JP6898920B2 - 光受容器のターゲッティングにより失明を治療するための新規な治療用ツールおよび方法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、失明の治療方法に関する。本発明はまた、失明を治療する際に使用するための構築物、ならびに失明治療用の医薬の製造におけるそれらの使用に関する。

発明の背景
失明は、世界中の何百万人もの人々に障害を与える大きな健康問題である。最も多い失明原因の一つに、網膜の機能不全がある。網膜性の失明で最も多いのが、網膜色素変性症（ＲＰ）、黄斑変性（ＭＤ）および緑内障（Ｇ）の３タイプである。ＲＰおよびＭＤにおける主要な問題は、光受容器の変性およびそれに伴う光感受性の喪失である。ゆえに、かかる光受容器の変性に伴う問題の解消を可能にすることに対するニーズが存在する。

１つのアプローチとして、人工網膜（眼内に挿入される１０００本あまりの微小電極を備える「ｓｅｅｉｎｇ ｅｙｅ」チップ）の開発がなされた。これにより、視力を失った人が、自立して行動できる程に視覚を取り戻すのを補助し得ると考えられるが、得られる視力の程度またはレベルを高めるには電極数がただ不足している。更に、異物を眼内に挿入することに関連する問題が存在する。近年、発現した際に細胞を光感受性にするいくつかの遺伝子の単離および／または操作がなされている。場合によっては、細胞を光感受性にするのに更なる非遺伝子的な因子も必要となる。

２００１年には、Ｅｌｉにより、ホウレンソウのクロロフィル含有タンパク質を用いて視力喪失を治療するという１つの提案がなされている。これらのタンパク質は、入射光の光子のエネルギーを捕捉した後で小さな電圧を放出する。該研究では、光化学系Ｉ反応中心はリポソームに組み込むことができ、機能を発揮することが示されているが、光をそこへ照射したときに生じる電圧は実験レベルのものであるため、これまで、これが網膜細胞で機能することが示されることはなかった。

一方、カリフォルニア大学バークレー校の神経生物学者Ｒｉｃｈａｒｄ Ｋｒａｍｅｒによる研究では、電圧よりもむしろ光に反応性を示すカリウムチャネルを再構成して、通常光感受性を有さない脳細胞への光活性化スイッチの挿入を可能にすることに着目している。しかしながら、チャネルは、それが常に開口したままとなり、またチャネルに付着する化学「プラグ」が、長波長の紫外光で照射されたとき、チャネルから放出され、チャネルの外へカリウムを放出させる意味で光感受性となるように、変異させなければならない。より長波長の光により、プラグがチャネルに再度挿入され、カリウムの放出が停止する。しかしながら、そのような系は非常に複雑であり、チャネルが間違ったタイプの網膜細胞に供給された場合、問題が生じ得ると考えられる。

Ｂｉらは、光受容器変性を有するマウスにおいて、微生物由来のロドプシンを用いて視覚応答を回復させることを開示している（Neuron, 50, 2006, p23-33）。しかしながら、ロドプシン遺伝子の発現は、眼内の様々なタイプの細胞で生じると考えられ、望ましくないおよび／または問題となり得る事態が生じ得る。また、応答を生じさせるのに必要な閾値光強度が、通常の桿体および錐体光受容器よりも顕著に高いと考えられ、例えば弱光環境下でこれにいかに対処し得るかについては何ら教示されていない。

その他の方法として、本発明者の一部による国際公開第２００８／０２２７７２号パンフレットでは、例えばチャネルロドプシン−２を用いて、例えばオン細胞をターゲッティングする方法が記載されている。しかしながら、この方法には、オフ細胞ではサブオプティマルな結果となるという欠点が存在する。

発明の概要
更なる研究において、本発明者らは、網膜光受容器における脱分極性光感受性分子の発現が、例えば視力回復に非常に有用であり得ることを知るに至った。網膜光受容器を活性化させるには、通常では過分極が必要であるため、そこで脱分極性光感受性分子を発現させることは常識に反することであるが、本発明者らは、この発現が驚く程有用であり、驚くほど良好に機能するのみならず、例えば、それぞれの網膜細胞内での外生的な感光性分子の発現を用いた視力回復方法において、全体的な網膜応答の調節をも可能にすることを見出した。本発明者は更に、疾患状態においては、網膜光受容器の分極が通常の状態を必ずしも反映せず、健常な網膜光受容器と比較し、場合によっては逆になることさえあり得ることをも見出した。

ゆえに、本発明には、網膜光受容器において脱分極性光駆動性（light-gated）イオンチャネルの特異的な発現をもたらすプロモーターに機能的に連結された、前記脱分極性光駆動性イオンチャネルをコードするヌクレオチド配列または前記ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、失明の治療または改善に用いられる、単離された核酸分子が包含される。脱分極性光駆動性イオンチャネルは、チャネルロドプシン、例えばチャネルロドプシン−２またはその変異体であってもよい。

本発明の単離された核酸分子は、網膜光受容器で前記脱分極性光駆動性イオンチャネルの発現をもたらす、ヒトロドプシンプロモーター、ヒト赤オプシンプロモーター、赤錐体オプシンプロモーター、ａｒｒ３プロモーター（ｍＣＡＲ）、Ｇｒｍ６プロモーター、Ｆａｂｐ７（ｔｒｕｎｃ）（配列番号１）、Ｇｎａｔ２＿５００（配列番号２）、Ｇｎａｔ２＿２ｋｂ（配列番号３）、Ａｒｒ３＿２ｋｂ（配列番号４）、ＴＦ＿ＺＦＨＸ３（配列番号５）およびＴＦ＿ＧＳＨ２（配列番号６）の群から選択されるプロモーターを有してもよい。

本発明では、網膜光受容器細胞は、桿体細胞および／または錐体細胞であり得る。

本発明にはまた、配列番号１、２、３、４、５または６の核酸配列を含むか、もしくはそれからなるか、または、前記配列番号１、２、３、４、５または６のそれぞれの配列と少なくとも９０％の相同性を有する、少なくとも２００ｂｐの核酸配列からなる単離された核酸分子であって、網膜光受容器の遺伝子をコードする核酸配列が、前記単離された核酸分子に作動可能に連結されたとき、前記遺伝子の発現を特異的にもたらす、単離された核酸分子が包含される。

本発明には更に、本発明の上記核酸を含む組換えベクターが包含される。

本発明にはまた、本発明のベクターを含む宿主細胞が包含される。

本発明には更に、本発明の単離された核酸、組換えベクターまたは宿主細胞を含むキットが包含される。

本発明にはまた、本発明の単離された組換えベクターまたは細胞を、失明の治療を必要とする患者に投与することを特徴とする、失明の治療方法が包含される。前記失明の治療方法では、投与は、網膜下注射を通じて行うことができる。

ＣａｔＣｈは、オン応答を誘導する。全視野白色光マルチ電極アレイ（full field, white light multi-electrode array）によるＲＧＣレコーディング。光強度は、ｃｍ²あたり、１秒あたりの有効光子数（effective photons）で表す。ｎ＝２６３ニューロン。

発明の詳細な記載
更なる研究において、本発明者らは、網膜光受容器における脱分極性光感受性分子の発現が、例えば視力回復に非常に有用であり得ることを知るに至った。網膜光受容器を活性化させるには、通常では過分極が必要であるため、そこで脱分極性光感受性分子を発現させることは常識に反することであるが、本発明者らは、この発現が驚く程有用であり、驚くほど良好に機能するのみならず、例えば、それぞれの網膜細胞内での外生的な感光性分子の発現を用いた視力復元方法において、全体的な網膜応答の調節をも可能にすることを見出した。本発明者は更に、疾患状態においては、網膜光受容器の分極が通常の状態を必ずしも反映せず、健常な網膜光受容器と比較し、場合によっては逆になることさえあり得ることをも見出した。

