CN100467487C

CN100467487C - 具有多种功能的多肽

Info

Publication number: CN100467487C
Application number: CNB2004100986271A
Authority: CN
Inventors: 王应; 张颖妹; 韩文玲; 马大龙; 刘雅楠; 李丹
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2004-12-14
Filing date: 2004-12-14
Publication date: 2009-03-11
Anticipated expiration: 2024-12-14
Also published as: CN1789282A; WO2006063518A1; US20070292443A1; US7465453B2

Abstract

本发明涉及如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽或如SEQ ID NO：2的9-27位氨基酸所示的多肽(统称CKLF1 C末端多肽)，以及编码CKLF1 C末端多肽的多核苷酸，含有所述多核苷酸的基因工程载体和宿主细胞。同时，本发明还涉及药物组合物，该药物组合物含有所述多肽或所述多核苷酸、载体、宿主细胞，和/或一种或一种以上药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。本发明还涉及体外检测来自待测者的样品中；本发明所述的多肽或多核苷酸的表达水平是否变化的方法；本发明还涉及与本发明的多肽或其活性片段特异性结合的单克隆或多克隆抗体；本发明的多肽或多核苷酸用于预防和/或治疗HIV感染、过敏性疾病、移植排斥、脑部疾病或自身免疫病。

Description

具有多种功能的多肽

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别地，本发明涉及具有多种功能的多肽及编码其的多核苷酸，含有所述多核苷酸的载体或宿主细胞及它们的应用。

背景技术

趋化因子是一类具有趋化作用的细胞因子，在机体的免疫调节、炎症反应、干细胞增殖分化等过程中发挥重要作用。目前，趋化因子已经成为国内外研究的热点之一。申请人利用抑制性减数杂交技术，从PHA刺激的U937细胞中，成功克隆了一个新的具有趋化活性的细胞因子，即趋化素样因子1(chemokine-like factor 1，CKLF1)。CKLF1编码99个氨基酸，在体内、外具有广谱的趋化活性，注射CKLF1真核表达质粒的小鼠肺部炎性病变明显，表现与哮喘发病后期的病理改变非常相似。已申请中国发明专利和国际专利，中国专利申请号是99107284.7，国际专利号是PCT/CN00/00026，国际专利公布号是WO 00/69910。在CKLF1(其核酸序列在Gen-bank^TM的注册登记号为AF096895)的基础上，本发明人又陆续得到了一些新的多肽。

发明内容

发明人构建了CKLF1果蝇表达系统，经表达、纯化，获得分泌表达的CKLF1重组蛋白。这种重组蛋白对外周血单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及U937细胞仍然具有趋化作用。进一步通过SDS-PAGE分离获得CKLF1蛋白条带，进行N端测序，得到两种CKLF1分泌多肽，命名C19、C27多肽(统称CKLF1 C末端多肽)；申请人也利用CKLF1重组蛋白研究其受体，发现CCR4、CCR5是CKLF1的受体。申请人又进一步化学合成了C19、C27多肽，并对化学合成的C19、C27多肽的相互作用受体进行了研究，发现CCR4、CCR5、CCR6是C19、C27多肽的相互作用受体，表现出刺激或者拮抗的活性。例如，在预防和/或治疗HIV(人免疫缺陷病毒)中，当C19、C27多肽与受体结合，阻止HIV与受体结合或这些受体与已知配体的相互作用。另外，申请人惊奇地发现，CKLF1 C末端多肽不仅具有与CKLF1相同的趋化因子相互作用受体，而且表现具有拮抗作用，同时，CKLF1 C末端多肽可化学合成，更有应用前景。尤其CKLF1C末端多肽的受体拮抗剂作用在预防和/或治疗HIV(人免疫缺陷病毒)、移植排斥、脑部疾病、自身免疫病或治疗过敏性疾病中更理想。

因此，本发明的一个目的是提供一种多肽。

本发明另一个目的是提供一种多核苷酸。

本发明的另一目的是提供一种含有本发明的多核苷酸的载体。

本发明的另一目的是提供一种含有本发明的载体的宿主细胞。

本发明的另一目的是提供一种药物组合物，该药物组合物含有本发明的多肽、多核苷酸、载体、或宿主细胞，和/或一种或一种以上药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的另一目的是提供本发明的多肽或多核苷酸在制备预防和/或治疗人免疫缺陷病毒感染、过敏性疾病、移植排斥、脑部疾病或自身免疫病的药物中的应用。本发明的另一目的是提供检测待测样品中本发明的多肽或多核苷酸的表达水平是否变化的方法。

本发明的另一目的是提供一种单克隆或多克隆抗体，其与本发明的多肽或其具有抗原性的片段特异性结合。

本发明提供一种多肽，该多肽包含：

(1)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽，或如SEQ ID NO：2的9-27位氨基酸所示的多肽；或

(2)与(1)具有至少80％同源性的多肽，该多肽的功能与(1)的功能相同或相似。

如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽(在本发明中称为C27)，为CKLF1多肽的C末端27个氨基酸序列(CKLF1多肽的核酸序列在Gen-bank^TM的注册登记号为AF096895，另外还可参见国际申请：PCT/CN00/00026，中国专利申请：99107284.7)。本发明SEQ ID NO：2所示序列的片段也在本发明的范围内，如SEQ ID NO：2的9-27位氨基酸所示序列，也就是CKLF1多肽的C末端19个氨基酸序列(在本发明中称为C19)。在本发明中C27和C19统称为CKLF1 C末端多肽。本发明多肽还包括与如SEQID NO：2所示的氨基酸序列，或如SEQ ID NO：2的9-27位氨基酸所示序列的同源性(序列匹配)超过80％，优选超过85％，更为优选超过90％，更进一步优选超过95％，特别优选超过98％，更进一步特别优选超过99％的序列。这些序列可以与本发明的SEQID NO：2所示的序列或如SEQ ID NO：2的9-27位氨基酸所示序列具有相同、相似或不同的生物学功能，优选具有相同或相似的功能。

