种或多种另外的治疗剂不是甘氨酸。
67.一种试剂盒，其包含载体，所述载体包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子；包装材料；以及用于将所述载体施用至有需要的哺乳动物以治疗可兴奋细胞相关的疾病或病状的说明书。
68.如权利要求67所述的试剂盒，其还包括一种或多种其它治疗剂。
69.一种包含表达盒的载体用于制备用于治疗有需要的哺乳动物的可兴奋细胞相关的疾病或病状的药物的用途，其中所述表达盒包含与编码多聚体离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子。
70.一种用于药物疗法中的载体，所述载体包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体氯离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子。
71.一种载体，其包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码多聚体氯离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子，所述载体用于体内调节哺乳动物细胞的电生理学活性。
72.一种用于体内调节哺乳动物细胞的电生理学活性的方法，所述方法包括使所述细胞与包含表达盒的载体接触，所述表达盒包含与编码多聚体氯离子通道的亚基的核酸可操作地连接的启动子。
73.如权利要求71或72所述的载体或方法，其中所述亚基与一种或多种另外的亚基多聚化并形成多聚体离子通道。
74.如权利要求73所述的方法，其中不向所述哺乳动物施用所述多聚体离子通道的激动剂或变构调节剂。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述激动剂是甘氨酸。
76.如权利要求71或72所述的载体或方法，其中所述多聚体离子通道由内源性激动剂活化。
77.如权利要求71或72所述的载体或方法，其中所述核酸编码甘氨酸受体(GlyR)、γ-氨基丁酸受体(GABAAR)或谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)的亚基。
78.如权利要求77所述的载体或方法，其中所述核酸编码GlyR的亚基。
79.如权利要求71或72所述的载体或方法，其中与相应的野生型亚基相比，所述编码的亚基包含至少一种突变。
80.如权利要求79所述的载体或方法，其中所述多聚体离子通道是组成型活性的。
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