ゆえに、本発明には、網膜光受容器において脱分極性光駆動性イオンチャネルの特異的な発現をもたらすプロモーターに機能的に連結された、前記脱分極性光駆動性イオンチャネルをコードするヌクレオチド配列または前記ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、失明の治療または改善に用いられる、単離された核酸分子が包含される。脱分極性光駆動性イオンチャネルは、チャネルロドプシン、例えばチャネルロドプシン−２またはその変異体であってもよい。

本発明の単離された核酸分子は、網膜光受容器で前記脱分極性光駆動性イオンチャネルの発現をもたらす、ヒトロドプシンプロモーター、ヒト赤オプシンプロモーター、赤錐体オプシンプロモーター、ａｒｒ３プロモーター（ｍＣＡＲ）、Ｇｒｍ６プロモーター、Ｆａｂｐ７（ｔｒｕｎｃ）（配列番号１）、Ｇｎａｔ２＿５００（配列番号２）、Ｇｎａｔ２＿２ｋｂ（配列番号３）、Ａｒｒ３＿２ｋｂ（配列番号４）、ＴＦ＿ＺＦＨＸ３（配列番号５）およびＴＦ＿ＧＳＨ２（配列番号６）の群から選択されるプロモーターを有することができる。

本発明では、網膜光受容器細胞は、桿体細胞および／または錐体細胞であり得る。

本発明にはまた、配列番号１、２、３、４、５または６の核酸配列を含むか、もしくはそれからなるか、または、前記配列番号１、２、３、４、５または６のそれぞれの配列と少なくとも９０％の相同性を有する、少なくとも２００ｂｐの核酸配列からなる単離された核酸分子であって、網膜光受容器の遺伝子をコードする核酸配列が、前記単離された核酸分子に作動可能に連結されたとき、前記単離された核酸分子は、前記遺伝子の発現を特異的にもたらす、単離された核酸分子が包含される。

本発明には更に、本発明の上記核酸を含む組換えベクターが包含される。

本発明にはまた、本発明のベクターを含む宿主細胞が包含される。

本発明には更に、本発明の単離された核酸、組換えベクターまたは宿主細胞を含むキットが包含される。

本発明にはまた、本発明の単離された組換えベクターまたは細胞を、失明の治療を必要とする患者に投与することを特徴とする、失明の治療方法が包含される。前記失明の治療方法では、投与は、網膜下注射を通じて実施できる。

本発明の核酸分子を含む組成物もまた、本発明に包含される。前記組成物は、薬学的に許容できる組成物であってもよい。

「網膜光受容器」は、桿体および錐体を含む。網膜は、並行画像プロセッサーであると考えられ、そこでは光受容器のモザイクを経て画像を取得し、取得した画像から様々な視覚像を抽出する。桿体光受容器は低い強度の光に直接応答し、一方、錐体光受容器は高い強度の光に応答する。並行処理の基礎をなす細胞内インフラストラクチャーは、局所的ニューロン回路のモザイクからなる。網膜は、６０超のタイプの細胞から構築されたそのような回路のモザイクを約２０個有し、それぞれが視野から異なる像を抽出する。各モザイクはそれに連結する出力細胞（神経節細胞）のモザイクを有し、処理された像がより高度な大脳中枢にリレーされる。網膜内の錐体は、各々約１０タイプの錐体双極細胞に連結され、これらの双極細胞は各々数タイプの神経節細胞に連結されている。錐体、双極細胞および神経節細胞は、興奮性の神経伝達物質であるグルタミン酸塩を用いて伝達を行う。錐体と双極細胞との間の伝達は、それを阻害する水平細胞により調節され、双極細胞と神経節細胞との間の伝達は、それを阻害する多種多様なアマクリン細胞により調節される。錐体は、その膜電圧を下げることで光に応答し、すなわち過分極する。錐体双極細胞の半分も過分極化する（オフ細胞）が、残り半分はそれらの膜電圧を増加させ、光強度が増加するときには脱分極する（オン細胞）。神経節細胞の応答極性は、それらが入力を受ける双極細胞の極性により決定される。桿体は、各々、桿体双極細胞と呼ばれる特殊なタイプの双極細胞に連結されている。桿体双極細胞は、いわゆるＡＩＩアマクリン細胞と「交信（talk）」し、次に、オン型錐体双極細胞の軸索末端へ興奮性入力を、またオフ型錐体双極細胞の末端へ抑制性入力を供給する。桿体（光受容器）は、光により過分極する一方、桿体双極細胞およびＡＩＩアマクリン細胞は脱分極し、ゆえにこれらはオン細胞である。網膜細胞はモザイク状に配置され、網膜全体をカバーする。ある種の霊長類、および数種の捕食性の鳥類および爬虫類において、モザイクの配置における唯一の例外として、網膜に特別な領域が存在する。この領域は窩と呼ばれ、錐体密度が最も高い部位である。ヒトの窩（また斑点とも呼ばれる）は、その中心に桿体が存在せず、モザイク状に組織された唯一の細胞区画が錐体外節である。中心窩の錐体細胞体は各々積み重なる一方、他の全てのタイプの細胞体は外側に分布し、細胞体の同心の輪を形成する。

「失明」とは、全体的または部分的な視覚喪失を意味する。黄斑変性、緑内障および／または網膜色素変性症に伴う失明の治療には、典型的に医薬を用いることができる。しかしながら、眼内の光受容器の変性または機能喪失につながるいかなる疾患または症状も、医薬を使用して治療できると考えられる。更に、理論に拘束されないが、本発明は特に網膜変性（ｒｄ）の初期、すなわち光受容器の機能が失われているが光受容器から双極細胞へのシナプスが未だ損なわれていない時期における失明の治療に効果的であると考えられる。

「脱分極性光駆動性イオンチャネルの活性断片」は、発現したときに、光捕捉分子として未だ機能することができ、チャネルが存在する細胞からのその後のイオン流、およびそれに伴う電圧の変化を生じさせるポリペプチドを生成する断片である。

「過分極」とは、細胞の膜電位の低下（より負の電位となること）を意味する。「脱分極」によって、細胞の膜電位の上昇（より正の電位となること）を意味する。

本発明はまた、失明に罹患する患者に、脱分極性光駆動性イオンチャネルの遺伝子配列またはその活性断片を含む本発明に係るＤＮＡ構築物を投与することにより、失明を治療的に処置する方法にも及ぶと考えられ、遺伝子配列またはその断片は、網膜細胞内で脱分極性光駆動性イオンチャネルタンパク質の１つ以上のコピーを発現でき、その結果、前記脱分極性光駆動性イオンチャネルタンパク質の１つ以上のコピーの発現により細胞が光感受性となり、失明の治療または改善が可能となる。

典型的には、本発明の脱分極性光駆動性イオンチャネルの遺伝子配列またはその断片は、適切な転写／翻訳制御下で、前記光駆動性イオンチャネル遺伝子配列または活性断片を含む組換え分子の形態で対象に投与されることにより、対象の網膜細胞に投与されたときに前記脱分極性光駆動性イオンチャネルタンパク質の発現を可能にする。脱分極性光駆動性イオンチャネル配列または断片は、適切なプロモーター、例えば構成的および／または制御可能プロモーターの制御下に置かれ得ると理解される。

ゆえに、本発明はまた、治療用の、脱分極性光駆動性イオンチャネル遺伝子配列またはその活性断片を含む本発明の組換え分子を提供する。組換え分子は、プラスミド、ファージミドまたはウイルスベクターの形態であってもよい。更に、組み換え発現された、または化学合成された脱分極性光駆動性イオンチャネルタンパク質またはその機能的に重要な断片は、前記の疾患の処置のための治療または予防手段として、作製し、適切な軟膏または他の薬剤ビヒクルにより眼に適用することができる。