本发明CKLF1 C末端多肽或其片段可以是天然的、合成的、半合成的、或者重组产生。本发明CKLF1 C末端多肽可按照Steward和Young(Steward，J.M.和Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.，(1984))描述的方法用AppliedBiosystem合成仪或Pioneer^TM肽合成仪按固相化学技术合成。一般，这些方法包括向成长的肽链上依次添加一个或多个氨基酸或适当保护的氨基酸。通常，第一个氨基酸的氨基或羧基用适当的保护基保护，然后将保护的氨基酸连在惰性固相载体上，随后在适于形成酰胺键的条件下加入相应氨基或羧基被适当保护的序列中的下一个氨基酸。然后从新加入的氨基酸残基上除去保护基，再加入必要时适当保护的下一个氨基酸，如此重复操作。当所有氨基酸以正确的顺序连接后，相继或同时除去任何剩余的保护基和固相支持物，得到最终的多肽。通过简单修改此标准程序，可能一次向成长链添加一个以上的氨基酸。在本发明的一个优选实施方案中，使用自动合成仪制备本发明的多肽。其中使用α氨基被酸或碱敏感性基团保护的氨基酸。这种保护基应该在肽键形成条件下稳定，又容易除去而不破坏成长的肽链、不会引起其中的任何手性中心外消旋。适当的保护基有9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)、2-氰基叔丁氧羰基等。9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)是合成本发明肽特别优选的。也可按常规的生物工程方法由宿主细胞中的重组DNA序列编码产生本发明的多肽(具体参见实施例1-4)。在实施例1-4中，申请人将CKLF1编码序列插入表达系统，经表达、纯化，获得分泌表达的CKLF1重组蛋白，进一步通过SDS-PAGE分离获得CKLF1蛋白条带，进行N端测序，得到本发明的C19、C27多肽。本领域技术人员已知，可以直接使用编码本发明的多肽的多核苷酸序列产生本发明的CKLF1C末端多肽，例如将编码本发明的多肽的多核苷酸序列(如SEQ ID NO：1所述的序列或其片段)直接插入表达系统，经表达、纯化，获得本发明的多肽。或者可使用衍生于本发明的DNA构建体的mRNA，在无细胞翻译系统中产生所需的多肽。

本领域普通技术人员已知，本发明所述的多肽或其片段可以同其它的多肽或其片段形成融合多肽。其它多肽或其片段一般是已知的，有些可以以载体形式购买得到，或者可以按常规方法合成或从已知生物体中克隆得到。

本发明优选的多肽为：

(2)与(1)具有至少90％同源性的多肽，该多肽的功能与(1)的功能相同。

本发明还提供一种多核苷酸，该多核苷酸包含：

(1)编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多核苷酸，或编码如SEQ ID NO：2所示的9-27位氨基酸序列的多核苷酸；或

(2)与(1)具有至少80％同源性的多核苷酸，该多核苷酸编码的多肽与(1)编码的多肽具有相同的功能。

如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为CKLF1多肽的C末端27个氨基酸序列(C27)。如SEQ ID NO：2的9-27位氨基酸所示的序列为CKLF1多肽的C末端19个氨基酸序列(C19)。本发明的多核苷酸序列可以只编码CKLF1 C末端多肽，也可以在上述多肽的编码序列的基础上，增加非编码序列，例如内含子、编码序列5′或3′端的非编码序列等。本发明的多核苷酸序列最好是以分离形式提供的。本发明的多核苷酸是“分离”形式的，其不仅已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开，而且已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来。

本发明还包括与编码CKLF1 C末端多肽或其片段的多核苷酸具有至少有70％、80％、85％，较好90％、95％，最好98％同源性的多核苷酸序列。特别涉及在严格条件下与CKLF1 C末端多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸，所说的“严格条件”意指发生杂交的前提是序列间至少具备95％的同源性。这样的序列可以是天然存在或人工产生的，可以包括CKLF1 C末端多肽的多核苷酸序列的等位基因变异体、也可以包括CKLF1 C末端多肽多核苷酸序列中碱基的缺失、插入及置换。这样的序列编码的多肽可以在功能上与本发明的CKLF1 C末端多肽相同、相似、或不同，但最好是编码与CKLF1 C末端多肽的生物学活性基本相同的多肽。因此，优选与编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多核苷酸序列或其片段具有至少80％同源性的多核苷酸，该多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的多肽具有相同的功能。

本发明的多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA，DNA可以是双链或是单链形式，单链DNA可以是编码链或是非编码链(反义链)。本发明所述的反义链可以为如SEQ ID NO：1所示的序列的互补序列。本领域普通技术人员已知，反义链或者其一部分(反义寡核苷酸)可用于抑制细胞内本发明CKLF1 C末端多肽的表达。本发明的CKLF1 C末端多肽的核苷酸序列可以来自任何物种，特别是哺乳动物，包括牛、羊、猪、鼠、马，优选人类。

如SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列为一种编码本发明C27多肽的多核苷酸，其来自人类。如SEQ ID NO：1的25-81位所示的多核苷酸序列为一种编码本发明C19多肽的多核苷酸，其来自人类。所以，优选本发明的多核苷酸包含如SEQ ID NO：1所示的多核苷酸或其互补序列，或如SEQ ID NO：1的25-81位所示的多核苷酸。

