EA003086B1 - ПОЛИПЕПТИДЫ LAG-3V1, LAG-3V2 И LAG-3V3 И КОДИРУЮЩИЕ ИХ кДНК - Google Patents

ПОЛИПЕПТИДЫ LAG-3V1, LAG-3V2 И LAG-3V3 И КОДИРУЮЩИЕ ИХ кДНК Download PDF

Info

Publication number
EA003086B1
EA003086B1 EA200000038A EA200000038A EA003086B1 EA 003086 B1 EA003086 B1 EA 003086B1 EA 200000038 A EA200000038 A EA 200000038A EA 200000038 A EA200000038 A EA 200000038A EA 003086 B1 EA003086 B1 EA 003086B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
lac
agde
pro
bei
seeg
Prior art date
Application number
EA200000038A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200000038A1 (ru
Inventor
Фредерик Триебель
Ренато Мастранджели
Серджо Романьяни
Original Assignee
Энститю Насьональ Де Ля Санте Э Де Ля Решерш Медикаль (Энсэрм)
Энститю Гюстав Русси
Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Энститю Насьональ Де Ля Санте Э Де Ля Решерш Медикаль (Энсэрм), Энститю Гюстав Русси, Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. filed Critical Энститю Насьональ Де Ля Санте Э Де Ля Решерш Медикаль (Энсэрм)
Publication of EA200000038A1 publication Critical patent/EA200000038A1/ru
Publication of EA003086B1 publication Critical patent/EA003086B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Mechanical Coupling Of Light Guides (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение касается выделенных нуклеотидных последовательностей, выбираемых из группы, которая включает: 1) нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5; 2) нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются в жёстких условиях с любой из последовательностей, определённых в п.1, и которые кодируют полипептид, являющийся вариантом молекулы LAG-3; 3) нуклеотидные последовательности, являющиеся модифицированными в результате вырожденности генетического кода по отношению к нуклеотидным последовательностям, определённым в пп.1 и 2, у которых кодируют полипептид, являющийся генетическим вариантом молекулы LAG-3.

Description

Настоящее изобретение касается идентификации образующихся в результате альтернативного сплайсинга вариантов молекулы ЬАС-3 и их применения в качестве иммуномодуляторов.
В настоящее время известно, что белки, кодируемые генами класса II МНС (главный комплекс гистосовместимости), вовлечены во многие процессы иммунного узнавания, включая взаимодействие между различными типами лимфоидных клеток, таких как лимфоциты и антиген-презентирующие клетки. Различные исследования также показали наличие других механизмов, которые не связаны с участием антигена СЭ4 в проявлении эффекторной функции хелперных Т-лимфоцитов.
Лимфоцит-активирующий ген-3 (ЬАС-3), экспрессирующийся в активированных клетках Т и ΝΚ человека, кодирует мембранный белок I типа, состоящий из 498 аминокислот, включающий четыре внеклеточных домена, представляющих суперсемейство иммуноглобулинов (1§8Р). Анализ этой последовательности показал наличие сегментов существенной идентичности при сопоставлении с сегментами аминокислотной последовательности, занимающими соответствующие положения в составе Τ.Ό4. хотя общий уровень гомологии аминокислотных последовательностей при сравнении лишь ненамного превышает базовый уровень (приблизительный уровень гомологии последовательности 20%). Также имеется несколько внутренних участков гомологии последовательности в составе молекулы ЬАС-3, находящихся между доменами 1 (Ό1) и 3 (Ό3), а также между доменами 2 (Ό2) и 4 (Ό4): это подтверждает, что белок ЬЛС-3 эволюционировал, как и белок СЭ4, за счёт механизма генных дупликаций, а предковой являлась бинарная 1д8Р2-структура. Кроме того, гены, кодирующие белки ЬЛС-3 и СЭ4, локализованы очень близко друг к другу в дистальной части короткого плеча хромосомы 12 [2: В.Ниагй, Р.Саи1агй, Р.Раиге, Т.Негсепй Т., ТпеЬе1 Р, 1994, 1тшиподепе11С8, 39, 213]. Соответственно, гены ЬАС-3 и СЭ4 могут быть образно названы эволюционными двоюродными братьями в пределах гораздо более разрозненного суперсемейства 1§8Р.
С применением количественного теста на клеточную адгезию авторы настоящего изобретения ранее показали, что образование розеток между клетками СО8-7, трансфицированными геном ЬАС-3, и В-лимфоцитами, позитивными по генам класса II МНС, проявляет специфическую зависимость от взаимодействия ЬАС-3/МНС-П. Также с использованием химерной конструкции белков ЬАС-3Лд было показано, что имеет место прямое специфическое связывание ЬАС-3 с различными молекулами класса II МНС человека (включая продукты различных аллелей и различные изотипы), равно как и с молекулами класса II МНС мышей и обезьян.
Этот димерный рекомбинантный глобулин ЬАС-3Лд связывается с мономорфными компонентами класса II МНС с более высокой аффинностью (К,,=60 нМ при 37°С) по сравнению с СП4Лд; ЬАС-3 действительно способен блокировать взаимодействие между СЬ4 и молекулами класса II МНС в тесте на межклеточную адгезию.
Роль взаимодействия ЬАС-3/МНС-П была исследована с использованием моноклональных антител, специфичных в отношении ЬАС-3 и молекул ЬАС-3Лд. Такое взаимодействие обусловливает негативную регуляцию активации клонов Т-лимфоцитов. Эффективность взаимодействия ЬАС-3/МНС-П опосредуется контактами между Т-клетками (Т-Т), в основном через передачу негативного сигнала молекул класса II МНС в Т-клетки. В целом, белок ЬАС-3 экспрессируется только после активации лимфоцитов, причём как ίη νίνο, так и ίη νίΐο, а, следовательно, не играет роли в индукционной фазе иммунного ответа в противоположность антигену СЭ4. Кроме того, эксперименты по блокированию действием моноклональных антител показали, что ЬАС-3 не участвует в распознавательной фазе, связанной с ограниченными по МНС-П СО4-позитивным Т-клеточным клонам. Функциональное значение белка ЬАС-3, соответственно, принципиально отличается от такового, характерного для других лигандов системы МНС - СЭ4 и СЭ8. В настоящее время принята точка зрения, согласно которой Тлимфоциты, несущие молекулы класса II МНС, играют ту роль, которая сходна с СТЬА-4 по тому, что происходит после связывания ЬАС-3: т. е. индукция клонального делегирования ранее активированных Т-лимфоцитов.
Недавно было обнаружено, что предпочтительная экспрессия и секреция ЬАС-3 осуществляется активированными клетками ТЬ1, т.е. хелперными Т-лимфоцитами, вырабатывающими γ-интерферон и фактор некроза опухоли, при этом оно позитивно регулируется интерлейкином-12 - мощным Тй1-индуцирующим цитокином (Е.Аппип/1а1о, КМапеШ, Ь.Топтеую, М.6.6шШа, К.В1адюШ, У.С1аппо, Р.Сегтапо Р., С.МауШа, Е.Маддг 8. Котадпаш, 1996, РА8ЕВ 1, 10, 769-775). Высокие уровни цитоплазматических ЬАС-3 (§ЬАС-3) также были обнаружены в сыворотке у пациентов с диагнозом рецидивного рассеянного склероза (цит. там же) и у отдельных пациентов с системной красной волчанкой (8.Кошадпаш, 1996, С1ш. ТшшипоТ Опшипора1йо1, 80, 225-235). Эти данные подтверждают, что ЬАС-3 может являться эффективным диагностическим маркёром для опосредованных клетками ТЫ иммунных заболеваний, таких как тироидит Хасимото, сахарный диабет I типа, рассеянный склероз, болезнь Крона, ревматоидный артрит, острое отторжение пересаженных тканей и органов и острый синдром трансплантат-против-хозяина (СУНЬ). С дру гой стороны, присутствие высокого уровня кЬАС-3 в сыворотке у пациентов с рассеянным склерозом и, вероятно, у пациентов с другими вышеназванными заболеваниями, подтверждает естественную защитную роль белка &ЬАС-3 за счёт того, что он может конкурировать со связанной с мембраной формой, что тем самым обеспечивает блокировку иммунных ответов, опосредованных белком ЬАС-3.
Авторы настоящего изобретения исследовали возможную экспрессированность других форм ЬАС-3, которые могут быть обусловлены альтернативным сплайсингом первичного ядерного транскрипта.
Большинство эукариотических генов, кодирующих белки, включают последовательности, присутствующие в соответствующих зрелых мРНК в виде непрерывных фрагментов ДНК (экзоны), прерываемых последовательностями (интроны), которые не являются частью зрелых (процессированных) мРНК. Первичные транскрипты этих генов, таким образом, содержат последовательности, которые соответствуют и экзонам, и интронам. Интронные последовательности вырезаются в ходе многоступенчатого внутриядерного процесса, известного как сплайсинг пре-мРНК. При этом интроны демаркированы присутствием консенсусных последовательностей, расположенных по их 5'- и 3'-концам (соответственно, донорному и акцепторному). Процесс сплайсинга включает расщепление по акцепторному сайту с последующим лигированием 5'- и 3'-концов экзонов.
В большинстве случаев присутствующие в составе гена экзоны попадают в одну зрелую молекулу мРНК благодаря инвариантному лигированию соответствующих пар донорных и акцепторных сайтов сплайсинга, в результате чего образуется единственный генный продукт.
Однако в некоторых случаях тот же ген может включать сайты альтернативного сплайсинга, что может обусловливать появление дифференцированных транскриптов. Механизм, регулирующий процесс альтернативного сплайсинга, пока точно не определён, но, по крайней мере, для некоторых генов известно, что эти механизмы специфичны по типам клеток и этапах индивидуального развития.
Альтернативный сплайсинг приводит к образованию множественных изоформ одного и того же белка, кодируемых одним геном. Соответственно, этот процесс является одним из молекулярных механизмов, обеспечивающих многообразие белков.
В настоящее время известно более 50 генов, для которых подтверждено образование белкового разнообразия за счёт механизма альтернативного сплайсинга. Этот механизм характеризуется общими чертами и свойственен генам, кодирующим сократительные белки.