遺伝子治療に用いられる多様なウイルスベクターおよび非ウイルスベクター、およびそれらの送達方法が公知であり、例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、リポソーム、裸のＤＮＡ投与などが挙げられる。眼の所望の細胞の遺伝子転換において利用可能な技法の詳細な総説が、Ｗｒｉｇｈｔにより教示されている（Br J Ophthalmol, 1997; 81: 620-622）。更に、例えばＮｅｕｒｏｔｅｃｈ社が開発したようなカプセル化細胞技術も利用可能である。

光駆動性イオンチャネル遺伝子は、単細胞藻類などの微生物、典型的にはクラミドモナス（Chlamydomonas）属の種、特にクラミドモナス・ラインハーティ（Chlamydomonas reinhardtii）由来のロドプシンなどのロドプシン遺伝子であってよい。好ましいロドプシンは、Ｃ． ラインハーティ由来の光駆動性カチオンチャネルであるチャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）であり、例えば、Boyden et al 2005 (Nature Neuroscience, 8, 9; 1263-1268）および国際公開第２００３／０８４９９４号パンフレットを参照。チャネルロドプシン−２の変異体もまた、本発明に非常に適する。そのようなｙ変異体の例は、ＣａｔＣｈと称する、ＣｈＲ２のＬ１３２Ｃ突然変異体である（Nat Neurosci. 2011 Apr; 14(4): 513-8. doi: 10.1038/nn.2776. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca²+-permeable channelrhodopsin CatCh. Kleinlogel S1, Feldbauer K, Dempski RE, Fotis H, Wood PG, Bamann C, Bamberg E.）。

医薬またはベクターを投与しようとする網膜の光受容器は、その光感受性を喪失している可能性があるが、通常は「死」んでおらず、脱分極性光駆動性イオンチャネル遺伝子の発現に使用できる。更に、光受容器における脱分極性光駆動性イオンチャネル遺伝子の発現により、変性が予防もしくは遅延され得る。

本発明の光駆動性イオンチャネル遺伝子の発現は、細胞特異的プロモーターにより制御されるのが好ましいと理解される。ゆえに、細胞特異的プロモーターを用いて、光駆動性イオンチャネル遺伝子を特定のタイプの細胞でのみ確実に発現させることができる。

脱分極性光駆動性イオンチャネルタンパク質が適切な網膜細胞内で発現すると、細胞の原形質膜内に挿入され、それにより細胞が光感受性となり、光に応答したイオン（カチオンまたはアニオン）輸送を生じさせることが可能となる。しかしながら、光受容器の適応可能な性質のために、網膜は非常に広い範囲の光強度に対して感受性であることが知られているが、光駆動性イオンチャネルまたはポンプは、適応可能でない場合があり、ゆえに狭い範囲の光強度でのみ応答する場合がある。これが事実ならば、そのような限界は、当分野で公知のイメージインテンシファイア（image intensifier）および／またはイメージコンバータ（image converter）の使用により緩和され得る。例えば、上記の方法による処置を受けた患者は、例えば眼鏡などに装着されたイメージインテンシファイア／エンハンサーを着用すれば良い。

例として、Ｔｅｌｅｓｅｎｓｏｒｙ社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｅｌｅｓｅｎｓｏｒｙ．ｃｏｍ）から提供されるものなどのイメージ増強装置と、Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ．ｃｏｍ／ｍｉｌｐｒｏｄ．ｈｔｍｌ）により開発された網膜スキャン装置（ＲＳＤ）とを組み合わせ、視覚障害の患者の網膜に増強された明瞭なイメージを直接伝送可能な頭部装着型の装置として提供することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｅｌｅｓｅｎｓｏｒｙ．ｃｏｍ／ｈｏｍｅ８．ｈｔｍｌ）。手短に説明すると、ＲＳＤは、スクリーンまたはモニターの追加を要せずに、大きいフルモーションのイメージを個人が視覚できるようにイメージを網膜上に投影する。すなわち、視覚障害を有する個人の網膜に増強されたイメージを直接投影することにより、盲目と考えられる個人の視力を改善することが可能になると考えられる。

網膜の双極細胞または神経節細胞において脱分極性光駆動性イオンチャネルを発現させる場合には、網膜のネットワーク処理能力の一部が損なわれることがあり得る。例えば、光により双極細胞または神経節細胞が活性化された場合、水平細胞が媒介する側方抑制が失われ得る。かかる場合、網膜様プロセッサー（D. Balya and B. Roska: "Retina model with real time implementation", International Symposium on Circuits and Systems ISCAS 2005, Kobe, Japan, May, pp. 5222-5225、ならびにhttp://www.anafocus.com/ および http://www.eutecus.com/を参照）を、マイクロビジョン（Microvision）システムと組合わせることができる。

本発明のこれらの態様および他の態様は、当業者であれば本明細書の教示から自明である。

便宜を図るため、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語および句の意味を、改めて以下に示す。

単数形を示す用語「１つの（a, an）」、および「当該（the）」は、特に断りのない限り、その複数形を含む。

「ハロロドプシン」は、塩化物イオンに特異的な光駆動性イオンポンプであり、好塩菌として知られる、系統学的には「古細菌」（archaea）に存在する。それは、レチニリデンタンパク質ファミリーに属する７回膜貫通型タンパク質であり、光駆動性プロトンポンプであるバクテリオロドプシンと相同であり、また網膜で光を感知する色素である脊椎動物由来のロドプシンとも、三次構造が類似する（但し、一次配列構造は類似しない）。ハロロドプシンはまた、チャネルロドプシン（光駆動性イオンチャネル）とも配列類似性を有する。ハロロドプシンは、光異性化性のビタミンＡ誘導体である全トランス型レチナールを必須として含む。ハロロドプシンは、結晶構造が知られている数少ない膜タンパク質のうちの１つである。ハロロドプシンのアイソフォームは、ハロバクテリウム・サリナラム（H. salinarum）およびナトロノモナス・ファラオニス（N. pharaonis）（ＮｐｈＲ）を含むいくつかの好塩菌の種に存在する。現在の研究では、これらの相違の解析、およびそれを用いた光サイクルおよびポンプ特性の解明が主に行われている。バクテリオロドプシンに続き、ハロロドプシンは、研究されたもののうち、最も優れたＩ型（微生物型）オプシンであると考えられる。ハロロドプシン網膜複合体のピーク吸光度は約５７０ｎｍである。近年では、ハロロドプシンは光遺伝学（optogenetics）のツールとなっている。青色光で活性化されたイオンチャネルであるチャネルロドプシン−２が、短い青色光パルスで興奮性細胞（例えばニューロン、筋細胞、膵細胞および免疫細胞）を活性化する能力を示すように、ハロロドプシンは、短い黄色光パルスで興奮性細胞を鎮静化する能力を示す。すなわち、ハロロドプシンおよびチャネルロドプシンは協働して、多色光による神経活動の活性化、鎮静化および脱同期化を可能にし、ニューロエンジニアリングにおける強力なツールボックスをなす。強化型ＮｐｈＲ（ｅＮｐｈＲ）などのハロロドプシン変異体が更に開発されている。本発明の目的において、前記変異体も、「ハロロドプシン」の定義に含まれる。