本发明还涉及一种基因工程载体，该基因工程载体含有编码本发明的C末端多肽的多核苷酸。所述基因工程载体可以是普通载体、表达载体等。其中普通载体主要用于各种基因组文库和cDNA文库的建立，它们通常含有两个或两个以上的标记基因，其中一个基因用于选择转化体(transformant)，另一基因则是用于检查载体中是否有外源DNA插入。表达载体主要用于研究基因的表达或是用于大量生产一些有用的转录产物或蛋白质，有的也可用于cDNA文库的建立。这类载体除具有普通型载体的特征外，还应含有适当的启动子、核糖体结合位点、终止子等。为了便于表达产物在细胞中定位，在多肽编码序列上游可加入适当的前导序列。合适载体和启动子的选择为本领域普通技术人员周知。本领域普通技术人员周知用于构建含有本发明的多核苷酸以及合适的转录及翻译调控元件之载体的方法。具体地说，适用于原核细胞的市售表达载体一般均带有可选择标志和细胞复制原点，带有lacI、T7、λPL和trp等细菌启动子，以及已知克隆载体pBR322(ATCC 37017)的其他遗传元件。这样的市售载体包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)。可根据所选用的适当启动子和待表达的结构基因序列来选择衍生于pBR322的适当载体。GST原核表达系统也可用于本发明。适用于真核细胞的载体带有真核细胞启动子如CMV、SV40等，这样的载体包括pMT-hIL-3(马大龙，狄春辉，庞健等(1991)高技术通讯11：26-29)、pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)，以及pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。在本发明的实施例1中CKLF1编码序列插入pCDNA3.1-myc-his6(Invitrogen公司)表达载体，构建pCDNA3.1-CKLF1-myc-his6表达质粒。将PCR产物用EcoR I+Xho I双酶切处理后，与用EcoR I+Xho I双酶切的pMT/V5-HisA载体(Invitrogen公司)连接，得到pMT/V5-HisA-CKLF1-myc-his6质粒。

本发明还涉及一种宿主细胞，该宿主细胞含有编码本发明CKLF1 C末端多肽的多核苷酸。宿主包括但不限于：原核宿主，诸如大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等；真核宿主，诸如：酵母属、曲霉属、昆虫细胞，诸如果蝇S2和草地夜蛾Sf9；动物细胞，如CHO、COS(猴肾成纤维细胞系，Gluzman(Cell 23:175，1981))及其它的能表达相容载体的细胞系。本领域技术人员周知将含有本发明的多核苷酸的构建体导入上述宿主细胞的方法，包括但不限于：氯化钙介导的转化、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、显微注射、粒子轰击法或基因枪方法(Sambrook，J.(1989)，Molecular Cloning，aLaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N.Y.；Ausubel，F.M.(1989)CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.；Hobbs，S.等人，McGraw HillYearbook of Science and Technology(1992)，McGraw Hill，N.Y.191-196；Engelhard，E.K.等人，PNAS，91:3224-3227；Logan，J.等人，PNAS，81:3655-3659)。在适当的培养条件与培养基中培养经转化的宿主菌株或细胞，使其生长到恰当的细胞密度之后，用适当的方法(例如温度转变或化学品诱导)诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。针对不同的宿主菌株或细胞以及所表达的目的多肽的性质选择相应的培养条件和培养基在本领域技术人员知识范围之内。例如：在本发明实施例1中使用的宿主细胞为XL1-Blue大肠杆菌，在实施例2中使用的宿主细胞为果蝇S2细胞，转染方法为氯化钙转染方法，在实施例7中使用的宿主细胞为HEK293细胞(ATCC CRL-1573)，转染方法为电穿孔方法。

本发明提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的CKLF1 C末端多肽、编码本发明的多肽的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、宿主细胞，和/或一种或一种以上药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。“药物可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触，而无过多的毒性、刺激、变态反应等的盐。本发明的药物可接受的盐是本领域药剂学常规组分。这种盐可以在本发明多肽的最终分离和纯化的过程中制备，也可以将多肽与适当的有机或无机酸或碱反应单独制备。药学上可接受的载体或赋形剂指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料。

本发明还提供本发明的CKLF1 C末端多肽在制备预防和/或治疗人免疫缺陷病毒感染、过敏性疾病、移植排斥、脑部疾病或自身免疫病的药物中的应用。

目前研究发现，介导HIV进入细胞的辅助受体包括：CCR3、CCR5、CXCR4、CX3CR1，目前研制的人免疫缺陷病毒(HIV)感染的抑制剂包括来自于病毒蛋白的Kaposi氏肉瘤相关泡疹病毒编码的趋化因子和HHV-8vMIP，能与多种趋化因子受体结合而抑制HIV与辅助受体结合感染细胞；还有经修饰改造的人趋化因子及小分子化合物特异地结合CCR5、CXCR4而抑制HIV感染细胞。本发明的CKLF1 C末端多肽与多种趋化因子受体结合，并与HIV结合的辅助受体相吻合(具体参见实施例7-8)，而且是来自于人体的多肽，利于长期有效地使用。因此，CKLF1 C末端多肽在用于防止HIV的感染与播散中有很大的优势。

特应性皮炎，哮喘，和过敏性鼻炎是常见的过敏性疾病，与Th2细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞的迁移有关，一种治疗策略是利用趋化因子受体拮抗剂来防止这些效应细胞的迁移。CCR3、CCR4、和CCR8通常表达于Th2细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞。CCR5也与哮喘发生有关。本发明通过确切的实验证明，CKLF1 C末端多肽是CCR4和CCR5的功能性配体。因此CKLF1 C末端多肽还可以在抑制过敏性疾病方面起作用。

研究表明CCR5与脑部疾病有关。在多发性硬化症脑损伤部位的活化的小神经胶质细胞、侵润的T细胞，及Alzheimer’s病(阿尔茨海墨氏病)脑损伤部位的小神经胶质细胞均可检测到CCR5表达，在本发明的实施例7-8中证明，CKLF1 C末端多肽是CCR5的配体，因此，CKLF1 C末端多肽可用于抑制这些疾病中慢性炎症引起的损害。

