CN111726985B - 灵长类动物视网膜色素上皮细胞特异性启动子 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中特异性表达外源基因的方法，所述方法包括将分离的核酸分子递送至所述灵长类动物的视网膜色素上皮细胞的步骤，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1的核酸序列或由其组成，或者由与SEQ ID NO:1的序列具有至少80％总体同一性的至少400bp的核酸序列组成，其中，当编码所述外源基因的核酸序列与所述分离的核酸分子可操作地连接时，所述分离的核酸分子使得外源基因在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中特异性表达。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸序列，该核酸序列使得基因在视网膜色素上皮(RPE)细胞中特异性表达。
背景技术
出于表达目的，通常将重组基因在活性表达盒的背景下作为cDNA构建体转染到靶细胞、细胞群或组织中，以允许异源基因转录。DNA构建体在涉及顺式调控元件上的许多反式作用转录因子(TF)的活性的过程中被细胞转录机器识别，这些顺式调控元件包括增强子、沉默子、绝缘子和启动子(本文统称为“启动子”)。
基因启动子参与所有这些层面的调控，通过整合DNA序列、转录因子结合特征和表观遗传特征的影响，充当基因转录中的决定因素。它们决定例如由质粒载体编码的转基因表达的强度，以及将在其中表达所述转基因的一种或多种细胞类型。
用于驱动哺乳动物细胞中的异源基因表达的最常见启动子是人和小鼠巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子。它们赋予强烈的表达，并且已在若干细胞类型中证明了稳健性。其他病毒启动子如SV40立即早期启动子和劳氏肉瘤病毒(RSV)长末端重复序列(LTR)启动子也经常用在表达盒中。
也可以使用细胞启动子代替病毒启动子。已知的启动子有来自管家基因的那些启动子，这些管家基因编码大量转录的细胞转录物，如β-肌动蛋白、延伸因子1-α(EF-lα)或泛素。与病毒启动子相比，真核基因表达更复杂并且需要许多不同因子的精确协调。
关于内源性调控元件用于转基因表达的用途的一个方面是产生稳定的mRNA，并且该表达可以在宿主细胞的天然环境中进行，其中相应地提供反式作用转录因子。由于真核基因的表达受顺式和反式作用调控元件的复杂机制控制，因此大多数细胞启动子未得到广泛的功能表征。部分真核启动子通常紧邻其转录序列的上游，并且充当转录起始点。核心启动子直接围绕转录起始位点(TSS)，该位点足以被转录机器识别。近端启动子包含核心启动子上游的区域，并且含有TSS和转录调控所需的其他序列特征。转录因子通过与启动子和增强子序列中的调控基序结合而序列特异性地起作用，从而激活染色质和组蛋白修饰酶，这些酶改变核小体结构及其位置，最终允许转录起始。功能性启动子的鉴定主要取决于相关上游或下游增强子元件的存在。
关于内源性调控元件用于转基因表达的用途的另一关键方面是一些启动子可以按细胞特异性方式起作用并且将使得转基因在特定类型的细胞上/中表达，或取决于启动子，在特定亚群的细胞中表达。
因此，本发明的一个目的是获得适用于在哺乳动物的视网膜细胞中以高表达水平并以细胞类型特异性方式表达重组基因的新序列。
此类序列满足了本领域对视网膜细胞特异性启动子的需求，以开发用于研究神经退行性障碍、视力恢复、药物发现、肿瘤疗法和障碍诊断的系统。
发明内容
目前，本发明的诸位发明人已意外发现已知在WO 2015/118507中所述的鼠模型中在视网膜无长突细胞中特异性驱动基因表达的人工启动子，其在灵长类动物中具有非预期且非典型的完全不同的特异性。在灵长类动物中，该启动子特异性驱动视网膜色素上皮(RPE)细胞中的基因表达。这种特异性对于解决和靶向在例如年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿病性视网膜病变和视网膜色素上皮增生患者的病变视网膜的视网膜色素上皮细胞中的基因表达十分有用。
该启动子的核酸序列是：
因此，本发明提供了一种在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中特异性表达外源基因的方法，所述方法包括将分离的核酸分子递送至所述灵长类动物的视网膜色素上皮细胞的步骤，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1的核酸序列或由其组成，或者由与SEQ IDNO:1的所述序列具有至少80％总体同一性的至少400bp的核酸序列组成，其中，当编码所述外源基因的核酸序列与所述分离的核酸分子可操作地连接时，所述分离的核酸分子使得外源基因在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中特异性表达。所述分离的核酸分子可以进一步包含与所述分离的核酸分子可操作地连接的最小启动子，例如，SEQ ID NO:2的最小启动子。所述分离的核酸分子可以是表达盒的一部分，其又可以是载体(例如，病毒载体)的一部分。
本发明还提供了一种分离的核酸分子的用途，所述分离的核酸分子包含SEQ IDNO:1的核酸序列或由其组成，或者由与SEQ ID NO:1的所述序列具有至少80％总体同一性的至少400bp的核酸序列组成，其中，当编码外源基因的核酸序列与所述分离的核酸分子可操作地连接时，所述分离的核酸分子使得外源基因在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中特异性表达，以在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中特异性表达外源基因。在该用途中，所述分离的核酸分子可以进一步包含最小启动子，例如，SEQ ID NO:2的最小启动子。所述分离的核酸分子可以是表达盒的一部分，其可以是载体(例如，病毒载体)的一部分。
本发明进一步提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1的核酸序列或由其组成，或者由与SEQ ID NO:1的所述序列具有至少80％总体同一性的至少400bp的核酸序列组成，其中，当编码外源基因的核酸序列与所述分离的核酸分子可操作地连接时，所述分离的核酸分子使得外源基因在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中特异性表达，用于治疗与视网膜色素上皮相关的疾病。所述与视网膜色素上皮相关的疾病可以选自由以下组成的组：年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿病性视网膜病变和视网膜色素上皮增生。
