ES2296829T3 - Imaginologia, diagnostico y tratamiento de la enfermedad. - Google Patents

Abstract

Uso de un compuesto que incluye (i) un anticuerpo que une selectivamente el polipéptido humano ECSM4 y (ii) una unidad fácilmente detectable, donde dicho ECSM4 humano es un polipéptido que existe de manera natural, que incluye una porción de 50 residuos aminoacídicos consecutivos de la secuencia polipeptídica de las Figuras 4 ó 5, o variantes naturales de la misma, en la fabricación de un agente para la imagenología de la vasculatura del cuerpo de un individuo.

Description

Imaginología, diagnóstico y tratamiento de la enfermedad.

La presente invención se refiere a genes cuya expresión es selectiva para el endotelio y al uso de estos genes o productos génicos, o moléculas que se unen a los mismos, en la imaginología, diagnóstico y tratamiento de enfermedades que involucran el endotelio vascular.

El endotelio desempeña un papel esencial en muchos procesos fisiológicos y patológicos y se sabe que se trata de un sitio de transcripción excepcionalmente activo. Aproximadamente 1000 genes diferentes se expresan en una célula endotelial. En contraste, se encontró que los glóbulos rojos expresan 8, las plaquetas 22 y el músculo liso 127 genes diferentes (Adams et al, 1995). Algunos genes endoteliales específicos conocidos atraen mucha atención tanto por parte de la investigación básica, como por parte de la comunidad clínica. Por ejemplo, las tirosina quinasas específicas endoteliales Tie, TIE2/TEK, KDR y flt1 desempeñan papeles cruciales en la regulación de la integridad vascular, los procesos inflamatorios mediados por el endotelio y en la angiogénesis (Sato et al, 1993, Sato et al, 1995, Fong et al, 1995, Shalaby et al, 1995, Alello et al, 1995). Se reconoce ampliamente a la angiogénesis en la actualidad como un proceso que limita el crecimiento de tumores sólidos. También se encuentra involucrado en la formación de las placas de ateroesclerosis y restenosis. Por último, el endotelio desempeña un papel esencial en el complejo y dinámico sistema que regula la coagulación y la hemostasis.

De los muchos genes diferentes que se expresan en una célula endotelial, no todos son completamente selectivos de las células endoteliales, de modo que los genes y sus productos, y las moléculas que se unen a ellos por lo general no resultan útiles para las imágenes, el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades. Por tanto, existe aún la necesidad de encontrar moléculas específicas o selectivas de las células endoteliales.

En este documento reportamos la identificación de dos genes endoteliales altamente selectivos a los que hemos llamado: molécula 1 específica de células endoteliales (ECSM1) y glorieta mágica (molécula 4 específica de células endoteliales; ECSM4), aunque la presente invención se relaciona, únicamente, con ECSM4. El término ECSM4 se emplea para indicar, como lo dejará claro el contexto, el ADNc y los polipéptidos codificados por el gen. ECSM4 es sorprendentemente específico en su perfil de expresión celular, y muestra una selectividad por las células endoteliales que es similar a la de el marcador aceptado actualmente en la técnica como el mejor marcador de células endoteliales (Factor von Willibrand). Obviamente, un grado tan elevado de especificidad por las células endoteliales es tan inédito como inesperado.

El clon de ADNc de la glorieta mágica humana (ECSM4), con una ORF de más de 417 aa (Número de Acceso de GenBank AK000805) y descrito en WO 99/46281 como una secuencia de 3716 nucleótidos se identificó mediante búsquedas de BLAST contra el contig 111518. Esta secuencia es rica en prolinas y presenta varias regiones de baja complejidad aminoacídica. La búsqueda de BLAST contra PRODOM (base de datos de familias de proteínas en HGMP, UK) identificó una región de 120 pb con homología con el dominio citoplasmático conservado de la familia de receptores de transmembrana involucrados en la guía repulsiva del axón (familia de proteínas ROBO1 DUTT1, E=4e-07). La homología se extendió a 468 aa (E=1,3e-09) cuando se llevó a cabo un análisis más riguroso empleando ssearch (Smith y Waterman, 1981), pero la región de similitud seguía contenida aun en el dominio citoplasmático. La familia ROBO1 DUTT1 incluye el homólogo 1 de la glorieta humana (ROBO1), el gen de ratón DUTT1 y el gen de rata ROBO1 (Kidd et al, 1998, Brose et al, 1999). Debido a esta región de homología llamamos al gen representado por Hs. 111518 "glorieta mágica" (ECSM4). Además el BLAST SBASE (base de datos de dominios de proteínas en HGMP) sugirió una región de similitud con el dominio largo del precursor de la molécula intracelular de adhesión de células neurales (E=2e-11). Debe resaltarse que el verdadero producto proteico de la glorieta mágica es probablemente más largo que los 417 aa codificados por el clon AK000805, dado que aparentemente la ORF no tiene un límite upstream (sentido hacia arriba), y la comparación de tamaño con la glorieta humana 1 (1651 aa) sugiere que se trata de una proteína mucho mayor. Esto está confirmado por la Figura 3, que muestra que el producto de traducción del gen ECSM4 de humanos tiene alrededor de 118 kDa. Sin embargo, ECSM4 es más pequeña que otros miembros de la familia de las glorietas, con los que comparte sólo dos de los cinco dominios Ig y dos de los tres dominios de tipo fibronectina en la región extracelular. La probable región intracelular rica en prolina que es homóloga a las de las glorietas que se piensa que se unan a c-abl. La Figura 12 muestra la secuencia aminoacídica completa de la ECSM4 humana (1105 aa), y la secuencia del homólogo de ratón se muestra en la Figura 13. En WO 99/11293 y WO 99/53051 se presentan secuencias nucleotídicas codificantes, que muestran alrededor de 99% de identidad con la secuencia nucleotídica de ECSM4 dada en la Figura 12.

En EP 1 074 617, WO 00/53756, WO 99/46281, WO 01/23523 y WO 99/11293 se presentan otras secuencias que muestran homología con la secuencia polipéptidica o nucleotídica de ECSM4. Sin embargo, ninguna de estas publicaciones revela que estas secuencias se expresen de manera selectiva en el endotelio vascular, ni sugieren tampoco que puedan ser expresadas de esa forma.

Recientemente se han descubierto asociaciones interesantes entre los genes de la diferenciación neuronal y los de las células endoteliales. Por ejemplo, se identificó un receptor neuronal para el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) neuropilin 1 (Soker et al, 1998). La creencia tradicional era que VEGF era un factor de crecimiento exclusivo del endotelio. Procesos similares a la guía de los axones neuronales se implican ahora en la guía de la migración de las células endoteliales durante la angiogénesis y el crecimiento de los capilares. Por tanto, los ligandos efrinB y los receptores de EphB están involucrados en la demarcación de los dominios arterial y venoso (Adams et al, 1999). Es posible que la glorieta mágica (ECSM4) sea un homólogo específico del endotelio de la glorieta humana 1 involucrada en la guía repulsiva de las células endoteliales, presumiblemente con un ligando diferente, dado que la similitud está confinada a la región citoplasmática, o sea, efectora y se sabe que los receptores de guía poseen una arquitectura altamente modular (Barshaw y Goodman, 1999).

Sin embargo, hasta el momento no ha habido ninguna mención a la existencia de una contraparte endotelial, ni a que el patrón de expresión del gen de la glorieta mágica (ECSM4) se encuentre restringido a las células endoteliales, en especial a las células endoteliales angiogénicas, ni a ninguna función del polipéptido codificado por dicho gen.

Debe señalarse que un resultado sorprendente de nuestro análisis de RT-PCR, descrito en el Ejemplo 1 fue que ECSM4 aparentemente muestra una especificidad para el endotelio (Fig. 1) comparable con el marcador endotelial clásico factor de von Willebrand (vWF). La expresión de genes conocidos específicos del endotelio usualmente no se encuentra 100% restringida a la célula endotelial. Los datos presentados en este documento muestran el muy inesperado hallazgo de que ECSM4 no se expresa a niveles detectables (al menos mediante el empleo de los métodos descritos en los ejemplos) en tipos celulares distintos de las células endoteliales, dado que la selectividad de los marcadores conocidos de las células endoteliales es inferior al 100%. El análisis de protección con ribonucleasa confirmó y extendió esta observación (Figura 14a). Se observó que la expresión de ECSM4 se restringía al endotelio (tres aislamientos diferentes) y se encontraba ausente de los fibroblastos, las células de carcinoma y las neuronas. KDR y FLT1 se expresan en el tracto reproductivo masculino y femenino: en las células espermatogénicas (Obermair et al, 1999), trofoblastos y en la decidua (Clark et al, 1996). Se ha mostrado que KDR define a las células tronco hematopoiéticas (Ziegler et al, 1999). FLT1 también se encuentra presente en monocitos. Además de las células endoteliales vWF tiene una fuerte presencia en megacariocitos (Sporn et al, 1985, Nichols et al, 1985) y, por consecuencia, está presente en las plaquetas. Del mismo modo, la multimerina se encuentra presente tanto en las células endoteliales (Hayward et al, 1993), como en las plaquetas (Hayward et al, 1998).

Hablando de manera general, las células endotelilaes y las células hematopoiéticas descienden de los mismos precursores embrionarios: los hemangioblastos, y estos dos linajes celulares comparten muchos marcadores celulares (para una revisión ver Suda et al, 2000). Por tanto, el hallazgo de que ECSM4 no se expresa en células que no sean las del endotelio vascular es muy sorprendente.

La determinación de los genes cuya expresión es selectiva para el endotelio vascular permite un direccionamiento selectivo hacia estas células y, por tanto, la entrega específica de moléculas para la imaginología, el diagnóstico, el pronóstico, el tratamiento, la prevención y la evaluación de terapias para las enfermedades asociadas al crecimiento vascular normal o aberrante.

La presente invención se encamina al método y los usos definidos en las reivindicaciones 1 a 29 anexas. Los compuestos que pueden emplearse en los métodos y usos de la presente invención incluyen un compuesto que comprende (i) un anticuerpo que se une selectivamente al polipéptido ECSM4 y (ii) otra unidad.

En el término "polipéptido ECSM4" incluimos cualquier polipéptido que ocurra de manera natural y que contiene una porción de 50 residuos de aminoácidos consecutivos, o variantes naturales del mismo, con la secuencia polipéptidica dada en las Figuras 4 ó 5.

De preferencia el anticuerpo y la otra unidad se encuentran unidos de manera covalente.

En el término "variantes naturales" incluimos, por ejemplo, variantes alélicas. Por lo regular, estas se diferenciarán de la secuencia dada en solo uno, dos o tres y, por lo regular, no más de 10 ó 20 residuos aminoacídicos. Por lo regular, las variantes poseen sustituciones conservativas.

De preferencia, un anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4 es el que se une de manera selectiva a un polipéptido con la secuencia GGDSLLGGRGSL, LLQPPARGHAHDGQALSTDL, EPQDYTEPVE, TAPGGQGAPWAEE o ERATQEPSEHGP, o una secuencia localizada en la porción extracelular de ECSM4. Como se describe en más detalle más adelante, estas secuencias representan secuencias aminoacídicas que solo se encuentran en el ECSM4 humano y que no se encuentran en la secuencia polipéptidica de ECSM4 de ratón.

De preferencia, el anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4 es el que se une a un polipéptido cuya secuencia aminoacídica contiene la secuencia dada en cualquiera de las Figuras 4, 5 ó 12 o una variante natural de la misma, pero no se une al polipéptido representado por ninguna de las SEC. ID. No 18085 de EP 1 074 617, SEC ID No 211 de WO 00/53756 o W099146281, SEC ID Nos 24-27, 29, 30, 33, 34, 38 o 39 de WO 01/23523, o SEC ID No 86 de WO 99/11293, o codificado por ninguna de las secuencias nucleotídicas representadas por la SEC. ID No 18084 o 5096 de EP 1 074 617, SEC ID No 210 de WO 00 53756 o WO 99/46281, o SEC ID Nos 22, 23, 96 o 98 de WO 01/23523 y SEC ID No 31 de WO 99/11293.

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En el término "anticuerpo" incluimos no solo moléculas de inmunoglobulina completas, sino también fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')2, Fv y otros fragmentos de las mismas que mantienen el sitio de unión al antígeno. De manera similar, el término "anticuerpo" incluye derivados modificados genéticamente de anticuerpos, tales como moléculas Fv de cadena simple (scFv) y dominios de anticuerpos (dAbs). El término incluye también moléculas de tipo anticuerpo que pueden producirse mediante técnicas de phage-display u otras técnicas de selección aleatoria de moléculas que se unen a ECSM4.

Los dominios variable pesado (V_{H}) y variable ligero (V_{L}) de los anticuerpos están involucrados en el reconocimiento del antígeno, un hecho que fue reconocido por primera vez por experimentos tempranos de digestión mediante proteasas. Una confirmación posterior se obtuvo mediante la "humanización" de anticuerpos de roedores. Los dominios variables de los roedores pueden fusionarse a los dominios constantes de origen humano, de manera que el anticuerpo resultante mantiene la especificidad antigénica del anticuerpo de roedor original (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855).

El hecho de que la especificidad antigénica la confieren los dominios variables, y es independiente de los dominios constantes es conocido a partir de experimentos que involucran la expresión en bacterias de fragmentos de anticuerpos, todos conteniendo uno o más dominios variables. Estas moléculas incluyen a las moléculas de tipo Fab (Better et al (1988) Science 240, 1041); las moléculas de tipo Fv (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); moléculas Fv de simple cadena (ScFv) en las que los dominios V_{H} y V_{L} correspondientes se encuentran unidos por medio de un oligopéptido flexible (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) y los anticuerpos de un único dominio (dAbs), que contienen dominios V aislados (Ward et al (1989) Nature 341, 544). Una revisión general de las técnicas involucradas en la síntesis de fragmentos de anticuerpos que mantienen sus sitios de unión específicos puede encontrarse en Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.

Por "moléculas ScFv" entendemos moléculas en las que los dominios V_{H} y V_{L} correspondientes se encuentran unidos por medio de un oligopéptido flexible.

Las ventajas del empleo de fragmentos de anticuerpos, en lugar de anticuerpos completos son de varios niveles. El tamaño menor de los fragmentos puede conducir a propiedades farmacológicas mejoradas, tales como una mejor penetración al sitio blanco. Se eliminan las funciones efectoras de los anticuerpos enteros, tales como la unión al complemento. Los fragmentos Fab, Fv, ScFv y dAb pueden expresarse y secretarse en E. coli permitiendo, de ese modo, la fácil producción de grandes cantidades de dichos fragmentos.

Los anticuerpos enteros y los fragmentos F(ab')_{2} son "bivalentes". Por "bivalentes" entendemos que dichos anticuerpos y fragmentos F(ab')_{2} tienen dos sitios de combinación con el antígeno. Por el contrario, los fragmentos Fab, Fv, ScFv y dAb son monovalentes, al poseer un único sitio de combinación al antígeno.

Aunque el anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, se prefiere utilizar un anticuerpo monoclonal. En algunas circunstancias, en particular si el anticuerpo va a ser administrado de manera repetida a un paciente humano, se prefiere que el anticuerpo monoclonal sea un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal humanizado.

Anticuerpos monoclonales adecuados, que son reactivos como tales pueden prepararse mediante el empleo de técnicas conocidas, por ejemplo, las presentadas en "Monoclonal Antibodies; A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application", SGR Hurrell (CRC Press, 1982). Pueden producirse anticuerpos policlonales que sean poliespecíficos o monoespecíficos. Se prefiere que sean monoespecíficos.

Los anticuerpos quiméricos se discuten en Neuberger et al (1998, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799).

Anticuerpos no humanos preparados de manera adecuada pueden "humanizarse" por métodos conocidos, por ejemplo, mediante la inserción de las regiones CDR de anticuerpos de ratón en el marco de anticuerpos humanos.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanos en el sentido de que poseen la secuencia aminoacídica de anticuerpos humanos anti ECMS4, pero pueden prepararse empleando métodos conocidos en la técnica que no requieren la inmunización de humanos. Por ejemplo, están disponibles ratones trangénicos que contienen, en esencia, genes de inmunoglobulinas humanos (see Vaughan et al (1998) Nature Biotechnol. 16, 535-539).

La unidad adicional puede ser cualquier unidad que confiera al compuesto una propiedad útil con respecto al tratamiento o la imagen o el diagnóstico de enfermedades u otros padecimientos o estados que involucren una formación indeseable de nueva vasculatura. Tales enfermedades u otros padecimientos o estados se describen a continuación con mayor detalle. En particular, la unidad adicional es alguna que resulta útil en la eliminación o imaginología de nueva vasculatura asociada con el crecimiento de un tumor. De preferencia, la unidad adicional es alguna que es capaz de matar las células endoteliales a las que se dirige el compuesto.

En una realización preferida de la invención, la unidad adicional es citotóxica de manera directa o indirecta. En particular, la unidad adicional es, de preferencia, tóxica de manera directa o indirecta sobre células de la nueva vasculatura o células que se hallan en la vecindad cercana de, y asociadas a la nueva vasculatura.

En el término "directamente citotóxica" incluimos el sentido de que la unidad es alguna que resulta, por sí misma, citotóxica. En el término "indirectamente citotóxica" incluimos el sentido de que al unidad es alguna que, aunque no es en sí misma citotóxica, puede inducir citotoxicidad, por ejemplo, a través de su acción sobre alguna otra molécula o mediante otra acción sobre la misma.

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En una realización, la unidad citotóxica es un agente citotóxico quimioterapéutico. Son bien conocidos en la técnica los agentes citotóxicos quimioterapéuticos.

Los agentes citotóxicos quimioterapéuticos, tales como los agentes anticancerígenos incluyen: agentes alquilantes incluidos los derivados del nitrógeno, como la mecloroetamina (NH_{2}), la ciclofosfamida, la ifosfamida, el melfalan (L-sarcolisina) y el clorambucil; las etilenaminas y metilenaminas, tales como la hexametilmelamina, el tioepta; los alquilsulfonatos, tales como el busulfan; las nitrosureas, tales como la camustina (BCNU), la lomustina (CCNU), la semustina (metil-CCNU) y la estreptozocina (estreptozocina); y los triazenos, tales como la decarbazina (DTIC; dimetiltriazenoimidazol-carboxamida); los antimetabolitos, incluyendo los análogos del ácido fólico, tales como el metotrexato (ametopterina); los análogos de la pirimidina, tales como el fluorouracilo (5-fluorouracilo; 5-FU), la floxuridina (fluorodesoxiuridina; FUdR) y la citarabina (arabinósido de citosina); y los análogos de purinas e inhibidores relacionados, tales como la mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP), la tioguanina (6-tioguanina; TG) y la pentostatina (2'-desoxicoformicina). Los productos naturales incluyendo los alcaloides vinca, tales como la vinblastina (VLB) y la vincristina; las epipodofilotoxinas, tales como el etopósido y el tenipósido; los antibióticos, tales como la dactinomicina (actinomicina D), la daunorrubicina (daunomicina; rubidomicina), doxorrubicina, bleomicina, plicamicina (mitramicina) y mitomicina (mitomicina C); enzimas, tales como la L-asparaginasa; y modificadores de la respuesta biológica, tales como alfenomas de interferón. Agentes variados, incluyendo los complejos de coordinación de platino, tales como el cisplatin (cis-DDP) y el carboplatin; la antracenediona, tal como la mitoxantrona y la antraciclina; ureas sustituidas, tales como la hidroxiurea; derivados de la metil hidracina, tales como la procarbacina (N-metilhidracina, MIH); y supresores adrenocorticales, tales como el mitotano (o,p'-DDD) y la aminoglutetimida; el taxol y análogos/derivados; y agonistas/antagonistas de hormonas, tales como la flutamida y el tamoxifeno.

Varios de estos agentes han sido unidos con anterioridad a anticuerpos y otros agentes de liberación dirigida a blancos, de manera que compuestos de la invención que incluyan dichos agentes pueden prepararse con facilidad por parte de personas versadas en la técnica. Por ejemplo, puede emplearse la conjugación por carbodiimida (Bauminger & Wilchek (1980) Methods Enzymol. 70, 151-159) para conjugar una gama de agentes, incluyendo la doxorrubicina, a anticuerpos o péptidos.

Las carbodiimidas incluyen un grupo de compuestos que poseen la fórmula general R-N=C=N-R', donde R y R' pueden ser alifáticos o aromáticos, y se emplean para la síntesis de enlaces peptídicos. El procedimiento preparativo es simple, relativamente rápido y puede llevarse a cabo bajo condiciones suaves. Los compuestos de tipo carbodiimida atacan a los grupos carboxílicos para convertirlos en sitios reactivos para los grupos amino libres.

La carbodiimida soluble en agua, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) es particularmente útil para la conjugación de una unidad funcional a una unidad de unión y puede usarse para conjugar doxorrubicina a péptidos que aparecen en tumores. La conjugación de la doxorrubicina y una unidad de unión requiere la presencia de un grupo amino, que es proporcionado por la doxorrubicina, y un grupo carboxilo, que es proporcionado por la unidad de unión, tal como un anticuerpo o un péptido.

Además del uso de las carbodiimidas para la formación directa de enlaces peptídicos, la EDC puede emplearse también para preparar ésteres activos, tales como éster N-hidroxisuccinimida (NHS). El éster NHS, que se une solo a grupos amino, puede emplearse a su vez para inducir la formación de un enlace amida con el único grupo amino de la doxorrubicina. Se emplea con frecuencia el uso combinado de EDC y NHS para la conjugación, con el objetivo de incrementar el rendimiento en la formación del conjugado (Bauminger & Wilchek, supra, 1980).

También se pueden emplear otros métodos para conjugar una unidad funcional a un anticuerpo. Por ejemplo, puede emplearse la oxidación con peryodato de sodio, seguida por alquilación reductiva de reactivos apropiados, así como el entrecruzamiento con glutaraldehído. Sin embargo, se reconoce que, cualquiera sea el método de producción de un conjugado de la invención que se seleccione, debe tomarse la determinación de que el anticuerpo mantenga su capacidad de direccionamiento y que la unidad funcional mantenga su función relevante.

En otra realización, la unidad citotóxica es un péptido citotóxico o una unidad polipeptídica, en la que incluimos cualquier unidad que conduzca a la muerte celular. Se conocen bien en la técnica péptidos citotóxicos y unidades polipeptídicas e incluyen, por ejemplo, la ricina y la abrina, la exotoxina de Pseudomonas, el factor tisular, y similares. También se conocen en la técnica métodos para unirlos a los anticuerpos. El uso de ricina como agente citotóxico se describe en Burrows & Thorpe (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8996-9000; y el uso de factor tisular, que conduce a la coagulación localizada de la sangre y al infarto del tumor se ha descrito en Ran et al (1998) Cancer Res. 58, 4646-4653 and Huang et al (1997) Science 275, 547-550. Tsai et al (1995) Dis. Colon Rectum 38, 1067-1074 describe la cadena A de la abrina, conjugada con un anticuerpo monoclonal. Otras proteínas inactivadotas de ribosomas se describen como agentes citotóxicos en WO 96/06641. La exotoxina de Pseudomonas puede usarse también como unidad polipeptídica citotóxica (ver, por ejemplo, Aiello et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10457-10461)

Algunas citoquinas, tales como TNF\alpha e IL-2, pueden también ser útiles como agentes citotóxicos.

