CN108350463A - 通过靶向光受体治疗失明的新型治疗工具和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分离的核酸分子，其包含编码去极化光门控离子通道的核苷酸序列或与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述编码去极化光门控离子通道的核苷酸序列功能性连接到导致视网膜光受体中所述去极化光门控离子通道的特异性表达的启动子，所述核酸分子用于治疗或改善失明。本发明还涉及使用这种核酸分子治疗失明的方法。

Description

通过靶向光受体治疗失明的新型治疗工具和方法
发明领域
本发明涉及治疗失明的方法。本发明还涉及用于治疗失明的构建体，以及它们在制造用于治疗失明的药物中的用途。
背景技术
失明是造成世界上数百万人残疾的主要健康问题。失明的最常见成因之一是视网膜的功能障碍。视网膜性失明的三种最常见形式是色素性视网膜炎(RP)、黄斑变性(MD)以及青光眼(G)。在RP和MD中，首要问题是光受体的变性以及随之发生的光敏感性的丧失。因此，需要能够避免与此种光受体变性相关的问题。
一种方法是开发视网膜赝复体，该视网膜赝复体是在眼睛中植入有多达1,000个微小电极的“导盲”芯片。这将具有帮助已经丧失视力的人重获足够的视力以独立活动的潜能，但是电极的数量完全不够提供要获得之高的视力程度或水平。此外，存在与向眼睛中插入外来物相关的问题。
近来，已经分离和/或利用了许多基因，这些基因在表达时可以使细胞对光敏感。在一些情形下，也需要其它非遗传因子来使细胞对光敏感。
Eli在2001年的一个提议是使用菠菜中的含叶绿素的蛋白质来治疗视力丧失。这些蛋白质在捕获入射光的光子能量后释放小的电压。尽管该研究显示出因为在被光照射时产生了电压的实验上的等效物而可将光系统I反应中心引入脂质体并且显示出可行使功能，但是迄今，这还没有显示出在视网膜细胞中有影响。
加州大学伯克利分校(UC Berkeley)的神经生物学家Richard Kramer进行的其它工作着眼于负责光而非电压的钾通道的重新改造，以便允许向通常对光不敏感的脑细胞中插入光活化的开关。然而，必须将该通道突变以便它总是保持开启并且对于光敏感的化学“插头”与该通道相连以便当用长波长UV光照射时，从该通道释放插头，使得钾从通道外流。较长波长的光造成插头插回到通道中并使钾的释放停止。然而应理解的是，这样的系统是极其复杂的并且如果将该通道送至错误的视网膜细胞类型，那么很可能引起问题。
Bi等人(Neuron,50,2006,第23-33页)公开了微生物型视紫红质用于使光受体变性的小鼠回复视觉反应。然而，视紫红质基因的表达很可能在眼睛中的多种类型的细胞中发生，这可能是不想要的和/或有问题的。产生反应所需的临界光强度似乎也比用于正常视杆和视椎光受体的要高很多，但是没有教导这将如何在诸如低亮度环境下工作。
本发明的一些发明人已经在WO-A-2008/022772中描述了替代的方法，其中，例如，将视紫红质通道蛋白-2靶向诸如ON-细胞。然而，这一方法存在对于OFF细胞不理想的缺点。
发明内容
在进一步的研究中，本发明人认识到视网膜光受体中去极化光敏分子的表达对于例如，视力恢复可以非常有用。尽管在通常需要超极化激活的视网膜光受体中表达去极化光敏分子是有悖常理的，但本发明人发现这种表达是令人惊讶的有用的，并且不仅出人意料地发挥作用，而且还可以允许在视力恢复方法期间使用例如外源性光敏分子在离散视网膜细胞中的表达来调整总体视网膜响应。此外，发明人还发现，在疾病状态下，与健康的视网膜光受体相比，视网膜光受体的极化不总是反映正常状态，并且在一些情况下甚至可以被反转。
因此，本发明包括分离的核酸分子，其包含编码去极化光门控离子通道的核苷酸序列或与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列，用于治疗或改善失明，所述核苷酸序列功能性连接到导致所述去极化光门控离子通道在视网膜光受体中特异性表达的启动子。去极化光门控离子通道可以是通道视紫红质，例如通道视紫红质-2或其变体。
本发明的分离的核酸分子可以具有导致所述去极化光门控离子通道在视网膜光受体中表达的启动子，其选自人视紫红质启动子、人红视蛋白启动子、红锥视蛋白启动子、arr3启动子(mCAR)、Grm6启动子、Fabp7(trunc)(SEQ ID NO：1)、Gnat2_500(SEQ ID NO：2)、Gnat2_2kb(SEQ ID NO：3)、Arr3_2kb(SEQ ID NO：4)、TF_ZFHX3SEQ ID NO：5)和TF_GSH2(SEQ ID NO：6)。
在本发明中，视网膜光受体细胞可以是杆和/或锥。
本发明还包括分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的核酸序列或由其组成，或由与所述SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的序列分别具有至少90％的同一性的至少200bp的核酸序列组成，其中所述分离的核酸分子特异性地导致基因在编码所述基因的核酸序列有效连接到所述分离的核酸分子时，在视网膜光受体中的表达。
本发明还包括含有本发明的上述核酸的重组载体。
本发明还包括含有本发明载体的宿主细胞。
本发明还包括包含本发明的分离的核酸，重组载体或宿主细胞的试剂盒。
本发明还包括治疗失明的方法，其特征在于将本发明的分离的重组载体或细胞施用给有需要的患者。在所述治疗失明的方法中，施用可以通过视网膜下注射进行。
附图说明
图1：CatCh诱导ON响应。全视野，白光多电极阵列RGC录制。以每秒每平方厘米有效光子表示的光强度。n＝263个神经元。
发明的详细描述
本发明人认识到视网膜光受体中去极化光敏分子的表达对于例如，视力恢复可以非常有用。尽管在通常需要超极化激活的视网膜光受体中表达去极化光敏分子是有悖常理的，但本发明人发现这种表达是令人惊讶的有用的，并且不仅出人意料地发挥作用，而且还可以允许在视力恢复方法期间使用例如外源性光敏分子在离散视网膜细胞中的表达来调整总体视网膜响应。此外，发明人还发现，在疾病状态下，与健康的视网膜光受体相比，视网膜光受体的极化不总是反映正常状态，并且在一些情况下甚至可以被反转。
因此，本发明包括分离的核酸分子，其包含编码去极化光门控离子通道的核苷酸序列或与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列，用于治疗或改善失明，所述核苷酸序列功能性连接到导致所述去极化光门控离子通道在视网膜光受体中特异性表达的启动子。去极化光门控离子通道可以是通道视紫红质，例如通道视紫红质-2或其变体。