所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1的核酸序列或由其组成，或者由与SEQ IDNO:1的所述序列具有至少80％总体同一性的至少400bp的核酸序列组成，其中，所述分离的核酸分子特异性使得与编码所述基因的所述核酸序列可操作地连接的基因在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中的表达可以是至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少750bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ ID NO:1的所述核酸序列具有至少80％的同一性。在一些实施例中，所述核酸序列为至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ ID NO:1的所述核酸序列具有至少85％总体同一性。在一些实施例中，所述核酸序列为至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ IDNO:1的所述核酸序列具有至少90％总体同一性。在一些实施例中，所述核酸序列为至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ ID NO:1的所述核酸序列具有至少95％总体同一性。在一些实施例中，所述核酸序列为至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ IDNO:1的所述核酸序列具有至少96％总体同一性。在一些实施例中，所述核酸序列为至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ ID NO:1的所述核酸序列具有至少97％总体同一性。在一些实施例中，所述核酸序列为至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ IDNO:1的所述核酸序列具有至少98％总体同一性。在一些实施例中，所述核酸序列为至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ ID NO:1的所述核酸序列具有至少99％总体同一性。在一些实施例中，所述核酸序列为至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ IDNO:1的所述核酸序列具有100％总体同一性。
本发明的所述分离的核酸分子可以包含最小启动子，如SV40最小启动子，例如，SV40最小启动子
可以与本发明的启动子可操作地连接的典型基因是编码光感受器的基因。例如，它可以是光敏分子，如视紫红质通道蛋白或盐细菌视紫红质。
附图说明
图1：从包含SEQ ID NO:1的启动子向灵长类动物视网膜中的视网膜色素上皮细胞靶向表达。成年猕猴(Macaca mulatta)眼睛视网膜下注射AAV-synP12-ChR2-EGFP 3个月后，来自包含SEQ ID NO:1的启动子的EGFP表达的激光扫描共聚焦显微镜图像。可以观察到在视网膜色素上皮细胞中的诱导表达。绿色＝由SEQ ID NO:3驱动的EGFP。白色＝Hoechst。
具体实施方式
目前，本发明的诸位发明人已偶然发现已知在WO 2015/118507中所述的鼠模型中在视网膜无长突细胞中特异性驱动基因表达的人工启动子，其在灵长类动物中具有非预期且非典型的完全不同的特异性。在灵长类动物中，该启动子特异性驱动视网膜色素上皮细胞中的基因表达。这种特异性对于解决和靶向在例如年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿病性视网膜病变和视网膜色素上皮增生患者的病变视网膜的视网膜色素上皮细胞中的基因表达十分有用。
该启动子的核酸序列是：
因此，本发明提供了一种在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中特异性表达外源基因的方法，所述方法包括将分离的核酸分子递送至所述灵长类动物的视网膜色素上皮细胞的步骤，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1的核酸序列或由其组成，或者由与SEQ IDNO:1的所述序列具有至少80％总体同一性的至少400bp的核酸序列组成，其中，当编码所述外源基因的核酸序列与所述分离的核酸分子可操作地连接时，所述分离的核酸分子使得外源基因在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中特异性表达。所述分离的核酸分子可进一步包含最小启动子，例如，SEQ ID NO:2的最小启动子。所述分离的核酸分子可以是表达盒的一部分，其又可以是载体(例如，病毒载体)的一部分。
本发明还提供了一种分离的核酸分子的用途，所述分离的核酸分子包含SEQ IDNO:1的核酸序列或由其组成，或者由与SEQ ID NO:1的所述序列具有至少80％总体同一性的至少400bp的核酸序列组成，其中，当编码外源基因的核酸序列与所述分离的核酸分子可操作地连接时，所述分离的核酸分子使得外源基因在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中特异性表达，以在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中特异性表达外源基因。在该用途中，所述分离的核酸分子可以进一步包含最小启动子，例如，SEQ ID NO:2的最小启动子。所述分离的核酸分子可以是表达盒的一部分，其可以是载体(例如，病毒载体)的一部分。
本发明进一步提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1的核酸序列或由其组成，或者由与SEQ ID NO:1的所述序列具有至少80％总体同一性的至少400bp的核酸序列组成，其中，当编码外源基因的核酸序列与所述分离的核酸分子可操作地连接时，所述分离的核酸分子使得外源基因在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中特异性表达，用于治疗与视网膜色素上皮相关的疾病。所述与视网膜色素上皮相关的疾病可以选自由以下组成的组：年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿病性视网膜病变和视网膜色素上皮增生。
