CN101747425B - 与视网膜光反应相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与视网膜光反应相关的蛋白及其编码基因与应用。该蛋白质命名为MGARP，是如下a)或b)的蛋白：a)其氨基酸序列是序列表中序列2；b)在序列表中序列2限定的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与视网膜光反应相关由(a)衍生的蛋白质。本发明还公开了MGARP蛋白的编码基因。MGARP基因可用来建立转基因小鼠模型或药物筛选模型。MGARP基因或MGARP蛋白也可用来筛选或制备治疗视网膜疾病的药物或能量代谢疾病的药物。

Description

与视网膜光反应相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及与视网膜光反应相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

视网膜是动物眼壁组织的重要组成部分，是光感信号通路中一个必不可少的信号转换区，它将外界的光感信号转化为神经信号并经由视神经传送之大脑。视网膜病变的发生常会导致视力丧失甚至失明，其中老年黄斑病变失明症(Age-relatedMacular Degeneration，AMD)、糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy，DR)是典型的视网膜病变疾病。近年来，视网膜病变的发生率逐年提高，其中AMD已成为老年人主要的致盲疾病，70岁以上人群发生率接近20％(Marx J et al.，2006，Science，311：1704-1705；Hollyfield JG et al.，2008，Nature Medicine，14：194-198)。DR是糖尿病的严重眼部并发症，糖尿病发病后晚期几乎所有患者都有眼部并发症，其中失明的糖尿病患者大约有85％是由视网膜病变引起的(Hammes HP，2005，Horm Metab Res，37：39-43)。

但是，目前对视网膜病变机理的研究仍存在很多未知的领域，使得视网膜病变在临床治疗面临着诸多问题(Rosenfeld PJ et al.，2006，N Engl J Med，355：1419-1431；Hu J et al.，2007，Nature Reviews Drug Discovery，6：480-498)。关于视网膜特异性表达蛋白的研究为解读人类疾病和治疗视网膜病变提供重要的依据和参考，其中关于老年黄斑病变失明症的研究进展被美国《科学》杂志评为2006年十大科学进展。

视网膜特异性表达一些特殊的酸性蛋白，因其富含谷氨酸而被命名为GARP(Glutamic Acid-rich Protein)，编码该蛋白的基因序列在1989年首次从小牛视网膜克隆出来(Sugimoto Y et al.，1991，Proc Natl Acad Sci，88：3116-3119)。目前已知的GARP蛋白一共有三种：可溶性GARP1、GARP2以及GARP’(也是cGMP门控离子通道位于胞浆N端的B1亚基)。GARP蛋白一个显著的特性是富含谷氨酸，其中GARP1和GARP’蛋白的C端110个氨基酸残基中谷氨酸占61％。此外，GARP2也比一般球状蛋白多出将近一倍的谷氨酸残基。2006年研究者分析GARP蛋白结构时发现，GARP蛋白在自然状态下表现出非折叠的结构形式(Safferling RB，2006，J Biol Chem，281：1449-1460)，而这种特殊的非折叠结构正是由于高含量的酸性带正电的氨基酸残基——谷氨酸而形成的。已有研究表明，GARP蛋白参与调节视杆细胞光感信号传递，但其调控机理和作用机制方面的研究还存在大量空白(Pentia DC，2006，J Biol Chem，281：5500-5505)。

发明内容

本发明的目的是提供与视网膜光反应相关的蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的与视网膜光反应相关的蛋白，命名为MGARP，是如下a)或b)的蛋白：

a)其氨基酸序列是序列表中序列2；

b)在序列表中序列2限定的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与视网膜光反应相关由(a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中序列2由283个氨基酸残基组成。

为了使a)中的MGARP便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列	大小/kDa
				Poly-Arg	5-6(通常5个)	RRRRR	0.80
Poly-His	2-10(通常6个)	HHHHHH	0.84
				FLAG	8	DYKDDDDK	1.01
Strep-tagII	8	WSHPQFEK	1.06
				c-myc	11	MASMQKLISEEDL	1.20
HA	9	YPYDVPDYA	1.10