CCR5及其配体还参与了移植排斥反应、类风湿关节炎，CCR5还与丙型肝炎的发生有关。CCR6与银屑病有关。在本发明的实施例7-9中证明，CKLF1 C末端多肽具有与上述多种受体相结合的作用，提示CKLF1 C末端多肽可以用于阻止移植排斥反应、类风湿关节炎、丙型肝炎的发生和/或银屑病的防治。

自身免疫病、过敏性疾病、HIV感染等疾病与趋化因子及其受体密切相关，拮抗剂是一个主要的治疗手段。本发明通过实验证明，本发明的CKLF C末端多肽具有与趋化素因子受体结合的特性，而其又来源于人类本身，所以CKLF1 C末端多肽在多种疾病的治疗方面具有广阔的应用前景。

本发明还提供一种体外检测来自待测者的样品中本发明所述的多肽或多核苷酸的表达水平的方法，该方法为反转录-聚合酶链式反应或蛋白质印迹检测方法。

可以采用本领域已知的任何方法检测本发明所述的多肽或多核苷酸的表达水平。优选利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测所述多核苷酸在核酸水平的表达水平；或利用特异性单克隆或多克隆抗体检测所述多核苷酸在蛋白质水平的表达水平，例如或蛋白质印迹(Western blotting)检测方法。所述待测样品可以从来自受试者的细胞获得，如来自血液、尿、唾液、胃液、头发，活组织检查和尸体解剖材料的细胞。PT-PCR主要分以下步骤：提取总RNA，加入一个与mRNA 3’端互补的引物，在反转录酶的作用下合成cDNA；第二步是以cDNA为模板，再加入与cDNA互补的另一引物(两引物位于不同的外显子上，以避免基因组DNA污染)进行PCR扩增。蛋白质印迹主要分三阶段：第一阶段为抗原等蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；第二阶段为电转移：将在凝胶中已分离的条带转移到硝酸纤维素膜上；第三阶段为显色检测：硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)，依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成显色物的酶反应底物，使条带染色。标记二抗的酶包括辣根过氧化物酶(horseradishPeroxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatease，AP)。也可以使用葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。在本发明的一个实施方式中，采用辣根过氧化物酶作为标记二抗的酶。本领域普通技术人员已知，针对不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于临苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS等。碱性磷酸酶的底物一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)，AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮)。常用的酶标第二抗体已有市售。

本发明还提供对本发明CKLF1 C末端多肽或其抗原性片段具有特异性的多克隆和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里所述的“特异性”是指抗体能结合于本发明的CKLF1 C末端多肽基因产物或片段。优选那些能与本发明的CKLF1 C末端多肽的基因产物结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制本发明CKLF1 C末端多肽基因产物的抗体，也包括那些并不影响本发明CKLF1 C末端多肽功能的抗体。本发明还包括那些能与本发明CKLF1 C末端多肽具有至少80％同源性的蛋白或活性片段特异性结合的抗体。上述抗体不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域普通技术人员已知的各种方法进行制备。例如，纯化的本发明CKLF1 C末端多肽基因产物或其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达本发明的CKLF1 C末端多肽或具有其抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体优选单克隆抗体，其可利用杂交瘤技术制备(见Kohler等人，Nature 256:495；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T cell Hybridaomad，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的各类抗体可以利用本发明的CKLF1 C末端多肽基因产物或其片段或功能区，通过常规免疫技术获得，这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用蛋白合成仪合成。与本发明CKLF1 C末端多肽的基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如，E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或蛋白)，可以用真核细胞(例如酵母或哺乳细胞，例如兔)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

附图说明

图1显示PCR鉴定稳定转染S2细胞株染色体DNA(包含hCKLF1-myc编码区序列)的电泳结果，其中，第1泳道为以DL2000 DNA为分子量标准，第2泳道为以pMT/V5-HisA转染S2细胞染色体为模板，第3泳道为以pMT/V5HisAhCKLF1-myc转染的S2细胞染色体为模板，用相同的hCKLF1(p1，p2)为引物扩增。

图2为RT-PCR鉴定稳定转染S2细胞株有hCKLF1-myc mRNA的转录，其中，第1泳道为分子量标准，第2、3、4泳道是分别以pMT/V5HisAhCKLF1-myc、pMT/V5HisA、S2空细胞为模板，以CKLF1(P1，P2)为引物，第5、6、7是与上述模板相同，而以G3PDH(p1，P2)为引物进行的RT-PCR，其中5、6、7分别作为内部标准。

图3显示利用Western Blotting检查目的蛋白的表达结果。在图3A中可以看出，加入兔Anti-hCKLF1多肽抗体，抗兔IgG HRP为二抗反应，经X片显影可见8-10kd处有两条清晰条带(图中箭头所示)；在图3B中可以看出，加入Anti-c-myc抗体作用后，再加入抗鼠IgG HRP二抗反应，经X光片显影，在8-10kd处有两条清晰条带(图中箭头所示)。

图4显示纯化后的蛋白质样品经15％SDS-PAGE电泳，直接考马斯亮蓝染色。箭头所指为CKLF1myc蛋白质。

图5显示纯化后的蛋白质样品转移至PVDF膜后做Western Bloting鉴定结果。条带1为分子量标准，条带2为S2/pMT上清液；条带3为S2/CKLF1细胞裂解液；条带4为S2/CKLF1上清液。