所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1的核酸序列或由其组成，或者由与SEQ IDNO:1的所述序列具有至少80％总体同一性的至少400bp的核酸序列组成，其中，所述分离的核酸分子使得与编码所述基因的所述核酸序列可操作地连接的基因在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中的特异性表达可以是至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少750bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ ID NO:1的所述核酸序列具有至少80％的同一性。在一些实施例中，所述核酸序列为至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ ID NO:1的所述核酸序列具有至少85％总体同一性。在一些实施例中，所述核酸序列为至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ IDNO:1的所述核酸序列具有至少90％总体同一性。在一些实施例中，所述核酸序列为至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ ID NO:1的所述核酸序列具有至少95％总体同一性。在一些实施例中，所述核酸序列为至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ IDNO:1的所述核酸序列具有至少96％总体同一性。在一些实施例中，所述核酸序列为至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ ID NO:1的所述核酸序列具有至少97％总体同一性。在一些实施例中，所述核酸序列为至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ IDNO:1的所述核酸序列具有至少98％总体同一性。在一些实施例中，所述核酸序列为至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ ID NO:1的所述核酸序列具有至少99％总体同一性。在一些实施例中，所述核酸序列为至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp，并且与SEQ IDNO:1的所述核酸序列具有100％总体同一性。
本发明的所述分离的核酸分子可以包含最小启动子，如SV40最小启动子，例如，SV40最小启动子
可以与本发明的启动子可操作地连接的典型基因是编码光感受器的基因。例如，它可以是光敏分子，如视紫红质通道蛋白或盐细菌视紫红质。
使用本发明的启动子表达外源基因可以在体外、体内或离体进行。
如本文所用，术语“启动子”是指任何顺式调控元件，包括增强子、沉默子、绝缘子和启动子。启动子是DNA的通常位于需要转录的基因上游(朝向5'区域)的区域。启动子容许正确激活或抑制其控制的基因。在本发明的上下文中，启动子使得与它们可操作地连接的基因在中间神经元中的特异性表达。“特异性表达”，也称为“仅在某种类型的细胞中表达”，是指至少75％以上的表达目的基因的细胞属于特定类型，即本案中的视网膜色素上皮细胞(RPE)。
视网膜色素层或视网膜色素上皮(RPE)，也称为色素性黑质，是位于神经感觉视网膜外部的色素细胞层，其营养视网膜视觉细胞，并牢固地附着在下面的脉络膜和上方的视网膜视觉细胞上。RPE由单层的六边形细胞组成，这些细胞内密集分布着色素颗粒。在锯齿缘，RPE延续作为从睫状体上方通过的膜并继续作为虹膜的后表面。这形成了扩张肌的纤维。在这些上皮细胞的正下方是神经上皮细胞(即，视杆细胞和视锥细胞)，其与RPE共同通过。两者结合起来，被认为是胚胎的睫状体上皮。视网膜的前端延续是后虹膜上皮，其在进入虹膜后吸收色素。当从外表面观察时，这些细胞光滑，呈六边形。当以截面观察时，每个细胞由包含大椭圆形核的外部无色素部分和内部色素部分组成，该内部色素部分在视杆细胞之间以一系列直螺纹样过程延伸，特别是当眼睛暴露于光的情况下。RPE具有多种功能，即，光吸收、上皮转运、空间离子缓冲，视觉循环、吞噬作用、分泌和免疫调节。
典型地将表达盒引入载体中，该载体有利于表达盒进入宿主细胞并将表达盒保持在宿主细胞中。此类载体是常用的并且是本领域技术人员熟知的。许多此类载体可例如从英杰公司(Invitrogen)、斯特吉公司(Stratagene)、宝日医公司(Clontech)等商购获得，并且在许多指南中有描述，例如Ausubel、Guthrie、Strathem或Berger，全部同上。此类载体典型地包括启动子、多聚腺苷酸化信号等，连同多个克隆位点，以及其他元件，如复制起点、选择标记基因(例如，LEU2、URA3、TRP 1、HIS3、GFP)、着丝粒序列等。
病毒载体，如AAV、PRV或慢病毒，适用于使用本发明的启动子将基因靶向并递送至视网膜色素上皮细胞。
视网膜细胞的输出可以使用电学方法测量，如多电极阵列或膜片钳，或使用目视法测量，如荧光检测。
使用本发明的核酸序列的方法可以用于鉴定用于治疗神经障碍或涉及RPE细胞的视网膜障碍的治疗剂，所述方法包括以下步骤：将供试化合物与在本发明的启动子下表达一种或多种转基因的视网膜色素上皮细胞接触，并将在所述供试化合物存在的情况下获得的视网膜色素上皮细胞的至少一种输出与在所述供试化合物不存在的情况下获得的相同输出进行比较。
此外，使用本发明启动子的方法还可用于视觉恢复的体外测试，所述方法包括以下步骤：将在本发明启动子控制下表达一种或多种转基因的视网膜色素上皮细胞与试剂接触，并将与所述试剂接触后获得的至少一种输出与在与所述试剂接触前获得的相同输出进行比较。
视紫红质通道蛋白是视蛋白的一个亚家族，起到光学门控离子通道的作用。它们在单细胞绿藻中充当感觉光感受器，从而控制趋光性，即响应于光的运动。在其他生物体的细胞中表达时，它们能够用光来控制细胞内酸度、钙流入、电兴奋性和其他细胞过程。目前已知至少有三种“天然”视紫红质通道蛋白：视紫红质通道蛋白-1(ChR1)、视紫红质通道蛋白-2(ChR2)和Volvox视紫红质通道蛋白(VChR1)。此外，还存在这些蛋白质的一些修饰/改进形式。所有已知的视紫红质通道蛋白都是非特异性阳离子通道，传导H+、Na+、K+和Ca2+离子。
盐细菌视紫红质是一种光驱动的离子泵，对氯离子有特异性并发现于系统发育学上古老的“细菌”(古生菌)(被称为盐杆菌(halobacteria))中。它是亚视黄基(retinylidene)蛋白家族的七次跨膜蛋白，与光驱动的质子泵细菌视紫红质同源，并且在三级结构(而不是一级序列结构)上与脊椎动物视紫红质(视网膜中感受光的色素)相似。盐细菌视紫红质也与视紫红质通道蛋白(光驱动的离子通道)具有序列相似性。盐细菌视紫红质含有必需的光可异构化维生素A衍生物全反式视黄醛。盐细菌视紫红质是少数晶体结构已知的膜蛋白之一。盐细菌视紫红质同种型可以在多种盐杆菌中发现，包括盐生盐杆菌(H.salinarum)和嗜盐碱单胞菌(N.pharaonis)。许多正在进行的研究正在探索这些差异，并用它们来解析光循环和泵的性质。在细菌视紫红质之后，盐细菌视紫红质可以是研究的最佳I型(微生物)视蛋白。盐细菌视紫红质视网膜复合物的峰值吸光度为约570nm。最近，盐细菌视紫红质已成为光遗传学中的工具。就像蓝光激活的离子通道视紫红质通道蛋白-2开启了用短暂的蓝光脉冲激活可兴奋细胞(如神经元、肌肉细胞、胰腺细胞和免疫细胞)的能力一样，盐细菌视紫红质开启了用短暂的黄光脉冲使可兴奋细胞沉默的能力。因此，盐细菌视紫红质和视紫红质通道蛋白一起实现了神经活动的多色光激活、沉默和去同步，从而创造了强大的神经工程工具箱。