GST	231	MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGS	26
				GFP	239	MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK	26.9

上述b)中的MGARP可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的MGARP的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第19-870所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

MGARP蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述的基因具体可是如下1)或2)或3)或4)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1；

2)其编码序列是序列表中序列1自5′末端第19-870位；

3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码与与视网膜光反应相关的蛋白的DNA分子；

4)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码上述与视网膜光反应相关的蛋白的DNA分子。

所述步骤4)中的基因，与1)的基因最好有95％以上的同源性。

序列表中的序列1由852个碱基组成，自5′末端第19-870位为编码区，编码序列表中序列2的蛋白质。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

扩增上述MGARP基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述MGARP基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

MGARP蛋白免疫动物获得的多克隆抗体也属于本发明的保护范围。

MGARP基因可用来建立转基因小鼠模型或药物筛选模型。MGARP基因或MGARP蛋白也可用来筛选或制备治疗视网膜疾病的药物或能量代谢疾病的药物。

其中，所述视网膜疾病为糖尿病视网膜病变、视网膜光损伤或老年性视网膜黄斑病。

本发明的MGARP蛋白富含酸性氨基酸，特别是谷氨酸，但却又与已知的富含谷氨酸的视网膜蛋白GARP具有较低的相似性。组织分布研究显示，MGARP基因不仅在视网膜中特异性地高表达，同时在肾脏、睾丸和脾脏等重要调节器官中也有较高的表达水平。对其细胞定位进行系统研究的结果表明该蛋白定位在细胞的线粒体上，预示其可能是视网膜疾病相关的一个重要基因。更重要的是该基因的表达在黑暗条件下会降低，而光照情况下又可以被显著诱导提高，说明该基因能够参与视网膜对光反应，将在视网膜光损伤以及能量代谢等相关视网膜疾病方面发挥重要作用。

附图说明

图1为MGARP基因的RT-PCR扩增结

图2为MGARP与GST融合蛋白在大肠杆菌BL21中的表达纯化图。

图3为MGARP多克隆抗体Western Blot检测结果。

图4为MGARP多克隆抗体免疫荧光染色检测结果。

图5为MGARP基因的RT-PCR组织分布检测结果。

图6为MGARP在细胞线粒体中定位的检测结果。

图7为MGARP在视网膜中分布的检测结果。

图8为MGARP在黑暗和光照处理时表达水平的变化。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

实施例1、与视网膜光反应相关的蛋白MGARP

一、MGARP基因的获得

根据基因芯片技术筛选出的小鼠视网膜特异性表达基因片段为模板，将测序所得的序列结果通过NCBI BLASTn工具(http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/)搜索，得到可能的cDNA和EST序列片段为参考序列，设计引物MGARP1和MGARP2，克隆出小鼠的完整编码序列。

MGARP1：5’-CGA GAA TTC ACC ATG TAT CTC CGC AGG GCT GTG；

MGARP2：5’-CCG CTC GAG ACC TTG GGG TGA TGC TGT TTC。

以提取的昆明小鼠(北京市实验动物研究中心)视网膜总RNA为模板，用TaKaRa公司的One Step RNA PCR Kit(AMV)扩增目的片段。

PCR扩增条件为：先94℃4min；然后94℃45sec，60℃45sec，72℃1min，30个循环；最后72℃10min。

经RT-PCR扩增得到了特异性片段。将该片段克隆到pGEM-T-Easy(Promega)载体上，获得重组载体pGEM-T-MGARP，经EcoR I酶切鉴定后进行测序。

图1A为小鼠的RT-PCR扩增结果：1为DNA分子量标准，2为RT-PCR产物。

测序结果表明，RT-PCR产物为852bp，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，编码283个氨基酸残基，其氨基酸序列如序列表中的序列2所示。