本明細書で交換可能に用いられる「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである、ヌクレオチドの任意の長さの重合形態を指す。ゆえに、これらの用語には、限定されないが、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、または、プリンおよびピリミジン塩基または他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。これらの用語には更に、限定されないが、イントロン配列を含むｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドの主鎖は、糖およびリン酸基（典型的にＲＮＡまたはＤＮＡに存在）を含んでもよく、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含んでもよい。あるいは、ポリヌクレオチドの主鎖は、ホスホラミダイトなどの合成サブユニットのポリマーを含んでもよく、ゆえに、オリゴデオキシヌクレオシドのホスホラミデート、またはホスホラミデートとリン酸ジエステルとの混合オリゴマーのいずれでもよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドやヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチド、ウラシル、フルオロリボースおよびチオエートなどの他の糖および連結基、ならびに分岐型ヌクレオチド（nucleotide branches）を含んでもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは重合後に、標識化成分とのコンジュゲーションにより更に修飾されてもよい。本定義中に含まれる他のタイプの修飾として、キャップ付加、ヌクレオチドアナログによる１つ以上の天然ヌクレオチドの置換、ならびに、ポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識化成分、他のポリヌクレオチドもしくは固体担体に付着させるための手段の導入が挙げられる。「ポリヌクレオチド」という用語には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびＬＮＡが包含される。ポリヌクレオチドには更に、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが包含され得る。

「配列同一性」とは、類似性または相補性の程度のことを指す。それは部分的な同一性または完全な同一性であってもよい。部分的に相補的な配列とは、同一の配列が標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するものであり、「実質的に同一である」という機能的表現で表されるものである。標的配列とその完全相補的な配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、低いストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションアッセイ（サザンもしくはノザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション（solution hybridization）など）を用いて検証できる。実質的に同一の配列またはプローブは、低いストリンジェントな条件下で、完全に同一の配列またはプローブの標的配列への結合（すなわちハイブリダゼーション）に対して競合し、それを阻害する。なお、低いストリンジェントな条件とは、非特異的結合がないことまでは意味しないが、低いストリンジェントな条件では、２つの配列による相互の結合が特異的（すなわち選択的）な相互作用であることが必要である。非特異的結合がないことは、相補性の程度が非常に低い（例えば約３０％未満の同一性の）第２の標的配列を用いて試験することができ、非特異的な結合がない場合には、プローブは非相補的な第２の標的配列とハイブリダイズしない。

２つの核酸またはポリペプチド配列に関連する配列同一性を調べる別の方法として、特定の領域において最大限対応するように整列させたときに同じとなる２つの配列中の残基の解析が挙げられる。本明細書中で用いられる配列同一性のパーセンテージは、比較ウインドウ内の最適に整列された２つの配列の比較により測定される値を意味し、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の一部には、２つの配列の最適アラインメント用の参照配列（付加または欠失を含まない）と比較し、付加、欠失（すなわちギャップ）が含まれる場合がある。パーセンテージの算出は、両配列において同一の核酸塩基が存在する部位の数を計数してマッチ部位数を得、比較ウインドウ内の全部位数でマッチ部位数を除算し、得られた数値に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることにより行われる。

「遺伝子」とは、ポリペプチドまたは前駆体の産生に必要となる制御およびコード配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。ポリペプチドは、全長のコード配列により、またはコード配列のいずれかの部分によりコードされ得る。遺伝子は連続的なコード配列を構成するものであってもよく、または、それは１つ以上のイントロンを含み、適切なスプライス部位を介して結合されるものであってもよい。更に、遺伝子は、コーディング領域または非翻訳領域において、発現生成物の生物学的活性もしくは化学構造、発現速度または発現制御方法に影響を与え得る１つ以上の修飾を含んでもよい。かかる修飾には、限定されないが、１つ以上のヌクレオチドの変異、挿入、欠失および置換が含まれる。この点から、かかる修飾後遺伝子は「天然の」遺伝子の「変異体」とも称され得る。

「発現」とは一般的に、ポリヌクレオチド配列が適切に転写および翻訳され、検出可能な濃度のアミノ酸配列またはタンパク質が発現されるプロセスを指す。本明細書では、ある場合には、発現はｍＲＮＡの産生を指す。他の場合には、発現はタンパク質の産生を指す。

「細胞タイプ」とは、所定の給源（例えば組織または器官）由来の細胞、または所定の分化段階の細胞、または所定の病理学的もしくは遺伝的構成に関連する細胞を指す。

本明細書で交換可能に用いられる「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸の任意の長さの重合形態を指し、それらは翻訳された、非翻訳の、化学修飾された、生化学的修飾された、および誘導体化されたアミノ酸を含んでもよい。ポリペプチドまたはタンパク質は、天然物、組換え体もしくは合成物、またはこれらの任意の組合せであってもよい。更に、ポリペプチドまたはタンパク質は、天然由来のタンパク質またはペプチドの断片を含んでもよい。ポリペプチドまたはタンパク質は、一分子であってもよく、または複数分子の複合体であってもよい。更に、そのようなポリペプチドまたはタンパク質は、修飾型のペプチド主鎖を有してもよい。用語には融合タンパク質が含まれ、例えば異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種および同種のリーダー配列を有する融合タンパク質（Ｎ末端メチオニン残基を有する、または有さないもの）、免疫学的タグが付加されたタンパク質などが挙げられる。

「タンパク質の断片」とは、他のタンパク質の一部であるタンパク質を指す。例えば、タンパク質の断片には、培養細胞から単離される全長タンパク質の切断により得られるポリペプチドが含まれ得る。一実施形態では、タンパク質断片は、少なくとも約６個のアミノ酸を含む。他の実施形態では、断片は、少なくとも約１０個のアミノ酸を含む。更に別の実施形態では、タンパク質断片は、少なくとも約１６個のアミノ酸を含む。

「発現産物」または「遺伝子産物」は、生物体内で遺伝子が転写、翻訳もしくは翻訳後修飾されるときに産生される、タンパク質またはｍＲＮＡなどの生体分子である。

「宿主細胞」とは、単細胞体として培養され、組換えベクターまたは他の導入ポリヌクレオチドの受容細胞として使用し得るか、または使用された微生物、原核細胞、真核細胞または細胞系を指し、またトランスフェクトされた親細胞の子孫も含まれる。但し、天然による、偶然による、または人為的な変異導入により、単細胞の子孫が、形態学的に、またはゲノム的に、または全てのＤＮＡ補足物（complement）の点でも、元の親と必ずしも完全に同一となる訳ではない。

「機能的同等物」という用語には、天然の遺伝子またはウイルスの「断片」、「突然変異体」、「誘導体物」、「対立遺伝子」、「ハイブリッド」、「変異体」、「アナログ」または「化学誘導体」が含まれるものとする。

ポリヌクレオチド、ポリペプチド、免疫グロブリン、ウイルスまたは宿主細胞が「単離された」とは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、免疫グロブリン、ウイルスまたは宿主細胞が天然の状態で存在する環境とは異なる環境に存在していることを指す。

「実質的に精製された」とは、ある化合物が、その天然存在時の環境から分離され、かつ、天然存在時に共存する他の構成要素を、少なくとも約６０％含まず、少なくとも約６５％含まず、少なくとも約７０％含まず、少なくとも約７５％含まず、少なくとも約８０％含まず、少なくとも約８３％含まず、少なくとも約８５％含まず、少なくとも約８８％含まず、少なくとも約９０％含まず、少なくとも約９１％含まず、少なくとも約９２％含まず、少なくとも約９３％含まず、少なくとも約９４％含まず、少なくとも約９５％含まず、少なくとも約９６％含まず、少なくとも約９７％含まず、少なくとも約９８％含まず、少なくとも約９９％含まず、少なくとも約９９．９％含まず、または少なくとも約９９．９９％以上含まない状態にあることを指す。

「診断」および「診断すること」には、一般的には、対象の疾患または障害への感受性の決定、対象が現在疾患または障害に罹患しているか否かの決定、疾患または障害に罹患した対象の予後診断（例えば、転移前もしくは転移後の癌の状態、癌の段階または治療に対する癌の応答を判定すること）、ならびにセラメトリクス（therametrics）（例えば、治療の効果または有効性に関する情報を提供するために、対象の症状をモニターすること）が含まれる。

