CN1181201C - Lag-3剪接变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分离的核苷酸序列，它选自下列序列：a)SEQ ID NO：1、SEQID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列；b)在严谨条件下与a)定义的任一序列杂交且编码的多肽是LAG-3分子变体的核苷酸序列；c)遗传密码与a)和b)所确定的核苷酸序列简并、且编码的多肽是LAG-3分子基因型变体的核苷酸序列。

Description

LAG-3剪接变体
本发明涉及LAG-3分子的不同剪接变体的鉴定及其作为免疫调节剂的用途。
现在已经认识到，MHC II类区域编码的蛋白参与了免疫识别的许多方面，包括不同淋巴样细胞(如淋巴细胞和抗原呈递细胞)之间的相互作用。不同的观察结果还表明，不通过CD4发生的其它机制参与了T辅助淋巴细胞的效应功能。
人激活的T和NK细胞中表达的淋巴细胞激活基因3(LAG-3)编码了498个氨基酸(aa)的I型膜蛋白，其具有四个细胞外免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域。分析该序列表明，尽管整个氨基酸序列与人CD4的同源性仅高于背景水平(约20％的序列相同性)，但是有值得注意的一小段序列与CD4对应位置上发现的一段氨基酸序列相同。在LAG-3分子内，在结构域1(D1)和3(D3)之间以及结构域2(D2)和4(D4)之间发现有一些内部下列同源，这提示LAG-3象CD4一样通过预先存在的2 IgSF结构(1)基因复制而进化得到。另外，LAG-3和CD4基因在染色体12短臂远部上非常靠近(2，B.Huard，P.Gaulard，F.Faure，T.Hercend，F.Triebel，Immunogenetics 39，213，1994)。因此，LAG-3和CD4可视作是IgSF中进化上的“第一代表亲”。
本发明者以前采用定量细胞粘附试验曾表明，LAG-3转染的Cos-7细胞和MHC II+型B淋巴细胞之间的花结形成特异性地取决于LAG-3/MHC II型相互作用。用LAG-3Ig融合蛋白还观察到LAG-3与各种人II型分子(包括不同等位基因和同种型)、以及和小鼠及猴II型分子之间有直接和特异性的结合。该二聚LAG-3Ig重组球蛋白与MHC II型分子单型残基结合的亲合力比CD4Ig高得多(Kd＝60nM，37℃)；LAG-3Ig实际上能在细胞间粘附试验中阻断CD4/MHC II型相互作用。
已经用LAG-3特异性单克隆抗体(mAb)和LAG-3Ig分子研究了LAG-3/II型分子相互反应所起的作用。这种相互反应导致下游的T细胞克隆激活。产生LAG-3/MHC II型相互作用通过T-T细胞接触来介导，据推测是通过阴性MHC II型信号传导到T细胞。总之，在体外和在体内，LAG-3都仅仅在淋巴细胞激活后才表达，因此它在应答的诱导阶段中不起作用(与CD4相反)。此外，单克隆抗体阻断试验已经表明，LAG-3没有参与MHC II型限制的CD4+T细胞克隆的识别阶段。因此，LAG-3的功能作用显然与其它MHC配体CD4和CD8的功能不同。目前认为，T细胞MHC II型分子起的作用与CTLA-4在LAG-3结合后所起作用类似，即诱导以前激活的T细胞克隆性缺失。
Huard等人在Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 94：5744-5749，1997年5月中指出，可溶性LAG-3的前两个N端结构域D1和D2能够结合MHC II型分子。另外，国际出版物WO95/30750中也指出，LAG-3D1-D4能象抗MHC II型分子的单克隆抗体949一样有效地与MHC II型分子特异性结合，而LAG-3D1D2也能象LAG-3D1-D4一样有效地与表达MHC II型分子的细胞结合。
最近已经发现，LAG-3优先被激活的Th1细胞(即产生IFN-γ和TNF的T辅助细胞)表达和释放，并可由IL-12(一种强效的Th1-诱导性细胞因子)上调(F.Annunziato，R.Manetti，L.Tomasevic，MG.Giudizi，R.Biagiotti，V.Gianno，P.Germano，C.Mavilia，E.Maggi和S.Romagnani，FASEB J.10，769-775，1996)。在患复发性多发性硬化(MS)的患者(出处同上)和患系统性红斑狼疮的少数患者(S.Romagnani，clin.Immunol.Immunopath.80，225-535，1996)的血清中也发现了高水平的可溶性LAG-3(sLAG-3)。这些发现提示，LAG-3可以作为Th1介导的免疫疾病(如桥本氏甲状腺炎、I型糖尿病、多发性硬化、Chron’s疾病、类风湿性关节炎、急性异体移植排斥反应和急性移植物抗宿主疾病(GVHD))的有用的诊断标记物。另一方面，MS患者以及可能患上述疾病的其它患者血清中存在高水平的sLAG-3支持了sLAG-3天然存在的保护作用，因为它能与膜结合形式竞争，从而阻断了LAG-3介导的免疫应答。
本发明者已经调查了是否因为核转录物的其它剪接而表达出其它形式的LAG-3。
大多数编码真核蛋白的基因所含序列在对应的成熟mRNA中以不连续的DNA片段(外显子)存在，外显子之间散布有不形成成熟mRNA部分的序列(内含子)。因此，这些基因的初级转录物含有对应于外显子的序列和对应于内含子的序列。随后，内含子序列经细胞核多步加工(称为预初mRNA剪接)而切除。即，内含子以其5’(供体)和3’(受体)边界共有序列为界。剪接过程包括受体位点的断裂以及伴随的5’和3’外显子的连接。
在大多数情况下，基因中存在的外显子通过连续供体对和受体剪接位点的恒定连接插入一个成熟的mRNA中，产生了单基因产物。
然而，在一些情况下，相同的基因含有可能导致不同转录物的另一种剪接位点。关于调节该可变剪接的机制还不清楚，但是至少某些基因，已经知道是细胞和发育特异性的。
另一种剪接导致单基因产生多个蛋白同种型。这是产生蛋白多样性的一种分子加工。
目前已经知道50种以上的基因通过多种剪接产生蛋白多样性。该机制在伸缩性蛋白基因中特别常见和完善。
本发明者已经发现了三种新的以不同方式剪接的LAG-3变体，它们各自称为LAG-3V1、LAG-3V2和LAG-3V3。
LAG-3V1是可溶性36kD蛋白，其在D2结构域后有8个新的氨基酸残基，LAG-3V2是61kD的跨膜蛋白，它不含结构域D4，而LAG-3V3是52kD的可溶性蛋白，其在D3结构域后含有8个新的氨基酸残基。
这些变体为研究LAG-3基因的调节作用以及其蛋白的生物功能提供了新的方法，可用于产生新的免疫调节化合物、尤其是模仿LAG-3生物功能的化合物或能作为LAG-3和MHC II型分子之间相互作用的促效剂或对抗剂的化合物。
因此，本发明的主题是一种分离的核苷酸序列，它选自下列序列：
a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列；
b)遗传密码与a)所确定的核苷酸序列简并的核苷酸序列，该核苷酸序列所编码的多肽具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示的序列。
本发明另一方面提供了与核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5完全互补的序列。
本发明另一方面提供了一种多肽，它选自LAG-3V1、LAG-3V2或LAG-3V3，LAG-3V1的序列是由SEQ ID NO：1编码的SEQ ID NO：2，LAG-3V2的序列是由SEQ ID NO：3编码的SEQ ID NO：4，LAG-3V3的序列是由SEQ ID NO：5编码的SEQ ID NO：6。
本发明还提供了包含前述核苷酸序列的表达载体，经所述表达载体转化的宿主细胞。
本发明还涉及含有前述多肽作为活性组分的药物组合物。
本发明还涉及前述多肽用于生产免疫调节化合物的应用和用于生产治疗免疫相关疾病用治疗性组合物的应用。
本发明还涉及由上述核苷酸序列编码的纯化的多肽。所述多肽在下文称为“LAG-3变体”。本发明还涉及包含LAG-3变体多肽的药物组合物。这些组合物可用来治疗与免疫有关的病理，尤其是Th1依赖型疾病如Hashimoto’s甲状腺炎、I型糖尿病、多发性硬化、Chron’s疾病、类风湿性关节炎、急性移植排斥反应、急性GVHD、突眼型甲状腺肿(Grave′s)眼病、大脑疟疾、莱姆关节炎、反应性关节炎(耶尔森氏菌诱导的)、HCV诱导的慢性肝炎、原发性硬化性胆管炎(colangitis)、接触性皮炎、不能解释的反复流产、再生障碍性贫血和幽门螺旋菌诱导的胃窦炎。