在一些实施例中，启动子是靶向视网膜的载体的一部分，所述载体表达至少一种在活的视网膜色素上皮细胞中可检测到的报道基因。此类报道基因可以指示功能性神经回路。此类载体的实例是活性感受器或虹彩病毒(Nature Methods[自然方法]6,127-130(2009))。此类病毒的实例是具有遗传编码的活性感受器的逆行突触性假狂犬病病毒(PRV)，该活性感受器可在光学上报告大脑中空间混合的神经元之间连接的神经元的活动。这种活性感受器可以是表达外源荧光活性感受器的分离的跨突触病毒。跨突触病毒可以是弹状病毒(例如，狂犬病毒)，或疱疹病毒，如α疱疹病毒(例如，假狂犬病病毒)。
荧光外源活性感受器可以是荧光蛋白Ca2+感受器(例如，yellow cameleon、camgaroo、G-CaMP/Pericam或TN-L15)，或者荧光蛋白电位感受器(例如，FlaSh、SPARC或VSP(优选为VSP1)。
适于本发明的病毒载体是本领域熟知的。如AAV、PRV或慢病毒，适用于将基因靶向并递送至视网膜色素上皮细胞。
当与分离的视网膜一起使用时，可以通过将神经节细胞侧向下固定来实现针对光感受器的最佳病毒递送，使得视网膜的光感受器侧暴露，从而可以更好地进行转染。另一种技术是对视网膜的内界膜进行切片(例如用剃刀刀片)，使得递送病毒可以穿透内膜。另一种方式是将视网膜包埋在琼脂中，对所述视网膜进行切片并从切片侧面施加递送病毒。
转染后的细胞的输出可以使用熟知的方法测量，例如使用电学方法，如多电极阵列或膜片钳，或使用目测法，如荧光检测。在一些情况下，通过对内界膜进行显微手术来去除内界膜。在其他情况下，通过对内界膜进行切片来实现记录。
用于本发明的视网膜细胞的来源是灵长类动物。在本发明的一些实施例中，视网膜细胞来自人视网膜或处于人视网膜中。在其他实施例中，视网膜来自另一灵长类动物，其来自两种不同系群(原猴和直鼻猴)中的任一种。人视网膜可以容易地从角膜库获得，其中所述视网膜通常在角膜解剖后丢弃。成人视网膜具有大的表面(约1100mm2)，并因此可以容易地分成许多实验亚区。此外，视网膜也可以用作突触通信的精巧模型，因为视网膜具有与大脑其他部分同一的突触。
如本文所用，术语“动物”在本文中用于包括所有动物。在一些实施例中，非人类动物是脊椎动物。动物的实例为人、小鼠、大鼠、牛、猪、马、鸡、鸭、鹅、猫、狗等。术语“动物”还包括处于所有发育期(包括胚胎和胎儿期)的个体动物。“经遗传修饰的动物”是含有一种或多种下述细胞的任何动物，所述细胞带有通过在亚细胞水平上的有意遗传操作，例如通过靶向重组、显微注射或重组病毒感染而直接或间接改变或接收的遗传信息。术语“经遗传修饰的动物”无意涵盖经典杂交或体外受精，而是意在涵盖其中一种或多种细胞被重组DNA分子改变或接收该重组DNA分子的动物。该重组DNA分子可以特异性地靶向限定的遗传基因座，可以随机整合到染色体内，或者可以是染色体外复制DNA。术语“种系遗传修饰的动物”是指其中将遗传改变或遗传信息引入种系细胞中，从而赋予将遗传信息传递给其后代的能力的经遗传修饰的动物。如果这种后代实际上具有该改变或遗传信息中的一些或全部，则它们也是经遗传修饰的动物。
该改变或遗传信息对于受者所属的动物物种可能是外来的，或者仅对于特定的个体受者是外来的，或者可以是受者已经具有的遗传信息。在最后一种情况下，该改变或引入的基因可以与天然基因不同地表达，或者根本不表达。
用于改变靶基因的基因可以通过多种技术获得，这些技术包括但不限于从基因组来源分离、由分离的mRNA模板制备cDNA、直接合成或其组合。
用于引入转基因的一类靶细胞是ES细胞。ES细胞可以从体外培养的植入前胚胎获得并与胚胎融合(Evans等人(1981),Nature[自然]292:154-156；Bradley等人(1984),Nature[自然]309:255-258；Gossler等人(1986),Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]83:9065-9069；Robertson等人(1986),Nature[自然]322:445-448；Wood等人(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:4582-4584)。可以通过标准技术例如使用电穿孔进行DNA转染或通过逆转录病毒介导的转导，将转基因有效地引入ES细胞中。之后可以通过聚集将得到的转化ES细胞与桑椹胚组合或注射到来自非人动物的囊胚中。之后所引入的ES细胞定殖于胚胎并产生所得嵌合动物的种系(Jaenisch(1988),Science[科学]240:1468-1474)。在产生基因靶向的经遗传修饰的小鼠中基因使用基因靶向的ES细胞如1987(Thomas等人(1987),Cell[细胞]51:503-512)所述，并另见综述(Frohman等人(1989),Cell[细胞]56:145-147；Capecchi(1989),Trends in Genet.[遗传性趋势]5:70-76；Baribault等人(1989),Mol.Biol.Med.[医学分子生物学]6:481-492；Wagner(1990),EMBO J.[EMBO杂志]9:3025-3032；Bradley等人(1992),Bio/Technology[生物/技术]10:534-539)。
有技术可用于通过使用靶向同源重组将特定变化插入染色体等位基因中，而使任何遗传区失活或改变成任何所需的突变。
如本文所用，“靶向基因”是通过人为干预(包括但不限于本文所述的方法)引入非人动物种系中的DNA序列。本发明的靶向基因包括被设计成特异性改变同源内源性等位基因的DNA序列。
在本发明中，“分离的”是指从其原始环境(例如，如果它是天然存在的，则为天然环境)中移出的材料，并因此“通过人工”从其天然状态改变。例如，分离的多核苷酸可以是载体或物质组合物的一部分，或者可以包含在细胞内，并且仍然是“分离的”，因为该载体、物质组合物或特定细胞不是多核苷酸的原始环境。术语“分离的”不是指基因组或cDNA文库、全细胞总体或mRNA制备物、基因组DNA制备物(包括通过电泳分离并转移到印迹上的那些)、剪切的全细胞基因组DNA制备物或其中本领域并未显示出本发明的多核苷酸/序列的区别性特征的其他组合物。分离的DNA分子的进一步实例包括保持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或溶液中的纯化(部分或基本上)DNA分子。分离的RNA分子包括本发明的DNA分子的体内或体外RNA转录物。然而，出于本发明的目的，作为某文库(例如，基因组或cDNA文库)的成员但尚未与该文库的其他成员分离(例如，呈含有克隆和该文库的其他成员的均一溶液的形式)的克隆中所含的核酸，或从细胞或细胞裂解物中移出的染色体(例如，“染色体分散”，如在核型中)，或随机剪切的基因组DNA的制备物，或经一种或多种限制酶切割的基因组DNA的制备物不是“分离的”。如本文进一步讨论的，根据本发明的分离的核酸分子可以是以天然、重组或合成方式产生的。
“多核苷酸”可以由单链和双链DNA、作为单链和双链区混合物的DNA、单链和双链RNA、以及作为单链和双链区混合物的RNA、包含可为单链或更常见为双链的或为单链和双链区混合物的DNA和RNA的杂交分子组成。另外，多核苷酸可由包含RNA或DNA或者RNA和DNA两者的三链区组成。多核苷酸还可以含有一个或多个经修饰的碱基或出于稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA主链。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化碱基和稀有碱基，如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括以化学、酶促或代谢方式修饰的形式。