Авторы настоящего изобретения обнаружили три новых дифференцированно сплайси руемых варианта ЬАС-3: соответственно, они были обозначены ЬАС-3 VI, ЬАС-3 У2 и ЬАС3У3.
Вариант ЬАУ-3У1 кодирует цитоплазматический белок с молекулярной массой 36 кД, включающий 8 новых аминокислотных остатков после домена Ό2; вариант ЬАС-3 У2 кодирует белок с молекулярной массой 6ί кД не содержит домена Ό4; а вариант ЬАС-3ν3 кодирует цитоплазматический белок с молекулярной массой 52 кД, включающий 8 новых аминокислотных остатков после домена Ό3.
Эти варианты предоставляют новые возможности изучения как механизмов регуляции собственно гена ЬАС-3, так и биологических функций кодируемого им белка, а также применимы для производства новых иммуномодулирующих соединений, особенно таких соединений, которые мимируют биологические функции самого ЬАС-3 или которые могут действовать как агонисты или антагонисты взаимодействия между ЬАС-3 и молекулами класса II МНС.
Объектом настоящего изобретения, таким образом, является выделенная нуклеотидная последовательность, выбираемая из группы, которая включает:
a) нуклеотидные последовательности 8ЕО ГО N0 1, 8ЕО ГО N0 3 или 8ЕО ГО N0 5;
b) нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются в жёстких условиях с любой из последовательностей, определённых выше в п.(а), и которые кодируют полипептид, являющийся вариантом молекулы ЬАС-3;
c) нуклеотидные последовательности, являющиеся модифицированными в результате вырожденности генетического кода нуклеотидными последовательностями, определёнными выше в пп.(а) и (Ь), и которые кодируют полипептид, являющийся генетическим вариантом молекулы ЬАС-3.
Также настоящее изобретение направлено на очищенные полипептиды, кодируемые нуклеотидными последовательностями, определёнными выше. Упомянутые полипептиды здесь и далее обозначаются как варианты ЬАС-3.
Также настоящее изобретение касается фармацевтических композиций, включающих варианты ЬАС-3. Эти композиции применимы для лечения иммунологических патологий, в частности, тех заболеваний, которые опосредуются участием клеток ТЬ1, таких как тироидит Хасимото, сахарный диабет I типа, рассеянный склероз, болезнь Крона, ревматоидный артрит, острое отторжение пересаживаемых тканей и органов, острый синдром трансплантат-противхозяина (СУНИ), офтальмопатия Грейва, церебральная малярия, артрит Лайма, инфекционный (индуцируемый бактерией рода Уегыша) артрит, НСУ-индуцируемый хронический гепатит, первичный склерозирующий колангит контактный дерматит, повторяющиеся выкидыши неясной этиологии, апластическая анемия и вызываемый бактериями вида Не11соЬас1ет ρϊΐοη гастероантрит.
Также настоящее изобретение касается применения вариантов белка ЬАС-3 в производстве иммуномодуляторных соединений. Такие соединения могут мимировать или изменять биологические функции самого ЬАС-3 и (или) вариантов ЬАС-3, индуцируя таким образом некоторые модификации клеточных взаимодействий, участниками которых являются сам ЬАС-3 или его варианты.
Также настоящее изобретение представляет поликлональные или моноклональные антитела и их фрагменты ТаЬ, ТаЬ' и Т(аЬ')2 или Τν, специфичные в отношении конкретных эпитопов в составе одного из вышеназванных вариантов ЬАС-3. Применение этих специфичных антител для очистки упомянутых вариантов или для выработки терапевтических или диагностических композиций, равно как и сами получаемые в результате композиции также входят в объём настоящего изобретения.
Далее настоящее изобретение представляет способ лечения, предназначенный для лечения иммунных патологий, включающий введение пациенту эффективного количества варианта ЬАС-3 или композиции, содержащей упомянутый вариант в качестве активного компонента.
Далее настоящее изобретение представляет способ, предназначенный для лечения иммунных патологий, включающий введение пациенту обозначенного выше антитела, специфичного в отношении варианта ЬАС-3, или терапевтической композиции, содержащей упомянутое антитело в качестве активного компонента.
В предпочтительном варианте настоящее изобретение направлено на выделенную нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, которая включает 8ЕО ΙΌ N0 1, 8Е0 ГО N0 3 или 8Е0 ГО N0 5, или полностью комплементарные им последовательности.
Также настоящее изобретение касается очищенного полипептида, который образуется в результате экспрессии одной из нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению. Предпочтительно этот полипептид выбирается из группы, которая включает варианты ЬАС-3У1, ЬАС-3У2 и ЬАС-3У3, которые, соответственно, кодируются нуклеотидными последовательностями 8Е0 ГО N0 1, 8Е0 ГО N0 3 и 8 ЕС ГО N0 5 и которые соответствуют аминокислотным последовательностям, показанным в 81Т) ГО N0 2, 81Т) ГО N0 4 и 8Ер ГО N0 6.
Полипептиды в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены с применением любого стандартного метода очистки мембранных или цитоплазматических белков, с помощью пептидного синтеза или путём применения методов генетической инженерии. Упомя нутые методики включают внесение нуклеотидной последовательности, кодирующей один из пептидов по настоящему изобретению, в состав экспрессирующего вектора, такого как плазмида, и трансформацию клеток-хозяев этим экспрессирующим вектором, используя при этом любой из методов, известных специалистам в данной области техники, таким как электропорация.
Преимущественно нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению получают методом ПЦР с ревертированием (полимеразная цепная реакция с использованием обратной транскриптазы) в отношении кДНК соответствующего варианта ЬАС-3. Вкратце, общий пул РНК экстрагируют из активированных лимфоцитов периферической крови человека и подвергают обратной транскрипции и амплификации с использованием специфической пары олигонуклеотидных затравок. В случае настоящего изобретения затравки включают смысловую и антисмысловую затравки, которые располагаются в двух конкретных сайтах последовательности гена ЬАС-3, которые будут более подробно описаны в нижеследующих примерах. Полученную в результате кДНК затем амплифицируют методом ферментативной (полимеразной) амплификации, и она может быть субклонирована в состав подходящей клеткихозяина.
Настоящее изобретение также касается экспрессирующих векторов, несущих нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид в соответствии с настоящим изобретением, а также клетки-хозяева, трансформированные этими векторами.
Термин экспрессирующий вектор обозначает способную к репликации конструкцию ДНК, используемую либо для амплификации, либо для экспрессирования последовательности, которая кодирует один из полипептидов по настоящему изобретению.
Клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими, включая, но тем самым не ограничиваясь, бактерии, дрожжи, клетки насекомых, клетки млекопитающих, включая культивируемые клеточные линии, доступные на коммерческой основе.
Настоящее изобретение также представляет антитела, специфичные по отношению к вариантам ЬАС-3, или их фрагменты в соответствии с тем, на что было указано выше. Необязательно эти антитела или их фрагменты могут быть соединены с маркёром (радиоактивным изотопом, флуоресцентным красителем, ферментным маркёром и т.п.) или с терапевтически активной молекулой, которая, например, является цитотоксичным соединением.
Поликлональные антитела могут быть получены в соответствии с хорошо известными методами, такими которые описаны Бенедиктом с соавт. (ВепеФс! А.А. е1 а1.). Методы получения моноклональных антител также хорошо известны на предшествующем уровне техники, в частности, метод, описанный Кёлером и Мильштейном (КоЫег & Μίΐδΐθίη). Этот метод, наряду с его модификациями, описан Йелтоном с соавт. (УеИоп е! а1.).
Эти антитела могут быть использованы в методе очистки полипептида по настоящему изобретению или в методе дозирования или идентификации. Упомянутым методом, например, являются такие методы (не ограничиваясь ими), как радиоиммунологический метод типа РИА или иммунорадиометрический тест, иммуноферментный тест, такой как метод ТИФА, или метод прямого или непрямого иммунофлуоресцентного лечения.
Настоящее изобретение также представляет применение упомянутых антител для производства терапевтических композиций, способных блокировать активность вариантов ЬАС-3, т.е. обладающих иммуномодуляторной активностью, такой как индукция созревания, дифференциации, пролиферации и(или) функционирования клеток, экспрессируюших вариант ЬАС-3, например, активированными клетками Т и ΝΚ.
Антитела к вариантам ЬАС-3 могут быть использованы в качестве потенциирующих (усиливающих) факторов вакцин или иммуностимуляторов для пациентов, страдающих иммунодепрессией, например, пациентов, заражённых вирусом иммунодефицита (ВИЧ) или проходящих лечение с применением иммуносупрессорных препаратов.
Терапевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением включают цитоплазматические варианты ЬАС-3 или антитела, определявшиеся здесь выше, а также фармацевтически приемлемый наполнитель. Эти композиции могут быть получены в соответствии со стандартными методиками. Наполнитель может варьироваться, исходя из выбираемого типа введения композиции: перорального, парентерального, подъязычного, ректального или назального.
Для композиций, предназначенных для парентерального введения, наполнителем обычно является стерильная вода, равно как и другие компоненты, обеспечивающие растворение композиции или её способность к хранению. Парентеральный способ введения может включать внутривенные, внутримышечные или подкожные инъекции.
Терапевтическая композиция может относиться к типу с замедленным выделением, пригодной, в частности, для долговременной терапии, например, при лечении аутоиммунных заболеваний. Предназначенная для введения доза зависит от конкретного пациента, лечение которого проводится, в частности, от параметров его(её) иммунной системы с точки зрения достижения желательного уровня защиты. Точные количества предназначенного для введения ак тивного компонента могут быть легко определены практикующим врачом, назначающим данное лечение.
Терапевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут включать, в дополнение к цитоплазматическим вариантам ЬАС-3 или антителам по настоящему изобретению, другой, являющийся подходящим, активный компонент, химически соединённый с вариантом ЬАС-3 или с антителом по настоящему изобретению. В качестве примера можно привести слияние вариантов ЬАС-3 по настоящему изобретению с токсинами, например, с рицином или с дифтерийным анатоксином, способным связываться с молекулами класса II главного комплекса гистосовместимости и уничтожать клетки-мишени, например, лейкозные или меланомные клетки, или слитые с радиоактивным изотопом.