图6A和图6B显示纯化后的蛋白质样品转移至PVDF膜后N端测序结果。其中，图6A表示C19肽，6B表示C27肽。

图7显示钙流分析的实验结果，其中CCR4的相应配体为TARC，CCR5的的相应配体为RANTES。A-D为CCR4转染细胞；E-H为CCR5转染细胞。A中a-b为100nMTARC刺激后，c-d为167nM C27；B中a-b为167nM C27，c-d为100nM TARC；C中a-b为100nM TARC，c-d为167nM C19；D中a-b为167nM C19，c-d为100nM TARC；E中a-b为100nM RANTES，c-d为167nM C27；F中a-b为167nM C27，c-d为100nMRANTES；G中a-b为100nM RANTES，c-d为167nM C19；H中a-b为167nM C19，c-d为100nM RANTES。

图8A和图8B为钙流变化图像的相对荧光用Leica confocal软件分析。其中，图8A为CCR4转染细胞；图8B为CCR5转染细胞。

图9显示CKLF1 C末端多肽对CCR4或CCR5转染细胞的趋化作用，其中，图9A：转染CCR4未处理的HEK293细胞及用CKLF1 C末端多肽、TARC或PTX预处理30min的HEK293/CCR4细胞；图9B：转染CCR5未处理的HEK293细胞及用CKLF1 C末端多肽、RANTES或PTX预处理30min的HEK293/CCR5细胞。图中，M代表RPMI-1640；T代表TARC；27代表C27；19代表C19；P代表PTX；R代表RANTES。

图10显示纯化的pMT/V5HisA-CKLF1-myc蛋白对U937细胞的趋化活性。

图11显示纯化的pMT/V5HisA-CKLF1-myc蛋白对CCR4转染的HEK293细胞的趋化活性及脱敏效应。

图12显示CKLF1 C末端多肽对趋化因子受体CCR6内在化的影响。其中，1为对照，2为BSA，3为MIP3-α，4为C27多肽，5为C19多肽。

具体实施方式

实施例1、构建pMT/V5-HisA-CKLF1-myc-his6融合蛋白表达质粒

构建pMT/V5-HisA-CKLF1-myc-his6质粒，用于表达CKLF1-myc-his6融合蛋白。

一、方法：

将CKLF1编码序列(SEQ ID NO：3)插入pCDNA3.1-myc-his6(Invitrogen公司)表达载体，构建pCDNA3.1-CKLF1-myc-his6表达质粒。以测序正确的pCDNA3.1-CKLF1-myc-his6为模板，用T7为上游引物(5’-TGTAA TACGA CTCAC TATAG-3’(SEQ ID NO：4))以及带有Xho I酶切位点的下游引物(5′-CAT TGA GTT TAA ACG GTC TCG AGC GG-3′(SEQ ID NO：5))进行PCR，获得编码CKLF1-myc-his6融合蛋白的DNA片段，电泳回收PCR产物，用EcoR I+Xho I双酶切处理后，与用EcoR I+Xho I双酶切的pMT/V5-HisA载体(Invitrogen公司)连接，得到pMT/V5-HisA-CKLF1-myc-his6质粒。连接产物转化XL1-Blue大肠杆菌，筛选正向插入的克隆，测序验证质粒的正确性后，进行质粒扩增，用Qiagen 100提取质粒，用于细胞转染。

二、结果：

经DNA测序编码区序列正确。

实施例2、质粒转染细胞筛选稳定细胞株

一、方法：

对数生长的果蝇S2(Drosophila Schneider 2)细胞调成3×106细胞/3ml浓度在35cm平皿中28℃培养16小时进行转染，2M CaCl₂ 36μl，pMT/V5-HisA hCKLF1-myc DNA1μg/μl 19μl，PCoHyGro 1μg/μl1μl，用水补足300μl体积，缓缓加入到等体积2XHBS缓冲液中，室温静置30分钟，混合液慢慢滴入准备好的细胞中，同时设pMT/V5-HisA空载体转染细胞及未转染的S₂细胞对照，28℃培养16小时，将转染后的细胞离心，PBS离洗两次，换含10％FBS的新鲜培养基培养，72小时后再次离心细胞，换上含10％FBS新鲜培养基后，加入潮霉素B至终浓度300μg/ml，压稳定细胞株。

每4-5天换液一次，持续21天左右。

一星期后，未经转染的S2细胞大量死亡，两星期后98％以上未转染的细胞已经死亡，而经转染的细胞逐渐形成克隆，这时将S2细胞，空载体转染和pMT/V5-HisAhCKLF1-myc转染并经潮霉素B筛选的细胞克隆分别提取染色体DNA，做PCR，结果证实目的基因已成功整合，可进一步筛选单克隆。

将正常培养对数期的S2细胞作为饲养细胞铺于96孔细胞培养板，1.1 x 10⁶/ml，100μl/孔，内含300μg/ml潮霉素B。将用pMT/V5-HisA-hCKLF1-myc转染，将潮霉素B压后得到的S2细胞用含10％FBS，300μg/ml潮霉素B的新鲜培养基稀释成1 x 10⁴/ml，1 x 10³/ml，1 x 10²/ml，1 x 10¹/ml系列浓度。分别加入到已经铺好饲养细胞的96孔板中，每孔100μl，每个稀释度一块96孔板。24℃培养，4-5天半量换液一次。两星期后，饲养细胞全部死亡，有抗性的细胞已长满96孔板，将细胞按对应孔传入48孔板中，经两次传代后，每孔吸出部分细胞，提取细胞染色体DNA，做PCR。

将筛选并传代后的细胞分别吸出，加入细胞裂解液，蛋白酶K、RNaseA孵育后提取细胞染色体DNA，以此染色体DNA为模板，以CKLF1上游5’ATG GAT AAC GTGCAG CCG AAA AT3’(SEQ ID NO：6)，下游5’CAA AAC TTC TTT TTT TTC ATG CACA3’(SEQ ID NO：7)为引物，扩增30轮，根据PCR结果再挑出目的基因整合并且是高拷贝的阳性克隆细胞做RT-PCR进一步鉴定。首先利用博大公司的TRIZOL试剂提取细胞总RNA，然后利用GIBCO-BRL公司的RT-PCR试剂盒进行逆转录和PCR，根据RT-PCR结果将阳性克隆细胞进行扩增。

利用Western Blotting检查目的蛋白的表达：

经15％SDS-PAGE电泳，用1XCaps电转液将蛋白转移至PVDF膜上，加入Anti-c-myc抗体(Sigma公司)作用后，再加入抗鼠IgG HRP二抗反应(Promega公司)，采用ECL Western Blotting检测系统，经X光片显影，在8-10kd处有两条清晰条带。将PVDF膜剥离后加入兔抗-hCKLF1多肽抗体，抗兔IgG HRP为二抗反应，采用ECL WesternBlotting检测系统，经X片显影。

二、结果：

1.PCR鉴定稳定转染S2细胞株染色体DNA包含hCKLF1-myc编码区序列：

分别以未转染的S2细胞，和pMT/V5HisA及pMT/V5HisA-hCKLF1-myc转染的S2细胞的染色体为模板，以CKLF1 p1(5′-GCA AGA AGC GGG AAG CCG A-3′(SEQ ID NO：8))，p2(5′-CAT TGA GTT TAA ACG GTC TCG AGC GG-3′(SEQ ID NO：5)为引物进行扩增，制备1％琼脂糖进行电泳，结果请参见图1所示，第一泳道是以DL2000 DNA为分子量标准，第二泳道为以pMT/V5-HisA转染S2细胞染色体为模板，第三泳道是以pMT/V5HisA hCKLF1-myc转染的S2细胞染色体为模板，用相同的hCKLF1(p1，p2)为引物扩增，发现第三泳道在300bp位置有一条特异区带。

2.RT-PCR鉴定稳定转染S2细胞株有hCKLF1-myc mRNA的转录：

请参见图2所示：第1泳道为分子量标准；第2、3、4泳道是分别以pMT/V5HisA-hCKLF1-myc、pMT/V5HisA、S2空细胞为模板，以CKLF1(P1，P2)为引物；第5、6、7是与上述模板相同，而以G3PDH的p1(5’ACCACAGTCCATGCCATCAC3’(SEQ ID NO：9))，P2(5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA3’(SEQ ID NO：10))为引物进行的RT-PCR。RT-PCR结果显示：第二泳道300bp处可见一条清晰带。

3.利用Western Blotting检查目的蛋白的表达：

结果请参见图3所示。加入Anti-c-myc抗体作用后，再加入抗鼠IgG HRP二抗反应，经X光片显影，在8-10kd处有两条清晰条带(图3B)。

加入兔Anti-hCKLF1多肽抗体，(实施例10中提供该抗体的制备方法)，抗兔IgG HRP为二抗反应，经X片显影可见8-10kd处有两条清晰条带，且两种抗体反应的结果吻合(图3A)。

实施例3、CKLF1-myc蛋白质的纯化

一、方法：

将阳性细胞经扩增后转入Drosophila-SFM(Invitrogen公司)中撤掉潮霉素B培养到适当浓度，加入CuSO₄诱导目的蛋白表达。收获30小时S₂细胞表达上清，2000rpm/min，10分钟，8000rpm/min，20分钟，0.4μm滤膜过滤。取Chelating Sepharose Fast Flow柱料，20倍体积水平衡后上样，PBS缓冲液、0.5M NaCl分别洗柱，再依次用10mM、50mM、500mM咪唑/50mM Tris-HCl pH8.0洗脱，20mM EDTA洗柱后可用水平衡柱料，将第一次过柱穿过液再次上样，重复上述过程。

二、结果：

如图4所示，纯化后的蛋白质样品经15％SDS-PAGE电泳，直接考马斯亮蓝染色。图中用箭头指示的CKLF myc pro为目的蛋白条带。

实施例4、纯化后的蛋白质N端测序

一、方法：

取NiCl₂鳌合的Chelating Sepharose Fast Flow柱料，平衡液平衡，收集经Western blot检测的过柱阳性洗脱峰，经透析去除咪唑后上样，先用杂蛋白洗液洗柱，再用含500mM咪唑的蛋白洗液洗脱。经二次过柱纯化，洗脱后样品经15％SDS-PAGE电泳转移至PVDF膜上，用考马斯亮兰染色，甲醇/冰乙酸脱色后裁下与Western blot检测阳性位置相同的带进行蛋白质的N端测序(委托医科院基础所测序)。

二、结果：

图5为纯化后的蛋白质样品转移至PVDF膜后做Western Bloting鉴定结果，其中条带1为分子量标准，条带2为S2/pMT上清液；条带3为S2/CKLF1细胞裂解液；条带4为S2/CKLF1上清液。从图中可以看出，CKLF1可分泌表达。参见图6A和图6B蛋白质的N端测序，结果显示分子量较大条带测出两种主要的带型，分别为A-L-I-Y-R-K-L-L和F-N-P-S-G-P-Y-Q，分子量较小的条带也有两种主要的带型，并且与前两个带型的N端序列相同。

实施例5、CKLF1 C末端多肽合成

一、方法：

氨基酸序列分析显示CKLF1最少有两个成熟的结构；它们的序列分别是ALIYRKLLFNPSGPYQKKPVHEKKEVL(C27)(SEQ ID NO：2)和FNPSGPYQKKPVHEKKEVL(C19)(SEQ ID NO：2的第9位至27位)。为进一步分析功能在深圳翰宇(Hybio Engineering)中国有限公司，按照标准方法化学合成了这两个多肽。