本发明还涉及用LAG-3变体生产免疫调节剂化合物的用途。这种化合物能模拟或改变LAG-3和/或LAG-3变体的生物功能，因此诱导了涉及LAG-3或其变体参与的细胞相互作用的某些变化。
本发明还涉及多克隆或单克隆抗体、及其Fab、Fab’和F(ab)’2或Fv片段，涉及上述定义的一种LAG-3变体的特异性表位。这些特异性抗体纯化所述变体或制备治疗性或诊断性组合物中的用途以及所产生的组合物也包含在本发明范围内。
本发明还提供一种治疗免疫相关疾病的治疗方法，该方法包括给予患者有效量的LAG-3变体或包含所述变体作为活性组分的组合物。
本发明还涉及一种治疗免疫相关疾病的治疗性方法，该方法包括给予患者前述的抗LAG-3变体的抗体、或含有所述抗体作为活性组分的治疗性组合物。
在一个较佳的实例中，本发明涉及一种分离的核苷酸序列，该核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或其完全互补的序列。
本发明还涉及一种纯化的多肽，该多肽由本发明的一个核苷酸序列表达产生。较佳的是，该多肽选自LAG-3V1、LAG-3V2和LAG-3V3，它们分别由分别对应于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：5的序列编码。
本发明的多肽可用纯化膜蛋白或可溶性蛋白的标准技术、用肽合成或用基因工程技术来获得。所述技术包括将编码本发明的一种多肽的核苷酸序列插入表达载体(如质粒)中，用本领域技术人员所知的任何方法(例如电穿孔)将该表达载体转化宿主细胞。
有利的是，本发明的核苷酸序列是通过RT-PCR(反转录酶聚合酶链反应)从对应的LAG-3变体cDNA来获得。简言之，从激活的人外周血淋巴细胞(PBL)抽提出总RNA，用特定的一对寡核苷酸引物进行反转录和扩增。在本发明的例子中，引物由有义引物和反义引物组成，它们位于LAG-3序列的两个特定位置，这将在下列实施例中有更详细的描述。然后用酶法扩增得到cDNA，并亚克隆到合适的宿主细胞中。
本发明还涉及包含编码本发明多肽的核苷酸序列的表达载体以及用这些载体转化的宿主细胞。
“表达载体”指用来扩增或表达编码本发明一种多肽的DNA的可复制的DNA构建物。
宿主细胞可以是原核或真核细胞，包括(但不局限于)细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞，包括商业上可获得的细胞系。
本发明还涉及上述的抗-LAG-3变体抗体或其片段。较佳的是，这些抗体或其片段能与标记(放射性同位素、荧光染料、酶标记等)或有治疗活性的分子(例如细胞毒性化合物)相连。
多克隆抗体可用熟知的方法(如BENEDICT A.A.等人描述的方法)制备。生产单克隆抗体的方法是现有技术所熟知的，尤其是KOHLER和MILSTEIN所描述的方法。YELTON等人描述了该方法及其变化方案。
这些抗体可用于纯化本发明的多肽，或用于制剂或鉴别方法。所述方法例如是(但不局限于)RIA或IRMA类型的放射性免疫学方法、免疫酶方法(如ELISA方法)、或直接或间接的免疫荧光方法。
本发明还包括用所述抗体来生产能阻断LAG-3变体活性(即具有免疫调节活性，如诱导表达LAG-3变体的细胞(如激活的T和NK细胞)成熟、分化、增殖和/或起作用)的治疗型组合物。
针对LAG-3变体的抗体可用作免疫抑制患者(如HIV感染者或用免疫抑制药物治疗的患者)体内的疫苗或免疫刺激剂的增效剂。
本发明的治疗性组合物包含上述的可溶性LAG-3变体蛋白或抗体，以及药学上可接受的载体。这些组合物可根据通常的技术来配制。载体的形式可根据所选给药途径(口、肠胃外、舌下、直肠或鼻)而不同。
对于肠胃外给药用的组合物，载体通常包含无菌水和促进组合物溶解度或其贮藏能力的其它可能的组分。肠胃外给药途径可包括静脉内、肌内或皮下注射。
治疗组合物可以是缓释类型的，尤其对于长期治疗(例如自身免疫疾病)而言。给予的剂量取决于待治疗的主体，尤其是他/她的免疫系统实现所需保护程度的能力。最初治疗的医师很容易确定所给予活性组分的精确用量。
本发明的治疗性组合物除了包括本发明的可溶性LAG-3变体或抗体外，在适当的情况下还可包括另一种活性组分，该组分通过化学键与本发明的LAG-3变体或抗体连接。例如，可以指出，本发明的可溶性LAG-3变体蛋白与一种毒素(例如能结合MHC II型分子和杀死靶细胞(例如白血病或黑色素瘤细胞)的蓖麻毒素或白喉类毒素)融合或与放射性同位素融合。
下列实施例以及所附的参考附图将更详细地描述本发明。
图例
图1示出了野生型(wt)LAG-3及其变体V1、V2和V3的结构。LAG-3V1通过保留内含子4衍生获得(即侧接内含子4的供体和受体位点没有发生断裂)。保留的内含子4中位于8个密码子后的框内终止密码子产生了截短的可溶性LAG-3V1蛋白，它含有D1、D2和8个新的氨基酸残基。
LAG-3V2由于内含子5上的供体位点与内含子6上的受体位点连接而缺少外显子6。由于读框没有发生偏移，所得LAG-3V2蛋白是不含D4结构域的跨膜蛋白。
LAG-3V3通过核转录在内含子5的5’末端下游约170bp处的不同聚腺苷酸化位点处断裂而衍生获得。保留的内含子5序列含有一个符合读框的终止密码子。所得mRNA编码的截短的可溶蛋白含有D1、D2、D3和8个新的氨基酸残基。
图2显示了LAG-3基因的内含子/外显子组成。导致编码wtLAG-3、LAG-3V1、LAG-3V2或LAG-3V3的RNA转录物产生的剪接行为用虚线表示。
SP：信号肽；D1-D4：IgSF结构域1-4；TM：跨膜序列；CYT：胞质结构域；I1-I9：内含子1-9。
LAG-3V1和LAG-3V3中的新的外显子用带阴影的方框表示。
图3表示wtLAG-3和LAG-3V1。用来分离LAG-3V1的引物和探针的位置用箭头表示。用特定引物扩增的DNA片段用单线表示。图中示出了用RT-PCR获得的片段的大小。
图4显示了用引物F459和R460经RT-PCR扩增得到的wtLAG-3和LAG-3V1cDNA片段的Southern印迹分析。
a)溴化乙啶染色的凝胶。b)与LAG-3特异性cDNA探针杂交的印迹。下方的条带从wtLAG-3获得，而上方的条带(只有在杂交后存在)从LAG-3V1获得。
图5显示了用引物F176和R460经RT-PCR扩增获得的LAG-3V1 cDNA片段的Southern印迹分析。a)溴化乙啶染色的凝胶。主要的条带从wtLAG-3衍生获得。b)与LAG-4内含子4特异性寡探针14杂交的印迹。上方条带从LAG-3V1获得，而下方条带是wtLAG-3/LAG-3V1异源双链体。
图6表示wtLAG-3、LAG-3V2和LAG-3V3。用来分离LAG-3V2和LAG-3V3的引物和探针的位置用箭头表示。用特定引物扩增的DNA片段用单线表示。图中示出了用RT-PCR获得的片段的大小。
图7显示了用引物F176和R401经RT-PCR扩增得到的wtLAG-3、LAG-3V2和LAG-3V3 cDNA片段的Southern印迹分析。
a)溴化乙啶染色的凝胶。b)与LAG-3D2特异性寡探针F459杂交的印迹。上方条带从wtLAG-3衍生获得，而780和940bp的条带分别从LAG-3V2和LAG-3V3获得。
图8显示了分别用LAG-3V2和LAG-3V3特定引物(即173/V2R和173/V3R)获得的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图形。
图9显示了PHA-母细胞与单克隆抗体抗LAG-3的Western印迹图形。
实施例
实施例1：
在人PBMC(外周血单核细胞)上RT-PCR克隆人LAG-3变体1(LAG-3V1)RNA抽提和RT-PCR：
用Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离PBMC，用1微克/毫升PHA和100U/毫升IL-2于37℃、5％CO2活化48小时。用O1igotex Direct mRNA试剂盒(QuiagenInc.，Chatsworth，CA，USA)抽提mRNA，用寡(dT)引物和第一链合成试剂盒(RT-PCR试剂盒，Stratagen，La Jolla，CA，USA)进行反转录。
用2.5单位Taq聚合酶和分别与LAG-3序列的核苷酸762-791和1217-1246退火的正向引物F459(5′TCTCTC AGAGCC TCCGAT GGGTC ATTTTG 3′)(SEQID NO：7)和反向引物R460(5′TCCTGC AGATGG ATATGG CAGGTG TAGGTC3′)(SEQ ID NO：8)(图3)各100ng进行cDNA的扩增。进行30轮PCR循环，每一轮包括94℃变性1分钟、66℃退火1分钟和72℃延伸2分钟。
