ES2227862T3 - Variantes de lag-3 obtenidas por corte y empalme. - Google Patents
Variantes de lag-3 obtenidas por corte y empalme.Info
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Abstract
Esta invención se refiere a una secuencia nucleotídica aislada, seleccionada del grupo constituido por: a) las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 5; b) las secuencias nucleotídicas que se hibridan en condiciones estrictas a cualquiera de las secuencias definidas en a) y que codifican para un polipéptido que es una variante de la molécula LAG-3; c) las secuencias nucleotídicas degeneradas como resultado del código genético para las secuencias nucleotídicas definidas en a) y b) y que codifican para un polipéptido que es una variante genética de una molécula LAG-3.
Description
Variantes de LAG-3 obtenidas por
corte y empalme.
La presente invención se refiere a la
identificación de variantes diferencialmente cortadas y empalmadas
de la molécula de LAG-3 y su uso como
inmunomoduladores.
En la actualidad está reconocido que las
proteínas codificadas por la región de Clase II de MHC están
involucradas en muchos aspectos del reconocimiento inmune, incluida
la interacción entre diferentes células linfoides como linfocitos y
células de presentación de antígenos. Diferentes observaciones han
mostrado también que otros mecanismos que no tienen lugar a través
de CD4 participan en la función efectora de los linfocitos T
helper.
El gen 3 de activación de linfocitos
(LAG-3) expresado en células T y NK activadas
humanas codifica una proteína de membrana de tipo I de 498
aminoácidos (aa) con cuatro dominios (1) de la superfamilia de las
inmunoglobulinas (IgSF). El análisis de esta secuencia puso de
manifiesto parches considerables de identidad con las extensiones de
unas secuencias de aa encontradas en la correspondientes posiciones
en CD4, aunque la homología global de secuencias de aa con CD4
humano está escasamente por encima del nivel de fondo
(aproximadamente 20% de identidad de secuencias). Hay también
algunas homologías de secuencias internas en la molécula de
LAG-3 entre los dominios 1 (D1) y 3 (D3) así como
entre los dominios y (D1) y 4 (D4) sugiriendo que el LAG3 se ha
desarrollado como CD4 por duplicación génica desde una estructura 2
IgSF previamente existente. Además, los genes LAG-3
y CD4 están colocados en una proximidad muy estrecha sobre la parte
distal del brazo corto del cromosoma 12 (2, B. Huard, P. Gaulard, F.
Faure, T. Hercend, F. Triebel, Immunogenetics 39, 213, 1994). Por lo
tanto, LAG-3 y CD4 pueden ser considerados como
"primos hermanos" evolutivos con el IgSF (2).
Usando un ensayo de adhesión celular
cuantitativo, los autores de la presente invención mostraron
previamente que la formación de rosetas entre células
Cos-7 transfectadas con lG-3 y
linfocitos B clase II^{+} era específicamente dependiente de la
interacción de la clase II de LAG3/MHC (3). Se observó también una
unión directa y específica de LAG-3 a diversas
moléculas de clase II humana (incluidos diferentes alelos e
isotipos), así como a moléculas de clase II murinas y de mono, con
una proteína de fusión LAG-3Ig (4). Esta globulina
recombinante LAG-3Ig dímera se une a residuos
monomórficos de clase II de MHC con una actividad mucho mayor (Kd =
60 nM a 37ºC) que la CD4Ig (5); LAG-3Ig es capaz de
hecho de bloquear la interacción de clase II de CD4/MHC en un ensayo
de adhesión
\hbox{intercelular (5).}
La función de la interacción de moléculas
LAG3/clase II ha sido investigada usando anticuerpos monoclonales
específicos de LAG-3 (mAb) (6) y moléculas de
LAG-3Ig (7). Esta interacción conduce a una baja
regulación de la activación de clones de células T. La interacción
de clase II de LAG-3/MHC productiva está mediada a
través de contactos de células T-T, presumiblemente
a través de una señalización negativa de la clase II de mHC en
células T. Globalmente, LAG-3 es expresada solamente
después de la activación de linfocitos tanto in vitro como
in vivo (6) y, por tanto, no desempeña ninguna función en la
fase de inducción de la respuesta, en contraste con CD4. Además,
experimentos de bloqueo de mAb han mostrado que
LAG-3 no participa en la fase de reconocimiento de
clones de células T CD4^{+} restringidas a clase II de MHC. Por
tanto, el papel funcional de LAG-3 es
sorprendentemente diferente del de los demás ligandos de MHC, CD4 y
CD8. Actualmente se cree que las moléculas de clase II de MHC de
células T tienen una función similar a CTLA-4 a
continuación de la unión a lAG-3 (4), es decir, la
inducción de la deleción clonal de células T previamente activadas
(8).
Más recientemente, se ha encontrado que
LAG-3 es preferentemente expresado y liberado por
medio de células Th1 activadas, es decir, células helper T que
producen IFN-\gamma y TNF, que está regulado al
alza por IL-12, una potente citoquina inductora de
Th1 (F. Annunziato, R. Manetti, L. Tomasévic, MG. Giudizi, R.
Biagiotti, V. Giannò, P. Germano, C. Mavilia, E. Maggi y S.