二、结果：

获得冻干的多肽，溶于磷酸盐缓冲液中，浓度为1mg/ml于-80℃保存。

实施例6、受体表达质粒的构建及细胞表达

一、方法：

1、受体表达质粒的构建：

含各种人趋化因子受体开放阅读框的cDNA片段通过如下方法获得：CCR4、CCR5和CCR6受体通过聚合酶链反应(PCR)从K562细胞的cDNA文库克隆。引物设计根据Gen-Bank^TM登录的序列：CCR4(NM_005508.2)，CCR5(NM_000579)，CCR6(XM_004279)。各种受体开放阅读框的cDNA片段分别插入pcDI(本室改造的载体：用pCI(Promega公司)质粒的BglII-KpnI片段置换pcDNA3(Invitrogen公司)质粒的BglII-KpnI片段所得到的真核表达载体)和pEGFP(CLONTECH公司)表达载体使之在HEK293细胞有效表达。经DNA测序编码区序列正确，与Gen-Bank^TM登录的序列相符。

2、细胞培养：

HEK293细胞用含10％热灭活的胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640(LifeTechnologies，Inc.)培养。每4×10⁶HEK293细胞/400μl用15μg趋化因子受体表达质粒瞬时电穿孔转染，条件是120V，20ms使用的仪器是电脉冲发生器(ElectroSquare porator ECM 830，BTX，San Diego，CA)，48h后进行钙流分析和趋化实验。

二、结果：

进行钙流分析和趋化实验时，在转染受体的培养上清中，分别加入各自受体的已知配体：TARC、RANTES(皆购自peprotech公司)，可诱导受体转染细胞钙流或趋化。参见图7-12中已知配体的阳性对照，即图7中CCR4的相应已知配体为TARC，CCR5的为RANTES。A-D为CCR4转染细胞；E-H为CCR5转染细胞。A中a-b为100nM TARC刺激后，c-d为167nM C27；B中a-b为167nM C27，c-d为100nM TARC；C中a-b为100nM TARC，c-d为167nM C19；D中a-b为167nM C19，c-d为100nM TARC；E中a-b为100nM RANTES，c-d为167nM C27；F中a-b为167nM C27，c-d为100nM RANTES；G中a-b为100nMRANTES，c-d为167nM C19；H中a-b为167nM C19，c-d为100nM RANTES。

实施例7、CKLF1 C末端多肽(C19和C27)对细胞内钙流的影响

一、方法：

HEK293细胞用含10％热灭活的胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养。每4×10⁶HEK293细胞/400μl用15μg表达质粒瞬时电穿孔转染，条件是120V，20ms，使用的仪器是电脉冲发生器(Electro Squareporator ECM 830，BTX，San Diego，CA)，48h后进行钙流分析和趋化实验。

转染了pcDI-CCR4、CCR5的HEK293细胞用玻璃底的微孔皿(MatTek corporation，U.S.A.)培养，用10μM fluo-3/AM(HEPES缓冲盐溶液配制)负载，37℃1h，避光。HEPES缓冲盐溶液洗细胞，然后分别用167nM C末端多肽，100nM TARC、100nM RANTES刺激。荧光用Leica TCS-NT荧光共聚焦显微镜40×油镜(Wetzler，Heidelberg，Germany)，每5秒检测一次，激发波长488nm，发射波长530nm。上述操作在室温进行，随机选取各个视野的细胞。每5秒收集一次图象，共240秒。图象用Leica共聚焦软件分析相对荧光强度，数据用微软Excel 2000处理。

二、结果：

CCR4(图7-8)和CCR5(图7-8)转染的细胞中诱导钙流，如图7-8所示，TARC或RANTES诱导表达了各自受体的HEK293的钙流。CKLF1C末端多肽可诱导转染CCR4和CCR5的HEK293细胞的钙流，尤其通过CCR5引起的钙流最显著。167nM CKLF1C末端多肽可以使受体对接下来的100nM TARC或RANTES的刺激敏感性降低。C27可以使CCR4或CCR5转染细胞产生低强度信号，而C19可以使CCR4转染细胞产生低强度信号。同样用100nM TARC或RANTES预处理CCR4和CCR5转染细胞可以使转染细胞对接下来的CKLF1 C末端多肽的敏感性降低。这些结果清晰地显示CKLF1 C末端多肽是CCR4和CCR5的功能性配体。

实施例8、CKLF1 C末端多肽(C19和C27)的趋化功能

一、方法：

CKLF1 C末端多肽的趋化功能检测：趋化实验在48孔的趋化小室(Neutroprobe；Cabin John，MD，U.S.A.)里进行。用作趋化检测的所有因子用含0.1％BSA的Hepes RPMI1640稀释后加到小室的下孔里(28μl/孔)。用pcDI-CCR4、pcDI-CCR5、pcDI-CCR6或pcDI转染HEK293细胞，然后用同样的培养基重悬为2×10⁶个细胞/ml，加到小室的上孔中(50μl/孔)，上下孔用无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯滤膜相隔，滤膜孔径为8μm。将小室放入培养箱37℃，5％CO₂，孵育2h。从小室上移去滤膜，用3步染色试剂盒洗涤，固定，染色。每孔迁移的细胞随机选取5个高倍镜视野计数。转染pcDI空载体的HEK293细胞作为对照。所有样品检测2次。趋化指数CI为迁移细胞数除以对照组细胞数。CI>2有显著性意义。某些实验细胞在CKLF1 C末端多肽，TARC、RANTES或MIP3α刺激前用100ng/ml PTX(购自ALEXIS Biochemicals Corporation)预处理6h。