用Southern印迹分析扩增的DNA：
使10微升等份的扩增DNA在2％琼脂糖凝胶上分级。观察到预计的485bpLAG-3片段(图4a)。在印迹到硝酸纤维素滤膜上并和PCR获得的32P-标记的LAG-3D1D2特异性cDNA探针杂交后，除了由485bp的条带外，还发现了大约890bp的条带。再次对该890bp片段进行扩增、克隆和测序。
890bp的LAG-3片段的克隆和测序：
将890bp片段克隆到载体pCRTMI1(Promega)中，用ABI Prism Dye TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(Perkin-Elmer)和自动化的DNA测序仪373A型(Perkin-Elmer)对插入物测序。结果表明，该片段长度为892bp，它从保留内含子4的LAG-3变体衍生获得(图2)。由于内含子4中存在符合读框的终止密码子，该变体(即LAG-3V1)预计编码了含有结构域D1、D2和8个新的C端氨基酸残基的可溶性36kD蛋白(图1)。
LAG-3V1表达的确认：
为了确认LAG-3V1片段来自mRNA而不是来自基因组DNA，用与LAG-3序列的核苷酸725-745退火的正向引物F176(5′CCTGGG CCAGG CCTCGATGAC 3′)(SEQ ID NO：9)和反向引物R460(图3)进行第二次RT-PCR试验。引物F176跨越了D1/D2剪接接头位点，应当不会使LAG-3基因组DNA扩增。
PCR产物在琼脂糖凝胶电泳后，观察到所预计的大约520bp的wtLAG-3条带。和LAG-3内含子4特定寡探针I4(5′CCCCAC TCTGC TTCAC ATTT 3′)(SEQ IDNO：10)的Southern印迹显示了所预计的930bp的LAG-3V1条带和另一约800bp的条带(图5b)。对两个片段重新扩增和测序。经确认上方条带对应于LAG-3V1，而下方条带为wtLAG-3/LAG-3V1异源二聚体。
实施例II：
在激活的PBMC上以RT-PCR克隆人LAG-3变体2(LAG-3V2)和LAG-3变体3(LAG-3V3)
RNA抽提和RT-PCR：
用Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离PBMC，用1微克/毫升和100U/毫升IL-2于37℃、5％CO2激活48小时。
用TriZol试剂(GIBCO-BRL)抽提总RNA。用锚式寡(dT)引物混合物AT17A、AT17C和AT17G(5′GGCCCT GGATCC GGACC TAA(T)17(SEQ ID NO：1)，其后是A、C或G)(图6)反转录总RNA(5微克)，这些引物能获得具有同源3′末端和用于随后PCR的锚位的cDNA分子。
反转录酶(RT)反应在37℃、50微升最终体积的1×RT缓冲液、10毫摩尔DTT、1毫摩尔dNTP、40U RNA酶抑制剂(Boehringer)和400U Superscript IIRT(GIBCO-BRL)中进行90分钟。RT于90℃反应5分钟终止。用1U RNA酶H(Boehringer)37℃消化30分钟。
用正向引物F176和与cDNA 3′锚位退火的反向引物R401(5′GGCCCTGGATC CGGAC CTAA 3′)(SEQ ID NO：12)(图6)进行PCR。引物F176和R401应当允许扩增含有D1D2接头至聚(A)尾序列的所有LAG-3剪接变体。
在含有1×Taq缓冲液、2.5U Taq DNA聚合酶(Advanced Biotechnologies)、1.5mM MgCl2、200μM dNTP、10％DMSO和F176和R401引物各50皮摩尔的100微升最终体积中5微升cDNA(等价于0.5微克总RNA)上进行PCR。采用热开始(hot start)技术和30轮PCR循环(96℃30秒、65℃30秒、72℃4分钟)。用没有RT的RNA作为PCR试验的负对照。
RT-PCR产物的Southern印迹分析：
用琼脂糖凝胶电泳对RT-PCR产物(10微升)分级，并印迹到Hybond N+尼龙膜(Amersham)上。使印迹和5×SSC、0.02％SDS、0.5％封闭剂(Boehringer)、0.1％N-月桂基肌氨酸中的DIG标记的LAG-3D2特异性寡探针F459(图6)55℃杂交30分钟。
印迹用2×SSC、0.1％SDS于55℃洗涤两次。用HRP偶联的抗DIG抗体(Boehringer)和ECL试剂(Amersham)检测杂交物。
结果表明，在溴化乙啶染色凝胶(图7a)和Southern印迹(图7b)中，除了所预计的1.12kb wtLAG-3片段外，还有两条约940和780bp的小条带。
LAG-3片段的测序：
从琼脂糖凝胶上分离940和780bp的PCR片段，用F176/R401引物再扩增并直接测序。结果表明，780bp片段从LAG-3外显子6的框内跳越衍生获得(图2)。该变体命名为LAG-3V2，预计其编码61kD不含结构域D4的跨膜蛋白(图1)。
对940bp片段测序显示，它通过核转录物在内含子5的5′末端下游约170bp的不同聚腺苷酸化位点的断裂衍生获得(图2)。保留的内含子5序列含有符合读框的终止密码子。所得mRNA编码52kD可溶性LAG-3变体(即LAG-3V3)，它含有结构域D1、D2和D3，结构域D3后是8个新的氨基酸残基(图1)。LAG-3V2和LAG-3V3均保留了野生型LAG-3的4个糖基化位点。
LAG-3V2和LAG-3V3表达的确认：
为了确认LAG-3V2和LAG-3V3的表达并评价编码LAG-3 N-末端的整个5′序列的存在，用与LAG-3序列中跨越ATG起始密码子的核苷酸212-233退火的正向引物173(5′TATAGG ATCCG GTGCC CAGACC ATAGGA GAGATG3′)(SEQID NO：13)和反向引物V2R(5′GGCGTT CACGTGG TTGGGC ACCTGTGATGATT 3′)(SEQ ID NO：14)或V3R(5′TCACCT ACTCGA GAAAAG TGGGGGCCGAGAT3′)(SEQ ID NO：15)(图6)对活化PBMC的总RNA进行RT-PCR。由于引物V2R与LAG-3V2的剪接接头位点D3/TM退火，引物V3R与LAG-3V3中保留的内含子5的5′序列退火，所以应只发生这两个变体的扩增。
PCR进行时前两轮采用68℃的退火温度，其余28轮采用72℃的退火温度。在琼脂糖凝胶电泳后，发现了预计的1.10kb LAG-3V2和1.23kb LAG-3V3片段(图8)。扩增片段的DNA测序确认了LAG-3V2编码61kD跨膜蛋白(含有结构域D1、D2、D3)、跨膜结构域(TM)和细胞质结构域(CYT)，而LAG-3V3编码的52kD可溶性蛋白含有D1、D2和新的8个氨基酸的C端尾序列(图1)。
总之，目前已经发现四种LAG-3分子，两个与膜结合(野生型LAG-3和LAG-3V2)，两个是缺少跨膜序列的可溶性形式(LAG-3V1和LAG-3V3)。特异性T细胞亚组中的以及不同活化状态的LAG-3变体表达分析能为更好地了解LAG-3的功能提供有用的信息。
实施例III：
LAG-3V3蛋白的特征分析
Ficoll-泛影葡胺密度梯度离心供血单位提供的暗黄色(白细胞)层，获得人外周血单核细胞(PBMC)。PBMC从两个健康献血者获得。从上清液和梯度液间的界面处收集PBMC，用PBS洗涤三次，最后以2×106/毫升的浓度将细胞重悬于富含10％胎牛血清(FBS)、2毫摩尔L-谷氨酰胺、青霉素100IU/毫升和链霉素100微克/毫升的RPMI1640培养液中。然后加入植物凝集素(PHA)和重组人白细胞介素(IL-2)至最终浓度分别为1微克/毫升和100U/毫升。
将细胞37℃培育在5％CO2气氛下72和120小时。在培育时间的最后，将细胞悬浮液转移至50毫升聚丙烯试管中，并400g离心10分钟。收集上清液，立即-20℃冷冻。用Bradford方法用Coomassie Plus Protein试验(Pierce，Rockford，IL，USA)测定总蛋白。为了便于分析，使100微克样品真空离心完全干燥，重悬于10微升双蒸水(ddH2O)中，加入10微升样品缓冲液2x，100℃培育样品5分钟。然后将样品上样到8％聚丙烯酰胺Tris甘氨酸凝胶上进行SDS-PAGE分析，并在125伏恒压、变性和还原条件下进行。然后当染料前缘到达凝胶底部时停止电泳。