表述“编码多肽的多核苷酸”涵盖仅包括该多肽的编码序列的多核苷酸以及包括另外的编码序列和/或非编码序列的多核苷酸。
“严格杂交条件”是指在42℃下在包含50％甲酰胺、5x SSC(750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5x邓哈特氏溶液(Denhardt's solution)、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的剪切鲑精DNA的溶液中过夜孵育，然后在约50℃下在0.1x SSC中洗涤过滤器。杂交和信号检测严格性的改变主要通过控制甲酰胺浓度(较低的甲酰胺百分比导致严格性降低)；盐条件或温度实现。例如，中等高严格性条件包括于37℃下在包含6X SSPE(20XSSPE＝3M NaCl；0.2M NaH2PO4；0.02M EDTA，pH 7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、100μg/ml阻断DNA的鲑鱼精液的溶液中过夜孵育；之后用1XSSPE,0.1％SDS于50℃下洗涤。另外，为了达到甚至更低的严格性，严格杂交后进行的洗涤可以在更高的盐浓度(例如5X SSC)下进行。上述条件的变化可以通过包含和/或替换用于抑制杂交实验中的背景的替代性阻断试剂来实现。典型的阻断试剂包括邓哈特氏试剂(Denhardt's reagent)、BLOTTO、肝素、变性鲑精DNA和市售专利配制剂。由于相容性问题，包含特定的阻断剂可能需要修改上述杂交条件。
当涉及多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”意指保留与此类多肽基本上相同的生物学功能或活性的多肽。类似物包括前蛋白(pro-protein)，它可以通过裂解前蛋白部分而激活以产生活性成熟多肽。
术语“基因”意指参与产生多肽链的DNA片段；它包括编码区之前和之后的区域“前导区和尾区”以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
多肽可以由通过肽键或修饰的肽键彼此连接的氨基酸组成，即肽等排体，并且可以含有除20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸。多肽可以通过天然过程(如翻译后加工)或通过本领域熟知的化学修饰技术进行修饰。此类修饰在基础教科书和更详细的专著以及大量研究文献中有充分描述。修饰可以发生在多肽中的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基末端或羧基末端。应当认识到，相同类型的修饰可以在给定多肽中的几个位点以相同或不同的程度存在。而且，给定多肽可以含有许多类型的修饰。例如，多肽可以例如由于泛素化而分支，并且它们可以是环状的，有或没有分支。环状、分支和分支环状多肽可以由翻译后的天然过程产生，或者可以通过合成方法制备。修饰包括但不限于乙酰化、酰化、生物素化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、通过已知的保护/阻断基团衍生化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、与抗体分子或其他分子配体连接、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工(例如，裂解)、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转运RNA介导的向蛋白质添加氨基酸(如精氨酸化)和泛素化。(参见，例如，PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES[蛋白-结构和分子性质],第2版,,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company[W.H.弗里曼出版集团],纽约(1993)；POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS[蛋白的翻译后共价修饰],B.C.Johnson,编辑,学术出版社,纽约,pgs.I-12(1983)；Seifter等人,Meth Enzymol[酶法]182:626-646(1990)；Rattan等人,Ann NY Acad Sci[纽约科学院院刊]663:48-62(1992)。)
“具有生物学活性”的多肽片段是指表现出与原始多肽(包括成熟形式)的活性相似但不一定同一的活性的多肽，如在特定生物学测定法中所测量的，具有或不具有剂量依赖性。在确实存在剂量依赖性的情况下，它不需要与该多肽的剂量依赖性同一，而是与原始多肽相比与给定活性中的剂量依赖性基本上相似(即，相对于原始多肽，候选多肽将表现出更强的活性或低不超过约25倍且在一些实施例中，低不超过约十倍的活性，或低不超过约三倍的活性。)
可以通过以下方式分离和鉴定物种同源物：由本文提供的序列制备合适的探针或引物，以及针对所需同源物对合适的核酸来源进行筛选。
“变体”是指与原始多核苷酸或多肽不同但保留其基本性质的多核苷酸或多肽。通常，变体与原始多核苷酸或多肽总体上非常相似，并且在许多区域中，与原始多核苷酸或多肽同一。
实际上，任何特定的核酸分子或多肽与本发明的核苷酸序列是否具有至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性可以使用已知的计算机程序常规确定。用于确定查询序列(本发明的序列)与目标序列(也称为全局序列比对)之间的最佳总体匹配的优选方法可以使用FASTDB计算机程序确定，该程序基于Brutlag等人(Comp.App.Blosci.[生物科学计算机应用](1990)6:237-245)的算法。在序列比对中，查询序列和目标序列都是DNA序列。可以通过将U转换为T来比较RNA序列。所述全局序列比对的结果是百分比同一性。用于DNA序列的FASTDB比对以计算百分比同一性的优选参数是：矩阵(Matrix)＝酉(Unitary)，k-元组(k-tuple)＝4，错配罚分(Mismatch Penalty)--1，连接罚分(Joining Penalty)--30，随机分组长度(Randomization Group Length)＝0，截止得分(Cutoff Score)＝l，空位罚分(Gap Penalty)--5，空位大小罚分(Gap Size Penalty)0.05，窗口大小(Window Size)＝500或目标核苷酸序列的长度(以较短者为准)。如果目标序列由于5'或3'缺失，而不是因为内部缺失而比查询序列短，则必须对结果进行人工校正。这是因为FASTDB程序在计算百分比同一性时不考虑目标序列的5'和3'截短。