二、结果：

本发明用CKLF1 C末端多肽诱导CCR4或CCR5转染的细胞的迁移来检测它的活性。如图9所示，CKLF1 C末端多肽可以诱导CCR4和CCR5转染细胞的迁移，转染pcDI-CCR4或CCR5的不用任何刺激的HEK293细胞作为对照。用0.8μg/ml TARC或RANTES，37℃，30min预处理可以使受体对接下来CKLF1 C末端多肽的刺激去敏感。类似地，用2μg/ml CKLF1 C末端多肽预处理也可以使受体对下面TARC或RANTES刺激去敏感。通过对PTX敏感的Gi/Go家族G蛋白来评价CKLF1发挥的效应，用PTX 100ng/ml预处理CCR4和CCR5转染的HEK293细胞6h，然后用CKLF1C末端多肽，TARC或RANTES刺激。图9显示CKLF1 C末端多肽诱导的趋化，TARC或RANTES被PTX完全阻断，提示包含一个Gi途径。这些结果进一步证实CKLF1 C末端多肽是CCR4和CCR5的配体。与前期实验相吻合：利用传代细胞系U937细胞和CCR4转染的HEK293细胞测定了CKLF1-myc蛋白的趋化活性(结果请分别参见图10和图11所示)。从图10中可以看出，50mM咪唑洗脱的CKLF1-myc蛋白1：125倍稀释对U937细胞的趋化指数为16，对CCR4转染的293细胞趋化结果如图11所示，趋化因子RANTES封闭了HEK293细胞CCR4后能够抑制这种趋化作用，表明两者有交叉脱敏效应。

实施例9、CKLF1 C末端多肽对趋化因子受体CCR6内在化的影响

一、方法：

将CCR6编码区序列插入pEGFPN1载体(CLONTECH)，构建成pEGFPN1-CCR6-EGFP融合表达质粒。将pEGFPN1-CCR6-EGFP受体融合表达质粒转染进入HEK293细胞，继续培养24小时后血清饥饿16-24小时。培养上清中加入CKLF1 C末端多肽或MIP3α，37℃2小时，细胞用冷PBS冲洗，4％多聚甲醛固定，荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察并拍照。

二、结果：

利用pEGFPN1-CCR6的EGFP受体融合表达质粒转染进入HEK293细胞，培养上清中加入CKLF1、CKLF1 C末端多肽或MIP3α，通过荧光显微镜或共聚焦显微镜观察，发现CKLF1 C末端多肽能诱导CCR6-EGFP受体内化(图12)，说明CKLF1 C末端多肽能与CCR6受体相互作用。

实施例10、兔抗-hCKLF1多肽抗体的制备

一、方法：

CKLF1羧基端16个氨基酸，并在其N端增加一个半胱氨酸残基，以利于偶联载体，氨基酸序列为CSGPYQKKPVHEKKEVL(即本发明的C27或C19的C端16个氨基酸，序列参见SEQ ID NO：2的12-27位氨基酸，并在其N端增加一个半胱氨酸残基)。此多肽与KLH偶联(Pierce公司偶联试剂盒)。

2.5kg重成年雄性新西兰兔，初次免疫用1mg CKLF羧基端16个氨基酸多肽-KLH偶联物与等体积弗氏完全佐剂(FCA)充分乳化后，于背部皮下多点注射。初次免疫后21、42、63天，用弗氏不完全佐剂(FIA)完全乳化的抗原1mg，进行加强免疫。

二、结果：

每次免疫后7-10天，ELISA方法检测血清效价，达到1×10^-4时，取血分离血清，用Protein G亲和层析法，纯化抗肽抗体IgG，并保存于0.01M PBS中，用于其它实验。

序列表

<110>北京大学

<120>具有多种功能的多肽

<130>D0411045F

<160>10

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>81

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(81)

<223>

<400>1

<210>2

<211>27

<212>PRT

<213>智人

<400>2

<210>3

<211>310

<212>DNA

<213>智人

<400>3

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

Claims

1、一种多肽，该多肽包含：

(1)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽，或如SEQ ID NO:2的9-27位氨基酸所示的多肽；或

(2)在(1)限定的多肽中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与(1)所述多肽具有相同生物学功能的由(1)衍生的多肽。

2、一种多核苷酸，该多核苷酸包含：

(1)编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多核苷酸，或编码如SEQ ID NO:2所示的9-27位氨基酸序列的多核苷酸；或

(2)编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽为(1)所编码的氨基酸序列中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸而衍生的多肽，且所述多肽与(1)所编码的多肽具有相同的生物学功能。

3、如权利要求2所述的多核苷酸，该多核苷酸包含如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸或其互补序列，或如SEQ ID NO:1的25-81位所示的多核苷酸。

4、一种基因工程载体，该基因工程载体含有权利要求2或3所述的多核苷酸。

5、一种宿主细胞，该宿主细胞含有权利要求2或3所述的多核苷酸。

6、一种药物组合物，该药物组合物含有权利要求1所述的多肽、权利要求2或3所述的多核苷酸、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的宿主细胞，和含有一种或一种以上药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。

7、如权利要求1所述的多肽或如权利要求2或3所述的多核苷酸在制备预防和/或治疗人免疫缺陷病毒感染、过敏性疾病、移植排斥、脑部疾病或自身免疫病的药物中的应用。

8、如权利要求7所述的应用，其中所述的药物用于预防和/或治疗特应性皮炎、哮喘、过敏性鼻炎、阿尔茨海墨氏病、类风湿关节炎、丙型肝炎、多发性硬化和/或银屑病。

9、一种体外检测来自待测者的样品中权利要求1所述的多肽或权利要求2或3所述的多核苷酸表达水平的方法，该方法为反转录—聚合酶链式反应或蛋白质印迹检测方法。

10、一种单克隆或多克隆抗体，该抗体与权利要求1所述的多肽或其抗原性片段特异性结合。