本发明的分离的核酸分子可以具有导致所述去极化光门控离子通道在视网膜光受体中表达的启动子，其选自人视紫红质启动子、人红视蛋白启动子、红锥视蛋白启动子、arr3启动子(mCAR)、Grm6启动子、Fabp7(trunc)(SEQ ID NO：1)、Gnat2_500(SEQ ID NO：2)、Gnat2_2kb(SEQ ID NO：3)、Arr3_2kb(SEQ ID NO：4)、TF_ZFHX3SEQ ID NO：5)和TF_GSH2(SEQ ID NO：6)。
在本发明中，视网膜光受体细胞可以是杆和/或锥。
本发明还包括分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的核酸序列或由其组成，或由与所述SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的序列分别具有至少90％的同一性的至少200bp的核酸序列组成，其中所述分离的核酸分子特异性地导致基因在编码所述基因的核酸序列有效连接到所述分离的核酸分子时，在视网膜光受体中的表达。
本发明还包括含有本发明的上述核酸的重组载体。
本发明还包括含有本发明载体的宿主细胞。
本发明还包括包含本发明的分离的核酸，重组载体或宿主细胞的试剂盒。
本发明还包括治疗失明的方法，其特征在于将本发明的分离的重组载体或细胞施用给有需要的患者。在所述治疗失明的方法中，施用可以通过视网膜下注射进行。
包含本发明的核酸分子的组合物也包含在本发明中。所述组合物可以是药学可接受的组合物。
“视网膜光受体”包括杆和锥。视网膜可以被看作是一个并行图像处理器，通过光受体马赛克(mosaic of photoreceptors)获取图像，并从获取的图像中提取各种视觉特征。杆光受体直接对较低强度的光作出响应而锥光受体对较高强度的光作出响应。在并行处理之下的细胞基础结构由局部神经元电路的马赛克组成。视网膜有～20个这样的电路马赛克，自60多种细胞类型建成，它们独立地从视觉世界中提取不同的特征。每个马赛克都有相关联的输出细胞的马赛克，该输出细胞即神经节细胞，其将计算的特征传递给更高级的大脑中心。视网膜中的每个锥连接至约10种类型的锥双极细胞，并且这些双极细胞中的每一个都连接至几种类型的神经节细胞。锥、双极细胞和神经节细胞使用兴奋性神经递质谷氨酸进行通信。锥和双极细胞之间的通信被抑制性水平细胞改变，并且双极细胞和神经节细胞之间的通信被多种多样的抑制性无长突细胞修饰。锥通过降低其膜电压来响应光；即它们超极化。一半的锥双极细胞也超极化(OFF细胞)，而另一半增加其膜电压，当光强度增加时去极化(ON细胞)。神经节细胞响应的极性由它们双极细胞(自其它们接收输入)的极性决定。每个杆都连接到被称为杆双极细胞的特殊双极细胞类型。杆双极细胞与所谓的AII无长突细胞“交谈”，然后向ON锥双极细胞的轴突终端提供兴奋性输入，并向OFF锥双极细胞终端提供抑制性输入。杆(光受体)被光超极化，而杆双极细胞和AII无长突细胞去极化：因此这些细胞是ON细胞。视网膜细胞以马赛克排列，覆盖整个视网膜。马赛克排列的唯一例外是在一些灵长类动物和一些掠食性鸟类和爬行动物中视网膜的特殊区域。这个区域被称为凹(fovea)，并且是锥密度最高的地方。人的凹也称为黄斑(macula)，在其中心没有杆，并且唯一以马赛克方式组织的细胞室是锥外段。凹锥细胞体彼此顶部堆叠，而所有其他细胞类型的细胞体被洗到一侧，形成细胞体的同心环。
“失明”意指完全或部分的视力丧失。通常，该药物可用于治疗与黄斑变性、青光眼和/或色素性视网膜炎相关的失明。然而，应理解可使用该药物治疗任何导致眼睛中光受体变性或无功能的疾病或病症。此外，不希望受任何理论限制，相信在光受体功能丧失但光受体-双极突触可能仍旧完整时，本发明将尤其对于治疗在视网膜变性(rd)早期的失明是有效的。
“去极化光门控离子通道的活性片段”是这样的片段，当其表达时产生仍旧能够作为光捕获分子发挥功能的多肽，其造成随后的离子流出该通道所定位的细胞以及由此的电压改变。
“超极化”意指细胞膜电位的降低(变得更负)。“去极化”意指细胞膜电位的增加(变得更正)。
应理解，本发明也延及通过向罹患失明的患者给予根据本发明的DNA构建体来治疗性地治疗失明的方法，该DNA构建体包括去极化光门控离子通道基因序列或其活性片段，该基因序列或其片段能够在视网膜细胞中表达一或多拷贝的去极化光门控离子通道蛋白，从而所述一或多拷贝的去极化光门控离子通道蛋白的表达导致细胞光敏感性以便能够治疗或改善失明。
通常，本发明的去极化光门控离子通道基因序列或其片段可以以包括所述光门控离子通道基因序列或其活性片段的重组分子的形式给予受试者，所述光门控离子通道基因序列或其活性片段在适当的转录/翻译控制下以允许所述去极化光门控离子通道蛋白在给予受试者的视网膜细胞时表达。应理解，该去极化光门控离子通道序列或其片段可处于适当启动子，如组成型和/或可控启动子的控制下。
本发明因此也提供包括去极化光门控离子通道基因序列或其活性片段的本发明重组分子以用于治疗。该重组分子可为质粒、噬粒或病毒载体的形式。另外，可生产重组表达的或化学合成的去极化光门控离子通道蛋白，或者其功能上重要的片段并将它通过适当的软膏或其他药学介载体施用于眼睛作为治疗或预防措施来治疗前述疾病。
用于基因疗法的许多不同的病毒和非病毒载体以及它们的递送方法是已知的，例如腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒(lentiviral vectors)载体、疱疹病毒载体、脂质体、裸露的DNA给药等。Wright教导了用于将基因递送到期望的眼睛细胞中的可能技术的详细综述(Br J Ophthalmol,1997；81:620-622)。此外，例如，也可使用由Neurotech开发的微囊化细胞技术。
光门控离子通道基因可以是视紫红质基因，该视紫红质例如来自微生物的视紫红质，例如单胞藻，通常来自衣藻属(Chlamydononas)物种，特别是莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)。优选的视紫红质是视紫红质通道蛋白-2(ChR2)，其是来自莱茵衣藻的光门控阳离子通道，参见例如Boyden等人，2005(Nature Neuroscience,8,9；1263-1268)和WO-A-2003/084994。通道视紫红质-2的变体也非常适合于本发明。这种y变体的实例是ChR2的L132C突变体CatCh，(Nat Neurosci.2011Apr；14(4):513-8.doi:10.1038/nn.2776.Ultralight-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeablechannelrhodopsin CatCh.Kleinlogel S1,Feldbauer K,Dempski RE,Fotis H,Wood PG,Bamann C,Bamberg E.)