对于相对于查询序列在5'或3'末端截短的目标序列，通过计算查询序列中在目标序列5'和3'而未匹配/对齐的碱基数占查询序列总碱基数的百分比来校正百分比同一性。通过FASTDB序列比对的结果确定核苷酸是否匹配/对齐。然后从上述FASTDB程序使用指定参数计算的百分比同一性中减去该百分比，以得出最终的百分比同一性得分。该校正后的得分是用于本发明目的的得分。为了人工调整百分比同一性得分，仅计算目标序列5'和3'碱基外(如通过FASTDB比对展示的)未与查询序列匹配/对齐的碱基。例如，将90个碱基的目标序列与100个碱基的查询序列比对以测定百分比同一性。缺失发生在目标序列的5'末端，因此，FASTDB比对未显示5'末端前10个碱基的匹配/对齐。这10个受损碱基占序列的10％(5'和3'端未匹配的碱基数/查询序列中的碱基总数)，所以从通过FASTDB程序计算的百分比同一性得分中减去10％。如果剩余的90个碱基完全匹配，则最终的百分比同一性为90％。在另一个实例中，将90个碱基的目标序列与100个碱基的查询序列进行比较。这次缺失是内部缺失，所以在目标序列的5'或3'上没有与查询序列不匹配/对齐的碱基。在这种情况下，通过FASTDB计算的百分比同一性不进行人工校正。再次，仅人工校正目标序列5'和3'处与查询序列不匹配/对齐的碱基。然而，在特定情况下，总体同一性仅指与例如SEQ ID NO:1的序列具有至少一定相似程度的序列的部分。换言之，仅针对包含SEQ ID NO:1的序列部分或其极相似的部分计算2000bp查询序列的序列同一性。
所谓具有与本发明的查询氨基酸序列至少(例如)95％“同一”的氨基酸序列的多肽，旨在表示除了以下方面外，目标多肽的氨基酸序列与查询序列同一：目标多肽序列可以在查询氨基酸序列的每100个氨基酸中包括最多五个氨基酸改变。换言之，为了获得具有与查询氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列的多肽，目标序列中最多5％的氨基酸残基可以插入、缺失或用另一种氨基酸取代。参考序列的这些改变可以发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或那些末端位置之间的任何位置，单独散布在参考序列中的残基之间或参考序列内的一个或多个连续组中。
实际上，可以使用已知的计算机程序以常规方式测定任何特定多肽是否与例如序列中所示的氨基酸序列或与保藏DNA克隆所编码的氨基酸序列至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。用于确定查询序列(本发明的序列)与目标序列(也称为全局序列比对)之间的最佳总体匹配的优选方法可以使用FASTDB计算机程序确定，该程序基于Brutlag等人(Comp.App.Blosci.[生物科学计算机应用](1990)6:237-245)的算法。在序列比对中，查询序列和目标序列均为核苷酸序列或均为氨基酸序列。所述全局序列比对的结果是百分比同一性。用于FASTDB氨基酸比对的优选参数是：矩阵＝PAM 0，k-元组＝2，错配罚分--I，连接罚分＝20，随机分组长度＝0，截止得分＝I，窗口大小＝序列长度，空位罚分--5，空位大小罚分--0.05，窗口大小＝500或目标氨基酸序列的长度(以较短者为准)。如果目标序列由于N-或C-端缺失，而不是因为内部缺失而比查询序列短，则必须对结果进行人工校正。这是因为FASTDB程序在计算全局百分比同一性时不考虑目标序列的N-和C-端截短。对于相对于查询序列在N-和C-端截短的目标序列，通过计算查询序列中在目标序列N-和C-端而未与相应目标残基匹配/对齐的残基数占查询序列总碱基数的百分比来校正百分比同一性。通过FASTDB序列比对的结果确定残基是否匹配/对齐。然后从上述FASTDB程序使用指定参数计算的百分比同一性中减去该百分比，以得出最终的百分比同一性得分。该最终百分比同一性得分是用于本发明目的的得分。为了人工调整百分比同一性得分，仅考虑目标序列N-和C-端未与查询序列匹配/对齐的碱基。也就是说，仅查询位于目标序列的最远N-和C-端残基外的残基位置。仅人工校正目标序列N-末端和C-末端外(如FASTDB比对中所展示的)与查询序列不匹配/对齐的残基位置。出于本发明的目的，不需要进行其他人工校正。
天然存在的蛋白质变体称为“等位基因变体”，并且是指占据生物染色体上的给定基因座的基因的几种替代性形式之一。(Genes[基因]11，Lewin,B.编，纽约约翰威利国际出版公司(John Wiley&Sons,New York)(1985)。)这些等位基因变体可以在多核苷酸和/或多肽水平上变化。替代性地，非天然存在的变体可以通过诱变技术或通过直接合成而产生。
“标记”是指能够直接地或通过与信号产生系统的一个或多个另外成员相互作用而提供可检测信号的试剂。可直接检测并且可用于本发明的标记包括荧光标记。特定的荧光团包括荧光素、若丹明、BODIPY、花青染料等。
“荧光标记”是指当被另一波长的光激发时能够发射某一波长的光的任何标记。
“荧光”是指任何可检测的荧光信号特征，包括强度、光谱、波长、胞内分布等。
“检测”荧光是指使用定性或定量方法评估细胞的荧光。在本发明的一些实施例中，将以定性方式检测荧光。换言之，是否存在荧光标记，表明重组融合蛋白是否表达。对于其他情况，可以使用定量手段测定荧光，例如，测量荧光强度、光谱或胞内分布，从而允许对不同条件下获得的值进行统计比较。该水平还可以使用定性方法来测定，例如视觉分析和人为对多个样品进行比较，例如，使用荧光显微镜或其他光学检测器(例如，图像分析系统等)检测样品。荧光的“改变”或“调制”是指在特定条件下与另一条件相比，荧光的强度、胞内分布、光谱、波长或其他方面的任何可检测的差异。例如，以定量方式检测“改变”或“调制”，并且差异是统计学上显著的差异。荧光的任何“改变”或“调制”可以使用标准仪器，如荧光显微镜、CCD或任何其他荧光检测器来检测，并且可以使用自动化系统(如集成系统)来检测，或者可以通过人类观察者来反映对改变的主观检测。
“绿色荧光蛋白”(GFP)是一种由238个氨基酸组成的蛋白质(26.9kDa)，该蛋白质最初从水母维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)/水螅水母(Aequoreaaequorea)/肋骨水母(Aequorea forskalea)分离，当暴露于蓝光时发出绿色荧光。来自维多利亚多管发光水母的GFP具有在395nm的波长下的主要激发峰和在475nm处的次要激发峰。其发射峰在509nm处，这处于可见光谱的绿色下部。来自海肾(Renilla reniformis)的GFP具有在498nm处的单个主要激发峰。由于广泛使用的潜力和研究人员不断变化的需求，已经工程设计了许多不同的GFP突变体。第一个主要的改进是1995年由Roger Tsien在Nature[自然]上报道的单点突变(S65T)。这种突变显著改善了GFP的光谱特征，导致增强的荧光、光稳定性和主要激发峰迀移至488nm而发射峰保持在509nm。将37℃折叠效率(F64L)点突变添加至这个支架产生了增强的GFP(EGFP)。EGFP的消光系数(表示为ε)，也称为其光学截面，为9.13×10-21m2/分子，也作为55,000L/(mol·cm)引述。2006年报道了超级折叠GFP，这是一系列允许GFP即使在与弱折叠肽融合时也快速折叠和成熟的突变。