经Bioedit软件分析蛋白序列，序列2所示蛋白的谷氨酸残基含量为17％，等电点为4.15，分子量为29.9kDa。经预测(http:www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)，该蛋白在42-64AA处有一个跨膜区。由于其富含酸性氨基酸，是一种新的蛋白，命名为MGARP(a Novel Retinal Glutamic acid-rich Protein)。

二、MGARP基因在大肠杆菌中的表达与纯化

用EcoR I和Xho I双酶切pGEM-T-MGARP载体(如前所述)，并经凝胶回收目的片段，以T4 DNA连接酶连接到经EcoR I和Xho I双酶切的pGEX-4T-1(AmershamPharmacia)上，经EcoR I和Xho I双酶切鉴定得到构建正确的重组载体pGEX-4T-1-MGARP。

将pGEX-4T-1-MGARP转化大肠杆菌DH5a，在含氨苄青霉素50μg/mL的LB平板中筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取pGEX-4T-1-MGARP，再将pGEX-4T-1-MGARP转化大肠杆菌BL21，37℃过夜培养，然后以1∶100的体积将新鲜菌液比接种于1L含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB摇瓶中，37℃培养至OD600＝0.6时，将菌液置于冰上预冷，加入IPTG至终浓度为0.1mM，16℃振荡培养20h，诱导蛋白表达。

在诱导前和诱导后分别取1ml和0.5ml菌液，离心后去除上清，加入50μL去离子水备用。4℃，5000rpm，离心10min收集诱导后的菌体，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4，下同)重悬，先加入DTT至终浓度5mM，后加溶菌酶至1mM，冰上搅拌溶菌30-60min。随后在冰上超声波破碎，超声0.5s中止0.5s，5min为一个循环，共超声4个循环，每个循环间隔5min。破碎后的菌液在4℃，12000rpm离心30min，收集上清，留样50μl。上清加入含1ml Glutathione-Sepharose-4B(AmershamPharmacia)填料的预装柱中，收集流出液，重复上样3次。待液面下降至与填料相切时，用含100mM NaCl的Tris-HCl缓冲液清洗柱子，共清洗五倍柱体积，收集洗脱液，留样20μl。其后用洗脱缓冲液(100mM谷胱甘肽，GST、100mM NaCl、100mMTris-HCl)洗脱GST-MGARP融合蛋白，每次加入500μl洗脱缓冲液，收集流出液到1.5ml离心管中，共收集10管标记为E1-E10，每管取20μl留样。洗脱结束后，用两柱体积的3M NaCl的Tris-HCl清洗柱子，最后用Tris-HCl重新平衡柱子，并将其保存在20％乙醇中。留取的样品加入等体积的2×蛋白上样缓冲液，于沸水中煮样5min后，放置冰上冷却，取25μl混合液进行SDS-PAGE电泳分析。

SDS-PAGE电泳分析结果表明，表达出的GST-MGARP融合蛋白在SDS-PAGE中比预测偏大，与以往报道的富含谷氨酸的蛋白的表现是一致的。

图2中泳道1是低分子标准蛋白质，泳道2和3分别是IPTG诱导前和诱导后的表达产物，泳道4和5分别是超声波裂菌后的上清和沉淀，泳道6和7是含100mMNaCl的Tris-HCl缓冲液清洗柱子后的流出液，泳道8-12分别是洗脱液E1-E5，泳道13和14分别是洗脱液E7，E9，泳道15是3M NaCl的Tris-HCl处理后流出液。

三、MGARP多克隆抗体的制备

将纯化后的蛋白洗脱液E2-E5加入Sephadex G200分子筛层析柱(Pharmacia)层析柱脱盐和进一步纯化。先用去离子水清洗柱子，再用25mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液平衡，流速控制为0.3ml/min，并检测流出液经过280nm紫外检测的读数，读数稳定不再变时加入蛋白洗脱液E2-E5，用25mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集UV280nm峰值样品即为脱盐后蛋白样品GST-MGARP。