Приводимые ниже примеры, наряду с определяемыми далее фигурами, должны проиллюстрировать настоящее изобретение с большими подробностями.
Описание чертежей
Фиг. 1 представляет схематическое изображение молекулы ЬАС-3 дикого типа и её вариантов VI, У2 и У3. Вариант ЬАС-3У1 происходит в результате сохранения последовательности 4-го интрона, т.е. расщепления по донорному и акцепторному сайтам, фланкирующим 4-й интрон, не происходит. Оказывающийся в пределах открытой рамки стопкодон, расположенный через 8 кодонов, имеющихся в составе сохраняющегося 4-го интрона, приводит к образованию укороченного цитоплазматического белка ЬАС-П^1. включающего домены Ό1, Ό2 и 8 новых аминокислотных остатков.
Вариант ЬАС-П^2 утрачивает 6-й экзон, что обусловливается сшиванием донорного сайта сплайсинга 5-го интрона с акцепторным сайтом 6-го интрона. Поскольку при таком процессе сдвига кодирующей рамки не происходит, то образующийся в результате белок ЬАС-3 ν2 является трансмембранным белком не содержащим в своём составе домена Ό4.
Вариант ЬАС-П^3 образуется в результате расщепления первичного ядерного транскрипта по отличающемуся сайту полиаденилирования, расположенному примерно на 170 пар нуклеотидов ниже 5'-конца 5-го интрона. Сохраняющаяся последовательность 5-го интрона включает внутрирамочный стоп-кодон. Образующаяся в результате зрелая мРНК кодирует укороченный цитоплазматический белок, включающий в своём составе домены Ό1, Ό2, Ό3 и 8 новых аминокислотных остатков.
Фиг. 2 представляет схематическое изображение экзон-интронной организации гена
ЬАС-3. Пунктирной линией показаны процессы сплайсинга, в результате которых образуются зрелые РНК-транскрипты, кодирующие ЬАС-3 дикого типа и варианты ЬАС-3VI, ЬАС-3У2 или ΕΑ^3ν3.
БР - сигнальный пептид; Ό1-Ό4 - иммуноглобулиноподобные домены 1-4; ТМ - трансмембранная последовательность; СУТ - цитоплазматический домен; 11-19 - интроны от 1-го по 9-й.
Новые экзоны в составе вариантов ЬАС3ν1 и ЬАС-3ν3 показаны в виде заштрихованных прямоугольников.
Фиг. 3 показывает схематическое изображение ЬАС-3 дикого типа и варианта ΕΑ&3ν1. Локализация затравок и зондов, использовавшихся для выделения ЬАС-3 ν1, обозначена стрелками. Фрагменты ДНК, амплифицированные с использованием специфических затравок, обозначены одиночными линиями. Обозначен размер фрагментов, полученных в методе ПЦР с ревертированием.
Фиг. 4 представляет данные анализа методом Саузерн-блоттинга фрагментов кДНК ЬАС3 дикого типа и варианта ЬАС-3 ν1, амплифицированных с помощью ПЦР с ревертированием с использованием затравок Р459 и К460;
а) гель, окрашенный бромистым этидием; Ь) блот, гибридизовавшийся с кДНК-зондом, специфичным в отношении ЬАС-3. Нижний бэнд является производным от ЬАС-3 дикого типа, в то время как верхний бэнд, проявляющийся только после гибридизации, является производным от ЬАС-ПШ1.
Фиг. 5 показывает данные анализа методом Саузерн-блоттинга кДНК-фрагментов ЬАС3ν1, амплифицированных с помощью ПЦР с ревертированием с использованием затравок Р176иК460;
а) гель, окрашенный бромистым этидием. Самый крупный бэнд происходит от ЬАС-3 дикого типа; Ь) блот, гибридизовавшийся с олигонуклеотидным зондом, специфичным в отношении последовательности 4-го интрона гена ЬАС-3. Верхний бэнд является производным от варианта ЬАС-ПШ1. в то время как нижний бэнд - от гетеродуплекса, образованного ЬАС-3 дикого типа и ЬАС-ПШ1.
Фиг. 6 представляет схематическое изображение ЬАС-3 дикого типа и варианты ЬАС3ν2 и ЬАС-3 ν3. Расположение затравок и зондов, использовавшихся при выделении ЬАС3ν2 и ЬАСПШ3, обозначено стрелками. Фрагменты ДНК, амплифицированные с использованием этих специфических затравок, показаны одиночными линиями. Обозначен размер фрагментов, полученных методом ПЦР с ревертированием.
Фиг. 7 показывает данные анализа методом Саузерн-блоттинга кДНК-фрагментов ЬАС3 дикого типа и вариантов ЬАС-3 ν2 и ЬАС3ν3, амплифицированных с применением ПЦР с ревертированием с использованием затравок Р176 и К401;
а) гель, окрашенный бромистым этидием; Ь) блот, гибридизовавшийся с олигонуклеотидным зондом Р459, специфичным в отношении ЬАС-ПШ2. Верхний бэнд является производным от ЬАС-3 дикого типа, в то время как бэнды размером 780 и 940 пар нуклеотидов, являются производными от вариантов ЬАС-3 ν2 и ЬАС3ν3 соответственно.
Фиг. 8 показывает параметры электрофореза в агарозном геле продуктов ПЦР с ревертированием, полученных с использованием затравок, специфичных в отношении ЬАС-3 ν2 и ЬАС-ПШ3, т.е. соответственно 173/ν2Κ и 173/ν3Κ.
Фиг. 9 показывает результаты Вестернблоттинга ФГА-бластов с использованием моноклональных антител, специфичных в отношении ЬАС-3.
Примеры
Пример 1. Клонирование варианта 1 ЬАС3 человека (ЬАС-3 νΐ) с помощью ПЦР с ревертированием в отношении РВМС человека (моноядерные клетки периферической крови).
Экстракция РНК и ПЦР с ревертированием.
Моноядерные клетки периферической крови (РВМС) были выделены с помощью центрифугирования в градиенте плотности Р1со11Нурасще и активированы 1 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) и 100 ед./мл интерлейкина-2 в течение 48 ч при 37°С при 5% СО2. Пулы мРНК были экстрагированы с использованием набора реактивов О1що1сх Ь|гсс1 тКЫА кй (Ошадеп 1пс., Οιαΐ5\\ΌΠ1ι, СА, США) и подвергнуты обратной транскрипции с олигодезокситимидиновой затравкой и набора реактивов для синтеза первой цепи (КТ-РСК кй: Б1га1адепе, Ьа 1о11а, СА, США).
Амплификация кДНК была осуществлена с 2,5 ед. Тас.|-полимеразы и 100 нг каждой затравки - прямой затравки Р459 (5'-ТСТСТСАСАСССТСССАТСССТСАТТТТС-3') (БРО Ш N0 7) и обратной затравки К460 (5'ТССТССАСАТССАТАТСССАССТСТАССТС3') (8ЕО Ш N0 8), которые отжигали на нуклеотиды 762-791 и 1217-1246 нуклеотидной последовательности ЬАС-3, соответственно (фиг. 3). Было проведено тридцать циклов ПЦР: каждый цикл включал этап денатурации при 94°С в течение 1 мин, отжиг при 66°С в течение 1 мин и достройку цепи при 72°С в течение 2 мин.
Анализ амплифицированной ДНК методом Саузерн-блоттинга.
10-мкл аликвоты амплифицированной ДНК фракцинировали в 2% агарозном геле. Был выявлен ожидаемый фрагмент длиной 485 пар нуклеотидов, соответствующий ЬАС-3 (фиг. 4а). После блоттинга на нитроцеллюлозный мембранный фильтр и гибридизации с 32Р-помеченным кДНК-зондом, специфичным в отношении ЬАС-3ПШ2, в дополнение к 485нуклеотидному фрагменту был выделен бэнд, соответствующий фрагменту длиной примерно 890 пар нуклеотидов. Фрагмент длиной 890 пар нуклеотидов был подвергнут повторной амплификации, клонирован и секвенирован.
Клонирование и секвенирование 890нуклеотидного фрагмента ЬАС-3.
890-Нуклеотидный фрагмент был клонирован в состав вектора рСК™П (Рготеда), а вставку секвенировали с использованием набора реактивов ΑΒΙ РгЬш Эуе ТетипаЮг Сус1е 8ес.|иепстд Кеабу КеасИои ΚίΙ (Регк1и-Е1тег) и с использованием автоматического секвенсора ДНК, модель 373А (Регк1и-Е1тег). Полученные результаты указывают на то, что этот фрагмент состоит из 892 нуклеотидов и происходит от варианта ЬАС-3, сохраняющего последовательность 4-го интрона (фиг. 2). Благодаря присутствию внутрирамочного стоп-кодона в последовательности 4-го интрона этот вариант, обозначаемый как ЬАС-3У1, предсказательно кодирует цитоплазматический белок с молекулярной массой 36 кД, включающий домены Ό1, Ό2 и 8 новых С-концевых аминокислотных остатков (фиг. 1).
Подтверждение экспрессии ЬАС-3 VI.
Для подтверждения того, что фрагмент ЬАС-3\1 происходит от мРНК, но не от геномной ДНК, был проведён второй эксперимент с ПЦР с ревертированием, в котором использовали прямую затравку Р176 (5'-ССТСССССАССС СТССА1САС-3') (8ЕО ΙΌ N0 9), которую отжигали на нуклеотиды 725-745 последовательности ЬАС-3, а также обратную затравку К460 (фиг. 3). Затравка Р176, которая покрывает сайт сллайсинга участков, кодирующих домены Ό1/Ο2, не должна приводить к амплификации геномной последовательности гена ЬАС-3.
В условиях разгонки продуктов ПЦР методом электрофореза в агарозном геле был выявлен ожидаемый бэнд длиной 520 пар нуклеотидов, соответствующий ЬАС-3 дикого типа (фиг. 5а). Саузерн-блоттинг с использованием олигонуклеотидного зонда 14 (5'-ССССАСТСТССТ ТСАСАТТТ-3') (8 ЕС) ΙΌ N0 10), специфичного для 4-го интрона гена ЬАС-3, показал наличие ожидаемого из 930 пар нуклеотидов бэнда ЬАС3ν1 и дополнительно бэнда, соответствующего примерно 800-нуклеотидному фрагменту (фиг. 5). Эти два фрагмента подвергали повторному амплифицированию и секвенировали. Было подтверждено, что верхний бэнд соответствует варианту ЬАС-3\Е в то время как нижний бэнд является гетеродуплексом, образованным ЬАС3 дикого типа и ЬАС-3\1.