要被给予药物或载体的视网膜光受体可能丧失其光敏感性，但是通常未“死”并且可以用于表达去极化光门控离子通道基因。此外，去极化光门控离子通道基因在光受体中的表达可阻止变性或显示降低的变性。
应理解的是，优选本发明的光门控离子通道基因的表达以细胞特异性启动子的方式被控制。因此，细胞特异性启动子可用于确保该光门控离子通道基因只在特异的细胞类型中表达。
去极化光门控离子通道蛋白一旦在适当的视网膜细胞中表达，就插入细胞的质膜中，导致细胞对光敏感并且能够响应光而造成离子(阳离子或阴离子)输送。然而，尽管已知由于光受体的适应性质而使视网膜对于非常大范围的光强度是敏感的，但是光门控离子通道或泵可能不能适应并且可能因此只响应于窄范围的光强度。如果是这种情形，那么此种限制可通过使用本领域已知的图像增强器和/或图像转换器来缓解。例如，已用上述方法治疗的患者可佩戴例如安装在眼镜上的图像增强器等。
作为实例，图像增强装置，如Telesensory提供的那些(http:// www.telesensory.com)可与Microvision开发的视网膜扫描装置(RSD)(http:// www.microvision.com/milprod.html)组合，以提供能够直接向视力受损的患者的视网膜递送明亮、增强的图像的头戴式设备(http://www.telesensory.com/home8.html)。简言之，RSD将图像投射到视网膜上以便个体可以观看到大的全动态图像而不需要其他屏幕或监控器。因此，通过将增强的图像直接投射到视力受损的个体的视网膜，可能能改善被认为将失明的那些人的视力。
在视网膜双极或节细胞中表达去极化光门控离子通道的情形下，视网膜的网络处理能力的一些方面可能丧失。例如，如果光激活双极或节细胞，那么可能丧失介导侧抑制的水平细胞。在这些情形下，诸如处理器的视网膜(D.Balya和B.Roska:“Retina model withreal time implementation”,International Symposium on Circuits and SystemsISCAS 2005,Kobe,Japan,May,第5222-5225页，也参见http://www.anafocus.com/和http://www.eutecus.com/)可以与Microvision系统组合。
本领域技术人员将根据在此的教导而显见本发明的这些和其他方面。
为了方便，下面也提供在说明书、实施例、所附权利要求中使用的某些术语和短语的含义。
除非上下文中明确地指出，否则单数形式的“一”、“该”包括复数。
“盐细菌视紫红质”是对于氯离子特异的、光驱动型离子泵，并且存在于被称作“盐细菌”的系统发育上古老的“细菌”(古生菌)中。它是视黄醇(retinylidene)蛋白家族中的7-跨膜蛋白，与光驱动型质子泵细菌视紫红质同源，并且与脊椎动物视紫红质在三级结构上类似(但一级结构不同)，脊椎动物视紫红质是在视网膜中感应光的色素。盐细菌视紫红质也与作为光驱动型离子通道的视紫红质通道蛋白具有序列相似性。盐细菌视紫红质含有必要的光可异构化(light-isomerizable)的维生素A衍生的全反式视黄醛。盐细菌视紫红质是少数晶体结构已知的膜蛋白之一。盐细菌视紫红质同工型可以见于多种盐细菌中，包括盐沼盐杆菌(H.salinarum)和N.pharaonis(NphR)。许多进行中的研究正在探讨这些差异，并且使用它们来分析区分光周期和泵特性。继细菌视紫红质之后，盐细菌视紫红质可能是所研究的最佳的I型(微生物)视蛋白。盐细菌视紫红质视网膜复合体的峰值吸收约为570nm。近来，盐细菌视紫红质已经成为光发生学(optogenetics)中的工具。正如蓝光激活的离子通道视紫红质通道蛋白-2展示了利用蓝光的短脉冲(brief pulse)激活可激发细胞(例如神经元、肌肉细胞、胰脏细胞和免疫细胞)的能力，盐细菌视紫红质展示了利用黄光的短脉冲使可激发细胞沉默的能力。因此，盐细菌视紫红质和视紫红质通道蛋白一起使得多色光激活、沉默以及使神经活性去同步化、产生强有力的神经改造工具盒。已经开发了盐细菌视紫红质的其他变体，例如，增强的NphR(eNphR)。为了本发明的目的，所述变体也包括在“盐细菌视紫红质”的定义中。
“多核苷酸”和“核酸”在此互换使用，都指任何长度的聚合形式的核苷酸，无论是核糖核苷酸或是脱氧核糖核苷酸。因此，这些术语包括但不限于单-、双-、或多-链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包括嘌呤和嘧啶碱基或者其他天然的、化学或生化修饰的、非天然的、或衍生的核苷酸碱基的聚合物。这些术语还包括但不限于包括有内含子序列的mRNA或cDNA。多核苷酸的骨架可以包括糖和磷酸基团(如通常可见于RNA或DNA中)，或者修饰的或取代的糖或磷酸基团。或者，多核苷酸骨架可以包括合成亚基如亚磷酰胺的聚合物，并且因此可以是寡脱氧核苷亚磷酰胺或混合的亚磷酰胺-磷酸二酯寡聚体。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶(uracyl)、其他糖、以及连接基团如氟核糖(fluororibose)和thioate，以及核苷酸支链。核苷酸序列可被非核苷酸组分打断。多核苷酸还可在聚合后被修饰，如通过与标记组分缀合。这一定义中包括的其他类型的修饰是加帽、一或多个天然发生的核苷酸被类似物的取代、以及用于将该多核苷酸连接到蛋白质、金属离子、标记组分、其他核苷酸或固体支持物的手段的引入。术语“多核苷酸”也涵盖肽性核酸、PNA和LNA。多核苷酸还可包括基因组DNA、cDNA或DNA-RNA杂合体。
“序列同一性”指相似性或互补性程度。可能是部分同一性或完全同一性。部分互补序列是至少部分抑制相同序列与靶多核苷酸杂交的序列；提及时使用功能性术语“基本上相同”。可使用杂交检测法(Southern或Northern印迹，溶液杂交等)，在低严谨性条件下检测完全互补序列与靶序列杂交的抑制。基本上相同序列或探针将在低严谨性条件下与完全相同序列或探针竞争和靶序列的结合(即杂交)或者抑制该结合。这并不意味着低严谨性条件是允许非特异性结合；低严谨性条件需要两个序列彼此的结合是特异的(即选择性)相互作用。可通过使用甚至缺乏部分程度的互补性(例如，低于约30％同一性)的第二靶序列来检测非特异性结合的缺失；在没有非特异性结合时，探针将不与该第二非互补靶序列杂交。
就两核酸或多肽序列而言，另一种观察序列同一性的方法包括在比对特定区域的最大一致性时，对两序列中相同的残基的参考。如在此使用，序列同一性百分数意指通过在比较窗中比较两最佳比对序列所测定的数值，其中比较窗中的那部分多核苷酸序列可包括为了两序列最佳比对而相比于参考序列(其不包括添加或缺失)的添加或缺失(即，空位)。该百分数是通过测定在两序列中都出现相同核酸碱基处的位置数来得到匹配位置数，将该匹配位置数除以比较窗中的总位置数并将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