Algunos átomos radiactivos pueden también ser citotóxicos si se les suministra en dosis suficientes. Por tanto, la unidad citotóxica puede incluir un átomo radiactivo que, al usarse, libere una cantidad suficiente de radiactividad al sitio blanco, como par ser citotóxico. Átomos radiactivos adecuados incluyen el fósforo 32, el yodo 125, yodo 131, indio 111, renio 186, renio 188 o ytrio 90, o cualquier otro isótopo que emita suficiente energía para destruir las células, organelos o ácidos nucleico vecinos. De preferencia, los isótopos y la densidad de los átomos radiactivos en el compuesto de la invención son tales que una dosis de más de 4000 cGy (de preferencia al menos 6000, 8000 ó 10000 cGy) se suministre al sitio blanco, de preferencia, a las células en el sitio blanco y sus organelos, en particular, el núcleo.

El átomo radiactivo puede unirse al anticuerpo de maneras conocidas. Por ejemplo, se puede unir EDTA u otro agente quelante a la unidad de unión y usarse para unir 111In o 90Y. Los residuos de tirosina pueden marcarse con ^{125}I o ^{131}I.

La unidad citotóxica puede ser un polipéptido indirectamente citotóxico adecuado. En una realización preferida, el polipéptido indirectamente citotóxico es un polipéptido que posee actividad enzimática y puede convertir una prodroga relativamente no tóxica en una droga citotóxica. Cuando la unidad direccionadora es un anticuerpo, este tipo de sistema se denomina con frecuencia ADEPT (Terapia de enzima direccionada por anticuerpo sobre prodroga). El sistema requiere que la unidad direccionadora localice la porción enzimática al sitio deseado del cuerpo del paciente (o sea, el sitio que expresa ECSM4, tal como la nueva vasculación asociada con un tumor) y luego de permitir cierto tiempo para que la enzima se localice en el sitio, administrar una prodroga que es el sustrato de la enzima, el producto final de cuya catálisis es un compuesto citotóxico. El objeto de esta estrategia es maximizar la concentración de droga en el sitio deseado y minimizar la concentración de droga en tejidos normales (ver Senter, P.D. et al (1988) "Antitumor effects of antibody-alkaline phosphatase conjugates in combination with etoposide phosphate" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4842-4846; Bagshawe (1987) Br. J. Cancer 56, 531-2; y Bagshawe, K.D. et al (1988) "A cytotoxic agent can be generated selectively at cancer sites" Br. J. Cancer. 58, 700-703.)

La enzima y la prodroga del sistema que emplea una enzima direccionada a ECSM4 como se describe aquí puede ser cualquiera de las propuestas anteriormente. La sustancia citotóxica puede ser cualquier droga anticancerígeno existente, tal como un agente alquilante; un agente que se intercala en el ADN; un agente que inhibe cualquier enzima clave, tal como la dihidrofolato reductasa, la timidina sintetasa, la ribonucleótido reductasa, la nucleósido quinasa o la topoisomerasa; o un agente que provoca la muerte celular mediante su interacción con cualquier otro constituyente celular. El etopósido es un ejemplo de un inhibidor de la topoisomerasa.

Sistemas de prodrogas reportados incluyen: una prodroga de gas de fenol activada por una \beta-glucuronidasa de E. coli (Wang et al, 1992 and Roffler et al, 1991); una prodroga de doxorrubicina activada por una \beta-glucuronidasa humana (Bosslet et al, 1994); otras prodrogas de doxorrubicina activadas por \alpha-galactosidasa de semilla de café (Azoulay et al, 1995); las prodrogas de daunorrubicina activadas por \alpha-D-galactosidasa de semilla de café (Gesson et al, 1994); una prodroga de 5-fluorouridina activada por una \beta-D-galactosidasa (Abraham et al, 1994); y prodrogas de metotrexato (p.e. metotrexato-alanina) activadas por carboxipeptidasa A (Kuefner et al, 1990, Vitols et al, 1992 and Vitols et al, 1995). Estas y otras se incluyen en la siguiente tabla.

1

(Esta tabla está adaptada de Bagshawe (1995) Drug Dev. Res. 34, 220-230, de donde pueden obtenerse referencias completas para estos diferentes sistemas; el derivado de taxol se describe en M.L. et al (1995) Chemistry & Biology 2, 223).

Las enzimas adecuadas para formar parte de la porción enzimática incluyen: exopeptidasas, tales como carboxipeptidasas G, G1, y G2 (para las mostazas de prodrogas glutamiladas), carboxipeptidasas A y B (para prodrogas basadas en MTX) y aminopeptidasas (para prodrogas de 2-\alpha-aminoacil MTC); endopeptidasas, tales como, p.e., trombolisina (para prodrogas de trombina); hidrolasas, tales como fosfatasas (p.e., fosfatasa alcalina) o sulfatasas (p.e., aril sulfatasas) (para prodrogas fosforiladas o sulfatadas); amidasas, tales como amidasas de penicilina y arilacil amidasa; lactamasas, tales como \beta-lactamasas; glicosidasas, como \beta-glucuronidasa (para antraciclinas \beta-glucuronómido), \alpha-galactosidasa (para amigdalina) y \beta-galactosidasa (para antraciclina \beta-galactosa); deaminasas, tales como citosina deaminasa (para 5FC); quinasas, tales como uroquinasa y timidina quinasa (para ganciclovir); reductasas, tales como nitrorreductasa (para CB1954 y análogos), azorreductasa (para mostazas de azobenceno) y DT-diaforasa (para CB1954); oxidasas, tales como glucosa oxidasa (para glucosa), xantina oxidasa (para xantina) y lactoperoxidasa; DL-racemasas, anticuerpos catalíticos y ciclodextrinas.

La prodroga es relativamente no tóxica, en comparación con la droga citotóxica. Por lo regular, tiene menos de 10% de la toxicidad, de preferencia, menos de 1% de la toxicidad, según el resultado de la medida en una prueba adecuada de citotoxicidad in vitro.

Es probable que la unidad capaz de convertir una prodroga en una droga citotóxica sea activa en aislamiento del resto del compuesto, pero solo es necesario que sea activa cuando (a) se encuentra en combinación con el resto del compuesto y (b) el compuesto está unido a, adyacente a, o internalizado en las células blanco.

Cuando la otra unidad del compuesto es un polipéptido, el anticuerpo y la otra unidad pueden estar unidas entre sí mediante cualquiera de los medios convencionales de entrecruzamiento de polipéptidos, tales como los que se describen de manera general en O'Sullivan et al (1979) Anal. Biochem. 100, 100-108. Por ejemplo, el anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4 puede estar enriquecido con grupos tiol y la otra unidad puede reaccionar con un agente bifuncional capaz de reaccionar con dichos grupos tiol, por ejemplo, el éster de ácido iodoacético de la N-hidrosuccinimida (NHIA) o N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato (SP-DP). Los enlaces amida y tioéster, por ejemplo, conseguidos mediante éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida son, por lo general, más estables in vivo que los puentes disulfuro.

De manera alternativa, el compuesto puede producirse como un compuesto de fusión, mediante técnicas de ADN recombinante, en las cuales, un segmento de ADN contiene las regiones respectivas que codifican para el anticuerpo y la otra unidad, ya sea adyacentes una de otra, o separadas por una región que codifica para un polipéptido de unión que no destruye las propiedades del compuesto. Concebiblemente, las dos porciones del compuesto pueden sobrelaparse total o parcialmente.

El ADN, a continuación, se expresa en un hospedero adecuado para producir un polipéptido que contiene el compuesto de la invención.

La unidad citotóxica puede ser un radiosensibilizador. Los radiosensibilizadores incluyen las fluoropirimidinas, los análogos de timidina, la hidroxiurea, la gencitabina, la fludarabina, la nicotinamida, las pirimidinas halogenadas, la 3-aminobenzamida, la 3-aminobenzodiamida, el etanixadol, el pimonidazol y el misonidazol (ver, por ejemplo, McGinn et al (1996) J. Natl. Cancer Inst. 88, 1193-11203; Shewach & Lawrence (1996) Invest. New Drugs 14, 257-263; Horsman (1995) Acta Oncol. 34, 571-587; Shenoy & Singh (1992) Clin. Invest. 10, 533-551; Mitchell et al (1989) Int. J. Radiat. Biol. 56, 827-836; Iliakis & Kurtzman (1989) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 1235-1241; Brown (1989) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 987-993; Brown (1985) Cancer 55, 2222-2228).

También, la entrega de genes a las células puede radiosensibilizarlas, por ejemplo, la insernción del gen de p53 o la ciclina D (Lang et al (1998) J. Neurosurg. 89, 125-132; Coco Martin et al (1999) Cancer Res. 59, 1134-1140).

La otra unidad puede ser una que se convierta en citotóxica, o libere una unidad citotóxica, bajo irradiación. Por ejemplo, el isótopo de boro 10, cuando se le irradia adecuadamente, libera partículas \alpha que son citotóxicas (ver, por ejemplo, US 4.348. 376 a Goldenberg; Primus et al (1996) Bioconjug. Chem. 7, 532-535).

De manera similar, la unidad citotóxica puede ser una que sea útil en la terapia fotodinámica, tal como la fotofrina (ver, por ejemplo, Dougherty et al (1998) J. Natl. Cancer Inst. 90, 889-905).

La otra unidad puede contener una molécula de ácido nucleico que sea directa o indirectamente citotóxica. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede ser un oligonucleótido antisentido que, al ser localizado en el sitio blanco sea capaz de penetrar a las células y provocarles la muerte. El oligonucleótido, por tanto, puede ser uno de los que evita la expresión de un gen esencial, o uno que conduzca a un cambio en la expresión génica que provoque apoptosis.

Ejemplos de oligonucleótidos adecuados incluyen los dirigidos a bcl-2 (Ziegler et al (1997) J. Natl. Cancer Inst. 89, 1027-1036), y ADN polimerasa a y topoisomerase II\alpha (Lee et al (1996) Anticancer Res. 16, 1805-1811.

Los ácidos nucleicos de péptidos pueden resultar útiles en lugar de los ácidos nucleicos convencionales (ver Knudsen & Nielsen (1997) Anticancer Drugs 8, 113-118).

En otra realización, el anticuerpo puede estar contenido en un vehículo de entrega, para la entrega del ácido nucleico al blanco. El vehículo de entrega puede ser cualquier vehículo de entrega apropiado. Puede, por ejemplo, ser un liposoma que contenga ácido nucleico, o puede ser un virus o una partícula similar a un virus que sea capaz de entregar un ácido nucleico. En estos casos, el anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4 está presente, por lo regular, en la superficie del vehículo de entrega. Por ejemplo, el anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4, tal como un fragmento adecuado de anticuerpo, puede estar presente en la superficie externa de un liposoma y el ácido nucleico a ser entregado puede estar presente en el interior del liposoma. Como otro ejemplo, un vector viral, tal como un vector retroviral o adenoviral, se construye, de manera que el anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4 se encuentra unido a o se localiza en, la superficie de la partícula, lo que permite que la partícula viral sea direccionada al sitio deseado. También se conocen sistemas de entrega direccionada como los sistemas de adenovirus modificados, descritos en WO 94/10323 en los que, por lo regular, el ADN es portado por la partícula adenoviral o de tipo adenoviral. Michael et al (1995) Gene Therapy 2, 660-668 describen una modificación de los adenovirus para añadir una unidad selectiva de células a una fibra proteica. También se encuentran disponibles retrovirus diseccionados para el uso en la invención; por ejemplo, secuencias que confieren afinidades de unión específicas pueden construirse dentro de genes env virales preexistentes (ver Miller & Vile (1995) Faseb J. 9, 190-199 para una revisión de este y otros vectores diseccionados para la terapia génica).

Inmunoliposomas (liposomas direccionados por anticuerpos) que contienen un anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4 pueden emplearse. Para la preparación de inmunoliposomas MPB-PE (N-[4-(p-maleimidofenill)butiril]-fosfatidiletanolamina) se sintetiza de acuerdo con el método de Martin & Papahadjopoulos (1982) J. Biol. Chem. 257, 286-288. MBP-PE se incorpora a las bicapas liposomales para permitir una unión covalente del anticuerpo anti-ECSM4, o un fragmento del mismo, a la superficie liposomal. El liposoma se carga de modo conveniente con el ADN u otra construcción genética, seguida por la extrusión secuencial a través de filtros de membranas de policarbonato con tamaños de poro de 0.6 \mum y 0.2 \mum bajo presiones de nitrógeno de hasta 0.8 MPa. Después de la extrusión, la construcción de ADN atrapada se separa de la construcción de ADn libre por ultracentrifugación a 80 000 x g durante 45 minutos. Los liposomas MBP-PE acabados de preparar en tampón desoxigenado se mezclan con el anticuerpo recién preparado (o un fragmento del mismo) y se llevan a cabo las reacciones de acoplamiento en una atmósfera de nitrógeno a 4ºC bajo rotación constante durante toda la noche. Los inmunoliposomas se separan de los anticuerpos no conjugados por ultracentrifugación a 80 000 x g durante 45 min. Los inmunoliposomas pueden inyectarse por vía intraperitoneal o directamente en el tumor.

El ácido nucleico entregado al sitio blanco puede ser cualquier ADN que conduzca, de manera directa o indirecta, a la citotoxicidad. Por ejemplo, el ácido nucleico puede codificar para una ribozima que sea citotóxica para la célula, o puede codificar para una enzima que sea capaz de convertir un prodroga esencialmente no tóxica en una droga citotóxica (este último sistema a veces recibe el nombre de GDEPT: Terapia enzimática de Prodroga dirigida por
gen).

Las ribozimas que pueden estar codificadas en el ácido nucleico a ser entregado al blanco se describen en Cech and Herschlag "Site-specific cleavage of single stranded DNA" US 5.180.818; Altman et al "Cleavage of targeted RNA by RNAse P" US 5.168.053, Cantin et al "Ribozyme cleavage of HIV-1 RNA" US 5.149.796; Cech et al "RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods", US 5.116.742; Been et al "RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endonucleases and methods", US 5.093.246; and Been et al "RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods; cleaves single-stranded RNA at specific site by transesterification", US 4.987.071. Blancos adecuados para las ribozimas incluyen factores de transcripción, tales como c-fos y c-myc, y bcl-2. Durai et al (1997) Anticancer Res. 17, 3307-3312 describen una ribozima cabeza de martillo contra bcl-2.

EP 0 415 731 describe el sistema GDEPT. Consideraciones similares en cuanto a la selección de la enzima y la prodroga se aplican al sistema GDEPT del mismo modo que al sistema ADEPT descrito anteriormente.

El ácido nucleico entregado al sitio blanco puede codificar para un polipéptido directamente citotóxico.

De manera alternativa, la otra porción puede incluir un polipéptido o un polinucleótido que codifique para un polipéptido que no sea directa ni indirectamente citotóxico, pero que sí sea de beneficio terapéutico. Ejemplos de tales polipéptidos incluyen citoquinas anti-proliferativas o antiinflamatorias que pueden ser beneficiosas para la ateroesclerosis, y los inmunomoduladores o factores antiproliferativos que influyen sobre la coagulación de la sangre pueden ser beneficiosos para el tratamiento del cáncer.

La otra unidad puede resultar un inhibidor útil de la angiogénesis, tal como los péptidos angiostatina o endostatina. La otra unidad puede también resultar una enzima útil que convierte un polipéptido precursor a angiostatina o endostatina. Las metaloproteasas matriciales humanas tales como la elastasa de macrófagos, la gelatinasa y la estromolisina convierten el plasminñogeno a angiostatina (Cornelius et al (1998) J. Immunol. 161, 6845-6852). El plasminógeno es un precursor de la angiostatina.

En otra realización de la invención, la otra unidad es una unidad fácilmente detectable.

En el término "unidad fácilmente detectable" incluimos el sentido de que la unidad es una que, cuando se localiza en el sitio blanco luego de la administración del compuesto a un paciente, puede ser detectada, por lo regular, de manera no invasiva desde el exterior del organismo y puede detectarse el sitio blanco. Por tanto, los compuestos son útiles para la imaginología y el diagnóstico.

Por lo regular, la unidad fácilmente detectable es, o comprende, un átomo readiactivo que es útil en la imaginología. Átomos radiactivos adecuados incluyen el tecnecio 99, o el yodo 123 para estudios cintigráficos. Otras unidades fácilmente detectables incluyen, por ejemplo, las marcas de espín para la imaginología de resonancia magnética (MRI), tales como yodo 123 nuevamente, yodo 131, indio 111, flúor 19, carbono 13, nitrógeno 15, oxígeno 17, gadolinio, manganeso o hierro. Obviamente, el compuesto debe tener una cantidad suficiente del isótopo atómico apropiado para que la molécula pueda detectarse con facilidad.

La marca radiactiva o de otro tipo puede ser incorporada al compuesto por medios conocidos. Por ejemplo, el anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4 puede ser biosintetizado o puede sintetizarse mediante síntesis química de aminoácidos, empleando los precursores aminoacídicos apropiados, lo que incluye, por ejemplo, el flúor 19 en lugar del hidrógeno. Las marcas tales como ^{99}Tc, ^{123}I, ^{186}Rh, ^{188}Rh, e ^{111}In pueden, por ejemplo, unirse mediante un residuo de cisteína a la unidad de unión. El Itrio 90 puede unirse mediante un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57) puede emplearse para incorporar yodo 123. La referencia ("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989) describe otros métodos en detalle.

En otra realización preferida de la invención, la otra unidad es capaz de unirse de manera selectiva a una unidad directa o indirectamente citotóxica o a una unidad fácilmente detectable. Por tanto, en esta realización, la otra unidad puede ser cualquier unidad que se una a otro compuesto o componente que sea citotóxico o fácilmente detectable.

La otra unidad puede, por tanto, ser un anticuerpo que se una de manera selectiva a otro compuesto o componente, o puede ser alguna otra unidad de unión, tal como la estreptavidina, o la biotina, o similares. Los ejemplos siguientes ilustran los tipos de moléculas que se encuentran incluidos; se puede deducir fácilmente la utilidad de otras moléculas a partir de las explicaciones que se brindan en este documento.

Un anticuerpo biespecífico, en el que un sitio de unión incluye la unidad que se une de manera selectiva a ECSM4 y el segundo sitio de unión incluye una unidad que se une, por ejemplo, a una enzima que es capaz de convertir una prodroga sustancialmente no tóxica en una droga citotóxica.

Un compuesto, tal como un anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4, al cual se ha unido biotina, avidina o estreptavidina, que han sido marcadas con una sonda fácilmente detectable puede emplearse de conjunto con el anticuerpo marcado con biotina en un sistema de imaginología de dos etapas, en el que el anticuerpo marcado se localiza primero en el sitio blanco en el paciente, y luego, la avidina o estreptavidina marcadas se administran al paciente. Los sistemas de anticuerpos biespecíficos y de biotina/estreptavidina (avidina) están revisados en Rosebrough (1996) Q J Nucl. Med. 40,234-251.

En una realización preferida de la invención, el anticuerpo que se une selectivamente a ECSM4 y la otra unidad son polipéptidos que se encuentran fusionados.

Los compuestos descritos con anterioridad son útiles para el tratamiento, la imaginología o el diagnóstico de enfermedades, en particular, enfermedades en las que puede formarse nueva vasculatura indeseable, como se describe más adelante en más detalle.

En los métodos y usos de la presente invención el compuesto antes descrito se usa, por lo regular, en la forma de una composición farmacéutica que incluye al compuesto y a un portador farmacéuticamente aceptable.

En el término "farmacéuticamente aceptable" se incluye que la formulación sea estéril y libre de pirógenos. En la técnica farmacéutica se conocen bien portadores farmacéuticamente aceptables.

Los portadores deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con el compuesto de la invención y no deletéreos para los receptores del mismo. Por lo regular, los portadores serán agua o solución salina estéril y libre de pirógenos; sin embargo, pueden emplearse otros portadores aceptables.

Por lo regular, las composiciones o formulaciones farmacéuticas son para la administración parenteral, más particularmente, para la administración intravenosa.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones estériles de inyección, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con respecto a la sangre del receptor deseado, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden contener agentes de suspensión y agentes que las tornan más densas.

Los compuestos descritos con anterioridad son útiles para la imaginología del endotelio vascular en el cuerpo de un individuo cuando la otra unidad es una unidad fácilmente detectable. En concordancia con esto, un primer aspecto de la invención proporciona el uso como se define en la Reivindicación 1.

Por lo regular, el endotelio vascular está relacionado con la angiogénesis.

La imaginología del endotelio vascular de un individuo, por lo regular, incluye la detección de la localización del compuesto en dicho individuo.

La detección del compuesto o el anticuerpo puede llevarse a cabo empleando métodos bien conocidos en la técnica de imaginología y diagnóstico clínico. El método específico que se requiera dependerá del tipo de marca detectable unida al compuesto o anticuerpo. Por ejemplo, los átomos radiactivos pueden detectarse empleando autorradiografía o, en algunos casos, mediante imaginología de resonancia magnética (MRI), como se describió con anterioridad.

La imaginología del endotelio vascular en el cuerpo resulta útil porque puede proporcionar información acerca de la salud del organismo. Resulta de particular utilidad cuando el endotelio vascular está enfermo, o se encuentra en proliferación debido a un crecimiento canceroso. La imaginología del cáncer en un paciente es especialmente útil, porque puede emplearse para determinar el tamaño de un tumor y si el mismo está respondiendo a tratamiento. Dado que las enfermedades metastáticas involucran la formación de nuevos vasos sanguíneos, el método resulta útil en la evaluación de si ha ocurrido una metástasis.

Por tanto, en una realización preferida del primer aspecto de la invención, el endotelio vascular es nueva vasculatura, tal como la que se produce en el cáncer.

Los compuestos descritos con anterioridad también resultan útiles para el diagnóstico o el pronóstico, en un individuo, de una dolencia que involucra al endotelio vascular, cuando la otra unidad es una unidad fácilmente detectable. En concordancia, un segundo aspecto de la invención proporciona el uso que se define en la Reivindicación 4.

La dolencia puede ser una que incluya el crecimiento aberrante o excesivo del endotelio vascular, tal como el cáncer, aterosclerosis, restenosis, retinopatía diabética, artritis, soriasis, endometriosis, menorragia, los hemangiomas, y las malformaciones venosas.