「生体試料」には、診断的またはモニタリング式アッセイで使用され得る生物体由来の様々なタイプの試料が包含される。用語には、血液および他の生物由来の液体試料、生検標本などの固形の組織試料、または培養組織もしくはそれに由来する細胞およびその子孫が包含される。用語には、具体的には臨床試料が包含され、更に、細胞培養中の細胞、細胞上清、細胞可溶化物、血清、血漿、尿、羊水、生物学的液体および組織試料が含まれる。用語にはまた、例えば試薬による処理、可溶化または特定成分の富化など、入手後に何らかの形の処理を受けた試料が包含される。

本明細書で交換可能に用いられる「個人」、「対象」、「宿主」および「患者」は、診断、処置または治療が望ましい任意の哺乳類の対象を指す。１つの好ましい実施形態では、個人、対象、宿主または患者は、ヒトである。他の対象としては、限定されないが、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、霊長類およびマウスが挙げられる。

「ハイブリダイゼーション」とは、ポリヌクレオチド配列が、塩基対形成を通じて、相補的な配列と結合する任意のプロセスを指す。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション溶液中の塩もしくはホルムアミド濃度、またはハイブリダイゼーション温度により定義することができ、また当技術分野では周知である。ハイブリダイゼーションは、様々なストリンジェントな条件下で行われ得る。

「ストリンジェントな条件」とは、プローブが、他のいかなる配列とではなく、その標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし得る条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的である（例えば、より長い配列では、より高い温度で特異的にハイブリダイズする）。通常、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおける、特異的配列との融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低い温度が選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列と（所定のイオン強度、ｐＨおよびポリヌクレオチド濃度下で）ハイブリダイズする温度である。典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨが約７．０〜約８．３、塩濃度が少なくとも約０．０１〜約１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）濃度、ならびに温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）の場合は最低約３０℃、である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により設定してもよい。

「生体分子」には、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。

「生物学的活性」とは、タンパク質またはペプチドの生物学的挙動および効果を指す。タンパク質の生物学的活性は、細胞レベルおよび分子レベルにおいて影響を受け得る。例えば、タンパク質の生物学的活性は、分子レベルでの変化の影響を受け得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のｍＲＮＡの翻訳を妨害することができ、それにより、ｍＲＮＡがコードするタンパク質の生物学的活性を阻害する。更に、免疫グロブリンは特定のタンパク質と結合することができ、そのタンパク質の生物学的活性を阻害することができる。

「オリゴヌクレオチド」とは、例えば、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１０００ｎｔを含むポリヌクレオチド配列を指す。本発明で用いるオリゴヌクレオチドは、例えば約１５ｎｔ〜約１５０ｎｔ、例えば約１５０ｎｔ〜約１０００ｎｔの長さである。オリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオチドのいずれでもよい。

「修飾オリゴヌクレオチド」および「修飾ポリヌクレオチド」とは、塩基、糖部分、ヌクレオシド間のリン酸結合の全体または一部の天然分子構造への、分子レベルでの１つ以上の化学修飾がなされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、ならびに、これらの部位になされた置換または修飾の組合せを有する分子を指す。ヌクレオシド間リン酸結合は、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、ホスホラミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセタミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホラミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートもしくはスルホンによるヌクレオチド間結合、または３’−３’、５’−３’または５’−５’結合、ならびにかかる同様の結合の組合せのいずれでもよい。ホスホジエステル結合は、例えばホスホロチオエート、メチルアミノ、メチルホスホネート、ホスホラミデートおよびグアニジンなどの置換結合で置き換えてもよく、ポリヌクレオチドのリボースサブユニットを置換してもよい（例えばヘキソースリン酸ジエステル、ペプチド核酸）。修飾は、オリゴヌクレオチド分子の内部（単回もしくは繰り返し）または（両）末端部で行ってもよく、またヌクレオシド間リン酸結合の分子への付加も含まれ、例えば、デオキシリボースおよびリン酸を修飾して、反対側の鎖を切断もしくは鎖と架橋させるか、または、関連する酵素または他のタンパク質と結合させる修飾も含まれ得る。用語「修飾オリゴヌクレオチド」および「修飾ポリヌクレオチド」にはまた、糖部分への修飾を含み、５’→３’結合を介して連結されるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（例えば、３’−置換リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドモノマー）が含まれる。

「生体分子の配列」または「配列」とは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の全体または一部を指す。

「検出可能である」という用語は、当業者に公知の、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素−（ＲＴ）ＰＣＲ、ディファレンシャルディスプレイおよびノザン解析の標準的な技術で検出可能である、ポリヌクレオチドの発現パターンを指す。同様に、ポリペプチドの発現パターンは、ウエスタンブロットなどの免疫学的測定法を含む標準的な技術で「検出可能」である。

「標的遺伝子」とは、通常では生体試料に由来するポリヌクレオチドを指し、それに対して特異的にハイブリダイズするよう、オリゴヌクレオチドプローブが設計されている。それは、標的ポリヌクレオチドの有無を検出するものであるか、または標的ポリヌクレオチドの量を定量するものである。標的ポリヌクレオチドは、それを標的とする対応プローブのポリヌクレオチド配列と相補的な配列を有する。標的ポリヌクレオチドはまた、プローブが標的とする、より大きなポリヌクレオチド中の特異的な配列、または発現レベルを検出しようとする配列全体（例えば遺伝子またはｍＲＮＡ）を指す場合もある。

「標的タンパク質」とは、通常では生体試料に由来するポリペプチドを指し、それに対して、タンパク質捕捉剤が特異的にハイブリダイズまたは結合する。それは、標的タンパク質の有無を検出するものであるか、または標的タンパク質の量を定量化するものである。標的タンパク質には、それを標的とする対応するタンパク質捕捉剤により認識される構造が存在する。標的タンパク質またはアミノ酸とは、タンパク質捕捉剤が標的とするより大型のタンパク質中の特異的な部分構造を指す場合も、または発現レベルを検出しようとする全体の構造（例えば遺伝子またはｍＲＮＡ）を指す場合もある。

「相補的」とは、プローブ分子およびその標的の相互作用表面が位相的に互換性を有すること、またはそれらが互いにマッチすることを指す。標的とそのプローブとは、相補的であるといえ、更に、それらの接触表面の特性は互いに相補的である。ヌクレオチドまたは核酸の間、例えば二本鎖ＤＮＡ分子の２つの鎖間、またはオリゴヌクレオチドプローブと標的との間、のハイブリダイゼーションまたは塩基対形成は、相補的である。

「ラベル」とは、直接的に、または、１つ以上の追加されたシグナル発生系の部材との相互作用を通じて、検出可能なシグナルを発生させることができる薬剤を指す。直接的に検出可能で、かつ本発明で使用可能なラベルには、蛍光ラベルが含まれる。具体的なフルオロフォアには、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン色素などが含まれる。

「融合タンパク質」という用語は、その天然の状態では通常結合されないが、ペプチド結合を通してそれらのそれぞれのアミノ末端およびカルボキシル末端が結合して１つの連続的なポリペプチドを形成した、２つ以上のポリペプチドから構成されるタンパク質を指す。それは、２つ以上のポリペプチド部分が直接結合してもよく、または、ペプチドリンカー／スペーサーを介して間接的に結合してもよいと理解される。

「通常の生理的条件」という用語は、生存する生物体または細胞内部の通常の条件を意味する。器官または生物体の中には、極端な条件を提供するものも存在するが、生物体内の、および細胞内の環境は通常、ｐＨ７（すなわちｐＨ６．５からｐＨ７．５まで）付近で変動し、主な溶媒として水を含み、０℃より高く、５０℃より低い温度で存在する。様々な塩の濃度は、使用対象となる器官、生物体、細胞または細胞区画により異なる。

「ＢＬＡＳＴ」とは、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ、すなわち、所定のクエリー配列にマッチするギャップのない部分配列を検出する技術を指す。