“基因”指包括产生多肽或前体所需的控制和编码序列的多核苷酸序列。多肽可以由全长编码序列或由编码序列的任何部分所编码。基因可由未被打断的编码序列组成或者它可包括由适当的拼接位点所结合的一或多个内含子。此外，基因可在编码或非翻译区含有一或多个可影响表达产物的生物活性或化学结构、表达率或表达控制方式的修饰。此种修饰包括但不限于一或多个核苷酸的突变、插入、缺失以及取代。在这一方面，此种修饰的基因可被称作“天然”基因的“变体”。
“表达”通常指多核苷酸序列经历成功的转录和翻译以便表达出可检测水平的氨基酸序列或蛋白质的过程。在此的某些上下文中，表达指mRNA的生产。在其他上下文中，表达指蛋白质的生产。
“细胞类型”指来自给定来源(例如组织或器官)的细胞或者处于给定分化状态的细胞，或者与给定病理学或遗传组成相关的细胞。
“多肽”和“蛋白质”在此互换使用，都指任何长度的聚合形式的氨基酸，其可包括翻译的、未翻译的、化学修饰的、生化修饰的、和衍生的氨基酸。多肽或蛋白质可为天然发生的、重组的或合成的，或者这些的任何组合。此外，多肽或蛋白质可包括天然发生的蛋白质或肽的片段。多肽或蛋白质可为单分子或可为多分子复合物。另外，此种多肽或蛋白质可具有修饰的肽骨架。该术语包括融合蛋白质，包括与异源氨基酸序列融合的蛋白质，具有异源和同源前导序列，具有或不具有N端甲硫氨酸残基，经免疫标记的蛋白质的融合体，等。
“蛋白质片段”指作为另一蛋白质的一部分的蛋白质。例如，蛋白质片段可包括通过消化从培养细胞分离的全长蛋白质所获得的多肽。在一个实施方式中，蛋白质片段包括至少约6个氨基酸。在另一实施方式中，该片段包括至少约10个氨基酸。在又另一实施方式中，蛋白质片段包括至少约16个氨基酸。
“表达产物”或“基因产物”是生物分子，如蛋白质或mRNA，它是在生物中的基因被转录或翻译或翻译后修饰时所生产的。
“宿主细胞”指微生物，原核生物细胞、真核生物细胞或作为单细胞实体培养的细胞系，其可用作或者已经用作重组载体或者多核苷酸的其他转移物的接受体，并且包括已经被转染的原始细胞的后代。由于天然的、偶然的或故意突变，单细胞的后代可不必与原始亲本在形态学或基因组或总DNA染色体上完全相同。
术语“功能等效物”旨在包括天然基因或病毒的“片段”、“突变体”、“衍生物”、“等位基因”、“杂合体”、“变体”、“类似物”或“化学衍生物”。
“分离的”指处于与多核苷酸、多肽、免疫球蛋白、病毒或宿主细胞天然发生的环境不同环境下的多核苷酸、多肽、免疫球蛋白、病毒或宿主细胞。
“基本上纯化的”指这样的化合物，其从天然环境中移出并且至少约60％不含、至少约65％不含、至少约70％不含、至少约75％不含、至少约80％不含、至少约83％不含、至少约85％不含、至少约88％不含、至少约90％不含、至少约91％不含、至少约92％不含、至少约93％不含、至少约94％不含、至少约95％不含、至少约96％不含、至少约97％不含、至少约98％不含、至少约99％不含、至少约99.9％不含、或至少约99.99％不含、或者更高地不含与其天然相关的其他组分。
“诊断”通常包括受试者对于疾病或病症的易感性的测定、受试者目前是否受到疾病或病症影响的测定、受疾病或病症影响的受试者的预后(例如，转移前或转移性癌症状态、癌症阶段的鉴定，或者癌症对于治疗的反应性)以及therametrics(例如监控受试者状况以提供关于治疗效果或效力的信息)。
“生物样品”涵盖多种获自可用于诊断或监控检测的生物的样品类型。该术语涵盖生物源的血液和其他液体样品、固体组织样品，如活检标本，或者组织培养物或来自该组织培养物的细胞以及其后代。该术语特别涵盖临床样品并且还包括细胞培养物中的细胞、细胞上清物、细胞裂解物、血清、血浆、尿、羊水、生物流体以及组织样品。该术语也涵盖在取得后以任何方式被操作的样品，如用试剂处理、溶解、或富集某些组分。
“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在此互换使用，都指需要诊断、处理或治疗的任何哺乳动物受试者。在一个优选的实施方式中，个体、受试者、宿主或患者是人类。其他受试者可包括但不限于牛、马、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、灵长类和小鼠。
“杂交”指多核苷酸序列通过碱基配对结合互补序列的任何过程。杂交条件可以通过例如，预杂交和杂交溶液中的盐或甲酰胺浓度，或者通过杂交温度来限定，并且是本领域公知的。杂交可以在多种严谨性条件下发生。
“严谨性条件”指探针可与其靶多核苷酸序列杂交而不与其他序列杂交的条件。严谨性条件是序列依赖性的(例如较长序列在较高温度下特异杂交)。通常，严谨性条件被选择为在限定离子强度和pH下比特异序列的溶解温度(Tm)低约5℃。Tm是50％与靶序列互补的探针与该靶序列杂交处于平衡状态下的温度(在限定的离子强度、pH和多核苷酸浓度下)。典型地，对于短探针(例如10至50各核苷酸)，严谨性条件将是在约pH 7.0至约pH8.3下离子浓度至少约0.01至约1.0M钠离子浓度(或其他盐)以及温度至少约30℃。
严谨性条件也可通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。
“生物分子”包括多核苷酸和多肽。
“生物活性”指蛋白质或肽的生物行为和效果。可在细胞水平和分子水平来影响蛋白质的生物活性。例如，可通过在分子水平的改变来影响蛋白质的生物活性。例如，反义寡核苷酸可阻止特定mRNA的翻译，从而抑制由该mRNA所编码的蛋白质的生物活性。此外，免疫球蛋白可结合特定蛋白质并且抑制该蛋白质的生物活性。
“寡核苷酸”指包括例如约10个核苷酸(nt)至约1000nt的多核苷酸序列。用于本发明的寡核苷酸长度为，例如约15nt至约150nt，例如约150nt至约1000nt。寡核苷酸可为天然发生的寡核苷酸或者合成的寡核苷酸。
“修饰的寡核苷酸”和“修饰的多核苷酸”指在所有或任何的碱基、糖部分、核苷酸间磷酸键的天然分子结构的分子水平上，具有一或多个化学修饰的寡核苷酸或多核苷酸，以及在这些位点具有添加的取代基或这些修饰的组合的分子。核苷酸间磷酸键可为磷酸二酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、亚氨酸乙酯(acetamidate)、氨基甲酸酯、硫醚、桥接氨基磷酸酯、桥接亚甲基磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸甲酯、二硫代磷酸酯、桥接硫代磷酸酯或砜核苷酸间键、或3'-3',5'-3'或5'-5'键，以及此种类似键的组合。磷酸二酯键可被取代键所代替，例如硫代磷酸酯、甲氨基、磷酸甲酯、氨基磷酸酯和胍，并且多核苷酸的核糖亚基也可被取代(例如己糖磷酸二酯；肽性核酸)。修饰可为寡核苷酸分子内部的(单个或重复)或者在端部，并且可包括对于分子添加核苷酸间磷酸键，如切割相反链或相关酶或其他蛋白质或者与它们交联的脱氧核糖和磷酸修饰。术语“修饰的寡核苷酸”和“修饰的多核苷酸”也包括对糖部分有修饰的寡核苷酸或多核苷酸(例如，3'-取代的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体)，任意这些寡核苷酸或多核苷酸通过5’到3’键结合在一起。
“生物分子序列”或“序列”指全部或者部分的多核苷酸或多肽序列。