取下凝胶并在转移缓冲液中培育20分钟。使硝酸纤维素膜0.45μm在置于分开容器中的转移缓冲液中培育10分钟并轻微搅动。然后在75伏恒压下将凝胶上的蛋白电泳转移到膜上90分钟。当转移完成后，在室温下干燥膜，然后在1％(w/v)KOH中培育20分钟同时轻微搅动，用PBS洗涤4次5分钟。使膜在PonceauS溶液中染色5分钟，以显示蛋白和分子量标记，用PBS脱色4次。使膜和1％Mile(PBS配)/0.5％吐温一起4℃培育过夜，以封闭非特异性的结合位点。在除去封闭溶液后，膜用5微克/毫升稀释在封闭溶液中的抗LAG-3-单克隆抗体(mAb)印迹。室温下搅动培育1小时后，用PBS/0.5％吐温洗膜5次各10分钟，然后和偶联辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠多克隆抗体(1∶1000稀释于封闭溶液中)一起室温下搅动培育1小时。在培育最后，如上所述洗涤膜。
结果
然后用增强性化学发光(ECL)方法(Amersham Italia，Milan Italy)显示免疫印迹的蛋白。
图9的泳道1和3代表献血者1在分别培育72和120小时后获得的结果；而泳道2和4对应于献血者2，泳道5对应于作为负对照的类淋巴母细胞系RAJI。泳道1至5的起始蛋白浓度分别为3.1毫克/毫升；1.9毫克/毫升；2.8毫克/毫升；3.4毫克/毫升；3.4毫克/毫升。
表观分子量约为5.5kDa的条带与抗-LAG-3单克隆抗体反应。该表观分子量与根据mRNA序列推定的LAG-3变体3所预计的一致。该条带特异性地出现在PAH-母细胞中，而不存在于作为PHA-母细胞上清液(对照)的B淋巴母细胞系RAJI的上清中。
                                   序列表
(1)一般信息：
    (i)申请人：
        (A)姓名：Institut National de la Santéet de la
                 Recherche Médicale
        (B)街道：101 rue de Tolbiac
        (C)城市：Paris
        (E)国家：France
        (F)邮政编码(邮编)：75013
        (A)姓名：Institut Gustave Roussy
        (B)街道：39 rue Camille Desmoulins
        (C)城市：Villejuif
        (E)国家：France
        (F)邮政编码(邮编)：94805
        (G)电话：0142114211
        (H)电传：0142115300
(A)姓名：Applied Research Systems ARS Holding N.V
(B)街道：6 John R.Gorsiraweg PO Box 3889
(C)城市：CURACAO
(E)国家：The Dutch West Indies
    (ii)发明名称：Lag-3变体
    (iii)序列数目：15
    (iv)计算机可读形式：
        (A)记录介质类型：软盘
        (B)计算机：IBM PC兼容型
        (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
        (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)
(2)SEQ ID NO：1的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：2279碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (vi)来源：
        (A)生物体：智人
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
TCAGGCTGCC TGATCTGCCC AGCTTTCCAG CTTTCCTCTG GATTCCGGCC TCTGGTCATC      60
CCTCCCCACC CTCTCTCCAA GGCCCTCTCC TGGTCTCCCT TCTTCTAGAA CCCCTTCCTC     120
CACCTCCCTC TCTGCAGAAC TTCTCCTTTA CCCCCCACCC CCCACCACTG CCCCCTTTCC     180
TTTTCTGACC TCCTTTTGGA GGGCTCAGCG CTGCCCAGAC CATAGGAGAG ATGTGGGAGG     240
CTCAGTTCCT GGGCTTGCTG TTTCTGCAGC CGCTTTGGGT GGCTCCAGTG AAGCCTCTCC     300
AGCCAGGGGC TGAGGTCCCG GTGGTGTGGG CCCAGGAGGG GGCTCCTGCC CAGCTCCCCT     360
GCAGCCCCAC AATCCCCCTC CAGGATCTCA GCCTTCTGCG AAGAGCAGGG GTCACTTGGC     420
AGCATCAGCC AGACAGTGGC CCGCCCGCTG CCGCCCCCGG CCATCCCCTG GCCCCCGGCC     480
CTCACCCGGC GGCGCCCTCC TCCTGGGGGC CCAGGCCCCG CCGCTACACG GTGCTGAGCG     540
TGGGTCCCGG AGGCCTGCGC AGCGGGAGGC TGCCCCTGCA GCCCCGCGTC CAGCTGGATG     600
AGCGCGGCCG GCAGCGCGGG GACTTCTCGC TATGGCTGCG CCCAGCCCGG CGCGCGGACG     660
CCGGCGAGTA CCGCGCCGCG GTGCACCTCA GGGACCGCGC CCTCTCCTGC CGCCTCCGTC     720
TGCGCCTGGG CCAGGCCTCG ATGACTGCCA GCCCCCCAGG ATCTCTCAGA GCCTCCGACT     780
GGGTCATTTT GAACTGCTCC TTCAGCCGCC CTGACCGCCC AGCCTCTGTG CATTGGTTCC     840
GGAACCGGGG CCAGGGCCGA GTCCCTGTCC GGGAGTCCCC CCATCACCAC TTAGCGGAAA     900
GCTTCCTCTT CCTGCCCCAA GTCAGCCCCA TGGACTCTGG GCCCTGGGGC TGCATCCTCA     960
CCTACAGAGA TGGCTTCAAC GTCTCCATCA TGTATAACCT CACTGTTCTG GGTAACTCCC    1020
CCACTCTGCT TCACATTTGA CCACAACTCC TTCCTGCCCC CCTTGTCACC TCCCCTAACT    1080
ATGGGTCCCC AAACCAGGTT CTCGGCAGCG AGTGGCCTAC GTCATTGCTG TGGGTCTCAC    1140
TGTTCGACCC CTTTATATTG CTGGCAGCCT CACAGCTGCC ATCACCCCTT CTTGCTTCTC    1200
CCGTGGCCTT CCAGCGTCAT TGCCGGCCTT CCCTCTCCTT CCGACTAAGC CCACTTGCTG    1260
GGTTTCTGAG CCTCCTCAGC TCATCACCTT ATTCTGCTCC TTAGCACTCT TATGAGCCAG    1320
ACCATCTCCT GAATTCTTCT GCCTCCCTTC CTTGCAGCCC CAGCACTCCC TCCCCACTGC    1380
AGCACCCAGC TTTAACTTTG GGTTTTCTTT TCTCTTCAGG TCTGGAGCCC CCAACTCCCT    1440
TGACAGTGTA CGCTGGAGCA GGTTCCAGGG TGGGGCTGCC CTGCCGCCTG CCTGCTGGTG    1500
TGGGGACCCG GTCTTTCCTC ACTGCCAAGT GGACTCCTCC TGGGGGAGGC CCTGACCTCC    1560
TGGTGACTGG AGACAATGGC GACTTTACCC TTCGACTAGA GGATGTGAGC CAGGCCCAGG    1620
CTGGGACCTA CACCTGCCAT ATCCATCTGC AGGAACAGCA GCTCAATGCC ACTGTCACAT    1680
TGGCAATCAT CACAGTGACT CCCAAATCCT TTGGGTCACC TGGATCCCTG GGGAAGCTGC    1740