Romagnani, FASEB J. 10, 769-775, 1996). Se
encontraron también niveles elevados de LAG-3
soluble (sLAG-3) en el suero de pacientes con
esclerosis múltiple recurrente (MS) (ibidem) y de unos pocos
pacientes con lupus sistémico eritematoso (S. Romagnani, Clin.
Immunol. Immunopath. 80, 225-235, 1996). Estos
descubrimientos sugieren que LAG-3 podría
representar un marcador de diagnóstico útil para enfermedades
inmunes mediadas por Th1, como tiroiditis de Hashimoto, diabetes
mellitus de tipo I, esclerosis múltiple, enfermedad de Chron,
artritis reumatoide, rechazo agudo de aloinjertos y enfermedad aguda
de injerto frente a hospedante (GVHD). Por otra parte, la presencia
de niveles elevados de sLAG-3 en el suero de
pacientes de MS y posiblemente de otros pacientes que padezcan las
enfermedades anteriores, apoya una función protectora que se produce
de forma natural para sLAG-3, ya que podría competir
con la forma unida a membranas y, por tanto, bloquear las respuestas
inmunes mediadas por LAG-3.
Los autores de la presente invención han
investigado si son expresadas otras formas de LAG-3,
debidas a un corte y empalme alternativo del trascripto nuclear.
La mayoría de los genes codificadores de
proteínas eucarióticas contienen las secuencias presentes en el
correspondiente mRNA maduro en fragmentos discontinuos de DNA
(exones) intercalados entre secuencias (intrones) que no forman una
parte del mRNA maduro. Por tanto, los trascriptos primarios de estos
genes contienen las dos secuencias correspondientes a exones y
secuencias correspondientes a intrones. Las secuencias de intrones
son posteriormente cortadas mediante un procedimiento nuclear de
múltiples etapas, conocido como corte y empalme
pre-mRNA. A saber, los intrones son desmarcados por
medio de secuencias de consenso en sus contornos 5' (donante) y 3'
(aceptor). El procedimiento de partición comprende escindir en el
sitio aceptor con ligadura concomitante de los exones 5' y 3'.
En la mayoría de los casos, los exones presentes
en un gen están incorporados en mRNA maduro a través de una ligadura
invariable de pares consecutivos de sitios de partición donantes y
aceptores, proporcionado un único producto génico.
Sin embargo, en algunos casos, el mismo gen
contienen sitios de partición alternados que pueden conducir a
trascriptos diferentes. El mecanismo que regula esta partición
alternativa está escasamente comprendido, pero al menos para algunos
genes, es conocido que es específico para células y desarrollo.
El corte y empalme alternativo conduce a la
producción de múltiples isoformas de proteínas a partir de un único
gen. Es uno de los procedimientos responsables de generar la
diversidad de proteínas.
Actualmente se conoce que más de 50 genes generan
diversidad de proteínas mediante el uso de cortes y empalmes
alternativos. Este mecanismo es particularmente común y es elaborado
entre los genes de proteínas contráctiles.
Los autores de la presente invención han
descubierto tres nuevas variantes de LAG-E
diferencialmente cortadas y empalmadas, respectivamente denominadas
LAG-3V1, LAG-3V2 y
LAG-3V3.
LAG-3V1 codifica una proteína
soluble de 36 kD que contiene 8 nuevos residuos de aminoácidos
después del dominio D2, LAG-3V2 codifica una
proteína de transmembranas de 68 kD que no contiene el dominio D4, y
LAG-3V3 codifica una proteína de 52 kD soluble que
contiene 8 nuevos residuos de aminoácidos después del dominio
D3.
D3.
Estas variantes proporcionan nuevas
aproximaciones para estudiar tanto la regulación del gen
LAG-3 como la función biológica de la proteína, y
son útiles para la elaboración de nuevos compuestos
inmunomoduladores, especialmente compuestos que emulan la función
biológica de LAG-3 o que pueden actuar como
agonistas o antagonistas de la interacción entre
LAG-3 y las moléculas de clase II de MHC.
Por tanto, el objeto de la presente invención es
una secuencia de nucleótidos aislada seleccionada entre el grupo que
consiste en:
a) las secuencias de nucleótidos SEQ ID Nº 1, SEQ
ID Nº 3 o SEQ ID Nº 5;
b) las secuencias de nucleótidos que se hibridan
bajo condiciones restringidas a cualquiera de las secuencias
definidas en el apartado a) y que codifican un polipéptido que es
una variante de la de molécula de LAG-3;
c) las secuencias de nucleótidos que son
degeneradas como consecuencia del código genético para las
secuencias de nucleótidos definidas en los apartados a) y b), y que
codifican un polipéptido que es una variante genética de la molécula
de LAG-3.
La presente invención se dirige también a los
polipéptidos purificados, codificados por las secuencias de
nucleótidos anteriormente mencionadas. Dichos polipéptidos son
denominados en lo sucesivo "variantes de
LAG-3".
La presente invención se refiere también a
composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido de
variante de LAG-3. Estas composiciones son útiles
para tratar patologías asociadas al sistema inmune, en particular
enfermedades dependientes de Th1 como tiroiditis de Hashimoto,
diabetes mellitus de tipo I, esclerosis múltiple, enfermedad de
Chron, artritis reumatoide, rechazo agudo de aloinjertos, GVHD
aguda, oftalmopatía de Grave, malaria cerebral, artritis de Lyme,
artritis reactiva (inducida por Yersinia), hepatitis crónica
inducida por HCV, colangitis esclerosante primaria, dermatitis de
contacto, aborto recurrente inexplicado, anemia aplástica y artritis
gástrica inducida por Helicobacter pilori.
La presente invención se refiere también al uso
de las variantes de LAG-3 para la elaboración de
compuestos inmunomoduladores. Estos compuestos pueden emular o
alterar la función biológica de LAG-3 y variantes de
LAG-3, induciendo por lo tanto algunas
modificaciones de las interacciones celulares que incluyen la
participación de LAG-3 o sus variantes.
La presente invención se dirige también a
anticuerpos poli- o monoclonales, Fab, Fab' y F(ab')_{2} o
sus fragmentos de Fv, dirigidos a epitopos específicos que consisten
en 240-247 residuos de SEQ ID Nº 2 y
331-338 residuos de SEQ ID Nº 6. El uso de estos
anticuerpos específicos para purificar dichas variantes o para
preparar composiciones terapéuticas o de diagnóstico, así como las
composiciones resultantes, están también comprendidos dentro del
alcance de la presente invención.
La presente invención proporciona adicionalmente
un método terapéutico para tratar patologías asociadas al sistema
inmune, que comprende la administración a un paciente de una
variante de LAG-3 en una cantidad eficaz, o una
composición que comprenda dicha variante, como ingrediente
activo.
La invención se refiere también a un método
terapéutico para tratar patologías asociadas al sistema inmune, que
comprende la administración a un paciente de un anticuerpo
anti-variante de LAG-3 como se
definió anteriormente, o una composición terapéutica que comprende
dicho anticuerpo como ingrediente activo.
En una realización preferida, la invención se
dirige a una secuencia de nucleótidos aislada seleccionada entre el
grupo que consiste en SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 3, SEQ ID Nº 5 o sus
secuencias completamente complementarias.
La invención se refiere también a un polipéptido
purificado que resulta de la expresión de una de las secuencias de
nucleótidos de la invención. Preferentemente, el polipéptido es
seleccionado entre el grupo que consiste en LAG-3V1,
LAG-3V2 y LAG-3V3, respectivamente
codificados por las secuencias SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 3 y SEQ ID Nº
5 y correspondientes respectivamente a las secuencias SEQ ID Nº 2,
SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº 6.
Los polipéptidos según la invención pueden ser
obtenidos mediante cualquiera de los métodos estándar o purificación
de proteínas de membranas o solubles, mediante síntesis de péptidos
o mediante la aplicación de técnicas de ingeniería genética. Dichas
técnicas comprenden la inserción de una secuencia de nucleótidos que
codifique uno de los péptidos de la invención en un vector de
expresión, como un plásmido, y la transformación de células
hospedantes con este vector de expresión, mediante cualquiera de los
métodos disponibles por el experto en la técnica, como por ejemplo,
electroporación.
Ventajosamente, las secuencias de nucleótidos de
la invención son obtenidas por RT-PCR (reacción de
cadenas de transcriptasa inversa-polimerasa) del
correspondiente cDNA de la variante de LAG-3.
Brevemente, el RNA total es extraído de linfocitos activados de
sangre periférica humana (PBL), y es inversamente transcrito y
amplificado usando un par específico de cebadores de
oligonucleótidos. En el caso de la presente invención, los cebadores
consisten en un cebador de sentido y un cebador de antisentido que
están colocados en dos posiciones específicas en la secuencia de
LAG-3 que se describirá más en detalle en los
siguientes ejemplos. El cDNA resultante es seguidamente amplificado
por amplificación enzimática y puede ser subclonado en una célula
hospedante apropiada.
La presente invención se refiere también a
vectores de expresión que comprenden una secuencia de nucleótidos
que codifica un polipéptido según la invención y células hospedantes
transformadas con estos vectores.
Un "vector de expresión" se refiere a una
construcción de DNA replicable usada para amplificar o expresar DNA
que codifica uno de los polipéptidos de la invención.
Las células hospedantes pueden ser procarióticas
o eucarióticas, incluidas, pero sin limitación, bacterias,
levaduras, células de insectos, células de mamíferos, incluidas
líneas celulares que están disponibles en el comercio.
La presente invención se dirige también a
anticuerpos anti-variantes de LAG-3
o sus fragmentos, como se definió anteriormente. Opcionalmente,
estos anticuerpos o sus fragmentos pueden estar unidos a un marcador
(radioisótopo, colorante fluorescente, marcador enzimático, etc.) o
a una molécula terapéuticamente activa que es, por ejemplo, un
compuesto citotóxico.
Los anticuerpos policlonales pueden ser
preparados según métodos bien conocidos, como se describe por
BENEDICT A.A. et al. Los métodos de producción de los
anticuerpos monoclonales son bien conocidos a partir de la técnica
anterior, especialmente la descrita por KOHLER y MILSTEIN. Este
método, junto con sus variantes, está descrito por YELTON et
al.
Estos anticuerpos pueden ser usados en un método
para purificar un polipéptido según la invención, o para un método
de dosificación o identificación. Dicho método es, por ejemplo, pero
sin limitación, un método radio-inmunológico del
tipo RIA o IRMA, un método inmuno-enzimático, como
el método ELISA, o un método de inmunofluorescencia directo o
indirecto.
La invención incluye también el uso de dichos
anticuerpos para la elaboración de composiciones terapéuticas
capaces de bloquear la actividad de variantes de
LAG-3, es decir, que tengan actividades
inmunomoduladoras, como la inducción de la maduración,
diferenciación, proliferación y/o función de células que expresan
una variante de LAG-3, por ejemplo, células T y NK
activadas.
Los anticuerpos para variantes de
LAG-3 pueden ser usados como potenciadores de
vacunas o inmunoestimulantes en pacientes con supresión del sistema
inmune, como pacientes infectados con VIH o tratados con sustancias
inmunosupresoras.
Las composiciones terapéuticas según la presente
invención comprenden proteínas de variantes de LAG-3
o anticuerpos como se definieron anteriormente, así como un vehículo
farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden ser
formuladas según las técnicas habituales. El vehículo puede variar
de forma según la vía de administración escogida: oral, parenteral,
sublingual, rectal o nasal.
Para las composiciones para una administración
parenteral, el vehículo comprenderá generalmente aguas esterilizada
así como otros posibles ingredientes que favorezcan la solubilidad
de la composición o su capacidad para ser almacenada. La vía de
administración parenteral puede consistir en inyecciones
intravenosas, intramusculares o subcutáneas.
La composición terapéutica puede ser del tipo de
liberación sostenida, en particular para tratamientos a largo plazo,
por ejemplo, en enfermedades autoinmunes. La dosis que vaya a ser
administrada depende del sujeto que vaya a ser tratado, en
particular de la capacidad de su sistema inmune para conseguir el
grado deseado de protección. Las cantidades precisas de ingrediente
activo que va a ser administrado pueden ser fácilmente determinadas
por el facultativo que inicie el tratamiento.
Las composiciones terapéuticas según la invención
pueden comprender, además de variantes de LAG-3
solubles o los anticuerpos según la invención, otro ingrediente
activo, cuando sea apropiado, unido a través de un enlace químico a
la variante de LAG-3 o a un anticuerpo según la
invención. Como ejemplo, pueden ser mencionadas las proteínas de
variantes de LAG-3 solubles mencionadas según la
invención fusionadas a una toxina, por ejemplo, ricino o anatoxina
de difteria, capaz de unirse a moléculas de clase II de MCH y de
destruir las células dianas, por ejemplo, células leucémicas o de
melanomas, o fusionadas a un radioisótopo.
Los ejemplos que siguen, junto con las figuras de
referencia anejas, ilustrarán la invención más en detalle.
- La Fig. 1 representa la estructura esquemática
de LEG-3 de tipo salvaje (wt) y sus variantes V1, V2
y V3. LAG-3V1 deriva de la retención del intrón 4,
es decir, no se produce la escisión en los sitios de donantes y
aceptores que flanquean el intrón 4. Un codón de detención dentro
del marco situado después de 8 codones en el intrón 4 retenido
conduce a una proteína de LAG-3V1 soluble truncada,
que contiene D1, D2 y 8 residuos de aminoácidos nuevos.
LAG-3V2 carece del exón 6, debido
a la ligadura del sitio donante del intrón 5 al sitio aceptor en el
intrón 6. Como no se produce ningún desplazamiento del marco de
lectura, la proteína de LAG-3V2 resultante es una
proteína de transmembrana que no contiene el dominio D4.
LAG-3V3 deriva de la escisión del
trascripto nuclear en un sitio de poliadenilación diferente colocado
\sim170 pb (pares de bases) aguas abajo del extremo 5' del intrón
5. La secuencia del intrón 5 retenido contiene un codón de detención
en el marco. El mRNA codifica una proteína soluble truncada que
contiene D1, D2, D3 y 8 nuevos residuos de aminoácidos.
- La Fig. 2 es una representación esquemática de
la organización de intrón/exón del gen LAG-3. Los
acontecimientos de corte y empalme que resultan en la generación de
trascriptos de RNA cual codifican wtLAG-3,
LAG-3V1, LAG-3V2 o
LAG-3V3 están indicados por líneas de puntos.
SP: péptido señal; D1-D4:
dominios 1-4 de IgSF; TM: secuencia de
transmembrana; CYT: dominio citoplásmico; I1-19:
intrón 1-9.
Los nuevos exones en LAG-3V1 y
LAG-3V3 se muestran como recuadros oscurecidos.
- La Fig. 3 es una representación esquemática de
wtLAG-3 y LAG-3V1. La situación de
los cebadores y sondas usados para el aislamiento de
LAG-3V1 está indicada mediante flechas. Los
fragmentos de DNA amplificados usando los cebadores específicos
están mostrados por líneas sencillas. El tamaño de los fragmentos
obtenidos mediante RT-PCR está indicado.
- La Fig. 4 muestra un análisis de
transferencia Southern de fragmentos de cDNA de
wtLAG-3 y LAG-3V1 amplificados por
RT-PCR con cebadores F459 y R460.
a) Gel teñido con bromuro de etidio. b)
Transferencia hibridada con una sonda de cDNA específica para
LAG-3. La banda inferior deriva de
wtLAG-3 mientras que la superior, evidente solo
después de la hibridación, deriva de LAG-3V1.
- La Fig. 5 muestra un análisis por transferencia
Southern de fragmentos de cDNA de LAG-3V1
amplificados por RT-PCR con cebadores F176 y R460.
a) Gel teñido con bromuro de etidio. La banda principal deriva de
wtLAG-3. b) Transferencia hibridada con la
oligosonda 14 específica del intrón 4 de LAG-3. La
banda superior deriva de LAG-3V1 mientras que la
inferior es un heteroduplex de
wtLAG-3/LAG-3V1.
- La Fig. 6 es una representación esquemática de
wtLAG-3, LAG-3V2 y
LAG-3V3. La situación de los cebadores y sondas
usados para el aislamiento de LAG-3V2 y
LAG-3V3 está indicada mediante flechas. Los
fragmentos de DNA amplificados usando los cebadores específicos
están mostrados por medio de líneas sencillas. El tamaño de los
fragmentos obtenidos mediante RT-PCR está
indicado.
- La Fig. 7 muestra un análisis por transferencia
Southern de fragmentos de cDNA de wtLAG-3,
LAG-3V2 y LAG-3V3 amplificados por
RT-PCR con cebadores F176 y R401.
a) Gel teñido con bromuro de etidio. b)
Transferencia hibridada con la oligosonda F459 específica para
LAG-3D2. La banda superior deriva de
wtLAG-3 mientras que las bandas de 780 y 940 pb
derivan de LAG-3V2 y LAG-3V3,
respectivamente.
- La Fig. 8 muestra el modelo de electroforesis
sobre gel de agarosa de productos de RT-PCR
obtenidos con cebadores específicos para LAG-3V2 y
LAG-3V3, es decir, 173/V2R y 173/V3R,
respectivamente.
- La Fig. 9 muestra los modelos de transferencia
Western de extracciones de PHA con
anti-LAG-3 en mAbs.
Se aislaron PMBM mediante centrifugación por
gradiente de densidad Ficoll-Hypaque y se activaron
con 1 \mug/ml de PHA y 100 U/ml de IL-2 durante 48
h a 37ºC, 5% CO_{2}. Se extrajo mRNA por medio del estuche de
ensayo de mRNA Oligotex Direct (Ouiagen Inc., Chatsworth, CA,
EE.UU.) y fue sometido a transcripción inversa con un cebador
oligo(dT), usando un primer estuche de ensayo de síntesis de
cadenas (RT-PCR kit, Stratagen, La Jolla, CA,
EE.UU.).
La amplificación de cDNA se realizó con una
polimerasa 2.5 U Taq y 100 mg de cada uno de cebador directo F459
(5' TCTCTCAGAGCCTCCGATGGGTCATTTTG 3') (SEQ ID Nº 7) cebador inverso
R460 (5' TCCTGCAGATGGATATGGCAGGTGTAGGTC 3') (SEQ ID Nº 8) que se
reasocian a los nucleótidos 762-791 y
1217-1246 de la secuencia de LAG-3,
respectivamente (Fig. 3). Se realizaron treinta ciclos de PCR, y
cada ciclo incluía una desnaturalización a 94ºC durante 1 minutos,
reasociación a 66ºC durante 1 minutos y extensión a 72ºC durante 2
minutos.
Una parte alícuota de 10 \mul del DNA
amplificado fue fraccionada en un gel de agarosa al 2%. Fue
observado el fragmento de LAG-3 de 485 pb esperado
(Fig. 4a). Después de hacer una transferencia sobre un filtro de
membrana de nitrocelulosa y de una hibridación con una sonda de cDNA
específico de LAG-3D1D2 marcado con P^{32}
obtenida por PCR, además de la banda de 485 pb, se encontró una
banda de \sim890 pb. El fragmento de 890 pb fue nuevamente
amplificado,clonado y secuenciado.
El fragmento de 890 pb fue clonado en el vector
pCR®II (Promega) y el inserto fue secuenciado usando el estuche de
ensayo "ABI Prism Dye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction" (Perkin-Elmer) y el secuenciador de DNA
automatizado mod. 373A (Perkin-Elmer). Los
resultados indican que este fragmento es de 892 pb de longitud y
deriva de una variante de LAG-3 que retiene el
intrón 4 (Fig. 2). Debido a la presencia de un codón de detención en
el marco en el intrón 4, esta variante, denominada
LAG-3V1, está previsto que codifique una proteína de
36 kD soluble que contiene los dominios D1, D2 y 8 residuos de
aminoácidos C-terminales (Fig. 1).
Para confirmar que el fragmento de
LAG-3V1 deriva de mRNA y no de DNA genómico, se
realizó un segundo experimento pr RT-PCR usando el
cebador directo F176 (5' CCTGGGCCAGGCCTCGA TGAC 3') (SEQ ID Nº 9)
que se reasocia a los nucleótidos 725-745 de la
secuencia de LAG-3, y el cebador inverso R460 (Fig.
3). El cebador F176 que extiende el sitio de unión de corte y
empalme D1/D2 no debe permitir la amplificación de DNA genómico de
LAG-3.
Tras una electroforesis sobre gel de agarosa de
los productos de PCR, se observó la banda esperada de
wtLAG-3 de \sim520 pb (Fig. 5a). Una transferencia
Southern con la oligosonda I4 específica para el intrón 4 de
LAG-3 (5' CCCCACTCTGCTTCACATTT 3') (SEQ ID Nº 10)
mostró la banda de LAG-3V1 de 930 pb esperada y una
banda de \sim800 pb adicional (Fig. 5b). Los dos fragmentos fueron
reamplificados y secuenciados. La banda superior se confirmó que
correspondía a LAG-3V1, mientras que la inferior era
un heteroduplex de
wtLAG/3-LAG-3V1.
Fueron aisladas PBMC por centrifugación por
gradiente de densidad Ficoll-Hypaque y se activaron
con 1 \mug/ml de pHA y 100 U/ml de IL-2 durante 48
h a 37ºC, 5% CO_{2}.
Se extrajo RNA total por medio de reactivo TriZol
(GIBCO-BRL). El RNA total (5 \mug) fue sometido a
transcripción inversa usando la mezcla de cebadores oligo(dT)
de anclaje AT17A, AT17C y AT17G (5'
GGCCCTGGATCCGGACCTAA(T)_{17} (SEQ ID Nº 1) seguida
de A, C o G) (Fig. 6) que permite obtener moléculas de cDNA con
extremos 3' homogéneos y un anclaje para una posterior PCR.
Se realizó una reacción de transcriptasa inversa
(RT) en un volumen final de 50 \mul de 1 x tampón RT, DTT 10 mM,
dNTP 1 mM, 40 U de inhibidor de RNasa (Boehringer) y 400 U de
Superscript II RT (GIBCO-BRL) a 37ºC durante 90
minutos. La reacción de RT fue detenida a 90ºC durante 5 minutos. El
RNA fue digerido con 1 U de RNasa (Boehringer) a 37ºC durante 30
minutos.
Se realizó una PCR con el cebador F176 directo y
el cebador R401 inverso (5' GGCCCTGGATCCGGACCTAA 3') (SEQ ID Nº 12)
que se reasocia al anclaje 3' de Cdna (Fig. 6). Los cebadores F176 y
R401 deben permitir amplificar todas las variantes de corte y
empalme de LAG-3 que contengan la unión D1D2 hasta
la cola de poli(A).
Se realizó una PCR sobre 0,5 \mul de
equivalente de cDNA hasta 0,5 \mug de RNA total en 100 \mul de
volumen final que contenían 1 x tampón Taq, 2,5 U de
DNA-polimerasa Taq (Advanced Biotechnologies),
MgCl_{2} 1,5 mM, dNTP 200 \muM, 10% de DMSO y 50 pmoles de cada
uno de los cebadores F176 y R401. Se usaron una técnica de comienzo
en caliente y 30 ciclos de PCR (96ºC durante 30 segundos, 65ºC
durante 30 segundos, 72ºC durante 4 minutos). Se usó RNA sin RT como
testigo negativo en el experimento de PCR.
Los productos de RT-PCR (10
\mul) fueron fraccionados por electroforesis sobre gel de agarosa
y sometidos a transferencia en membrana de nilón Hybond N+
(Amersham). La transferencia fue hibridada con la oligosonda F459
específica para LAG-3D2 marcada con DIG (Fig. 6) en
2X SSC, 0,02% de SDS, 0,5% de reactivo de bloqueo (Boehringer), 0,1%
de N-laurilsarcosina a 55ºC durante 30 minutos.
La transferencia fue lavada dos veces con 2x SSC
y 0,1% de SDS a 55ºC. Se relación una detección híbrida con
anticuerpos anti-DIG conjugados con HRP (Boehringer)
y reactivos ECL (Amersham).
Los resultados mostraron que además del
fragmento de wtLAG-3 de 1,12 kb, estaban presentes
dos bandas menores de aproximadamente 940 y 780 pb tanto en el gel
teñido con bromuro de etidio (Fig. 7a) como en la transferencia
Southern (Fig. 7b).
Los fragmentos de PCR de 940 y 780 pb fueron
aislados a partir de gel de agarosa, reamplificados con cebadores
F176/R401 y directamente secuenciados. Los resultados mostraron que
el fragmento de 780 pb deriva de una omisión en el marco del exón 6
de LAG-3 (Fig. 2). Esta variante, denominada
LAG-3V2, está previsto que codifique una proteína de
transmembrana de 61 kD que no contiene el dominio D4 (Fig. 1).
El secuenciado del fragmento de 940 pb mostró que
deriva de la escisión del trascripto nuclear en un sitio de
poliadenilación diferente situado \sim170 pb aguas abajo del
extremo 5' el intrón 5 (Fig. 2). La secuencia del intrón 5 retenido
contiene un codón de detención en el marco. El mRNA resultante
codifica una variante de LAG-3 soluble de 52 kD,
denominada LAG-3V3, que contiene los dominios D1, D2
y D3, seguida de 3 residuos de aminoácidos nuevos (Fig. 1). Tanto
LAG-3V2 como LAG-3V3 mantienen los 4
sitios de glicosilación de wtLAG-3.
Para confirmar la expresión de
LAG-3V2 y LAG-3V3 y para valorar la
presencia de la secuencia en 5' completa que codifica el
LAG-3 N-terminal, se realizó una
RT-PCR sobre RNA total de PMBC activadas con el
cebador directo 173 (5' TATAGGATCCGGTGCCCAG ACCATAGGAGAGATG 3') (SEQ
ID Nº 13) que se reasocia a los nucleótidos 212-233
de una secuencia de LAG-3 que extiende el codón de
comienzo de ATG, y los cebadores inversos V2R
(5'GGCGTTCACGTGGTTGGGCACCTGTGATGATT 3') (SEQ ID N DEG 14) o V3R
(5'TCACCTACTCGAGAAAAGTGGGGGCCGAGAT 3') (SEQ ID N DEG 15) (Fig. 6).
Como el cebador V2R se reasocia al sitio de omisión de la unión
D3/TM de LAG-3V2 y el cebador V3R se reasocia a la
secuencia en 5' del intrón 5 retenido en LAG-3V3,
solo se produciría la amplificación de estas dos variantes.
Se realizó una PCR con una temperatura de
reasociación de 68ºC para los dos primeros ciclos y 72ºC para los 28
ciclos restantes. Tras una electroforesis sobre gel de agarosa,
fueron encontrados los fragmentos esperados de
LAG-3V2 de 1,10 Kb y LAG-3V3 de 1,23
Kb. El secuenciado de DNA de los fragmentos amplificados confirmó
que LAG-3V2 codifica una proteína de transmembrana
de 61 kD que contiene los dominios D1, D2 y D3, el dominio de
transmembrana (TM) y el dominio citoplásmico (CYT), mientras que
LAG-3V3 codifica una proteína insoluble de 52 kD que
contiene D1, D2 y una cola en C de 8 nuevos aa (Fig. 1).
En conclusión, en la actualidad han sido
descubiertas cuatro moléculas de LAG-3, dos unidas a
membrana (wtLAG-3 y LAG-3V2) y dos
formas solubles que carecen de la secuencia de transmembrana
(LAG-3V1 y LAG-3V3). El análisis de
la expresión de la variante de LAG-3 en subconjuntos
de células T específicas y en diferentes estados de activación
pueden proporcionar una información útil para una mejor comprensión
de la función de LAG-3.
Se obtuvieron células mononucleares de sangre
periférica humana (PBMC) por centrifugación sobre gradiente de
densidad de ficoll-diatriazoato a partir de células
mononucleares de cultivo de unidades de donantes de sangre. Las PBMC
fueron obtenidas de dos donantes sanos. Las PBMC recogidas de la
superficie interfacial entre la materia sobrenadante y el gradiente
fueron lavadas tres veces en PBS y finalmente se volvieron a poner
en suspensión a la concentración de 2\cdot10^{6} células/ml en
medio de cultivo RPMI 1640 enriquecido con 10% de suero bovino fetal
(FBS) al 10%, L-glutamina 2 mM, 100 IU/ml de
penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina. Seguidamente se
añadieron fitohemaglutinina (PHA) e interleucina recombinante
(IL-2) a una concentración final de 1 \mug/ml y
100 U/ml, respectivamente.
Las células fueron incubadas a 37ºC en atmósfera
con 5% de CO_{2} durante 72 y 120 horas. Al final de los tiempos
de incubación, las suspensiones celulares fueron transferidas a
tubos de polipropileno de 50 ml y centrifugadas a 400 g durante 10
minutos. Las materias sobrenadantes fueron recogidas e
inmediatamente congeladas a -20ºC. La determinación de proteínas
totales se llevó a cabo mediante el método de Bradford, usando el
ensayo de proteínas Coomassie Plus (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.).
Para un análisis, 100 \mug de muestras fueron completamente
secadas bajo centrifugación a vacío, se volvieron a poner en
suspensión en 10 \mul de agua bi-destilada
(ddH_{2}O), se añadieron 10 \mul de tampón por muestra dos veces
y las muestras fueron incubadas 5 minutos a 100ºC.
Las muestras fueron seguidamente introducidas en
geles de poliacrilamida-Tris-glicina
para un análisis SDS-PAGE y y se realizó bajo
condiciones desnaturalizantes y reductoras a 125 voltios constantes.
El experimento fue detenido cuando el frente de colorante alcanzó el
fondo del gel.
El gel fue retirado e incubado durante 20 minutos
en tampón de transferencia. Una membrana de nitrocelulosa de 0,45
\mum fue incubada durante 10 minutos en tampón de transferencia en
un recipiente separado con agitación suave. Las proteínas en el gel
fueron seguidamente transferidas por vía electroforética a la
membrana durante 90 minutos a 75 voltios constantes. Cuando la
transferencia se completó, la membrana fue secada a temperatura
ambiente y seguidamente incubada durante 20 minutos en KOH al 1%
(p/v) con agitación suave y se lavó 4 veces con PBS durante 5
minutos. La membrana fue teñida 5 minutos en solución Ponceau S para
mostrar proteínas y marcadores del peso molecular y desteñida 4
veces con PBS. Los sitios de unión no específica fueron bloqueados
incubando la membrana durante una noche a 4ºC con Mile al 1% en
PBS/Tween al 0,5%. Después de eliminar la solución de bloqueo, la
membrana fue sometida a transferencia con anticuerpo monoclonal
anti-LAG-3 (mAb) 2H6 diluido a 5
\mug/ml de solución de bloqueo. Después de una hora de incubación
a temperatura ambiente con agitación, la membrana fue lavada 5 veces
con PBS/0,5% Tween durante 10 minutos cada vez y seguidamente fue
incubada durante una hora a temperatura ambiente con agitación con
anticuerpos policlonales anti-ratón de cabra
conjugados con peroxidasa de rabanillo (HRP) diluida 1:1000 en
solución de bloqueo. Al final de la incubación, la membrana fue
lavada como se describió anteriormente.
Las proteínas sometidas a inmunotransferencia
fueron seguidamente reveladas usando un método quimioluminiscente
mejorado (ECL) (Amersham Italia, Milan, Italia).
Las columnas 1 y 3 de la figura 9 representan los
resultados obtenidos para el donante 1, respectivamente después de
72 y 120 oras de incubación; mientras que las columnas 2 y 4
corresponden al donante 2 y la columna 5 a la línea celular
linfoblastoide RAJI como testigo negativo. Las concentraciones de
proteínas de partida fueron respectivamente 3,1 mg/ml; 1,9 mg/ml;
2,8 mg/ml; 3,4 mg/ml; 3,4 mg/ml de la columna 1 a la columna 5.
Una banda con un peso molecular aparente de
aproximadamente 5,5 kDa reaccionó con
anti-LAG-3 mAb. Este peso molecular
aparente está en congruencia con el esperado para la variante 3 de
LAG-3 putativa basada en la secuencia de mRNA. Esta
banda aparece específicamente en PHA-blastos y no
está presente en la materia sobrenadante de la línea celular
linfoblástica B RAJI, tratada como las materias sobrenadantes de
PHA-blastos.
- (i)
- SOLICITANTES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 101 rue de Tolbiac
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: París
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 75013
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Institut Gustave Roussy
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 19 rue Camille Desmoulins
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Villejuif
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 94805
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Applied Research Systems ARS Hoding N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 6 John R. Gorsiraweg PO Box 3889
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Curacao
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: The Dutch West Indies
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Variantes de LAG-3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 15
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/M-DOS
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2279 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 247 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1629 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 422 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1458 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 338 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 6:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTCTCAGAG CCTCCGATGG GTCATTTTG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCTGCAGAT GGATATGGCA GGTGTAGGTC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTGGGCCAG GCCTCGATGA C
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCACTCTG CTTCACATTT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCCCTGGAT CCGGACCTAA TTTTTTTTTT TTTTTTT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCCCTGGAT CCGGACCTAA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATAGGATCC GGTGCCCAGA CCATAGGAGA GATG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGTTCACG TGGTTGGGCA CCTGTGATGA TT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
TCACCTACTC GAGAAAAGTG GGGGCCGAGA T
Claims (12)
1. Una secuencia de nucleótidos aislada,
seleccionada entre el grupo que consiste en:
a) las secuencias de nucleótidos SEQ ID Nº 1, SEQ
ID Nº 3 o SEQ ID Nº 5;
b) las secuencias de nucleótidos que se hibridan
bajo condiciones restringidas a cualquiera de las secuencias
definidas en el apartado a) y que codifican un polipéptido que es
una variante de la molécula de LAG-3, y se
seleccionan entre el grupo que consiste en SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 4
y SEQ ID Nº 6;
c) las secuencias de nucleótidos que son
degeneradas como consecuencia del código genético para las
secuencias de nucleótidos definidas en los apartados a) y b), y que
codifican un polipéptido que es una variante genética de la molécula
de LAG-3 y se seleccionan entre el grupo que
consiste en SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº 6.
2. Una secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 1, seleccionada entre el grupo que consiste en las
secuencias de nucleótidos SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 3, y SEQ ID Nº 5 o
las secuencias completamente complementarias de las mismas.
3. Un polipéptido, seleccionado entre el grupo
que consiste en LAG-3V1, LAG-3V2 y
LAG-3V3, que tiene una secuencia seleccionada entre
el grupo que consiste en SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 4, y SEQ ID Nº 6,
respectivamente codificadas por SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 3 o SEQ ID Nº
5.
4. Un vector de expresión, que comprende una
secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 ó 2.
5. Una célula hospedante, transformada con un
vector de expresión según la reivindicación 4.
6. Una composición farmacéutica, que comprende
como ingrediente activo un polipéptido según la reivindicación
3.
7. El uso de un polipéptido según la
reivindicación 3, para la elaboración de una composición terapéutica
para tratar patologías asociadas al sistema inmune.
8. Anticuerpos dirigidos a epitopos que consisten
en los residuos 240-247 de la SEQ ID Nº 2 y los
residuos 331-338 de la SEQ ID Nº 6.
9. Anticuerpos según la reivindicación 8, en los
que dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales o Fab, Fab',
F(ab') o fragmentos de Fv de los mismos.
10. El uso de anticuerpos según la reivindicación
8 ó 9, en un método para purificar, dosificar o identificar un
polipéptido según la reivindicación 3.
11. El uso de anticuerpos según la reivindicación
8 ó 9, para la elaboración de una composición terapéutica para
tratar patologías asociadas al sistema inmune.
12. Una composición terapéutica, que comprende
como ingrediente activo un anticuerpo según la reivindicación 8 ó
9.
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