术语“可检测的”指通过本领域熟练技术人员公知的聚合酶链式反应(PCR)、反转录酶(RT)PCR、差异显示和Northern分析的标准技术而可检测的多核苷酸表达类型。类似地，多肽表达类型可通过包括诸如Western印迹的免疫检测法的标准技术而被“检测”。
“靶基因”指通常源自生物样品，为其设计寡核苷酸探针以特异性杂交的多核苷酸。或者将检测靶多核苷酸的存在与否，或者将量化靶多核苷酸的量。靶多核苷酸具有与针对于该靶标的相应探针的多核苷酸序列互补的序列。靶多核苷酸也可指探针所针对的较大多核苷酸的特异子序列或者想要检测其表达水平的整个序列(例如基因或mRNA)。
“靶蛋白”指通常源自生物样品、被蛋白质捕获剂特异杂交或结合的多肽。或者将检测靶蛋白的存在或不存在，或者将量化靶蛋白的量。靶蛋白具有被针对于靶标的相应蛋白质捕获剂所识别的结构。靶蛋白或氨基酸也可指蛋白质捕获剂所针对的较大蛋白质的特异子结构或者想要检测其表达水平的整个结构(例如基因或mRNA)。
“互补”指探针分子与其靶标的相互作用表面的拓扑兼容性或匹配在一起。靶标及其探针可以描述为互补体，并且接触表面特性是彼此互补的。核苷酸或核酸之间，例如双链DNA分子的两条链或者寡核苷酸探针及靶标之间的杂交或碱基配对是互补的。
“标记”指能够或者是直接的或者通过与信号产生系统的一或多个其他成员相互作用而提供可检测的信号的试剂。可直接检测的并且可用于本发明的标记包括荧光标记。特异的荧光团包括荧光素、罗丹明、BODIPY、花青染料等。
术语“融合蛋白”指由两种或更多种多肽构成的蛋白质，它们尽管通常在天然状态下不结合，但是通过它们各自的氨基和羧基末端经肽键而结合在一起以形成一个连续多肽。应理解的是该两种或更多种多肽组分可以直接结合或者通过肽接头/间隔物而间接结合。
术语“正常生理条件”意指在活生物体或细胞内部的典型条件。尽管一些器官或生物体提供极端环境，但是生物体内和细胞内环境一般围绕pH 7变化(即从pH 6.5至pH7.5)，含有水作为主要的溶剂，并且在高于0℃且低于50℃的温度存在。多种盐的浓度取决于用作参考的器官、生物体、细胞或细胞区室。
“BLAST”指Basic Local Alignment Search Tool，它是用于检测匹配给定检索序列的非空位子序列的技术。
“BLASTP”是将氨基酸检索序列与蛋白质序列数据库相比较的BLAST程序。“BLASTX”是将核苷酸检索序列(双链)的六-框概念上的翻译产物与蛋白质序列数据库相比较的BLAST程序。
在GenBank DNA序列输入中使用“cds”来表示编码序列。编码序列是推测编码基因的DNA序列的子序列。
如在此所理解，“共有序列”或“重叠群序列”是一组组装的重叠序列，特别是在本发明的一或多个数据库中的序列之间。
本发明的核酸分子可以通过带有编码相关基因序列的核酸的病毒来生产。该病毒可包括能够控制和/或增强该核酸表达的元件。该病毒可为重组病毒。该重组病毒也可包括其它功能元件。例如，重组病毒可以设计为使该病毒在靶细胞中自主复制。这种情形下，重组病毒可能需要诱导核酸复制的元件。重组病毒也可包括启动子或调控子或增强子以按照需要来控制核酸的表达。可使用组织特异性启动子/增强子元件来调控特异细胞类型中的核酸表达。启动子可为组成型或诱导型的。
“启动子”是通常定位在需要被转录的基因上游(朝向5’区)的DNA区。启动子允许其所控制的基因的适当激活或抑制。在本发明的上下文中，启动子导致光受体中光门控离子通道的特异性表达。“特异性表达”是指至少超过75％的表达目的基因的细胞是所指定的类型，即在本情况下为光受体。适合在视网膜光受体中表达构建体的启动子的例子是人视紫红质启动子(Allocca等人，Novel AAV serotypes efficiently transduce murinephotoreceptors,J Virol.(2007))，人红视蛋白启动子(Nathan等人，Science.1986Apr11；232(4747):193-202)，GRM6启动子，红锥视蛋白启动子，或arr3启动子(mCAR)(Zhu,X.等人，Mouse cone arrestin gene characterization:promoter targets expression to conephotoreceptors.FEBS Letters 524,116-122(2002))。此外，已发现以下启动子适合视网膜光受体中基因的特异性和几乎排他性(超过75％)表达，并且也非常适合于本发明：
天然环境的污染组分是将干扰本发明方法和组合物的物质，并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。通常，将通过至少一个纯化步骤来制备分离试剂。在一个实施方式中，将该试剂纯化为按重量计至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约88％，至少约90％，至少约92％，至少约95％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，至少约99.9％，或者至少约99.99％。
在细胞中“表达”蛋白质意指确保该蛋白质存在于该细胞中，例如出于感兴趣的方法的目的。在众多实施方式中，“表达”蛋白质将包括将包括编码该蛋白质的多核苷酸的转基因导入细胞中，该转基因有效连接启动子以及定位序列，其中该启动子是组成型启动子，或者在建立了足以用于诱导的条件的诱导型启动子。然而，例如，可以使用天然表达目的蛋白质而不用操作的细胞并且这被认为是“表达”蛋白质。对于本发明，“视网膜光受体中的去极化光门控离子通道的特异性表达”是指去极化光门控离子通道仅在视网膜光受体中表达(超过75％)。重要的是要注意，在许多不同的细胞中表达可能会导致矛盾的信号，相互消减。
“荧光探针”指任何在被另一波长的光所激活时，具有发射某一波长的光的能力的化合物。
“荧光性”指荧光信号的任何可检测的特性，包括强度、光谱、波长、细胞内分布等。
“检测”荧光性指使用定性或定量的方法来评估细胞的荧光性。例如，使用定量手段，如测量荧光强度、光谱或细胞内分布来测定荧光性，使得允许对在不同条件下获得的数值进行统计学比较。该水平也可以通过使用定性方法来测定，例如通过人对多个样品的视觉分析和比较，该样品例如使用荧光显微镜或其它光学监测器(如图像分析系统等)所检测。荧光性的“改变”或“调节”指在特定条件下，相比于另一条件的荧光的强度、细胞内分布、光谱、波长或其他方面的任何可检测的差异。例如，“改变”或“调节”是定量检测的，并且该差异是统计学上显著的差异。荧光性的任何“改变”或“调节”可以使用标准仪器如荧光显微镜、CCD、或任何其它荧光检测器来检测，并且可以使用自动化系统，如集成系统来检测，或者可以通过人观察者来反映改变的主观检测。
以“均质形式”进行的检测意指该检测可以在单个容器中进行，而不需要操作或纯化任何测定该检测的结果所需的组分，例如，可以向检测体系中添加检测试剂并且直接测量任何效果。通常，此种“均质形式”检测法将包括至少一个在检测试剂存在或不存在下“被淬灭的”或者被修饰的组分。