TTTGTGAGGT GACTCCAGTA TCTGGACAAG AACGCTTTGT GTGGAGCTCT CTGGACACCC    1800
CATCCCAGAG GAGTTTCTCA GGACCTTGGC TGGAGGCACA GGAGGCCCAG CTCCTTTCCC    1860
AGCCTTGGCA ATGCCAGCTG TACCAGGGGG AGAGGCTTCT TGGAGCAGCA GTGTACTTCA    1920
CAGAGCTGTC TAGCCCAGGT GCCCAACGCT CTGGGAGAGC CCCAGGTGCC CTCCCAGCAG    1980
GCCACCTCCT GCTGTTTCTC ACCCTTGGTG TCCTTTCTCT GCTCCTTTTG GTGACTGGAG    2040
CCTTTGGCTT TCACCTTTGG AGAAGACAGT GGCGACCAAG ACGATTTTCT GCCTTAGAGC    2100
AAGGGATTCA CCCTCGCAGG CTCAGAGCAA GATAGAGGAG CTGGAGCAAG AACCGGAGCC    2160
GGAGCCGGAG CCGGAACCGG AGCCCGAGCC CGAGCCCGAG CCGGAGCAGC TCTGACCTGG    2220
AGCTGAGGCA GCCAGCAGAT CTCAGCAGCC CAGTCCAAAT AAACGTCCTG TCTAGCAGC     2279
(2)SEQ ID NO：2的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：247氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)来源：
        (A)生物：智人
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala
1               5                   10                  15
Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser
            20                  25                  30
Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly
        35                  40                  45
Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro
    50                  55                  60
Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu
65                  70                  75                  80
Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro
                85                  90                  95
Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu
            100                 105                 110
Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala
        115                 120                 125
Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu
    130                 135                 140
Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser
145                 150                 155                 160
Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala
                165                 170                 175
Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg
            180                 185                 190
Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln
        195                 200                 205
Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg
    210                 215                 220
Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Asn
225                 230                 235                 240
Ser Pro Thr Leu Leu His Ile
                245
(2)SEQ ID NO：3的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：1629碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (vi)来源：
        (A)生物：智人
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
TCAGGCTGCC TGATCTGCCC AGCTTTCCAG CTTTCCTCTG GATTCCGGCC TCTGGTCATC     60
CCTCCCCACC CTCTCTCCAA GGCCCTCTCC TGGTCTCCCT TCTTCTAGAA CCCCTTCCTC    120
CACCTCCCTC TCTGCAGAAC TTCTCCTTTA CCCCCCACCC CCCACCACTG CCCCCTTTCC    180
TTTTCTGACC TCCTTTTGGA GGGCTCAGCG CTGCCCAGAC CATAGGAGAG ATGTGGGAGG    240
CTCAGTTCCT GGGCTTGCTG TTTCTGCAGC CGCTTTGGGT GGCTCCAGTG AAGCCTCTCC    300
AGCCAGGGGC TGAGGTCCCG GTGGTGTGGG CCCAGGAGGG GGCTCCTGCC CAGCTCCCCT    360
GCAGCCCCAC AATCCCCCTC CAGGATCTCA GCCTTCTGCG AAGAGCAGGG GTCACTTGGC    420
AGCATCAGCC AGACAGTGGC CCGCCCGCTG CCGCCCCCGG CCATCCCCTG GCCCCCGGCC    480
CTCACCCGGC GGCGCCCTCC TCCTGGGGGC CCAGGCCCCG CCGCTACACG GTGCTGAGCG    540
TGGGTCCCGG AGGCCTGCGC AGCGGGAGGC TGCCCCTGCA GCCCCGCGTC CAGCTGGATG    600
AGCGCGGCCG GCAGCGCGGG GACTTCTCGC TATGGCTGCG CCCAGCCCGG CGCGCGGACG    660
CCGGCGAGTA CCGCGCCGCG GTGCACCTCA GGGACCGCGC CCTCTCCTGC CGCCTCCGTC    720
TGCGCCTGGG CCAGGCCTCG ATGACTGCCA GCCCCCCAGG ATCTCTCAGA GCCTCCGACT    780