「ＢＬＡＳＴＰ」は、タンパク質配列データベースとアミノ酸クエリー配列とを比較するＢＬＡＳＴプログラムである。「ＢＬＡＳＴＸ」は、タンパク質配列データベースと、６フレームのヌクレオチドクエリー配列（両方の鎖）の概念上の翻訳物とを比較するＢＬＡＳＴプログラムである。

「ｃｄｓ」は、ＧｅｎＢａｎｋ ＤＮＡ配列エントリーにおいて、コード配列を参照するのに用いられる。コード配列は、遺伝子をコードすると推測されるＤＮＡ配列の部分配列である。

「コンセンサス」または「コンティグ配列」は、本発明で理解されるところでは、特に、本発明の１つ以上のデータベースの配列間で重複する一群の配列である。

本発明の核酸分子は、適切な遺伝子配列をコードする核酸を保持するウイルスにより産生させることができる。ウイルスは、核酸の発現を制御および／または強化し得る要素を含んでもよい。ウイルスは組換えウイルスであってもよい。組換えウイルスは、他の機能的要素を含んでもよい。例えば、組換えウイルスは、ウイルスが標的細胞で自律的に複製され得るように設計することができる。この場合、核酸の複製を誘導する要素が組換えウイルスで必要と考えられる。組換えウイルスは、必要に応じて核酸の発現を制御するためのプロモーターまたはレギュレーターまたはエンハンサーを含んでもよい。組織特異性プロモーター／エンハンサー要素を用いて、特定のタイプの細胞において核酸の発現を制御してもよい。プロモーターは、構成的プロモーターであっても、または誘導型プロモーターであってもよい。

「プロモーター」は、通常、転写が行われるのに必要となる、遺伝子の上流側（５’領域側）に位置するＤＮＡ中の領域である。プロモーターは、それが制御する遺伝子の適切な活性化または抑制を可能にする。本発明の関連では、プロモーターは、光受容器における光駆動性イオンチャネルの特異的な発現をもたらす。「特異的な発現」とは、目的遺伝子を発現する細胞の少なくとも７５％超が、特定のタイプ、すなわちこの場合においては光受容器であることを意味する。網膜光受容器における構築物の発現に適するプロモーターの例は、ヒトロドプシンプロモーター（Allocca et al., Novel AAV serotypes efficiently transduce murine photoreceptors, J Virol. (2007)）、ヒト赤オプシンプロモーター（Nathan et al., Science. 1986 Apr 11; 232(4747): 193-202）、ＧＲＭ６プロモーター、赤錐体オプシンプロモーター、またはａｒｒ３プロモーター（ｍＣＡＲ）（Zhu, X. et al. Mouse cone arrestin gene characterization: promoter targets expression to cone photoreceptors. FEBS Letters 524, 116-122 (2002)）である。更に、以下のプロモーターが、網膜光受容器における遺伝子の特異的およびほぼ排他的（７５％超）な発現に適し、また本発明において非常に適することが明らかとなった：
Ｆａｂｐ７（ｔｒｕｎｃ）（配列番号１）

Ｇｎａｔ２＿５００（配列番号２）

Ｇｎａｔ２＿２ｋｂ（配列番号３）

Ａｒｒ３＿２ｋｂ（配列番号４）

ＴＦ＿ＺＦＨＸ３（配列番号５）

およびＴＦ＿ＧＳＨ２（配列番号６）

その天然の環境の汚染物質成分は、本発明の方法および組成物に干渉する物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性もしくは非タンパク質性の溶質が挙げられる。通常、単離された薬剤は、少なくとも１回の精製工程により調製される。一実施形態では、薬剤は、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％または少なくとも約９９．９９％（重量ベース）の純度で精製される。

細胞においてタンパク質を「発現させる」とは、例えば、行おうとする手順の目的に応じてタンパク質を細胞内に確実に存在させることを意味する。多くの実施形態では、タンパク質を「発現させる」ことには、作動可能な状態でプロモーターと連結された、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびに局在化配列を含む導入遺伝子を細胞に導入することを含み、プロモーターは、構成的プロモーターであるか、または、適切な条件が設定された場合に誘導される誘導型プロモーターである。しかしながら、例えば天然条件で目的タンパク質を発現する細胞の場合、何らの操作を行わずに使用でき、タンパク質を「発現する」と考えられる。本発明の場合、「網膜光受容器における脱分極性光駆動性イオンチャネルの特異的な発現」とは、脱分極性光駆動性イオンチャネルが、網膜光受容器で排他的に（７５％超）発現することを意味する。重要なことは、多くの異なる細胞における発現によりシグナルが交錯し、各々が打ち消しあうこととなる、ということである。

「蛍光プローブ」とは、ある波長の光により活性化されたとき、他の特定の波長の光を放出する能力を有する任意の化合物を指す。

「蛍光」とは、強度、スペクトル、波長、細胞内分布などの、蛍光シグナルに係る任意の検出可能な特徴を指す。

蛍光を「検出する」とは、定性的または定量的な方法を用いて細胞の蛍光を評価することを指す。例えば、蛍光は、例えば、蛍光強度、スペクトルまたは細胞内分布を測定し、異なる条件下で得られる値との統計的比較を行うなどの、定量的方法を用いて測定される。蛍光レベルは、複数のヒト試料（例えば、蛍光顕微鏡または他の光学的検出装置（画像解析システムなど）を使用して検出される試料）を用いた視覚的解析および比較などの定性的方法を用いて測定することもできる。蛍光の「変化」または「調節」とは、他の条件と比較した、特定の条件での蛍光の強度、細胞内分布、スペクトル、波長または他の態様における任意の検出可能な差異を指す。例えば、「変化」または「調節」は定量的に検出され、差異は統計的に有意な差異となる。いかなる蛍光の「変化」または「調節」も、例えば蛍光顕微鏡、ＣＣＤまたは他の任意の蛍光検出装置などの標準的な装置を用いて検出することができ、また、例えば統合システムなどの自動化システムを用いて検出することができ、または、観察者（ヒト）による主観的な変化の検出を反映させることもできる。

「同一のフォーマット」で行われるアッセイとは、アッセイが、アッセイ結果を決定するのに必要となるいかなる成分も、未処理または未精製の状態で、単一の容器内で実施できることを意味し、例えば、試験薬がアッセイシステムに添加され、得られるいかなる効果も直接に測定できるものである。かかる「同一のフォーマット」によるアッセイでは通常、試験薬の有無により「クエンチされる」かまたは修飾される、少なくとも１つの成分が含まれる。

細胞内で異種タンパク質を発現させる方法は、当業者に周知であり、例えばAusubel (1999), Guthrie and Fink (1991), Sherman, et al. (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, Freshneyなどに記載されている。典型的には、かかる実施形態では、目的の異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、異種タンパク質を発現させようとする特定の宿主細胞用の好適な発現制御配列に、作動可能な状態で連結される。かかる方法では、多数の周知のプロモーターのいずれかを使用することができる。プロモーターの選択は、得ようとする発現レベルおよび目的とする細胞特性に応じて適宜行う。また、ポリアデニル化シグナル、５’および３’非翻訳配列などの更なる要素も、周知の参考文献に記載されている。