在细胞中表达异源蛋白的方法是本领域技术人员公知的并且描述于例如，Ausubel(1999),Guthrie and Fink(1991),Sherman等人(1982)Methods in YeastGenetics,Cold Spring Harbor Laboratories,Freshney，以及其它。典型地，在此种实施方式中，将编码目的异源蛋白质的多核苷酸有效地连接到用于特定宿主细胞的适当表达控制序列上，其中该异源蛋白在该宿主细胞中表达。此种方法可以使用大量公知的启动子中的任意。启动子的选择将取决于要实现的表达水平以及想要的细胞特异性。其他元件如聚腺苷酸化信号，5’和3’非翻译序列等也描述于公知的参考书中。
在后生生物(具有由分化成组织和器官的细胞所组成的机体的动物)细胞中，用于表达异源蛋白的启动子和其他元件是普遍使用的并且是熟练技术人员公知的。参见，例如Cruz & Patterson(1973)Tissue Culture,Academic Press；Meth.Enzymology 68(1979),Academic Press；Freshney，第三版(1994)Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechniques,Wiley-Liss。用于此种细胞的启动子和控制序列包括，例如普遍使用的来自猿猴病毒40(SV40)的早期和晚期启动子，或者其他病毒启动子，如来自多瘤病毒、腺病毒2、牛乳头瘤病毒或者鸟类肉瘤病毒，疱疹病毒家族(如巨细胞病毒、单纯性疱疹病毒、或EB病毒)的那些，或者免疫球蛋白启动子和热休克蛋白启动子(参见，例如，Sambrook,Ausubel,Meth.Enzymology Pouwells，等人，上文(1987))。此外，可以使用受调控的启动子，如金属硫蛋白(即，MT-1和MT-2)，糖皮质激素，或抗生素基因“开关”。也可以使用此种启动子的增强子区。
通常将表达盒导入载体中，该载体促进表达盒进入宿主细胞并维持表达盒在宿主细胞中的表达。此种载体被普遍使用并且是本领域技术人员公知的。许多的此种载体是市售可得的，例如来自Invitrogen，Stratagene，Clontech等，并且描述于许多指南中，如Ausubel，Guthrie，Strathem，或Berger，都在上文。此种载体通常包括启动子、聚腺苷酸化信号等，结合有多克隆位点，以及其他元件如复制起点，选择标记基因(例如LEU2、URA3、TRP1、HIS3、GFP)，着丝粒序列等。
对于在哺乳动物细胞中的表达，可以使用多种载体中的任一种，例如pSV2、pBC12BI、和p91023，及lytic病毒载体(例如，痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒)，游离型病毒载体(例如，牛乳头瘤病毒)，以及逆转录病毒载体(例如，鼠科逆转录病毒)。
如在此使用，术语“病症”指病症、疾病、小病、临床症状、或病理症状。
如在此使用，术语“可药用运载体”指不干扰活性成分的生物学活性的效力的运载体介质是化学惰性的，并且对于其所给予的患者没有毒性。
如在此使用，术语“可药用衍生物”指试剂的任何同源物、类似物或片段，例如使用本发明筛选方法所鉴定的对于受试者相对无毒性。
术语“治疗剂”指任何帮助预防或治疗病症或病症并发症的分子、化合物或治疗物。
可制备、封装并标记组合物用于治疗，该组合物包括在兼容的药学运载体中配制的试剂。
如果复合物是水溶性的，那么它可在适当的缓冲液中配制，例如磷酸盐缓冲的生理盐水或其他生理学兼容的溶液。
或者，如果得到的复合物在水性溶剂中具有较差的溶解性，那么它可以与非离子表面活性剂如Tween，或聚乙二醇一起配制。因此，可配制该化合物和它们生理学可接受溶质以通过吸入或吹入(经口或鼻)给药或者口服、口腔、非经肠道、直肠给药，或者在肿瘤的情形下，直接注射实体瘤。
对于口服给药，药物制剂可为液体形式，例如溶液、浆液或悬液，或者可作为药物产品存在以在使用前与水或其他适当介载体重构。此种液体制剂可通过常规手段用可药用添加剂来制备，所述可药用添加剂如悬浮试剂(如山梨醇浆，纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化试剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性介载体(如杏仁油、油脂或分馏的植物油)；以及防腐剂(例如甲基或丙基-p-羟苯甲酸酯或山梨酸)。例如，药学组合物可采用片剂或胶囊的形式，所述片剂或胶囊通过常规手段用可药用赋形剂来制备，所述药学赋形剂例如粘合剂(如预胶化的玉米淀粉，聚乙烯基吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(如硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(如马铃薯淀粉或羧甲淀粉钠)；或湿润剂(如十二烷基硫酸钠)。可用本领域公知的方法为片剂包衣。
该化合物可配制用于通过注射的非经肠道给药，例如，通过快速推注注射或者连续灌注。用于注射的制剂可以单位剂量形式存在于，例如安瓿或多剂量容器中，它们具有加入的防腐剂。
该组合物可采用悬剂、溶剂或在油性或水性介载体中的乳剂的形式，并且可含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可为粉剂形式以在使用前与适当的介载体如灭菌无热原水一起构成。
该化合物也可配制作为局部应用，例如乳霜或乳液。
除了前述制剂，该化合物也可配制成药性持久的制剂(depot preparation)。此种长效制剂可通过埴入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射给予。
因此，例如，该化合物可与适当的聚合材料或疏水材料一起配制(如配制成在可接受油中的乳剂)或与离子交换树脂一起配制，或作为略溶的衍生物，例如作为略溶的盐。脂质体和乳剂是用于亲水药物的递送介载体或运载体的公知实例。
需要时，该组合物可在封装或分散装置中存在，该装置可含有一或多个含活性成分的单位剂量形式。例如，该封装可包括金属或塑料箔，例如水泡眼包装。该封装或分散装置可带有用于给药的说明书。
本发明也提供用于进行本发明治疗方案的试剂盒。此种试剂盒在一或多个容器中包括治疗或预防上有效量的可药用形式的组合物。
在试剂盒的小瓶中的组合物可为可药用溶液的形式，例如，组合灭菌生理盐水，葡萄糖溶液或缓冲溶液或其他可药用灭菌流体。或者，复合物可为冻干的或脱水的；在这种情况下，该试剂盒任选地还在容器中包括可药用溶液(例如生理盐水、葡萄糖溶液等)，优选为灭菌的，以重构该复合物而形成用于注射目的的溶液。
在另一个实施方式中，试剂盒还包括针或注射器，优选地以灭菌形式封装用于注射该复合物，和/或包括封装的醇布。任选地包括说明书用于临床医生或患者进行组合物给药。
除非另有定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述领域熟练技术人员通常理解一致的含义。尽管与在此所述那些相似或等效的方法和材料可以用于实践或检测本发明，但是下面描述了适当的方法和材料。在有冲突的情形下，本说明书包括定义将约束。此外，所述材料、方法和实施例仅仅是说明性的并且并不旨在限制本发明。
实施例
通过使用细胞特异性启动子小鼠锥抑制蛋白3(mCar)(Busskamp，2010)完成来自rd1小鼠(rd1突变纯合的小鼠具有早期发病的严重视网膜变性)的锥中CatCh的靶向表达。这在早先示出为有选择性地驱动高百分比的rd1锥表达(Busskamp，2010)。将与增强型绿色荧光蛋白EGFP融合的CatCh包装在AAV内并注射到rd1小鼠的视网膜下空间。所有小鼠注射都在P28和P39之间进行。在整个研究中使用仅表达EGFP的AAV作为对照。在多电极阵列(MEA)上测量CatCh转染的rd1锥体向下游视网膜神经节细胞(RGC)(视网膜的输出神经元)传达信息的能力。全视野白光CatCh MEA记录在P79-P114之间进行。在CatCh转导的视网膜中，可观察到从每秒每cm 2的10(15)个有效光子开始的、瞬时的和持续的、稳健的RGC ON响应。响应在光强度的四个对数单位中持续。在注射了对照仅EGFP病毒的rd1小鼠中没有引起光响应。
因此锥不仅可以响应光经由例如盐细菌视紫红质而超极化，模拟天然超极化视蛋白响应。如果CatCh靶向rd1锥，那么它也可以响应光而去极化。
光受体的下游，视网膜分离成两个平行的信息通道。ON双极和ON神经节细胞通过光的增量被激活，并经由标志翻转突触连接到锥体。OFF双极和OFF神经节细胞通过光的减量被激活并且被连接到具有标志保守突触(sign conserving synapses)的锥。由于CatCh转导的光受体现在响应于光而去极化，所以ON通路将响应于光而超极化并且将保持沉默，而OFF通路将去极化并将引起ON响应。
为了证明去极化光受体能够经由ON和OFF电路两者中的反转将信息传递给神经节细胞，本发明人通过将转基因利用组成型鸡β肌动蛋白(CBA)启动子导入到野生型小鼠视网膜中，诱导它们的视网膜变性。在视网膜下注射AAV2/8-CBA-DIO-InhA-2A-EGFP盒10天后，野生型小鼠的视网膜显示几乎完全的视蛋白。锥抑制蛋白标记显示锥形态的改变。内部部分看起来缩短了，最终完全消失；锥不再位于相同的光受体层平面，并且随着时间的推移，锥细胞体大小明显增加。当野生型小鼠是P36时，发明人继续共同注射这种这一有毒的具有CatCh的CBA盒。全视野白光MEA记录在P61-P73之间进行。在MEA记录过程中，ON和OFF神经节细胞响应均是可见的。

Claims (10)

1.一种分离的核酸分子，包含编码去极化光门控离子通道的核苷酸序列或与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述编码去极化光门控离子通道的核苷酸序列功能性连接到导致所述去极化光门控离子通道在视网膜光受体中特异性表达的启动子，所述核酸分子用于治疗或改善失明。
2.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述去极化光门控离子通道是通道视紫红质，例如通道视紫红质-2或其变体。
3.权利要求1或2中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述导致所述去极化光门控离子通道在视网膜光受体中表达的启动子选自人视紫红质启动子，人红视蛋白启动子，红锥视蛋白启动子，arr3启动子(mCAR)，Grm6启动子(SEQ ID NO：1)，Fabp7(trunc)(SEQ ID NO:1)，Gnat2_500(SEQ ID NO:2)，Gnat2_2kb(SEQ ID NO:3)，Arr3_2kb(SEQ ID NO:4)，TF_ZFHX3(SEQ ID NO:5)和TF_GSH2(SEQ ID NO:6)。
4.前述权利要求中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述视网膜光受体是杆和/或锥。
5.一种分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的核酸序列或由其组成，或由与SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的所述序列分别具有至少90％同一性的至少200bp的核酸序列组成，其中当编码在视网膜光受体中的基因的核酸序列与所述分离的核酸分子有效连接时，所述分离的核酸分子特异性地导致所述基因的表达。
6.包含权利要求1至5中任一项所述的核酸的重组载体。
7.包含权利要求6的载体的宿主细胞。
8.一种试剂盒，包含根据权利要求1至5中任一项所述的分离的核酸，根据权利要求6所述的重组载体或根据权利要求7所述的宿主细胞。
9.一种治疗失明的方法，其特征在于对有需要的患者施用根据权利要求1至5中任一项的分离的核酸，根据权利要求6的重组载体或根据权利要求7的细胞。
10.权利要求9所述的治疗失明的方法，其中所述施用是通过视网膜下注射进行。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112930200A (zh) * 2018-10-25 2021-06-08 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 用于视网膜神经节细胞中特异表达基因的启动子SynP151(ProC29)
CN113316643A (zh) * 2019-01-24 2021-08-27 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 用于使基因在视网膜神经节细胞中特异性表达的启动子SynP35(ProC8)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2271369E (pt) 2008-04-18 2014-07-10 Novartis Forschungsstiftung Novas ferramentas terapêuticas e métodos para tratar a cegueira
EP3289090B1 (en) 2015-04-30 2019-06-26 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Promoter for the specific expression of genes in müller cells
WO2017046084A1 (en) 2015-09-15 2017-03-23 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Novel therapeutical tools and methods for treating blindness by targeting photoreceptors
ES2881782T3 (es) 2015-10-14 2021-11-30 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Res Promotor para la expresión específica de genes en células endoteliales retinianas.
EP3384033B1 (en) 2015-12-03 2021-09-08 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Synp160, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors
US10898586B2 (en) 2015-12-03 2021-01-26 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research SynP161, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors
JP7075341B2 (ja) 2015-12-03 2022-05-25 フリードリッヒ ミーシェー インスティトゥート フォー バイオメディカル リサーチ ＳｙｎＰ１６２、桿体光受容器における遺伝子の特異的発現のためのプロモーター
WO2017093931A1 (en) 2015-12-03 2017-06-08 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp159, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors
AU2017354086C1 (en) 2016-11-02 2021-05-06 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research SynP198, a promoter for the specific expression of genes in direction selective retinal ganglion cells
WO2018146588A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp88, a promoter for the specific expression of genes in retinal ganglion cells
CN111726985B (zh) 2017-11-15 2022-06-10 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 灵长类动物视网膜色素上皮细胞特异性启动子
AU2018376259A1 (en) 2017-11-30 2020-06-11 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research SynPIII, a promoter for the specific expression of genes in retinal pigment epithelium
EP3914300A1 (en) * 2019-01-24 2021-12-01 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Synp66 (proa21), a promoter for the specific expression of genes in retinal ganglion cells
US20220119841A1 (en) * 2019-01-24 2022-04-21 Friedrich Miescher Instit for Biomedical Research Synp5 (proa9), a promoter for the specific expression of genes in retinal ganglion cells
WO2020152626A1 (en) * 2019-01-24 2020-07-30 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp166 (proa36), a promoter for the specific expression of genes in photoreceptors
WO2024033837A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Institute Of Molecular And Clinical Ophthalmology Basel (Iob) Human cone photoreceptor optogenetic constructs

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009127705A1 (en) * 2008-04-18 2009-10-22 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Novel therapeutical tools and methods for treating blindness
WO2013068413A1 (en) * 2011-11-08 2013-05-16 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Rod cell-specific promoter
WO2014199299A1 (en) * 2013-06-11 2014-12-18 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Retinal on bipolar cells-specific artificial promoter

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001088188A2 (en) * 2000-05-18 2001-11-22 Nihon University, School Juridical Person Method for examining ischemic conditions
DE10216005A1 (de) 2002-04-11 2003-10-30 Max Planck Gesellschaft Verwendung von biologischen Photorezeptoren als direkt lichtgesteuerte Ionenkanäle
EP1891976A1 (en) 2006-08-23 2008-02-27 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Use of light sensitive genes
EP2655621B1 (en) * 2010-12-20 2018-05-23 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding rnas
US9579399B2 (en) 2012-08-27 2017-02-28 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Retinal OFF circuit-specific promoter
EP3104895A1 (en) 2014-02-10 2016-12-21 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Aii retinal amacrine cell-specific promoter
ES2748282T3 (es) 2014-02-11 2020-03-16 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Res Promotor específico de células de Müller
GB201403260D0 (en) * 2014-02-25 2014-04-09 Univ Manchester Treatment of retinal degeneration using gene therapy
EP3289090B1 (en) 2015-04-30 2019-06-26 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Promoter for the specific expression of genes in müller cells
WO2017046084A1 (en) 2015-09-15 2017-03-23 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Novel therapeutical tools and methods for treating blindness by targeting photoreceptors
ES2881782T3 (es) 2015-10-14 2021-11-30 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Res Promotor para la expresión específica de genes en células endoteliales retinianas.
US10898586B2 (en) 2015-12-03 2021-01-26 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research SynP161, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors
JP7075341B2 (ja) 2015-12-03 2022-05-25 フリードリッヒ ミーシェー インスティトゥート フォー バイオメディカル リサーチ ＳｙｎＰ１６２、桿体光受容器における遺伝子の特異的発現のためのプロモーター
EP3384033B1 (en) 2015-12-03 2021-09-08 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Synp160, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors
WO2017093931A1 (en) 2015-12-03 2017-06-08 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp159, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors
AU2016363830C1 (en) 2015-12-04 2022-03-24 Centre National De La Recherche Scientifique Promoters and uses thereof
US20190209708A1 (en) 2016-05-17 2019-07-11 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Novel therapeutic tools and methods for treating blindness
AU2017354086C1 (en) 2016-11-02 2021-05-06 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research SynP198, a promoter for the specific expression of genes in direction selective retinal ganglion cells
EP3548094A1 (en) 2016-12-01 2019-10-09 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Synpi, a promoter for the specific expression of genes in interneurons
WO2018099974A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp107, a promoter for the specific expression of genes in interneurons
WO2018146588A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp88, a promoter for the specific expression of genes in retinal ganglion cells
CN111726985B (zh) 2017-11-15 2022-06-10 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 灵长类动物视网膜色素上皮细胞特异性启动子
AU2018376259A1 (en) 2017-11-30 2020-06-11 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research SynPIII, a promoter for the specific expression of genes in retinal pigment epithelium
KR20200091435A (ko) 2017-11-30 2020-07-30 프리드리히 미셔 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치 영장류 망막 색소 상피 세포-특이적 프로모터 SynP61
EP3870242A1 (en) 2018-10-25 2021-09-01 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Synp151 (proc29), a promoter for the specific expression of genes in retinal ganglion cells
US20210388386A1 (en) 2018-10-25 2021-12-16 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp57 (proa14), a promoter for the specific expression of genes in photoreceptors
WO2020084542A1 (en) 2018-10-25 2020-04-30 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp194 (prob15), a promoter for the specific expression of genes in retinal ganglion cells
JP2022505516A (ja) 2018-10-25 2022-01-14 フリードリッヒ ミーシェー インスティトゥート フォー バイオメディカル リサーチ 網膜神経節細胞中の遺伝子の特異的発現のためのプロモーターＳｙｎＰ１７（ＰｒｏＢ１）
CN112930201A (zh) 2018-10-25 2021-06-08 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 用于视网膜神经节细胞中特异表达基因的启动子SynP78(ProA27)
EP3870709A1 (en) 2018-10-25 2021-09-01 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Synp27 (prob12), a promoter for the specific expression of genes in protoplasmic astrocytes
WO2020152626A1 (en) 2019-01-24 2020-07-30 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp166 (proa36), a promoter for the specific expression of genes in photoreceptors
US20220119841A1 (en) 2019-01-24 2022-04-21 Friedrich Miescher Instit for Biomedical Research Synp5 (proa9), a promoter for the specific expression of genes in retinal ganglion cells
EP3914300A1 (en) 2019-01-24 2021-12-01 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Synp66 (proa21), a promoter for the specific expression of genes in retinal ganglion cells
CN113316643A (zh) 2019-01-24 2021-08-27 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 用于使基因在视网膜神经节细胞中特异性表达的启动子SynP35(ProC8)
SG11202108044YA (en) 2019-02-25 2021-09-29 Novartis Ag Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy
CN113474461A (zh) 2019-02-25 2021-10-01 诺华股份有限公司 治疗bietti晶体营养不良的组合物和方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009127705A1 (en) * 2008-04-18 2009-10-22 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Novel therapeutical tools and methods for treating blindness
WO2013068413A1 (en) * 2011-11-08 2013-05-16 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Rod cell-specific promoter
WO2014199299A1 (en) * 2013-06-11 2014-12-18 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Retinal on bipolar cells-specific artificial promoter

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SKARNES,W.C.: "Mus musculus targeted non-conditional, lacZ-tagged mutant allele Gnat2:tm1e(EUCOMM)Wtsi; transgenic,GenBank: JN955177.1", 《NCBI GENBANK DATABASE》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112930200A (zh) * 2018-10-25 2021-06-08 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 用于视网膜神经节细胞中特异表达基因的启动子SynP151(ProC29)
CN113316643A (zh) * 2019-01-24 2021-08-27 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 用于使基因在视网膜神经节细胞中特异性表达的启动子SynP35(ProC8)

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Publication number Publication date
US20180256753A1 (en) 2018-09-13
ES2926677T3 (es) 2022-10-27
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US10857241B2 (en) 2020-12-08
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JP6898920B2 (ja) 2021-07-07
US20210085804A1 (en) 2021-03-25
JP2018531004A (ja) 2018-10-25

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