紫外分光光度计测蛋白浓度，每次取500μg作为抗原蛋白免疫兔子。首次免疫用完全弗士佐剂与蛋白样品按1∶1体积比例充分混匀乳化，取小滴混合液滴于水中，若能呈球形悬浮于水中而不弥散，说明乳化充分，可供免疫。使用一次性无菌针筒将混匀的抗原样品对兔子进行皮下注射，注射点至少选取三处以上。间隔1周后用不完全弗士佐剂加强，方法同完全弗士佐剂，一共免疫4次。免疫4次后取兔血，37℃静置4h，4℃，4000rpm离心10min，取上层血清，检测mMGARP多克隆抗体的效价。

四、Western Blot检测MGARP多克隆抗体

用EcoRI和Xho I双酶切pGEM-T-MGARP并经凝胶回收目的片段，以T4 DNA连接酶连接到经EcoR I和Xho I双酶切的真核表达载体pcDNA3.1-Myc/His(Invitrogen)上，构建出真核表达质粒pcDNA3.1-Myc-MGARP。然后用Vigofect脂质体转染试剂(Vigorus)，按常规的细胞转染方法将pcDNA3.1-Myc-MGARP瞬时转染293T细胞，转染24h后收获并裂解细胞，4℃，12000rpm离心10min收集上清液，加入等体积2×蛋白上样缓冲液，以此样品进行SDS-PAGE和Western Blot检测。Western Blot按照常规方法进行，其中一抗分别使用1∶1000比例稀释的鼠源抗Myc抗体(Santa Cruz)和多个梯度稀释的MGARP多克隆抗体，二抗分别使用辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(中杉金桥)和辣根酶标记山羊抗兔IgG(中杉金桥)，以β-actin作为内参。

Western Blot检测结果如图3A所示，泳道1-2是阴性对照，分别是不含任何质粒的细胞裂解液样品和含pcDNA3.1空质粒的细胞裂解液样品，用1∶1000稀释的MGARP多克隆抗体杂交，并没有检测出任何特异条带。泳道3-7均为含pcDNA3.1-Myc-MGARP质粒的细胞裂解液样品，其中泳道7是抗Myc抗体为一抗，作为阳性对照，检测出Myc-MGARP特异性蛋白条带，泳道3-6是经梯度稀释的MGARP多克隆抗体为一抗(稀释比例依次为1∶200，1∶500，1∶1000，1∶2000)，均可特异检测出真核细胞表达的Myc-MGARP蛋白，且在同样的实验条件和稀释浓度(1∶1000)下比商业Myc抗体检测效果更显著。按1∶10000的浓度稀释，MGARP抗体依然能特异地检测到MGARP蛋白条带的存在，说明MGARP抗体具有较好的滴度(图3B)图3B中“1∶2000、1∶3000、1∶5000和1∶10000”代表MGARP多克隆抗体的稀释度。

五、免疫荧光染色检测MGARP多克隆抗体

EcoR I和Apa I酶切pcDNA3.1-Myc-MGARP上经和凝胶回收纯化后，克隆到经EcoR I和Apa I双酶切处理的pEGFP-N2载体上(BD Bioscience Clotech)，用同样的两种酶进行酶切鉴定，构建可在真核中表达GFP-MGARP融合蛋白的质粒pEGFP-N2-MGARP。用步骤四中所述方法将质粒转染Hela细胞。转染24h前，预先在新的35mm培养皿或六孔板中放入无菌干净的24mm×24mm盖玻片，再将细胞按40-60％密度接种到盖玻片上。转染24h后，去掉培养基，用预冷的PBS轻轻清洗一遍，每皿或每孔加入1ml固定液(含4ml/100ml多聚甲醛的PBS)，室温放置10min后，去掉固定液，PBS清洗两遍，加入1ml穿透液(含0.2ml/100ml Tritoin X-100的PBS)，室温10min后用PBS清洗两遍，用封闭液(含10ml/100ml牛血清的PBS)37℃孵育1h。其后将盖玻片从培养皿中取出，一抗在湿盒中37℃孵育1h(抗体稀释与2ml/100ml牛血清的PBS)。一抗选用按1∶2000稀释的MGARP多克隆抗体。除去一抗，重新把盖玻片放回培养皿中，用PBST缓冲液(含0.05ml/100mlTween-20，1g/100ml BSA的PBS)洗5min，3次。用二抗稀释液避光孵育，37℃1h，二抗选用按1∶200稀释的TRITC荧光标记山羊抗兔IgG(中杉金桥)。除去二抗，用PBST洗涤5min，5次，加入Hoechst 33342(Sigma)复染细胞核，用PBS洗涤5min，4次，然后用甘油封片。激光共聚焦显微镜(Olympus)600倍下观察并拍照的结果。

图4为激光共聚焦显微镜(Olympus)600倍下观察的结果，其中图4A蓝色为Hoechst标记的细胞核，图4B绿色为GFP绿色荧光蛋白，图4C红色为TRITC红色荧光，图4D黄色是绿色与红色叠加。

光共聚焦显微镜(Olympus)600倍下观察的结果表明转染了pEGFP-N2-MGARP的Hela细胞，融合蛋白GFP-MGARP自身被激发出绿色荧光，与TRITC红色荧光标记的MGARP抗体免疫位点可完全重合而呈黄色，说明MGARP抗体能特异识别真核细胞表达的MGARP蛋白，可应用于免疫荧光染色实验。

六、MGARP在小鼠组织中的表达分布

将昆明小鼠(北京市实验动物研究中心)处死后，迅速取出其不同组织，将这些组织分别在液氮中研磨，至粉末状后，按照Trizol试剂(Invitrogen)使用说明书的操作方法提取组织总RNA，用紫外分光光度计测定RNA的浓度，1％的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。以相同量的小鼠不同组织总RNA为模板进行半定量RT-PCR，以β-actin作为内参。

RT-PCR结果如图5所示，表明MGARP基因在小鼠的视网膜中表达量最大，在睾丸、肾脏和脾中表达量也很高，在脑和血也有较低水平的表达，说明该基因在小鼠各脏器中均有表达，与机体生理和发育有密切的关系。

七、MGARP在线粒体定位检测

亚细胞定位预测(http://www.cb.dtu.dk/services/TargetP)表明，MGARP蛋白极有可能定位在线粒体膜上，故采用线粒体特异荧光探针MitoTracker Red(Invitrogen)判断MGARP是否定位于线粒体。pEGFP-N2-MGARP质粒转染的Hela细胞，转染后24h，去掉培养基，用37℃预热的PBS清洗两遍，避光加入含100nMMitoTracker荧光探针的PBS，37℃避光孵育10min，去掉探针，PBS清洗5min，2次。同步骤五的方法固定细胞，PBS清洗两遍后加入Hoechst 33342(Sigma)复染细胞核，用PBS洗涤5min，4次，然后用甘油封片，在激光共聚焦显微镜(Olympus)600倍下观察并拍照。转染pEGFP-N2空载体的Hela细胞作为对照。

图6为MGARP细胞定位结果图，蓝色是Hochest标记的细胞核，绿色是GFP绿色荧光蛋白，红色是MitoTracker探针标记的线粒体。

图6A是转染pEGFP-N2空载体的Hela细胞对照组，GFP在细胞核和细胞质中均匀分布；图6B是转染pEGFP-N2-MGARP质粒的Hela细胞，GFP-MGARP融合蛋白呈颗粒状或短线状分布于细胞质中(与步骤五的结果吻合)，明显区别于GFP均匀分布的状态，而与MitroTracker标记的线粒体分布基本一致，二者可重合而呈黄色，说明MGARP蛋白定位于细胞质的线粒体中。目前研究已知线粒体是能量代谢和细胞凋亡发生的重要场所，这说明MGARP蛋白在能量代谢相关疾病方面具有重要功能，包括糖尿病视网膜病变、视网膜光损伤以及老年性视网膜黄斑病等。