“黄色荧光蛋白”(YFP)是源自维多利亚水母的绿色荧光蛋白的遗传突变体。其激发峰为514nm且发射峰为527nm。
如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”也包括复数指示物。
“病毒”是不能在宿主细胞外生长或繁殖的亚微观感染因子。每种病毒颗粒或病毒粒子由在称为衣壳的保护性蛋白外壳内的遗传物质DNA或RNA组成。衣壳形状从简单的螺旋和二十面体(多面体或近球形)形式到更复杂的具有尾部或包膜的结构变化。病毒感染细胞生命形式并且根据感染的宿主类型，分为动物、植物和细菌类型。
如本文所用的术语“跨突触病毒”是指能够通过突触从一个神经元迁移到另一个相连神经元的病毒。此类跨突触病毒的实例是弹状病毒，例如狂犬病病毒和α疱疹病毒，例如假狂犬病病毒或单纯疱疹病毒。如本文所用的术语“跨突触病毒”还涵盖自身具有通过突触从一个神经元迁移到另一个相连神经元的能力的病毒亚单位和包含此类亚单位并展示出通过突触从一个神经元迀移到另一个相连神经元的能力的生物载体(如经修饰的病毒)。
跨突触迀移可以是顺行的或逆行的。在逆行迁移期间，病毒将从突触后神经元移动到突触前神经元。因此，在顺行迁移期间，病毒将从突触前神经元移动到突触后神经元。
同源物是指具有共同祖先的蛋白。类似物没有共同的祖先，但具有一些功能(而非结构)相似性，使得将它们包括在一个类别中(例如胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶明显不相关-它们在活性位点外的结构完全不同，但它们具有几何学上几乎同一的活性位点，并因此被认为是趋同进化为类似物的实例)。
同源物有两个亚类-直系同源物和旁系同源物。直系同源物是不同物种中的相同基因(例如细胞色素“c”)。相同生物体中的两个基因不可能是直系同源物。旁系同源物是基因复制的结果(例如血红蛋白β和δ)。如果两种基因/蛋白是同源的并且在相同的生物体中，则它们是旁系同源物。
如本文所用，术语“障碍”是指小病、疾病、病痛、临床病症或病理病症。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性、是化学惰性的并且对所施用的患者无毒的载剂介质。
如本文所用，术语“药学上可接受的衍生物”是指例如使用本发明的筛选方法鉴定的、对受试者相对无毒的药剂的任何同源物、类似物或片段。
术语“治疗剂”是指有助于预防或治疗障碍或障碍的并发症的任何分子、化合物或治疗。
可以制备配制在相容性药物载剂中的包含这种药剂的组合物、包装并贴标签以用于治疗。
如果复合物是水溶性的，则可以将其配制在合适的缓冲液中，例如磷酸盐缓冲盐水或其他生理上相容的溶液。
替代性地，如果所得的复合物在水性溶剂中的溶解性差，则可以用非离子表面活性剂如吐温(Tween)或聚乙二醇配制。因此，化合物及其生理上可接受的溶剂化物可以被配制成通过以下方式施用：吸入或吹入(通过口或鼻)或口服、含服、肠胃外、直肠施用，或者在肿瘤的情况下，直接注射到实体瘤中。
对于口服施用，药物制剂可以呈液体形式，例如溶液、糖浆或悬浮液，或者可以作为在使用前用水或其他合适的媒介物复原的药物产品来呈现。此类液体制剂可以通过常规方式与药学上可接受的添加剂一起制备，所述药学上可接受的添加剂如助悬剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如，杏仁油、油性酯或分馏植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或者山梨酸)。药物组合物可以采用例如片剂或胶囊剂的形式，通过常规方法与药学上可接受的辅料一起制备，所述药学上可接受的辅料如粘合剂(例如，预糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)。片剂可以通过本领域熟知的方法包衣。
可以适当地配制用于口服施用的制备物以实现活性化合物的控释。
为了通过吸入施用，根据本发明使用的化合物方便地以气溶胶喷雾的形式从加压包装或喷雾器中使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)递送。在加压的气溶胶的情况下，可以通过提供阀门来确定剂量单位，以递送经计量的量。吸入器或吹药器中使用的例如明胶的胶囊和药筒可以配制成含有化合物和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
化合物可以被配制成通过注射，例如通过推注或连续输注而进行肠胃外施用。注射用制剂可以以单位剂型呈现，例如，在添加了防腐剂的安瓿中或多剂量容器中。
该组合物可以采取例如溶于油性媒介物或水性媒介物的悬浮液、溶液或乳剂的形式，并且可以含有配制剂(例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂)。替代性地，活性成分可以呈粉末形式，以在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)复原。
化合物也可以配制成供局部应用，如霜剂或洗剂。
除了先前描述的制剂以外，化合物还可配制成贮库(depot)制剂。此类长效型制剂可以通过植入(例如，眼内、皮下或肌内)或通过肌内注射而施用。
因此，例如，化合物可以用合适的聚合或疏水性材料配制(例如配制成可接受的油中的乳液)或用离子交换树脂配制，或配制成难溶性衍生物，例如配制成难溶性盐。脂质体和乳液是用于亲水性药物的递送媒介物或载剂的熟知实例。
如果需要，组合物可以呈现于包装或分配装置中，该包装或分配装置可以含有一个或多个包含活性成分的单位剂型。该包装例如可以包含金属箔或塑料箔，例如泡罩包装。该包装或分配装置可以附有施用说明。
本发明还提供了用于实施本发明的治疗方案的试剂盒。此类试剂盒在一个或多个容器中包含治疗或预防有效量的药学上可接受形式的组合物。
试剂盒的小瓶中的组合物可以呈药学上可接受的溶液的形式，例如与无菌盐水、葡萄糖溶液或缓冲溶液或其他药学上可接受的无菌流体组合。替代性地，复合物可以冻干或脱水；在这种情况下，试剂盒任选地进一步在容器中包含优选地为无菌的药学上可接受的溶液(例如，盐水、葡萄糖溶液等)，以将复合物复原以形成用于注射目的的溶液。
在另一个实施例中，试剂盒进一步包含优选以无菌形式包装以用于注射复合物的针或注射器，和/或包装好的酒精垫。任选地包括供临床医生或患者施用组合物的说明书。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但是以下描述合适的方法和材料。在冲突存在的情况下，则以包括定义在内的本说明书为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的而不旨在限制。
实例
基因构建体
本实例使用的启动子(964bp；SEQ ID NO:3)由与SEQ ID NO:2的最小启动子SV40启动子偶联的SEQ ID NO:1中的一种组成。在该启动子和优化的Kozak序列(GCCACC)之后立即插入ChR2-eGFP编码序列，之后插入土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)和SV40聚腺苷酸化位点。使用滴度为2.9E+10GC/mL的AAVs血清型2/8靶向视网膜神经元。