El método puede ser uno que sea una ayuda para el diagnóstico.

El diagnóstico o el apoyo al diagnóstico de una dolencia que incluye el endotelio vascular en un individuo, por lo regular, incluye la detección de la localización del compuesto en el individuo. De preferencia el endotelio es en nueva vasculatura, o sea, vasculatura angiogénica.

La función de ECSM4 puede no ser la promoción de la proliferación de las células del endotelio vascular. Por lo tanto, el nivel de expresión de los polipéptidos ECSM4 en una célula endotelial puede no ser informativo con respecto de la salud del endotelio vascular. Sin embargo, la localización de la expresión de los polipéptidos ECSM4 puede resultar informativa, ya que representan el crecimiento de los vasos sanguíneos. La proliferación celular anormal, tal como el cáncer puede diagnosticarse mediante la detección de nueva vasculatura.

Los compuestos descritos con anterioridad también son útiles en un método de tratamiento de una dolencia que involucra al endotelio vascular cuando la otra unidad es una unidad citotóxica o terapéutica. En concordancia, un tercer aspecto de la invención proporciona un uso como se define en la Reivindicación 9.

En una realización de este aspecto, el paciente que requiere el tratamiento tiene una enfermedad proliferativa o una dolencia que involucra al endotelio vascular.

Una cantidad de enfermedades y dolencias involucra la formación no deseada de nueva vasculatura. La formación de nueva vasculatura está asociada con el cáncer, la soriasis, la aterosclerosis, la menorragia, la artritis (tanto inflamatoria como reumatoidea), la degeneración macular, la enfermedad de Pager, la retinopatía y sus complicaciones vasculares (incluyendo las proliferativas y de prematuridad, y diabéticas), las proliferaciones vasculares benignas y las fibrosis.

Por cáncer se incluye el sarcoma de Kaposi, la leucemia, el linfoma, el mieloma, los carcinomas sólidos (tanto primarios como secundarios (metástasis), los tumores vasculares, incluyendo el hemangioma (tanto capilar como juvenil (infantil)), la hemangiomatosis y el hemagioblastoma. Por lo regular, la enfermedad se asocia con la formación de nueva vasculatura indeseada y el tratamiento reduce la misma en una cantidad apropiada.

Los tumores que pueden tratarse por los métodos de la invención incluyen cualesquiera tumores asociados con la producción de nuevos vasos sanguíneos.

El término "tumor" debe entenderse como referido a todas las formas de crecimiento celular neoplásico, incluyendo los tumores de pulmón, de hígado, de células sanguíneas, de piel, de páncreas, de estómago, de colon, de próstata, de útero, de mamas, de glándulas linfáticas y de vejiga. Los tumores sólidos son especialmente apropiados. Sin embargo, actualmente también se estima que los cánceres de la sangre, incluyendo las leucemias y los linfomas también involucran la formación de nuevos vasos sanguíneos y pueden tratarse por medio de los métodos de la invención.

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Por lo regular, en los usos antes mencionados, la otra unidad es una que destruye o desacelera, o revierte el crecimiento de la nueva vasculatura.

Se apreciará con facilidad que, en dependencia del compuesto particular empleado en la imaginología, el diagnóstico o el tratamiento, el momento de la administración puede variar, así como la cantidad de otros componentes empleados en los sistemas terapéuticos aquí descritos.

Por ejemplo, en el caso en el que el compuesto incluye una unidad fácilmente detectable o una unidad directamente citotóxica, puede suceder que solo el compuesto, en una formulación adecuada, sea para la administración al paciente, Por supuesto, al paciente se le pueden administrar otros agentes, tales como agentes inmunosupresores y similares.

Con respecto a los compuestos que se encuentran marcados de manera detectable, la imaginología tiene lugar una vez que el compuesto ha localizado el sitio blanco.

Sin embargo, si el compuesto es tal que requiere otro componente para ser útil para el tratamiento, la imaginología y el diagnóstico, el compuesto puede administrarse y permitírsele que localice el sitio blanco y, con posterioridad, administrar el otro componente pasado un lapso de tiempo adecuado.

Por ejemplo, con respecto a los sistemas de tipo ADEPT y GDEPT antes mencionados, el compuesto unidad de unión-unidad enzimática se administra y se localiza en el sitio blanco. Una vez que esto está hecho, se administra la prodroga.

Algo similar sucede, por ejemplo, con respecto a los compuestos en los cuales la otra unidad contenida en el compuesto es tal que se une a otro componente, el compuesto puede administrarse primero y permitírsele que se localice en el sitio blanco y, a continuación, administrar el otro componente.

Por tanto, en una realización, se administra al paciente un anticuerpo anti ECSM4 marcado con biotina y, luego de un período de tiempo adecuado, se administra estreptavidina marcada de manera detectable. Una vez que la estreptavidina se haya localizado en los sitios en los que se ha localizado el anticuerpo (o sea, los sitios blanco), tiene lugar la imaginología.

Se cree que los compuestos descritos con anterioridad, en los que la otra unidad es una unidad fácilmente detectable, pueden resultar útiles para la determinación del estado angiogénico de los tumores u otros estados de enfermedad en los que la angiogénesis contribuye a la patología. Esto puede ser un factor importante que influya en la naturaleza y el desenlace de la terapia futura.

Los fragmentos del polipéptido ECSM4 que pueden resultar útiles para levantar anticuerpos incluyen los fragmentos con las secuencias GGDSLLGGRGSL, LLQPPARGHAHDGQALSTDL, EPQDYTEPVE, TAPGGQGAPWAEE y ERATQEPSEHGP. Estos péptidos corresponden a regiones del polipéptido ECSM4 humano (localizadas en los residuos 4-16, 91-109, 227-236,288-300 y 444-455, respectivamente en la Figura 12) que no son, o solo lo son pobremente, conservadas en el homólogo de ratón (ver Figura 14). Como se describirá más adelante, tales péptidos pueden resultar particularmente útiles para levantar anticuerpos contra el polipéptido ECSM4 humano.

De acuerdo con el programa de predicción de dominios de transmembrana llamado PRED-TMR (disponible en el sitio de Internet http://www.biophys.biol.uoa.gr) y un alineamiento de la secuencia aminoacídica con la proteína humana Robo1 (cuya región de transmembrana se conoce), los residuos 1-467, como muestra la Figura 12 tienen posibilidades de ser extracelulares, y además de ser extracelulares y estar expuestos, pueden incluir el sitio de unión para el ligando natural. Por lo tanto, fragmentos de ECSM4 que contengan o consistan en una secuencia del dominio extracelular de los residuos 1-467 de la Figura 12, pueden representar fragmento útiles para levantar anticuerpos selectivos para células que expresen ECSM4 en su superficie y que pueden también resultar útiles en la modulación de la actividad del polipéptido ECSM4.

Por tanto, los fragmentos preferidos del polipéptido ECSM4 para levantar anticuerpos son aquellos fragmentos de la secuencia polipeptídica de la Figura 12 que comprenden, al menos 1, 3, ó 5 residuos aminoacídicos que no están conservados cuando se compara con el ECSM4 de ratón (como se muestra en la Figura 13). Con mayor preferencia, al menos 7, 9, 11, ó 13 residuos aminoacídicos en el fragmento no están conservados entre el ECSM4 humano y el ECSM4 de ratón, y con mayor preferencia aún, al menos 15, 17, 19, ó 21 residuos del fragmento no están conservados entre el ECSM4 humano y el ECSM4 de ratón. La secuencia de tales fragmentos puede determinarse a partir del alineamiento de las secuencias aminoacídicas humana y de ratón que se muestran en la Figura 14. Otros fragmentos útiles de ECSM4 son aquellos que son capaces de unir un ligando selectivo para ECSM4. Métodos adecuados para la identificación de ligandos, tales como péptidos u otras moléculas que unen ECSM4 se discutieron con anterioridad con mayor detalle. Tales péptidos u otras moléculas de unión a ECSM4 pueden emplearse para identificar la secuencia aminoacídica presente en ECSM4 que es responsable de la unión al ligando. La identificación de los fragmentos de ECSM4 que, cuando resultan aislados del resto de la molécula, son todavía capaces de unir un ligando de ECSM4 puede lograrse por medio de una selección. Por lo regular, tal selección incluirá poner en contacto un ligando de ECSM4 con un fragmento de prueba del polipéptido ECSM4 y determinar si el fragmento de prueba se une al ligando. Los fragmentos de ECSM4 se encuentran dentro del alcance de la presente invención y pueden resultar de utilidad particular en la medicina. Un fragmento de ECSM4 que une a un ligando natural de ECSM4 puede neutralizar el efecto del ligando y, de esa manera, afectar la migración de las células endoteliales, el crecimiento y/o el desarrollo vascular. Por lo tanto, fragmentos de ECSM4 pueden ser útiles para el tratamiento de dolencias en las que la migración de las células endoteliales, el crecimiento y/o el desarrollo vascular necesitan ser modulados. Ejemplos de estas enfermedades incluyen el cáncer y la aterosclerosis.

Una "variante" del polipéptido ECSM4 incluye variantes naturales, incluyendo variaciones alélicas y formas mutantes que ocurren en la naturaleza, y variantes con inserciones, deleciones y sustituciones, ya sean conservativas o no conservativas, cuyos cambios no alteran de manera significativa la actividad de dicho polipéptido. En el caso del polipéptido ECSM4, como un homólogo endotelial específico de la glorieta 1 humana, puede muy bien estar involucrado en la guía repulsiva del endotelio. Además, los polipéptidos que resulten alongados como resultado de una inserción o que sean truncados como consecuencia de la deleción de una región, están incluidos dentro del alcance de esta invención. Por ejemplo, la deleción de regiones localizadas en el citoplasma puede resultar útil para la creación de formas "dominantes negativos" o "dominantes positivos" del polipéptido. De manera similar, la deleción de una región de transmembrana del polipéptido puede producir estas formas.

Por "sustitución conservativa" se entienden combinaciones tales como Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; and Phe, Tyr.

En "sustitución no conservativa" incluimos otras sustituciones, tales como aquellas en que el residuo sustituido mimetiza una modificación particular del residuo remplazado, por ejemplo una tirosina o serina fosforiladas pueden ser remplazadas por un aspartato o un glutamato, merced a la similitud de la cadena lateral del aspartato o el glutamato con un residuo fosforilado (en este caso, portan carga negativa a pH neutro).

Otras sustituciones no conservativas que se encuentran incluidas dentro del término "variantes" son mutaciones puntuales que alteran uno, a veces dos y, por lo regular no más de tres aminoácidos. Tales mutaciones son bien conocidas en las técnicas bioquímicas y, usualmente, están diseñadas para insertar o eliminar una característica definida del polipéptido. Otro tipo de mutación no conservativa es la alteración o adición de un residuo de cisteína o lisina que puede usarse con posterioridad con reactivos de entrecruzamiento como maleimida o succinimida para conjugar covalentemente el polipéptido a otra unidad. Las proteínas no glicosiladas pueden mutarse para convertir una asparagina en el motivo de reconocimiento N-X-S/T para la N-glicosilación. Dicha modificación puede resultar útil para crear una marca para la purificación del péptido empleando cuentas unidas a concanavalina A.

Estas variantes pueden fabricarse empleando los métodos de ingeniería de proteínas y mutagénesis sitio específica bien conocidos en la técnica.

Variantes del polipéptido ECSM4 incluyen polipéptidos que contienen una secuencia con al menos 65% de identidad con la secuencia aminoacídica dada en la Figura 4, o la Figura 7, o la Figura 12, o la Figura 13, preferentemente al menos 70% u 80% u 85% o 90% de identidad con dicha secuencia, y con mayor preferencia al menos 95%, o 98% de identidad con dicha secuencia aminoacídica.

El porciento de identidad puede determinarse empleando, por ejemplo, el programa LALIGN (Huang and Miller, Adv. Appl. Math. (1991) 12: 337-357) disponible en el sitio de Expasy (http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN form.html) empleando como parámetros la opción de alineamiento global, la matriz de puntuación BLOSUM62, -14 como penalización para la apertura de hendiduras, -4 como penalización para la extensión de hendiduras.

De preferencia, un anticuerpo que se une selectivamente a ECSM4 es uno que se une a un polipéptido cuya secuencia aminoacídica contiene la secuencia dada en cualesquiera de las Figuras 4, 5 ó 12, o una variante natural de los mismos, pero no se une al polipéptido representado por ninguno de los ID. SEC No. 18085 de EP 1 074 617, ID. SEC. No 211, ya sea de WO 00/53756 o WO99/46281, ID. SEC. Nos 24-27, 29, 30, 33, 34, 38 o 39 de WO 01/23523, o ID. SEC. No 86 de WO 99/11293, o codificado por ninguna de las secuencias nucleotídicas representadas por el ID. SEC No 18084 o 5096 de EP 1 074 617, ID. SEC. No 210 de WO 00/53756 o WO 99/46281, o ID. SEC. Nos 22, 23, 96 o 98 de WO 01/23523 e ID. SEC. No 31 de WO 99/11293.

En el término "unir selectivamente" incluimos anticuerpos que se unen al menos con diez veces más fuerza a un polipéptido de ECSM4 que a otro polipéptido; de preferencia al menos 50 veces con más fuerza y, con mayor preferencia, al menos con 100 veces más fuerza. Tales anticuerpos pueden fabricarse por métodos bien conocidos en la técnica, empleando la información relacionada con las diferencias en las secuencias aminoacídicas de ECSM4 y otro polipéptido que no sea un polipéptido de ECSM4.

Los anticuerpos que se unen de manera selectiva a ECSM4 pueden modular también la función del polipéptido ECSM4. Los anticuerpos que mimetizan el efecto de la unión del verdadero ligando mediante la estimulación o la activación de ECSM4, o que se unen y de ese modo evitan la unión subsiguiente y la activación o estimulación de ECSM4 por el ligando verdadero, y tales anticuerpos moduladores de la función están incluidos en el alcance de la invención. Se apreciará que los anticuerpos que modulan la función son útiles como un instrumento de investigación, por ejemplo, en el estudio de los efectos de la estimulación o activación de ECSM4, o procesos posteriores desencadenados por dicha estimulación. Dichos anticuerpos son útiles en la medicina, por ejemplo, en la modulación de la angiogénesis en pacientes. Específicamente, la modulación de la angiogénesis por la administración de dichos anticuerpos puede resultar útil para el tratamiento de una enfermedad en un paciente en el que la modulación de la angiogénesis resulte beneficiosa, como el cáncer.

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Los siguientes péptidos pueden resultar útiles como inmunógenos en la generación de anticuerpos, tales como suero policlonal de conejo: LSQSPGAVPQALVAWRA, DSVLTPEEVALCLEL, TYGYISVPTA and KGGVLLCPPRPCLTPT.

En una realización preferida, el anticuerpo de la invención se une de manera selectiva a una secuencia aminoacídica de secuencia GGDSLLGGRGSL, LLQPPARGHAHDGQALSTDL, EPQDYTEPVE, TAPGGQGAPWAEE o ERATQEPSEHGP. Estas secuencias representan secuencias aminoacídicas que no son idénticas entre las secuencias polipéptidicas de ECSM4 de humano y ratón. Por lo general, los polipéptidos ECSM4 de humano y ratón muestran un alto grado de identidad, lo que hace que la producción de anticuerpos de ratón contra el ECSM4 humano sea particularmente difícil, debido a la falta de inmunogenicidad de gran parte de la secuencia de ECSM4 humana en ratón. Las secuencias aminoacídicas que están ausentes del ECSM4 de ratón tienen más probabilidad de ser inmunogénicas en un ratón que las secuencias que están presentes en el ECSM4 de ratón (un alineamiento entre las secuencias aminoacídicas del ECSM4 humano y de ratón se encuentra en la Figura 14). Por tanto, los fragmentos polipeptídicos que contienen secuencias únicas al ECSM4 humano como se describió con anterioridad son más útiles que los polipéptidos ECSM4 cuyas secuencias se encuentran tanto en humanos como en ratones, para la producción de anticuerpos que se unen de manera selectiva al polipéptido ECSM4 humano.

Los anticuerpos generados como resultado del uso de secuencias aminoacídicas que se localizan en la porción extracelular del polipéptido ECSM4 tienen probabilidad de ser útiles como moléculas blanco del tejido endotelial. Por tanto, es particularmente preferido que el anticuerpo de la invención se levante contra y, de preferencia, se una de manera selectiva a, una secuencia aminoacídica que es única del polipéptido ECSM4 humano, cuya secuencia se localiza hacia el extremo N-terminal del polipéptido, y se encuentra en la porción extracelular, localizada entre los residuos 1 y 467 de la secuencia aminoacídica mostrada en la Figura 12.

Aunque las secuencias aminoacídicas que son únicas del ECSM4 humano pueden emplearse para producir anticuerpos policlonales, se prefiere emplearlas para producir anticuerpos monoclonales.

Los péptidos en los que uno ó más de los residuos aminoacídicos se encuentran químicamente modificados, antes o después de la síntesis del péptido, pueden emplearse, siempre que la función del péptido, o sea, la producción de anticuerpos específicos in vivo, permanezca sustancialmente inalterada. Tales modificaciones incluyen la formación de sales con ácidos o bases, especialmente ácidos o bases orgánicos o inorgánicos fisiológicamente aceptables, la formación de ésteres o amidas a partir de un grupo carboxilo terminal, y la unión de grupos protectores a los aminoácidos, tales como N-t-butoxicarbonilo. Tales modificaciones pueden proteger al péptido del metabolismo in vivo. Los péptidos pueden estar presentes como copias simples o múltiples, por ejemplo, repeticiones en tándem. Estas repeticiones en tándem o múltiples pueden ser en sí mismas lo suficientemente antigénicas para obviar el empleo de portadores. Puede resultar ventajoso que el péptido se sintetice como un lazo, con los extremos N-terminal y C-terminal unidos, o añadir uno o más residuos de Cys a un extremo, para incrementar la antigenicidad, y/o para permitir la formación de enlaces disulfuro. Si el péptido se encuentra unido de manera covalente a un portador, de preferencia, un polipéptido, entonces el arreglo es de preferencia, tal que el péptido de la invención forma un lazo.

De acuerdo a las teorías inmunológicas en boga, una función portadora debe estar presente en cualquier formulación inmunogénica con el objetivo de estimular al, o aumentar la estimulación del, sistema inmune. Se piensa que el mejor portador contiene (o forma, de conjunto con el antígeno) un epítope de célula T. Los péptidos pueden estar asociados, por ejemplo, mediante entrecruzamiento, con un portador separado, tal como albúminas de suero, mioglobinas, toxoides bacterianos y hemocianina. Más recientemente, los portadores desarrollados que inducen la ayuda T en la respuesta inmune incluyen el antígeno del núcleo de la hepatitis B (también llamado proteína de la nucleocápside), epítopes de células T presumibles, tales como Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cys, \beta-galactosidasa y el péptido 163-171 de la interleuquina-1. El último compuesto puede verse como portador o como adyuvante, o ambos. De manera alternativa, varias copias del mismo o diferentes péptidos de la invención pueden entrecruzarse, en esta situación no existe un portador separado como tal, sino que la función portadora puede ser proporcionada por dicho entrecruzamiento. Agentes de entrecruzamiento adecuados incluyen los listados como tal en los catálogos de Sigma y Pierce, por ejemplo, el glutaraldehído, la carbodiimida y el succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato, cuyo último agente explota el grupo SH del residuo de cisteína en el C-terminal (si está presente).

Si el péptido se prepara por la expresión de una secuencia de un nucleótido adecuado en un hospedero adecuado, entonces puede ser ventajoso expresar el péptido como un producto de fusión con una secuencia peptídica que actúa como un portadro. El sistema de Kabigen "ECOSOC" es un ejemplo de tal reordenamiento.

Los péptidos pueden sintetizarse por el método Fmoc-poliamida de síntesis de péptidos en fase sólida, como está descrito en Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433, y las referencias de dicho trabajo. La protección temporal del grupo N-amino se logra por el grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La ruptura repetitiva de este grupo protector altamente lábil ante bases se efectúa empleando 20% de piperidina en N,N-dimetilformamida. Las funciones de las cadenas laterales pueden protegerse como sus éteres butílicos (en el caso de serina, treonina y tirosina), butil ésteres (en el caso del ácido glutámico y el ácido aspártico), derivado de butiloxicarbonilo (en el caso de lisina e histidina), derivado tritilo (en el caso de cisteína) y derivado de 4-metoxi-2,3,6-trimetil-bencenosulfonilo (en el caso de arginina). En el caso en que la glutamina o la asparagina son los residuos C-terminal, se hace uso del grupo 4,4'-dimetoxibenzidrilo para la protección de las funcionalidades de las cadenas laterales amido. El soporte de fase sólida se basa en un polímero de polidimetil archilamida, constituido por los tres monómeros dimetilacrilamida (monómero del esqueleto), bisacrioiletilén diamino (entrecruzador) y el éster metílico de acriloilsarcosina (agente funcionalizador). El agente unido escindible de péptido a resina empleado es el derivado del ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético lábil al ácido. Todos los derivados de aminoácidos se añaden en la forma de sus derivados de anhídridos simétricos preformados, con la excepción de la asparagina y la glutamina, que se añaden empleando un procedimiento de acoplamiento reverso mediado por N,N-diciclohexil-carbodiimida/1-hidroxibenzotriazol. Todas las reacciones de acoplamiento y desprotección se monitorean empleando procedimientos de prueba de ninhidrina, ácido trinitrobeceno sulfónico o isotina. Al completar la síntesis, se separan los péptidos del soporte de resina con la remoción concomitante de los grupos protectores de las cadenas laterales, mediante el tratamiento con ácido trifluoroacético al 95%, conteniendo una mezcla limpiadora al 50%. Los limpiadores comúnmente empleados son etanoditiol, fenol, anisol y agua, de los cuales la elección concreta depende de los aminoácidos que compongan el péptido que se está sintetizando. El ácido trifluoroacético se elimina por evaporación al vacío, con la trituración subsiguiente con dietiléter que rinde el péptido crudo. Los limpiadores presentes se eliminan por un procedimiento simple de extracción que, mediante la liofilización de la fase acuosa, rinde el péptido crudo, libre de limpiadores. Los reactivos para la síntesis peptídica están generalmente disponibles a partir de Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK. La purificación puede llenarse a cabo mediante cualquiera de, o una combinación de, técnicas tales como la cromatografía de exclusión por tamaño, la cromatografía de intercambio iónico y (especialmente) la cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa. Se puede llevar a cabo el análisis de los péptidos empleando cromatografía de capa fina, cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa, análisis de aminoácidos después de al hidrólisis ácida y por medio de análisis de espectrometría de masas por bombardeo rápido de átomos (FAB).