後生動物（組織および器官に分化した細胞から構成される体を有する動物）の細胞における、異種タンパク質発現用のプロモーターおよび他の要素は一般的に用いられおり、当業者に周知である。例えば、Cruz & Patterson (1973) Tissue Culture, Academic Press: Meth. Enzymology 68 (1979), Academic Press; Freshney, 3rd Edition (1994) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, Wiley-Lissを参照。かかる細胞用のプロモーターおよび制御配列には、例えばＳｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０（ＳＶ４０）由来の一般的に用いられる初期および後期プロモーター、または、ポリオーマ、アデノウイルス２、ウシ乳頭腫ウイルスもしくはトリ肉腫ウイルス、ヘルペスウイルスファミリー（例えばサイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスもしくはイプシュタイン−バーウイルス）由来の他のウィルスプロモーター、または、免疫グロブリンプロモーターおよび熱ショックプロモーター（例えばSambrook, Ausubel, Meth. Enzymology Pouwells, et al., supra (1987)を参照）が含まれる。更に、例えばメタロチオネイン（すなわちＭＴ−１およびＭＴ−２）、グルココルチコイドまたは抗生物質による遺伝子「スイッチ」などの制御型プロモーターを使用できる。かかるプロモーターのエンハンサー領域を使用することもできる。

発現カセットは通常、宿主細胞への発現カセットの導入および宿主細胞における発現カセットの維持を促進するベクターに挿入される。かかるベクターは一般的に用いられ、当業者に周知である。かかるベクターは、インビトロゲン社、ストラタジーン社、クローンテック社などから多数市販されており、例えば上記のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｇｕｔｈｒｉｅ、ＳｔｒａｔｈｅｍまたはＢｅｒｇｅｒなどの多くの案内書に記載されている。かかるベクターは通常、マルチクローニング部位と共にプロモーター、ポリアデニル化シグナルなど、ならびに、複製開始点、選択可能マーカー遺伝子（例えばＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、ＧＦＰ）、セントロメア配列などの更なる要素を含む。

哺乳動物細胞における発現のために、多くのベクター、例えばｐＳＶ２、ｐＢＣ１２ＢＩおよびｐ９１０２３、ならびに、溶菌ウイルスベクター（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルス）、エピソームウイルスベクター（例えばウシ乳頭腫ウイルス）およびレトロウイルスベクター（例えばマウスレトロウイルス）のうちのいずれかを使用できる。

本明細書で用いられる「障害」という用語は、病気、疾患、疾病、臨床症状または病的症状を指す。

本明細書で用いられる「薬学的に許容できる担体」という用語は、有効成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、化学的に不活性であり、それを投与される患者への毒性がない担体としての媒体を指す。

本明細書で用いられる「薬学的に許容できる誘導体」という用語は、例えば本発明に係るスクリーニング方法を用いて対象に比較的無毒であると同定される、薬剤のあらゆるホモログ、アナログまたは断片を指す。

「治療剤」という用語は、障害または障害の合併症の予防または治療を補助する任意の分子、化合物または処置を指す。

適切な医薬用担体中に製剤化したかかる薬剤を含む組成物を、治療用に調製し、包装し、ラベル表示することができる。

複合体が水溶性である場合、それを適切なバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水または他の生理的に適合する溶液中で製剤化してもよい。

あるいは、得られる複合体の水性溶媒中の溶解度が低い場合、それを、例えばＴｗｅｅｎなどの非イオン性界面活性剤、またはポリエチレングリコールと共に製剤化してもよい。このようにして、化合物およびそれらの生理的に許容できる溶媒和化合物は、（口または鼻を通じた）吸入もしくは吸引、または経口、バッカル、非経口、直腸内投与用に、または腫瘍の場合には固形腫瘍への直接注入用に製剤化してもよい。

経口投与においては、医薬調製物は液体の状態、例えば溶液、シロップまたは懸濁液であってもよく、あるいは、使用前に水または他の適切な溶媒中で再構成するための薬物製品であってもよい。かかる液体調製物は、懸濁剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化油脂）、乳化剤（例えばレシチンまたはアカシア）、非水性溶媒（例えばアーモンド油、エステル油または分画後の植物油）、および防腐剤（例えばメチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）などの薬学的に許容できる添加剤と共に、従来法により調製することができる。医薬組成物は、例えば結合剤（例えば顆粒状とされたトウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えばラクトース、結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉または澱粉グリコール酸ナトリウム）、または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容できる賦形剤と共に、従来法により調製し、錠剤またはカプセル剤の形態とし得る。錠剤は、当業界で周知の方法によりコーティングしてもよい。

化合物は、例えばボーラス投与または持続投与による注射による非経口投与用に製剤化してもよい。注射用製剤とする場合、例えば防腐剤を添加したアンプル形態または多回投与用容器などの単位投与形態としてもよい。

組成物は、油性もしくは水性溶媒中の懸濁剤、溶液またはエマルジョンなどの形態であってもよく、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの調製助剤を含有してもよい。あるいは、有効成分を粉末形態とし、使用前に滅菌済のパイロジェンフリー水などの適切な溶媒中で構成してもよい。

化合物は、例えばクリームまたはローション剤として、局所投与用に製剤化してもよい。

前記の製剤に加えて、化合物はデポー調製物として製剤化してもよい。かかる持続性の製剤は、移植（例えば皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与され得る。

ゆえに、化合物は例えば、適切な重合性もしくは疎水性材料（例えば許容できる油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂と共に、または、例えばやや溶解性の低い塩などのやや溶解性の低い誘導体として、製剤化され得る。リポソームおよびエマルジョンは、親水性薬物の輸送用溶媒または担体として周知の例である。

組成物は、必要に応じて、有効成分を含有する１つ以上の単位投与形態を含み得る包装容器またはディスペンサー装置中に提供されてもよい。包装容器は、例えば金属またはプラスチック製のホイル、例えばブリスターパックを含んでもよい。包装容器またはディスペンサー装置は、投与用の使用説明書が添付されていてもよい。

本発明ではまた、本発明の治療レジメンを実施するためのキットが提供される。かかるキットは、１つ以上の容器内に、薬学的に許容できる形態の、治療的または予防的有効量の組成物を含む。

キット中のバイアルに含まれる組成物は、例えば滅菌済生理食塩水、ブドウ糖溶液または緩衝液と、または他の薬学的に許容できる滅菌済みの液体と組み合わせた、薬学的に許容できる溶液の形態であってもよい。あるいは、混合液を凍結乾燥または脱水してもよく、この場合、キットには、任意に、混合液を再構成して注射用溶液を形成するための、好ましくは滅菌済みの薬学的に許容できる溶液（例えば、生理食塩水、ブドウ糖溶液など）を含む容器が更に含まれる。

他の実施形態では、キットは、混合液を注射するための、好ましくは滅菌済み形態で包装されたニードルもしくはシリンジ、および／または、包装されたアルコールパッドを更に含む。臨床医による、または患者による組成物の投与のための使用説明書が任意に含まれる。

別段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての専門用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験の際には、本明細書に記載のものと類似もしくは同等の方法もしくは材料を使用できるが、以下に適切な方法および材料を記載する。語義に齟齬が生じる場合には、定義を含む本明細書の記載が優先される。更に、材料、方法および実施例は、飽くまで例示を目的とし、限定を目的とするものではない。