Пример 2. Клонирование варианта 2 ЬАС3 (ЕАС-3\2) и варианта 3 ЬАС-3 (ЬАС-3\3) человека с помощью ПЦР с ревертированием из активированных клеток РВМС.
Экстракция РНК и ПЦР с ревертированием.
Моноядерные клетки периферической крови (РВМС) были выделены с применением центрифугирования в градиенте плотности Ρίсо11-Нурас|ие и активированы 1 мкг/мл ФГА и 100 ед./мл интерлейкина-2 в течение 48 ч при 37°С при 5% С02.
Общий пул РНК экстрагировали с применением реагента ΠΙΖοΙ (С1Ьсо ВКЪ). Общую РНК (5 мкг) подвергали обратной транскрипции с использованием смеси якорных олигодезокситимидиновых затравок АТ17А, АТ17С и АТ17С - 5'-СССССТССАТССССАССТАА (Т)п (8 ЕС) ΙΌ N0 1), завершающихся нуклеотидом А, С или С соответственно (фиг. 6), которые позволяют получать молекулы кДНК, характеризующиеся гомогенными 3'-концами и якорем, являющимся мишенью для последующих этапов ПЦР.
Реакцию обратной транскрипции осуществляли при конечном объёме в 50 мкл 1х обратнотранскриптазного буфера, 10 мМ дитиотреитола, 1 мМ дНТФ, 40 ед. РНКазного ингибитора (Воейпидег) и 400 ед. 8ирег8спр1 II КТ (С1Ьсо ВКЪ) при 37°С в течение 90 мин. Реакцию обратной транскрипции останавливали нагреванием до 90°С на 5 мин. РНК расщепляли 1 ед. РНК-азы-Н (Воейпидег) при 37°С в течение 30 мин.
ПЦР проводили с использованием прямой затравки Ρ176 и обратной затравки К401 (5'СССССТССАТССССАССТАА-3') (8 ЕС) ΙΌ N0 12), которые отжигали на 3'-якорные последовательности кДНК (фиг. 6). Затравки Ρ176 и К401 должны позволить амплифицировать все сплайсинговые варианты ЬАС-3, включающие участок от П1/П2-соединения до полиаденилового хвоста.
ПЦР проводили в 5 мкл кДНК-эквивалента по отношению к 0,5 мкг общей РНК при конечном объёме в 100 мкл, включающем 1х Тас.|полимеразного буфера, 2,5 ед. ДНК-полимеразы Тас.| (Абуаисеб Вю1есйио1оду), 1,5 мМ хлорида магния, 200 мМ дНТФ, 10% диметилсульфоксида и 50 пкмоль каждой из затравок Ρ176 и К401. Был применён метод горячего старта с последующими 30 циклами ПЦР (каждый из них: 96°С - 30 с, 65°С - 30 с, 72°С - 4 мин). В качестве негативного контроля в эксперименте с ПЦР использовали РНК без обратной транскриптазы.
Анализ методом Саузеры-блоттинга продуктов ПЦР с ревертированием.
Продукты ПЦР с ревертированием (10 мкл) фракционировали методом электрофореза в агарозном геле и промокали на нейлоновую мембрану Ну-Ьоиб-Н+(Атег8Йат). Блот гибридизовали с помеченным дигоксигенином олигонуклеотидным зондом Ρ459, специфичным для ЬАС-3 Ό2, (фиг. 6) в 5х 88С, 0,02% 8Ό8, 0,5% блокирующего реагента (Воейпидег), 0,1% N лаурилсаркозина при 55°С в течение 30 мин.
Затем блот промывали дважды в растворе 2х88С, 0,1% 8Ό8 при 55°С. Выявление гибридных молекул проводили с использованием соединённых с пероксидазой редьки антител к дигоксигенину (Воейппдег) и ЕСЬ-реагентов (Атегкйат).
Полученные результаты показали, что в дополнение к ожидаемому фрагменту длиной 1120 пар нуклеотидов, соответствующему ЬАС3 дикого типа, два минорных бэнда, соответствующие фрагментам длиной примерно 940 и 780 пар нуклеотидов, были выявлены в геле, окрашенным бромистым этидием (фиг. 7а) и при Саузерн-блоттинге (фиг. 7Ь).
Секвенирование фрагментов ЬЛС-3.
ПЦР-фрагменты, состоящие из 940 и 780 пар нуклеотидов, были выделены из агарозного геля, повторно амплифицированы с использованием затравок Ε176/Κ4Ό1 и секвенированы напрямую. Полученные результаты показали, что фрагмент, состоящий из 780-нуклеотидов, происходит в результате проскакивания 6-го экзона гена ЬЛС-3 (фиг. 2). Этот вариант, обозначенный как ЬЛС-3 У2, предсказательно кодирует транс-мембранный белок с молекулярной массой 61 кД, который не включает домен Ό4 (фиг. 1).
Секвенирование фрагмента, состоящего из 940 пар нуклеотидов, показало, что он образуется в результате расщепления первичного ядерного транскрипта в отличающемся сайте полиаденилирования, расположенном примерно на 170 нуклеотидов дальше от 5'-конца 5-го интрона (фиг. 2). Оставшаяся последовательность 5-го интрона включает внутрирамочный стоп-кодон. Образующаяся в результате мРНК транслируется в вариант ЬЛС-3, обозначаемый как ЬАС3У3, который включает домены Ό1, Ό2 и Ό3, за которыми имеется ещё 8 новых аминокислотных остатков (фиг. 1). В обоих вариантах ЬЛС-3У2 и ЬЛС-3У3 - сохраняются характерные для ЬЛС-3 дикого типа четыре сайта потенциального гликозилирования.
Подтверждение экспрессии ЬЛС-3 У2 и ЬЛС-3У3.
Для подтверждения экспрессии вариантов ЬЛС-3У2 и ЬЛС-3У3 и для оценки присутствия полноразмерной 5'-последовательности, кодирующей Ν-концевую часть белка ЬЛС-3, ПЦР с ревертированием была осуществлена в отношении общего пула РНК, выделенной из клеток РВМС с использованием прямой затравки Е173 (5'-ТАТАССАТССССТССССАСАССАТАССАСАСАТС-3') (8Е0 ГО N0 13), которую отжигали на нуклеотиды 212-233 последовательности ЬАС-3, в составе которой имеется старт-кодон АТС, и обратных затравок У2К (5'-ССССТТ САССТССТТССССАССТСТСАТСАТТ-3') или У3К (5'-ТСАССТАСТССАСААААСТССССС СССАСАТ-3') (8Е0 ГО N0 15) (фиг. 6). Поскольку затравка У2К отжигается на сайт сплайсинга доменов Ό3/ΓΜ варианта ЬАС-3У2, а затравка У3К отжигается на 5'-последовательность 5-го интрона варианта ЬАС-3У3, то должна происходить амплификация обоих этих вариантов.
ПЦР была проведена при использовании температуры отжига 68°С для первых двух циклов и 72°С в остальные 28 циклов. При проведении электрофореза в агарозном геле были обнаружены ожидаемые фрагменты длиной 1100 нуклеотидов (ЬАС-3У2) и 1230 нуклеотидов (ЬАС-3У3) (фиг. 8). Секвенирование ДНК в составе амплифицированных фрагментов подтвердило, что ЬАС-3У2 кодирует трансмембранный белок с молекулярной массой 61 кД, включающий домены Ό1, Ό2, Ό3, трансмембранный домен (ТМ) и цитоплазматический домен (СУТ), в то время как вариант ЬАС-3У3 кодирует растворимый (цитоплазматический) белок с молекулярной массой 52 кД, включающий домены Ό1, Ό2 и 8 новых С-концевых аминокислот (фиг. 1).
В заключение можно отметить, что в настоящее время идентифицированы четыре молекулы ЬАС-3 - две связанные с мембраной (ЬАС-3 дикого типа и ЬАС-3У2) и две цитоплазматические формы, которые утрачивают транс-мембранную последовательность (ЬАС3У1 и ЬАС-3У3). Анализ экспрессии вариантов ЬАС-3 в линиях отдельных Т-лимфоцитов и при разном статусе их активации может обеспечить полезную информацию для лучшего понимания функций белка ЬАС-3.
Пример 3. Характеристика белка ЬАС3У3.
Моноядерные клетки периферической крови (РВМС) человека были получены путём центрифугирования в градиенте плотности Фиколл-диатризоата на материале поверхностной плёнки отдельных проб донорской крови. РВМС были получены от двух здоровых доноров. РВМС, взятые из зоны соприкосновения надосадочного слоя и слоя градиента, трижды промывали в фосфатном буфере и в конечном счёте ресуспендировали при концентрации 2 млн. клеток на 1 мл в культуральной среде ΚΡΜΙ-1640 обогащенной 10% плодной телячьей сыворотки, 2 мМ Ь-глутамина, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Затем добавляли фитогемагглютинин (ФГА) и рекомбинантный человеческий интерлейкин-2 (1Ь-2) при конечной концентрации 1 мкг/мл и 100 ед./мл соответственно.
Клетки инкубировали при 37°С в присутствии 5% С02 в течение 72 и 120 ч. По окончании инкубации клеточные суспензии переносили в 50-мл полипропиленовые пробирки и центрифугировали при 400д в течение 10 мин. Надосадочные фракции отбирали и сразу замораживали при 20°С. Определение общего белка проводили по методу Бредфорда с использованием теста с окрашиванием кумасси голубым (Р1егсе, КоскГогб. 1Ь, США). Для проведения анализа 100 мкг образца полностью высушивали с использованием вакуумной центрифуги, ре суспендировали в 10 мкл бидистиллированной воды, 10 мкл образцового буфера 2х добавляли и образцы инкубировали в течение 5 мин при 100°С.
Образцы затем загружали в 8% полиакриламидный гель с трис-глицином для проведения анализа методом электрофореза в 8Б8-ПААГ. который проводили в денатурирующих и восстанавливающих условиях при напряжении в 125 В. Электрофоретическую разгонку останавливали тогда, когда граница красителя достигала дна геля.