Pueden levantarse los anticuerpos en un animal mediante la inmunización con un péptido adecuado. Los péptidos adecuados se describen en el presente documento. De manera alternativa, con la tecnología actual, resulta posible fabricar anticuerpos como se definen en el presente documento sin necesidad de emplear animales. Dichas técnicas incluyen, por ejemplo, la tecnología de muestra de anticuerpos en fagos, como se conoce bien en la técnica. Los péptidos adecuados, como se describen en el presente documento, pueden emplearse para seleccionar los anticuerpos producidos de esta manera.

Se podrá apreciar que, con los avances en las tecnologías de anticuerpos puede no resultar necesario inmunizar un animal para producir un anticuerpo. Los sistemas sintéticos, tales como las librerías de muestras de fagos, pueden emplearse. El empleo de estos sistemas se incluye en los métodos de la invención y los productos de dichos sistemas son "anticuerpos" para los propósitos de la invención.

Se reconocerá que los anticuerpos que reconocen a ECSM4 y variantes o fragmentos del mismo son reactivos de investigación y agentes terapéuticos útiles, en particular cuando se preparan como un compuesto de la invención como se describió con anterioridad. Adecuadamente, los anticuerpos de la invención son marcables para su detección, por ejemplo, puede marcárseles de modo que puedan ser detectados de modo directo o indirecto. Convenientemente, los anticuerpos se marcan con una unidad radiactiva o una unidad coloreada, o una unidad fluorescente, o pueden unirse a una enzima. Por lo regular, la enzima es una que puede convertir un sustrato no coloreado (o no fluorescente) en un producto coloreado (o fluorescente). El anticuerpo puede estar marcado con biotina (o estreptavidina) y detectarse luego de modo indirecto usando estreptavidina (o biotina) que haya sido marcada con una unidad radiactiva o una unidad coloreada, o una unidad fluorescente, o similares, o pueden encontrarse unidas a cualquier enzima del tipo descrito antes.

Un cuarto aspecto de la invención proporciona un método para detectar daño endotelial o activación en un individuo que comprende la obtención de una muestra de fluido del individuo, y la detección de la presencia de fragmentos de ECSM4 en la muestra, como se define en la Reivindicación 19.

De preferencia, la muestra de fluido es sangre. Por lo común, la presencia de péptidos derivados de ECSM4 se detecta.

En una realización preferida de este aspecto, se detecta la presencia de fragmentos de péptidos de los polipéptidos ECSM4 empleando un anticuerpo selectivo para un polipéptido cuya secuencia aminoacídica contiene una secuencia dada en cualesquiera de las Figuras 4 ó 12 o fragmentos de las mismas. Por lo regular, tal anticuerpo estará marcado de modo detectable.

La detección o el diagnóstico de daño celular endotelial en un individuo es útil para el diagnóstico del cáncer o la asistencia en el diagnóstico de enfermedades cardíacas, endometriosis o aterosclerosis en dicho individuo. Puede ser que se detecten ciertos niveles de daño celular aparente en individuos que no poseen cáncer, enfermedades cardíacas, endometriosis o aterosclerosis. Puede ser necesario comparar la cantidad de daño celular endotelial detectado con las cantidades o los niveles observados en individuos que se sabe que tienen cáncer, enfermedades cardíacas, endometriosis o aterosclerosis.

Por lo tanto, la detección de daño o activación endotelial en un individuo puede ser útil como medio de detectar la presencia o tamaño de la velocidad de crecimiento de un tumor en dicho individuo. La detección de daño vascular es un reporte indirecto de la formación de neovasculatura tumoral. De esta manera, ECSM4 puede ser un marcador sustituto de la angiogénesis. La presencia de fragmentos de ECSM4 en una muestra que proviene de un individuo, o más fragmentos de polipéptidos ECSM4 que en un individuo que no tiene tumor, puede ser un medio para detectar un tumor, o el crecimiento de un tumor conocido, en dicho individuo.

Además, se notará que la detección de nueva vasculatura por medio de la detección de la presencia de, o un cierto nivel de, ECSM4 en una muestra proveniente de un individuo puede ser útil para determinar si un tratamiento suministrado a dicho individuo resulta efectivo, y/o hasta qué punto este tratamiento es efectivo. De preferencia, la terapia es para el tratamiento de un tumor o cáncer en el individuo.

Por tanto, un aspecto de la invención proporciona un método para la detección de neovasculatura asociada a tumor o enfermedades cardíacas, o endometriosis, o aterosclerosis en un individuo, método que comprende la obtención de una muestra de fluido a partir del individuo y la detección de la presencia de fragmentos de ECSM4 en la muestra.

Como se describió con anterioridad en relación con la detección o el diagnóstico de daño celular endotelial, la detección de la enfermedad (tal como tumor o enfermedades cardíacas, etc) por medio de la detección de la presencia de, o un determinado nivel de, ECSM4 en una muestra tomada de un individuo puede resultar útil para determinar la eficacia de un tratamiento suministrado a dicho individuo.

En una realización, la terapia es terapia génica.

De preferencia, la eficacia del tratamiento en un individuo se determina empleando la cantidad de fragmentos de ECSM4 hallados en la muestra de fluidos del individuo, y comparándola ya sea con la cantidad de fragmentos de ECSM4 en una muestra tomada a partir de un individuo que no tiene cáncer, enfermedades cardíacas, endometriosis, o aterosclerosis y/o con la cantidad que se obtiene de una muestra tomada al individuo con anterioridad al comienzo de dicho tratamiento. La comparación indica la eficacia del tratamiento suministrado al individuo, mientras que si no hay cambios en la cantidad de fragmentos determinada antes y durante/después del tratamiento, tal cosa es indicativa de pobre eficacia del tratamiento. Una disminución del número de fragmentos encontrados durante o después del tratamiento en comparación con la cantidad encontrada antes del comienzo del tratamiento indica alguna eficacia del tratamiento en el mejoramiento de la dolencia del individuo.

Los métodos actuales para la evaluación de la eficacia de variadas terapias antiangiogénicas que se encuentran en ensayos clínicos son invasivos. La expresión selectiva de ECSM4 en células endoteliales de vasos sanguíneos angiogénicos significa que la detección de la presencia, ausencia, incremento o disminución en el nivel de ECSM4 en un sujeto sometido a terapia es un medio de determinar la eficacia de la terapia en dicho sujeto sin necesidad, o con una necesidad reducida, de biopsias invasivas, barridos, y otros similares.

Por tanto, la determinación del nivel de fragmentos de ECSM4 en la sangre de un individuo sometido a una terapia antiangiogénica (tal como una terapia contra el cáncer) puede actuar como un "marcador sustituto de la angiogénesis".

Por "fragmentos de péptidos derivados de ECSM4" entendemos péptidos que poseen al menos 5 aminoácidos consecutivos del polipéptido ECSM4. Por lo regular, los fragmentos poseen al menos 8 aminoácidos consecutivos, de preferencia, al menos 10, con mayor preferencia, al menos 12 ó 15 ó 20 ó 30 ó 40 ó 50 aminoácidos consecutivos del polipéptido ECSM4.

Los métodos para la detección de la presencia de fragmentos de péptidos derivados de polipéptidos mayores se conocen en la técnica.

Otro aspecto de la invención proporciona el uso, como se define en la Reivindicación 28, para la modulación de la angiogénesis en un individuo.

De preferencia, el fragmento de péptido o anticuerpo es tal que modula la actividad o función, ya sea directa o indirectamente, del polipéptido ECSM4 del individuo.

Los anticuerpos preferidos son los que se describieron con más detalles con anterioridad.

La producción de anticuerpos que modulan la función de un polipéptido expuesto en la superficie celular es conocida en la técnica y se discutió con más detalles con anterioridad. Dichos anticuerpos pueden modular la función mediante la imitación de la función del ligando natural y la estimulación del polipéptido para la actividad o función, o puede modular la función del polipéptido mediante la eliminación de la estimulación del polipéptido por el ligando mediante la obstrucción estérica del sitio de unión del ligando, evitando, de ese modo la unión del ligando natural.

La entrega de un ligando a la glorieta mágica puede resultar un inhibidor angiogénico útil en la terapia del cáncer u otras enfermedades que involucran la hiperangiogénesis. También, la introducción del polipéptido ECSM4 a las células endoteliales mediante terapia génica, empleando el polinucleótido que codifica para ECSM4 puede alterar el crecimiento y la migración.

Otro aspecto diferente de la invención proporciona un método para el diagnóstico de una dolencia que involucra el crecimiento aberrante o excesivo de edotelio vascular en un individuo que incluye la obtención de una muestra que contenga ácido nucleico del individuo y la puesta en contacto de dicha muestra con un polinucleótido que hibridiza selectivamente con un ácido nucleico que codifica para el polipéptido ECSM4 o una variante natural del mismo, como se define en la Reivindicación 27.

El método puede emplearse para asistir en el diagnóstico.

Una dolencia que involucra el crecimiento aberrante o excesivo del endotelio vascular, tal como el cáncer, la aterosclerosis, la restenosis, la retinopatía diabética, la artritis, la soriasis, la endometriosis, la menorragia, los hemangiomas y las malformaciones venosas puede ser causada por una mutación en el ácido nucleico que codifica para los polipéptidos ECSM1 o ECSM4.

El polinucleótido capaz de hibridizar de modo selectivo con un polinucleótido que codifica para el polipéptido ECSM4 o un fragmento o una variante del mismo es, de preferencia, de al menos 10 nucleótidos, con mayor preferencia de al menos 15 nucleótidos y con mayor preferencia aún de al menos 30 nucleótidos en longitud. Dicho polinucleótido puede tener más de 100 nucleótidos y puede tener más de 200 nucleótidos, pero de preferencia, dicho polinucleótido no tiene más de 250 nucleótidos. Tales polinucleótidos son útiles en procedimientos como instrumento de detección para demostrar la presencia del polinucleótido en una muestra. Tal muestra puede ser una muestra de ADN, tal como una colonia bacteriana, fija en una membrana o un filtro.

De preferencia, el polinucleótido que es capaz de hibridizar de modo selectivo como se ha descrito no es ninguna de las secuencias nucleotídicas representadas por ID SEC. No 18084 ó 5096 de EP 1 074 617, ID SEC. No 210 de WO 00 53756 o WO 99/46281, o ID. SEC. Nos 22, 23, 96 ó 98 de WO 01/23523 o ID. SEC. No. 31 de WO 99/11293.

Con el término "hibridizar selectivamente" queremos decir que el polinucleótido hibridiza bajo condiciones rigurosas. La hibridización ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN puede llevarse a cabo en solución acuosa conteniendo entre 0,1X SSC y 6X SSC y a temperaturas entre 55ºC y 70ºC. Es bien conocido en la técnica que mientras mayor sea la temperatura o menor la concentración de SSC más rigurosas son las condiciones de hibridización. Por "elevado rigor" entendemos 2X SSC y 65º . 1X SSC es NaCl 0,15M/citrato de sodio 0,015M. Los polinucleótidos que hibridizan con elevado rigor se incluyen dentro del alcance de la invención que se reivindica.

Por "hibridizar selectivamente" también se entiende que el ácido nucleico tiene suficiente similaridad de secuencia con dicho ADN o ADNc humano que le permite hibridizar bajo condiciones de alto rigor. Como es bien conocido en la técnica, el rigor de la hibridización de ácidos nucleicos depende de factores tales como la longitud de ácido nucleico sobre la que ocurre la hibridización, el grado de identidad de las secuencias que hibridizan y de factores tales como la temperatura, la fuerza iónica y el contenido GC o AT de la secuencia. Por tanto, cualquier ácido nucleico que es capaz de hibridizar selectivamente como se ha descrito resulta útil en la práctica de la invención.

Los ácidos nucleicos que pueden hibridizar selectivamente con dicho ADN o ADNc humano incluyen ácidos nucleicos que poseen una identidad de secuencia superior al 95%, de preferencia aquellos con más de 98%, con mayor preferencia aquellos con más de 99% de identidad de secuencia, al menos sobre una porción del ácido nucleico con dicho ADn o ADNc humano. Como es bien conocido los genes humanos usualmente contienen intrones de manera que, por ejemplo, un ARNm o ADNc derivado a partir de un gen dentro de dicho ADN humano no coincidirá perfectamente a lo largo de toda su longitud con dicho ADN humano pero será, sin embargo, un ácido nucleico capaz de hibridizar selectivamente con dicho ADN humano. Por tanto, la invención específicamente incluye ácidos nucleicos que pasan las fronteras intrón-exón del gen ECSM4 pero pueden no hibridar selectivamente con el ADNc de ECSM4.

Condiciones típicas de hibridización de elevado rigor que producen hibridización selectiva son conocidas en la técnica, por ejemplo, las descritas en Molecular Cloning, a laboratory manual, 2nd edition, Sambrook et al (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA.

Un ejemplo de una solución de hibridización típica cuando un ácido nucleico está inmovilizado en una membrana de nylon y la sonda de ácido nucleico tiene más de 500 bases o pares de bases es:

6X SSC (citrato de sodio salino)

0,5% de dodecil sulfato de sodio (SDS)

100 \mug/ml de ADN de semen de salmón fragmentado y desnaturalizado

La hibridización se lleva a cabo a 68ºC. La membrana de nylon, con el ácido nucleico inmovilizado puede lavarse a 68ºC, para elevado rigor, en SSC 0,1 x.

Se puede preparar SSC 20 x de la siguiente forma. Disuélvase 175,3 g de NaCl y 88,2 g de citrato de sodio en 800 ml de agua. Ajústese al pH a 7,0 con unas pocas gotas de una solución de NaOH 10 N. Ajústese el volumen a 1 litro con agua. Dispénsese en alícuotas. Esterilícese en una autoclave.

Un ejemplo de una solución típica de hibridización cuando se inmoviliza un ácido nucleico en una membrana de nylon y la sonda es un oligonucleótido de entre 15 y 50 bases es:

Cloruro de trometilamonio 3,0 M (TMAC1)

Fosfato de sodio 0,01 M (pH 6,8)

EDTA 1 mM (pH 7,6)

SDS 0,5%

ADN de semen de salmón desnaturalizado y fragmentado 100 \mug/ml

Leche en polvo descremada 0,1%

La temperatura óptima para la hibridización se selecciona, por lo regular, 5ºC por debajo de Ti, para la longitud de cadena dada. Ti es la temperatura de fusión irreversible del híbrido formado entre la sonda y su secuencia blanco. Jacobs et al (1988) Nucl. Acids Res. 16, 4637, discuten la determinación de Tis. La temperatura de hibridización recomendada para oligómeros de 17 nucleótidos en TMAC1 3M es 48-50ºC; para oligómeros de 19 nucleótidos es 55-57ºC; y para oligómeros de 20 nucleótidos, es 58-66ºC.

En el término "ácido nucleico que hibridiza de modo selectivo" se incluyen también ácidos nucleicos que amplificarán ADN proveniente de dicha región de ADN humano mediante cualquiera de los sistemas de amplificación bien conocidos, tales como los que se describen con más detalles más adelante, en particular, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las condiciones adecuadas para la amplificación por PCR incluyen la amplificación en un tampón de amplificación adecuado 1 x.

El tampón de amplificación 10 x contiene KCl 500 mM; TrisCl 100 mM, (pH 8,3 a temperatura ambiente); MgCl_{2} 15 mM; gelatina 0,1%.

Se emplea un procedimiento o agente de desnaturalización adecuado (tal como calentamiento a 95ºC) con el objetivo de separar las cadenas de ADN de doble cadena.

Adecuadamente, la parte de renaturalización de la amplificación se lleva a cabo entre 37ºC y 60ºC, de preferencia, a 50ºC.

Aunque el ácido nucleico que resulta útil en los métodos de la invención puede ser ARN o ADN, se prefiere ADN. Aunque el ácido nucleico que resulta útil en los métodos de la invención puede ser de doble cadena o de simple cadena, se prefiere el ácido nucleico de simple cadena bajo ciertas circunstancias, tal como en las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos.

Por tanto, el polinucleótido puede emplearse como cebador en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y en esta capacidad se prefiere un polinucleótido entre 15 y 30 nucleótidos. Se prefiere, en particular, que el cebador de PCR contenga alrededor de 15 a 30 nucleótidos contiguos (o sea, coincidencias perfectas) de la secuencia nucleótidica dada en la Figura 4 o la Figura 12.

Se prefiere el uso de cebadores adecuados para su empleo en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Saiki et al (1988) Science 239, 487-491). Los cebadores de PCR adecuados pueden tener las propiedades siguientes:

Es bien conocido que la secuencia del extremo 5' del oligonucleótido no debe coincidir necesariamente con la secuencia blanco para ser amplificada.

Es usual que los cebadores de PCR no contengan ninguna estructura complementaria uno con otro que se extienda por más de 2 bases, especialmente en sus extremos 3', ya que dicha característica puede estimular la formación de un producto artificial llamado "dímero cebador". Cuando los extremos 3' de los dos cebadores hibridizan, forman un complejo de "molde cebado", y la extensión del cebador da como resultado un producto dúplex corto llamado "dímero cebador".

Se debe evitar la formación de estructuras secundarias internas en los cebadores. Para un PCR simétrico, se recomienda con frecuencia un contenido G+C entre 40% y 60% para ambos cebadores, sin segmentos largos de una base determinada. Los cálculos clásicos de temperatura de fusión empleados de conjunto con los estudios de la hibridización de sondas de ADN predicen con frecuencia que un cebador determinado se unirá a una temperatura específica o que la temperatura de extensión de 72ºC disociará de forma prematura el híbrido cebador/molde. En la práctica, los híbridos resultan más efectivos en el proceso del PCR que lo que se predice por lo general por medio de cálculos de T_{m}.

Las temperaturas de hibridización óptimas pueden determinarse empíricamente y pueden resultar más altas que lo predicho. La ADN polimerasa Taq posee actividad en la región de 37ºC a 55ºC, de manera que ocurrirá extensión del cebador durante la etapa de hibridización y luego se estabilizará el híbrido. Las concentraciones del cebador son iguales en PCR convencionales (simétricos) y, por lo regular, caen en el rango de 0,1 a 1 nM.

Cuando se emplea un par de ácidos nucleicos adecuados de la invención en un PCR resulta conveniente detectar el producto mediante electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. Como alternativa para la detección del producto de la amplificación del ADN empleando electroforesis en gel de azarosa y tinción con bromuro de etidio del ADN, resulta conveniente emplear un oligonucleótido marcado capaz de hibridizar con el ADN amplificado como una sonda. Cuando la amplificación se realiza mediante PCR la sonda oligonucleotídica hibridiza con la secuencia intercebadora definida por los dos cebadores. La sonda puede marcarse con un radionúclido, tal como 32P, 33P y 35S empleando técnicas estándar, o puede marcarse con un pigmento fluorescente. Cuando la sonda oligonucleotídica se marca con fluorescencia, el producto de ADN amplificado puede detectarse en solución (ver, por ejemplo, Balaguer et al (1991) "Quantification of DNA sequences obtained by polymerase chain reaction using a bioluminescence adsorbent" Anal. Biochem. 195, 105-110 and Dilesare et al (1993) "A high-sensitivity electrochemiluminescence-based detection system for automated PCR product quantitation" BioTechniques 15, 152-157.

Los productos de PCR también pueden detectarse empleando una sonda que puede tener una pareja de reducción de fluoróforo o puede estar unida a un soporte sólido o puede tener una marca de biotina o puede detectarse empleando una combinación de una sonda de captura y una sonda de detección.

Los pares fluoróforo-apagador resultan particularmente adecuados para las mediciones cuantitativas de las reacciones de PCR (p.e., RT-PCR). La polarización de fluorescencia empleando una sonda adecuada puede emplearse también para detectar productos de PCR.

Los cebadores de oligonucleótidos pueden sintetizarse empleando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el empleo de química de fosforamidita de fase sólida.

Un cebador de polinucleótido u oligonucleótido de la invención puede contener una o más bases modificadas o puede contener un esqueleto modificado que haya sido modificado con fines de estabilidad o por otros motivos. En el término modificado incluimos, por ejemplo, bases tritiladas y bases poco frecuentes, como la inopina. Se pueden realizar diversas modificaciones al ADN y ARN y las mismas se encuentran incluidas en el alcance de la invención.

En una realización preferida, los polinucleótidos de la invención se encuentran marcados de manera que puedan ser detectados. Las marcas adecuadas para la detección se describieron con detalles anteriormente.

La muestra puede haberse obtenido directamente del paciente, por ejemplo, por medio de una biopsia de un tejido que puede estar asociado al desarrollo vascular aberrante, o puede haberse obtenido a partir del paciente, de un sitio alejado del tejido, por ejemplo, dado que las células del tejido hayan migrado desde el tejido hacia otras partes del organismo. Otra alternativa consiste en obtener la muestra de manera indirecta a partir del paciente, en el sentido de que, por ejemplo, el tejido o las células del mismo pueden cultivarse in vitro, o cultivarse en un modelo xenogénico; o la muestra de ácido nucleico puede ser una que se haya replicado (ya sea in vitro o in vivo) a partir del ácido nucleico original de la fuente original del paciente. Por tanto, aunque el ácido nucleico obtenido a partir del paciente puede haberse encontrado físicamente dentro del paciente, alternativamente, el mismo puede haberse copiado a partir del ácido nucleico que se encontraba físicamente dentro del paciente. Cuando se cree que existe crecimiento vascular aberrante relacionado con un tumor, se puede tomar tejido del tumor primario o de la metástasis.

Se constatará que un método útil de la invención incluye el análisis de mutaciones en, o la detección de presencia o ausencia de ECSM4 en cualquier fuente apropiada. La muestra puede, adecuadamente, ser una muestra obtenida fresca a partir de un paciente, o la muestra puede ser una muestra histórica, por ejemplo, una muestra guardada en una biblioteca de muestras.

Convenientemente, el ácido nucleico, capaz de hibridizar de manera selectiva con dicho ADN humano y que se emplea en los métodos de la invención, contiene también una marca detectable.

En el término "marca detectable" se incluye cualquier marca radiactiva conveniente, tal como 32P, 33P o 35S que pueden incorporarse fácilmente a la molécula de ácido nucleico empleando métodos bien conocidos; también se incluye cualquier marca fluorescente o quimioluminiscente que pueda incorporarse fácilmente al ácido nucleico. Además, el término "marca detectable" también incluye una unidad que puede detectarse por medio de la unión a otra unidad (tal como la biotina, que puede detectarse mediante su unión a estreptavidina); y una unidad, tal como una enzima, que puede detectarse por medio de su capacidad de transformar un compuesto incoloro en un compuesto coloreado, o viceversa (por ejemplo, la fosfatasa alcalina puede convertir el o-nitrofenilfosfato incoloro en o-nitrofenol coloreado). Convenientemente, la sonda de ácido nucleico puede ocupar una cierta posición en un ensayo fijo y el hecho de si el ácido nucleico hibridiza con dicha región de ADN humano puede determinarse con referencia a la posición de la hibridización en el ensayo fijo. La marca detectable puede ser también un par fluoróforo-apagador, como se describe en Tyagi & Kramer (1996) Nature Biotechnology 14, 303-308.