細胞特異的プロモーターであるマウス錐体アレスチン３（ｍＣａｒ）（Busskamp, 2010）を用い、ｒｄ１マウス（ｒｄ１変異のホモ接合マウスでは、早発性の重度の網膜変性が発症する）由来の錐体におけるＣａｔＣｈの標的発現を行った。これは、ｒｄ１錐体において高いパーセンテージで選択的発現を誘導することが既に示されているものである（Busskamp, 2010）。ＣａｔＣｈを、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）と融合させ、ＡＡＶ内にパッケージングし、ｒｄ１マウスの網膜下腔に注射した。マウスへの注射はいずれもＰ２８からＰ３９の間に実施した。本研究全体にわたり、ＥＧＦＰのみを発現するＡＡＶをコントロールとして用いた。ＣａｔＣｈをトランスフェクトしたｒｄ１錐体による、下流側の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）（網膜の出力ニューロン）への情報伝達能力を、マルチ電極アレイ（ＭＥＡ）を用いて測定した。Ｐ７９〜Ｐ１１４の間に、全視野白色光ＣａｔＣｈ ＭＥＡレコーディングを実施した。ＣａｔＣｈを形質導入された網膜では、毎秒ｃｍ２当たり１０（１５）の有効光子数から始まる強力なＲＧＣのオン反応が、一時的および持続的の両方で、見られた。４つの対数的単位（ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ ｕｎｉｔ）の光強度にわたり応答が持続した。ＥＧＦＰのみのコントロールウイルスを注射したｒｄ１マウスでは、光応答が誘導されなかった。ゆえに、錐体は、例えばハロロドプシンを経た光応答により過分極し、オプシン固有の応答である過分極を擬態できるだけではない。それはまた、ＣａｔＣｈでｒｄ１の錐体を標的とした場合には、光に応答して脱分極することもできる。光受容器の下流において、網膜は２本の平行な情報チャネルに分離する。オン型の双極細胞およびオン型の神経節細胞は、光の増強により活性化し、符号逆転シナプス（sign inverting synapse）を経て錐体と連結している。オフ型の双極細胞およびオフ型の神経節細胞は、光の減弱により活性化し、符号維持シナプス（sign conserving synapse）により錐体と連結している。ＣａｔＣｈを導入された光受容器は、現在光に応答して脱分極するため、オン経路は光に応答して過分極化して独立する（ｓｉｌｅｎｔ）であろうし、一方、オフ経路は脱分極してオン反応を引き起こすであろう。

脱分極性光受容器が、オン回路とオフ回路の両方における逆転を経て神経節細胞に情報伝達できることを実証するため、本発明者らは、構成的プロモーターであるニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターと共に導入遺伝子を野生型マウスの網膜変性に導入し、そこにおいて網膜変性を誘導した。ＡＡＶ２／８−ＣＢＡ−ＤＩＯ−ＩｎｈＡ−２Ａ−ＥＧＦＰカセットを網膜下注射した１０日後、野生型マウスの網膜ではほぼ完全なオプシンを示した。錐体のアレスチンを標識したところ、錐体の形態が変化していた。内節は短縮しており、最終的には全く消失し、錐体は同じ光受容層に最早存在せず、また時間経過と共に錐体細胞は明らかにサイズが増加した。本発明者らは、引き続き、野生型マウスのＰ３６のとき、この毒性を示すＣＢＡカセットをＣａｔＣｈと共に注射した。Ｐ６１〜Ｐ７３の間に全視野白色光ＭＥＡレコーディングを行った。オン型およびオフ型の神経節細胞の応答を、ＭＥＡレコーディングの間に見ることができた。

以下の態様を包含し得る。
［１］ 網膜光受容器において脱分極性光駆動性イオンチャネルの特異的な発現をもたらすプロモーターに機能的に連結された、前記脱分極性光駆動性イオンチャネルをコードするヌクレオチド配列または前記ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、失明の治療または改善に用いられる、単離された核酸分子。
［２］ 前記脱分極性光駆動性イオンチャネルが、チャネルロドプシン、例えばチャネルロドプシン−２またはその変異体である、上記［１］に記載の単離された核酸分子。
［３］ 網膜光受容器で前記脱分極性光駆動性イオンチャネルの発現をもたらす前記プロモーターが、ヒトロドプシンプロモーター、ヒト赤オプシンプロモーター、赤錐体オプシンプロモーター、ａｒｒ３プロモーター（ｍＣＡＲ）、Ｇｒｍ６プロモーター、Ｆａｂｐ７（ｔｒｕｎｃ）（配列番号１）、Ｇｎａｔ２＿５００（配列番号２）、Ｇｎａｔ２＿２ｋｂ（配列番号３）、Ａｒｒ３＿２ｋｂ（配列番号４）、ＴＦ＿ＺＦＨＸ３（配列番号５）およびＴＦ＿ＧＳＨ２（配列番号６）の群から選択される、上記［１］または［２］に記載の単離された核酸分子。
［４］ 前記網膜光受容器細胞が、桿体細胞および／または錐体細胞である、上記［１］から［３］のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
［５］ 配列番号１、２、３、４、５または６の核酸配列を含むか、もしくはそれからなるか、または、前記配列番号１、２、３、４、５または６のそれぞれの配列と少なくとも９０％の相同性を有する、少なくとも２００ｂｐの核酸配列からなる単離された核酸分子であって、網膜光受容器の遺伝子をコードする核酸配列が、前記単離された核酸分子に作動可能に連結されたとき、前記遺伝子の発現を特異的にもたらす、前記単離された核酸分子。
［６］ 上記［１］から［５］のいずれか１項に記載の核酸を含む組換えベクター。
［７］ 上記［６］に記載のベクターを含む宿主細胞。
［８］ 上記［１］から［５］のいずれか１項に記載の単離された核酸、上記［６］に記載の組換えベクター、または上記［７］に記載の宿主細胞を含むキット。
［９］ 上記［１］から［５］のいずれか１項に記載の単離された核酸、上記［６］に記載の組換えベクター、または上記［７］に記載の細胞を、失明の治療を必要とする患者に投与することを特徴とする、失明の治療方法
［１０］ 前記投与が、網膜下注射を通じて行われる、上記［９］に記載の失明の治療方法。

Claims (17)

1. 網膜光受容器細胞において脱分極性光駆動性イオンチャネルの発現をもたらすプロモーターに機能的に連結された、前記脱分極性光駆動性イオンチャネルをコードするヌクレオチド配列を含み、失明の治療または改善に用いるための、
   ここで、網膜光受容器細胞で前記脱分極性光駆動性イオンチャネルの発現をもたらす前記プロモーターが、Ｇｎａｔ２＿５００（配列番号２）、Ｇｎａｔ２＿２ｋｂ（配列番号３）、およびＴＦ＿ＧＳＨ２（配列番号６）からなる群から選択される、
   単離された核酸分子。
2. 前記脱分極性光駆動性イオンチャネルが、チャネルロドプシンである、請求項１に記載の単離された核酸分子。
3. 前記チャネルロドプシンが、チャネルロドプシン−２またはその変異体である、請求項２に記載の単離された核酸分子。
4. 前記網膜光受容器細胞が、桿体細胞または錐体細胞である、請求項１から３のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
5. 配列番号２、３、または６の核酸配列を含むか、もしくはそれからなるか、または、前記配列番号２、３、または６のそれぞれの配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ少なくとも２００塩基対の核酸配列からなる単離された核酸分子であって、網膜光受容器細胞の遺伝子をコードする核酸配列が、前記単離された核酸分子に作動可能に連結されたとき、前記遺伝子の発現をもたらす、前記単離された核酸分子。
6. 配列番号２の核酸配列を含む、請求項５に記載の単離された核酸分子。
7. 前記単離された核酸分子が、遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に連結される、請求項５または６に記載の単離された核酸分子。
8. 前記網膜光受容器細胞が、桿体細胞または錐体細胞である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
9. 失明を治療または改善するのに用いるための、請求項５〜８のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
10. 請求項１から９のいずれか１項に記載の単離された核酸分子を含む組換えベクター。
11. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１０に記載の組換えベクター。
12. 前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１１に記載の組換えベクター。
13. 請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
14. 請求項１から９のいずれか１項に記載の単離された核酸分子、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組換えベクター、または請求項１３に記載の宿主細胞を含むキット。
15. 請求項１から９のいずれか１項に記載の単離された核酸分子、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組換えベクター、または請求項１３に記載の宿主細胞を含む、失明の治療方法で用いるための医薬組成物であって、前記方法が、失明の治療を必要とする患者に前記医薬組成物を投与することを含む、医薬組成物。
16. 前記投与することが、網膜下注射を通じて行われる、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 前記投与することが、非経口注射を通じて行われる、請求項１５に記載の医薬組成物。
    

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