Гель снимали и инкубировали в течение 20 мин в трансферном буфере. Нитроцеллюлозные мембраны 0,45 мкм инкубировали в течение 10 мин в трансферном буфере в отдельной емкости при легком перемешивании. Затем белки из геля электрофоретически переносили на мембрану в течение 90 мин при постоянном напряжении 75 В. По завершении переноса мембрану высушивали при комнатной температуре и затем инкубировали в течение 20 мин в 1% (весовые проценты) едком калии при тщательном перемешивании и промывали 4 раза фосфатным буфером в течение 5 мин. Мембрану окрашивали в течение 5 мин раствором красителя понсо-8, позволяющим выявлять тестируемые белки и маркёры молекулярных масс, и затем обескрашивали четырежды фосфатным буфером. Сайты неспецифического связывания блокировали путём инкубирования мембраны в течение ночи при 4°С при 1% Мйе в фосфатном буфере +0,5% Твин. После удаления блокирующего раствора на мембрану накапывали специфичное в отношении БАС-3 моноклональное антитело 2Н6, разведённое в 5 мкг/мл блокирующего раствора. Через 1 ч инкубации при комнатной температуре при перемешивании мембрану 5 раз промывали фосфатным буфером +0,5% Твин в течение 10 мин (каждая промывка) и затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при перемешивании с козьими поликлональными антителами к мыши, соединённой с пероксидазой редьки, разведённой в соотношении 1:1000 в блокирующем растворе. По окончании инкубации мембрану промывали так же, как это было описано выше.
Результаты
Подвергнутые иммуноблоттингу белки затем выделяли с применением метода усиливающей люминесценции (ЕСЬ) (Атегайат Пайа, М11ап, Италия).
Колонки 1 и 3 на фиг. 9 представляют результаты, полученные от 1-го донора через 72 и 120 ч инкубации соответственно, в то время как колонки 2 и 4 соответствуют данным 2-го донора, а колонка 5 - лимфобластоидной клеточной линии ВАЛ, взятой в качестве негативного контроля. Исходные концентрации белков составили соответственно 3,1, 1,9, 2,8, 3,4, 3,4 мг/мл от 1-й к 5-й колонке.
Бэнд, соответствующий молекулярной массе примерно 5,5 кД, реагировал с моноклональным антителом к БАС-3. Эта выявленная величина молекулярной массы согласуется с той, которая является расчётной для варианта БАС-3У3, исходя из последовательности, соответствующей мРНК. Этот бэнд специфически проявляется ФГА-стимулированными бластами и отсутствует в надосадочной фракции Влимфобластных клетках линии ВАЛ, полученных в качестве супер-натантов ФГА-стимулированных бластов.
Список последовательностей (1) БАЗОВАЯ ИНФОРМАЦИЯ (1) ЗАЯВИТЕЛЬ:
(A) ИМЯ: 1П51йи1 Νηΐίοηηΐ бе 1а 8ап1е е1 бе 1а Весйетсйе Меб1са1е (B) УЛИЦА: 101 гие бе То1Ыас (C) СТРАНА: Франция (Ό) ПОЧТОВЫЙ КОД: 75013 (A) ИМЯ: 1п51Ии1 С.ВоиББу (B) УЛИЦА: 39 гие СатШе БеБтоиНпБ (C) ГОРОД: УШеМ (Е) СТРАНА: Франция (Е) ПОЧТОВЫЙ ИНДЕКС: 94805 (6) ТЕЛЕФОН: (33-1) 42-11-42-11 (H) ФАКС: (33-1) 42-11-53-00 (A) ИМЯ: Аррйеб Векеагсй 8у51ет5 АВ8 Но1бтд Ν.ν.
(B) УЛИЦА: 6 ТВ.СогБпатед Р.О.Вох 3889 (C) ГОРОД: Сигасао (Е) СТРАНА: Голландская Вест-Индия (ίί) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Сплайсинговые варианты БАС-3 (ш) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 15 (ίν) ФОРМА, ПРИГОДНАЯ ДЛЯ КОМПЬЮТЕРА (A) ТИП носителя дискета (B) КОМПЬЮТЕР 1ВМ-совместимый (C) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: РСБО8/М8-ОО8 (Ό) ПРОГРАММА: Ра1еп1ш Ве1еа§е 1.0, \егБ. 1.25 (ЕРО) (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 8ЕС ГО ΝΟ 1 (I) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА: 2279 пар нуклеотидов (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (νί) ОРИГИНАЛЬНЫЙ ИСТОЧНИК:
Ното 5ар1еп5 (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8ЕС ГО ΝΟ 1
ТСАОССТССС ТбАТСТбССС АССТТТССАС СТТТССТСТС САТТСССОСС ТСТССТСАТС60
ССТССССАСС СТСТСТССАА СОСССТСТСС ТССТСТСССТ ТСТТСТАСАА ССССТТССТС120
САССТСССТС ТСТССАСААС ТТСТССТТТЛ ССССССАССС СССАССАСТС СССССТГТСС180
ТТТТСТОАСС ТССТТТТСОА СООСТСАССВ СТССССАОАС САТАООАОАС АТОТСССАСС240 стелаттсст саосттсстс тттстосаос состттосат состссастс аассстстсс зоо атсстстсса сссаосаосо СА6САТСТСА ассттстсса ССССССССТС ССССССССОЗ ТССТСССССС ССАССССССВ АСССССАССС ТОССССТССА састтстссс татссстссо ОТВСАССТСА СООАССССОС АТСАСТаССА СССССССА&5 ТТСАСССОСС СТСАСССССС ОТСССТСТСС ТССАСТСССС стсаосссса тооастстоо СТСТССАТСА ТСТАТААССТ ССАСААСТСС ТТССТССССС СТССССАССС АСТСОССТАС СТСОСАСССТ САСАССТССС ТСССОСССТТ СССТСТССТТ ТСАТСАССТТ АТТСТССТСС ОССТСССТТС СТТОСАСССС ОСТТТТСТТТ ТСТСТТСАОС СОТТССАОСС тавссстосс АСТСССААСТ ССАСТССТСС САСТТТАССС ТТССАСТАОА АТССАТСТОС АОСААСАССА СССАААТССТ ТТСООТСАСС ТСТССАСААС ААСССТТТСТ ООАССТТСОС ТООАООСЛСА ТАССАССОСС АСАСССТТСТ ССССААСССТ СТСЗСАЗАОС АСССТТОСТС ТССТТТСТСТ
АСССАССССС ТСАССТСССС ССАСССССАС аатссссстс АОСАТСАОСС АСАСАСТССС стсасссссс аасоссстсс тссстссссс аоосстсссс ассссссссо ссасссссос ссссссаста сссссссасз тссссстсос ссАсасстсо СССТСЛТТТТ СААСТССТСС СОААССОООа ССАССОССОА ссттсстстт сстсссссаа ССТАСАСАСА ТСССТТСАЛС ССАСТСТССТ ТСАСАТТТОА АТСССТСССС АААССАССТТ ТОТТССАССС СТТТАТАТТ8, ссотассстт ссассстсат ЭОТТТСТбАО ССТССТСАСС АССАТСТССТ СААТТСТТСТ АСОАСССАСС ТТТААСТТТО ТСАСАСТОТА СССТССАССА тососасссо отстттсстс ТССТСАСТСС АСАСААТОСС СТСООАССТА САССТСССАТ ТСССААТСАТ САСАСТСАСТ ТТТСТСАССТ ОАСТССАОТА САТСССЛОАС САЗТТТСТСА АСССТТСОСА АТСССЛССТС САСАССТОТС ТАССССАССТ ОССАССТССТ «остстттстс
ООСТССТОСС САССТССССТ ААСАССАСОС СТСАСТТССС ссатссссто ссссссассс ССССТАСАСС ОТОСТСАОСС сссссасатс сасстосато сссасссссс сосасаслсс сстстсстсс сссстссстс АТСТСТСАСА СССТССОАСТ АСССТСТСТС САТТССТТСС ССАТСАССАС ТТАССССААА ССССТОСССС ТССАТССТСА САСтаттста сстаастссс ССТТСТСАСС ТССССТААСТ стсаттссто тасстстслс АТСАССССТТ СТТССТТСТС СССАСТААСС ССАСТТССТС ТТАССАСТСТ ТАТОАОССАС САССАСТССС ТССССАСТСС ТСТОСАСССС ССААСТСССТ стсссссстс сстсстсото ТСОСССАСЭС ССТСАССТСС ССАТОТСАСС САОССССАСС «ЗСТСААТССС АСТСТСАСАТ ТССАТСССТС СССААССТСС СТОСАССТСТ СТССАСАССС ССАОССССАС СТССТТТССС ТССАССАССА СТСТАСТТСА СССАССТССС СТСССАССАС 1 ССТССТТТТС ОТСАСТбОАО
Эбо
420
480
540
600
660
720 780
840
900
960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980
2040
ССТТТСССТТ ТСАССТТТСО АОААОАСАСТ ООССАССААб АССАТТТТСТ ОССТТАСАСС 2100
ААССОАТТСА СССТСССАСС СТСАСАССАА 6АТАСАО6А6 СТСбАССААО ААССССАОСС 2160
ССАСССССАС СССОААСССС АСССССАССС ССАОССССАС ССССАССАСС
АОСТСАСОСА СССАОСАСАТ СТСАОСАССС САСТССАААТ АААССТССТС тстсАсстас
2220
2279
ТСТАССАСС (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 8Ер ГО N0 2 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА: 247 аминокислот (B) ТИП: аминокислота (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: белок (νί) ОРИГИНАЛЬНЫЙ ИСТОЧНИК:
Ното 8ар1еи8 (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8ЕО ГО N0 2
Ьеи <ЗХп Рго СХу Ма СХи ναΐ Рго УаХ 7а1 Тгр АХа СХп СХи СХу АХа
Ю 15
Рго А1а С1п Ееа 20 Рго Суз 5эг Рго ТЬг Не Рго Ьеи О1п Азр Ьеи Зег
25 30
Ьеи Ьеи Агд Агд А1а С1у νβΐ ТЬг Тгр С1п Н13 СХп Рго Агр Зег СХу
35 40 45