病毒转染和组织制备
对于AAV施用，通过尖锐的30号针头刺入麻醉动物的眼睛靠近晶状体的巩膜中。通过Hamilton注射器在视网膜下注射2微升AAV颗粒悬液。3周后，将分离的视网膜在PBS中的4％PFA中固定30min，之后是于4℃下在PBS中进行的洗涤步骤。在室温下用PBS中的10％正常驴血清(NDS)、1％BSA、0.5％曲通(Triton)X-100处理整个视网膜1小时。在室温下用在PBS中的3％NDS、1％BSA、0.5％曲通X-100中的单克隆大鼠抗GFP抗体(分子探针公司(Molecular Probes Inc.)；1:500)和多克隆山羊抗-ChAT(密理博公司(Millipore)：1:200)处理5天。用驴抗大鼠Alexa Fluor-488二抗(分子探针公司；1:200)、抗山羊AlexaFluor-633和Hoechst处理2小时。洗涤切片，用ProLong Gold抗褪色试剂(分子探针公司)封固在载玻片上，并使用Zeiss LSM 700Axio Imager Z2激光扫描共聚焦显微镜(卡尔·蔡司公司(Carl Zeiss Inc.))拍照。
Claims (34)
1.一种在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中表达外源基因的体外或离体方法，所述方法包括将分离的核酸分子递送至所述灵长类动物的视网膜色素上皮细胞的步骤，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1的核酸序列，其中，当编码所述外源基因的核酸序列与所述分离的核酸分子可操作地连接时，所述分离的核酸分子有效地驱动所述外源基因在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中表达。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述分离的核酸分子与所述外源基因可操作地连接。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述分离的核酸分子进一步包含最小启动子序列。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述最小启动子序列包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述外源基因编码视紫红质通道蛋白(chanelrhodopsin)或盐细菌视紫红质(halorhodopsin)。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述分离的核酸分子是表达盒的一部分。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述表达盒是载体的一部分。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述载体是病毒载体。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述灵长类动物是人。
11.如权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述灵长类动物是非人灵长类动物。
12.分离的核酸分子在制备用于使外源基因在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中表达的药物中的用途，其中所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1的核酸序列，其中，当编码所述外源基因的核酸序列与所述分离的核酸分子可操作地连接时，所述分离的核酸分子有效驱动外源基因在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中表达。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述分离的核酸分子与所述外源基因可操作地连接。
14.如权利要求12所述的用途，其中，所述分离的核酸分子进一步包含最小启动子序列。
15.如权利要求14所述的用途，其中，所述最小启动子序列包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
16.如权利要求12所述的用途，其中所述外源基因编码视紫红质通道蛋白或盐细菌视紫红质。
17.如权利要求12所述的用途，其中，所述分离的核酸分子是表达盒的一部分。
18.如权利要求17所述的用途，其中，所述表达盒是载体的一部分。
19.如权利要求18所述的用途，其中，所述载体是病毒载体。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
21.如权利要求12-20任一项所述的用途，其中所述灵长类动物是人。
22.如权利要求12-20任一项所述的用途，其中所述灵长类动物是非人灵长类动物。
23.一种分离的核酸分子在制备治疗与视网膜色素上皮相关的疾病中使用的药物中的用途，其中所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1的核酸序列，其中，当编码外源基因的核酸序列与所述分离的核酸分子可操作地连接时，所述分离的核酸分子有效驱动所述外源基因在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中表达。
24.如权利要求23所述的用途，其中，所述与视网膜色素上皮相关的疾病选自由以下组成的组：年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿病性视网膜病变和视网膜色素上皮增生。
25.如权利要求23所述的用途，其中所述分离的核酸分子与所述外源基因可操作地连接。
26.如权利要求23所述的用途，其中，所述分离的核酸分子进一步包含最小启动子序列。
27.如权利要求26所述的用途，其中，所述最小启动子序列包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
28.如权利要求23所述的用途，其中所述外源基因编码视紫红质通道蛋白或盐细菌视紫红质。
29.如权利要求23所述的用途，其中，所述分离的核酸分子是表达盒的一部分。
30.如权利要求29所述的用途，其中，所述表达盒是载体的一部分。
31.如权利要求30所述的用途，其中，所述载体是病毒载体。
32.如权利要求31所述的用途，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
33.如权利要求23-32任一项所述的用途，其中所述灵长类动物是人。
34.如权利要求23-32任一项所述的用途，其中所述灵长类动物是非人灵长类动物。
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