Por conveniencia, en este método de diagnóstico de una dolencia en la que el desarrollo vascular es aberrante el ácido nucleico capaz de dicha hibridización selectiva (ya sea que esté marcado con una sonda detectable o no) se pone en contacto con el ácido nucleico obtenido a partir del paciente, bajo condiciones de hibridización. Las condiciones apropiadas de hibridización incluyen las que se describieron con anterioridad.

Este método de diagnóstico de una dolencia en la que el desarrollo vascular es aberrante puede incluir la secuenciación de ADN en una o más posiciones importantes dentro de la región relevante, incluyendo la secuenciación directa; la secuenciación directa de los exones amplificados por PCR; la hibridización diferencial de una sonda oligonucleotídica diseñada para hibridizar en las posiciones relevantes dentro de la región relevante (por conveniencia, esto usa sondas de oligonucleótidos inmovilizadas en un así llamado sistema "chip" que es bien conocido en la técnica); la electroforesis desnaturalizante en gel a continuación de la digestión con una enzima de restricción adecuada, de preferencia después de la amplificación de las regiones de ADN relevantes; el análisis de secuencia con nucleasa S1; electroforesis no desnaturalizante en gel, de preferencia después de la amplificación de las regiones de ADN relevantes; ensayos de RFLP convencionales (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción); análisis de heterodúplex; amplificación selectiva de ADN empleando oligonucleótidos; hibridización fluorescente in situ (FISH) de cromosomas interfásicos; ARMS-PCR (Sistema de PCR de amplificación de mutaciones refractarias) para mutaciones específicas; ruptura en sitios de errores en los ácidos nucleicos hibridizados (con ruptura de tipo químico o enzimático); polimorfismo conformacional de simple cadena (SSCP) o DGGE (electroforesis en gel con gradiente discontinuo o desnaturalizante); análisis para detectar errores en el pareamiento en la hibridización de cadenas de ADN normal/mutante amplificadas por PCR; y ensayos de proteínas truncadas (traducción y transcripción de exones: si una mutación introduce un codón de parada el resultado será una proteína truncada). Pueden emplearse otros métodos tales como la detección de cambios en la estructura secundaria de ADN simple cadena que son resultados de cambios en la secuencia primaria, por ejemplo, empleando la enzima clivasa I. Este sistema se encuentra disponible comercialmente a partir de GibcoBRL, Life Technologies, 3 Fountain Drive, Inchinnan Business Park, Paisley PA4 9RF, Scotland.

Podrá apreciarse que los métodos de la invención pueden aplicarse también sobre "chips de ADN". Dichos "chips" se describen en US 5.445.934 (Affymetrix; arreglos de sonda), WO 96/31622 (Oxford; arreglos de sonda más ligasa o extensión por polimerasa), y WO 95/22058 (Affymax; blancos marcados con fluorescencia se unen a sustratos oligoméricos, y se detecta la localización en el arreglo).

Métodos detallados de detección de mutaciones se describen en "Laboratory Protocols for Mutation Detection" 1996, ed. Landegren, Oxford University Press, para HUGO (Organización del Genoma Humano).

Se prefiere el empleo de RFLP para la detección de deleciones o inserciones más bien largas (\geq 500pb). Se puede emplear Southern blot para este método de la invención.

La amplificación por PCR de regiones más pequeñas (hasta 300pb) para detectar cambios pequeños mayores que inserciones o deleciones de 3-4 pb puede ser preferida. La secuencia amplificada puede analizarse en un gel de secuenciación, y pueden visualizarse pequeños cambios (tamaño mínimo 3-4 pb). Los cebadores apropiados se diseñan como se describe en el presente documento.

Además, se pueden detectar sitios de variación para las enzimas de restricción mediante el empleo de análisis de Southern blot o PCR. Por ejemplo, para el análisis de los sitios de variación en la digestión de ADN genómico con enzimas de restricción, la electroforesis en gel, el Southern blot, y la hibridización de sondas específicas (por ejemplo, cualquier fragmento adecuado derivado de el ADNc o el gen de ECSM4).

Por ejemplo, para el análisis de sitios de variación empleando la aplicación de ADN mediante PCR, al digestión con enzimas de restricción, la detección en el gel mediante bromuro de etidio, la tinción con plata o la incorporación de radionucleótidos o cebadores fluorescentes en el PCR.

Otros métodos adecuados incluyen el desarrollo de oligonucleótidos alelo específicos (ASOs) para eventos mutacionales específicos. Se emplean métodos similares en ARN o ADNc para el tejido adecuado.

En tanto resulta útil la detección de mutaciones en cualquier lugar del gen ECSM4, se prefiere que las mutaciones se detecten en los exones del gen y se prefiere además que las mutaciones sean del tipo que cambia el sentido codificado. La detección de estas mutaciones constituye un aspecto preferido de la invención.

Los métodos de la invención también incluyen el chequeo de la pérdida de heterocigosidad (LOH; muestra una copia perdida). LOH puede constituir un marcador suficiente para el diagnóstico; la búsqueda de mutaciones/pérdida de segundo alelo puede no resultar necesaria. La LOH del gen puede detectarse empleando polimorfismos de la secuencia codificadora, e intrones, del gen.

Ácidos nucleicos particularmente preferidos para su empleo en los métodos antes mencionados de la invención son aquellos que se seleccionan a partir de un grupo constituido por los cebadores adecuados para la amplificación de ácidos nucleicos.

Adecuadamente, los cebadores se seleccionan a partir del grupo constituido por los cebadores que hibridizan con las secuencias nucleotídicas mostradas en cualquiera de las Figuras que muestran las secuencias del gen o el ADNc ECSM4 humano. Se prefiere de manera particular que los cebadores hibridicen con los intrones del gen ECSM4 o que los cebadores sean tales que ceben la síntesis del ADN a partir del gen o el ADNc ECSM4, pero no a partir de otros genes o ADNc.

Los cebadores que son adecuados para su empleo en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Saiki et al (1988) Science 239, 487-491) se prefieren. Los cebadores de PCR adecuados y los métodos para detectar los productos de las reacciones de PCR se describen con detalles más arriba.

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Cualquiera de los protocolos de amplificación de ácidos nucleicos puede emplearse en el método de la invención, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa, la reacción en cadena de la QB replicasa y la ligasa. También se puede emplear NASBA (amplificación basada en la secuencia de los ácidos nucleicos), también llamada 3SR, como se describe en Compton (1991) Nature 350, 91-92 and AIDS (1993), Vol 7 (Suppl 2), S108 o SDA (amplificación de desplazamiento de cadena), como se describe en Walker et al (1992) Nucl. Acids Res. 20, 1691-1696. La reacción en cadena de la polimerasa es particularmente preferida, por su simplicidad.

La presente invención proporciona el uso de un ácido nucelico que hibridiza de manera selectiva con el ADN derivado de humanos de clones genómicos, como se describe en la Tabla 8 del Ejemplo 1, o de ECSM4, o de un alelo mutante de la misma, o un ácido nucleico que hibridiza de forma selectiva con el ADNc de ECSM4, o un alelo mutante del mismo, o su complemento en un método de diagnóstico de una dolencia en la que el desarrollo vascular es aberrante, o en la fabricación de un reactivo para llevar a cabo dichos métodos.

Los polinucleótidos preferidos que se unen de forma selectiva al gen o ADNc de ECSM4 son los que se describen más arriba en relación con un método de diagnóstico.

Además, la presente invención proporciona un método para la determinación de la presencia o ausencia de, o una mutación en, dicho gen ECSM4. De preferencia, el método emplea una muestra adecuada obtenida a partir de un paciente.

Los métodos de la invención incluyen la detección de mutaciones en el gen ECSM4.

Los métodos de la invención pueden hacer uso de una diferencia en los sitios de corte de una enzima de restricción, causada por una mutación. Un gel no desnaturalizante puede emplearse para detectar las diferencias de tamaño de fragmentos resultantes de la digestión con una enzima de restricción adecuada.

Una "enzima de restricción adecuada" es aquella que reconoce y corta la secuencia de tipo salvaje y no la secuencia mutada, o viceversa. La secuencia que es reconocida y cortada por la enzima de restricción (o no, como puede ser el caso) puede estar presente como consecuencia de la mutación o puede introducirse en el alelo normal o mutante empleando oligonucleótidos con fallas en la hibridización en la reacción de PCR. Es conveniente que la enzima corte el ADN solo de manera poco frecuente, o sea, que reconozca una secuencia que aparece solo en raras
ocasiones.

En otro método, se emplea un par de cebadores de PCR que concuerda (o sea, hibridiza) ya sea con el genotipo de tipo salvaje, o con el genotipo mutante, pero no con ambos. Si el ADN amplificado se produce ello indicará el genotipo de tipo salvaje o mutante (y por tanto el fenotipo correspondiente). Sin embargo, este método se basa, parcialmente en un resultado negativo (o sea, la ausencia de ADN amplificado) lo que puede deberse a fallas técnicas. Por tanto, el mismo debe ser menos confiable y/o requerir experimentos de control adicionales.

Un método preferible emplea cebadores de PCR similares pero, al mismo tiempo que la hibridización con una sola de las secuencias de tipo salvaje o mutante, introduce un sitio de restricción que no se encontraba antes en la secuencia de tipos mutante o salvaje.

Los ácidos nucleicos que hibridizan de forma selectiva con el gen o ADNc de ECSM4, o que hibridizan de manera selectiva con clones genómicos que contienen ECSM4 se listan en la Tabla 8 del Ejemplo 1 y son útiles para un número de propósitos. Pueden emplearse en la hibridización de Southern con el ADN genómico y en el método de protección de ARNasa para la detección de mutaciones puntuales ya discutidas anteriormente. Las sondas pueden emplearse para detectar los productos de amplificación de PCR. También pueden emplearse para detectar errores de pareamiento con el gen o el ARNm de ECSM4 en una muestra empleando otras técnicas. Los errores de pareamiento pueden detectarse empleando ya sea enzimas (por ejemplo, nucleasa S1 o resolvasa), agentes químicos (por ejemplo, hidroxilamina o tetróxido de osmio y piperidina), o cambios en la movilidad electroforética de los híbridos mal pareados, en comparación con los híbridos que parean perfectamente. Estas técnicas son conocidas en la técnica. En general las sondas son complementarias con las secuencias codificantes del gen ECSM4, aunque también se contemplan sondas para ciertos intrones. Se puede emplear una batería de sondas de ácidos nucleicos para componer un equipo para la detección, pérdida de, o mutación en el gen ECSM4 de tipo salvaje. El paquete permite la hibridización de la totalidad del gen ECSM4. Las sondas pueden sobrelaparse mutuamente o ser contiguas.

Si se emplea una ribosonda para detectar errores de pareamiento con el ARNm, la misma es complementaria con el ARNm del gen ECSM4 humano. La ribosonda, por tanto, es una sonda antisentido por el hecho de que no codifica para la proteína codificada por el gen ECSM4, porque tiene polaridad opuesta a la de la cadena codificadora. La ribosonda, por lo general estará marcada, por ejemplo, radiactivamente, lo que puede lograrse por cualquier medio conocido en la técnica. Si se emplea la ribosonda para detectar errores de pareamiento con el ADN. La misma puede ser de cualquier polaridad, sentido o antisentido. Igualmente, las sondas de ADN pueden emplearse también para detectar errores de pareamiento.

Las sondas de ácidos nucleicos pueden también ser complementarias a alelos mutantes del gen ECSM4. Las mismas son útiles para detectar mutaciones similares en otros pacientes, sobre la base de la hibridización, y no sobre la base de los errores de pareamiento. Como se mencionó con anterioridad, las sondas del gen ECSM4 pueden emplearse también en hibridizaciones de Southern con ADN genómico, para detectar cambios gruesos en el cromosoma, tales como deleciones e inserciones.

Métodos particularmente útiles para detectar una mutación en el gen ECSM4 incluyen el polimorfismo de conformación de simple cadena (SSCP), análisis de heterodúplex, reacción en cadena de la polimerasa, empleando chips de ADN y secuenciación.

Cualquier muestra que contenga un ácido nucleico obtenido de un individuo resulta útil en los métodos de la invención. Se prefiere que el ácido nucleico en la muestra sea ADN. De este modo, muestras tomadas de células pueden obtenerse de la forma que es bien conocida en la técnica, por ejemplo, a partir de muestras de sangre o células tomadas de la cavidad bucal, o similares. Cuando los métodos se emplean para determinar la presencia o ausencia de una mutación en un feto, se prefiere que la muestra sea una muestra materna que contenga ácido nucleico del feto. Las muestras maternas adecuadas incluyen el fluido amniótico de la madre, muestras de villus coriónico y muestras de sangre de las que puedan obtenerse células fetales.

Otro aspecto de la invención proporciona el uso de un ácido nucleico antisentido, que evita de manera selectiva la expresión de ECSM4 en la preparación de un medicamento que reduce la expresión del polinucleótido ECSM4 humano en un individuo, como se define en la Reivindicación 29.

De preferencia, el ácido nucleico antisentido no es (o no es antisentido de) uno de aquellos cuyas secuencias son las secuencias representadas por la ID SEC No 18084 o 5096 de EP 1 074 617, ID SEC No 210 de WO 00/53756 o WO 99/46281, o ID SEC Nos 22, 23, 96 o 98 de WO 01/23523 o ID SEC No 31 de WO 99/11293 o sus complementos, o una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido, cuya secuencia aminoacídica se representa por cualquiera de los ID SEC No 18085 de EP 1 074 617, ID SEC No 211 de WO 00/53756 o WO99/46281, ID SEC Nos 24-27, 29, 30, 33, 34, 38 o 39 de WO 01/23523, o ID SEC No 86 de WO 99/11293.

Otro aspecto de la misma incluye la administración de un ácido nucleico antisentido a una célula con le objetivo de evitar la expresión de ECSM4.

El polinucleótido ECSM4 que se une a una molécula antisentido puede ser ADN o ARN.

Las moléculas antisentido preferidas son las que se describen más arriba.

Las enfermedades que pueden tratarse mediante la reducción de la expresión de ECSM4 incluyen enfermedades que involucran la vascularización aberrante o excesiva, como se describió más arriba.

Los ácidos nucleicos antisentido son bien conocidos en la técnica y son, por lo general, ácidos nucleicos de simple cadena, que pueden unirse de manera específica a una secuencia de ADN complementaria. Mediante la unión a la secuencia blanco apropiada, se forma un dúplex ARN-ARN, ADN-ADN, o ARN-ADN. A estos ácidos nucleicos por lo regular se les conoce con el nombre de "antisentido" porque son complementarios a las cadenas codificadoras o sentido de los genes. Recientemente, se ha demostrado que resulta posible la formación de triple hélices, en las que el oligonucleótido se une a un ADN dúplex. Se ha encontrado que los oligonucleótidos pueden reconocer secuencias en el surco mayor de un ADN de doble hélice, De esta manera se forma una triple hélice. Esto sugiere la posibilidad de sintetizar moléculas secuencia-específicas que se unan de forma específica a un ADN doble cadena mediante el reconocimiento de sitios de unión en el surco mayor.

Mediante la unión al ácido nucleico blanco, los oligonucleótidos anteriores pueden inhibir la función del ácido nucleico blanco. Esto podría ser el resultado, por ejemplo, de un bloqueo de la transcripción, el procesamiento, la adición de poliA, la replicación, la traducción, o la estimulación de mecanismos inhibitorios en las células, tales como la estimulación de la degradación de ARN.

Los oligonucleótidos antisentido se preparan en el laboratorio y luego se introducen en las células, por ejemplo, mediante microinyección o toma por las células del cultivo celular; o se expresan en las células mediante transfección con plásmidos o retrovirus u otros vectores que contengan el gen antisentido. Los oligonucleótidos antisentido se descubrieron por primera vez en la inhibición de la replicación viral o la expresión en cultivo de células del virus de sarcoma de Rous, el virus de la estomatitis vesicular, el virus de herpes simple tipo 1, el virus de simios y el virus de influenza. Desde entonces, la inhibición de la traducción de RNAm por medio de oligonucleótidos antisentido se ha estudiado de modo extensivo en sistemas libres de células incluyendo los lisados de reticulocitos de conejo y los extractos de germen de trigo. Se ha demostrado la existencia de la inhibición de funciones virales por oligonucleótidos antisentido in vitro empleando oliginucleótidos que eran complementarios al ARN del retrovirus VIH del SIDA (Goodchild, J. 1988 "Inhibition of Human Immunodeficiency Virus Replication by Antisense Oligodeoxynucleotides", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85 (15), 5507-11). El estudio de Goodchild mostró que los oligonucleíotidos que eran más efectivos eran complementarios a la señal de poliA; también eran efectivos los dirigidos al extremo 5' del ARN, en particular a la caperuza y la región 5' no traducida, contigua al sitio de unión del cebador y en el sitio de unión del cebador. La caperuza, la región 5' no traducida, y la señal de poliA están contenidas dentro de una secuencia repetida en los extremos del ARN retroviral (región R) y los oligonucleótidos complementarios a las mismas pueden unirse por partida doble al ARN.

Por lo regular, los oligonucleótidos antisentido tienen una longitud de entre 15 y 35 bases. Por ejemplo, se ha demostrado que oligonucleótidos de 20 nucleótidos inhiben la expresión del RNAm del receptor del factor de crecimiento epidérmico (Witters et al, Breast Cancer Res Treat 53: 41-50 (1999)) y se ha demostrado que oligonucleótidos de 25 nucleótidos disminuyen la expresión de la hormona adrenocorticotrópica en más de 90% (Frankel et al, J Neurosurg 91:#261-7 (1999)). Sin embrago, se conoce que puede resultar deseable el empleo de oligonucleótidos con longitudes que caigan fuera de este rango, por ejemplo, 10, 11, 12, 13 ó 14 bases, ó 36, 37, 38, 39, ó 40 bases.

Los oligonucleótidos se encuentran sujetos a la posible degradación o inactivación por las nucleasas celulares endógenas. Para contrarrestar este problema, es posible emplear oligonucleótidos modificados, o sea, que poseen alterados los enlaces internucleotídicos, en que los enlaces fosfodiéster que ocurren de manera natural han sido remplazados por otros enlaces. Por ejemplo, Agrawal et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083 mostraron el incremento de la inhibición en cultivo de tejido de VIH-1 empleandofosforamidatos y fosforotioatos de oligonucleótidos. Sarin et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7451 demostraron el incremento de la inhibición de VIH-1 usando metilfosfonatos de oligonucleótidos. Leither et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3430-3434 reportaron la existencia de inhibición en cultivo de tejidos de la replicación del virus de la influenza por medio de fosforotioatos de oligonucleótidos.

Se ha demostrado que los oligonucleótidos que poseen enlaces artificiales son resistentes a la degradación in vivo. Por ejemplo, Shaw et al (1991) in Nucleic Acids Res. 19, 747-750, reportan que nucleótidos de otro modo no modificados se hacen más resistentes a la nuclesas in vivo cuando se les bloquea el extremo 3' mediante ciertas estructuras de caperuza y que los fosforotioatos de oligonucleótidos no son degradados in vivo.

Una descripción detallada de la estrategia del H-fosfonato para la síntesis de fosforotioatos de oligonucleótidos la proporcionan Agrawal and Tang (1990) Tetrahedron Letters 31, 7541-7544. La síntesis de metilfosfonatos, fosforotioatos, fosforamidatos, ésteres fosfato, fosforamidatos puenteados y fosforotioatos puenteados de oligonucleósidos es conocida en la técnica. Ver, por ejemplo, Agrawal and Goodchild (1987) Tetrahedron Letters 28, 3539; Nielsen et al (1988) Tetrahedron Letters 29, 2911; Jager et al (1988) Biochemistry 27, 7237; Uznanski et al (1987) Tetrahedron Letters 28, 3401; Bannwarth (1988) Helv. Chim. Acta. 71, 1517; Crosstick and Vyle (1989) Tetrahedron Letters 30, 4693; Agrawal et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1401-1405. Otros métodos para la síntesis o producción son también posibles. En una realización preferida, el oligonucleótido es un ácido desoxirribonucleico (ADN), aunque también se pueden sintetizar y aplicar secuencias de ácido ribonucleico (ARN).

Los oligonucleótidos útiles en la invención de preferencia se diseñan para resistir la degradación por parte de enzimas nucleolíticas endógenas. La degradación in vivo de oligonucleótidos produce productos de ruptura de oligonucleótidos de tamaño reducido. Tales productos de ruptura tienen mayor probabilidad de formar parte de hibridizaciones no específicas y tienen menor probabilidad de ser efectivos que sus contrapartes de tamaño completo. Por tanto, resulta deseable el empleo de oligonucleótidos que sean resistentes a la degradación en el organismo y que sean capaces de alcanzar las células blanco. Los oligonucleótidos presentes pueden hacerse más resistentes a la degradación in vivo mediante la sustitución de uno o más enlaces internucleotídicos artificiales por los enlaces fosfodiéster nativos, por ejemplo, mediante el reemplazo de fosfato por azufre en el enlace. Ejemplos de enlaces que pueden emplearse incluyen los fosforotioatos, los metilfosfonatos, sulfota, sulfato, cetilo, fosforoditioatos, varios fosforamidatos, ésteres fosfato, fosforotioatos puenteados y fosforamidatos puenteados. Tales ejemplos son ilustrativos, más que limitantes, dado que se conocen en la técnica otros enlaces internucleotídicos. Ver, por ejemplo, Cohen, (1990) Trends in Biotechnology. La síntesis de oligonucleótidos que poseen uno o más de estos enlaces que sustituyen el enlace fosfodiéster internucleotídico es bien conocida en la técnica, incluyendo rutas de síntesis para la producción de oligonucleótidos que poseen una mezcla de enlaces internucleotídicos.

Los oligonucleótidos pueden hacerse resistentes a la extensión por enzimas endógenas mediante la introducción de una "caperuza" o la incorporación de grupos similares en los nucleótidos terminales 3' ó 5'. Un reactivo para la introducción de caperuza se encuentra disponible comercialmente como Amino-Link II TM, a partir de Applied BioSystems Inc, Foster City, CA. Los métodos para la introducción de caperuzas se describen, por ejemplo, en Shaw et al (1991) Nucleic Acids Res. 19, 747-750 and Agrawal et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88 (17), 7595-7599.