Рго Рго А1а А1а А1а Рго О1у Н13 ₽го Ьеи А1а Рго С1у Рго Н15 Рго
50 55 60
А1а А1а Рго Зег* Зег Тгр О1у Рго Агд Рго Агд Агд Туг ТЬг νβΐ Ьеи
65 70 75 80
Зег Уа1 <31у ΡΧΌ <31у <31у Ьеи Агд Зег (Э1у Агд Ьеи Рго Ьеи СХп Рго
85 90 95
Агд Уа1 <31а Ьеи Азр О1и Агд О1у Агд <Э1п Агд С1у А5р РЬе Зег Ьеи
100. 105 НО
Тгр Ьеи Агд РГО А1а Агд Агд А1а Аер АХа С1у СХи Туг Агд АХа А1а
115 120 125
Уа1 Н13 Ьеи Агд Азр Агд А1а Ьеи Зег Су8 Агд Ьеи Агд Ьеи Агд Ьеи
130 135 140
□1у О1п А1а Зег МеИ ТЬг АХа Зег Рго РГО О1у Зег Ьеи Агд АХа Зег
145 150 155 160
Агр Тгр νβΐ Не Ьеи Азп Суз Зег РЬе Зег Агд Рго Агр Агд Рго А1а
165 170 175
Зег Уа1 ΗΪ8 Тгр РЬе Агд Азп Агд О1у С1П О1у Агд УаХ Рго Уа1 Агд
180 185 190
С1 и Зег Рго 195 Ηί3 ΗΪ8 ΗΪ3 Ьеи А1а 200 С1и Звг РЬе Ьеи РЬе 205 Ьеи Рго СХп
νβΐ ^ег 210 Рго Мес Азр Зег О1у 215 Рго Тгр СХу Суз Не 220 Ьеи ТНг Туг Агд
Азр 225 С1у РЬе Агп УаХ Зег 230 Не МеС Туг Агп Ьеи 235 ТЬг УаХ Ьеи СХу АЗП 240
Зег Рго ТЬг' Ьеи Ьеи ΗΪ8 Не
245 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 8Ер ГО N0 3 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА: 1629 пар нуклеотидов (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (νί) ОРИГИНАЛЬНЫЙ ИСТОЧНИК: Ното 8ар1еи8 (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЛТ) ГО N0 3
ТСАСССТОСС ТСАТСТСССС АССТТТССАС СТТТССТСТО САТТСССОСС ТСТССТСАТС60
ССТССССАСС СТСТСТССАА СОСССТСТСС ТОСТСТСССТ ТСТТСТАОАА ССССТТССТС120
САССТСССТС ТСТССАСААС ТТСТССТТТА ССССССАССС СССАССАСТС СССССТТТСС180
ТТТТСТСАСС ТССТТТТСОА ОСССТСАССС СТССССАОАС САТАССАСАО АТОТСССАСС240
СТСАСТТССТ СООСТТОСТО ТТТСТОСАОС СССТТТСССТ СОСТССАСТС ААСССТСТСС300
АОССАССОСС ТСАОСТСССС СТСбТСТОСО СССАССАОСС СССТССТССС САССТССССТ360
ССАСССССАС ААТСССССТС, САССАТСТСА СССТТСТССО ААСАССАСОС СТСАСТТССС420
АССАТСАОСС АСАСАСТССС ССССССОСТО ССССССССОЗ ССАТССССТО ОССССССССС400
СТСАСССССС СССССССТСС ТССТООСССС ССАССССССС ССССТАСАСО СТССТСАССС540
ТСССТССССС АССССТСССС АСССССАССС ТОССССТССА ССССССССТС САССТОСАТО600
АОСССССССО ССАССОССОО САСТТСТССС ТАТСССТССС СССАОСССОС СССССССАСС660
ССССССАСТА СССССССССС СТОСАССТСА ООСАСССССС ССТСТССТСС ССССТСССТС720
ТССОССТССС ССАССССТСС АТОАСТСССА СССССССАСС АТСТСТСАСА СССТСССАСТ780
СССТСАТТТТ СААСТССТСС ТТСАСССОСС СТСАСССССС АСССТСТСТС САТТССТТСС840
ООААССОООС ССАОССССОА ОТСССТСТСС СОСАОТСССС ССАТСАССАС ТТАССССААА900
ССТТССТСТТ ССТСССССАА СТСАОССССА ТССАСТСТОО ССССТССОСС ТССАТССТСА960
ССТАСАСАСА ТООСТТСААС СТСТССАТСА ТСТАТААССТ САСТОТТСТС ОСТСТООАСС1020
ССССААСТСС СТТОАСАОТО ТАСССТССАО САССТТССАС ССТСССССТС СССТСССССС 1080
ТСССТССТСС ТСТСОССАСС СССТСТТТСС ТСАСТСССАА СТСОАСТССТ ССТССОССАС 1140
ССССТСАССТ ССТССТСАСТ ССАСАСААТС СССАСТТТАС ССТТССАСТА САССАТСТСА 1200
ОССАСОСССА«СССТОССАСС ТАСАССТбСС АТАТССАТСТ ОСАбСААСАО САССТСААТС 1260
ССАСТСТСАС АТТСССААТС АТСАСАССТС СССААСССТС ТбСбАСАОСС ССАСОТСССС 1320
ТСССАОСАСО ССАССТССТС СТСТТТСТСА СССТТССТОТ ССТТТСТСТС СТССТТТТбС 1380
ТСАСТСОАОС СТТТбССТТТ САССТТТССА СААОАСАСТС СССАССААСА ССАТТТТСТС 1440
ССТТАСАССА АССОАТТСАС ССТССССАСб СТСАСАССАА САТАСАССАО СТССАССААС 1500
ААССССАССС ССАССССбАС ССССААСССС АОССССАССС ССАОССССАС ССССАССАСС 1560
ТСТСАССТСС АССТбАСОСА СССАССАСАТ СТСАОСАССС САСТССАААТ АААССТССТС 1620
ТСТАССАСС 1629
(2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ Л Т) ГО N0 4 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА: 422 аминокислоты (B) ТИП: аминокислота (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: белок (νί) ОРИГИНАЛЬНЫЙ ИСТОЧНИК: Ното 8ар1еи8 (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8ЕР ГО N0 4
Ьеи С1п РГО С1у АХа СХи νβΐ Рго Уа1 Уа1 Тгр А1а СХп СХи СХу АХа
1 5 10 15
Рго АХа О1п Ьеи Рго Суз Зег РГО ТЫ Не Рго Ьеи СХп Азр Ьеи Зег
20 25 30
Ьеи Ьеи Агд Агд А1а С1у νβΐ ТЬг Тгр С1п К1в С1п Рго Азр Зег СХу
35 40 45
Рго Рго А1а АХ а АХа Рго СХу ΗΪ8 Рго Ьеи А1а Рго ОХу Рго ΗΪ3 Рго
50 55 60
А1а АХа Рго Зег Зег Тгр СХу РГО Агд Рго Агд Агд Туг ТЬг Уа1 Ьеи
65 70 75 во
Зег Уа1 С1у Рго О1у СХу Ьеи Агд Зег С1у Агд Ьеи Рго Ьеи СХп РГО
85 9С 95
Агд V»! О1п Ьеи Азр С1и Агд ОХу Агд С1п Агд О1у Азр РЬе Зег Ьеи
100 105 110
Тгр Ьеи Ага рго А1а Агд Агд АХа Авр А1а <31у СХи Туг Агд А1а А1а 115 120 125
Уа1 Нхз Ьеи Агд Авр Агд А1а Ьеи Зег Сув Агд Ьеи Агд Ьеи Агд Ьеи
130 135 140
СХу 145 СХп АХа Зег Меь ТЬг 150 АХа Зег Рго Рго СХу Зег Ьеи Агд Х55 А1а Зег 160
Азр тгр Уа1 Не Ьеи Азп Суз Зег РЬе Зег Агд РГО Авр Агд Рго А1а
165 170 175
Зег УаХ ΗΪΒ Тгр РЬе Агд Азп Агд СХу СХп С1у Агд Уа1 Рго Уа1 Агд
1во 185 190
СХи Зег Рго ΚΪ8 Нхз Ηίε Ьеи А1а СХи Зег РЬе Ьеи РЬе Ьеи Рго С1п
195 200 205
УаХ Зег РГО МеС. Азр Зег С1у Рго Тгр С1у Суз Х1е Ьеи ТЬг Туг Агд
210 215 220
Азр СХу РЬе Азп Уа1 Зег Не Мес Туг Азп Ьеи ТЬг УаХ Ьеи С1у Ьеи
225 230 235 240
С1и Рго Рго ТЬг Рго Ьеи ТЫ УаХ Туг АХа СХу АХа СХу Зег Агд Уа1
245 250 255
СХу Ьеи Рго Суз Агд Ьеи ₽го АХа СХу-Уа1 СХу ТЬг Агд Зег РЬе Ьеи
260 - 265 270
ТЬг АХа ьуз Тгр ТЬг Рго Рго СХу С1у С1у Рго Азр Ьеи Ьеи Уах ТЬг
275 280 285
С1у Азр Азп С1у Азр РЬе ТЫ Ьеи Агд Ьеи С1и Азр Уа1 Зег СХп А1а
290 295 300
С1п А1а С1у ТЫ Туг ТЫ Суз Нхз ХХе Н13 Ьеи СХп СХи С1п СХп Ьеи
305 310 315 320
Азп А1а ТЬг Уа1 ТЬг Ьеи АХа 1Хе 11е ТЬг СХу АХа С1п Агд Зег СХу
325 330 335
Агд А1а Рго ОХу АХа Ьеи Рго А1а С1у Н15 Ьеи Ьеи Ьеи РЬе Ьеи ТЬг
340 345 350
ТСАСОСТССС ССТССССАСС САССТСССТС ТТТТСТОАСС СТСАСТТССТ аоссассссс ССАСССССАС АССАТСАССС стсасссосс тссстссссс АССССССССС» ССССССАСТА тссссстссэ ОССТСАТТТТ ОСААСССООО ССТТССТСТТ ССТАСАОАОА ССССААСТСС тссстсстса сссстсасст СССАСССССА ССАСТОТСАС СССАСССТАС ТСТСАТСССА ТСАСССССАТ
ТОАТСТСССС СТСТСТССАА ТСТССАСААС тссттттсса аоссттссто ТСАССТСССС ААТСССССТС
АЗАСАЭТССС сссассстсс Асасстассс ссасссссос ссассссасо ССАССССТСС СААСТССТСС ССАОСССССА ССТОССССАА таасттсААС СТТСАСАЗТС ТОТСОССАСС сстаатсАСГ ОССТСССАСС АТТООСААТС АААОСАСАСНЗ асссАСТОоа ААТАААСААА
АССТТТССАС сассстстсс ТТСТССТТТА сссстсассс ТТТСТССАСС стсстотсса САССАТСТСА сссссссстс тсстасссас АОССССАСОС састтстсос СТССАССТСА АТСАСТСССА ттсаоссссс стссстатсс СТСАСССССА ОТСТССАТСА ТАСОСТССАС СССТСТТТСС ССАСАСААТС ТАСАССТССС АТСАСАССТС САОЗААЗССС САСААОТТСС ССАААСТС
СТТТССТСТО тсотстссст ССССССАССС СТССССАОАС састттоаат СССАССАСОС сссттстсса ссссссссае ссассссссо ТСССССТССА тАтасстосо СССАСССССС СССССССА60 СТСАСССССС сссастсссс тссастстос ТСТАТААССТ САОСТТССАО ТСАСТВССАА СССАСТТТАС АТАТССАТСТ ассстсасст ТСЗСАССССА АОАСССТССС саттссзссс ТСТТСТАСАА СССАССАСТО САТАССАСАО СССТССАСТС ссстсстссс аасассас&з ССАТССССТС сссстасасс сссссссстс СССАСССССС сстстсстас АТСТСТСАСА АОССТСТСТС ССАТСАССАС сссстассас САСТСТТСТС СОТОСООСТС СТССАСТССТ ССТТССАСТА ССАОСААСАС СССАААССАС ААОАСТАСОС САТСТССССС тстоатсАте ССССТТССТС СССССТТТСС АТОТСООАСО ААСССТСТСС САССТССССТ отсАСТтоас сссссссссс СТССТСАССС САССТС5САТО сссссссасс сссстссстс СССТСССАСТ САТТСОТТСС ТТАССССААА ТССАТССТСА ОСТСТССАСС СССТОССОСС ССТСССССАС САССАТСТСА САССТСААТС ТАОСТССССТ АААСССАССС СССАСТТТТС
Ьеи СХу Уа1 Ьеи Зег Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи У&1 ТЬг С1у АХа РЬе СХу РЬе
355 360 365