GGGTCATTTT GAACTGCTCC TTCAGCCGCC CTGACCGCCC AGCCTCTGTG CATTGGTTCC    840
GGAACCGGGG CCAGGGCCGA GTCCCTGTCC GGGAGTCCCC CCATCACCAC TTAGCGGAAA    900
GCTTCCTCTT CCTGCCCCAA GTCAGCCCCA TGGACTCTGG GCCCTGGGGC TGCATCCTCA    960
CCTACAGAGA TGGCTTCAAC GTCTCCATCA TGTATAACCT CACTGTTCTG GGTCTGGAGC    1020
CCCCAACTCC CTTGACAGTG TACGCTGGAG CAGGTTCCAG GGTGGGGCTG CCCTGCCGCC    1080
TGCCTGCTGG TGTGGGGACC CGGTCTTTCC TCACTGCCAA GTGGACTCCT CCTGGGGGAG    1140
GCCCTGACCT CCTGGTGACT GGAGACAATG GCGACTTTAC CCTTCGACTA GAGGATGTGA    1200
GCCAGGCCCA GGCTGGGACC TACACCTGCC ATATCCATCT GCAGGAACAG CAGCTCAATG    1260
CCACTGTCAC ATTGGCAATC ATCACAGGTG CCCAACGCTC TGGGAGAGCC CCAGGTGCCC    1320
TCCCAGCAGG CCACCTCCTG CTGTTTCTCA CCCTTGGTGT CCTTTCTCTG CTCCTTTTGG    1380
TGACTGGAGC CTTTGGCTTT CACCTTTGGA GAAGACAGTG GCGACCAAGA CGATTTTCTG    1440
CCTTAGAGCA AGGGATTCAC CCTCCGCAGG CTCAGAGCAA GATAGAGGAG CTGGAGCAAG    1500
AACCGGAGCC GGAGCCGGAG CCGGAACCGG AGCCCGAGCC CGAGCCCGAG CCGGAGCAGC    1560
TCTGACCTGG AGCTGAGGCA GCCAGCAGAT CTCAGCAGCC CAGTCCAAAT AAACGTCCTG    1620
TCTAGCAGC                                                            1629
(2)SEQ ID NO：4的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：422氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)来源：
        (A)生物：智人
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala
1               5                   10                  15
Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser
            20                  25                  30
Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly
        35                  40                  45
Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro
    50                  55                  60
Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu
65                  70                  75                  80
Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro
                85                  90                  95
Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu
            100                 105                 110
Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala
        115                 120                 125
Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu
    130                 135                 140
Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser
145                 150                 155                 160
Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala
                165                 170                 175
Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg
            180                 185                 190
Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln
        195                 200                 205
Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg
    210                 215                 220
Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu
225                 230                 235                 240
Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val
                245                 250                 255
Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu
            260                 265                 270
Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr
        275                 280                 285
Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala
    290                 295                 300
Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu
305                 310                 315                 320
Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr Gly Ala Gln Arg Ser Gly
                325                 330                 335
Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly His Leu Leu Leu Phe Leu Thr
            340                 345                 350
Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe
        355                 360                 365
His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu
    370                 375                 380
Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu
385                 390                 395                 400
Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu
                405                 410                 415
Pro Glu Pro Glu Gln Leu
            420
(2)SEQ ID NO：5的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：1468碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (vi)来源：
         (A)生物：智人
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
TCAGGCTGCC TGATCTGCCC AGCTTTCCAG CTTTCCTCTG GATTCCGGCC TCTGGTCATC     60
CCTCCCCACC CTCTCTCCAA GGCCCTCTCC TGGTCTCCCT TCTTCTAGAA CCCCTTCCTC    120
CACCTCCCTC TCTGCAGAAC TTCTCCTTTA CCCCCCACCC CCCACCACTG CCCCCTTTCC    180
TTTTCTGACC TCCTTTTGGA GGGCTCAGCG CTGCCCAGAC CATAGGAGAG ATGTGGGAGG    240
CTCAGTTCCT GGGCTTGCTG TTTCTGCAGC CGCTTTGGGT GGCTCCAGTG AAGCCTCTCC    300
AGCCAGGGGC TGAGGTCCCG GTGGTGTGGG CCCAGGAGGG GGCTCCTGCC CAGCTCCCCT     360
GCAGCCCCAC AATCCCCCTC CAGGATCTCA GCCTTCTGCG AAGAGCAGGG GTCACTTGGC     420
AGCATCAGCC AGACAGTGGC CCGCCCGCTG CCGCCCCCGG CCATCCCCTG GCCCCCGGCC     480
CTCACCCGGC GGCGCCCTCC TCCTGGGGGC CCAGGCCCCG CCGCTACACG GTGCTGAGCG     540
TGGGTCCCGG AGGCCTGCGC AGCGGGAGGC TGCCCCTGCA GCCCCGCGTC CAGCTGGATG     600
AGCGCGGCCG GCAGCGCGGG GACTTCTCGC TATGGCTGCG CCCAGCCCGG CGCGCGGACG     660
CCGGCGAGTA CCGCGCCGCG GTGCACCTCA GGGACCGCGC CCTCTCCTGC CGCCTCCGTC     720
TGCGCCTGGG CCAGGCCTCG ATGACTGCCA GCCCCCCAGG ATCTCTCAGA GCCTCCGACT     780
GGGTCATTTT GAACTGCTCC TTCAGCCGCC CTGACCGCCC AGCCTCTGTG CATTGGTTCC     840
GGAACCGGGG CCAGGGCCGA GTCCCTGTCC GGGAGTCCCC CCATCACCAC TTAGCGGAAA     900
GCTTCCTCTT CCTGCCCCAA GTCAGCCCCA TGGACTCTGG GCCCTGGGGC TGCATCCTCA     960
CCTACAGAGA TGGCTTCAAC GTCTCCATCA TGTATAACCT CACTGTTCTG GGTCTGGAGC    1020
CCCCAACTCC CTTGACAGTG TACGCTGGAG CAGGTTCCAG GGTGGGGCTG CCCTGCCGCC    1080
TGCCTGCTGG TGTGGGGACC CGGTCTTTCC TCACTGCCAA GTGGACTCCT CCTGGGGGAG    1140
GCCCTGACCT CCTGGTGACT GGAGACAATG GCGACTTTAC CCTTCGACTA GAGGATGTGA    1200
GCCAGGCCCA GGCTGGGACC TACACCTGCC ATATCCATCT GCAGGAACAG CAGCTCAATG    1260
CCACTGTCAC ATTGGCAATC ATCACAGGTC AGCCTCAGGT GGGAAAGGAG TAGCTGCCCT    1320
CCCAGGGTAG AAAGGACAGG GAGGAAGGGC TGGCAGGGCA AAGACTAGGC AAACCCACCC    1380
TGTGATGCCA GGCCACTGGG CACAAGTTCC AGAGCCTGCC CATCTCGGCC CCCACTTTTC    1440
TCACCCCCAT AATAAAGAAA CGAAACTG                                       1468
(2)SEQ ID NO：6的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：338氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)来源：
        (A)生物：智人
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala
1               5                   10                  15
Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser
            20                  25                  30
Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly
        35                  40                  45
Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro
    50                  55                  60
Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu
65                  70                  75                  80
Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro
                85                  90                  95
Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu
            100                 105                 110
Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala
        115                 120                 125
Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu
    130                 135                 140
Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser
145                 150                 155                 160
Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala
                165                 170                 175
Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg
            180                 185                 190
Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln
        195                 200                 205
Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg
    210                 215                 220
Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu
225                 230                 235                 240
Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val
                245                 250                 255
Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu
            260                 265                 270
Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr
        275                 280                 285
Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala
    290                 295                 300
Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu
305                 310                 315                 320
Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr Gly Gln Pro Gln Val Gly
                325                 330                 335
Lys Glu
(2)SEQ ID NO：7的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：29碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
TCTCTCAGAG CCTCCGATGG GTCATTTTG                                       29
(2)SEQ ID NO：8的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：30碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
TCCTGCAGAT GGATATGGCA GGTGTAGGTC                                    30
(2)SEQ ID NO：9的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：21碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
CCTGGGCCAG GCCTCGATGA C                                             21
(2)SEQ ID NO：10的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：20碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
CCCCACTCTG CTTCACATTT                                               20
(2)SEQ ID NO：11的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：37碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
GGCCCTGGAT CCGGACCTAA TTTTTTTTTT TTTTTTT                            37
(2)SEQ ID NO：12的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：20碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
GGCCCTGGAT CCGGACCTAA                                               20
(2)SEQ ID NO：13的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：34碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：13：
TATAGGATCC GGTGCCCAGA CCATAGGAGA GATG                               34
(2)SEQ ID NO：14的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：32碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：14：
GGCGTTCACG TGGTTGGGCA CCTGTGATGA TT                                    32
(2)SEQ ID NO：15的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：31碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：15：
TCACCTACTC GAGAAAAGTG GGGGCCGAGA T                                     31

Claims (8)

1.一种分离的核苷酸序列，它选自下列序列：
a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列；
b)遗传密码与a)所确定的核苷酸序列简并的核苷酸序列，该简并核苷酸序列所编码的多肽具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示的序列。
2.一种分离的核苷酸序列，所述序列是与核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：5完全互补的序列。
3.一种多肽，它选自LAG-3V1、LAG-3V2或LAG-3V3，LAG-3V1的序列是由SEQ ID NO：1编码的SEQ ID NO：2，LAG-3V2的序列是由SEQ ID NO：3编码的SEQ ID NO：4，LAG-3V3的序列是由SEQ ID NO：5编码的SEQ ID NO：6。
4.一种包含权利要求1或2所述的核苷酸序列的表达载体。
5.一种用权利要求4所述的表达载体转化的宿主细胞。
6.一种含有权利要求3所述的多肽作为活性组分的药物组合物。
7.权利要求3所述的多肽用于生产免疫调节化合物的应用。
8.权利要求3所述的多肽用于生产治疗免疫相关疾病用治疗性组合物的应用。
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