Otro método para incrementar la resistencia de los oligonucleótidos al ataque de las nucleasas se hacerlos "auto estables", como se describe en Tang et al (1993) Nucl. Acids Res. 21, 2729-2735. Los oligonucleótidos auto estables poseen estructuras de tallo anillo en sus extremos 3', y muestran una resistencia incrementada a la degradación por la fosfodiesterasa de veneno de serpiente, la ADN polimerasa I y el suero fetal bovino. La región de auto estabilización del oligonucleótido no interfiere con la hibridización con el ácido nucleico complementario y los estudios de farmacocinética y estabilidad en ratones han mostrado el incremento de la persistencia in vivo de los oligonucleótidos auto estabilizados con respecto a sus contrapartes lineales.

De acuerdo con la invención, el medicamento que contiene el compuesto antisentido puede ser para la administración sistémica. De manera alternativa, la especificidad inherente de unión de oligonucleótidos antisentido que es característica del pareamiento de bases se incrementa al limitar la disponibilidad del compuesto antisentido en su localización in vivo, permitiendo el empleo de dosis menores y minimizando los efectos sistémicos. Por tanto, los oligonucleótidos pueden aplicarse localmente para alcanzar el efecto deseado. La concentración de los oligonucleótidos en el lugar deseado es mucho mayor que la que se obtiene si los oligonucleótidos hubieran sido administrados de forma sistémica, y el efecto terapéutico puede alcanzarse empleando una cantidad total que sea significativamente menor. La alta concentración local de oligionucleótidos incrementa la penetración de las células blanco y bloquea de manera efectiva la traducción de las secuencias de ácidos nucleicos blanco.

Los oligonucleótidos pueden ser para su suministro al lugar por cualquier medio apropiado para la administración localizada de una droga. Por ejemplo, una solución de oligonucleótidos puede ser para la inyección directa en el sitio o puede ser para el suministro por infusión, mediante el empleo de una bomba de infusión. Los oligonucleótidos también pueden incorporarse en un dispositivo implantable el que, al situarse en el sitio deseado, permite que el oligonucleótido sea liberado a los lugares vecinos.

Los oligonucleótidos pueden ser formulados para la administración a través de material de hidrogel. El hidrogel es no inflamatorio y biodegradable. Muchos materiales de este tipo son conocidos, incluyendo algunos fabricados a partir de polímeros naturales y sintéticos. En una realización preferida, el método explota un hidrogel que es líquido a una temperatura por debajo de la corporal, pero gelifica para formar un hidrogel semisólido que mantiene la forma a temperatura corporal o cerca de la misma. Los hidrogeles preferidos son polímeros de unidades repetitivas de óxido de etileno-óxido de propileno. Las propiedades del polímero dependen del peso molecular del polímero y el porcentaje relativo de óxido de polietileno y óxido de polipropileno en el polímero. Los hidrogeles preferidos contienen desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 80% en peso de óxido de etileno y desde aproximadamente 20% hasta aproximadamente 90% en peso de óxido de polipropileno. Un hidrogel particularmente preferido contiene alrededor de 70% de óxido de polietileno y 30% de óxido de polipropileno. Los hidrogeles que pueden emplearse están disponibles, por ejemplo, a partir de BASF Corp., Parsippany, NJ, bajo la marca Pluronic^{R}.

En esta realización, el hidrogel se enfría a un estado líquido y los oligonucleótidos se mezclan en el líquido a una concentración de aproximadamente 1 mg de oligonucleótido por gramo de hidrogel. La mezcla resultante es luego aplicada sobre la superficie que será tratada, por ejemplo, mediante spray o pintura durante cirugía o empleando un catéter o procedimientos endoscópicos. A medida que el polímero se calienta, se solidifica para formar el gel, y el oligonucleótido difunde hacia fuera del gel hacia las células circundantes, en un período de tiempo que está definido por la composición exacta del gel.

Se apreciará que los oligonucleótidos u otros agentes pueden administrarse a un paciente luego de la remoción quirúrgica de un tumor, por ejemplo, al área de la cual se ha extraído el tumor, y el tejido circundante, por ejemplo, empleando citoscopía para guiar la aplicación del oligonucleótido u otros agentes.

Los oligonucleótidos pueden formularse de manera tal que permitan su administración por medio de otros implantes que están disponibles comercialmente o descritos en la literatura científica, incluyendo liposomas, microcápsulas o dispositivos implantables. Por ejemplo, pueden emplearse implantes hechos de materiales biodegradables, como polianhidridos, poliortoésteres, ácido poliláctico y ácido poliglicólico, y copolímeros de los mismos, colágeno, y polímeros de proteínas, o materiales no biodegradables tales como acetato de etilén vinilo (EVAc), acetato de polivinilo, alcohol de etilén vinilo, y derivados de los mismos, para suministrar localmente los oligonucleótidos. Los oligonucleótidos pueden incorporarse al material mientras este se está polimerizando o solidificando, empleando técnicas de evaporación del solvente o fusión, o mezcla mecánica con el material. En una realización, los oligonucleótidos se mezclan en, o se aplican en, revestimientos para dispositivos implantables, tales como cuentas de sílica revestidas o catéteres.

La dosis de oligonucleótidos depende del tamaño de los oligonucleótidos y del propósito por el cual se le administra. En general, el rango se calcula sobre la base del área superficial a ser tratada. La dosis efectiva de oligonucleótido depende de alguna forma del tamaño y la composición química del oligonucleótido, pero por lo general, se encuentra en el rango de alrededor de 30 a 3000 \mug por centímetro cuadrado de área de superficie de tejido.

Los oligonucleótidos pueden ser para la administración sistémica al paciente tanto con propósitos terapéuticos como profilácticos. Los oligonucleótidos pueden formularse para la administración mediante cualquier método efectivo, por ejemplo, por vía parenteral (p.e., por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular) o por vía oral, nasal, o cualquier otro medio que permita que los oligonucleótidos accedan al torrente sanguíneo del paciente y circulen por él. Los oligonucleótidos administrados por vía sistémica de preferencia se administran además de los oligoncleótidos administrados localmente, pero también presentan utilidad en ausencia de la administración local. Una dosificación en el rango de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 gramos por administración a un humano adulto en general será efectivo para este propósito.

Se apreciará que los agentes antisentido también incluyen moléculas mayores que se unen a los mencionados ARNm o genes de ECSM4 y, de manera sustancial, evitan la expresión de dichos ARNm o genes de ECSM4 y de manera sustancial evitan la expresión de dicha proteína ECSM4. Por tanto, la expresión de una molécula antisentido que es sustancialmente complementaria a dicho ARNm de ECSM4 se contempla como parte de la invención.

Las mencionadas moléculas grandes pueden expresarse a partir de cualquier construcción genética, como se describe más adelante, y administradas al paciente. Por lo general, la construcción genética que expresa la molécula antisentido incluye al menos una porción del ADnc o el gen de dicho ECSM4 ligada operativamente a un promotor que puede expresar la molécula antisentido en una célula. Los promotores que pueden ser activos en células endoteliales se describen más adelante.

Aunque la construcción genética puede ser de ADN o ARN, se prefiere que sea de ADN.

De preferencia, la construcción genética se adapta para su administración a una célula humana.

Los medios y métodos para la introducción de una construcción genética a una célula de un organismo animal son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las construcciones de la invención pueden introducirse en células endoteliales en proliferación por cualquier método conveniente, por ejemplo, métodos que incluyen retrovirus, de manera que la construcción se inserta en el genoma de la célula endotelial. Por ejemplo, en Kuriyama et al (1991) Cell Struc. and Func. 16, 503-510 se administran retrovirus purificados. Los retrovirus proporcionan un medio potencial para la infección selectiva de células endoteliales en proliferación, porque solo pueden integrarse al genoma de células en división; la mayoría de las células endoteliales se encuentran en un estadio quiescente, no replicativo, del crecimiento celular o, al menos, se dividen con mucha menos rapidez que las células angiogénicas. Las construcciones de ADN retroviral que codifican para dichos agentes antisentido pueden fabricarse empleando métodos bien conocidos en la técnica. Para producir retrovirus activos a partir de estas construcciones resulta usual emplear una línea celular de empaquetamiento de psi2 ecotrópico crecida en medio Tagle modificado con Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FCS). La transfección de la línea celular es conveniente por coprecipitación con fosfato de calcio, y los transformantes estables se seleccionan por adición de G418 hasta una concentración final de 1 mg/ml (asumiendo que la construcción retroviral contiene un gen neoR). Las colonias independientes se aíslan y expanden y se elimina el sobrenadante del cultivo, se filtra a través de un filtro de tamaño de poro 0,45 \mum y se almacena a -70ºC. Para la introducción de los retrovirus en las células tumorales es conveniente inyectar directamente el sobrenadante retroviral, al cual se ha añadido Polibreno a 10 \mug/ml. Para los tumores que exceden los 10 mm de diámetro resulta apropiado inyectar entre 0,1 ml y 1 ml de sobrenadante retroviral; de preferencia, 0,5 ml.

Alternativamente, como describen Culver et al (1992) Science 256, 1550-1552, las células que producen retrovirus se inyectan al tejido específico. Las células productoras de retrovirus introducidas de esa manera se modifican para producir partículas del vector retroviral de manera activa, de manera que in situ dentro de la masa tumoral tenga lugar una producción continua del vector. De manera que, las células endoteliales en proliferación pueden transducirse de manera exitosa in vivo si se mezclan con células que producen vectores retrovirales.

Los retrovirus diseccionados también se encuentran disponibles para su empleo en la invención; por ejemplo, las secuencias que confieren afinidades de unión específicas pueden unirse a genes env virales preexistentes (see Miller & Vile (1995) Faseb J. 9, 190-199 para una revisión de este y otros vectores diseccionados para la terapia génica).

Otros métodos involucran la administración simple de la construcción en la célula para la expresión en la misma, ya sea por tiempo limitado o, después de la integración en el genoma, por un tiempo más prolongado. Un ejemplo de la última estrategia incluye liposomas (de preferencia, dirigidos a las células endoteliales), (Nässander et al (1992) Cancer Res. 52, 646-653).

Los inmunoliposomas (liposomas direccionados por anticuerpos) resultan especialmente útiles para el direccionamiento de tipos de células endoteliales que expresan en la superficie celular una proteína para la cual hay disponibles anticuerpos.

Otros métodos para la administración incluyen adenovirus que portan ADN externo por medio de un puente polilisina anticuerpo (ver Curiel Prog. Med. Virol. 40, 1-18) y conjugados de transferían con policationes como portadores (Wagner et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414). En el primero de estos métodos se forma un complejo anticuerpo-policatión con la construcción de ADN u otra construcción genética de la invención, en la que el anticuerpo es específico ya sea para el adenovirus de tipo salvaje o para una variante del adenovirus en la que se ha introducido una variante del epítope al que se une el anticuerpo. La unidad del policatión se une al ADN por medio de interacciones electrostáticas con el esqueleto de fosfato. El adenovirus, dado que contiene proteínas fibrilares y pentonas inalteradas, se internaliza dentro de la célula y lleva dentro de la célula, consigo, el ADN de la construcción de la invención. Se prefiere que el catión sea polilisina.

El ADN también puede administrarse mediante adenovirus en el que se presente dentro de la partícula de adenovirus, por ejemplo, como se describe más adelante.

En el segundo de estos métodos se emplea un sistema de entrega de ácido nucleico de alta eficiencia que emplea una endocitosis mediada por receptor para llevar las macromoléculas de ADN dentro de las células. Esto se logra por medio de la conjugación de la proteína transferían de transporte de hierro a policationes que se unen a los ácidos nucleicos. La transferían humana o su homólogo de pollo, conalbúmina, o combinaciones de las mismas que se unen de manera covalente a la pequeña proteína de unión a ADN protamina, o a polilisinas de diferentes tamaños, por medio de un enlace disulfuro. Estas moléculas de transferrina modificadas mantienen su capacidad de unirse a su receptor natural y mediar el transporte eficiente de hierro hacia la célula. Las moléculas de transferían-policatión forman complejos estables frente a la electroforesis con las construcciones de ADN u otras construcciones genéticas de la invención, con independencia de la talla del ácido nucleico (desde oligonucleótidos pequeños hasta ADN de 21 kilo pares de bases). Cuando los complejos de transferían-policatión y las construcciones de ADN u otras construcciones genéticas de la invención se suministran a las células endoteliales, se espera que haya un alto nivel de expresión de la construcción en las células.

El suministro de alta eficiencia mediado por receptor de las construcciones de ADN y otras construcciones genéticas de la invención empleando la actividad disruptora de endosoma de partículas de adenovirus deficientes o inactivadas químicamente producidas por los métodos de Cotten et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6094-6098 también pueden usarse. Esta estrategia parece descansar en el hecho de que los adenovirus se adaptan para permitir la liberación de su ADN desde un endosoma sin pasar por el lisosoma, y en presencia de, por ejemplo, transferrina unida a la construcción de ADN u otra construcción genética de la invención, la construcción es tomada por la célula por la misma vía que la partícula de adenovirus.

Esta estrategia tiene las ventajas de que no hay necesidad de emplear construcciones retrovirales complejas; no hay modificación permanente del genoma como ocurre con la infección retroviral; y el sistema de expresión direccionado está unido al sistema de suministro direccionado, lo que reduce la toxicidad a otros tipos celulares.

Puede resultar deseable prefundir de manera local un tumor con el vehículo adecuado de administración que contenga la construcción genética por un período de tiempo; de manera adicional o alternativa, el vehículo de administración o la construcción genética puede inyectarse directamente a los tumores accesibles.

Se apreciará que el "ADN desnudo" y el ADN acomplejado con lípidos neutrales o catiónicos puedes resultar también útiles para la introducción del ADN de la invención dentro de células del paciente a ser tratado. Las estrategias no virales para la terapia génica se describen en Ledley (1995) Human Gene Therapy 6, 1129-1144.

Sistemas de entrega direccionados de manera alternativa también se conocen, tales que el sistema de adenovirus modificado descrito en WO 94/10323 donde, por lo general, el ADN se aporta con el adenovirus, o la partícula de tipo adenovirus. Michael et al (1995) Gene Therapy 2, 660-668 describen modificaciones a adenovirus para añadir una unidad selectiva de células a una proteína fibrosa. Los adenovirus mutantes que se replican en células tumorales humanas carentes de p53, tales como las descritas en Bischoff et al (1996) Science 274, 373-376 son también útiles para la administración de la construcción genética de la invención a una célula. Por tanto, se apreciará que otro aspecto de la invención proporciona un virus o partícula de tipo viral que contiene una construcción genética de la invención. Otros virus o partículas virales adecuadas incluyen HSV, AAV, vaccinia y parvovirus.

Las construcciones genéticas empleadas en la invención pueden prepararse empleando métodos bien conocidos en la técnica.

La invención será ahora descrita con más detalles con referencia a los siguientes Ejemplos y Figuras.

Figura 1

Verificación experimental por PCR con transcripción reversa. Los candidatos a genes endoteliales específicos predichos mediante la combinación de la búsqueda por UniGene/EST y análisis diferencial xProfiler SAGE (Tabla 8) se ensayaron en busca de expresión en tres cultivos celulares endoteliales y nueve no endoteliales. Los cultivos endoteliales fueron los siguientes: HMVEC (células del endotelio microvascular humano), cultivo confluente de HUVEC (células del endotelio venoso umbilical humano) y cultivo proliferativo de HUVEC. Los cultivos no endoteliales fueron los siguientes: células del estroma endometrial normal (NES) cultivadas en normoxia y células del NES cultivadas en hipoxia, líneas celulares de carcinoma mamario MDA 453 y MDA 468, HeLa, fibroblastos FEK4 cultivados en normoxia y fibroblastos FEK4 cultivados en hipoxia, y SW480, HCT116, dos líneas celulares de epitelio colorrectal. ECSM1 mostró especificidad endotelial completa, mientras que la glorieta mágica/ECSM4 mostró una marcada preferencia por la expresión en el endotelio. Resulta interesante que aparentemente estos dos genes nuevos presentan mayor especificidad endotelial que el gen marcador específico del tejido endotelial: el factor de von Willebrand.

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Figura 2

Secuencia de contig generada con Phrap para ECSM1 y la secuencia aminoacídica del producto de su traducción. Los ESTs empleados para generar este contig se muestran en la Tabla 10.

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Figura 3

Transcripción/traducción in vitro de ECSM4. El ADNc que codifica para el ECSM4 de tamaño completo se clonó en un vector plasmídico pBluescript. Los plásmidos circular y digerido por Hindi se sometieron a transcripción/traducción in vitro empleando un sistema TNT T7 Quick de transcripción/traducción in vitro acoplado (Promega Corporation) que incorpora Metionina marcada con 35S según las instrucciones del fabricante. Los productos de reacción se resolvieron mediante SDS PAGE y se visualizaron por medio de una autorradiografía. El plásmido de luciferasa se empleó como control positivo de la reacción. Los números de la izquierda indican la posición de los marcadores de peso molecular, como referencia. El tamaño de la banda que denota ECSM4 es consistente con el peso molecular calculado del polipéptido de 118 kDa.

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Figura 4

ADNc y traducción computacional de GenBank AK000805 (ECSM4 humano/glorieta mágica).

Figura 5

Secuencia de contig generada mediante Phrap de ECSM4 humano (glorieta mágica) ESTs y traducción del polipéptido codificado. La secuencia de ADN se muestra en la orientación en que estaría el ADNc, que es opuesta a aquella en la que se generó originalmente. Los ESTs empleados para generar el contig se muestran en la Tabla 11. El inicio de la traducción en esta secuencia se encuentra en la posición 2 de la secuencia del contig, y el fin de la traducción está en la posición 948.

Figura 6

Un alineamiento del No. De Acceso AK000805 de GenBank ("sec. mágica") y Phrap ("hs. 111518") generó las secuencias de ácidos nucleicos del ECSM4 humano que se presentan en la Figura 4 y la Figura 5.

Figura 7

Secuencia nucleotídica y secuencia aminoacídica del contig ECSM4 de ratón.

Figura 8

Un alineamiento de las secuencias aminoacídicas de la proteína Robo1 de ratón ("T30805") y la ECSM4 humana ("pep. mágico").

Figura 9

Un alineamiento de las secuencias aminoacídicas de la proteína Robo1 de ratón ("T30805") y ECSM4 de ratón ("pep. mágico de ratón").

Figura 10

Un alineamiento de las secuencias aminoacídicas de las proteínas ECSM4 de humano ("pep. mágico") y ratón ("pep. mágico de ratón"). Los residuos en negrita indican secuencias bien conservadas. La secuencia de la proteína de ratón se muestra encima y la secuencia humana se muestra debajo.

Figura 11

Expresión de la glorieta mágica in vitro. (a) Análisis de protección de ribonucleasa. Encima, dos sondas para regiones diferentes (nucleótidos 1 a 355 y 3333 a 3679) de la glorieta mágica se emplearon en el análisis (mostrado a la izquierda y a la derecha). El ensayo de protección de ARNasa se llevó a cabo con el ARN pequeño nuclear U6 como control (mostrado debajo) (Maxwell et al (1999) Nature 399: 271). Líneas celulares humanas y aislamientos primarios: MRC-5, línea celular de fibroblastos, MCF-7, línea celular de carcinoma mamario. Neuro, SY-SH-5Y línea celular de neuroblastoma, HUVEC, aislamiento de endotelio venoso umbilical, HDMEC, aislamiento de endotelio microvascular dérmico y HMME2, línea celular de endotelio microvascular mamario. N, normoxia, H, hipoxia, P, proliferación, (b) Análisis de Western de lisados celulares. Una banda a aproximadamente 110 kD corresponde a MR y fue más fuerte en células expuestas a hipoxia durante 18 h. El experimento se repitió dos veces con resultados similares. La inmunotinción se llevó a cabo como se describe en Brown et al (2000) Cancer Res. 60: 6298. Se levantó anti suero policlonal en conejo contra los siguientes péptidos unidos a la hemocianina: aminoácidos 165-181 (LSQSPGAVPQALVAWRA) y 274-288 (DSVLTPEEVALCLEL) (anti-suero 1) o péptidos 311-320 (TYGYISVPTA) y 336-351 (KGGVLLCPPRPCLTPT) (anti-suero 2). Ambos anti sueros dieron resultados idénticos. Para los análisis de western, el anti suero fue purificado mediante afinidad en una columna "HP Hi-Trap activada por NHS" (Amersham) a la cual se unieron péptidos empleados para levantar el anti suero 1.

Figura 12

ADNc de ECSM4 humano de longitud completa y secuencia de la proteína codificada.

Figura 13

ADNc de ECSM4 de ratón (MuMR sec.) de longitud completa y secuencia de la proteína codificada.

Figura 14

Alineamiento de las secuencias aminoacídicas de la ECSM4 humana (encima) y de ratón (debajo).

Figura 15

Alineamiento de las secuencias de ADNc de ECSM4 de humano ("HuMR. sec"; encima) y ECSM4 de ratón ("MuMR. sec"; debajo).

Figura 16

Análisis de hibridización in situ de tejido placentario humano usando ECSM4 como sonda. Una vista de campo brillante con aumento de 10x de una sección fina de tejido placentario. La flecha indica un gran vaso sanguíneo.

Figura 17

Análisis de hibridización in situ de tejido placentario humano usando ECSM4 como sonda. Una ampliación mayor de la vista de campo brillante de la sección fina de tejido placentario mostrada en la Figura 16, centrada en el vaso sanguíneo. La flecha apunta a células endoteliales alrededor del lumen del vaso.

Figura 18

Análisis de hibridización in situ de tejido placentario humano usando ECSM4 como sonda. Una ampliación mayor de la vista de campo brillante de la sección fina de tejido placentario mostrada en la Figura 16, centrada en el vaso sanguíneo y mostrada aquí en campo oscuro. La flecha muestra tinción positiva de las células endoteliales alrededor del lumen del vaso.

Figura 19

Análisis de hibridización in situ de tejido metastático colorrectal y de hígado, empleando ECSM4 como sonda. Una vista de campo brillante de una sección de tejido metastático colorrectal y de hígado ampliada con objetivos de (A) 10x y (B) 20x. El área marcada por la frontera (circulando * A) muestra el tejido hepático normal. La flecha en (B) muestra uno de los vasos sanguíneos dentro del tejido del tumor metastático.

Figura 20

Análisis de hibridización in situ de tejido metastático colorrectal y de hígado, empleando ECSM4 como sonda. Esta es una vista de campo oscuro de una sección de tejido metastático colorrectal y de hígado ampliado con objetivos de (A) 10x y (B) 20x. El área marcada por la frontera (circulando *) muestra el tejido hepático normal. La flecha en (B) muestra uno de los vasos sanguíneos dentro del tejido del tumor metastático correspondiente al vaso mostrado en la Figura 19B. La expresión de ECSM4 está restringida a las células endoteliales de los vasos sanguíneos del tumor. Nótese que existe poca expresión en el tejido circundante normal (*).