ΗΪΞ Ьеи Тгр Агд Агд СХп тгр Агд РГО Агд Агд РЬе Зег АХа Ьеи СХи
370 375 380
СХп СХу Не Нхз 4₽го Рго СХп АХа С1п Зег Ьуз 11е С1и СХи Ьеи СХи
385 390 395 400
ОХп СХи Рго С1и Рго О1и Рго СХи Рго СХи Рго СХи Рго СХи Рго О1и
405 410 415
(2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 8ЕО ΙΌ N0 6 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА: 338 аминокислот (B) ТИП: аминокислота (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: белок (νί) ОРИГИНАЛЬНЫЙ ИСТОЧНИК: Ното 8ар1еп8 (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЛТ) ΙΌ N0 6
Рго СХи Рго СХи СХп Ьеи
420 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 8Ер ΙΌ N0 5 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА: 1468 пар нуклеотидов (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одноцепочечная (Ό) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ίί) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (νί) ОРИГИНАЛЬНЫЙ ИСТОЧНИК: Ното 8ар1еп8 (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8ЕО ΙΌ N0 5
Ьей С1л Рго 01у А1а С1и Уа1 РГО Уа1 УаХ Тгр А1а С1п С1и С1у А1а
1 5 10 15
Рго А1а 01Л Ьей Рго Суз Зег Рго ТПг 11з РГО Ьей □1п Азр Баи Зег
20 25 30
Ьей Ьей Агд Агд АХа СХу νβΐ ТПг Тгр <Э1п Н1з □1п Рго Азр Зег С1у
35 40 45
Рго Рго А1а АХа А1а Рго СХу Ηίδ Рго Ьей А1а Рго С1у Рго ΗΪ3 Рго
50 55 60
АХа АХа Рго Зег Зег Тгр О1у РГО Агд Рго Агд Агд Туг ТПГ УаХ Беи
65 70 75 80
Зег УаХ СХу Рго С31у СХу Ьей Агд Зег 01у Агд Ьей Рго Ьей СХп РГО
85 90 95
Агд Уа1 01л Ьей Азр 01и Агд СХу Агд О1л Агд С1у Азр РПе Зег Баи
100 105 но
Тгр Ьей Агд Рго АХа Агд Агд АХа Азр АХа СХу СХи Туг Агд АХа АХа
115 120 125
УаХ •Н18 Ьей Агд Азр Агд А1а Беи Зег Суз Агд Беи Агд Ьей Агд Беи
130 135 140
О1у 01л АХа Зег Мак ТПГ А1а Зег Рго Рго С1у Зег Баи Агд А1а Зег
145 150 155 160
Азр Тгр УаХ Не Ьей Азл Суз Зег РПе Зег Агд Рго Азр Агд Рго АХа
165 170 17 5
Зег УаХ ΗΪ5 Тгр РПе Агд Азп Агд СХу О1п СХу Агд Уа1 Рго УаХ Агд
Ιβο 165 190
С Хи Зег Рго ΗΪ3 ΗΪ8 Н15 Беи А1а С1и-Зег РПе Беи РПе Беи Рго СХп
195 200 205
УаХ Зег Рго Мек Азр Заг СХу Рго Тгр С1у Суз 11а Беи ТПг Туг Агд
210 215 220
Азр СХу РПе Азп УаХ 3ΘΓ 11а Мек туг Азп Беи ТПг Уа1 Беи СХу Баи
225 230 235 240
С1и Рго Рго ТПг Рго Беи ТПг Уа1 Туг А1а С1у А1а СХу Зег Агд Уа1
245 250 255
С1у Баи Рго Суз Агд Беи Рго А1а С1у Уа1 С1у ТПг Агд Зег РПе Беи
260 265 27 0
ТПг АХа Буз Тгр ТПг Рго Рго О1у С1у С1у Рго Азр Беи Беи Уа1 ТПг
27 5 280 285
С1у Азр АЗП С1у Азр РПе ТПг Баи Агд Беи С1и Азр Уа1 Зег сХл А1а
290 295 300
С1л АХа О1у ТПг Туг ТПг Суз Ηί3 На ΗΪ3 Баи С1п СХи СХп СХп Беи
305 310 315 320
Азп АХа ТПг Уа1 ТПг Беи АХа Х1а 11а ТПг СХу С1п Рго αΐη Уа1 СХу
325 330 335
Буз С1и
(2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 8Ер ГО N0 7 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА: 29 пар нуклеотидов (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одноцепочечная (И) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (х1) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ГО N0 7
ТСТСТСАЕАЕ ССТССЕАТЕЕ СТСАТТТТС (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 5ЕО ГО N0 8 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА: 30 пар нуклеотидов (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одноцепочечная (И) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (х1) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ГО N0 8
ТССТЕСАЕАТ СЕАТАТЕЕСА ЕЕТСТАЕЕТС 30 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 5ЕО ГО N0 9 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА: 21 пара нуклеотидов (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одноцепочечная (И) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (х1) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: δΗΟ ГО N0 9
ССТСССССАС СССТССАТ2А С 21 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 5ЕО ГО N0 10 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА: 20 пар нуклеотидов (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одноцепочечная (И) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (х1) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: δΗΟ ГО N0 10
ССССАСТСТС СТТСАСАТТТ 20 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 5ЕО ГО N0 11 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА: 37 нуклеотидов (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одноцепочечная (И) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (х1) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: δΗΟ ГО N0 11
СССССТССАТ ССССАССТАА ΤΤΤΊΤΤΤΤΤΤ ТТТТТТТ 37 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 5ЕО ГО N0 12 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА: 20 пар нуклеотидов (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одноцепочечная (И) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (х1) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: δΗΟ ГО N0 12
СССССТСЕАТ СССЗАССТАА 20 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 5ЕО ГО N0 13 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА: 34 пар нуклеотидов (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одноцепочечная (И) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (х1) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: δΗΟ ГО N0 13
ТАТАССАТСС ССТЗСССАСА ССАТАССАСА ОАТС 34 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 5ЕО ГО N0 14 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА: 32 пары нуклеотидов (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одноцепочечная (И) ТОПОЛОГИЯ: линейная (й) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ВЕр ГО N0 14 нессттсАсе тееттссесА сстетелтдА тт 31 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ВЕО ГО N0 15 (ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА: 31 пара нуклеотидов (B) ТИП: нуклеиновая кислота (с) ЧИСЛО НИТЕЙ: одноцепочечная (О) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ΐΐ) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: кДНК (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ВЕр ГО N0 15
ТСАССТАСТС САСААААСТС СССССССАСА Т 31

Claims (9)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. кДНК ВЕР ГО N0:1, приведенная в перечне последовательностей, кодирующая полипептид ЕАО-3У1 с аминокислотной последовательностью ВЕО ГО N0:2, приведенной в указанном перечне, а также варианты данной кДНК, полученные на основе вырожденности генетического кода.
  2. 2. Последовательность нуклеотидов, полностью комплементарная кДНК по п.1.
    5Р 01 02 РЗ ,04 ТМ ОТ «-™ |1|2|Э Е | 5 | ί | 7 | 8 I
    I νι 11Н1111¾¾ +
    чг НФ Ы 57 гя и НФ ЕЕ йиТ
    I
    Фиг. 1
  3. 3. Полипептид ЕАО-3У1 с аминокислотной последовательностью ВЕО ГО N0:2, кодируемый кДНК по п.1.
  4. 4. кДНК ВЕР ГО N0:3, приведенная в перечне последовательностей, кодирующая полипептид ЕАО-3У2 с аминокислотной последовательностью ВЕР ГО N0:4, приведенной в указанном перечне, а также варианты данной кДНК, полученные на основе вырожденности генетического кода.