八、MGARP在视网膜中分布的检测

将正常昆明小鼠(北京市实验动物研究中心)的视网膜组织用10％中性甲醛固定，石蜡包埋。用MGARP多克隆抗体进行特异性免疫，采用免疫荧光法进行组织切片染色，在激光共聚焦显微镜下观察组织内MGARP的表达情况。

激光共聚焦显微镜观察结果如图7所示，MGARP在视网膜的各个层次中均表达(图7中OS为光受体外节层；IS为光受体内节层；ONL为外核层；OPL为外网层；INL为内核层；IPL为内网层；GCL为节细胞层)，特别是在内节层(IS，inner segmentof photoreceptor)、外网层(OPL，outer plexiform layer)以及节细胞层(GCL，ganglion cell layer)中表达最高，且均在胞质中表达。而视网膜的这些区域中是含有线粒体最多的部位，特别是节细胞层，这些结果与上述细胞定位的结果是一致的。视网膜视部除中央凹和视神经盘外，还包括四层细胞，自外向内为色素上皮层、视细胞层、双极细胞层和节细胞层。视细胞层中含有视锥细胞和视杆细胞，这些组织均与感光有关，因此说明MGARP与视网膜对光的反应密切相关。

九、MGARP在黑暗和光照处理时表达水平的变化

将正常正常昆明小鼠(北京市实验动物研究中心)30只，分为3组，每组10只。第一组给予持续光照处理(L48)，第二组暗处理(D48)48小时，第三组不予任何干预，按照正常光周期饲养(L/D)。实验重复3次。

处理后将上述小鼠处死，取出视网膜组织进行蛋白提取。将小鼠组织在预冷的细胞裂解缓冲液(50mmol/L Tris，150mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，0.5％NP-40，0.1％SDS)中研磨，然后均匀摇动30分钟，再4度低温离心10分钟(10000g)，把上清导入一个预冷的干净离心管中，弃去沉淀。然后用Western blot的方法进行蛋白水平的检测。Western blot的方法同步骤四。

Western blot结果如图8所示，第二组小鼠的视网膜组织的MGARP在黑暗时表达量会降低，第一组小鼠的视网膜组织的MGARP在光照情况下表达水平提高。由此，进一步说明MGARP对外界的光刺激会做出反应，参与视网膜的光传递和光保护作用。

序列表

<110>清华大学

<120>与视网膜光反应相关的蛋白及其编码基因与应用

<130>CGGNARW82073

<160>2

<210>1

<211>1207

<212>DNA

<213>小鼠属小家鼠(Mus musculus)

<400>1

acgggggggc atctggcgat gtatctccgc agggctgtgt ccaagactct ggcgctgccc    60

cggagggcgc ccccgggtcc cgcgccgctg gggaaggacg catctcttcg ccgaatgtca    120

tccaggaaat tccctggaac atctggctcc aatatgatct attacctggt tgtaggtgtg    180

acagtcagtg ctggtggata ttacacttac aaggctttaa catcaaagca agtgagacgt    240

acagaacatg tagctgaacc gaaagaacaa acaaaggcgg agttgcaacc acttccaggt    300

gaaaaggaag agcatgtggc agaagccgag caagtgtgtt cagagcctgg agacactgct    360

gtaacggaag ctgaatcggt agatgctgag gaagtcccag aggctgcagt tgtgcttcca    420

gaagagtctc aggcctccgc cccctccgag gtccctgccg aagctgccgt ggtggaggca    480

tccttatcga gctcagagcc tgagctgaag ataaccgagg cttccctggt ggagactacc    540

gagagtgtcc ctgagtctac tcaggaggtg gagagtgcag ccccagacca ggatgacgtt    600

tgcaatgagg gggctgatac tagccaggag ggcgctgata ccagccagga gggggctgat    660

accagccagg agggcgctga taccaccaag gaggaggctg ataacagcaa ggaggctgaa    720

ggtaccacta ctgaggaccc gcgctcgatc tccgaggaga gtgccgaact agaagaaagc    780

cctcccttag gctcagaacc ccctgcccag cctgagtcac aagaagaaga aacccaggtc    840

acagaggaaa cagcatcacc ccaaggttga tctgcaaaat tctatagttg cttttgtatt    900

tttagtgacc ttagcccttc ttcctagaat attttaatat accttaaaga atttaacttt  960

actaatagat atttgattgg gagttggtat tttacaagtc ttaatagttt ttccaccctc  1020

taaaatcagg ctgtgttaag accttaaata gtgttaagtt tggatttaag ttttacgttt  1080

tagaaactga gttatctatg caaccggtgt cactttgatt ttcctttgcc tttctcttac  1140

tttgttctat gtaagaccag attactgggt ttgctgtgaa ctcatttaaa taaaattaga  1200

aaatcct                                                            1207

<210>2

<211>283

<212>PRT

<213>小鼠属小家鼠(Mus musculus)

<400>2

Met Tyr Leu Arg Arg Ala Val Ser Lys Thr Leu Ala Leu Pro Arg Arg

1               5                   10                  15

Ala Pro Pro Gly Pro Ala Pro Leu Gly Lys Asp Ala Ser Leu Arg Arg

            20                  25                  30

Met Ser Ser Arg Lys Phe Pro Gly Thr Ser Gly Ser Asn Met Ile Tyr

        35                  40                  45

Tyr Leu Val Val Gly Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr

    50                  55                  60

Lys Ala Leu Thr Ser Lys Gln Val Arg Arg Thr Glu His Val Ala Glu

65                  70                  75                  80

Pro Lys Glu Gln Thr Lys Ala Glu Leu Gln Pro Leu Pro Gly Glu Lys

                85                  90                  95

Glu Glu His Val Ala Glu Ala Glu Gln Val Cys Ser Glu Pro Gly Asp

            100                 105                 110

Thr Ala Val Thr Glu Ala Glu Ser Val Asp Ala Glu Glu Val Pro Glu

        115                 120                 125

Ala Ala Val Val Leu Pro Glu Glu Ser Gln Ala Ser Ala Pro Ser Glu

    130                 135                 140

Val Pro Ala Glu Ala Ala Val Val Glu Ala Ser Leu Ser Ser Ser Glu

145                 150                 155                 160

Pro Glu Leu Lys Ile Thr Glu Ala Ser Leu Val Glu Thr Thr Glu Ser

                165                 170                 175

Val Pro Glu Ser Thr Gln Glu Val Glu Ser Ala Ala Pro Asp Gln Asp

            180                 185                 190

Asp Val Cys Asn Glu Gly Ala Asp Thr Ser Gln Glu Gly Ala Asp Thr

        195                 200                 205

Ser Gln Glu Gly Ala Asp Thr Ser Gln Glu Gly Ala Asp Thr Thr Lys

    210                 215                 220

Glu Glu Ala Asp Asn Ser Lys Glu Ala Glu Gly Thr Thr Thr Glu Asp

225                 230                 235                 240

Pro Arg Ser Ile Ser Glu Glu Ser Ala Glu Leu Glu Glu Ser Pro Pro

                245                 250                 255

Leu Gly Ser Glu Pro Pro Ala Gln Pro Glu Ser Gln Glu Glu Glu Thr

            260                 265                 270

Gln Val Thr Glu Glu Thr Ala Ser Pro Gln Gly

        275                 280         283

Claims (2)

1.氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白或其基因在筛选或制备治疗视网膜疾病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述视网膜疾病为糖尿病视网膜病变、视网膜光损伤或老年性视网膜黄斑病。

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