Figura 21

Western Blot empleando el anticuerpo MGO-5 de ratón como anticuerpo primario. Las diluciones de los péptidos derivados de ECSM4, MR 165, MR 311, MR 366 y el polipéptido control Albúmina de Suero Bovino (BSA) se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS y se puntearon en una membrana de Immobilon P. Se empleó una sonda de anticuerpo MGO-5 para la gota y se visualizó empleando anticuerpo anti conejo unido a fosfatasa alcalina.

Figura 22

Inmunotinción de una sección de placenta congelada. Una sección fina congelada de placenta humana se analizó mediante inmunohistoquímica sin ningún anticuerpo primario (control negativo) y se visualizó empleando un anticuerpo anti conejo acoplado a fosfatasa alcalina. Se observa poca tinción de fondo.

Figura 23

Inmunotinción de una sección de placenta congelada. Una sección fina congelada de placenta humana se analizó mediante inmunohistoquímica empleando un anticuerpo primario que reconoce el Factor de von Willibrand (control positivo), y se visualizó empleando un anticuerpo secundario anti conejo unido a fosfatasa alcalina. Las flechas muestran altos niveles de expresión de vWF, restringidos a las células del endotelio vascular.

Figura 24

Inmunotinción de una sección de placenta congelada. Una sección fina congelada de placenta humana se analizó mediante inmunohistoquímica empleando MGO-5 (un anticuerpo policlonal de conejo levantado contra el péptido MR 165) como anticuerpo primario, y se visualizó empleando un anticuerpo secundario anti conejo unido a una fosfatasa alcalina. Las flechas muestran altos niveles de expresión de ECSM4 que están restringidos a las células del endotelio vascular. Nótese que el tejido circundante muestra poca tinción. La comparación don las Figuras 22 y 23 muestra que la expresión de ECSM4 está colocalizada con la de vWF, un conocido marcador de las células del endotelio vascular.

Figura 25

Análisis inmunohistoquímico de células HUVEC: Factor de von Willibrand (vWF). Las células HUVEC se inmovilizaron y analizaron por inmunohistoquímica empleando un anticuerpo que reconoce el Factor de von Willibrand (un marcador de células endoteliales) como anticuerpo primario y se visualizaron empleando un anticuerpo anto conejo unido a fosfatasa alcalina. Las flechas muestran la expresión de vWF en un subconjunto de células HUVEC.

Figura 26

Análisis inmunohistoquímico de células HUVEC empleando el anticuerpo MGO-7. Las células HUVEC se inmovilizaron y analizaron por inmunohistoquímica empleando el anticuerpo MGO-7 (un anticuerpo policlonal de ratón levantado contra los péptidos MR 311 y MR 336) como anticuerpo primario, y se visualizaron empleando un anticuerpo anti conejo unido a fosfatasa alcalina. Las flechas muestran la expresión de ECSM4 en un subconjunto de las células HUVEC. Nótese que la tinción está localizada, principalmente, en la superficie celular.

Figura 27 Expresión de la glorieta mágica in vivo

(A) Expresión de MR detectada por hibridización in situ en una arteriola placentaria (a) y vénula (b) (izquierda, campo brillante y derecha, campo oscuro). (c) Tinción inmunohistoquímica de la glorieta mágica en una arteriola placentaria. Izquierda, control del factor de von Willibrand y derecha, glorieta mágica. (B) Expresión de MR en endotelio de tumor. Ganglioglioma (a) x20 y (b) x50. Izquierda, campo brillante; derecha, campo oscuro. Las flechas resaltan un vaso que corre diagonalmente a través de la sección con un eritrocito dentro. Las células endoteliales son fuertemente positivas para la expresión de MR. El carcinoma papilar de vejiga (c) x20 y (d) x50. El núcleo vascular de la papila del tumor se muestra fuertemente positivo, en particular las células endoteliales "planas" indicadas por las flechas. Se generó una sonda antisentido de glorieta mágica empleando la polimerasa T3 a partir del clon IMAGE EST 1912098 (GenBank acc. AI278949). El plásmido se linealizó con EcoRI con anterioridad a la síntesis de la sonda. El análisis in situ se llevó a cabo entonces como se describe en Poulsom et al (1998) Eur. J. Histochemistry 42: 121-132.

Ejemplo 1 Clonaje in silico de nuevos genes específicos para el endotelio

Describimos el uso de dos estrategias independientes para el análisis de expresión diferencial combinado con la verificación experimental para la identificación de genes específicos o que se expresen de manera preferencial en el endotelio vascular.

La primera estrategia estuvo basada en el análisis de la expresión en grupos de EST en el índice de genes UniGene humano (Schuler et al, 1997). Se realizaron búsquedas recurrentes con hendiduras utilizando el BLAST (Altschul et al, 1997) con un muy alto rigor contra fragmentos expresados de secuencia (ESTs) divididos en dos grupos. Estos dos grupos incluyeron librerías de células endoteliales y no endoteliales derivadas de dbEST (Boguski et al, 1995). La segunda estrategia empleó una segunda herramienta de minería de datos: SAGEmap xProfiler. XProfiler es una herramienta en línea disponible gratuitamente, que forma parte del proyecto de anatomía del genoma del cáncer del NCBI (CGAP) (Strausberg et al, 1997, Cole et al, 1995). Aunque estas dos estrategias por sí solas produjeron un número desalentador de falsos positivos, cuando ambas se combinaron, las predicciones fueron excepcionalmente confiables y se identificaron dos nuevos candidatos de genes endoteliales específicos. Los ADNcs de longitud completa se han identificado en bases de datos de secuencia. Otro gen (conjunto EST) corresponde a una secuencia parcial de ADNc de un proyecto fr secuenciación de ADNc a gran escala y contiene una región de similaridad al dominio intracelular del homóloge 1 de la glorieta humana (ROBO1).

Pesquisaje de índice de genes UniGene/EST

Se extrajo un grupo de secuencias endoteliales y un grupo de secuencias no endoteliales utilizando el sistema de recuperación de secuencias (SRS) versión 5 a partir de dbEST. El grupo endotelial consistió en 11117 ESTs de nueve librerías endoteliales humanas (Tabla 1). El grupo no endotelial incluyó 173137 ESTs de 108 librerías de líneas celulares humanas y de tumores microdisectados (Tabla 2). Los ESTs se extrajeron de la versión de abril del 2000 de dbEST. Ficheros múltiples FASTA se convirtieron en una base de datos BLAST que permitiera búsquedas utilizando el programa pressdb. La tabla 3 muestra es estado de expresión de cinco genes específicos de células endoteliales conocidos en estos dos grupos.

Subsecuentemente, se buscó la secuencia representativa más larga en cada conjunto UniGene (UniGene Build #111 mayo del 2000, fichero múltiple FASTA hs.seq.uniq) utilizando un BLAST con muy alto rigor contra estos dos grupos. Si no se encontraron coincidencias para estas secuencias representativas, se usó el resto de las secuencias que pertenecía al conjunto (UniGene fichero múltiple-FASTA hs.seq) como secuencias de búsqueda del BLAST. Finalmente, se seleccionaron los conjuntos sin coincidencias en el grupo no endotelial y al menos una coincidencia en el grupo endotelial.

La optimización del valor E del BLAST fue crucial para el éxito de las búsquedas a nivel de identidad del BLAST. Un valor E demasiado alto hubiera producido parálogos de genes. Por otra parte, un valor E muy bajo (de alto rigor) hubiera producido muchos falsos negativos, por ejemplo, no se hubieran informado verdaderos positivos debido a errores de secuenciación en los datos de EST: Los ESTs son secuencias de un solo pase de secuenciación, hecho a gran escala y bajo costo y tienen una alta tasa de errores (Aaronson et al, 1996). En este trabajo, se utilizó un valor E de 10e-20 en las búsquedas contra el grupo de EST no endoteliales y un valor E de 10e-30 de más alto rigor en las búsquedas contra el grupo endotelial, más pequeño. Estos valores se consideraron óptimos después de una serie de búsquedas del BLAST de prueba.

Análisis diferencial de los datos SAGE y SAGEmap xProfiler

La segunda estrategia de minería de datos que se utilizó para la identificación de genes endoteliales específicos o preferentemente endoteliales nuevos fue la sustracción de la librería SAGE basada en la web (SAGEmap xProfiler: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE/sagexpsetup.cgi). Se compararon dos librerías SAGE endoteliales (SAGE_Duke_HMVEC y SAGE_Duke_HMVEC+VEGF con un total de 110790 secuencias) a veinticuatro librerías de líneas celulares no endoteliales, (la lista completa en la tabla 4, un total de 733461 secuencias). La tabla 5 muestra el estado de expresión de cinco genes endoteliales específicos conocidos: el factor von Willebrand (vWF), dos receptores del factor de crecimiento vascular endotelial: tirosina quinasa de tipo fins 1 (flt1) y receptor de dominio quinasa inserto (KDR), receptor tirosina quinasa de tipo tie (TIE1) y receptor tirosina quinasa de tipo tek (TIE2/TEK), en estos dos conjuntos SAGE.

Los datos combinados proporcionan predicciones altamente certeras

Se seleccionaron veinte genes conocidos en la búsqueda de UniGen/EST (Tabla 6). Estos genes no mostraban coincidencias en el conjunto no endotelial, y al menos una coincidencia en el conjunto endotelial. La lista contenía al menos cuatro genes específicos del endotelio: TIE1, TIE2/TEK, LYVE1, y multimerina, indicando aproximadamente 20% de exactitud de la predicción. Otros genes de la lista, aunque se encontraban, con certeza, expresados preferencialmente en las células endoteliales, podían no ser específicos del endotelio. Para aumentar la exactitud de la predicción decidimos combinar búsquedas de UniGen/EST con el análisis xPrifiler SAGE. La salida del xProfiler consistía en una lista de genes con diez veces más número de fragementos en el endotelio que en el conjunto no endotelial, ordenados de acuerdo con la certeza de la predicción. Se aplicó a esta lista un umbral de 90% de certeza. La Tabla 7 muestra de qué modo se combinaron los datos provenientes de las dos estrategias: Las búsquedas de nivel de identidad en el BLAST se llevaron a cabo con los ARNm (genes conocidos) o los contigo calculados mediante el Phrap (los grupos de EST que representaban genes nuevos) para investigar de qué modo estos genes se encontraban representados en los conjuntos endotelial y no endotelial. La verificación experimental que se llevó a cabo a continuación, mediante RT-PCR (Figura 1) demostró que la estrategia combinada tuvo un 100% de certeza, o sea, los genes en la lista de xProfiler que no poseían coincidencias en el conjunto de EST no endotelial y al menos una coincidencia en el conjunto endotelial era realmente específica del endotelio.

Discusión

Ha habido varios informes de análisis computacionales de transcriptosomas de tejidos. Por lo general, se construye un perfil de expresión, sobre la base del número de fragmentos asignados a un gen o clase de genes dados (Bernstein et al, 1996, Welle et al, 1999, Bortoluzzi et al, 2000). Se puede llevar a cabo un intento de identificar transcritos tejido específicos. Por ejemplo, Vasmatzis et al, (1997) describe tres genes nuevos que se expresan de modo exclusivo en la próstata mediante sustracción in silico de librerías de la colección dbEST. También se pueden emplear librerías de ADNc fabricadas con ese propósito. Se han identificado 10 candidatos de genes específicos de granulocitos por medio de análisis extensivo de secuencia de librerías de ADNc obtenidas a partir de granulocitos y muestras de otros 11 tejidos, específicamente, una línea celular de hepatocitos, hígado fetal, hígado infantil, hígado adulto, grasa subcutánea, grasa visceral, pulmón, mucosa del colon, queratinocitos, córnea y retina (Itoh et al, 1998).

Un análisis similar a la estrategia basada en dbEST, seguida por Vasmatzis et al, se complica por el hecho de que las células endoteliales están presentes en todos los tejidos del organismo y los EST endoteliales contaminan todas las librerías de tejidos. Para validar esto, empleamos tres genes específicos del endotelio bien conocidos: KDR, FLT1, y TIE-2 como interrogación para las búsquedas de BLAST contra dbEST. Los transcritos estaban presentes en una amplia gama de tejidos con múltiples coincidencias en tejidos muy vascularizados (p.e., placenta, retina), tejidos embrionarios (hígado, bazo) o infantiles (cerebro). Además, encontramos que la sustracción simple de las librerías de EST endoteliales contra todas las otras librerías de dbEST no fue capaz de identificar ningún gen específico (datos no mostrados).

Se emplearon dos tipos de datos de expresión muy diferentes en nuestros esfuerzos de minería de datos. La búsqueda de UniGen/EST se basó en las librerías de fragmentos de secuencia expresadas a partir de dbEST. Existen 9 librerías de endotelio humano en la versión actual de dbEST, con un número total de EST relativamente pequeño: 11117. Algunos genes endoteliales específicos bien conocidos no están representados en este conjunto de datos (tabla 3). Esta limitación aumentó nuestras preocupaciones de que genes con bajos niveles de expresión serían obviados en nuestro análisis. Por tanto, utilizamos otro tipo de datos de expresión computables: librerías CGAP SAGE. Los fragmentos SAGE son a veces llamados pequeños ESTs (usualmente 10-11 pb de longitud). Su principal ventaja es que pueden ser localizados dentro del ADNc de manera inequívoca: ellos están inmediatamente adyacentes al sitio de restricción 3' NlaIII. Aunque hay solo dos librerías CGAP SAGE endoteliales disponibles hasta el momento, estas contienen un total impresionante de \sim111000 fragmentos - un conjunto de datos aproximadamente 10 veces mayor que las \sim11117 secuencias en el conjunto de EST endoteliales. La estrategia combinada demostró ser muy exacta (tabla 8, figura 1) cuando se verificó por RT-PCR.

Reportamos aquí la identificación de dos nuevos genes endoteliales altamente específicos: molécula específica de célula endotelial 1 (ECSM1 - entrada UniGene Hs.13957) y glorieta mágica (entrada UniGene Hs.111518). Para un resumen abarcador de los datos disponibles de estos genes ver la tabla 8.

Nuestra estrategia combinada de minería de datos en conjunto con la verificación experimental es una herramienta de genómica funcional poderosa. Este tipo de análisis puede ser aplicado a muchos tipos celulares no solo a células endoteliales. El reto de identificar la función de los genes descubiertos perdura, pero las herramientas bioinformáticas como la genómica estructural, o las búsquedas por homología y de motivos pueden ofrecer conocimientos que pueden ser verificados experimentalmente.

En resumen, esta estrategia de pesquisaje ha permitido la identificación de nuevos genes específicos de células endoteliales y de genes conocidos cuya expresión no se conocía que fuera específica de células endoteliales. Esta identificación permite aumentar nuestro conocimiento de la biología de la célula endotelial y, además, proporciona nuevos blancos farmacéuticos para la imaginología, diagnóstico y tratamiento de dolencias médicas relacionadas con el endotelio.

Métodos Programas de PERL

Se generaron un número de programas en PERL para facilitar la recuperación de secuencias a gran escala, los envíos de búsquedas del BLAST, y el análisis automático de la salida del BLAST.

Recuperación de secuencias de bases de datos

Para la preparación de este informe se utilizaron ficheros UniGene almacenados localmente (Build #111, versión de mayo de 2000). Se puede acceder al sitio web UniGene en la URL: www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/, y se pueden descargar los ficheros UniGene del repositorio ftp: ftp://ncbi.nlm.nih.gov/repository/unigene/. Las secuencias representativas del subconjunto de humano de UniGene (el EST más largo dentro del conjunto) se almacenan en el fichero Hs.seq.uniq, mientras que todos los ESTs que pertenecen al conjunto se almacenan en un archivo separado llamado Hs.seq.

Las secuencias se extrajeron de la base de datos dbEST, a la que se accedió localmente en el centro HGMP utilizando el comando getz del sistema de recuperación de ficheros (SRS versión 5). Esto se realizó repetidamente utilizando un programa de PERL para todas las librerías en los subgrupos endoteliales y no endoteliales, y las secuencias se integraron en dos ficheros FASTA múltiples.

Criterio de selección para las librerías EST no endoteliales

La selección de 108 librerías dbEST no endoteliales fue fundamentalmente manual. Inicialmente, se realizó una búsqueda en la lista de todas las librerías dbEST disponibles (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/libs_{-}byorg.html) utilizando la palabra clave "células" y la frase "línea celular". Aunque esta búsqueda identificó la mayor cantidad de librerías, fue necesario añadir palabras clave adicionales para que la lista estuviese completa: "melanocito", "macrófago", "HeLa", "fibroblasto". En algunos casos, se consultó la descripción detallada de la librería para confirmar que la librería se había obtenido a partir de un cultivo primario o una línea celular. También añadimos cierto número de librerías de tumor microdisectado de CGAP. Para ello se empleó el navegador de librerías (disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CGAP/hTGI/lbrow/cgaplb.cgi) para buscar la palabra "microdisectado".

Pesquisaje del índice de genes UniGen

El índice de transcritos de gen UniGen se pesquisó contra la división EST de GenBank, dbEST. Tanto UniGen como dbEST fueron desarrollados por el Centro Nacional de Información sobre Biotecnología (NCBI). UniGen es una colección de grupos de EST que corresponden a probables genes únicos. Actualmente consta de cuatro conjuntos de datos: humano, ratón, rata y pez cebra. El conjunto de datos humanos está compuesto, aproximadamente, por 90 000 grupos (UniGene Build #111 May 2000). Por medio de búsquedas de identidad muy rigurosas mediante BLAST, intentamos identificar los genes de UniGen que poseen transcritos en el endotelio y que no poseen transcritos en las librerías de dbEST de células no endoteliales. En el curso del proyecto se empleó como implementación del BLAST el blast2 de la Universidad de Washington, que es una versión del BLAST que admite la introducción de hendiduras. El valor-E se fijó en 10e-20 en las búsquedas contra el conjunto de EST no endoteliales y en 10e-30 en las búsquedas contra el conjunto endotelial de menor tamaño.

Aunque UniGen no proporciona secuencias consenso de sus grupos, se identifica la secuencia de mayor longitud dentro del grupo. Por tanto, esta secuencia de mayor longitud, representativa (fichero multi FASTA Hs.seq.uniq) se empleó para la búsqueda de BLAST empleando condiciones muy rigurosas contra los conjuntos de EST endoteliales y no endoteliales. Si dicha secuencia representativa no encontró ninguna coincidencia, el resto de las secuencias del grupo (fichero multi FASTA UniGen Hs.seq) se utilizó a continuación para la búsqueda del BLAST. Por último, los grupos sin coincidencias en el conjunto no endotelial y con al menos una coincidencia en el conjunto endotelial se seleccionaron empleando programas de PERL que analizaban el texto de las salidas del BLAST.

Sustracción xProfiler SAGE

xProfiler permite a un usuario en línea llevar a cabo una comparación diferencial de cualquier combinación de cuarenta y siete análisis seriados de librerías de expresión génica (SAGE) con un total de aproximadamente 2 300 000 fragmentos de SAGE empleando un algoritmo estadístico dedicado (Chen et al, 1998). Puede accederse a xProfiler en http://www.ncbi.n1m.nih.gov/SAGE/sagexpsetup.cgi. SAGE es una tecnología de expresión cuantitativa en la que los genes se identifican, por lo general, por un fragmento de secuencia de 10 ú 11 pb adyacente al sitio de restricción de NIaIII más cercano al extremo 3' del ADNc (Velculescu et al, 1995).

Las dos librerías disponibles de células endoteliales (SAGE_Duke_HMVEC y SAGE_Duke_HMVEC+VEGF) definieron el conjunto A y 24 librerías no endoteliales (ver Tabla 4 para una lista) definieron el conjunto B. La estrategia se verificó mediante la verificación del estado de expresión de los cinco genes específicos del endotelio que sirvieron como referencia en los dos conjuntos SAGE (Tabla 5) empleando un mapeo de Gen a Fragmento (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE/SAGEcid.cgi). A continuación, se empleó el xProfiler para seleccionar los genes con expresión diferencial entre los conjuntos A y B. La salida del xProfiler consistió en una lista de genes con una diferencia de diez veces en el número de fragmentos encontrados en el conjunto endotelial con respecto al conjunto no endotelial, ordenados de acuerdo con la certeza de la predicción. Se aplicó un umbral de 90% de certeza a esta lista.

La otra herramienta de análisis de expresión diferencial en línea de CGAP, la Muestra Diferencial Digital (DDD) se basa en los datos de expresión de EST (información de librería fuente) en lugar de emplear los fragmentos de SAGE. Intentamos emplear esta herramienta de modo similar al mapeo de SAGE xProfiler, pero no hemos logrado obtener resultados útiles. Cinco de las nueve librerías endoteliales y sesenta y cuatro de ciento ocho librerías no endoteliales empleadas en nuestra estrategia orientada a BLAST estaban disponibles para análisis en línea empleando DDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CGAP/info/ddd.cgi). Cuando se llevó a cabo dicho análisis los quince genes con mayor puntuación fueron los siguientes: anexina A2, actina gamma 1, proteína ribosomal grande P0, inhibidor del activador de plasminógeno tipo I, timosina beta 4, peptidiloprolil isomerasa A, proteína ribosomal L13a, receptor de laminina 1 (proteína ribosomal SA), factor 1 alfa 1 de elongación de la traducción en eucariontes, vimentina, polipéptido pesado de ferritina, proteína ribosomal L3, proteína ribosomal S18, proteína ribosomal L19, proteína tumoral1 controlada traduccionalmente. Esta lista era bastante sorprendente; no incluía ninguno de los genes específicos del endotelio bien conocidos, no presentaba ningún sobrelapamiento con los resultados de SAGE (Tabla 8), y contenía muchos genes que, en la literatura están reportados como ubicuos en su expresión (proteínas ribosomales, actina, vimetina, ferritina). Una ventaja importante de nuestra búsqueda de UniGen/EST es que, en lugar de basarse en datos de las librerías fuente y algoritmos falibles de agrupamiento de los EST en realidad lleva a cabo comparaciones de identidad mediante el BLAST, en la búsqueda de transcritos que correspondan a un gen.

Minería de datos en los grupos de UniGen

Para acceder rápidamente a la información acerca de las entradas de UniGen (p.e., referencias a la literatura, sitios de STS, homólogos, referencias a la función) se emplean de manera rutinaria recursos en línea: las interfaces de UniGene y LocusLink del NCBI y la base de datos Online Mendelian Inheritance in Man.

Los EST en los grupos de UniGen no se ensamblan en contigo, de manera que antes de los análisis de secuencia se crearon contigo empleando el ensamblador phrap (para documentación acerca de phrap ver http://bozeman.mbt.
washington.edu/phrap.does/phrap.ht3nl).

Para el análisis del contig genómico AC005795 (44 399 pb) que contenía ECSM1, se empleó la interfaz NIX de Internet para análisis de múltiples aplicaciones en grandes secuencias de nucleótidos desconocidas. Para mayor información con respecto a NIX ver http://www.hgmp.mrc.ac.uk/NIX/. El alineamiento de ECSM1 contra AC005795 se obtuvo empleando la interfaz del NCBI a la Interfaz del Genoma Humano: el Visor del Mapa NCBI. Para más información sobre el Visor del Mapa del NCBI ver http://www.ncbi.nmi.nih.gov/genome/guide/.

Para buscar posibles dominios de transmembrana y secuencias señal en secuencias de nucleótidos traducidas se emplearon tres aplicaciones basadas en Internet: DAS http://www.biokemi.su.se/\simserver/DAS/ (Cserzo et al, 1997), TopPred2 http://www.biokemi.su.se/-server/toppred2/ (Heijne 1992), y SignalP http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ (Nielsen et al, 1997).

Programas de PERL

Se generó una cantidad de programas de PERL para facilitar la recuperación a gran escala de secuencias, el envío de los BLAST y el análisis automático de la salida de los BLAST.

Verificación experimental

Para verificar experimentalmente la especificidad de la expresión empleamos la reversotranscripción acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Se extrajo el ARN de tres líneas celulares endoteliales y siete no endoteliales, cultivadas in vitro. Los cultivos endoteliales fueron los siguientes: HMVEC (células de endotelio microvascular humano), HUVEC (células de endotelio venoso umbilical) cultivo confluente y cultivo proliferativo de HUVEC. Los cultivos no endoteliales fueron los siguientes: células estromales endometriales normales (NES) cultivadas en normoxia y NES cultivadas en hipoxia, líneas celulares de carcinoma mamario MDA 453 y MDA 468, HeLa, fibroblastos FEK4 cultivados en normoxia y fibroblastos FEK4 cultivados en hipoxia, y SW480, HCT116: dos líneas celulares de epitelio colorrectal.

Si estaba disponible un sitio de secuencia fragmentada (STS) se emplearon cebadores de PCR de dbSTS y se siguieron las condiciones de ciclo de PCR sugeridas en la entrada de dbSTS. De lo contrario, se diseñaron cebadores empleando el programa Primer3. Los cebadores se listan en la Tabla 9.

Medios de cultivo de tejidos, extracción de ARN y síntesis de ADNc

Se cultivaron las líneas celulares in vitro, de acuerdo con los protocolos estándar de cultivo de tejidos. En particular, se suplementó el medio de las células endoteliales con ECGS (suplemento de crecimiento de células endoteliales, Sigma), y heparina (Sigma) para estimular el crecimiento. Se extrajo el ARN total empleando el Minikit RNeasy (Qiagen) y se sintetizó el ADNc empleando el paquete de síntesis de la primera hebra Reverse-IT (ABgene).

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TABLA 1 Nueve librerías de endotelio humano de dbEST

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TABLA 2 Librerías dbEST no endoteliales

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TABLA 3 Cinco genes que se conoce que son genes endoteliales específicos en el grupo de dbEST

El número de ESTs en el grupo endotelial es relativamente pequeño (\sim11,117) y no todos los genes endoteliales conocidos se encuentran representados.

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TABLA 4 Veinticuatro librerías SAGE-CGAP de células no endoteliales

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TABLA 5 Cinco genes endoteliales específicos conocidos en los grupos CGAP SAGE

TIE1 y TIE2/TEK tienen múltiples coincidencias en el grupo no endotelial (la mayoría en líneas celulares normales o de carcinoma de origen ovárico). vWF es el más específico endotelial con 80 coincidencias en el grupo endotelial y solo una coincidencia en el grupo no endotelial.

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TABLA 6 Resultados del pesquisaje UniGene/EST

Se seleccionaron veinte genes conocidos en el pesquisaje UniGene/EST (sin coincidencias en el grupo no endotelial y como mínimo una coincidencia en el grupo endotelial). Al menos cuatro de estos genes se conoce que son genes endoteliales específicos: TIE1, TIE2/TEK, LYVE1 y multimerina, lo que indica \sim20% de exactitud de la predicción. Otros genes, aunque ciertamente se expresan de modo preferencial en las células endoteliales, pueden no ser genes endoteliales específicos.

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TABLA 7 El análisis diferencial de xProfiler se combinó con datos obtenidos del pesquisaje UniGen/EST, logrando un 100% de certeza de predicción

La salida de xProfiler lista genes con 10 veces más fragmentos en el conjunto endotelial que en el conjunto no endotelial de las librerías SAGE-CGAP. Las coincidencias que corresponden a estos genes en los conjuntos de EST endoteliales y no endoteliales se identificaron mediante búsquedas de niveles de identidad, mediante BLAST para encontrar ARNm (genes conocidos) o secuencias de contig ensambladas mediante phrap (grupos de EST que representan nuevos genes). Los genes se ordenan de acuerdo con el número de coincidencias en el conjunto de EST no endotelial. Los genes endoteliales específicos conocidos y predichos nuevos se encuentran en negrita.

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TABLA 8 Resumen de la información disponible sobre la glorieta mágica

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TABLA 9

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TABLA 10

Los ESTs que pertenecen a la secuencia del contig de ECSM1 son los siguientes:

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TABLA 11

ESTs dentro de la secuencia de la glorieta mágica:

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TABLA 12 110 ESTs en el grupo de la glorieta mágica de ratón (Mm.27782)

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Ejemplo 2 La expresión de ECSM4 está restringida a las células endoteliales

La hibridización in situ (ISH) de tejidos normal y tumoral mostró que la expresión de ECSM4 se encuentra restringida a células del endotelio vascular en los vasos angiogénicos de los adultos únicamente. El análisis de tejidos normales mostró que la expresión de ECSM4 se detecta en placenta humana y tejido fetal de cordón umbilical de 10,8 semanas de edad menstrual. Como se muestra en la Figura 16, la expresión de ECSM4 es altamente específica para las células del endotelio vascular de los vasos sanguíneos de la placenta. Además, la expresión estaba ausente a través de una gran cantidad de otros tejidos normales que se analizaron, incluyendo el hígado adulto, el cerebro y los grandes vasos, la próstata, el colon, el intestino delgado, el corazón, el ojo (coroide y esclerótica), el ovario, el estómago, las mamas, y la vejiga fetal, los testículos, los riñones (15,8 semanas) y el corazón fetal, los riñones, la glándula adrenal, el intestino (11,3 semanas), cerebro fetal (10,6 semanas) y ojo fetal (16,5 semanas) (datos no mostrados).

El análisis de ISH de las biopsias de metástasis de hígado y tejido colorrectal mostró que la expresión de ECSM4 se encontraba restringida a las células del endotelio vascular de los vasos tumorales únicamente (Figura 17 y 18). No se detectó expresión en el tejido circundante normal. Además, la expresión incrementada en la vecindad de los tejidos necróticos (Figura 18, el tejido necrótico se indica por medio de la señal brillante marcada *) es indicativa y consistente con la inducción de la expresión de ECSM4 por hipoxia. Como tal, ECSM4 puede ser un nuevo gen regulado por hipoxia.

El patrón de expresión altamente restringido de ECSM4 en los vasos angiogénicos en los tejidos normal y tumoral en los adultos es completamente consistente con el patrón de expresión selectivo a las células endoteliales por medio del análisis in silico descrito en el Ejemplo 1.

Métodos

Se obtuvieron bloques de tumores y tejidos embebidos en paraffin y fijados con formalina, de los archivos del grupo de Patologías Mamarias del Imperial Cancer Research Fund del Hospital Guys, Londres, Reino Unido. Se preparó una ribosonda antisentido para el ADNc ECSM4 para la localización específica del ARNm del ECSM4 por hibridización in situ. Los métodos para el pretratamiento, hibridización, lavado y enjuagues de las láminas en Ilford K5 para autoradiografía han sido descritos previamente (Poulsom, R., Longcroft, J. M., Jeffrey, R. E., Rogers, L., y Steel, J. H. (1998) Eur. J. Histochem. 42, 121-132). Las películas se expusieron de 7 a 15 días antes del revelado en Kodak D19 y la tinción opuesta con Giemsa. Se examinaron las secciones bajo las condiciones de campo oscuro de luz reflejada o convencionales (Olympus BH2 con epi-iluminación) bajo un objetivo de x5, x10 o x20 que permitió ver los granos de platas autorradiográficos individuales como objetos brillantes en un fondo oscuro.

Ejemplo 3 El polipéptido ECSM4 se detecta solo en células endoteliales

Se generaron anticuerpos capaces de unir selectivamente el polipéptido ECSM4 y se utilizaron en inmunohistoquímica para demostrar la presencia del polipéptido ECSM4 en un grupo de tipos celulares (figuras 21 a la 26). Las muestras de tejido se prepararon a través de técnicas estándares en las técnicas de inmunohistoquímica.

Generación de anticuerpos que reconocen al ECSM4

Se fusionaron los péptidos MR 165, MR 311 y MR 336 a hemocianina Keyhole Limpet (KLH) antes de la inmunización de conejos para la producción de anticuerpos policlonales. El anticuerpo MGO-5 se derivó de conejos inmunizados con el péptido MR 165, mientras que el MGO-7 se derivó de conejos inmunizados con una mezcla de MR 311 y MR 336. La secuencia de los péptidos utilizados para generar los anticuerpos policlonales se muestra debajo, con la referencia dentro de la secuencia de aminoácidos del ECSM4 humano de longitud completa, como se muestra en la figura 12.

MR 165 = LSQSPGAVPQALVAWRA (681-697)

MR 274 = DSVLTPEEVALCLEL (790-804)

MR 311 = TYGYISVPTA (827-836)

MR 336 = KGGVLLCPPRPCLTPT (852-867)

Ejemplo 4

Se utilizó la secuencia de EST de la glorieta mágica identificada en la búsqueda bioinformática de transcritos endoteliales específicos para aislar un ADNc de 3800 pares de bases de longitud a partir de una librería de ADNc de corazón humano. Una búsqueda utilizando cebadores específicos del gen mostró que el mismo estaba presente en librerías de corazón, cerebro fetal y adulto, hígado, pulmón, riñón, músculo, placenta e intestino delgado, pero ausente en leucocitos de sangre periférica, bazo y testículos. La mayor expresión estuvo en la librería de placenta. La comparación de la secuencia de la glorieta mágica a la de la glorieta reveló una proteína de transmembrana con homología en toda la secuencia de la proteína pero ausencia de algunos dominios extracelulares. Así, MR tiene dos dominios inmunoglobulina y dos dominios fibronectina en la porción extracelular comparada con cinco dominios inmunoglobulina y dos fibronectina en la porción extracelular de las glorietas neuronales específicas. Se identificó un dominio transmembrana a través de (i) la utilización de un programa de predicción de transmembrana PRED-TMR y (ii) la utilización de un alineamiento entre las secuencias de la MR humana y del péptido ROBO1 humano. Ambos métodos identificaron los mismos residuos correspondientes a la región de transmembrana de la MR humana, los aminoácidos 468-490. Por lo tanto, los aa 1-467 son extracelulares y los aa 491-1007 son intracelulares. El dominio intracelular contiene una región rica en prolina putative que es homóloga a aquellas en la glorieta que se piensa que se acoplan a c-abl (Bashaw et al (2000) Cell 101: 703-715).

Se mapeó el sitio de secuencia fragmentada (STS) del SHGC-11739 humano (GenBank acc. G14646) en el ARNm de la glorieta mágica en una búsqueda dbSTS del BLAST. Este STS se localizó en el cromosoma 11 en el mapa físico de Stanford G3 (región 5647.00 cR10000 LOD 1.09 bin 129). Sin embargo, falta gran cantidad de la secuencia y no se conoce la estructura genómica. La búsqueda en la base de datos RIKEN identificó la glorieta mágica murina. El peso molecular predicho del núcleo peptídico de la MR humana fue de 107457 kDa. Esto se confirmó por la traducción in vitro (figura 3).

Ejemplo 5 La expresión es detectable en los tumores

Se empleó la hibridización in situ para caracterizar la expresión de ECSM4 in vivo. Se encontró que la expresión de ECSM4 es muy restringida (Tabla 13), con una señal que no es detectable en muchos tejidos, incluyendo el tejido neuronal. Por el contrario, se detectó un fuerte expresión en placenta y en una gama de tumores, incluyendo los de cerebro, vejiga y metástasis del cáncer de colon en hígado (Figura 27). La expresión dentro de los tumores estuvo restringida a la vasculatura tumoral. La tinción inmunohistoquímica de la placenta confirmó la expresión endotelial específica de la proteína.

Una búsqueda de ECSM4 en librerías de CGAP SAGE la detectó únicamente en librerías endoteliales y de tumores (Tabla 14). Esto fue consistente con los resultados de la hibridización in situ en adultos, que mostró que la expresión estaba restringida a vasos tumorales (metástasis de cáncer de colon en hígado, ganglioglioma y carcinomas de vejiga y pulmón).

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TABLA 13 Expresión de la glorieta mágica en tejido humano in vivo

Expresión detectada

Placenta y tejido fetal de cordón umbilical (10,8 semanas de edad menstrual)

Vasos en métastasis en hígado de tumor colorrectal, ganglioglioma, vejiga y carcinoma mamario

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Expresión no detectada

Hígado de adulto, cerebro y vasos de gran calibre, próstata, solon, intestino delgado, corazón, coroide y esclerótica del ojo, ovario, estómago, mama

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TABLA 14 Librerías de CGAP SAGE en las que se encontró la glorieta mágica sobre la base del mapeo de fragmentos a genes

23

HMDEC, células endoteliales microvasculares dérmicas humanas; VEGF, factor de crecimiento endotelial vascular

Ejemplo 6 Inducción de ECSM4 en células endoteliales hipóxicas

El RT-PCR inicial detectó la expresión de ECSM4 en líneas celulares endoteliales, pero no en otras líneas celulares, tales como fibroblastos (endometrio normal y FEK4), carcinoma de colon (SW480 y HCT116), carcinoma mamario (MDA453 y MDA468) y células HeLa. El análisis de protección a ribonucleasa confirmó y extendió este resultado (Figura 11a). Se vio que la expresión de ECSM4 está restringida al endotelio (tres aislamientos diferentes) y ausente en los fibroblastos, las células de carcinoma y neuronas. La inducción de ECSM4 en hipoxia en células endoteliales (pero no en células no endoteliales) se observó cuando se analizó la expresión de ECSM4 usando dos sondas de protección de ARNasa diferentes. La expresión era, como promedio 5,5 y 2,6 veces superior en hipoxia para HUVEC y HDMEC respectivamente. El análisis de Western identificó una banda débil de 110 kD en las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMEC), pero que se encontraba ausente de los tipos celulares no endoteliales (Figura 11b). La banda era más intensa cuando las células HDMEC se exponían a 18 h de hipoxia, en consistencia con la hipótesis de que ECSM4 es un gen regulado mediante hipoxia.

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<110> Imperial Cancer Research Technology Limited

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<120> Imaginología diagnóstico y tratamiento de enfermedad

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<130> IMPW/P25480PC

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<140>

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<141>

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<160> 50

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido

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<210> 4

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido

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<400> 13

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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tgcagcttcc ttctcacctt

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20

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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tcacatcccc attcacactg

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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tgtaccatga ggttctcaat gc

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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20

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<210> 22

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 23

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28

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<210> 24

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<211> 465

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 24

31

32

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<210> 25

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<211> 2076

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 25

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33

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<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 314

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1046

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1023

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1271

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 205

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 417

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

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40

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 516

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<212> PRT

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<213> ¿Homo sapiens? O Mus musculus

\newpage

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<400> 32

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42

43

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 297

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

47

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

49

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3715

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

51

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1104

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

53

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3688

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

55

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3688

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

57

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1015

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

59

60

61

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1075

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

65

66

67

68

69

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

710

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip1cm

711

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\hskip1cm

712

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1005

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

72

73

74

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3651

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

76

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3607

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

78

79

Claims (29)

1. Uso de un compuesto que incluye (i) un anticuerpo que une selectivamente el polipéptido humano ECSM4 y (ii) una unidad fácilmente detectable, donde dicho ECSM4 humano es un polipéptido que existe de manera natural, que incluye una porción de 50 residuos aminoacídicos consecutivos de la secuencia polipeptídica de las Figuras 4 ó 5, o variantes naturales de la misma, en la fabricación de un agente para la imagenología de la vasculatura del cuerpo de un individuo.

2. Uso según la Reivindicación 1, en el que la vasculatura es neovasculatura.

3. Uso según la Reivindicación 1 ó 2, en el que la vasculatura es neovasculatura de cáncer.

4. Uso de un compuesto que incluye (i) un anticuerpo que une selectivamente el polipéptido humano ECSM4 y (ii) una unidad fácilmente detectable, donde dicho ECSM4 humano es un polipéptido que existe de manera natural, que incluye una porción de 50 residuos aminoacídicos consecutivos de la secuencia polipeptídica de las Figuras 4 ó 5, o variantes naturales de la misma, en la fabricación de un agente para el diagnóstico o pronóstico de una enfermedad relacionada con el endotelio vascular.

5. Uso según la Reivindicación 4, en el que la enfermada es cancer, soriasis, retinopatía diabética, aterosclerosis o menorragia.

6. Uso según cualquiera de las Reivindicaciones 1-5, en el que la unidad fácilmente detectable incluye un átomo radioactivo.

7. Uso según la Reivindicación 6, en el que el átomo radioactivo es tecnecio-99m o yodo-123.

8. Uso según cualquiera de las Reivindicaciones 1-5, en el que la unidad fácilmente detectable incluye una cantidad adecuada de uno cualquiera de yodo-123, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

9. Uso de un compuesto que incluye (i) un anticuerpo que une selectivamente el polipéptido humano ECSM4 y (ii) una unidad directa o indirectamente citotóxica, en el que dicho ECSM4 humano es un polipéptido que existe de manera natural, que incluye una porción de 50 residuos aminoacídicos consecutivos de la secuencia polipeptídica de las Figuras 4 ó 5, o variantes naturales de la misma, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad relacionada con el endotelio vascular.

10. Uso según la Reivindicación 9, en el que la unidad citotóxica es un agente quimoterapéutico directamente citotóxico.

11. Uso según la Reivindicación 9, en el que la unidad citotóxica es un polipéptido directamente citotóxico.

12. Uso según la Reivindicación 9, en el que la unidad citotóxica es una unidad que es capaz de convertir una prodroga relativamente no tóxica en una droga citotóxica.

13. Uso según la Reivindicación 9, en el que la unidad citotóxica es un radiosensibilizador.

14. Uso según la Reivindicación 9, en el que la unidad citotóxica incluye un ácido nucleico directamente citotóxico.

15. Uso según la Reivindicación 9, en el que la unidad citotóxica incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido directamente o indirectamente citotóxico.

16. Uso según la Reivindicación 9, en el que la unidad citotóxica incluye un átomo radioactivo.

17. Uso según la Reivindicación 16, en el que el átomo radioactivo es uno cualquiera entre fósforo-32, yodo-125, yodo-131, indio-111, renio-186, renio-188 o itrio-90.

18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 9-17, en el que la enfermedad es cáncer, soriasis, retinopatía diabética, aterosclerosis o menorragia.

19. Un método de detección de cualquier daño o activación endotelial, un tumor o neovasculatura de tumor, enfermedad cardíaca, endometriosis o aterosclerosis en un individuo, método que comprende la detección de la presencia de fragmentos de ECSM4 humano en una muestra de fluidos del individuo, en el que dicho ECSM4 humano es un polipéptido que existe de manera natural, que incluye una porción de 50 aminoácidos consecutivos de la secuencia polipéptidica de las Figuras 4 ó 5, o variantes naturales de la misma.

20. Un método de acuerdo con la Reivindicación 19, en el que la detección emplea un anticuerpo que se une de ma-
nera selectiva a la ECSM4 humana, o un compuesto como se define en cualquiera de las Reivindicaciones 1, 4 ó 6-8.

21. Un método de acuerdo con la Reivindicación 20, en el que el anticuerpo se une de forma selectiva a un polipéptido que contiene la secuencia aminoacídica localizada entre los residuos 1 y 467 de la secuencia polipéptidica de la Figura 12.

22. Un método de acuerdo con la Reivindicación 20, en el que el anticuerpo se une de forma selectiva a una cualquiera de las secuencias aminoacídicas GGDSLLGGRGSL, LLQPPARGHAHDGQALSTDL, EPQDYTEPVE, TAPGGQGAPWAEE o ERATQEPSEHGP.

23. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 20-22, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

24. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 20-23, en el que el anticuerpo se encuentra marcado de manera detectable.

25. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 19 a la 24, en el que el daño endotelial es diagnóstico de cáncer, enfermedad cardíaca, endometriosis o aterosclerosis en el individuo.

26. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 19 a la 25, en el que el individuo recibe tratamiento para el cáncer, enfermedad cardíaca, endometriosis o aterosclerosis y la cantidad de fragmentos de ECSM4 humano en la muestra se determina y se compara sea con (a) una muestra de un individuo que no padece de cáncer, enfermedad cardíaca, endometriosis o aterosclerosis y/o a (b) la cantidad en una muestra de un individuo previo al comienzo de dicho tratamiento, y la comparación indica la eficacia del tratamiento en el individuo.

27. Un método de diagnóstico de una enfermedad relacionada con un crecimiento excesivo o aberrante del endotelio vascular en un individuo que incluye el contacto de una muestra que contiene ácidos nucleicos del individuo con un polinucleótido que hibridiza bajo condiciones de alto rigor a un ácido nucleico que codifica para ECSM4 humano, en el que dicho ECSM4 humano es un polipéptido que existe de manera natural que incluye una porción de residuos de 50 aminoacídicos consecutivos de la secuencia polipeptídica de las Figuras 4 ó 5, o variantes naturales de la misma.

28. Uso del ECSM4 humano, o de un fragmento del mismo, o una variante del ECSM4 humano que tenga al menos 90% de identidad de secuencias con éste con éste, o un anticuerpo que se una selectivamente al ECSM4 humano, o un polinucleótido que sea capaz de expresar el ECSM4 humano o un fragmento, o una variante del mismo, o un polinucleótido que incluya un ácido nucleico antisentido ECSM4 humano, en la preparación de un medicamento para la modulación de la angiogénesis en un individuo, en el que dicho ECSM4 humano es un polipéptido que existe de manera natural que incluye una porción de 50 residuos aminoacídicos consecutivos de la secuencia polipeptídica de las Figuras 4 ó 5, o variantes naturales de la misma.

29. Uso de un ácido nucleico antisentido ECSM4 que impide selectivamente la expresión del polinucleótido ECSM4 humano, en el que dicho polinucleótido ECSM4 humano codifica para un polipéptido que existe de manera natural que incluye una porción de 50 residuos aminoacídicos consecutivos de la secuencia polipeptídica de las Figuras 4 ó 5, o variantes naturales de la misma, en la preparación de un medicamento para la reducción de la expresión del polinucleótido ECSM4 humano en un individuo.