  5. 5. Последовательность нуклеотидов, полностью комплементарная кДНК по п.4.
  6. 6. Полипептид ЕАО-3У2 с аминокислотной последовательностью ВЕО ГО N0:4, кодируемый кДНК по п.4.
  7. 7. кДНК ВЕР ГО N0:5, приведенная в перечне последовательностей, кодирующая полипептид ЕАО-3У3 с аминокислотной последовательностью ВЕР ГО N0:6, приведенной в указанном перечне, а также варианты данной кДНК, полученные на основе вырожденности генетического кода.
  8. 8. Последовательность нуклеотидов, полностью комплементарная кДНК по п.7.
  9. 9. Полипептид ЕАО-3У3 с аминокислотной последовательностью ВЕР ГО N0:6, кодируемый кДНК по п.7.
EA200000038A 1997-06-18 1998-06-03 ПОЛИПЕПТИДЫ LAG-3V1, LAG-3V2 И LAG-3V3 И КОДИРУЮЩИЕ ИХ кДНК EA003086B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP97401404A EP0900841A1 (en) 1997-06-18 1997-06-18 LAG-3 splice variants
PCT/EP1998/003307 WO1998058059A1 (en) 1997-06-18 1998-06-03 Lag-3 splice variants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200000038A1 EA200000038A1 (ru) 2000-06-26
EA003086B1 true EA003086B1 (ru) 2002-12-26

Family

ID=8229784

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200000038A EA003086B1 (ru) 1997-06-18 1998-06-03 ПОЛИПЕПТИДЫ LAG-3V1, LAG-3V2 И LAG-3V3 И КОДИРУЮЩИЕ ИХ кДНК

Country Status (18)

Country Link
EP (2) EP0900841A1 (ru)
JP (1) JP2002505582A (ru)
KR (1) KR100552526B1 (ru)
CN (1) CN1181201C (ru)
AT (1) ATE274057T1 (ru)
AU (1) AU740147B2 (ru)
BR (1) BR9810925A (ru)
CA (1) CA2293735A1 (ru)
DE (1) DE69825741T2 (ru)
DK (1) DK0977856T3 (ru)
EA (1) EA003086B1 (ru)
EE (1) EE04378B1 (ru)
ES (1) ES2227862T3 (ru)
HK (1) HK1027377A1 (ru)
IL (2) IL133544A0 (ru)
NO (1) NO996097L (ru)
PT (1) PT977856E (ru)
WO (1) WO1998058059A1 (ru)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030100359A1 (en) * 2000-10-04 2003-05-29 Loose Timothy C. Audio network for gaming machines
EP1295895B1 (en) * 2001-09-19 2011-08-10 Institut Gustave Roussy Peptides and proteins binding to glu-pro motifs, therapeutical compositions containing the same and applications thereof
SE0103423D0 (sv) * 2001-10-12 2001-10-12 Astrazeneca Ab Polymorphism
US20040258678A1 (en) * 2002-02-22 2004-12-23 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
US7867085B2 (en) 2003-01-16 2011-01-11 Wms Gaming Inc. Gaming machine environment having controlled audio and visual media presentation
US7364508B2 (en) 2003-01-16 2008-04-29 Wms Gaming, Inc. Gaming machine environment having controlled audio and visual media presentation
US7367886B2 (en) 2003-01-16 2008-05-06 Wms Gaming Inc. Gaming system with surround sound
US8313374B2 (en) 2003-02-14 2012-11-20 Wms Gaming Inc. Gaming machine having improved audio control architecture
WO2004078928A2 (en) * 2003-02-28 2004-09-16 The Johns Hopkins University T cell regulation
FR2902101B1 (fr) * 2006-06-12 2012-12-28 Scras Peptides a activite anti-proliferative
WO2008063391A2 (en) 2006-11-10 2008-05-29 Wms Gaming Inc. Wagering games using multi-level gaming structure
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
AR091649A1 (es) 2012-07-02 2015-02-18 Bristol Myers Squibb Co Optimizacion de anticuerpos que se fijan al gen de activacion de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
RS58705B1 (sr) 2013-09-20 2019-06-28 Bristol Myers Squibb Co Kombinacija anti-lag-3 antitela i anti-pd-1 antitela za lečenje tumora
US9412222B2 (en) 2013-09-20 2016-08-09 Igt Coordinated gaming machine attract via gaming machine cameras
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
TWI777174B (zh) 2014-03-14 2022-09-11 瑞士商諾華公司 針對lag-3之抗體分子及其用途
TWI693232B (zh) 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
JO3663B1 (ar) 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين
TWI773646B (zh) 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
GEP20227438B (en) 2015-07-30 2022-11-10 Macrogenics Inc Pd-1-binding molecules and methods of use thereof
TWI756187B (zh) 2015-10-09 2022-03-01 美商再生元醫藥公司 抗ｌａｇ３抗體及其用途
EP3389714A4 (en) 2015-12-14 2019-11-13 MacroGenics, Inc. BISPECIFIC MOLECULES HAVING IMMUNOREACTIVITY TO PD-1 AND CTLA-4 AND METHODS OF USE
AU2016371639A1 (en) 2015-12-16 2018-06-28 Merck Sharp & Dohme Llc Anti-LAG3 antibodies and antigen-binding fragments
SG11201907208XA (en) 2017-02-10 2019-09-27 Regeneron Pharma Radiolabeled anti-lag3 antibodies for immuno-pet imaging
BR112019021847A2 (pt) 2017-05-30 2020-06-02 Bristol-Myers Squibb Company Composições compreendendo um anticorpo anti-lag-3 ou um anticorpo anti-lag-3 e um anticorpo anti-pd-1 ou anti-pd-l1
EP3631454B1 (en) 2017-05-30 2023-09-13 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of lag-3 positive tumors
KR20220007593A (ko) 2019-05-13 2022-01-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 암 치료에서의 효능 강화를 위한 pd-1 억제제와 lag-3 억제제의 병용

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3134874B2 (ja) * 1986-08-21 2001-02-13 ザ・トラステイーズ・オブ・コロンビア・ユニヴアーシテイ・イン・ザ・シテイ・オブ・ニユー・ヨーク Ｔ細胞表面タンパク質ｔ４をコードするｄｎａ並びにｔ４フラグメントのａｉｄｓ治療への使用
FR2656800B1 (fr) * 1990-01-08 1992-05-15 Roussy Inst Gustave Nouvelles proteines produits par les lymphocytes humains, sequence d'adn codant pour ces proteines et applications pharmaceutiques et biologiques.
US5955300A (en) * 1994-05-06 1999-09-21 Institut Gustave Roussy Soluble polypeptide fractions of the LAG-3 protein, production method, therapeutic composition, anti-idiotype antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
EP0977856B1 (en) 2004-08-18
DK0977856T3 (da) 2004-12-20
IL133544A0 (en) 2001-04-30
AU740147B2 (en) 2001-11-01
EE04378B1 (xx) 2004-10-15
NO996097L (no) 2000-02-17
KR20010013539A (ko) 2001-02-26
JP2002505582A (ja) 2002-02-19
EE9900581A (xx) 2000-08-15
NO996097D0 (no) 1999-12-09
WO1998058059A1 (en) 1998-12-23
EA200000038A1 (ru) 2000-06-26
DE69825741D1 (de) 2004-09-23
IL133544A (en) 2006-12-31
BR9810925A (pt) 2000-08-15
ATE274057T1 (de) 2004-09-15
ES2227862T3 (es) 2005-04-01
CN1260833A (zh) 2000-07-19
DE69825741T2 (de) 2005-09-01
AU8435598A (en) 1999-01-04
HK1027377A1 (en) 2001-01-12
KR100552526B1 (ko) 2006-02-14
PT977856E (pt) 2005-01-31
EP0977856A1 (en) 2000-02-09
CA2293735A1 (en) 1998-12-23
CN1181201C (zh) 2004-12-22
EP0900841A1 (en) 1999-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA003086B1 (ru) ПОЛИПЕПТИДЫ LAG-3V1, LAG-3V2 И LAG-3V3 И КОДИРУЮЩИЕ ИХ кДНК
AU755794B2 (en) Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use
US6262244B1 (en) DNA and amino acid sequence specific for natural killer cells
KR19980702369A (ko) 신규 단백질 및 그 제조방법
JPH06502997A (ja) ヒトＴリンパ球レセプターのβ鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列対応するペプチドセグメント並びに診断及び治療への利用
US5817511A (en) Nucleotide sequence coding for variable regions of the α chains of human T lymphocyte receptors, corresponding peptide segments and the diagnostic and therapeutic uses
CA2146328A1 (en) C-c ckr-1, c-c chemokine receptor
AU2004287645A1 (en) Variants of human glycoprotein hormone alpha chain: compositions and uses thereof
US20050159590A1 (en) Variants of interleukin-1 receptor antagonist: compositions and uses thereof
CN109824777A (zh) 一种具有抑制玻璃体视网膜纤维化病变作用的单克隆抗体及其制备方法和应用
JP3231262B2 (ja) ヒトＴｈ１特異的タンパク質及びこれをコードする遺伝子、並びにこれに関連する形質転換体、組換えベクター及び抗体
WO1991012272A1 (en) Protein factor
US20160185835A1 (en) Immune system mediator
Gottsch et al. Cloning and sequence analysis of human and bovine corneal antigen (CO-Ag) cDNA: identification of host-parasite protein calgranulin C.
US20220251169A1 (en) Activatable fusion protein and use thereof
WO1992011289A1 (en) Antigen processing
Hue-Roye et al. Novel molecular basis of an Inab phenotype
Dhar et al. Alu elements in a Plasmodium vivax antigen gene
KR100304685B1 (ko) Il-16활성을갖는폴리펩티드를코딩하는게놈핵산,cdna및mrna,이의제조방법및이의용도
KR100301796B1 (ko) 면역억제능이 있는 항-씨디40 리간드 모노클로날 항체
JP2000106880A (ja) 新規なヒトｂ細胞表面タンパク質及びこれをコードするｄｎａ
MXPA99011397A (en) Lag-3 splice variants
MXPA00001524A (en) Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use
JPS62104584A (ja) 新規プラスミド

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU