PT1334194E - Imagiologia, diagnóstico e tratamento de doença - Google Patents

Description

ΕΡ 1 334 194/ΡΤ DESCRIÇÃO "Imagiologia, diagnóstico e tratamento de doença" 0 presente invento refere-se a genes cuja expressão é selectiva no endotélio e à utilização destes genes ou produtos génicos, ou de moléculas que se lhes ligam, em imagiologia, no diagnóstico e no tratamento de afecções que envolvem o endotélio vascular. 0 endotélio desempenha um papel central em muitos processos fisiológicos e patológicos e é um reconhecido local de transcrição excepcionalmente activo. Aproximadamente 1000 genes distintos são expressos numa célula endotelial. Em contraste, constatou-se que os glóbulos vermelhos expressam 8 genes, as plaquetas 22 genes e o músculo liso 127 genes separados (Adams et al, 1995). Os genes conhecidos específicos do endotélio atraem muita atenção tanto na comunidade de investigação fundamental como na comunidade clínica. Por exemplo, as tirosina-quinases específicas do endotélio - Tie, TIE2/TEK, KDR e fltl - são participantes cruciais na regulação da integridade vascular, nos processos inflamatórios mediados pelo endotélio e na angiogénese (Sato et al, 1993; Sato et al, 1995; Fong et al, 1995; Shalaby et al, 1995; Alello et al, 1995). A angiogénese é hoje amplamente reconhecida como sendo um processo limitante da velocidade para o crescimento de tumores sólidos. Ele também está implicado na formação de placas ateroscleróticas e na restenose. Finalmente, o endotélio desempenha um papel central no sistema complexo e dinâmico que regula a coagulação e a hemostase.

Dos muitos genes distintos expressos numa célula endotelial, nem todos são inteiramente selectivos da célula endotelial e, desta forma, os genes e os seus produtos, e as moléculas que se ligam a eles, não são geralmente úteis em imagiologia, no diagnóstico e no tratamento da doença. Assim, continua a existir a necessidade de dispor de moléculas específicas ou selectivas das células endoteliais.

Comunica-se aqui a identificação de dois genes extremamente selectivos do endotélio, que foram designados por: molécula específica de células endoteliais 1 (ECSMl) e 2 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ "magic roundabout" ("carrossel mágico") (molécula especifica de células endoteliais 4; ECSM4), embora o presente invento se refira unicamente a ECSM4. 0 termo ECSM4 é utilizado para indicar, como o contexto deixará claro, o ADNc e os polipéptidos codificados pelo gene. A ECSM4 é surpreendentemente especifica no seu perfil de expressão celular e revela uma selectividade para as células endoteliais similar ao marcador actualmente aceite na arte como sendo o melhor marcador de células endoteliais (factor de von Willebrand). Manifestamente, um nivel tão elevado de especificidade para as células endoteliais é não só inédito como inesperado. 0 clone de ADNc do "carrossel mágico" humano (ECSM4), possuindo uma ORF longa com mais de 417 aa (N.° acesso no GenBank AK000805) e que se encontra descrito em WO 99/46281 como uma sequência de 3716 nucleótidos, foi identificado através de pesquisas BLAST para o "contig" Hs.111518. Esta sequência é rica em prolinas e possui várias regiões de baixa complexidade de aminoácidos. Uma pesquisa BLAST em PRODOM (base de dados de famílias de proteínas do HGMP, Reino Unido) identificou uma região de homologia de 120 pb com o domínio citoplasmático conservado da família de receptores transmembranares envolvidos na orientação repulsiva de axónios (família de proteínas ROBOl DUTTl, E=4e-07). A homologia foi ampliada para 468 aa (E=1.3e-09) quando se efectuou uma análise mais rigorosa utilizando uma pesquisa SSEARCH (Smith & Waterman, 1981), embora a região de semelhança se encontrasse ainda limitada ao domínio citoplasmático. A família ROBOl, DUTTl compreende o homólogo 1 do "carrossel" humano (ROBOl), o gene DUTTl de ratinho e o gene ROBOl de rato (Kidd et al, 1998; Brose et al, 1999). Devido a esta região de homologia, o gene representado por Hs.111518 foi designado por "carrossel mágico" ("magic roundabout") (ECSM4). Adicionalmente, a pesquisa BLAST em SBASE (base de dados de domínios de proteínas do HGMP) sugeriu uma região de semelhança com o domínio do precursor intracelular da forma de domínio longo da molécula de adesão de células neurais (E=2e-ll). É de salientar que o verdadeiro produto proteico para o "carrossel mágico" é provavelmente maior que os 417 aa codificados no clone AK000805, uma vez que a ORF não possui nenhum limite evidente a montante e a comparação de tamanhos com o 3 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ "carrossel" humano 1 (1651 aa) sugere uma proteína muito maior. Isto é confirmado na Figura 3, que mostra que o produto de tradução do ECSM4 humano tem cerca de 118 kDa. Contudo, o ECSM4 é mais pequeno que os outros membros da família "carrossel", partilhando apenas dois dos cinco domínios Ig e dois dos três domínios fibronectina na região extracelular. Pensa-se que a região putativa intracelular rica em prolina, que é homóloga daquelas no "carrossel", acopla com c-abl. A Figura 12 ilustra a sequência completa de aminoácidos do ECSM4 humano (1105 aa), e a sequência do homólogo de ratinho está apresentada na Figura 13. As sequências nucleotídicas codificantes, que apresentam cerca de 99% de identidade com a sequência nucleotídica de ECSM4 apresentada na Figura 12, estão descritas em WO 99/11293 e WO 99/53051.

Sequências adicionais que apresentam homologia com o polipéptido ou a sequência polinucleotídica ECSM4 estão descritas em ΕΡ 1 074 617, WO 00/53756, WO 99/46281, WO 01/23523 e WO 99/11293. Contudo, nenhuma destas publicações refere que as sequências são expressas selectivamente no endotélio vascular, nem sugere que poderão ser assim expressas.

Recentemente, foram encontradas associações intrigantes entre os genes de diferenciação neuronal e as células endoteliais. Por exemplo, foi identificado um receptor neuronal para o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), a neuropilina 1 (Soker et ai, 1998). O VEGF era tradicionalmente considerado um factor de crescimento exclusivamente endotelial. Processos semelhantes à orientação dos axónios neuronais estão agora a ser implicados na orientação da migração das células endoteliais durante o desenvolvimento capilar angiogénico. Assim, os ligandos ephrinB e os receptores EphB estão envolvidos na demarcação dos domínios arteriais e venosos (Adams et ai, 1999). É possível que o "carrossel mágico" (ECSM4) seja um homólogo, específico do endotélio, do "carrossel" humano 1 envolvido na orientação repulsiva das células endoteliais, presumivelmente com um ligando diferente dado que a semelhança está contida na região citoplasmática, isto é, a região efectora, e é sabido que os receptores de orientação possuem uma arquitectura extremamente modular (Bashaw & Goodman, 1999) . 4 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Contudo, até ao momento, não houve qualquer referência à existência de um homólogo endotelial, nem ao facto do padrão de expressão do gene do "carrossel mágico" (ECSM4) estar restringido a células endoteliais, especialmente a células endoteliais angiogénicas, nem a qualquer função do polipéptido codificado. É de salientar que um resultado surpreendente da nossa análise de RT-PCR, descrita no Exemplo 1, foi o facto de o ECSM4 parecer apresentar uma especificidade endotelial (Fig. 1) comparável ao marcador endotelial clássico - o factor de von Willebrand (vWF). A expressão dos genes conhecidos específicos do endotélio geralmente não está 100% restringida à célula endotelial. Os resultados aqui apresentados ilustram a constatação bastante imprevista de que o ECSM4 não é expresso em níveis detectáveis (pelo menos utilizando os métodos descritos nos exemplos) em tipos de células diferentes de células endoteliais, dada a selectividade inferior a 100% dos marcadores conhecidos de células endoteliais. O ensaio de protecção da ribonuclease confirmou e expandiu esta observação (Figura 14a). Observou-se que a expressão de ECSM4 estava limitada ao endotélio (três isolados diferentes) e ausente dos fibroblastos, das células de carcinoma e das células neuronais. KDR e FLT1 são ambos expressos no tracto reprodutivo masculino e feminino: nas células espermatogénicas (Obermair et al, 1999), nos trofoblastos e na decídua (Clark et al, 1996) . Foi demonstrado que o KDR define as células estaminais hematopoiéticas (Ziegler et al, 1999) . O FLT1 também está presente nos monócitos. Além das células endoteliais, o factor de vWF é fortemente expresso nos megacariócitos (Sporn et al, 1985; Nichols et al, 1985) e, consequentemente, está presente nas plaquetas. De forma semelhante, a multimerina está presente tanto nas células endoteliais (Hayward et al, 1993) como nas plaquetas (Hayward et al, 1998) .

Em termos gerais, as células endoteliais e hematopoiéticas descendem dos mesmos precursores embrionários - os hemangioblastos - e muitos marcadores celulares são partilhados por estas duas linhagens celulares (para um artigo de revisão, consultar Suda et al, 2000) . Por esse motivo, a 5 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ constatação de que o ECSM4 não é expresso em células diferentes das do endotélio vascular é extremamente surpreendente. A determinação de genes cuja expressão é selectiva do endotélio vascular permite um direccionamento selectivo para estas células e, desta forma, a entrega específica de moléculas para imagiologia, diagnóstico, prognóstico, tratamento, prevenção e avaliação de terapias para condições associadas ao crescimento vascular normal ou aberrante. 0 presente invento refere-se aos métodos e utilizações definidos nas reivindicações 1 a 29 anexas. Os compostos que podem ser utilizados nos métodos e utilizações do presente invento incluem um composto compreendendo (i) um anticorpo que se liga selectivamente ao polipéptido ECSM4 e (ii) uma porção adicional. "Polipéptido ECSM4" inclui qualquer polipéptido de ocorrência natural, que compreende uma porção de 50 resíduos de aminoácidos consecutivos, ou suas variantes naturais, da sequência polipeptídica proporcionada na Figura 4 ou 5.

Preferencialmente, o anticorpo e a porção adicional estão ligados covalentemente. "Variantes naturais" incluem, por exemplo, as variantes alélicas. Normalmente, estas desviam-se da sequência proporcionada em apenas um, dois ou três, e tipicamente não mais de 10 ou 20 resíduos de aminoácidos. Normalmente, as variantes possuem substituições conservativas.

Preferencialmente, um anticorpo que se liga selectivamente a ECSM4 é um anticorpo que se liga selectivamente a um polipéptido com a sequência GGDSLLGGRGSL, LLQPPARGHAHDGQALSTDL, EPQDYTEPVE, TAPGGQGAPWAEE ou ERATQEPSEHGP ou uma sequência que se encontra localizada na porção extracelular de ECSM4. Tal como descrito em mais pormenor abaixo, estas sequências representam sequências de aminoácidos que apenas são encontradas no ECSM4 humano e não são encontradas na sequência polipeptídica ECSM4 de ratinho. 6 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Preferencialmente, ο anticorpo que se liga selectivamente a ECSM4 é um anticorpo que se liga a um polipéptido cuja sequência de aminoácidos compreende a sequência disponibilizada em qualquer uma das Figuras 4, 5 ou 12, ou uma sua variante natural, mas que não se liga ao polipéptido representado por qualquer uma das sequências SEQ ID No. 18085 de ΕΡ 1 074 617; SEQ ID No. 211 de WO 00/53756 ou de W0 99/46281; SEQ ID Nos. 24-27, 29, 30, 33, 34, 38 ou 39 de WO 01/23523; ou SEQ ID No. 86 de WO 99/11293; ou codificado por qualquer uma das sequências nucleotidicas representadas por SEQ ID No. 18084 ou 5096 de ΕΡ 1 074 617; SEQ ID No. 210 de WO 00 53756 ou de WO 99/46281; SEQ ID Nos. 22, 23, 96 ou 98 de WO 01/23523 e SEQ ID No. 31 de WO 99/11293. O termo "anticorpo" inclui não só as moléculas de imunoglobulina completas, mas também fragmentos destas como Fab, F(ab')2, Fv e outros fragmentos que conservam o local de ligação ao antigénio. De forma similar, o termo "anticorpo" inclui derivados geneticamente manipulados de anticorpos, como sejam as moléculas Fv de cadeia única (scFv) e os anticorpos de dominio (dAc). O termo também inclui moléculas semelhantes a anticorpos, que poderão ser produzidas utilizando técnicas de apresentação em fagos ou outras técnicas de selecção aleatória para moléculas que se ligam a ECSM4.

Os domínios variável pesado (VH) e variável leve (VL) do anticorpo estão envolvidos no reconhecimento do antigénio, um facto inicialmente reconhecido através de experiências precoces de digestão com protease. A confirmação adicional foi obtida por meio da "humanização" de anticorpos de roedor. Os domínios variáveis de origem roedora poderão ser fundidos com domínios constantes de origem humana, de forma que o anticorpo resultante retenha a especificidade antigénica do anticorpo parental de roedor (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 6851-6855). O facto de a especificidade antigénica ser conferida pelos domínios variáveis e ser independente dos domínios constantes é um conhecimento adquirido de experiências que envolvem a expressão em bactérias de fragmentos de anticorpos, todos eles contendo um ou mais domínios variáveis. Estas moléculas incluem moléculas similares a Fab (Better et al 7 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ (1988) Science 240, 1041); moléculas Fv (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); moléculas Fv de cadeia única (ScFv) em que os domínios associados VH e VL estão ligados através de um oligopéptido flexível (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 5879) e anticorpos de domínio único (dAb) compreendendo domínios V isolados (Ward et al (1989) Nature 341, 544). Uma análise geral das técnicas envolvidas na síntese de fragmentos de anticorpos que retêm os seus locais de ligação específicos pode ser encontrada em Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.

Por "moléculas de ScFv", pretendemos designar moléculas em que os domínios associados VH e VL estão ligados através de um oligopéptido flexível.

As vantagens de utilizar fragmentos de anticorpos, em vez dos anticorpos completos, são de várias ordens. O tamanho mais pequeno dos fragmentos poderá conduzir a propriedades farmacológicas melhoradas, como seja uma melhor penetração até ao local alvo. As funções efectoras dos anticorpos completos, tal como a ligação do complemento, são removidas. Os fragmentos de anticorpos Fab, Fv, ScFv e dAb podem ser todos expressos em E. coli, e segregados a partir dela, permitindo, assim, a produção fácil de grandes quantidades dos referidos fragmentos.

Os anticorpos completos e os fragmentos F(ab')2 são "bivalentes". Por "bivalente", pretendemos dizer que os referidos anticorpos e os fragmentos F(ab')2 possuem dois locais de combinação com o antigénio. Em contraste, os fragmentos Fab, Fv, ScFv e dAb são monovalentes, possuindo apenas um local de combinação com o antigénio.

Embora o anticorpo possa ser um anticorpo policlonal, é preferido que ele seja um anticorpo monoclonal. Em algumas circunstâncias, particularmente se o anticorpo se destinar a ser administrado repetidamente a um doente humano, é preferido que o anticorpo monoclonal seja um anticorpo monoclonal humano ou um anticorpo monoclonal humanizado. 8 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Os anticorpos monoclonais adequados, que são reactivos da forma referida, poderão ser preparados por meio de técnicas conhecidas, por exemplo, aquelas descritas em "Monoclonal Antibodies; A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) e em "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application", SGR Hurrell (CRC Press, 1982). Anticorpos policlonais, que são poliespecificos ou monoespecificos, poderão também ser produzidos. É preferido que eles sejam monoespecificos.

Os anticorpos quiméricos são discutidos por Neuberger et al (1998, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799) .

Os anticorpos não humanos preparados adequadamente podem ser "humanizados" de formas conhecidas, por exemplo, introduzindo as regiões CDR de anticorpos de ratinho no esqueleto de anticorpos humanos.

Os anticorpos poderão ser anticorpos humanos no sentido em que possuem a sequência de aminoácidos de anticorpos anti-ECSM4 humano, mas eles poderão ser preparados utilizando métodos conhecidos na arte que não requerem a imunização de seres humanos. Por exemplo, estão disponíveis ratinhos transgénicos que contêm, essencialmente, genes de imunoglobulinas humanas (ver Vaughan et al (1998) Nature Biotechnol. 16, 535-539). A porção adicional poderá ser qualquer porção adicional que confere ao composto uma propriedade útil, no que diz respeito ao tratamento ou à imagiologia ou ao diagnóstico de doenças ou de outras afecções ou estados que envolvem a formação indesejável de neovasculatura. Estas doenças ou outras afecções ou estados estão descritos em maior detalhe abaixo. Em particular, a porção adicional é uma porção que é útil na destruição ou na imagiologia da neovasculatura associada ao crescimento de um tumor. Preferencialmente, a porção adicional é uma porção que é capaz de destruir as células endoteliais às quais o composto é dirigido.

Numa concretização preferida do invento, a porção adicional é directa ou indirectamente citotóxica. Em ΕΡ 1 334 194/ΡΤ particular, a porção adicional é directa ou indirectamente tóxica para as células da neovasculatura ou para as células que estão próximas e associadas à neovasculatura.

Em "directamente citotóxico" inclui-se o significado de que o grupo é um grupo que, por si só, é citotóxico. Em "indirectamente citotóxico" inclui-se o significado de que o grupo é um grupo que, embora não seja ele próprio citotóxico, pode induzir citotoxicidade; por exemplo, através da sua acção sobre uma outra molécula ou por acção adicional sobre ela.

Numa concretização, a porção citotóxica é um agente quimioterapêutico citotóxico. Os agentes quimioterapêuticos citotóxicos são bem conhecidos na arte.

Os agentes quimioterapêuticos citotóxicos, como sejam os agentes anticancerosos, compreendem: agentes alquilantes, incluindo as mostardas de azoto como mecloretamina (HN2), ciclofosfamida, ifosfamida, melfalano (L-sarcolisina) e clorambucilo; etileniminas e metilmelaminas como hexametilmelamina e tiotepa; sulfonatos de alquilo como busulfan; nitrosoureias como carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), semustina (metil-CCNU) e estreptozocina (estreptozotocina); triazenos como decarbazina (DTIC; dimetiltriazenoimidazolcarboxamida); antimetabolitos, incluindo análogos do ácido fólico, como o metotrexato (ametopterina); análogos de pirimidinas como fluorouracilo (5-fluorouracilo; 5-FU), floxuridina (fluorodesoxiuridina; FUdR) e citarabina (arabinósido de citosina); análogos de purinas e inibidores relacionados como a mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP), a tioguanina (6-tioguanina; TG) e a pentostatina (2'-desoxicoformicina) . Produtos naturais, incluindo os alcaloides de vinca como vimblastina (VLB) e vincristina; epipodofilotoxinas como etoposido e teniposido; antibióticos como dactinomicina (actinomicina D), daunorrubicina (daunomicina; rubidomicina), doxorrubicina, bleomicina, plicamicina (mitramicina) e mitomicina (mitomicina C); enzimas como L-asparaginase; e modificadores da resposta biológica tais como o interferão alfa. Agentes diversos, incluindo complexos de coordenação com platina como a cisplatina (cis-DDP) e a carboplatina; antracenodionas como mitoxantrona e antraciclina; ureia substituída como seja a 10 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ hidroxiureia; um derivado de metil-hidrazina como a procarbazina (N-metil-hidrazina, MIH); e supressores adenocorticais como mitotano (ο,ρ'-DDD) e aminoglutetimida; o taxol e análogos/derivados; e agonistas/antagonistas de hormonas como flutamida e tamoxifeno. Vários destes agentes foram previamente ligados a anticorpos e a outros agentes de entrega no local alvo, pelo que os compostos do invento compreendendo estes agentes poderão ser facilmente preparados pelos peritos na arte. Por exemplo, a conjugação com carbodiimida (Bauminger & Wilchek (1980) Methods Enzymol. 70, 151-159) poderá ser utilizada para conjugar uma variedade de agentes, incluindo a doxorrubicina, a anticorpos ou péptidos.

As carbodiimidas constituem um grupo de compostos que possuem a fórmula geral R-N=C=N-R', em que R e R' podem ser alifáticos ou aromáticos, e são utilizados para a síntese de ligações peptídicas. O procedimento de preparação é simples, relativamente rápido e efectuado em condições suaves. Os compostos carbodiimida atacam os grupos carboxílicos para os transformar em locais reactivos para os grupos amino livres. A carbodiimida solúvel em água, l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDO), é particularmente útil para conjugar um grupo funcional com um grupo de ligação e poderá ser utilizada para conjugar a doxorrubicina com péptidos de localização de tumores. A conjugação da doxorrubicina com um grupo de ligação requer a presença de um grupo amino, que é proporcionado pela doxorrubicina, e de um grupo carboxílico, que é proporcionado pelo grupo de ligação, por exemplo, um anticorpo ou um péptido.

Além de utilizar carbodiimidas para a formação directa de ligações peptídicas, a EDC também pode ser utilizada para preparar ésteres activos como o éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) . O éster NHS, que se liga apenas a grupos amino, pode depois ser utilizado para induzir a formação de uma ligação amida com o único grupo amino da doxorrubicina. A utilização de EDC e de NHS em combinação é habitualmente usada para a conjugação, de forma a aumentar o rendimento da formação do conjugado (Bauminger & Wilchek, supra, 1980) . 11 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Outros métodos para conjugar uma porção funcional com um anticorpo também podem ser utilizados. Por exemplo, é possível utilizar a oxidação por periodato de sódio, seguida de alquilação redutora com os reagentes apropriados, bem como a reticulação com glutaraldeído. Contudo, é reconhecido que, independentemente do método seleccionado para produzir um conjugado do invento, é necessário determinar se o anticorpo conserva a sua capacidade de direccionamento e se a porção funcional conserva a sua função relevante.

Numa concretização adicional, a porção citotóxica é uma porção peptídica ou polipeptídica citotóxica na qual está incluída qualquer porção que conduza a morte celular. As porções peptídicas ou polipeptídicas citotóxicas são bem conhecidas na arte e incluem, por exemplo, ricina, abrina, exotoxina de Pseudomonas, factor tecidual e compostos similares. Os métodos para as ligar a anticorpos também são bem conhecidos na arte. A utilização de ricina como agente citotóxico está descrita em Burrows & Thorpe (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 8996-9000; e a utilização de factor tecidual, que conduz à formação localizada de coágulos sanguíneos e ao enfarte de um tumor, foi descrita por Ran et al (1998) Câncer Res. 58, 4646-4653 e Huang et al (1997)

Science 275, 547-550. Tsai et al (1995) Dis. Colon Rectum 38, 1067-1074 referem a cadeia A de abrina conjugada com um anticorpo monoclonal. Outras proteínas de inactivação dos ribossomas são descritas como agentes citotóxicos em WO 96/06641. A exotoxina de Pseudomonas também poderá ser utilizada como porção polipeptídica citotóxica (ver, por exemplo, Aiello et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 10457-10461).

Determinadas citoquinas, como o TNFa e a IL-2, também poderão ser úteis como agentes citotóxicos.

Certos átomos radioactivos também poderão ser citotóxicos caso sejam administrados em doses suficientes. Assim, a porção citotóxica poderá compreender um átomo radioactivo que, durante a utilização, entrega uma quantidade suficiente de radioactividade ao local alvo de forma a ser citotóxico. Os átomos radioactivos adequados incluem o fósforo 32, o iodo 12 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 125, ο iodo 131, ο índio 111, ο rénio 186, ο rénio 188, ο ítrio 90 ou qualquer outro isótopo que emita energia suficiente para destruir as células vizinhas, os organelos ou o ácido nucleico. Preferencialmente, os isótopos e a densidade de átomos radioactivos no composto do invento são tais que é administrada uma dose superior a 4000 cGy (preferencialmente pelo menos 6000, 8000 ou 10 000 cGy) ao local alvo e, de preferência, às células no local alvo e seus organelos, particularmente o núcleo. O átomo radioactivo poderá ser ligado ao anticorpo de formas conhecidas. Por exemplo, o EDTA ou outro agente quelante pode ser ligado ao grupo de ligação e depois utilizado para ligar inln ou 90Y. Os resíduos de tirosina 1 o c 131 poderão ser marcados com I ou I. A porção citotóxica poderá ser um polipéptido indirectamente citotóxico adequado. Numa concretização particularmente preferida, o polipéptido indirectamente citotóxico é um polipéptido que possui actividade enzimática e pode converter uma prodroga relativamente não tóxica numa droga citotóxica. Quando o grupo de direccionamento é um anticorpo, este tipo de sistema é frequentemente designado por ADEPT (de "Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy" - terapia dirigida por anticorpo-enzima-prodroga). O sistema requer que o grupo de direccionamento oriente a porção enzimática até ao local desejado no corpo do doente (isto é, o local que expressa ECSM4, como seja um novo tecido vascular associado a um tumor) e que, após permitir tempo suficiente para que a enzima se estabeleça no local, seja administrada uma prodroga que é um substrato para a enzima, em que o produto final da catálise é um composto citotóxico. O objectivo da abordagem consiste em maximizar a concentração de droga no local desejado e minimizar a concentração da droga nos tecidos normais (ver Senter, P.D. et al (1988) "Anti-tumor effects of antibody-alkaline phosphatase conjugates in combination with etoposide phosphate" Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 4842-4846; Bagshawe (1987) Br. J. Câncer 56, 531-2; e Bagshawe, K.D. et al (1988) "A cytotoxic agent can be generated selectively at câncer sites" Br. J. Câncer. 58, 700-703). 13 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ A enzima e a prodroga do sistema que utiliza uma enzima dirigida para ECSM4, tal como aqui descrito, poderão ser quaisquer umas daquelas previamente propostas. A substância citotóxica poderá ser qualquer droga anticancerosa existente, tal como um agente alquilante; um agente que se intercala no ADN; um agente que inibe quaisquer enzimas fundamentais, como di-hidrofolato-redutase, timidina-sintetase, ribonucleótido-redutase, nucleósido-quinases ou topoisomerase; ou um agente que leva a cabo a morte celular ao interagir com qualquer outro constituinte celular. 0 etoposido é um exemplo de um inibidor da topoisomerase.

Os sistemas de prodrogas descritos incluem uma prodroga de mostarda fenólica activada por uma β-glucuronidase de E. colí (Wang et al, 1992 e Roffler et al, 1991); uma prodroga de doxorrubicina activada por uma β-glucuronidase humana (Bosslet et al, 1994); prodrogas adicionais de doxorrubicina activadas por a-galactosidase de grãos de café (Azoulay et al, 1995); prodrogas de daunorrubicina activadas por a-D-galactosidase de grãos de café (Gesson et al, 1994); uma prodroga de 5-fluorouridina activada por uma β-D-galactosidase de E. colí (Abraham et al, 1994); e prodrogas de metotrexato (por exemplo, metotrexato-alanina) activadas por carboxipeptidase A (Kuefner et al, 1990; Vitols et al, 1992 e Vitols et al, 1995) . Estes e outros sistemas estão incluídos na tabela seguinte. EP 1 334 194/PT 14

Enzima Prodroga Carboxipeptidase G2 Derivados de mostardas de ácido L-glutâmico e de ácido benzóico, mostardas de anilina, mostardas fenólicas e mostardas de fenilenodiamina; derivados fluorados destes Fosfatase alcalina Fosfato de etoposido Fosfato de mitomicina Beta-glucuronidase Mostarda de p-hidroxianilina-glucuronida Epirrubicina-glucuronida Penicilina-V-amidase Adriamicina-N-fenoxiacetilo Penicilina-G-amidase N- (4'-hidroxifenilacetil)palitoxina Doxorrubicina e melfalano Beta-lactamase Mostarda de azoto-cefalosporina p-fenilenodiamina; derivados de doxorrubicina; derivado de vimblastina-cefalosporina, mostarda de cefalosporina; um derivado de taxol Beta-glucosidase Ácido cianofenilmetil-beta-D-glucopiranosidurónico Nitrorredutase 5-(Azaridin-l-il)-2,4-dinitrobenzamida Citosina-desaminase 5-Fluorocitosina Carboxipeptidase A Metotrexato-alanina (Esta tabela foi adaptada de Bagshawe (1995) Drug Dev. Res. 34, 220-230, a partir do qual se podem obter as referências completas para estes vários sistemas; o derivado de taxol está descrito em Rodrigues, M.L. et al (1995) Chemistry & Biology 2, 223) . 15 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

As enzimas adequadas para constituir parte da porção enzimática incluem exopeptidases como as carboxipeptidases G, G1 e G2 (para as prodrogas de mostardas glutamiladas), as carboxipeptidases A e B (para as prodrogas à base de mtx) e as aminopeptidases (para as prodrogas de 2-a-aminoacil-MTC); endopeptidases como, por exemplo, a trombolisina (para as prodrogas de trombina); hidrolases como sejam as fosfatases (por exemplo, a fosfatase alcalina) ou as sulfatases (por exemplo, as arilsulfatases (para as prodrogas fosforiladas ou sulfatadas); amidases, tais como as penicilina-amidases e a arilacilamidase; lactamases como as β-lactamases; glicosidases como a β-glucuronidase (para β-glucuronamida antraciclinas), a α-galactosidase (para a amigdalina) e a β-galactosidase (para a β-galactose antraciclina); desaminases como a citosina-desaminase (para 5FC); quinases como a uroquinase e a timidina-quinase (para o ganciclovir); redutases como a nitrorredutase (para CB1954 e análogos), a azorredutase (para as mostardas de azobenzeno) e a DT-diaforase (para CB1954); oxidases como a glucose-oxidase (para a glucose), a xantina-oxidase (para a xantina) e a lactoperoxidase; DL-racemases, anticorpos catalíticos e ciclodextrinas. A prodroga é relativamente não tóxica em comparação com a droga citotóxica. Tipicamente, ela possui menos de 10% da toxicidade, preferencialmente menos de 1% da toxicidade, tal como medida num teste de citotoxicidade adequado in vitro. É provável que a porção que é capaz de converter uma prodroga numa droga citotóxica seja activa mesmo quando isolada do resto do composto, embora apenas seja necessário que seja activa quando (a) está combinada com o resto do composto e (b) o composto está ligado a, adjacente a ou internalizado nas células alvo.

Quando a porção adicional do composto é um polipéptido, o anticorpo e a porção adicional poderão ser ligados um ao outro por qualquer uma das formas convencionais de reticulação de polipéptidos, como sejam aquelas descritas de uma maneira geral em 0'Sullivan et al (1979) Anal. Biochem. 100, 100-108. Por exemplo, o anticorpo que se liga selectivamente a ECSM4 poderá ser enriquecido com grupos tiol, e a porção adicional poderá ser submetida a reacção com um agente bifuncional capaz 16 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ de reagir com aqueles grupos tiol, por exemplo, éster de N-hidroxisuccinimida do ácido iodoacético (NHIA) ou N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP). As ligações amida e tioéter, obtidas por exemplo com um éster de m-maleimidobenzoíl-N-hidroxisuccinimida, são geralmente mais estáveis in vivo que as ligações dissulfureto.

Em alternativa, o composto poderá ser produzido na forma de um composto de fusão através de técnicas de ADN recombinante, em que uma extensão de ADN compreende as regiões que codificam o anticorpo e a porção adicional, adjacentes uma à outra ou separadas por uma região que codifica um péptido ligante que não destrói as propriedades desejadas do composto. Em teoria, as duas porções do composto poderão sobrepor-se total ou parcialmente. 0 ADN é depois expresso num hospedeiro apropriado para produzir um polipéptido que compreende o composto do invento. A porção citotóxica poderá ser um radiossensibilizador. Os radiossensibilizadores incluem fluoropirimidinas, análogos de timidina, hidroxiureia, gemcitabina, fludarabina, nicotinamida, pirimidinas halogenadas, 3-aminobenzamida, 3-aminobenzodiamida, etanixadol, pimonidazol e misonidazol (consultar, por exemplo, McGinn et al (1996) J. Natl. Câncer Inst. 88, 1193-11203; Shewach & Lawrence (1996) Invest. New

Drugs 14, 257-263; Horsman (1995) Acta Oncol. 34, 571-587;

Shenoy & Singh (1992) Clin. Invest. 10, 533-551; Mitchell et al (1989) Int. J. Radiat. Biol. 56, 827-836; iliakis & Kurtzman (1989) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 1235-1241; Brown (1989) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 987-993; Brown (1985) Câncer 55, 2222-2228).

Adicionalmente, a entrega de genes nas células pode radiossensibilizá-las; por exemplo, a entrega do gene de p53 ou de ciclina D (Lang et al (1998) J. Neurosurg. 89, 125-132; Coco Martin et al (1999) Câncer Res. 59, 1134-1140). A porção adicional poderá ser uma porção que se torna citotóxica, ou que liberta uma porção citotóxica, ao ser irradiada. Por exemplo, o isótopo boro 10, quando é adequadamente irradiado, liberta partículas α que são 17 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ citotóxicas (consultar, por exemplo, a Patente US 4,348,376 concedida a Goldenberg; Primus et al (1996) Bioconjug. Chem. 7, 532-535).

De forma similar, a porção citotóxica poderá ser uma que é útil em terapia fotodinâmica, como seja a fotofrina (consultar, por exemplo, Dougherty et al (1998) J. Natl. Câncer Inst. 90, 889-905). A porção adicional poderá compreender uma molécula de ácido nucleico que é directa ou indirectamente citotóxica. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico poderá ser um oligonucleótido anti-sentido que, após localização no local alvo, é capaz de entrar nas células e conduzir à sua morte. Por conseguinte, o oligonucleótido poderá ser um oligonucleótido que previne a expressão de um gene essencial, ou um que conduz a uma modificação da expressão génica que provoca a apoptose.

Os exemplos de oligonucleótidos adequados incluem aqueles dirigidos para bcl-2 (Ziegler et al (1997) J. Natl. Câncer Inst. 89,1 027-1036), ADN-polimerase α e topoisomerase lia (Lee et al (1996) Anticancer Res. 16, 1805-1811). Ácidos nucleicos peptidicos poderão ser úteis em lugar de ácidos nucleicos convencionais (consultar Knudsen & Nielsen (1997) Anticancer Drugs 8, 113-118) .

Numa concretização adicional, o anticorpo poderá estar compreendido num veiculo de entrega para levar os ácidos nucleicos até ao alvo. O veiculo de entrega poderá ser qualquer veiculo de entrega adequado. Poderá ser, por exemplo, um lipossoma contendo o ácido nucleico, ou um virus ou uma partícula semelhante a um virus que é capaz de entregar o ácido nucleico. Nestes casos, o anticorpo que se liga selectivamente a ECSM4 está tipicamente presente à superfície do veículo de entrega. Por exemplo, o anticorpo que se liga selectivamente a ECSM4, tal como um fragmento de anticorpo apropriado, poderá estar presente na superfície externa de um lipossoma, e o ácido nucleico a entregar poderá estar presente no interior do lipossoma. Em outro exemplo, um vector virai, tal como um vector retroviral ou adenoviral, é manipulado de 18 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ forma que ο anticorpo que se liga selectivamente a ECSM4 esteja unido ou localizado à superfície da partícula virai, permitindo, assim, que a partícula virai seja dirigida para o local desejado. Sistemas de entrega dirigida, como seja o sistema de adenovírus modificado descrito em WO 94/10323, em que o ADN é tipicamente transportado no interior do adenovírus ou da partícula semelhante a adenovírus, são também conhecidos. Michael et al (1995) Gene Therapy 2, 660-668 descrevem a modificação de adenovírus para adicionar um grupo selectivo para determinadas células a uma proteína de fibra. Os retrovírus dirigidos também estão disponíveis para utilizar no invento; por exemplo, as sequências que conferem afinidades de ligação específicas poderão ser manipuladas em genes virais env preexistentes (consultar Miller & Vile (1995) Faseb J. 9, 190-199 para uma análise deste e de outros vectores dirigidos destinados a terapia génica).

Os imunolipossomas (lipossomas dirigidos por anticorpos) que compreendem um anticorpo que se liga selectivamente a ECSM4 poderão ser utilizados. Para a preparação dos imunolipossomas, a MPB-PE (N-[4-(p-maleimidofenil)butiril]-fosfatidiletanolamina) é sintetizada de acordo com o método de Martin & Papahadjopoulos (1982) J. Biol. Chem. 257, 286-288. A MPB-PE é incorporada nas bicamadas lipossómicas para permitir um acoplamento covalente do anticorpo anti-ECSM4, ou de um seu fragmento, à superfície lipossómica. O lipossoma é convenientemente carregado com o adn ou com outra construção genética para administração às células alvo, por exemplo, através de preparação dos referidos lipossomas numa solução do ADN ou da outra construção genética, seguida de extrusão sequencial através de filtros de membrana de policarbonato com um tamanho de poro de 0,6 ^ e 0,2 μιη, sob pressões de azoto até 0,8 MPa. Após a extrusão, a construção de ADN confinada é separada da construção de ADN livre por ultracentrifugação a 80 OOOxg, durante 45 minutos. Os lipossomas de MPB-PE acabados de preparar, em tampão desoxigenado, são misturados com o anticorpo (ou um seu fragmento) acabado de preparar, e as reacções de acoplamento são efectuadas numa atmosfera de azoto, a 4°C e sob rotação constante, durante a noite. Os imunolipossomas são separados dos anticorpos não conjugados por ultracentrifugação a 80 OOOxg, durante 45 minutos. Os 19 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ imunolipossomas poderão ser injectados intraperitonealmente ou directamente no tumor. 0 ácido nucleico entregue no local alvo poderá ser qualquer ADN adequado que conduz, directa ou indirectamente, a citotoxicidade. Por exemplo, o ácido nucleico poderá codificar uma ribozima que é citotóxica para a célula, ou poderá codificar uma enzima que é capaz de converter uma prodroga substancialmente não tóxica numa droga citotóxica (este último sistema é por vezes denominado GDEPT: de "Gene Directed Enzyme Prodrug Therapy" - terapia dirigida por gene-enzima-prodroga).

As ribozimas que poderão ser codificadas pelo ácido nucleico que será entregue no alvo estão descritas em Cech & Herschlag "Site-specific cleavage of single stranded DNA"

Patente US 5,180,818; Altman et al "Cleavage of targeted RNA by RNAse P" Patente US 5,168,053; Cantin et al "Ribozyme cleavage of HIV-1 RNA" Patente US 5, 149, 796; Cech et al "RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods", Patente US 5,116,742; Been et al "RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endonucleases and methods", Patente US 5,093,246; e Been et al "RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods; cleaves single-stranded RNA at specific site by transesterification", Patente US 4, 987, 071. Os alvos adequados para as ribozimas incluem factores de transcrição como c-fos e c-myc e bcl-2. Durai et al (1997) Anticancer Res. 17, 3307-3312 descrevem uma ribozima do tipo cabeça de martelo contra bcl-2. EP 0 415 731 descreve o sistema GDEPT. Considerações relacionadas com a escolha da enzima e da prodroga aplicam-se ao sistema GDEPT de forma semelhante ao sistema ADEPT descrito acima. O ácido nucleico entregue no local alvo poderá codificar um polipéptido directamente citotóxico.

Em alternativa, a porção adicional poderá compreender um polipéptido ou um polinucleótido que codifica um polipéptido que não é directa nem indirectamente citotóxico, mas que tem um beneficio terapêutico. Os exemplos destes polipéptidos 20 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ incluem citoquinas antiproliferativas ou anti-inflamatórias que poderiam ser benéficas na aterosclerose, e os factores antiproliferativos, imunomoduladores ou que influenciam a coagulação do sangue que poderiam ser benéficos no tratamento do cancro.

Utilmente, a porção adicional poderá ser um inibidor da angiogénese, como os péptidos angiostatina ou endostatina. Utilmente, a porção adicional também poderá ser uma enzima que converte um polipéptido precursor em angiostatina ou endostatina. As metaloproteases de matriz humanas, como a elastase, gelatinase e estromelisina de macrófagos, convertem o plasminogénio em angiostatina (Cornelius et al (1998) J. Immunol. 161, 6845-6852). O plasminogénio é um precursor da angiostatina.

Numa concretização adicional do invento, a porção adicional é um grupo facilmente detectável.

Por "grupo facilmente detectável", pretende dizer-se que o grupo, quando está localizado no local alvo após administração do composto a um doente, poderá ser detectado, tipicamente de forma não invasiva a partir do exterior do corpo, e o local do alvo localizado. Assim, os compostos são úteis em imagiologia e em diagnóstico.

Normalmente, o grupo facilmente detectável é ou compreende um átomo radioactivo que é útil em imagiologia. Os átomos radioactivos adequados incluem o tecnécio 99m ou o iodo 123 para estudos cintigráficos. Outros grupos facilmente detectáveis incluem, por exemplo, marcadores de spin para imagiologia de ressonância magnética (MRI) como o iodo 123 outra vez, o iodo 131, o indio 111, o flúor 19, o carbono 13, o azoto 15, o oxigénio 17 o gadolinio, o manganésio ou o ferro. Evidentemente, o composto necessita ter uma quantidade suficiente dos isótopos atómicos apropriados para que a molécula seja facilmente detectável.

Os radiomarcadores ou outros marcadores poderão ser incorporados no composto de formas conhecidas. Por exemplo, o anticorpo que se liga selectivamente a ECSM4 poderá ser biossintetizado ou poderá ser sintetizado por síntese química 21 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ de aminoácidos, utilizando precursores adequados de aminoácidos e envolvendo, por exemplo, flúor 19 em vez de hidrogénio. Os marcadores como 99mTc, 123I, 186Rh, 188Rh e mIn podem ser ligados, por exemplo, via os resíduos de cisteína presentes no grupo de ligação. 0 ítrio 90 pode ser ligado via um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57) pode ser utilizado para incorporar o iodo 123. A obra de referência ("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989) descreve outros métodos em pormenor.

Numa concretização adicional preferida do invento, a porção adicional é capaz de se ligar selectivamente a uma porção directa ou indirectamente citotóxica ou a uma porção facilmente detectável. Assim, nesta concretização, a porção adicional poderá ser qualquer porção que se liga a um composto ou componente adicional que é citotóxica ou facilmente detectável. A porção adicional poderá, por conseguinte, ser um anticorpo que se liga selectivamente ao composto ou componente adicional, ou poderá ser algum outro grupo de ligação como estreptavidina, biotina ou um grupo similar. Os exemplos seguintes ilustram os tipos de moléculas que estão incluídos; outras moléculas destas serão evidentes a partir do que aqui é dito.

Um anticorpo biespecífico, em que um local de ligação compreende a porção que se liga selectivamente a ECSM4 e o segundo local de ligação compreende uma porção que se liga a, por exemplo, uma enzima que é capaz de converter uma prodroga substancialmente não tóxica numa droga citotóxica.

Um composto, tal como um anticorpo que se liga selectivamente a ECSM4, ao qual está ligada biotina. A avidina ou a estreptavidina, que foi marcada com um marcador facilmente detectável, poderá ser utilizada em conjunto com o anticorpo marcado com biotina num sistema de imagiologia em duas fases, em que o anticorpo marcado com biotina é inicialmente dirigido para o local alvo no doente e, em seguida, a avidina ou a estreptavidina marcada é administrada ao doente. Os anticorpos biespecíficos e os sistemas de 22 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ biotina/estreptavidina (avidina) são revistos por Rosebrough (1996) Q J Nucl. Med. 40, 234-251.

Numa concretização preferida do invento, o anticorpo que se liga selectivamente a ECSM4 e a porção adicional são polipéptidos que estão fundidos.

Os compostos descritos acima são úteis no tratamento, em imagiologia ou no diagnóstico de doenças, particularmente de doenças em que poderá existir uma formação indesejável de neovasculatura, tal como descrito em maior pormenor abaixo.

Nos métodos e utilizações do presente invento, o composto descrito acima é tipicamente usado sob a forma de uma composição farmacêutica compreendendo o composto e um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "farmaceuticamente aceitável" inclui a acepção de que a formulação é estéril e isenta de pirogénios. Os veículos farmacêuticos adequados são bem conhecidos na arte da farmácia. 0(s) veiculo (s) têm que ser "aceitáveis" no sentido de serem compatíveis com o composto do invento e não serem prejudiciais para aqueles que os irão receber. Tipicamente, os veículos serão água ou solução salina, que será estéril e isenta de pirogénios. Contudo, é possível utilizar outros veículos aceitáveis.

Normalmente, as composições ou formulações farmacêuticas destinam-se a administração parentérica, mais particularmente a administração intravenosa.

As formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções aquosas e não aquosas estéreis para injecção, que poderão conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do destinatário visado; e suspensões aquosas e não aquosas estéreis, que poderão incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. 23 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Os compostos descritos acima são úteis para a imagiologia do endotélio vascular no corpo de um indivíduo, quando a porção adicional é uma porção facilmente detectável. Por conseguinte, um primeiro aspecto do invento providencia a utilização definida de acordo com a reivindicação 1.

Tipicamente, o endotélio vascular está associado à angiogénese. A imagiologia do endotélio vascular num indivíduo compreende normalmente a detecção da localização do composto no indivíduo. A detecção do composto ou do anticorpo pode ser efectuada utilizando métodos bem conhecidos na arte da imagiologia clínica e dos diagnósticos. 0 método específico requerido dependerá do tipo de marcador detectável ligado ao composto ou ao anticorpo. Por exemplo, os átomos radioactivos poderão ser detectados utilizando autorradiografia ou, em alguns casos, por imagens de ressonância magnética (MRI) como descrito acima. A imagiologia do endotélio vascular no corpo é útil, pois pode proporcionar informações sobre a saúde do corpo. Ela é particularmente útil quando o endotélio vascular está doente ou quando está a proliferar devido a um crescimento canceroso. A imagiologia do cancro num doente é especialmente útil, uma vez que pode ser utilizada para determinar o tamanho de um tumor e se este está ou não a responder ao tratamento. Uma vez que a doença metastática envolve a formação de novos vasos sanguíneos, o método é útil para avaliar se ocorreu ou não metástase.

Por esse motivo, numa concretização preferida do primeiro aspecto do invento, o endotélio vascular é uma neovasculatura, como seja aquela produzida no cancro.

Os compostos descritos acima também são úteis para diagnosticar ou efectuar o prognóstico, num indivíduo, de uma afecção que envolve o endotélio vascular, quando a porção adicional é um grupo facilmente detectável. Por conseguinte, 24 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ um segundo aspecto do invento providencia a utilização definida de acordo com a reivindicação 4. A afecção poderá ser uma afecção que envolve o crescimento aberrante ou excessivo do endotélio vascular, como um cancro, uma aterosclerose, uma restenose, uma retinopatia diabética, uma artrite, uma psoriase, uma endometriose, os hemangiomas e as malformações venosas. 0 método poderá ser um auxiliar para o diagnóstico. 0 diagnóstico ou o auxilio no diagnóstico de uma condição envolvendo o endotélio vascular, num indivíduo, compreende normalmente a detecção da localização do composto no indivíduo. Preferencialmente, o endotélio está na neovasculatura, isto é, na vasculatura angiogénica. A função de ECSM4 poderá não ser promover a proliferação das células endoteliais vasculares. Por conseguinte, o nível de expressão dos polipéptidos ECSM4, numa célula endotelial, poderá não ser informativo sobre a saúde do endotélio vascular. Contudo, a localização da expressão dos polipéptidos ECSM4 poderá ser informativa, uma vez que eles representam o crescimento de vasos sanguíneos. A proliferação de células anormais, como o cancro, poderá ser diagnosticada através da detecção de uma nova vasculatura.

Os compostos descritos acima também são úteis num método de tratamento de uma afecção que envolve o endotélio vascular, quando a porção adicional é uma porção citotóxica ou terapêutica. Por conseguinte, um terceiro aspecto do invento proporciona uma utilização definida de acordo com a reivindicação 9.

Numa concretização deste aspecto, o doente necessitado de tratamento tem uma doença proliferativa ou uma afecção envolvendo o endotélio vascular. Várias doenças e afecções envolvem a formação de uma neovasculatura indesejável. A formação de uma neovasculatura está associada ao cancro, a psoriase, a aterosclerose, a menorragia, a artrite (tanto inflamatória como reumatóide), a 25 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ degeneração macular, a doença de Paget, a retinopatia e suas complicações vasculares (incluindo proliferativa, de prematuridade e diabética), a proliferações vasculares benignas e a fibroses. 0 termo cancro inclui o sarcoma de Kaposi, a leucemia, o linfoma, o mieloma, os carcinomas sólidos (tanto primários como secundários (metástases), os tumores vasculares incluindo o hemangioma (tanto capilar como juvenil (infantil)), a hemangiomatose e o hemagioblastoma.

Tipicamente, a doença está associada à formação de uma neovasculatura indesejável, e o tratamento reduz esta numa extensão útil.

Os tumores que poderão ser tratados pelos métodos do invento incluem quaisquer tumores que estejam associados à produção de novos vasos sanguíneos. 0 termo "tumor" deve ser entendido como designando todas as formas de crescimento de células neoplásicas, incluindo os tumores do pulmão, do fígado, das células sanguíneas, da pele, do pâncreas, do estômago, do cólon, da próstata, do útero, da mama, das glândulas linfáticas e da bexiga. Os tumores sólidos são especialmente adequados. Contudo, actualmente crê-se que os cancros do sangue, incluindo as leucemias e os linfomas, envolvem a formação de novos vasos sanguíneos e poderão ser tratados pelos métodos do invento.

Tipicamente, nas utilizações acima mencionadas, a porção adicional é uma porção que destrói ou abranda ou reverte o crescimento da neovasculatura.

Dependendo do composto particular utilizado em imagiologia, no diagnóstico ou no tratamento, o momento da administração poderá variar, e o número de outros componentes utilizados nos sistemas terapêuticos aqui descritos poderá variar.

Por exemplo, no caso em que o composto compreende uma porção facilmente detectável ou uma porção directamente citotóxica, poderá acontecer que apenas o composto, numa 26 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ formulação apropriada, se destine a administração ao doente. Evidentemente, o doente poderá receber outros agentes, tais como agentes imunossupressores e espécies similares.

No que diz respeito aos compostos que estão marcados de forma detectável, a imagiologia tem lugar após o composto estar localizado no local alvo.

Contudo, se o composto necessitar de um componente adicional de forma a ser útil no tratamento, em imagiologia ou no diagnóstico, o composto poderá ser administrado, permitindo-se que se dirija até ao local alvo, e o componente adicional poderá depois ser administrado num momento posterior adequado.

Por exemplo, no que diz respeito aos sistemas ADEPT e de tipo ADEPT acima referidos, o composto grupo de ligação-grupo enzimático é administrado, dirigindo-se para o local alvo. Uma vez isto efectuado, a prodroga é administrada.

De forma semelhante, por exemplo, relativamente aos compostos em que a porção adicional incluída no composto é um grupo que se liga a um componente adicional, o composto poderá ser primeiro administrado e autorizado a localizar-se no local alvo e, subsequentemente, o componente adicional é administrado.

Assim, numa concretização, um anticorpo anti-ECSM4 marcado com biotina é administrado ao doente e, após um período de tempo adequado, é administrada estreptavidina marcada de forma detectável. Depois de a estreptavidina se ter dirigido para os locais em que o anticorpo está localizado (isto é, os locais alvo), tem lugar a imagiologia.

Acredita-se que os compostos descritos acima, em que a porção adicional é uma porção facilmente detectável, poderão ser úteis na determinação do estado angiogénico de tumores ou do estado de outras doenças em que a angiogénese contribui para a patologia. Este poderá ser um factor importante a influenciar a natureza e o resultado da terapia futura. 27 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Os fragmentos do polipéptido ECSM4 que poderão ser úteis para produzir anticorpos incluem fragmentos que possuem a sequência GGDSLLGGRGSL, LLQPPARGHAHDGQALSTDL, EPQDYTEPVE, TAPGGQGAPWAEE ou ERATQEPSEHGP. Estes péptidos correspondem a regiões do polipéptido ECSM4 humano (localizadas nos residuos 4-16, 91-109, 227-236, 288-300 e 444-455, respectivamente, na sequência apresentada na Figura 12), que são pouco, ou nada, conservadas no homólogo de ratinho (ver Figura 14). Tal como descrito abaixo, estes péptidos poderão ser particularmente úteis na produção de anticorpos contra o polipéptido ECSM4 humano.

De acordo com o programa de software de previsão de domínios transmembranares denominado PRED-TMR (disponível no sítio da Internet http://www.biophys.blol.uoa.qr) e um alinhamento da sequência de aminoácidos com a proteína humana Robol (cuja região transmembranar é conhecida), os resíduos 1-467, tal como ilustrados na Figura 12, são provavelmente extracelulares e, além de estarem expostos extracelularmente, poderão incluir o local de ligação do ligando natural. Desta forma, os fragmentos de ECSM4, que incluem ou consistem numa sequência no interior do domínio extracelular dos resíduos 1-467 da Figura 12, poderão representar fragmentos úteis para produzir anticorpos selectivos para as células que expressam ECSM4 à sua superfície e que também poderão ser úteis para modular a actividade do polipéptido ECSM4.

Assim, os fragmentos preferidos do polipéptido ECSM4 para produzir anticorpos são aqueles fragmentos da sequência polipeptídica da Figura 12 que compreendem pelo menos 1, 3 ou 5 resíduos de aminoácidos que não são conservados quando é feita uma comparação com o polipéptido ECSM4 de ratinho (tal como ilustrado na Figura 13) . Mais preferencialmente, pelo menos 7, 9, 11 ou 13 resíduos de aminoácidos no fragmento não são conservados entre o ECSM4 humano e o ECSM4 de ratinho, ainda mais preferencialmente pelo menos 15, 17, 19 ou 21 resíduos do fragmento não são conservados entre o ECSM4 humano e o ECSM4 de ratinho. A sequência destes fragmentos poderá ser determinada a partir do alinhamento das sequências de aminoácidos humana e de ratinho apresentadas na Figura 14. 28 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Outros fragmentos úteis de ECSM4 são aqueles que são capazes de se ligar a um ligando selectivo para ECSM4. Os métodos adequados para a identificação de ligandos, como sejam os péptidos ou outras moléculas que se ligam a ECSM4, estão discutidos acima em maior detalhe. Estes péptidos ou outras moléculas de ligação a ECSM4 podem ser utilizados para identificar as sequências de aminoácidos presentes em ECSM4, que são responsáveis pela ligação ao ligando. A identificação daqueles fragmentos de ECSM4 que, quando são isolados do resto da molécula, ainda são capazes de se ligar a um ligando de ECSM4 pode ser efectuada por meio de um rastreio. Tipicamente, este rastreio compreenderá efectuar o contacto de um ligando de ECSM4 com um fragmento de teste do polipéptido ECSM4 e determinar se o fragmento de teste se liga ao ligando. Os fragmentos de ECSM4 estão no âmbito do invento e poderão ser particularmente úteis em medicina. Um fragmento de ECSM4 que se liga ao ligando natural de ECSM4 poderá neutralizar o efeito do ligando e, por conseguinte, afectar a migração, o crescimento e/ou o desenvolvimento vascular das células endoteliais. Assim, os fragmentos de ECSM4 poderão ser úteis no tratamento de doenças ou de afecções em que a migração, o crescimento e/ou o desenvolvimento vascular das células endoteliais necessitam ser modulados. Os exemplos destas doenças incluem o cancro e a aterosclerose.

Uma "variante" do polipéptido ECSM4 inclui as variantes naturais, incluindo as variantes alélicas, as formas mutantes de ocorrência natural e as variantes com inserções, deleções e substituições, conservativas ou não conservativas, em que estas modificações não alteram substancialmente a actividade do referido polipéptido. No caso do polipéptido ECSM4, na qualidade de um homólogo, especifico do endotélio, do "carrossel" humano 1, este poderá perfeitamente estar envolvido na orientação repulsiva das células endoteliais. Além disso, os polipéptidos que são alongados em resultado de uma inserção ou que são truncados devido a deleção de uma região estão incluídos no âmbito do invento. Por exemplo, a deleção de regiões localizadas no citoplasma poderá ser útil na criação de formas "dominantes negativas" ou "dominantes positivas" do polipéptido. De forma similar, a deleção de uma região transmembranar do polipéptido poderá produzir estas formas. 29 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Por "substituição conservativa" pretende-se designar combinações como Gly, Ala; Vai, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gin; Ser, Thr; Lys, Arg; e Phe, Tyr.

Em "substituição não conservativa" incluem-se outras substituições, por exemplo, aquelas em que o novo resíduo mimetiza uma modificação particular do resíduo substituído, por exemplo, uma tirosina ou uma serina fosforilada poderá ser substituída por aspartato ou glutamato devido à semelhança da cadeia lateral do aspartato ou do glutamato com um resíduo fosforilado (isto é, eles transportam uma carga negativa a pH neutro).

Substituições não conservativas adicionais, que estão incluídas no termo "variantes", são as mutações pontuais que alteram um, por vezes dois e geralmente não mais de três aminoácidos. Estas mutações são bem conhecidas na arte da bioquímica e são geralmente concebidas para inserir ou remover uma característica definida do polipéptido. Outro tipo de mutação não conservativa é a alteração ou a adição de um dado resíduo a um resíduo de cisteína ou de lisina, que pode depois ser utilizado com reagentes de reticulação à base de maleimida ou de succinimida para conjugar covalentemente o polipéptido com outro grupo. As proteínas não glicosiladas poderão ser mutadas para converter uma asparagina no motivo de reconhecimento N-X-S/T para a glicosilação ligada a N. Esta modificação poderá ser útil para criar uma marca destinada a purificação do polipéptido utilizando esferas ligadas a concanavalina A.

Estas variantes poderão ser preparadas utilizando os métodos de manipulação de proteínas e de mutagénese dirigida bem conhecidos na arte.

As variantes do polipéptido ECSM4 incluem polipéptidos que compreendem uma sequência com pelo menos 65% de identidade com a sequência de aminoácidos proporcionada na Figura 4 ou na Figura 7 ou na Figura 12 ou na Figura 13, preferencialmente pelo menos 70% ou 80% ou 85% ou 90% de identidade com a referida sequência, mais preferencialmente pelo menos 95% ou 98% de identidade com a referida sequência de aminoácidos. 30 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ A percentagem de identidade pode ser determinada, por exemplo, através do programa LALIGN (Huang & Miller, Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357) no sitio da unidade Expasy (http : //www. ch . embnet. org/sof tware/LALIGN...f orm. html), usando como parâmetros a opção de alinhamento global, a matriz BLOSUM62, uma penalização de iniciação do espaçamento -14 e uma penalização de extensão do espaçamento -4.

Preferencialmente, um anticorpo que se liga selectivamente a ECSM4 é um anticorpo que se liga a um polipéptido cuja sequência de aminoácidos compreende a sequência proporcionada em qualquer uma das Figuras 4, 5 ou 12, ou uma sua variante natural, mas que não se liga ao polipéptido representado por qualquer uma das sequências SEQ ID No. 18085 de ΕΡ 1 074 617; SEQ ID No. 211 de WO 00/53756 ou WO 99/46281; SEQ ID Nos. 24-27, 29, 30, 33, 34, 38 ou 39 de WO 01/23523; ou SEQ ID No. 86 de WO 99/11293, ou codificado por qualquer uma das sequências nucleotídicas representadas pela SEQ ID No. 18084 ou 5096 de ΕΡ 1 074 617; SEQ ID No. 210 de WO 00/53756 ou WO 99/46281; SEQ ID Nos. 22, 23, 96 ou 98 de WO 01/23523; e SEQ ID No. 31 de WO 99/11293.

Por "ligar selectivamente" entende-se que os anticorpos se ligam pelo menos lOx mais fortemente a um polipéptido de ECSM4 do que a outro polipéptido, preferencialmente pelo menos 50x mais fortemente, mais preferencialmente pelo menos lOOx mais fortemente. Estes anticorpos poderão ser preparados através de métodos bem conhecidos na arte, utilizando as informações relativas às diferenças entre as sequências de aminoácidos de ECSM4 e de outro polipéptido que não seja um polipéptido de ECSM4.

Os anticorpos que se ligam selectivamente a ECSM4 também poderão modular a função do polipéptido ECSM4. Os anticorpos que mimetizam o efeito de ligação do ligando cognato através da estimulação ou da activação de ECSM4, ou que se ligam e, desse modo, previnem a subsequente ligação e activação ou estimulação de ECSM4 pelo ligando cognato, estes anticorpos moduladores da função estão incluídos no âmbito do invento. Os anticorpos que modulam a função são úteis como ferramenta de pesquisa, por exemplo, no estudo dos efeitos da estimulação ou 31 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ da activação de ECSM4 ou dos processos a jusante activados por essa estimulação. Estes anticorpos também são úteis em medicina, por exemplo, na modulação da angiogénese num indivíduo. Especificamente, a modulação da angiogénese por administração de um anticorpo destes poderá ser útil no tratamento de uma doença num indivíduo, como seja um cancro, em que a modulação da angiogénese seria benéfica.

Os péptidos seguintes poderão ser úteis como imunogénios na geração de anticorpos, por exemplo, soros policlonais de coelho: LSQSPGAVPQALVAWRA, DSVLTPEEVALCLEL, TYGYISVPTA e KGGVLLCPPRPCLTPT.

Numa concretização preferida, o anticorpo do invento liga-se selectivamente a uma sequência de aminoácidos com a sequência GGDSLLGGRGSL, LLQPPARGHAHDGQALSTDL, EPQDYTEPVE, TAPGGQGAPWAEE ou ERATQEPSEHGP. Estas sequências representam sequências de aminoácidos que não são idênticas entre as sequências polipeptidicas de ECSM4 humano e de ECSM4 de ratinho. Geralmente, os polipéptidos ECSM4 humano e de ratinho apresentam um grau elevado de identidade, o que torna a produção de anticorpos de ratinho contra o ECSM4 humano particularmente dificil, devido à falta de imunogenicidade de grande parte da sequência de ECSM4 humano no ratinho. É mais provável que as sequências de aminoácidos que estão ausentes do ECSM4 de ratinho sejam mais imunogénicas num ratinho do que aquelas sequências que estão presentes no ECSM4 de ratinho (um alinhamento das sequências de aminoácidos do polipéptido ECSM4 humano e de ratinho está ilustrado na Figura 14). Desta forma, os fragmentos polipeptidicos que contêm sequências que são únicas do polipéptido ECSM4 humano, tal como descrito acima, são mais úteis que os polipéptidos ECSM4 cuja sequência é encontrada tanto no ECSM4 humano como no ECSM4 de ratinho, para a produção de anticorpos que se ligam selectivamente ao polipéptido ECSM4 humano.

Os anticorpos gerados em resultado da utilização de sequências de aminoácidos que estão localizadas na porção extracelular do polipéptido ECSM4 são provavelmente úteis como moléculas dirigidas para as células endoteliais. Por conseguinte, é particularmente preferido que o anticorpo do invento seja produzido contra, e de preferência se ligue 32 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ selectivamente a, uma sequência de aminoácidos que é única do polipéptido ECSM4 humano, sequência esta que está localizada próximo da extremidade N-terminal do polipéptido e é encontrada na porção extracelular localizada entre os resíduos 1 e 467 da sequência de aminoácidos proporcionada na Figura 12. Um exemplo de uma sequência de aminoácidos que é adequada para produzir moléculas de anticorpos selectivos para a região extracelular de ECSM4 está apresentado na Figura 12.

Embora as sequências de aminoácidos que são únicas do polipéptido ECSM4 humano possam ser utilizadas para produzir anticorpos policlonais, é preferido que elas sejam utilizadas para produzir anticorpos monoclonais.

Os péptidos em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos são quimicamente modificados, antes ou depois de o péptido ser sintetizado, poderão ser utilizados, desde que a função do péptido, nomeadamente a produção de anticorpos específicos in vivo, permaneça substancialmente inalterada. Estas modificações incluem a formação de sais com ácidos ou bases, especialmente sais orgânicos fisiologicamente aceitáveis ou em ácidos e bases orgânicos, a formação de um éster ou de uma amida a partir de um grupo carboxílico terminal e a ligação de grupos protectores dos aminoácidos, como o grupo N-t-butoxicarbonilo. Estas modificações poderão proteger o péptido do metabolismo in vivo. Os péptidos poderão estar presentes como cópias únicas ou múltiplas, por exemplo, sequências repetidas em tandem. Estas sequências de repetição múltiplas ou em tandem poderão ser, elas próprias, suficientemente antigénicas, de forma a evitar a utilização de um transportador. Poderá ser vantajoso para o péptido ser formado como uma volta, com as extremidades N-terminal e C-terminal unidas, ou adicionar um ou mais resíduos Cys a uma extremidade para aumentar a antigenicidade e/ou para permitir a formação de ligações dissulfureto. Caso o péptido esteja ligado covalentemente a um transportador, preferencialmente um polipéptido, então a disposição é de preferência tal que o péptido do invento forma uma volta.

De acordo com as teorias imunológicas actuais, deverá estar presente uma função de transportador em qualquer formulação imunogénica, de forma a estimular, ou aumentar a 33 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ estimulação de, ο sistema imunitário. Acredita-se que os melhores transportadores personificam (ou, juntamente com o antigénio, criam) um epitopo de célula T. Os péptidos poderão ser associados, por exemplo através de reticulação, a um transportador separado, tal como as albuminas séricas, as mioglobinas, os toxóides bacterianos e a hemocianina de lapa. Os transportadores desenvolvidos mais recentemente, que induzem a ajuda das células T na resposta imunitária, incluem o antigénio do núcleo da hepatite B (também denominado proteína da nucleocápside), presumíveis epítopos de célula T como Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cys, a β-galactosidase e o péptido 163-171 da interleucina-1. 0 último composto poderá ser encarado diversamente como um transportador ou como um adjuvante ou como ambos. Em alternativa, várias cópias do mesmo ou de diferentes péptidos do invento poderão ser reticuladas umas às outras; nesta situação, não existe um transportador separado como tal, mas uma função de transporte poderá ser proporcionada por esta reticulação. Os agentes de reticulação adequados incluem aqueles referidos como tal nos catálogos da Sigma e da Pierce, por exemplo, glutaraldeído, carbodiimida e 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato de succinimidilo; este último agente explora o grupo -SH no resíduo de cisteína C-terminal (se presente).

Caso o péptido seja preparado por expressão de uma sequência nucleotídica adequada num hospedeiro apropriado, então poderá ser vantajoso expressar o péptido como um produto de fusão com uma sequência peptídica que actua como transportador. 0 sistema "Ecosec" de Kabigen é um exemplo de uma construção destas.

Os péptidos poderão ser sintetizados pelo modo Fmoc-poliamida de síntese de péptidos em fase sólida, da forma descrita por Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433 e referências aí citadas. A protecção temporária do grupo N-amino é proporcionada pelo grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). A clivagem repetida deste grupo protector, extremamente lábil em meio básico, é realizada utilizando piperidina a 20% em N,N-dimetilformamida. As funcionalidades das cadeias laterais poderão ser protegidas sob a forma dos seus éteres butílicos (no caso da serina, da 34

ΕΡ 1 334 194/ΡΤ treonina e da tirosina), ésteres butílicos (no caso do ácido glutâmico e do ácido aspártico), derivado de butiloxicarbonilo (no caso da lisina e da histidina), derivado de tritilo (no caso da cisteína) e derivado de 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzenossulfonilo (no caso da arginina). Quando a glutamina ou a asparagina são resíduos C-terminais, utiliza-se o grupo 4,4'-dimetoxibenzidrilo para protecção das funcionalidades amido da cadeia lateral. 0 suporte de fase sólida baseia-se num polimero de polidimetilacrilamida constituído a partir dos três monómeros: dimetilacrilamida (monómero de estrutura), bis(acriloíl)etilenodiamina (agente de reticulação) e éster metílico de acriloílsarcosina (agente funcionalizante). 0 agente clivável da ligação péptido-resina utilizado é o derivado do ácido 4-hidroximetilfenoxiacético lábil em meio ácido. Todos os derivados de aminoácidos são adicionados sob a forma dos seus anidridos simétricos pré-formados, com excepção da asparagina e da glutamina que são adicionadas utilizando um procedimento de acoplamento reverso mediado por N,N-diciclohexil-carbodiimida/l-hidroxibenzotriazol. Todas as reacções de acoplamento e de desprotecção são monitorizadas utilizando procedimentos de teste com ninidrina, trinitrobenzeno, ácido sulfónico ou isotina. Uma vez a síntese terminada, os péptidos são clivados do suporte de resina, com a remoção concomitante dos grupos protectores das cadeias laterais por tratamento com ácido trifluoroacético a 95% contendo uma mistura de desactivadores a 50%. Os desactivadores habitualmente utilizados são o etanoditiol, o fenol, o anisol e a água, em que a escolha exacta depende dos aminoácidos constituintes do péptido que está a ser sintetizado. O ácido trifluoroacético é removido por evaporação sob vácuo, com subsequente trituração com éter dietílico, proporcionando o péptido em bruto. Quaisquer desactivadores presentes são removidos por meio de um simples procedimento de extracção que, com a liofilização da fase aquosa, proporciona o péptido em bruto livre de desactivadores. Os reagentes para a síntese dos péptidos estão normalmente disponíveis através de Calbiochem-Novabiochem (Reino Unido) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, Reino Unido. A purificação poderá ser efectuada por qualquer técnica ou combinação de técnicas, como a cromatografia de filtração em gel, a cromatografia de permuta iónica e (principalmente) a cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa. A 35 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ análise dos péptidos poderá ser realizada utilizando cromatografia em camada fina, cromatografia liguida de alto desempenho de fase reversa, análise de aminoácidos após hidrólise ácida e espectrometria de massa de bombardeamento com átomos rápidos (FAB).

Os anticorpos podem ser produzidos num animal através de imunização com um péptido apropriado. Os péptidos apropriados estão aqui descritos. Em alternativa, com a tecnologia actual, é possível produzir anticorpos da forma aqui definida sem necessidade de utilizar animais. Estas técnicas incluem, por exemplo, a tecnologia de apresentação de anticorpos em fagos tal como é bem conhecida na arte. Os péptidos apropriados, tal como aqui descritos, poderão ser utilizados para seleccionar os anticorpos produzidos desta forma.

Com os avanços da tecnologia de anticorpos, poderá não ser necessário imunizar um animal para produzir um anticorpo. Sistemas sintéticos, tais como as bibliotecas de apresentação em fagos, poderão ser utilizados. A utilização destes sistemas está incluída nos métodos do invento, e os produtos destes sistemas são "anticorpos" para as finalidades do invento.

Estes anticorpos que reconhecem ECSM4, e as suas variantes ou fragmentos, são reagentes de pesquisa e agentes terapêuticos úteis, particularmente quando são preparados como um composto do invento como descrito acima. Adequadamente, os anticorpos do invento estão marcados de forma detectável, por exemplo, eles poderão estar marcados de forma a poderem ser directa ou indirectamente detectados. Convenientemente, os anticorpos estão marcados com um grupo radioactivo ou com um grupo colorido ou com um grupo fluorescente, ou poderão estar ligados a uma enzima. Tipicamente, a enzima é uma enzima que pode converter um substrato não colorido (ou não fluorescente) num produto colorido (ou fluorescente). 0 anticorpo poderá ser marcado com biotina (ou estreptavidina) e depois detectado indirectamente utilizando estreptavidina (ou biotina), que foi marcada com um grupo radioactivo ou com um grupo colorido ou com um grupo fluorescente ou com um grupo similar, ou poderá estar ligada a qualquer enzima do tipo descrito acima. 36 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Um quarto aspecto do invento proporciona um método de detecção de uma lesão ou de uma activação endotelial num indivíduo, que compreende obter uma amostra de fluido proveniente do indivíduo e detectar a presença de fragmentos de ECSM4 na amostra, tal como definido na reivindicação 19.

Preferencialmente, a amostra de fluido é o sangue. Normalmente, é detectada a presença de fragmentos peptídicos derivados de ECSM4.

Numa concretização preferida deste aspecto, a presença de fragmentos peptídicos do polipéptido ECSM4 é detectada utilizando um anticorpo selectivo para um polipéptido cuja sequência de aminoácidos compreende uma sequência proporcionada em qualquer uma das Figuras 4 ou 12, ou seus fragmentos. Tipicamente, um anticorpo deste tipo estaria marcado de forma detectável. A detecção ou o diagnóstico de uma lesão nas células endoteliais, num indivíduo, é útil no diagnóstico do cancro ou no auxílio ao diagnóstico de doença cardíaca, de endometriose ou de aterosclerose nesse indivíduo. Poderá suceder que determinados níveis de lesão celular aparente sejam detectados em indivíduos que não têm cancro, doença cardíaca, endometriose ou aterosclerose. Poderá ser necessário comparar a quantidade detectada de lesão nas células endoteliais com as quantidades ou os níveis observados em indivíduos que se sabe terem cancro, doença cardíaca, endometriose ou aterosclerose e com os níveis "normais" de lesão aparente no indivíduo que não tem cancro, doença cardíaca, endometriose ou aterosclerose.

Por esse motivo, a detecção de uma lesão ou de uma activação endotelial num indivíduo poderá ser útil como um meio de detecção da presença ou da extensão ou da velocidade de crescimento de um tumor nesse indivíduo. A detecção de lesões nos vasos é uma indicação indirecta da formação de uma neovasculatura de um tumor. Desta forma, o polipéptido ECSM4 poderá ser um marcador suplente da angiogénese. A presença de fragmentos de ECSM4 numa amostra proveniente do indivíduo, ou de mais fragmentos polipeptídicos de ECSM4 que num indivíduo que não tem um tumor, poderá ser um meio de detectar um tumor, ou o crescimento de um tumor conhecido, nesse indivíduo. 37 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Além disso, a detecção de uma neovasculatura através da detecção da presença de, ou de uma determinada quantidade de, ECSM4 numa amostra proveniente de um indivíduo poderá ser útil para determinar se um tratamento nesse indivíduo está a ser eficaz e/ou em que extensão o tratamento é eficaz. Preferencialmente, a terapia destina-se a tratar um tumor ou um cancro no indivíduo.

Assim, um aspecto do invento disponibiliza um método de detecção de um tumor ou de uma neovasculatura de um tumor ou de uma doença cardíaca ou de uma endometriose ou de uma aterosclerose num indivíduo, que compreende obter uma amostra de fluido do indivíduo e detectar a presença de fragmentos de ECSM4 na amostra.

Tal como descrito acima em relação à detecção ou ao diagnóstico de uma lesão nas células endoteliais, a detecção da doença (como seja um tumor, uma doença cardíaca, etc.) por meio da detecção da presença de, ou de uma determinada quantidade de, ECSM4 numa amostra proveniente de um indivíduo poderá ser útil para determinar a eficácia de um tratamento nesse indivíduo.

Numa concretização, a terapia é a terapia génica.

De preferência, a eficácia do tratamento num indivíduo é determinada utilizando a quantidade de fragmentos de ECSM4 encontrados na amostra de fluido do indivíduo e comparando-a ou com a quantidade de fragmentos de ECSM4 numa amostra de um indivíduo que não tem cancro, doença cardíaca, endometriose ou aterosclerose e/ou com a quantidade numa amostra do indivíduo antes do início do referido tratamento. A comparação indica a eficácia do tratamento no indivíduo, em que se não existir alteração da quantidade de fragmentos determinada antes e durante/após o tratamento, tal é indicativo de uma fraca eficácia do tratamento. Uma diminuição da quantidade de fragmentos encontrados durante ou após o tratamento, comparada com a quantidade determinada antes do início do tratamento, indica alguma eficácia do tratamento na melhoria da afecção do indivíduo. 38 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Os métodos actuais de avaliação da eficácia de várias terapias anti-angiogénicas, que estão a ser testados em ensaios clínicos, são invasivos. A expressão selectiva de ECSM4 nas células endoteliais de vasos sanguíneos angiogénicos significa que a detecção da presença, ausência, aumento ou diminuição do nível de ECSM4, num sujeito que está a ser submetido a terapia, é um meio de determinar a eficácia da terapia nesse sujeito, sem a necessidade, ou com uma necessidade reduzida, de biópsias invasivas, varrimentos e procedimentos similares.

Por conseguinte, a determinação da quantidade de fragmentos de ECSM4 no sangue de um indivíduo, que está a ser submetido a uma terapia anti-angiogénica (como seja a terapia para o cancro), poderá actuar como um "marcador substituto da angiogénese".

Por "fragmentos peptídicos derivados de ECSM4", pretende designar-se péptidos que possuem pelo menos 5 aminoácidos consecutivos do polipéptido ECSM4. Normalmente, os fragmentos possuem pelo menos 8 aminoácidos consecutivos, preferencialmente pelo menos 10, mais preferencialmente pelo menos 12 ou 15 ou 20 ou 30 ou 40 ou 50 aminoácidos consecutivos do polipéptido ECSM4.

Os métodos para detectar a presença de fragmentos de péptidos derivados de polipéptidos maiores são conhecidos na arte.

Um aspecto adicional do invento proporciona a utilização definida de acordo com a reivindicação 28, para modular a angiogénese num indivíduo.

De preferência, o fragmento peptídico ou o anticorpo é uma espécie que modula, directa ou indirectamente, a actividade ou a função do polipéptido ECSM4 do indivíduo.

Os anticorpos preferidos são aqueles descritos em maior detalhe acima. A produção de anticorpos que modulam a função de um polipéptido exposto à superfície das células é conhecida na 39 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ arte e está discutida em maior detalhe acima. Estes anticorpos poderão modular a função imitando a função do ligando natural e estimulando o polipéptido em termos de actividade ou de função; ou podem modular a função do polipéptido evitando a estimulação do polipéptido pelo ligando impedindo estereoquimicamente o local de ligação do ligando e evitando desse modo a ligação do ligando natural. A entrega de um ligando ao polipéptido "carrossel mágico" poderia ser um inibidor angiogénico útil em terapia do cancro ou de outras doenças envolvendo uma hiperangiogénese. Adicionalmente, a introdução do polipéptido ECSM4 em células endoteliais por terapia génica, utilizando o polinucleótido que codifica ECSM4, poderia alterar o crescimento e a migração.

Um outro aspecto adicional do invento proporciona um método de diagnóstico de uma afecção que envolve o crescimento aberrante ou excessivo do endotélio vascular num indivíduo, o qual compreende obter uma amostra contendo o ácido nucleico do indivíduo e contactar a referida amostra com um polinucleótido que híbrida selectivamente com um ácido nucleico que codifica o polipéptido ECSM4, ou uma sua variante natural, tal como definido na reivindicação 27. 0 método poderá ser utilizado para auxiliar no diagnóstico.

Uma afecção que envolve um crescimento aberrante ou excessivo do endotélio vascular, como um cancro, uma aterosclerose, uma restenose, uma retinopatia diabética, uma artrite, uma psoríase, uma endometriose, uma menorragia, os hemangiomas e as malformações venosas, poderá ser causada por uma mutação no ácido nucleico que codifica o polipéptido ECSM4. 0 polinucleótido que é capaz de hibridar selectivamente com um polinucleótido que codifica o polipéptido ECSM4, ou um seu fragmento ou variante, tem preferencialmente pelo menos 10 nucleótidos, mais preferencialmente pelo menos 15 nucleótidos e ainda mais preferencialmente pelo menos 30 nucleótidos de comprimento. O referido polinucleótido 40 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ poderá ter mais de 100 nucleótidos e poderá ter mais de 200 nucleótidos, mas de preferência o referido polinucleótido não possui mais de 250 nucleótidos. Estes polinucleótidos são úteis como ferramenta de detecção em procedimentos, para demonstrar a presença do polinucleótido numa amostra. Esta amostra poderá ser uma amostra de ADN, tal como uma colónia bacteriana, fixa numa membrana ou filtro.

De preferência, o polinucleótido que é capaz de hibridar selectivamente, como referido, não é nenhuma das sequências nucleotídicas representadas por SEQ ID No. 18084 ou 5096 de EP 1 074 617; SEQ ID No. 210 de WO 00 53756 ou de WO 99/46281 ou SEQ ID Nos. 22, 23, 96 ou 98 de WO 01/23523 ou SEQ ID No. 31 de WO 99/11293.

Por "hibridar selectivamente", pretende dizer-se que o polinucleótido híbrida sob condições de elevado riqor. A hibridação ADN-ADN, ADN-ARN e ARN-ARN poderá ser efectuada em solução aquosa contendo entre 0,1X SSC e 6X SSC e a temperaturas compreendidas entre 55°C e 70°C. É bem conhecido na arte o facto de quanto mais elevada for a temperatura ou quanto menor for a concentração de SSC, mais riqorosas são as condições de hibridação. Por "rigor elevado", pretendemos dizer 2X SSC e 65°C. IX SSC é NaCl 0,15M/citrato de sódio 0,015M. Os polinucleótidos que hibridam em condições de rigor elevado estão incluídos no âmbito do invento reivindicado.

Por "hibridar selectivamente", pretende também dizer-se que o ácido nucleico possui uma similaridade de sequência suficiente com o referido ADNc ou ADN humano, pelo que pode hibridar sob condições extremamente rigorosas. Como é bem sabido na arte, o rigor da hibridação do ácido nucleico depende de factores como o comprimento do ácido nucleico com o qual ocorre a hibridação, o grau de identidade das sequências que irão hibridar e de factores como a temperatura, a força iónica e o teor de CG ou de AT da sequência. Assim, qualquer ácido nucleico que seja capaz de hibridar selectivamente, como referido, é útil na prática do invento.

Os ácidos nucleicos que podem hibridar selectivamente com o referido ADNc ou ADN humano incluem os ácidos nucleicos que possuem >95% de identidade de sequência, preferencialmente 41 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ aqueles com >98%, mais preferencialmente aqueles como >99% de identidade de sequência, em pelo menos uma porção do ácido nucleico, com o referido ADNc ou ADN humano. Como é bem sabido, os genes humanos normalmente contêm intrões, de forma que, por exemplo, um ARNm ou ADNc derivado de um gene contido no referido ADN humano não corresponderia perfeitamente, ao longo de todo o seu comprimento, ao referido ADN humano, mas seria ainda, não obstante, um ácido nucleico capaz de hibridar selectivamente com o referido ADN humano. Assim, o invento inclui especificamente ácidos nucleicos que hibridam selectivamente com um ADNc de ECSM4, mas que poderão não hibridar com um gene ECSM4. Por exemplo, os ácidos nucleicos que abrangem as fronteiras intrão-exão do gene ECSM4 poderão não ser capazes de hibridar selectivamente com o ADNc de ECSM4.

As condições típicas de hibridação extremamente rigorosas, que conduzem a uma hibridação selectiva, são conhecidas na arte; por exemplo, aquelas descritas em Molecular Cloning, a laboratory manual, 2nd edition, Sambrook et al (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA.

Um exemplo de uma solução de hibridação típica quando um ácido nucleico está imobilizado numa membrana de nylon e a sonda de ácido nucleico é > 500 bases ou pares de bases é: 6 x SSC (citrato de sódio salino) dodecilsulfato de sódio (SDS) a 0,5% ADN de esperma de salmão fragmentado e desnaturado 100 μρ/ιηΐ A hibridação é efectuada a 68°C. A membrana de nylon, com 0 ácido nucleico imobilizado, poderá ser lavada a 68°C, para obtenção de rigor elevado, em 0,1 x SSC. A solução 20 x SSC poderá ser preparada da seguinte forma. Dissolve-se 175,3 g de NaCl e 88,2 g de citrato de sódio em 800 ml de água. Ajusta-se o pH a 7,0 com algumas gotas de uma solução de NaOH 10 N. Ajusta-se o volume para 1 litro com H20. Distribui-se por alíquotas. Esteriliza-se em autoclave. 42 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Um exemplo de uma solução de hibridação típica quando um ácido nucleico está imobilizado numa membrana de nylon e a sonda é um oligonucleótido com 15 a 50 bases é: cloreto de trimetilamónio 3,0M (TMAC1) fosfato de sódio Ο,ΟΙΜ (pH 6,8) EDTA 1 mM (pH 7,6) SDS a 0,5% ADN de esperma de salmão fragmentado e desnaturado 100 μg/ml leite magro em pó a 0,1% A temperatura óptima para a hibridação é normalmente seleccionada de forma a ser 5°C abaixo da Ti para aquele comprimento de cadeia particular. T± é a temperatura de fusão irreversível do híbrido formado entre a sonda e a sua sequência alvo. Jacobs et al (1988) Nucl. Acids Res. 16, 4637 discutem a determinação das temperaturas Ti. A temperatura de hibridação recomendada para um comprimento de 17 nucleótidos, em TMAC1 3M, é de 48-50°C; para um comprimento de 19 nucleótidos, é de 55-57°C; e para um comprimento de 20 nucleótidos, é de 58-66°C. O termo "ácido nucleico que híbrida selectivamente" inclui também os ácidos nucleicos que amplificarão o ADN da referida região de ADN humano via qualquer um dos sistemas de amplificação bem conhecidos, como sejam aqueles descritos em maior detalhe abaixo, em particular a reacção em cadeia da polimerase (PCR). As condições adequadas para a amplificação por PCR incluem a amplificação num tampão de amplificação lx adequado: tampão de amplificação lOx é KC1 500 mM; Tris. Cl 100 mM (pH 8,3 à temperatura ambiente); MgCl2 15 mM; gelatina a 0,1%.

Um agente ou procedimento (como seja o aquecimento a 95°C) desnaturante adequado é utilizado de forma a separar as cadeias de ADN de cadeia dupla.

Adequadamente, a parte de hibridação dos iniciadores do processo de amplificação tem lugar entre 37°C e 60°C, preferencialmente 50°C. 43 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Embora ο ácido nucleico que é útil nos métodos do invento possa ser o ARN ou o ADN, o ADN é preferido. Embora o ácido nucleico que é útil nos métodos do invento possa ser de cadeia dupla ou de cadeia simples, o ácido nucleico de cadeia simples é preferido em algumas circunstâncias, por exemplo, nas reacções de amplificação de ácidos nucleicos.

Assim, o polinucleótido pode ser utilizado como um iniciador na reacção em cadeia da polimerase (PCR) e, nesta capacidade, é preferido um polinucleótido com 15 a 30 nucleótidos. É particularmente preferido se o iniciador de PCR contiver cerca de 15 a 30 nucleótidos contíguos (isto é, correspondências perfeitas) da sequência nucleotídica proporcionada na Figura 4 ou Figura 12.

Os iniciadores que são adequados para utilizar numa reacção em cadeia da polimerase (PCR; Saiki et al (1988) Science 239, 487-491) são preferidos. Os iniciadores de PCR apropriados poderão ter as propriedades que se seguem: É bem conhecido o facto de a sequência na extremidade 5' do oligonucleótido não precisar de corresponder à sequência alvo que será amplificada. É habitual que os iniciadores de PCR não contenham quaisquer estruturas complementares um do outro com mais de 2 bases, especialmente nas suas extremidades 3', uma vez que esta característica poderia promover a formação de um produto de artefacto denominado "dímero de iniciadores". Quando as extremidades 3' dos dois iniciadores hibridam, eles formam um complexo "modelo de iniciadores", e a extensão dos iniciadores resulta num produto dúplex curto denominado "dímero de iniciadores". A estrutura secundária interna deve ser evitada nos iniciadores. Para um PCR simétrico, é muitas vezes recomendado um teor G+C de 40-60% para ambos os iniciadores, sem grandes extensões de qualquer uma das bases. Os cálculos clássicos da temperatura de fusão, utilizados em conjunto com os estudos de hibridação de sondas de ADN, preveem frequentemente que um dado iniciador deve hibridar a uma temperatura específica ou que a temperatura de extensão de 72°C dissociará o híbrido 44 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ iniciador/modelo prematuramente. Na prática, os híbridos são mais eficazes no processo de PCR que geralmente previsto através de simples cálculos da Tf.

As temperaturas de hibridação óptimas poderão ser determinadas empiricamente e poderão ser mais elevadas que o previsto. A ADN-polimerase Taq possui efectivamente actividade na região de 37-55°C, pelo que a extensão de iniciadores ocorrerá durante o passo de hibridação e o híbrido será estabilizado. As concentrações dos iniciadores são iguais na reacção de PCR convencional (simétrica) e, normalmente, encontram-se no intervalo de 0,1 a 1 nM.

Quando um par de ácidos nucleicos adequados do invento é utilizado numa reacção de PCR, é conveniente detectar o produto por electroforese em gel e coloração com brometo de etídio. Como alternativa à detecção do produto da amplificação de ADN utilizando electroforese em gel de agarose e coloração do ADN com brometo de etídio, é conveniente utilizar um

oligonucleótido marcado capaz de hibridar com o ADN

amplificado como uma sonda. Quando a amplificação se efectua por PCR, a sonda oligonucleotídica hibrida com a sequência inter-iniciadores definida pelos dois iniciadores. A sonda poderá ser marcada com um radionuclido como 32P, 33P e 35S utilizando técnicas Standard, ou poderá ser marcada com um corante fluorescente. Quando a sonda oligonucleotídica está marcada de forma fluorescente, o produto de ADN amplificado poderá ser detectado em solução (ver, por exemplo, Balaguer et al (1991) "Quantification of DNA sequences obtained by polymerase chain reaction using a bioluminescence adsorbent" Anal. Biochem. 195, 105-110 e Dilesare et al (1993) "A high-sensitivity electrochemiluminescence based detection system for automated PCR product quantitation" BioTechniques 15, 152-157.

Os produtos de PCR também podem ser detectados utilizando uma sonda que poderá ter um par fluoróforo-desactivador, ou que poderá estar ligada a um suporte sólido, ou que poderá ter uma cauda de biotina, ou poderão ser detectados utilizando uma combinação de uma sonda de captura e uma sonda de detecção. 45 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Os pares de fluoróforo-desactivador são particularmente adequados para efectuar medições quantitativas das reacções de PCR (por exemplo, RT-PCR). A polarização de fluorescência utilizando uma sonda apropriada também poderá ser utilizada para detectar os produtos de PCR.

Os iniciadores oligonucleotidicos podem ser sintetizados utilizando métodos bem conhecidos na arte, por exemplo, utilizando a química de fosforamidito em fase sólida.

Um iniciador polinucleotídico ou oligonucleotídico do invento poderá conter uma ou mais bases modificadas, ou poderá conter um esqueleto que foi modificado para fins de estabilidade ou por outras razões. 0 termo "modificado" inclui, por exemplo, bases tritiladas e bases invulgares como a inosina. Uma variedade de modificações pode ser efectuada no ADN e no ARN, e estas estão incluídas no âmbito do invento.

Numa concretização preferida, os polinucleótidos do invento estão marcados de forma detectável. Os marcadores detectáveis adequados estão descritos em detalhe acima. A amostra poderá ser derivada directamente do doente, por exemplo, por biopsia de um tecido que poderá estar associado a um desenvolvimento vascular aberrante, ou poderá ser derivada do doente a partir de um local distante do tecido, por exemplo, porque as células do tecido migraram deste para outras partes do corpo. Em alternativa, a amostra poderá ser derivada indirectamente do doente, no sentido em que, por exemplo, o tecido ou as células deste poderão ser cultivados in vitro ou cultivados num modelo de xenoenxerto; ou a amostra de ácido nucleico poderá ser uma amostra que foi replicada (in vitro ou in vivo) a partir de ácido nucleico proveniente da fonte original do doente. Assim, embora o ácido nucleico derivado do doente possa ter estado fisicamente dentro dele, ele poderá em alternativa ter sido copiado a partir de ácido nucleico que esteve fisicamente dentro do doente. Quando se crê que o desenvolvimento vascular aberrante está associado a um tumor, o tecido do tumor poderá ser recolhido do tumor primário ou das metástases. 46 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Um método útil do invento inclui a análise de mutações em ECSM4 ou a detecção da presença ou da ausência de ECSM4, em qualquer amostra adequada. A amostra poderá ser uma amostra acabada de obter do doente, ou a amostra poderá ser uma amostra histórica, por exemplo, uma amostra mantida numa biblioteca de amostras.

Convenientemente, o ácido nucleico capaz de hibridar selectivamente com o referido adn humano e que é utilizado nos métodos do invento compreende adicionalmente um marcador detectável.

Por "marcador detectável", pretende designar-se qualquer marcador radioactivo conveniente, como 32P, 33P ou 35S, que pode ser facilmente incorporado numa molécula de ácido nucleico utilizando métodos bem conhecidos; qualquer marcador fluorescente ou quimioluminescente conveniente, que pode ser facilmente incorporado num ácido nucleico, também está incluido. Além disso, o termo "marcador detectável" também inclui um grupo que pode ser detectado em virtude da ligação a outro grupo (como a biotina, que pode ser detectada através da ligação a estreptavidina); e um grupo, tal como uma enzima, que pode ser detectado em virtude da sua capacidade para converter um composto incolor num composto colorido, ou vice-versa (por exemplo, a fosfatase alcalina pode converter o o-nitrofenilfosfato incolor em o-nitrofenol colorido). Convenientemente, a sonda de ácido nucleico poderá ocupar uma determinada posição num ensaio fixo, e o facto de o ácido nucleico hibridar ou não com a referida região do ADN humano pode ser determinado por referência à posição de hibridação no ensaio fixo. 0 marcador detectável também poderá ser um par fluoróforo-desactivador como descrito em Tyagi & Kramer (1996) Nature Biotechnology 14, 303-308.

Convenientemente, neste método de diagnóstico de uma afecção em que o desenvolvimento vascular é aberrante, o ácido nucleico que é capaz da referida hibridação selectiva (quer esteja marcado com um marcador detectável ou não) é colocado em contacto com um ácido nucleico derivado do doente, em condições de hibridação. As condições de hibridação adequadas incluem aquelas descritas cima. 47 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Este método de diagnóstico de uma afecção em que o desenvolvimento vascular é aberrante poderá envolver a sequenciação de adn numa ou mais de uma das posições relevantes dentro da região relevante, incluindo a sequenciação directa; a sequenciação directa de exões amplificados por PCR; a hibridação diferencial de uma sonda oligonucleotídica concebida para hibridar ao nível das posições relevantes dentro da região relevante (convenientemente, esta abordagem utiliza sondas oligonucleotídicas imobilizadas nos denominados sistemas de "chip", que são bem conhecidos na arte) ; a electroforese em gel desnaturante, após a digestão com uma enzima de restrição apropriada, preferencialmente após a amplificação das regiões de ADN relevantes; a análise da sequência utilizando a nuclease Sl; a electroforese em gel não desnaturante, preferencialmente após amplificação das regiões de ADN relevantes; ensaios de RFLP convencionais (de "Restriction Fragment Length Polymorphism" - polimorfismo do tamanho de fragmentos de restrição); a análise de heterodúplices; a amplificação selectiva de ADN utilizando oligonucleótidos; a hibridação fluorescente in situ (FISH) de cromossomas interfásicos; a ARMS-PCR (de "Amplification Refractory Mutation System-PCR") para mutações específicas; a clivagem em locais divergentemente emparelhados em ácidos nucleicos hibridados (sendo a clivagem de tipo químico ou enzimático); o SSCP (de "Single Strand Conformational Polymorphism" polimorfismo conformacional de cadeia simples) ou a DGGE ("Discontinuous or Denaturing Gradient Gel Electrophoresis" -electroforese em gel de gradiente desnaturante); a análise para detectar desigualdades de emparelhamento em ADN normal/mutante amplificado por PCR e hibridado; e o ensaio de truncamento de proteínas (tradução e transcrição de exões - se uma mutação introduzir um codão stop, resultará um produto proteico truncado). Outros métodos, como a detecção de alterações na estrutura secundária do ADN de cadeia simples resultantes de alterações na sequência primária, por exemplo, utilizando a enzima clivase I, poderão ser empregues. Este sistema está disponível comercialmente através de GibcoBRL, Life Technologies, 3 Fountain Drive, Inchinnan Business Park, Paisley PA4 9RF, Escócia. 48 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Os métodos do invento também poderão ser executados em "chips de ADN". Estes "chips" estão descritos na Patente US 5,445,934 (Affymetrix; conjuntos de sondas), WO 96/31622 (Oxford; conjunto de sondas mais extensão com ligase ou polimerase) e WO 95/22058 (Affymax; alvos marcados de forma fluorescente ligam-se a substrato oligomérico e a localização no conjunto é detectada).

Os métodos detalhados de detecção de mutações estão descritos em "Laboratory Protocols for Mutation Detection" 1996, ed. Landegren, Oxford University Press, em nome de HUGO (Human Genome Organisation). É preferido que o RFLP seja utilizado para a detecção de deleções ou inserções bastante grandes (> 500 pb). As transferências de Southern poderão ser utilizadas para este método do invento. A amplificação por PCR de regiões mais pequenas (máximo de 300 pb) para detectar pequenas alterações maiores que inserções ou deleções de 3-4 pb poderá ser preferida. A sequência amplificada poderá ser analisada num gel de sequenciação, e as pequenas alterações (tamanho minimo de 3-4 pb) podem ser visualizadas. Os iniciadores adequados são concebidos da forma aqui descrita.

Adicionalmente, utilizando quer a análise de transferência de Southern quer a reacção de PCR e enzimas de restrição, é possivel detectar locais variantes. Por exemplo, para analisar locais variantes no ADN genómico: digestão com enzimas de restrição, electroforese em gel, transferência de Southern e hibridação com uma sonda especifica (por exemplo, qualquer fragmento adequado derivado do ADNc ou do gene ECSM4).

Por exemplo, para analisar locais variantes utilizando PCR: amplificação de ADN, digestão com enzimas de restrição, detecção em gel por brometo de etidio, coloração com prata ou incorporação de radionucleótido ou de iniciador fluorescente no PCR. 49 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Outros métodos adequados incluem o desenvolvimento de oligonucleótidos específicos de alelos (ASO, de "Allele Specific Oligonucleotides") para eventos mutacionais específicos. Utilizam-se métodos similares no arn e no ADNc para o tecido adequado.

Embora seja útil detectar mutações em qualquer parte do gene ECSM4, é preferido se as mutações forem detectadas nos exões do gene, e é adicionalmente preferido se as mutações forem mutações que alteram o sentido de codificação. A detecção destas mutações é um aspecto preferido do invento.

Os métodos do invento também incluem a verificação da perda de heterozigosidade (LOH; apresenta uma cópia perdida). A LOH (de "Loss Of Heterozygosity") poderá ser um marcador suficiente para o diagnóstico; a pesquisa de mutação/perda do segundo alelo poderá não ser necessária. A LOH do gene poderá ser detectada utilizando polimorfismos na sequência codificante, e intrões, do gene.

Os ácidos nucleicos particularmente preferidos para utilizar nos métodos do invento acima referidos são aqueles seleccionados entre o grupo que consiste em iniciadores adequados para amplificar os ácidos nucleicos.

Convenientemente, os iniciadores são seleccionados entre o grupo que consiste em iniciadores que hibridam com as sequências nucleotídicas apresentadas em qualquer uma das Figuras que ilustram sequências de ADNc ou do gene ECSM4 humano. É particularmente preferido se os iniciadores hibridarem com os intrões do gene ECSM4 ou se os iniciadores forem iniciadores que iniciarão a síntese de ADN a partir do ADNc ou do gene ECSM4, mas não de outros genes ou ADNc.

Os iniciadores que são adequados para utilizar numa reacção em cadeia da polimerase (PCR; Saiki et al (1988) Science 239, 487-491) são preferidos. Os iniciadores de PCR e os métodos de detecção de produtos das reacções de PCR adequados estão descritos em pormenor acima.

Qualquer um dos protocolos de amplificação de ácidos nucleicos pode ser utilizado no método do invento, incluindo a reacção em cadeia da polimerase, a reacção da replicase QB e a 50 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ reacção em cadeia da ligase. Além disso, a NASBA (de "Nucleic Acid Sequence Based Amplification" - amplificação de ácidos nucleicos baseada na sequência), também designada por 3SR, pode ser utilizada da forma descrita em Compton (1991) Nature 350, 91-92 e AIDS (1993), Vol 7 (Suppl 2), S108; ou a SDA (de "Strand Displacement Amplification" - amplificação com remoção de cadeia) pode ser utilizada da forma descrita em Walker et al (1992) Nucl. Acids Res. 20, 1691-1696. A reacção em cadeia da polimerase é particularmente preferida devido à sua simplicidade. O presente invento proporciona a utilização de um ácido nucleico que híbrida selectivamente com o ADN de clones genómicos derivado de ser humano, tal como descrito na Tabela 8 do Exemplo 1, ou com o ECSM4, ou um seu alelo mutante, ou com um ácido nucleico que híbrida selectivamente com o ADNc de ECSM4, ou um seu alelo mutante, ou o seu complemento, num método de diagnóstico de uma afecção em que o desenvolvimento vascular é aberrante; ou no fabrico de um reagente para realizar estes métodos.

Os polinucleótidos preferidos, que hibridam selectivamente com o ADNc ou o gene ECSM4, são tal como descritos acima em relação a um método de diagnóstico.

Além disso, o presente invento disponibiliza um método de determinação da presença ou da ausência do referido gene ECSM4, ou de uma sua mutação. Preferencialmente, o método utiliza uma amostra adequada de um doente.

Os métodos do invento incluem a detecção de mutações no gene ECSM4.

Os métodos do invento poderão fazer uso de uma diferença ao nível dos locais de clivagem das enzimas de restrição causada por mutação. Um gel não desnaturante poderá ser utilizado para detectar diferentes tamanhos de fragmentos, resultantes da digestão com uma enzima de restrição apropriada.

Uma "enzima de restrição apropriada" é uma enzima que reconhecerá e cortará a sequência de tipo selvagem e não a sequência mutada, ou vice-versa. A sequência que é reconhecida 51 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ e cortada pela enzima de restrição (ou não, consoante o caso) pode estar presente em consequência da mutação ou pode ser introduzida no alelo normal ou mutante, utilizando oligonucleótidos com desigualdades na reacção de PCR. É conveniente que a enzima corte o ADN apenas pouco frequentemente; por outras palavras, que reconheça uma sequência que ocorre apenas raramente.

Em outro método, é utilizado um par de iniciadores de PCR que corresponde (isto é, híbrida com) ao genótipo de tipo selvagem ou ao genótipo mutante, mas não a ambos. 0 facto de ser ou não produzido ADN amplificado indicará depois o genótipo selvagem ou mutante (e daí o fenótipo). Contudo, este método assenta parcialmente num resultado negativo (isto é, a ausência de ADN amplificado), o qual pode dever-se a uma falha técnica. Ele poderá, por conseguinte, ser menos fiável e/ou requerer experiências de controlo adicionais.

Um método preferível utiliza iniciadores de PCR similares que, contudo, além de hibridarem apenas com uma das sequências de tipo selvagem ou mutante, introduzem um local de restrição que, de outra forma, não está presente em nenhuma das sequências de tipo selvagem ou mutante.

Os ácidos nucleicos que hibridam selectivamente com o ADNc ou o gene ECSM4, ou que hibridam selectivamente com os clones genómicos contendo ECSM4, como indicados na Tabela 8 do Exemplo 1, são úteis para várias finalidades. Eles podem ser utilizados em hibridação de Southern com ADN genómico e no método de protecção da ARNase para detectar mutações pontuais já discutidos acima. As sondas podem ser utilizadas para detectar produtos de amplificação por PCR. Elas também poderão ser utilizadas para detectar desigualdades em relação ao gene ou ao ARNm de ECSM4 numa amostra, utilizando outras técnicas. As desigualdades podem ser detectadas utilizando enzimas (por exemplo, a nuclease SI ou a resolvase), reagentes (por exemplo, a hidroxilamina ou o tetróxido de ósmio e a piperidina) ou alterações na mobilidade electroforética dos híbridos emparelhados divergentemente, em comparação com os híbridos totalmente emparelhados de forma correcta. Estas técnicas são conhecidas na arte. Geralmente, as sondas são complementares das sequências que codificam o gene ECSM4, 52 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ embora as sondas para determinados intrões também estejam contempladas. Um conjunto de sondas de ácido nucleico poderá ser utilizado para constituir um kit para detectar a perda do gene ECSM4 de tipo selvagem, ou uma mutação neste gene. 0 kit permite a hibridação com o gene ECSM4 completo. As sondas poderão sobrepor-se umas às outras ou poderão ser contíguas.

Caso seja utilizada uma ribossonda para detectar emparelhamentos divergentes com o ARNm, ela é complementar do ARNm do gene ECSM4 humano. A ribossonda é, assim, uma sonda anti-sentido, na medida em que não codifica a proteína codificada pelo gene ECSM4, dado que tem a polaridade oposta da cadeia de sentido directo. A ribossonda estará geralmente marcada, por exemplo, marcada radioactivamente, o que pode ser efectuado por qualquer meio conhecido na arte. Se a ribossonda for utilizada para detectar emparelhamentos divergentes com o ADN, ela poderá ter qualquer uma das polaridades, de sentido directo ou anti-sentido. De forma semelhante, as sondas de ADN também poderão ser utilizadas para detectar emparelhamentos divergentes.

As sondas de ácido nucleico também poderão ser complementares de alelos mutantes do gene ECSM4. Estas são úteis para detectar mutações semelhantes em outros doentes, com base na hibridação e não em emparelhamentos divergentes. Como referido acima, as sondas para o gene ECSM4 também podem ser utilizadas em hibridações de Southern com o ADN genómico, para detectar grandes alterações cromossómicas como deleções e inserções.

Os métodos particularmente úteis de detecção de uma mutação no gene ECSM4 incluem o polimorfismo conformacional de cadeia simples (SSCP), a análise de heterodúplices, a reacção em cadeia da polimerase, a utilização de chips de ADN e a sequenciação.

Qualquer amostra contendo ácido nucleico derivado do indivíduo é útil nos métodos do invento. É preferido se o ácido nucleico na amostra for ADN. Assim, as amostras de células poderão ser obtidas de formas bem conhecidas na arte, por exemplo, a partir de amostras de sangue ou de células da face ou similares. Quando os métodos estiverem a ser 53 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ utilizados para determinar a presença ou a ausência de uma mutação numa criança ainda não nascida, é preferido que a amostra seja uma amostra materna contendo ácido nucleico da criança ainda por nascer. As amostras maternas adequadas incluem o fluido amniótico da mãe, amostras de vilosidades coriais e amostras de sangue a partir das quais é possível isolar células do feto.

Um aspecto adicional do invento disponibiliza a utilização de um ácido nucleico anti-sentido que evita selectivamente a expressão de ECSM4, na preparação de um medicamento destinado a reduzir a expressão do polinucleótido ECSM4 humano num indivíduo, tal como definido na reivindicação 29.

De preferência, o ácido nucleico anti-sentido não é um ácido nucleico (ou não é anti-sentido em relação a um ácido nucleico) cuja sequência consiste na sequência representada pela SEQ ID No. 18084 ou 5096 de ΕΡ 1 074 617; SEQ ID No. 210 de WO 00/53756 ou de WO 99/46281; SEQ ID Nos. 22, 23, 96 ou 98 de WO 01/23523 ou SEQ ID No. 31 de WO 99/11293, ou o seu complemento, ou uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido cuja sequência de aminoácidos é representada por qualquer uma de SEQ ID No. 18085 de ΕΡ 1 074 617; SEQ ID No. 211 de WO 00/53756 ou de W0 99/46281; SEQ ID Nos. 24-27, 29, 30, 33, 34, 38 ou 39 de WO 01/23523 ou SEQ ID No. 86 de WO 99/11293.

Um aspecto adicional do invento inclui a administração de um ácido nucleico anti-sentido a uma célula, de forma a evitar a expressão de ECSM4. Normalmente, a célula encontra-se no corpo de um indivíduo que necessita que a expressão de ECSM4 seja evitada. O polinucleótido ECSM4 que está ligado por uma molécula anti-sentido poderá ser ADN ou ARN.

As moléculas anti-sentido preferidas são tal como descritas acima. 54 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

As doenças que poderão ser tratadas através de redução da expressão de ECSM4 incluem as doenças que envolvem uma vascularização aberrante ou excessiva como descrita acima.

Os ácidos nucleicos anti-sentido são bem conhecidos na arte e são tipicamente ácidos nucleicos de cadeia simples, que se podem ligar especificamente a uma sequência de ácido nucleico complementar. Ao ligarem-se à sequência alvo apropriada, forma-se um dúplex ARN-ARN, ADN-ADN ou ARN-ADN. Estes ácidos nucleicos são muitas vezes denominados "anti-sentido", pois são complementares da cadeia de sentido directo ou codificante do gene. Recentemente, a formação de uma hélice tripla, em que o oligonucleótido está ligado a um dúplex de ADN, mostrou-se possível. Verificou-se que os oligonucleótidos podiam reconhecer sequências no sulco principal da dupla hélice de ADN. Formou-se, deste modo, uma tripla hélice. Isto sugere que é possível sintetizar moléculas específicas para uma dada sequência, que se ligam especificamente ao ADN de cadeia dupla através do reconhecimento dos locais de ligação de hidrogénio no sulco principal.

Ao ligarem-se ao ácido nucleico visado, os oligonucleótidos acima referidos podem inibir a função do ácido nucleico visado. Isto poderia ser, por exemplo, um resultado do bloqueio da transcrição, do processamento, da adição de poli(A), da replicação ou da tradução, ou um resultado da promoção de mecanismos de inibição das células, por exemplo, a promoção de degradações do ARN.

Os oligonucleótidos anti-sentido são preparados no laboratório e depois introduzidos nas células, por exemplo, por micro-injecção ou captação a partir do meio de cultura para o interior das células; ou são expressos nas células após transfecção com plasmídeos ou retrovírus ou outros vectores que transportam um gene anti-sentido. Foi inicialmente constatado que os oligonucleótidos anti-sentido inibiam a replicação virai ou a expressão em cultura celular do vírus do sarcoma de Rous, do vírus da estomatite vesicular, do vírus herpes simplex tipo 1, do vírus símio e do vírus influenza. Desde essa altura, a inibição da tradução do ARNm por oligonucleótidos anti-sentido foi amplamente estudada em 55 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ sistemas isentos de células, incluindo lisados de reticulócitos de coelho e extractos de gérmen de trigo. A inibição da função virai por oligonucleótidos anti-sentido tem sido demonstrada in vitro, utilizando oligonucleótidos que eram complementares do ARN do retrovirus VIH da SIDA (Goodchild, J. 1988 "Inhibition of Human Immunodeficiency Virus Replication by Antisense Oligodeoxynucleotides", Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 85(15), 5507-11). O estudo de Goodchild mostrou que os oligonucleótidos mais eficazes foram aqueles complementares do sinal poli(A); também eficazes foram aqueles dirigidos para a extremidade 5' do ARN, particularmente a coifa e a região 5' não traduzida, junto ao local de ligação do iniciador e no próprio local de ligação do iniciador. A coifa, a região 5' não traduzida e o sinal poli(A) situam-se no interior da sequência repetida nas extremidades do ARN do retrovirus (região R), e os oligonucleótidos complementares destes poderão ligar-se duas vezes ao ARN.

Tipicamente, os oligonucleótidos anti-sentido têm um tamanho compreendido entre 15 e 35 bases. Por exemplo, oligonucleótidos com 20 unidades têm revelado inibir a expressão do ARNm do receptor do factor de crescimento epidérmico (Witters et al, Breast Câncer Res Treat 53:41-50 (1999)) e oligonucleótidos com 25 unidades têm revelado diminuir a expressão da hormona adrenocorticotrópica em mais de 90% (Frankel et al, J Neurosurg 91:261-7 (1999)). Contudo, poderá ser desejável utilizar oligonucleótidos com tamanhos fora deste intervalo, por exemplo, 10, 11, 12, 13 ou 14 bases ou 36, 37, 38, 39 ou 40 bases.

Os oligonucleótidos estão sujeitos a degradação ou inactivação pelas nucleases endógenas celulares. Para contrabalançar este problema, é possível utilizar oligonucleótidos modificados, por exemplo, possuindo ligações internucleótidos alteradas, em que as ligações fosfodiéster naturais foram substituídas por outra ligação. Por exemplo, Agrawal et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 7079-7083 mostraram uma inibição acrescida do VIH-1 em cultura de tecidos, utilizando oligonucleótidos fosforamidatos e fosforotioatos. Sarin et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 7448-7451 demonstraram a existência de uma inibição acrescida do VIH-1, utilizando oligonucleótidos 56 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ metilfosfonatos. Agrawal et al (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 7790-7794 mostraram a inibição da replicação do VIH-1 em culturas de células não só precocemente como cronicamente infectadas, utilizando oligonucleótidos fosforotioatos específicos para determinadas sequências nucleotídicas. Leither et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 3430-3434 referem a inibição, em cultura de tecidos, da replicação do vírus influenza por oligonucleótidos fosforotioatos.

Foi demonstrado que os oligonucleótidos que possuem ligações artificiais são resistentes à degradação in vivo. Por exemplo, Shaw et al (1991) in Nucleic Acids Res. 19, 747-750 referem que os oligonucleótidos não modificados de qualquer outra forma tornam-se mais resistentes às nucleases in vivo quando estão bloqueados na extremidade 3' por determinadas estruturas de coifa, e que os oligonucleótidos fosforotioatos sem coifa não são degradados in vivo.

Uma descrição detalhada da abordagem H-fosfonato para sintetizar oligonucleósidos fosforotioatos é proporcionada em Agrawal & Tang (1990) Tetrahedron Letters 31,7541-7544. As sínteses de metilfosfonatos, fosforoditioatos, fosforamidatos, ésteres fosfato, fosforamidatos em ponte e fosforotioatos em ponte, de oligonucleósidos, são conhecidas na arte. Ver, por exemplo, Agrawal & Goodchild (1987) Tetrahedron Letters 28, 3539; Nielsen et al (1988) Tetrahedron Letters 29, 2911; Jager et al (1988) Biochemistry 27, 7237; Uznanski et al (1987)

Tetrahedron Letters 28, 3401; Bannwarth (1988) Helv. Chim.

Acta. 71, 1517; Crosstick & Vyle (1989) Tetrahedron Letters 30, 4693; Agrawal et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 1401-1405. Outros métodos para síntese ou produção também são possíveis. Numa concretização preferida, o oligonucleótido é um ácido desoxirribonucleico (ADN), embora também possam ser sintetizadas e aplicadas sequências de ácido ribonucleico (ARN).

Os oligonucleótidos úteis no invento são preferencialmente concebidos para resistir à degradação por enzimas nucleolíticas endógenas. A degradação in vivo dos oligonucleótidos produz produtos de degradação de tamanho reduzido. Estes produtos de degradação são mais susceptíveis de participar numa hibridação não específica e menos 57 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ susceptíveis de ser eficazes, em relação aos seus homólogos completos. Assim, é desejável utilizar oligonucleótidos que sejam resistentes à degradação no corpo e sejam capazes de chegar às células visadas. Os presentes oligonucleótidos podem ser tornados mais resistentes à degradação in vivo por substituição de uma ou mais ligações fosfodiéster nativas por ligações internucleótidos artificiais internas, por exemplo, substituindo o fosfato por enxofre na ligação. Os exemplos de ligações que poderão ser utilizadas incluem fosforotioatos, metilfosfonatos, sulfona, sulfato, cetilo, fosforoditioatos, vários fosforamidatos, ésteres fosfato, fosforotioatos em ponte e fosforamidatos em ponte. Estes exemplos são ilustrativos e não restritivos, uma vez que são conhecidas na arte outras ligações internucleótidos. Ver, por exemplo, Cohen (1990) Trends in Biotechnology. A síntese de oligonucleótidos possuindo uma ou mais ligações internucleótidos fosfodiéster substituídas por estas ligações é bem conhecida na arte, incluindo vias sintéticas para produzir oligonucleótidos possuindo ligações internucleótidos mistas.

Os oligonucleótidos podem ser tornados resistentes à extensão por enzimas endógenas através de remates ou incorporação de grupos similares nos nucleótidos terminais 5' ou 3'. Um reagente para introduzir coifas está disponível comercialmente como Amino-Link II de Applied BioSystems Inc, Foster City, CA. Os métodos para incorporação de coifas são descritos, por exemplo, por Shaw et al (1991) Nucleic Acids Res. 19, 747-750 e Agrawal et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88(17), 7595-7599.

Um método adicional para tornar os oligonucleótidos resistentes ao ataque por nucleases consiste em serem "auto-estabilizados" como descrito por Tang et al (1993) Nucl. Acids Res. 21, 2729-2735. Os oligonucleótidos auto-estabilizados possuem estruturas em volta do tipo "gancho de cabelo" nas suas extremidades 3' e mostram uma resistência acrescida à degradação pela fosfodiesterase de veneno de cobra, a ADN-polimerase I e o soro fetal de bovino. A região auto-estabilizada do oligonucleótido não interfere na hibridação com os ácidos nucleicos complementares, e os estudos farmacocinéticos e de estabilidade em ratinhos revelaram uma 58 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ persistência acrescida in vivo dos oligonucleótidos auto-estabilizados em relação aos seus homólogos lineares.

De acordo com o invento, o medicamento compreendendo o composto anti-sentido poderá destinar-se a uma administração sistémica. Em alternativa, a especificidade de ligação inerente aos oligonucleótidos anti-sentido, que é caracteristica do emparelhamento de bases, é aumentada ao limitar-se a disponibilidade do composto anti-sentido no seu locus pretendido in vivo, o que permite a utilização de doses mais baixas e minimiza os efeitos sistémicos. Desta forma, os oligonucleótidos poderão ser aplicados localmente para obter o efeito desejado. A concentração dos oligonucleótidos no locus desejado é muito mais elevada que se os oligonucleótidos fossem administrados sistemicamente, e o efeito terapêutico pode ser alcançado utilizando uma quantidade total significativamente inferior. A concentração local elevada de oligonucleótidos aumenta a penetração nas células visadas e bloqueia eficazmente a tradução das sequências de ácido nucleico visadas.

Os oligonucleótidos podem ser administrados ao locus por qualquer meio apropriado para a administração localizada de uma droga. Por exemplo, uma solução dos oligonucleótidos pode destinar-se a injecção directamente no local ou pode destinar-se a entrega por infusão, utilizando uma bomba de infusão. Os oligonucleótidos também podem ser incorporados num dispositivo implantável que, quando é colocado no local desejado, permite que os oligonucleótidos sejam libertados no locus circundante.

Os oligonucleótidos poderão ser formulados para administração via um material de tipo hidrogel. 0 hidrogel é não inflamatório e biodegradável. Actualmente conhecem-se muitos destes materiais, incluindo aqueles preparados a partir de polímeros naturais e sintéticos. Numa concretização preferida, o método explora um hidrogel que é líquido abaixo da temperatura do corpo, mas que gelifica para formar um hidrogel semi-sólido que retém a forma à temperatura corporal ou próximo dela. Os hidrogéis preferidos são polímeros de unidades de repetição de óxido de etileno-óxido de propileno. As propriedades do polímero estão dependentes do peso molecular do polímero e da percentagem relativa de poli(óxido 59 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ de etileno) e poli(óxido de propileno) no polímero. Os hidrogéis preferidos contêm cerca de 10% a 80% em peso de óxido de etileno e cerca de 20% a 90% em peso de óxido de propileno. Um hidrogel particularmente preferido contém cerca de 70% de poli (óxido de etileno) e 30% de poli (óxido de propileno). Os hidrogéis que podem ser utilizados estão disponíveis, por exemplo, de BASF Corp., Parsippany, NJ, sob a marca registada PluronicR.

Nesta concretização, o hidrogel é arrefecido para um estado líquido, e os oligonucleótidos são misturados no líquido, para uma concentração de cerca de 1 mg de oligonucleótido por grama de hidrogel. A mistura resultante é depois aplicada sobre a superfície a tratar, por exemplo, por pulverização ou pintura durante a cirurgia ou utilizando um cateter ou procedimentos endoscópicos. À medida que o polímero aquece, ele solidifica para formar um gel, e os oligonucleótidos difundem-se do gel para as células circundantes, ao longo de um período de tempo definido pela composição exacta do gel.

Os oligonucleótidos ou os outros agentes poderão destinar-se a administração a um doente após a remoção cirúrgica de um tumor, por exemplo, administração à área da qual o tumor foi removido e ao tecido circundante, por exemplo, utilizando citoscopia para dirigir a aplicação dos oligonucleótidos ou de outros agentes.

Os oligonucleótidos podem ser formulados para administração através de outros implantes que estão disponíveis comercialmente ou se encontram descritos na literatura científica, incluindo os lipossomas, as microcápsulas e os dispositivos implantáveis. Por exemplo, os implantes preparados a partir de materiais biodegradáveis, como polianidridos, poliortoésteres, poli(ácido láctico) e poli(ácido glicólico) e os seus copolímeros, colagénio e polímeros proteicos; ou de materiais não biodegradáveis, como etileno-acetato de vinilo (EVAc), poli(acetato de vinilo), etileno-álcool vinilico e seus derivados, podem ser utilizados para administrar localmente os oligonucleótidos. Os oligonucleótidos podem ser incorporados no material à medida que este é polimerizado ou solidificado, utilizando técnicas 60 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ de fusão ou de evaporação do solvente, ou sendo misturados mecanicamente com o material. Numa concretização, os oligonucleótidos são misturados com, ou aplicados sobre, revestimentos destinados a dispositivos implantáveis, tais como cateteres, stents ou esferas de silica revestidas com dextrano. A dose de oligonucleótidos está dependente do tamanho dos oligonucleótidos e da finalidade para a qual eles são administrados. Em geral, o intervalo é calculado com base na área superficial de tecido a tratar. A dose eficaz de oligonucleótido está algo dependente do tamanho e da composição química do oligonucleótido, mas encontra-se geralmente compreendida no intervalo entre cerca de 30 e 3000 μρ por centímetro quadrado de área superficial de tecido.

Os oligonucleótidos poderão destinar-se a administração sistémica ao doente para fins não só terapêuticos, como também profilácticos. Os oligonucleótidos poderão ser formulados para administração por qualquer meio eficaz, por exemplo, parentericamente (por exemplo, intravenosamente, subcutaneamente, intramuscularmente) ou por via oral, nasal ou outros meios que permitam aos oligonucleótidos aceder e circular na corrente sanguínea do doente. Os oligonucleótidos administrados sistemicamente são de preferência administrados além dos oligonucleótidos administrados localmente, mas também têm utilidade na ausência de uma administração local. Uma dosagem no intervalo compreendido entre cerca de 0,1 e 10 grama por administração, a um ser humano adulto, será eficaz para este fim.

Os agentes anti-sentido também incluem moléculas maiores que se ligam aos referidos genes ou ao ARNm de ECSM4 e previnem substancialmente a expressão dos referidos genes ou do ARNm de ECSM4 e previnem substancialmente a expressão da referida proteína ECSM4. Assim, a expressão de uma molécula anti-sentido, que é substancialmente complementar do referido ARNm de ECSM4, é considerada parte do invento.

As referidas moléculas maiores poderão ser expressas a partir de qualquer construção genética adequada, tal como descrita abaixo, e administradas ao doente. Tipicamente, a 61 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ construção genética que expressa a molécula anti-sentido compreende pelo menos uma porção do referido ADNc ou gene ECSM4, ligada de forma operacional a um promotor que pode expressar a molécula anti-sentido numa célula. Os promotores que poderão ser activos em células endoteliais estão descritos abaixo.

Embora a construção genética possa ser ADN ou ARN, é preferido que ela seja ADN.

Preferencialmente, a construção genética está adaptada para administração a uma célula humana.

Os meios e métodos de introdução de uma construção genética numa célula, no corpo de um animal, são conhecidos na arte. Por exemplo, as construções do invento poderão ser introduzidas em células endoteliais em proliferação por meio de qualquer método conveniente, por exemplo, métodos envolvendo retrovirus, para que a construção seja inserida no genoma da célula endotelial. Por exemplo, em Kuriyama et al (1991) Cell Struc. and Func. 16, 503-510 são administrados retrovirus purificados. Os retrovirus proporcionam um meio potencial para infectar selectivamente as células endoteliais em proliferação, uma vez que eles apenas se podem integrar no genoma de células em divisão; a maioria das células endoteliais está numa fase quiescente e não receptiva do crescimento celular ou, pelo menos, está a dividir-se muito menos rapidamente que as células angiogénicas. As construções de ADN retroviral, que codificam os referidos agentes anti-sentido, poderão ser preparadas utilizando métodos bem conhecidos na arte. Para produzir retrovirus activos a partir de uma construção destas, é habitual utilizar uma linha celular de empacotamento psi2 ecotrópica crescida em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo soro fetal de vitelo (SFV) a 10%. A transfecção da linha celular é efectuada por co-precipitação com fosfato de cálcio, e os transformantes estáveis são seleccionados por adição de G418 para uma concentração final de 1 mg/ml (assumindo que a construção retroviral contém um gene neoR) . As colónias independentes são isoladas e expandidas, e o sobrenadante de cultura é removido, filtrado através de um filtro com um tamanho de poro de 0,45 μηι e armazenado a -70°C. Para a introdução do retrovirus 62 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ nas células tumorais, é conveniente injectar directamente o sobrenadante retroviral ao qual foi adicionado polibreno 10 μg/ml. No caso de tumores com um diâmetro superior a 10 mm, é apropriado injectar entre 0,1 ml e 1 ml de sobrenadante retroviral, de preferência 0,5 ml.

Em alternativa, tal como descrito em Culver et al (1992) Science 256, 1550-1552, as células que produzem retrovírus são injectadas num tecido especifico. As células produtoras de retrovírus introduzidas desta forma são manipuladas para produzirem activamente partículas de vector retroviral, de forma a ocorrer uma produção contínua do vector no interior da massa tumoral in situ. Assim, as células endoteliais em proliferação podem ser transduzidas com êxito in vivo se forem misturadas com células produtoras de vector retroviral.

Os retrovírus dirigidos também estão disponíveis para utilizar no invento; por exemplo, sequências que conferem afinidades de ligação específicas poderão ser manipuladas em genes virais env preexistentes (ver Miller & Vile (1995) Faseb J. 9, 190-199 para uma análise deste e de outros vectores dirigidos destinados a terapia génica).

Outros métodos envolvem a simples administração da construção à célula para que a expressão aí ocorra, quer durante um período de tempo limitado ou, após a integração no genoma, durante um período maior de tempo. Um exemplo da última abordagem inclui os lipossomas (preferencialmente, dirigidos para as células endoteliais) (Nássander et al (1992) Câncer Res. 52, 646-653).

Os imunolipossomas (lipossomas dirigidos por anticorpos) são especialmente úteis em termos de direccionamento para os tipos de células endoteliais que expressam uma proteína da superfície celular para a qual estão disponíveis anticorpos.

Outros métodos de entrega incluem adenovírus que transportam ADN externo via uma ponte anticorpo-polilisina (ver Curiel Prog. Med. Virol. 40, 1-18) e conjugados de transferrina-policatião como transportadores (Wagner et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 3410-3414). No primeiro destes métodos, forma-se um complexo de policatião-anticorpo 63 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ com a construção de ADN ou com outra construção genética do invento, em que o anticorpo é especifico ou para o adenovirus de tipo selvagem ou para uma variante do adenovirus na qual foi introduzido um novo epítopo que se liga ao anticorpo. 0 grupo policatião liga-se ao ADN através de interacções electrostáticas com o esqueleto de fosfato. 0 adenovirus, uma vez que contém fibra inalterada e proteínas penton, é internalizado na célula e transporta com ele para o interior da mesma a construção de ADN do invento. É preferido que o policatião seja a polilisina. 0 ADN também poderá ser entregue através de adenovirus, em que o ADN está presente no interior da partícula de adenovirus, por exemplo, como descrito abaixo.

No segundo destes métodos, é utilizado um sistema de entrega de ácidos nucleicos extremamente eficaz, que utiliza a endocitose mediada por receptor para transportar macromoléculas de ADN para o interior das células, isto é obtido através da conjugação da proteína de transporte de ferro, transferrina, com policatiões que se ligam aos ácidos nucleicos. A transferrina humana, ou a sua homóloga de galinha, conalbumina, ou combinações delas, é ligada covalentemente à pequena proteína de ligação ao ADN protamina, ou a polilisinas de vários tamanhos, através de uma ligação dissulfureto. Estas moléculas de transferrina modificadas mantêm a capacidade de ligação ao seu receptor cognato, bem como de mediação de um transporte eficaz do ferro para o interior da célula. As moléculas de transferrina-policatião formam complexos electroforeticamente estáveis com as construções de ADN ou com outras construções genéticas do invento, independentemente do tamanho do ácido nucleico (desde oligonucleótidos curtos até ADN com 21 pares de quilobases). Quando os complexos de transferrina-policatião e as construções de ADN ou outras construções genéticas do invento são proporcionados às células endoteliais, é esperado um nível elevado de expressão nas células a partir da construção. A entrega de elevada eficácia das construções de ADN ou de outras construções genéticas do invento mediada por receptores, que utiliza a actividade de ruptura dos endossomas de partículas de adenovirus anómalas ou quimicamente 64 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ inactivadas produzidas pelos métodos de Cotten et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 6094-6098, poderá também ser utilizada. Esta abordagem parece assentar no facto de os adenovirus estarem adaptados para permitir a libertação do seu ADN a partir de um endossoma, sem passagem pelo lisossoma, e na presença, por exemplo, de transferrina ligada à construção de ADN ou a outra construção genética do invento, em que a construção é captada pela célula pela mesma via que a partícula de adenovirus.

Esta abordagem tem as vantagens de não haver necessidade de utilizar construções retrovirais complexas; não existir uma modificação permanente do genoma como acontece com a infecção retroviral; e o sistema de expressão dirigido estar acoplado a um sistema de entrega dirigido, reduzindo, assim, a toxicidade para outros tipos de células.

Poderá ser desejável impregnar localmente um tumor, durante um certo periodo de tempo, com o veiculo de entrega apropriado compreendendo a construção genética; adicionalmente ou em alternativa, o veiculo de entrega ou a construção genética podem ser injectados directamente em tumores acessíveis. O "ADN nu" e o ADN complexado com lipidos neutros e catiónicos também poderão ser úteis para a introdução do ADN do invento em células do doente submetido a tratamento. As abordagens não virais à terapia génica estão descritas em Ledley (1995) Human Gene Therapy 6, 1129-1144.

Sistemas de entrega dirigida alternativos, tal como o sistema de adenovirus modificado descrito em WO 94/10323, em que o ADN é transportado no interior da partícula de adenovirus ou de tipo adenovirus, são também conhecidos. Michael et al (1995) Gene Therapy 2, 660-668 descrevem uma modificação do adenovirus para adicionar um grupo selectivo para determinadas células a uma proteína de fibra. Os adenovirus mutantes que se replicam selectivamente em células tumorais humanas deficientes em p53, como aqueles descritos em Bischoff et al (1996) Science 274, 373-376, também são úteis para entregar a construção genética do invento a uma célula. Assim, um aspecto adicional do invento proporciona um vírus ou 65 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ uma partícula de tipo vírus que compreende uma construção genética do invento. Outros vírus ou partículas de tipo vírus adequados incluem o VHS, o VAA, o vírus vaccinia e o parvovírus.

As construções genéticas utilizadas no invento podem ser preparadas utilizando métodos bem conhecidos na arte. 0 invento será agora descrito em maior detalhe por meio de referência aos Exemplos e Figuras que se seguem.

Figura 1.

Verificação experimental por PCR de transcrição reversa. Os candidatos a genes endoteliais específicos, previstos pela combinação do rastreio UniGene/EST com a análise diferencial xProfiler SAGE (Tabela 8), foram analisados quanto à expressão em três culturas de células endoteliais e em nove culturas de células não endoteliais. As culturas endoteliais foram as seguintes: células hmvec (células endoteliais microvasculares humanas), cultura confluente de células HUVEC (células endoteliais da veia umbilical humana) e cultura de células HUVEC em proliferação. As culturas não endoteliais foram as seguintes: células do estroma endometrial normal (NES) crescidas em normoxia e células NES crescidas em hipoxia, as linhas celulares de carcinoma da mama MDA 453 e MDA 468, células HeLa, fibroblastos FEK4 cultivados em normoxia e fibroblastos FEK4 cultivados em hipoxia e SW480 e HCT116 -duas linhas celulares do epitélio colorrectal. 0 gene ECSMl mostrou uma especificidade endotelial completa, enquanto o "carrossel mágico"/ECSM4 foi expresso, de forma preferencialmente muito forte, no endotélio. Curiosamente, ambos estes novos genes parecem ser mais específicos do endotélio que o gene específico do endotélio de referência: o factor de von Willebrand.

Figura 2.

Sequência "contig" para ECSMl gerada pelo programa Phrap e sequência de aminoácidos do produto de tradução. As EST utilizadas para gerar esta sequência contínua estão apresentadas na Tabela 10. 66 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Figura 3.

Transcrição/tradução in vitro de ECSM4. 0 ADNc que codifica o polipéptido ECSM4 completo foi clonado no vector plasmidico pBluescript. Os plasmídeos circular e digerido com HindIII foram submetidos a transcrição/tradução in vitro, utilizando o sistema "TNT® T7 Quick Coupled Transcription/Translation System" (Promega Corporation) e n r ^ incorporando S-metionina, de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos de reacção foram resolvidos por SDS-PAGE e visualizados por autorradiografia. 0 plasmideo contendo luciferase foi utilizado como controlo positivo para a reacção. Os números à esquerda indicam a posição dos marcadores de tamanho molecular para efeitos de referência. 0 tamanho da banda que designa ECSM4 é consistente com o peso molecular calculado do polipéptido de 118 kDa.

Figura 4. ADNc e tradução computacional de GenBank AK000805 (ECSM4/"carrossel mágico" humano).

Figura 5.

Sequência "contig" para as EST de ECSM4 humano ("carrossel mágico") gerada pelo programa Phrap e tradução do polipéptido codificado. A sequência de ADN é apresentada na orientação que teria se fosse um ADNc, que é oposta daquela em que foi originalmente gerada. As EST utilizadas para gerar a sequência continua estão apresentadas na Tabela 11. 0 inicio da tradução nesta sequência verifica-se na posição 2 da sequência continua, e a terminação da tradução ocorre na posição 948.

Figura 6.

Um alinhamento da sequência de ácido nucleico de ECSM4 humano com o n.° acesso ao GenBank AK000805 ("magic.seq") com a sequência de ácido nucleico de ECSM4 humano gerada pelo programa Phrap ("hs.111518") proporcionadas na Figura 4 e 5.

Figura 7.

Sequência nucleotidica continua e sequência de aminoácidos de ECSM4 de ratinho. 67 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Figura 8.

Um alinhamento das sequências de aminoácidos da proteína Robol de ratinho ("T30805") e da proteína ECSM4 humana ("magic.pep").

Figura 9.

Um alinhamento das sequências de aminoácidos da proteína Robol de ratinho ("T30805") e da proteína ECSM4 de ratinho ("mousemagic.pep").

Figura 10.

Um alinhamento das sequências de aminoácidos das proteínas ECSM4 humana ("magic.pep") e de ratinho ("mousemagic.pep") . Os resíduos em negrito indicam sequências bem conservadas. A sequência da proteína de ratinho é apresentada no topo e a sequência humana em baixo.

Figura 11.

Expressão do "carrossel mágico" in vitro. (a) Ensaio de protecção da ribonuclease. Topo, duas sondas para diferentes regiões (nucleótidos 1 a 355 e 3333 a 3679) do "carrossel mágico" foram utilizadas no ensaio (apresentadas à esquerda e à direita). O ensaio de protecção da ARNase foi efectuado com ARN nuclear pequeno U6 como controlo (apresentado em baixo) (Maxwell et al (1999) Nature 399: 271). Linhas celulares e isolados primários humanos: MRC-5, linha celular de fibroblastos; MCF-7, linha celular de carcinoma da mama;

Neuro, linha celular de neuroblastoma SY-SH-5Y; HUVEC, isolado endotelial da veia umbilical; HDMEC, isolado endotelial microvascular dérmico; e HMME2, linha celular endotelial microvascular mamária. N, normoxia; H, hipoxia; P, proliferação, (b) Análise de Western dos lisados celulares. Uma banda a ~110 kD corresponde ao MR e foi mais forte em

células expostas a hipoxia durante 18 horas. A experiência foi repetida duas vezes com resultados similares. A imunotransferência foi efectuada da forma descrita em Brown et al (2000) Câncer Res. 60: 6298. Produziram-se anti-soros policlonais de coelho contra os seguintes péptidos, acoplados a hemocianina de lapa: aminoácidos 165-181 (LSQSPGAVPQALVAWRA) e 274-288 (DSVLTPEEVALCLEL) (anti-soro 1) ou péptidos 311-320 (TYGYISVPTA) e 336-351 (KGGVLLCPPRPCLTPT) (anti-soro 2). Ambos os anti-soros proporcionaram resultados idênticos. Para a 68 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ análise de Western, o anti-soro foi purificado por afinidade numa coluna "Hi-Trap NHS-activated HP" (Amersham) à qual estavam acoplados os péptidos utilizados para gerar o anti-soro 1.

Figura 12. ADNc completo de ECSM4 humano e sequência da proteína codificada.

Figura 13. ADNc completo (MuMR.seq) de ECSM4 de ratinho e sequência da proteína codificada.

Figura 14.

Alinhamento das sequências de aminoácidos de ECSM4 humano (topo) e de ECSM4 de ratinho (em baixo).

Figura 15.

Alinhamento das sequências de ADNc de ECSM4 humano ("HuMR.seq"; topo) e de ECSM4 de ratinho ("MuMR.seq"; em baixo).

Figura 16.

Análise de hibridação in situ de tecido placentário humano, utilizando ECSM4 como sonda. Uma imagem em fundo claro de uma amplificação de lOx da secção fina de tecido placentário. A seta indica um vaso sanguíneo grande.

Figura 17.

Análise de hibridação in situ de tecido placentário humano, utilizando ECSM4 como sonda. Uma amplificação superior da imagem em fundo claro da secção fina de tecido placentário apresentada na Figura 16, com foco no vaso sanguíneo. A seta aponta para as células endoteliais que revestem o lúmen do vaso.

Figura 18.

Análise de hibridação in situ de tecido placentário humano, utilizando ECSM4 como sonda. Uma amplificação superior da secção fina de tecido placentário apresentada na Figura 16, com foco no vaso sanguíneo e visualizada aqui em fundo escuro. A seta representa uma coloração positiva das células endoteliais que revestem o lúmen do vaso. 69 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Figura 19.

Análise de hibridação in situ de tecido metastático de cancro colorrectal no fígado, utilizando ECSM4 como sonda. Uma imagem em fundo claro de uma secção do tecido metastático de cancro colorrectal no fígado amplificado com uma objectiva de (A) lOx e (B) 20x. A área delimitada pela fronteira (rodeando * A) representa o tecido do fígado normal. A seta em (B) ilustra um dos vasos sanguíneos no interior do tecido tumoral metastático.

Figura 20.

Análise de hibridação in situ de tecido metastático de cancro colorrectal no fígado, utilizando ECSM4 como sonda. Esta é uma imagem em fundo escuro de uma secção do tecido metastático de cancro colorrectal no fígado amplificado com uma objectiva de (A) lOx e (B) 20x. A área delimitada pela fronteira (rodeando *) representa o tecido do fígado normal. A seta em (B) ilustra um dos vasos sanguíneos no interior do tecido tumoral metastático, correspondente ao vaso apresentado na Figura 19B. A expressão de ECSM4 está limitada às células endoteliais dos vasos sanguíneos do tumor. É de salientar que há pouca expressão no tecido normal circundante (*).

Figura 21.

Transferência de Western utilizando o anticorpo de coelho MGO-5 como anticorpo primário. As diluições dos péptidos MR 165, MR 311, MR 366 derivados de ECSM4 e do polipéptido de controlo, albumina sérica de bovino (BSA), foram resolvidas por electroforese em gel de poliacrilamida-SDS e transferidas para uma membrana Immobilon P. A transferência foi pesquisada com o anticorpo MGO-5 e visualizada utilizando anticorpo anti-coelho acoplado a fosfatase alcalina.

Figura 22.

Imunocoloração de secção placentária congelada. Uma secção fina congelada de placenta humana foi analisada por imuno-histoquímica, sem qualquer anticorpo primário (controlo negativo), e visualizada utilizando anticorpo anti-coelho acoplado a fosfatase alcalina. Observa-se pouca coloração do fundo. 70 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Figura 23.

Imunocoloração de secção placentária congelada. Uma secção fina congelada de placenta humana foi analisada por imuno-histoquimica, utilizando um anticorpo primário que reconhece o factor de von Willebrand (controlo positivo), e visualizada utilizando um anticorpo secundário anti-coelho acoplado a fosfatase alcalina. As setas mostram niveis elevados de expressão de vWF restringida às células endoteliais vasculares.

Figura 24.

Imunocoloração de secção placentária congelada. Uma secção fina congelada de placenta humana foi analisada por imuno-histoquimica, utilizando MGO-5 (um anticorpo policlonal de coelho produzido contra o péptido MR 165) como anticorpo primário, e visualizada utilizando um anticorpo secundário anti-coelho acoplado a fosfatase alcalina. As setas mostram niveis elevados de expressão de ECSM4 restringida às células endoteliais vasculares. É de salientar que o tecido circundante mostra pouca coloração. Uma comparação com as

Figuras 22 e 23 mostra que a expressão de ECSM4 está co-localizada com a de vWF, um marcador conhecido para as células endoteliais vasculares.

Figura 25.

Análise imuno-histoquimica das células HUVEC: Factor de von willebrand (vWF). As células HUVEC foram imobilizadas e analisadas por imuno-histoquimica, utilizando um anticorpo que reconhece o factor de von Willebrand (um marcador para as células endoteliais) como anticorpo primário, e visualizadas utilizando um anticorpo anti-coelho acoplado a fosfatase alcalina. As setas mostram a expressão de vWF num subconjunto das células HUVEC.

Figura 26.

Análise imuno-histoquimica das células HUVEC utilizando o anticorpo MGO-7. As células HUVEC foram imobilizadas e analisadas por imuno-histoquimica, utilizando o anticorpo MGO-7 (um anticorpo policlonal de coelho produzido contra os péptidos MR 311 e MR 336) como anticorpo primário, e visualizadas utilizando um anticorpo anti-coelho acoplado a fosfatase alcalina. As setas mostram a expressão de ECSM4 num 71 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ subconjunto das células HUVEC. É de salientar que a coloração está localizada principalmente na superfície celular das células.

Figura 27. Expressão do "carrossel mágico" in vivo. (A) Expressão do MR detectada por hibridação in situ numa arteríola (a) e uma vénula (b) placentárias (à esquerda, fundo claro e à direita, fundo escuro). (c) Coloração imuno- histoquímica do "carrossel mágico" numa arteríola placentária. À esquerda, controlo com o factor de von Willebrand e à direita, "carrossel mágico". (B) Expressão de MR em endotélio de tumor. Ganglioma (a) 20x e (b) 50x. À esquerda, fundo claro; à direita, fundo escuro. As setas destacam um vaso que corre diagonalmente para baixo com um eritrócito no seu interior. As células endoteliais são fortemente positivas para a expressão de MR. Carcinoma papilar da bexiga (c) 20x e (d) 50x. 0 núcleo vascular da papila do tumor é fortemente positivo, particularmente as células endoteliais "planas" indicadas por setas. Uma sonda anti-sentido para o "carrossel mágico" foi gerada in situ, utilizando a polimerase T3 proveniente do clone 1912098 de EST IMAGE (n.° acesso ao GenBank AI278949). O plasmídeo foi linearizado com EcoRI antes da síntese da sonda. A análise in situ foi depois efectuada da forma descrita em Poulsom et al (1998) Eur. J. Histochemistry 42:121-132.

Exemplo 1.

Clonagem in silico de novos genes endoteliais específicos.

Descreve-se a utilização de duas estratégias independentes para análise da expressão diferencial, combinada com verificação experimental, com o intuito de identificar genes que são específica ou preferencialmente expressos no endotélio vascular. A primeira estratégia baseou-se na análise da expressão de agregados ("cluster") de EST no índice de genes humanos UniGene (Schuler et al, 1997) . Realizaram-se pesquisas recorrentes por BLAST com espaçamentos (Altschul et al, 1997), em condições de rigor muito elevado, contra marcas de sequências expressas (EST - "Expressed Sequence Tags") agrupadas em dois conjuntos. Estes dois conjuntos compreendiam 72 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ bibliotecas de células endoteliais e de células não endoteliais derivadas da base de dados dbEST (Boguski et al, 1995). A segunda estratégia utilizou uma segunda ferramenta de exploração de dados: xProfiler SAGEmap. 0 software xProfiler é uma ferramenta gratuita disponível online, que faz parte do projecto de anatomia do genoma do cancro (CGAP - "Câncer Genome Anatomy Project") do NCBI (Strausberg et al, 1997; Cole et al, 1995) . Embora estas duas abordagens isoladamente estivessem a produzir um número desencorajadoramente elevado de falsos positivos, quando ambas as estratégias foram combinadas, as previsões revelaram-se excepcionalmente fiáveis e foram identificados dois novos candidatos a genes endoteliais específicos. Identificaram-se ADNc completos em bases de dados de sequências. Outro gene (agregado de EST) corresponde a uma sequência parcial de ADNc proveniente de um projecto de sequenciação de ADNc em grande escala e contém uma região de semelhança com o domínio intracelular do homólogo 1 do "carrossel" humano (R0B01).

Rastreio do índice de genes UniGene/EST

Um conjunto de sequências endoteliais e um conjunto de sequências não endoteliais foram extraídos da base de dados dbEST, utilizando a versão 5 do sistema de recuperação de sequências (SRS - "Sequence Retrieval System"). 0 conjunto endotelial consistia em 11.117 EST de nove bibliotecas endoteliais humanas (Tabela 1). 0 conjunto não endotelial incluía 173.137 EST de 108 linhas celulares humanas e bibliotecas de tumores microdissecados (Tabela 2) . As EST foram extraídas da dbEST disponibilizada em Abril de 2000. Os ficheiros FASTA-multiple foram transformados numa base de dados BLAST pesquisável, utilizando o programa Pressdb. A Tabela 3 apresenta o estado de expressão, nestes dois conjuntos, de cinco genes conhecidos específicos de células endoteliais.

Subsequentemente, a sequência representativa mais comprida em cada agregado UniGene (UniGene, versão n.° 111, Maio de 2000, ficheiro FASTA-multiple hs.seq.uniq) foi analisada, utilizando BLAST de rigor muito elevado, contra estes dois conjuntos. Caso esta sequência representativa não apresentasse igualdades, as restantes sequências pertencentes 73 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ ao agregado (UniGene, ficheiro FASTA-multiple hs.seq) eram utilizadas como sequências de busca BLAST. Finalmente, seleccionaram-se os agregados sem igualdades no conjunto não endotelial e com pelo menos uma igualdade no conjunto endotelial. A optimização do valor E ("E-value") de BLAST era crucial para o êxito das pesquisas BLAST ao nível da identidade. Um valor E demasiado elevado resultaria na indicação de genes parálogos. Por outro lado, um parâmetro E demasiado baixo (rigoroso) resultaria em muitos falsos negativos, isto é, os positivos verdadeiros não seriam comunicados devido a erros de sequenciação nos dados de EST: as EST são sequências de passagem única de baixo custo e em larga escala, que possuem uma taxa de erro elevada (Aaronson et al, 1996) . Neste trabalho, utilizou-se um valor E de 10e-20 nas pesquisas contra o conjunto de EST não endoteliais e um valor mais rigoroso, de 10e-30, nas pesquisas contra o conjunto endotelial, mais pequeno. Estes valores foram considerados óptimos após uma série de pesquisas BLAST de teste.

Dados de SAGE e análise diferencial xProfiler SAGEmap A subtracção online de bibliotecas SAGE ("Serial Analysis of Gene Expression" - análise em série da expressão génica) (xProfiler SAGEmap: http://www.ncbi.nlmnihgov/SAGE/ saqexpsetup.cqi) foi usada como segunda estratégia de exploração de dados para a identificação de novos genes específica ou preferencialmente endoteliais. Duas bibliotecas SAGE endoteliais (SAGE_Duke_HMVEC e SAGE_Duke_HMVEC+VEGF com um total de 110.790 sequências) foram comparadas com vinte e quatro bibliotecas de linhas celulares não endoteliais (lista completa na Tabela 4, total de 733.461 sequências). A Tabela 5 mostra o estado da expressão de cinco genes conhecidos específicos do endotélio: o factor de von Willebrand (vWF), dois receptores do factor de crescimento endotelial vascular: a tirosina-quinase 1 de tipo fms (fltl) e o receptor contendo domínio de quinase inserido (KDR), o receptor tirosina-quinase de tipo tie (TIEl) e o receptor tirosina-quinase de tipo tek (TIE2/TEK), nestes dois conjuntos SAGE. 74 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Os dados combinados proporcionam previsões extremamente precisas vinte genes conhecidos foram seleccionados no rastreio UniGene/EST (Tabela 6). Estes genes não apresentaram quaisquer igualdades no conjunto não endotelial e tinham pelo menos uma igualdade no conjunto endotelial. A lista continha pelo menos quatro genes específicos endoteliais: TIEl, TIE2/TEK, LYVEl e multimerina, indicando uma precisão de -20% da previsão. Outros genes na lista, embora certamente expressos de forma preferencial nas células endoteliais, poderiam não ser específicos do endotélio. Para melhorar a precisão da previsão, decidiu-se combinar o rastreio UniGene/EST com a análise xProfiler SAGE. O resultado da análise xProfiler consistiu numa lista de genes com um número de marcas no conjunto endotelial dez vezes maior que no conjunto não endotelial, classificadas de acordo com a certeza de previsão. Aplicou-se um limiar de certeza de 90% a esta lista. A Tabela 7 ilustra a forma como os dados das duas abordagens foram combinados. As pesquisas BLAST ao nível de identidade foram efectuadas em ARNm (genes conhecidos) ou em sequências contínuas obtidas através do programa Phrap (agregados de EST que representam novos genes) para investigar a forma como estes genes estavam representados no conjunto endotelial e não endotelial. A verificação experimental subsequente por RT-PCR (Figura 1) provou que a abordagem combinada estava 100% correcta, isto é, os genes na lista xProfiler que não apresentaram igualdades no conjunto de EST não endoteliais e tiveram pelo menos uma igualdade no conjunto endotelial eram efectivamente específicos do endotélio.

DISCUSSÃO Têm surgido várias comunicações de análises computacionais de transcriptomas de tecidos. Geralmente, é construído um perfil de expressão baseado no número de marcas atribuídas a um dado gene ou a uma classe de genes (Bernstein et al, 1996 ; Welle et al, 1999 ; Bortoluzzi et al, 2000). É possível fazer uma tentativa para identificar transcritos específicos de determinados tecidos; por exemplo, Vasmatzis et al (1997) descreveram três novos genes expressos exclusivamente na próstata, através de subtracção in silico de 75 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ bibliotecas a partir da colecção dbEST. Bibliotecas de ADNc construídas de propósito poderão também ser empregues. Dez candidatos a genes específicos dos granulócitos foram identificados por análise exaustiva de sequência de bibliotecas de ADNc derivadas de granulócitos e de onze outras amostras de tecidos, nomeadamente, uma linha celular de hepatócitos, fígado fetal, fígado de criança, fígado de adulto, gordura subcutânea, gordura visceral, pulmão, mucosa do cólon, queratinócitos, córnea e retina (itoh et al, 1998) .

Uma análise semelhante à abordagem efectuada por

Vasmatzis et al baseada na dbEST é complicada pelo facto de as células endoteliais estarem presentes em todos os tecidos do corpo e as EST endoteliais estarem a contaminar todas as bibliotecas de tecidos a granel. Para validar isto, utilizaram-se três genes bem conhecidos específicos do endotélio - KDR, FLTl e TIE-2 - como sequências de busca para as pesquisas BLAST contra a base de dados dbEST. Os transcritos estavam presentes numa grande variedade de tecidos, com múltiplas igualdades em tecidos bem vascularizados (por exemplo, placenta, retina), tecidos embrionários (fígado, baço) ou tecidos infantis (cérebro). Adicionalmente, verificou-se que a simples subtracção de bibliotecas de EST endoteliais contra todas as outras bibliotecas dbEST não conseguia identificar quaisquer genes específicos (resultados não apresentados).

Dois tipos muito diferentes de recursos de dados de expressão foram utilizados nos esforços de exploração de dados deste invento. 0 rastreio UniGene/EST baseou-se nas bibliotecas de marcas de sequências expressas de dbEST. Há 9 bibliotecas endoteliais humanas na versão actual da base de dados dbEST com um número total relativamente pequeno de EST: ~11.117. Alguns genes bem conhecidos específicos do endotélio não estão representados neste conjunto de dados (Tabela 3) . Esta limitação aumentou as nossas preocupações quanto ao facto de os genes com níveis de expressão baixos não serem abrangidos por esta análise. Por conseguinte, utilizou-se outro tipo de dados de expressão computáveis: as bibliotecas CGAP SAGE. 76 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

As marcas SAGE são por vezes denominadas pequenas EST (geralmente 10-11 pb de comprimento). A sua principal vantagem é o facto de poderem ser localizadas inequivocamente no ADNc: elas situam-se em posição imediatamente adjacente ao local de restrição NlalII mais 3'. Embora existam apenas duas bibliotecas CGAP SAGE endoteliais actualmente disponíveis, elas contêm um impressionante número total de -111.000 marcas - um conjunto de dados aproximadamente 10 vezes maior que as 11.117 sequências no conjunto de EST endoteliais. A abordagem combinada revelou-se muito precisa (Tabela 8, Figura 1) quando foi verificada por RT-PCR.

Refere-se aqui a identificação de dois novos genes extremamente específicos do endotélio: a molécula especifica de células endoteliais 1 (ECSMl - entrada em UniGene Hs.13957) e o "carrossel mágico" (entrada em UniGene Hs.111518). Para um resumo abrangente dos dados disponíveis sobre estes genes, consultar a Tabela 8.

Esta abordagem combinada de exploração de dados, juntamente com a verificação experimental, é uma poderosa ferramenta genómica funcional. Este tipo de análise pode ser aplicado a muitos tipos de células, e não apenas às células endoteliais. O desafio de identificar a função dos genes descobertos mantém-se, mas as ferramentas de bioinformática, tais como a genómica estrutural ou as pesquisas de homologia e de motivos, podem oferecer conhecimentos que podem depois ser verificados experimentalmente.

Em resumo, esta abordagem de rastreio permitiu a identificação de novos genes específicos de células endoteliais e de genes conhecidos cuja expressão não se sabia ser específica das células endoteliais. Esta identificação não só aumenta a nossa compreensão da biologia das células endoteliais, como proporciona novos alvos farmacêuticos para a imagiologia, o diagnóstico e o tratamento de afecções médicas que envolvem o endotélio. 77 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

MÉTODOS "Scripts" de PERL

Criaram-se vários “scripts” de PERL para facilitar a recuperação de sequências, as submissões de pesquisas BLAST e a análise automática dos resultados de BLAST em grande escala.

Recuperação de sequências das bases de dados

Os ficheiros UniGene armazenados localmente (Versão n.° 111, data de publicação Maio de 2000) foram utilizados na preparação deste relatório. O sitio na rede de UniGene pode ser acedido no URL: www.ncbi.nlm.nlh.gov/UniGene/, e os ficheiros UniGene podem ser descarregados a partir do repositório ftp: ftp://ncbi.nlm.nih.gov/repository/unigene/. As sequências representativas para o subconjunto humano de UniGene (a EST mais comprida dentro do agregado) estão armazenadas no ficheiro Hs.seq.uniq, ao passo que todas as EST pertencentes ao agregado estão armazenadas num ficheiro separado chamado Hs.seq.

As sequências foram extraídas da base de dados dbEST acedida localmente no centro do HGMP, utilizando o comando "getz" do sistema de recuperação de sequências (SRS, versão 5). Este procedimento foi efectuado repetidamente utilizando um "script" de PERL para todas as bibliotecas nos subconjuntos endotelial e não endotelial, e as sequências foram fundidas em dois ficheiros FASTA-multiple.

Critérios de selecção para as bibliotecas de EST não endoteliais A selecção das 108 bibliotecas dbEST não endoteliais foi essencialmente manual. Inicialmente, a lista de todas as bibliotecas dbEST disponíveis (http://www,ncbi.nlm.nih,gov/ dbEST/'libs_byorg.htrnl) foi pesquisada utilizando a palavra-chave "cells" (células) e a frase "cell line" (linha celular). Embora esta pesquisa tenha identificado a maioria das bibliotecas, foi necessário adicionar palavras-chave adicionais para que a lista ficasse completa: "melanocyte" (melanócito), "macrophage" (macrófago), "HeLa", "fibroblast" 78 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ (fibroblasto). Em alguns casos, consultou-se a descrição detalhada da biblioteca para confirmar que essa biblioteca derivava de uma linha celular/cultura primária. Também incluimos algumas bibliotecas de tumores microdissecados de CGAP. Para isso, utilizou-se o navegador Library (disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CGAP/hTGl/lbrow/cgaplb.cgi) para procurar a palavra-chave "microdissected" (microdissecado).

Rastreio do índice de genes UniGene 0 índice de transcritos de genes UniGene foi rastreado contra a divisão de EST de GenBank, dbEST. Ambas as bases de dados UniGene e dbEST foram desenvolvidas no Centro Nacional para Informação em Biotecnologia (NCBI). UniGene é um conjunto de agregados de EST que correspondem a genes únicos putativos. Actualmente consiste em quatro conjuntos de dados: ser humano, ratinho, rato e peixe-zebra. 0 conjunto de dados humanos é constituído por cerca de 90.000 agregados (UniGene, Versão n.° 111, Maio de 2000) . Através de pesquisas BLAST de identidade em condições de rigor muito elevado, procurou-se identificar os genes UniGene que possuem transcritos nas bibliotecas dbEST de tipos de células endoteliais e não nas bibliotecas de tipos de células não endoteliais. Durante todo o projecto, utilizou-se a ferramenta blast2 da Universidade de Washington, que é uma versão com espaçamentos, como implementação do algoritmo BLAST. O valor E foi configurado para 10e-20 nas pesquisas contra o conjunto de EST não endoteliais e para 10e-30 nas pesquisas contra o conjunto endotelial mais pequeno.

Embora a base de dados UniGene não forneça sequências consenso para os seus agregados, a sequência mais comprida dentro do agregado está identificada. Assim, esta sequência representativa mais comprida (ficheiro FASTA-multiple Hs.seq.uniq) foi pesquisada, utilizando BLAST em condições de rigor muito elevado, contra os conjuntos de EST endotelial e não endotelial. Se esta sequência representativa não apresentasse quaisquer igualdades, as restantes sequências pertences ao agregado (UniGene, ficheiro FASTA-multiple Hs.seq) seguiam-se como sequências de busca BLAST. Finalmente, os agregados sem quaisquer igualdades no conjunto não endotelial e com pelo menos uma igualdade no conjunto 79 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ endotelial foram seleccionados, utilizando "scripts" de PERL que analisavam o resultado textual de BLAST.

Subtracção xProfiler SA6E A ferramenta xProfiler permite a um utilizador online efectuar uma comparação diferencial entre qualquer combinação de quarenta e sete bibliotecas de análise em série da expressão qénica (SAGE), num total de ~2 300 000 marcas SAGE, utilizando um alqoritmo estatístico dedicado (Chen et al, 1998) . É possível aceder à ferramenta xProfiler em: http://www,ncbi.nlm.nih.qov/SAGE/sagexpsetup.cgi. A própria SAGE é uma tecnoloqia de expressão quantitativa em que os genes são tipicamente identificados por meio de uma marca de sequência com 10 ou 11 pb adjacente ao local de restrição NlalII mais 3' do ADNc (Velculescu et al, 1995).

As duas bibliotecas de células endoteliais disponíveis (SAGE_Duke_HMVEC e SAGE_Duke_HMVEC+VEGF) definiram o conjunto A, e vinte e quatro (consultar a Tabela 4 para ver a lista) bibliotecas não endoteliais juntas construíram o conjunto B. A abordagem foi verificada estabelecendo o estado da expressão dos cinco genes de referência específicos do endotélio nos dois conjuntos de SAGE (Tabela 5), utilizando o mapeamento "gene para marca" {"Gene to Tag") (http://www,ncbi.nlm.nih,gov/SAGE/SAGEcid.cgi). Subsequentemente, a ferramenta xProfiler foi utilizada para seleccionar os genes expressos diferencialmente entre os conjuntos A e B. O resultado de xProfiler consistiu numa lista de genes com uma diferença de lOx no número de marcas no conjunto endotelial em comparação com o conjunto não endotelial, classificados de acordo com a certeza da previsão. Um limiar de certeza de 90% foi aplicado a esta lista. A outra ferramenta online de análise da expressão diferencial do projecto CGAP, "Digital Differential Display" (DDD), baseia-se nos dados de expressão de EST (informações da biblioteca de origem) em vez de utilizar as marcas de SAGE. Tentámos utilizar esta ferramenta de forma semelhante a xProfiler SAGEmap, mas não conseguimos obter resultados úteis. Cinco das nove bibliotecas de células endoteliais e sessenta e quatro das cento e oito bibliotecas de células não endoteliais 80 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ utilizadas na abordagem orientada para BLAST encontravam-se disponíveis para análise online utilizando DDD (http://www.ncbi.nlm.nih.qov/CGAP/info/ddd,cgi). Quando esta análise foi efectuada, o que se segue foram quinze genes com pontuação máxima: anexina A2, actina gama 1, proteína ribossómica grande PO, inibidor do activador do plasminogénio de tipo I, timosina beta 4, peptidilopropil-isomerase A, proteína ribossómica Ll3a, receptor de laminina 1 (proteína ribossómica SA), factor de elongação da tradução eucariótica 1 alfa 1, vimentina, polipéptido pesado ferritina, proteína ribossómica L3, proteína ribossómica S18, proteína ribossómica Ll9, proteína de tumor controlada via tradução 1. Esta lista foi bastante surpreendente, não incluía nenhum gene bem conhecido específico do endotélio, não apresentava qualquer sobreposição com os resultados de SAGE (Tabela 8) e continha muitos genes que, na literatura, são referidos como sendo expressos de forma ubíqua (proteínas ribossómicas, actina, vimentina, ferritina). Uma grande vantagem do rastreio UniGene/EST é o facto de, em vez de confiar em dados das bibliotecas de origem e em algoritmos falíveis para agrupamentos de EST, ele realiza efectivamente comparações BLAST ao nível de identidade, em busca de transcritos correspondentes a um gene.

Exploração de dados nos aglomerados de UniGene

Para aceder rapidamente a informações sobre as entradas UniGene (por exemplo, referências de literatura, sítios STS, homólogos, referências a função), utilizaram-se rotineiramente recursos online: as interfaces UniGene e LocusLink e "Online Mendelian Inheritance in Man" (Herança Mendeliana no Homem Online) de NCBI.

As EST nos aglomerados de UniGene não estão construídas em sequências contínuas, pelo que antes de qualquer análise de sequência, criaram-se sequências contínuas utilizando o programa de montagem Phrap (para obter documentação sobre o programa phrap, ver http://bozeman.mbt.Washington,edu/phrap. does/phrap.html).

Para analisar a sequência contínua genómica AC005795 (44 399 pb) contendo ECSMl, utilizou-se a interface online NIX 81 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ para a análise multi-aplicações de grandes sequências nucleotídicas desconhecidas. Para obter mais informações sobre NIX, consultar http://www.hgmp.mrc.ac.uk/NIX/. 0 alinhamento de ECSMl contra AC005795 foi obtido utilizando a interface do NCBI para a interface do genoma humano: o Map Viewer de NCBI (Visualizador de mapas de NCBI). Para obter informações adicionais sobre o Map Viewer de NCBI, consultar http: //www. ncbi . nlm. nih. gov/genorne/guide/ .

Para pesquisar possíveis domínios transmembranares e sequências sinal nas sequências nucleotídicas traduzidas, utilizaram-se três aplicações baseadas na Internet: DAS http://www.biokemi,su.se/~server/DAS/ (Cserzo et al, 1997); TopPred2 http://www.biokemi,su.se/~server/toppred2/ (Heijne 1992) e SignalP http://www.cbs.dtu.dk/Services/SignalP/ (Nielsen et al, 1997).

"Scripts" de PERL

Criaram-se vários "scripts” de PERL para facilitar a recuperação de sequências, as submissões de pesquisas BLAST e a análise automática dos resultados de BLAST em grande escala.

Verificação experimental

Para verificar experimentalmente a especificidade da expressão, utilizou-se a reacção em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR). 0 ARN foi extraído a partir de três tipos de células endoteliais e de sete tipos de células não endoteliais cultivadas in vltro. As culturas endoteliais foram as seguintes: células HMVEC (células endoteliais microvasculares humanas), cultura confluente de células HUVEC (células endoteliais da veia umbilical humana) e cultura de células HUVEC em proliferação. As culturas não endoteliais foram as seguintes: células do estroma endometrial normal (NES) crescidas em normoxia e células NES crescidas em hipoxia, as linhas celulares de carcinoma da mama mda 453 e MDA 468, células HeLa, fibroblastos FEK4 cultivados em normoxia e fibroblastos FEK4 cultivados em hipoxia e SW480 e HCT116 - duas linhas celulares do epitélio colorrectal.

Caso estivesse disponível uma STS (de "Sequence Tagged 82 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Site" - pequena sequência de ADN cuja localização e sequência de bases são conhecidas), utilizaram-se iniciadores de PCR da base de dados dbSTS e as condições de ciclo sugeridas na entrada da dbSTS. Caso contrário, os iniciadores foram concebidos utilizando o programa Primer3. Os iniciadores estão enumerados na Tabela 9.

Meios de cultura dos tecidos, extracção de arn e síntese de ADNC

As linhas celulares foram cultivadas in vitro de acordo com os protocolos Standard de cultura de tecidos. Em particular, os meios endoteliais foram suplementados com ECGS (suplemento de crescimento de células endoteliais - Sigma) e heparina (Sigma) para promover o crescimento. 0 ARN total foi extraído utilizando o conjunto "RNeasy Minikit" (Qiagen), e o ADNc foi sintetizado utilizando o conjunto "Reverse-IT lst Strand Synthesis Kit" (ABgene).

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Tabela 1.

Nove bibliotecas endoteliais humanas provenientes de dbEST

Endotélio aórtico humano, 20 sequências, cultura in vitro Células endoteliais humanas, 346 sequências, isolado primário Célula endotelial humana (Y.Mitsui), 3 sequências, cultura in vitro Célula endotelial de Stratagene 937223, 7171 sequências, isolado primário Células endoteliais da aorta, 1245 sequências, isolado primário Células endoteliais da aorta, tratadas com TNF, 1908 sequências, isolado primário Células endoteliais de veia umbilical I, 9 sequências

Biblioteca de ADNc de células HDMEC, 11 sequências, cultura in vitro Células endoteliais de veia umbilical II, 404 sequências ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Tabela 2.

Bibliotecas não endoteliais de dbEST.

1. Células T activadas I 2. Células T activadas II 3. Células T activadas III 4. Células T activadas IV 5. Células T activadas IX 6. Células T activadas V 7. Células T activadas VI 8. Células T activadas VII 9. Células T activadas VIII 10 . Células T activadas X 11. Células T activadas XI 12 . Células T activadas XII 13 . Células T activadas XX

14. Linha celular CAMAlEe I

15. Linha celular CAMAlEe II

16. Células CCRF-CEM, tratadas com ciclo-hexamida I 17. Biblioteca ADNc da linha de células B activadas 3D5 18. Biblioteca de ADNc do cromossoma 7 de células HeLa

19. Linha celular de carcinoma do cólon (Caco-2) I

20. Linha celular de carcinoma do cólon (Caco-2) II 21. Linha celular de carcinoma do cólon (HCC)

22. Linha celular de carcinoma do cólon (HCC) II 23. Linha celular HCC (metástases para fígado no ratinho)

24. Linha celular HCC (metástases para fígado ratinho) II 25. ADNc de HeLa (T. Noma) 26. SRIG (de "Synthetic Retinoids Induced Genes") HeLa 27. Macrófagos derivados de monócitos de Homo sapiens

28. Células HSC172 I

29. Células HSC172 II 30. Linha celular de carcinoma gástrico humano 23132 90 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45 . 46 . 47. 48 . 49 . 50 . 51. 52 . 53. 54 . 55 . 56 . 57. 58. 59. 60. 61.

Linha celular de cancro da mama humano Bcap 37

Subclone da linha celular humana A431

Linha celular humana AGZY-83a

Linha celular humana PCI-06A

Linha celular humana PCI-06B

Linha celular humana SK-N-MC

Linha celular humana TF-1 (D.L.Ma) Células exocervicais humanas (CGLee)

Linha de células de fibrossarcoma humano HT1080 Linha de células de fibrossarcoma humano HT1080-6TGc5 Linha de células de cancro gástrico humano SGC-7901 Linha de células humanas TF-1 privadas de GM-CSF (Liu,Hongtao) Células HeLa humanas (Y.Wang) Células HeLa humanas (M.Lovett) ARNm da linha de células Jurkat humanas (Thiele,K.) Células eritroleucémicas humanas K562 Linha de células de cancro do pulmão humano A549.A549 Linha celular de carcinoma nasofaringico humano HNEl Células SK-ER3 de neuroblastoma humano (M.Garnier) Melanócitos de recém-nascido humano (T.Vogt)

Linha celular de cancro pancreático humano Patu 8988t ARNm de melanócitos primários humanos (I.M.Eisenbarth)

Linha de células promielociticas humanas HL60 (S.Herblot)

Linha de células de retina humana ARPE-19

Linha de células de glândulas salivares humanas HSG

Glóbulos brancos humanos

Células T Jurkat I

Células T Jurkat II

Células T Jurkat III

Células T Jurkat V

Células T Jurkat VI ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 91 62 . Linha de células HepG2 de fígado 63 . Células LNCAP I 6 4 . Macrófago I 65 . Macrófago II 66 . Macrófago, subtraído (ADNc total) 67. Linha de células MCF7 68 . Células B Namalwa I 69 . Células B Namalwa II 70 . N CI_C GAP_B r 4 71. N CI_C GAP_B r 5 72 . N CI_C GAP_C L L1 73 . NCI_CGAP_GCBO 74 . NCI_CGAP_GCBl 75 . N CI_C GAP_HN1 76 . N CI_C GAP_HN 3 77 . N CI_C GAP_HN 4 78 . N CI_CGAP_H SCI 79 . N CI_C GAP_L í1 CO Ο N CI_C GAP_L í 2 81. NCI_CGAP_0v5 82 . N CI_CGAP_0v 6 83 . N CI_C GAP_P r1 84 . N CI_C GAP_P r10 85 . N CI_C GAP_P r11 00 N CI_CGAP_P r16 87. N CI_C GAP_P r18 CO CO N CI_C GAP_P r 2 89 . N CI_C GAP_P r 2 0 90 . N CI_CGAP_P r 2 4 91. N CI_C GAP_P r 2 5 92 . N CI_C GAP_P r 3 93 . N CI_C GAP_P r 4 94 . NCI_CGAP_Pr4.1 95 . NCI CGAP Pr5 NCI CGAP Pr5 92 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 96. NCI_CGAP_Pr6 97. NCI_CGAP_Pr7 98. NCI_CGAP_Pr8 99. NCI_CGAP_Pr9 100. Células de trabéculas ósseas humanas normais

101. Células Raji, tratadas com ciclo-hexamida I 102. Linha celular do epitélio do pigmento da retina 0041 103. Células HeLa tratadas com retinóide

104. Melanócito Soares 2NbHM

105. Fibroblastos senescentes Soares NbHSF 106. Célula HeLa s3 de Stratagene 937216

107. Células SupT

108. Linha de células de rabdomiossarcoma humano adulto, T

Tabela 3.

Cinco genes que se sabe serem genes específicos do endotélio nos conjuntos de dbEST. O número de EST no conjunto endotelial é relativamente pequeno (-11.117) e nem todos os genes endoteliais conhecidos estão representados.

Gene conhecido Igualdades no Igualdades no específico conjunto não conjunto do endotélio endotelial endotelial factor de von Willebrand (vWF) 1 27 receptor de VEGF fltl — — receptor de VEGF KDR 1 — tirosina-quinase TIEl — 5 tirosina-quinase TIE2/TEK 2 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 93 Tabela 4. Vinte e quatro endoteliais bibliotecas SAGE-CGAP de células não SÍMBOLO DESCRIÇÃO SAGE_HCT116 Cólon, linha celular derivada de carcinoma colorrectal SAGE_Caco_2 Cólon, linha celular de carcinoma colorrectal SAGE_Duke_H3 9 2 Cérebro, linha celular de glioblastoma multiforme de Duke SAGE_SW83 7 Cólon, linha celular de cancro SAGE_RKO Cólon, linha celular de cancro SAGE_NHA(5th) Cérebro, astrócitos humanos normais colhidos na passagem 5 SAGE_ES2-1 Linha celular de carcinoma de células claras do ovário ES-2, pouco diferenciadas SAGE_OVCA432-2 Ovário, linha de células de carcinoma OVCA432 SAGE_OVl063-3 Ovário, linha de células de carcinoma OV1063 SAGE_Duke_mhh-l Cérebro, linha de células de meduloblastoma negativas para c-myc mhh-1 SAGE_Duke_H3 41 Cérebro, linha de células de meduloblastoma positivas para c-myc H341 SAGE_H0SE_4 Ovário, epitélio superficial normal SAGE_0VP-5 Ovário, linhas celulares de cancro combinadas SAGE_LNCaP Próstata, linha celular. Dependente de androgénios SAGE_HME C-B 41 Cultura de células HMEC-B41 de células epiteliais mamárias humanas normais SAGE_MDA4 5 3 Linha de células MDA-MB-453 de carcinoma da mama humano SAGE_SKBR3 Linha de células SK-BR-3 (ATCC). Adenocarcinoma da mama humano SAGE_A2780-9 Ovário, linha celular de cancro do ovário A2780 SAGE_Duke_H2 4 7_nor mal Cérebro, linha celular de glioblastoma multiforme H247 94 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ SAGE_Duke_H247_Hyp Cérebro, linha celular de glioblastoma oxia multiforme de Duke, H247, crescida sob 1,5% oxigénio SAGE_Duke_post_crisi Pele, linha celular de fibroblastos de s_fibroblasts sobrevivência pós-crise SAGE_Duke_precrisis_ Pele, clones de fibroblastos humanos fibroblasts transformados com antigénio T grande SAGE_A SAGE_IOSE29-ll

Próstata, linha celular de cancro. Induzida com androgénio sintético

Ovário, linha de epitélio superficial

Tabela 5.

Cinco genes conhecidos específicos do endotélio nos conjuntos de SAGE-CGAP. TIEl e TIE2/TEK têm múltiplas igualdades no conjunto não endotelial (a maioria em linhas celulares normais ou de carcinoma de origem ovariana) . 0 factor vWF é o mais especifico do endotélio, tendo 80 igualdades no conjunto endotelial e apenas uma igualdade no conjunto não endotelial.

Gene conhecido específico do endotélio Marcas nas bibliotecas SAGE não endoteliais Marcas nas bibliotecas SAGE endoteliais Factor de von Willebrand (vWF) 1 (linha celular de carcinoma do cólon) 80 Receptor de VEGF fltl Receptor de VEGF KDR 1 (Linha celular do epitélio superficial do ovário (IOSE29) 6 Tirosina-quinase TIEl 17 (linhas celulares de epitélio do ovário normal e de tumor do ovário) 27 Tirosina-quinase TIE2/TEK 4 (linhas celulares de glioblastoma multiforme e de carcinoma do ovário) 2 95 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Tabela 6.

Resultados do rastreio UniGene/EST. vinte genes conhecidos foram seleccionados no rastreio UniGene/EST (ausência de igualdades no conjunto não endotelial e um mínimo de uma igualdade no conjunto endotelial). Pelo menos quatro destes genes são genes conhecidos específicos do endotélio: TIE1, TIE2/TEK, LYVEl e multimerina, indicando uma precisão de -20% da previsão. Outros genes, embora certamente expressos de forma preferencial nas células endoteliais, poderão não ser específicos do endotélio.

Descrição ID UniGene Igualdades endoteliais Tirosina-quinase endotelial receptora TIE1 Hs.78824 5 Fosfolipase A2 citosólica; envolvida no metabolismo de eicosanóides Hs .211587 3 Desidrogenase dos α-cetoácidos de cadeia ramificada Hs. 1265 2 Proteína-quinase dependente de CGMP; clonada a partir de ADNc da aorta, fortemente expressa em tecidos bem vascularizados como a aorta, o coração e o útero (Tamura et al, 1996) Hs. 2689 2 Receptor 1 do hialuronano endotelial nos vasos linfáticos -LYVEl (Banerji et al, 1999) Hs .17917 2 Proteína de interacção TRAF:via de sinalização de TNF Hs .21254 2 Multimerina: uma proteína muito grande específica do endotélio; liga-se ao factor plaquetário V, também pode ser encontrada nas plaquetas (Hayward et al, 1996) Hs.32934 2 Diubiquitina (um membro da família ubiquitina); referida em células dendríticas e linfócitos B; envolvida no processamento de antigénios; isto é a primeira evidência que também está presente nas células endoteliais (Bates et al, 1997) Hs.44532 2 96 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Proteína da família da β-transducina; também um homólogo do gene notchless de D. melanogaster: uma nova proteína contendo uma repetição WD40 que modula a actividade de sinalização Notch Tirosina-quinase endotelial receptora TIE2/TEK Proteína X associada ao BCL2 (BAX) ARNm de sepiapterina-redutase Receptor beta do ácido retinóico (RARB) Receptor ST2: um homólogo do receptor da interleucina 1 Proteína-quinase 8 activada por mitogénio (MAPK8) Gene ERG relacionado com o oncogene ETS

Hs . 85570

Hs .89640 Hs.159428 Hs.160100 Hs .171495 Hs . 66 Hs . 859 Hs . 45514 2 PP35 similar a yhdg de E. coli e nifR3 de R. capsulatus Proteoglicano da matriz interfotorreceptora; fortemente expresso na retina e na veia do cordão umbilical (Felbor et al, 1998) Gene da metilmalonato-semialdeído-desidrogenase Sequência retroviral endógena relacionada com HTLV-1

Hs.97627 Hs.129882

Hs.170008 Hs.247963 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 97 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Tabela 7. Ά análise diferencial xProfiler foi combinada com os dados do rastreio UniGene/EST, obtendo-se uma certeza da previsão de 100%. 0 resultado da análise xProfiler refere genes com um número de marcas no conjunto endotelial lOx maior que no conjunto não endotelial das bibliotecas SAGE-CGAP. As igualdades destes genes, nos conjuntos de est endotelial e não endotelial, foram identificados através de pesquisas BLAST ao nivel de identidade de ARNm (genes conhecidos) ou de sequências continuas obtidas com o programa Phrap (agregados de EST representando novos genes). Os genes são classificados de acordo com o número de igualdades no conjunto de EST não endotelial. Os genes conhecidos específicos do endotélio e os genes previstos como sendo novos genes específicos do endotélio encontram-se em negrito. ID UniGene Descrição do gene Certeza da previsão Xprofiler Correspondências no conjunto de EST endotelial Correspondências no conjunto de EST não endotelial Hs.13957 EST-ECSMl 97% 4 0 Hs.111518 "carrossel mágico", homologia distante com "carrossel" humano 1 100% 4 0 Hs.268107 multimerina 92% 5 0 HS.155106 proteína 2 modificadora da actividade do receptor similar ao receptor da calcitonina 97% 0 0 Hs. 233955 EST 96% 0 0 Hs.26530 proteína de resposta a privação de soro (proteína de ligação a fosfatidil-serina) 94% 3 1 Hs.83213 proteína 4 de ligação a ácidos gordos 100% 3 1 98 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Hs.110802 factor de von Wlllebrand 100% 25 1 Hs.76206 caderina 5, caderina-VE (endotélio vascular) 100% 4 1 Hs .2271 endotelina 1 98% 9 2 Hs.119129 colagénio, tipo IV, alfa 1 100% 4 6 Hs.78146 molécula de adesão às plaquetas/ células endotellals (antigénio CD31) 99% 18 5 Hs.76224 proteína 1 da matriz extracelular tipo fibulina contendo EGF 100% 37 9 Hs.75511 factor de crescimento do tecido conectivo 100% 34 48 99 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

100 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Tabela 9.

Lista de iniciadores utilizados nas reacções de RT-PCR.

Utilizaram-se os iniciadores de dbSTS se uma entrada de UniGene contivesse uma STS. Caso contrário, os iniciadores foram concebidos utilizando o programa Primer3.

Gene Iniciadores (sequência ou acesso GenBank para a STS) ECSMl - Hs.13957 G26129 "carrossel mágico" -Hs. 111518 G14937 Proteina 2 modificadora da actividade do receptor similar ao receptor da calcitonina G26129 Hs.233955 G21261 Proteina 4 de ligação a ácidos gordos 5'-TGC AGC TTC CTT CTC ACC TT-3' 5'-TCA CAT CCC CAT TCA CAC TG-3' Factor de von Willebrand 5'-TGT ACC ATG AGG TTC TCA ATG C-3' 5'-TTA TTG TGG GCT CAG AAG GG -3' Proteina de resposta a privação de soro G21528 Colagénio, tipo iv, alfa 1 G07125 Proteina 1 da matriz extracelular de tipo fibulina contendo EGF G06992 Factor de crescimento do tecido conectivo 5'-CAA ATG CTT CCA GGT GAA AAA-3' 5'-CGT TCA AAG CAT GAA ATG GA-3' 101 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Tabela 10.

As EST que pertencem à sequência contig de ECSMl são seguintes: SEQUÊNCIAS EST (30) AI540508, cDNAclonelMAGE:2209821, Útero, leitura 3', 2,lkb AI870175, cDNAclonelMAGE:2.424998, Útero, leitura 3', l,7kb AI978643, cDNAclonelMAGE:2491824, Útero, leitura 3', l,3kb AI473856, cDNAclonelMAGE:2044374, Linfa, leitura 3' AI037900, cDNAclonelMAGE:1657707, Embrião inteiro, leitura 3' 1,2kb AI417620, cDNAclonelMAGE:2115082, leitura 3', l,0kb AA147817, cDNAclonelMAGE:590062, leitura 3' AA968592, cDNAclonelMAGE:1578323, leitura 3', 0,7kb AW474729, cDNAclonelMAGE:2853635, Útero, leitura 3' R02352, cDNAclonelMAGE:124282, leitura 3', 0,7kb R01889, cDNAclonelMAGE:124485, leitura 5', 0,7kb AA446606, cDNAclonelMAGE:783693, Embrião inteiro, leitura 3' R02456, cDNAclonelMAGE:124282, leitura 5', 0,7kb T72705, cDNAclonelMAGE:108686, leitura 5', 0,7kb R01890, CDNAclonelMAGE:124485, leitura 3’, 0,7kb AA147925, cDNAclonelMAGE:590014, leitura 5' AI 131471; cDNAclonelMAGE:1709098, Coração, leitura 3', 0,6kb AA733177, cDNAclone399421, Coração, leitura 3' AI039489, cDNAclonelMAGE: 1658903, Embrião inteiro, leitura 3 0,6kb AI128585, cDNAclonelMAGE:1691245, Coração, leitura 3', 0,6kb AI540506, cDNAclonelMAGE:2209817, Útero, leitura 3', 0,6kb AA894832, cDNAclonellVlAGE:1502815, Rim, leitura 3', 0,5kb AW057578, CDNAclonelMAGE:2553014, Reunido, leitura 3', 0,3kb AA729975, cDNAclonelMAGE: 1257976, Célula germinal, 0,3kb AI131016, cDNAclonelMAGE:1706622, Coração, leitura 3', 0,2kb AA147965, cDNAclonelMAGE:590062, leitura 5' AA446735, cDNAclonelMAGE:783693, Embrião inteiro, leitura 5' AA147867, cDNAclonelMAGE:590014, leitura 3' AI497866, cDNAclonelMAGE:2125892, Reunido, leitura 3' T72636, cDNAclonelMAGE:108686, leitura 3', 0,7kb 102 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Tabela 11.

As EST dentro da sequência do "carrossel mágico":

Sequências EST no "carrossel mágico" (55): AI803963, cDNAclonelMAGE:2069520, leitura 3', 0,9kb W88669, cDNAclonelMAGE:417844, leitura 3', 0,7kb AI184863, cDNAclonelMAGE:1565500, Reunido, leitura 3', 0,6kb AA011319, cDNAclonelMAGE:359779, Coração, leitura 3', 0,6kb AA302765, cDNAcloneATCC: 194652, Adipose, leitura 3' AI278949, cDNAclonelMAGE:1912098, Cólon, leitura 3', 0,7kb AI265775, cDNAclonelMAGE:2006542, Ovário, leitura 3' AA746200, cDNAclonelMAGE:1324396, Rim, 0,5kb N78762, cDNAclonelMAGE:301290, Pulmão, leitura 3' AI352263, cDNAclonelMAGE:1940638, Embrião inteiro, leitura 3', 0,6kb AA630260, cDNAclonelMAGE:854855, Pulmão, leitura 3', 0,5kb C20950, cDNAclone(sem nome), leitura 3' W88875, cDNAclonelMAGE:417844, leitura 5', 0,7kb AA156022, cDNAclonelMAGE:590120, leitura 3' N93972, cDNAelonelMAGE:309369, Pulmão, leitura 3', l,7kb AI217602, cDNAclonelMAGE: 1732380, Coração, leitura 3', 0,5kb AW294276, cDNAclonelMAGE:27261347, leitura 3' AA010931, cDNAclonelMAGE:359779, Coração, leitura 5', 0,6kb AA3 03 624, cDNAcloneATCC:115215, Aorta, leitura 5' AI366745, cDNAclonelMAGE:1935056, leitura 3', 0,5kb AA327257, cDNAcloneATCC:127927, Cólon, leitura 5' C06489, cDNAclonehbc5849, Pâncreas BE218677, cDNAclonelMAGE:3176164, pulmão, leitura 3' AA335675, cDNAcloneATCC:137498, Testículos, leitura 5' R84975, cDNAclonelMAGE:180552, Cérebro, leitura 3', 2,lkb AI926445, cDNAclonelMAGE:2459442, Estômago, leitura 3', l,9kb H61208, cDNAclonelMAGE:236318, Ovário, leitura 3', l,9kb AA335358, cDNAcloneATCC:137019, Testículos, leitura 5' AI129190, cDNAclonelMAGE:1509564, Reunido, leitura 3', 0,8kb T59188, cDNAclonelMAGE:74634, Baço, leitura 5', 0,8kb T59150, cDNAclonelMAGE:74634, Baço, leitura 3', 0,8kb R53174, cDNAclonelMAGE:154350, Breast, leitura 5', 0,8kb AA156150, cDNAclonelMAGE:590120, leitura 5' AA302509, cDNAcloneATCC:114727, Aorta, leitura 5' R99429, cDNAclonelMAGE:201985, leitura 5', 2,4kb AI813787, cDNAclonelMAGE:2421627, Pâncreas, leitura 3', l,2kb H62113, cDNAclonelMAGE:236316, Ovário, leitura 5', l,0kb R16422, cDNAclonelMAGE:129313, leitura 5', 0,7kb T48993, cDNActoneiMAGE:70531, Placenta, leitura 5', 0,6kb 103 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ Τ05694, cDNAcloneHFBDF13, Cérebro R84531, cDNAclonelMAGE:180104, Cérebro, leitura 5', 2,2kb AI903080, cDNAclone(sem nome), mama AI903083, cDNAclone(sem nome), mama AA302764, cDNAcloneATCC:194652, Adipose, leitura 5' AA341407, cDNAcloneATCC:143064, Rim, leitura 5' W16503, cDNAclonelMAGE:301194, Pulmão, leitura 5' AW801246, cDNAclone(sem nome), útero AW959183, cDNAclone(sem nome) R85924, cDNAclonelMAGE:180104, Cérebro, leitura 3', 2,2kb AA358843, cDNAcloneATCC:162953, Pulmão, leitura 5' BE161769, cDNAclone(sem nome), cabeça-pescoço W40341, cDNAclonelMAGE:309369, Pulmão, leitura 5', l,7kb AA876225, cDNAclonelMAGE:1257188, Célula germinal, leitura 3' R99441, cDNAclonelMAGE:202009, leitura 5', 2,3kb W76132, cDNAclonelMAGE:344982, Coração, leitura 5', l,4kb,

Tabela 12. 110 EST no agregado do "carrossel mágico" de ratinho (Mm.27782) AI427548, cDNAclonelMAGE:521115, Músculo, leitura 3' AV022394, cDNAclonell90026N09, leitura 3' BB219221, cDNAcloneA530053H04, leitura 3' AI604803, cDNAcloneIMAGE:388336, Embrião, leitura 3' AI504730, cDNAclonelMAGE:964027, Glândula mamária, leitura 3' AI430395, cDNAclonelMAGE:388336, Embrião, leitura 5' AI181963, cDNAclonelMAGE:1451626, Fígado, leitura 3' AV020471, cDNAclonell90017N14, leitura 3' BB219225, cDNAcloneA530053Hl2, leitura 3' BB224304, cDNAcloneA530086A21, leitura 3' BB527740, cDNAcloneD930042M18, leitura 3' W66614, cDNAclonelMAGE:388336, Embrião, leitura 5' BB097630, cDNAclone9430060E21, leitura 3' AI152731, cDNAclonelMAGE:1478154, Útero, leitura 5' AW742708, cDNAclonelMAGE:2780289, ouvido interno, 170 reunidos, leitura 3' BB118169, cDNAclone9530064M17, leitura 3' AI839154, cDNAcloneUI-M-AO0-ach-e-ll-0-Ul, leitura 3' BB206388, cDNAcloneA430075J10, leitura 3' BB381670, cDNAcloneC230015E01, leitura 3' BB 199721, cDNAcloneA430017Al9, leitura 3' AI593217, cDNAclonelMAGE:1177959; Glândula mamária, leitura 3' BB219411, cDNAcloneA530054L01, leitura 3' 104 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ ΒΒ220744, ΒΒ220944, ΒΒ390078, ΒΒ220730, ΑΙ615527, Α1882477, AV025281, ΒΒ470462, ΒΒ247620, ΒΒ555377, ΒΒ512960, ΒΒ400157, ΒΒ320465, ΒΒ1056 70, ΒΒ441462, ΒΒ137530, ΑΑ553155, ΒΒ319763, ΒΒ451051, ΒΒ5046 72, ΑΙ429453, ΒΒ190585, ΒΒ257082, ΒΒ386699, ΒΒ295814, ΒΒ450972, ΑΑ718562, ΒΒ223775, AV020555, ΒΒ226083, ΒΒ482105, ΒΒ3816 71, ΒΒ383758, ΒΒ257519, ΒΒ26566 7, ΒΒ254777, AV240775, ΒΒ315010, ΒΒ390074, ΒΒ517605, ΒΒ484410, ΒΒ357583, AV225639, ΒΒ554921, cDNAcloneA530061M19, leitura 3' cDNAcloneA530062022, leitura 3' cDNAcloneC230066L23, leitura 3' cDNAcloneA530061L13, leitura 3' cDNAclonelMAGE:964027, Glândula mamária, leitura 5' cDNAclonelMAGE:1396822, Glândula mamária, leitura 5' cDNAclonel200012D01, leitura 3' cDNAcloneD230033L23, leitura 3' cDNAcloneA730020G03, leitura 3' cDNAcloneE330019B13, leitura 3' cDNAcloneD730043l21 cDNAcloneC330017F17, leitura 3' cDNAcloneB230385010, leitura 3' cDNAclone9430096H10, leitura 3' cDNAcloneD030027Bll, leitura 3' cDNAclone9830142007, leitura 3' cDNAclonelMAGE:964027, Glândula mamária, leitura 5' cDNAcloneB230382G07, leitura 3' cDNAcloneD130007l05, leitura 3' cDNAcloneD630049Jll, leitura 3' cDNAclonelMAGE:569122, Embrião, leitura 3' cDNAcloneA330062j23, leitura 3' cDNAcloneA730076M18, leitura 3' cDNAcloneC230047P06, leitura 3' cDNAcloneB130042A09, leitura 3' cDNAcloneD130007A22, leitura 3' cDNAclonelMAGE:1177959, Glândula mamária, leitura 5' cDNAcloneA530083K18, leitura 3' cDNAclonell90018G05, leitura 3' cDNAcloneA530095Kll, leitura 3' cDNAcloneD430007019, leitura 3' cDNAcloneC230015E02, leitura 3' cDNAcloneC230030C02, leitura 3' cDNAcloneA730080D13, leitura 3' cDNAcloneA830021117, leitura 3' cDNAcloneA730063K20, leitura 3' cDNAclone4732443F15, leitura 3' cDNAcloneB230352H04, leitura 3' cDNAcloneC230066L16, leitura 3' cDNAcloneD830025B17, leitura 3' cDNAcloneD430025H01, leitura 3' cDNAcloneC030022J01, leitura 3' cDNAclone3830431D12, leitura 3' cDNAcloneE330016A12, leitura 3' ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 105 ΒΒ161650, cDNAcloneA130061H21, leitura 3' ΒΒ106720, cDNAclone9530002M22, leitura 3' ΒΒ535465, cDNAcloneE030043P14, leitura 3' ΒΒ357738, cDNAcloneC030024B10, leitura 3' AV285588, cDNAclone5031411M12 ΒΒ188339, cDNAcloneA330048H22, leitura 3' AV337749, cDNAcloneô 430404F19, leitura 3' ΒΒ065281, cDNAclone8030443H10, leitura 3' ΒΒ148059, cDNAclone9930104N19, leitura 3' AV252251, cDNAclone4833438P20, leitura 3' ΒΒ184506, cDNAcloneA330012J24, leitura 3' ΒΒ522445, cDNAcloneD930007M08, leitura 3' ΒΒ520366, cDNAcloneD830041K23, leitura 3' AV127290, cDNAclone2 700047J01, leitura 3' ΒΒ248651, cDNAcloneA730027F04, leitura 3' ΒΒ008452, cDNAclone4732482M24, leitura 3' ΒΒ550719, cDNAcloneE230024C07, leitura 3' ΒΒ182033, cDNAcloneA230095N14, leitura 3' ΒΒ480258, cDNAcloneD33004SD17, leitura 3' ΒΒ004855, cDNAclone4732463E03, leitura 3' AV379748, cDNAclone9230013A19, leitura 3' ΒΒ552137, cDNAcloneE230035B12, leitura 3' ΒΒ288263, cDNAclonelMAGE:3490042, mamário ΒΒ215681, cDNAcloneA530026Mll, leitura 3' ΒΒ251356, cDNAcloneA730046B16, leitura 3' ΒΒ503441, cDNAcloneD630043F10, leitura 3' ΒΒ500571, cDNAcloneD630029E03, leitura 3' ΒΒ199833, cDNAcloneA430017K13, leitura 3' ΒΒ533549, cDNAcloneE030030K03, leitura 3' ΒΒ098399, cDNAclone9430063Ll8, leitura 3' ΒΒ213310, cDNAcloneA530009E09, leitura 3 ' ΒΒ240699, cDNAcloneA630083B 14, leitura 3 ΒΒ217106, cDNAcloneA530040N24, leitura 3' ΒΒ057432, cDNAclone7120459H22, leitura 3' ΒΒ214645, cDNAcloneA530021N22, leitura 3' ΒΒ218254, cDNAcloncA530048K12, leitura 3' ΒΒ319841, cDNAcloneB230382006, leitura 3' ΒΒ459759, cDNAcloneD130063G22, leitura 3' ΒΒ485618, cDNAcloneD430032M09, leitura 3' ΒΒ517699, cDNAcloneD830025118, leitura 3' ΒΒ53 5595 , cDNAcloneE030044M09, leitura 3 BBS36291, cDNAcloneE030049D17, leitura 3' ΒΒ552689, cDNAcloneE330001A16, leitura 3' ΒΒ552709, cDNAcloneE33C001C16, leitura 3' 106 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Exemplo 2. A expressão de ECSM4 está restringida às células endoteliais. A hibridação in situ (HIS) de tecidos normais e tumorais mostrou que a expressão de ECSM4 está restringida às células endoteliais vasculares apenas em vasos angiogénicos do adulto. A análise dos tecidos normais revelou que a expressão de ECSM4 é detectada na placenta humana e no tecido fetal do cordão umbilical às 10,8 semanas de idade menstrual. Como ilustrado na Figura 16, a expressão de ECSM4 é extremamente especifica das células endoteliais vasculares do vaso sanguíneo na placenta. Além disso, a expressão encontrava-se ausente em vários outros tecidos normais que foram analisados, incluindo o fígado, o cérebro e os grandes vasos, a próstata, o cólon, o intestino delgado, o coração, o olho (coróide e esclerótica), o ovário, o estômago e a mama de adulto; a bexiga, os testículos e o rim fetais (15,8 semanas); o coração, o rim, supra-renal e o intestino fetais (11,3 semanas); o cérebro fetal (10,6 semanas) e o olho fetal (16,5 semanas) (resultados não apresentados). A análise de HIS de biópsias de metástases de cancro colorrectal no fígado mostrou que a expressão de ECSM4 estava restringida às células endoteliais vasculares apenas dos vasos tumorais (Figura 17 e 18) . Não se detectou qualquer expressão no tecido normal circundante. Além disso, a maior expressão nas proximidades dos tecidos necróticos (Figura 18, o tecido necrótico está indicado pelo sinal brilhante designado por *) é indicativa e consistente com a indução da expressão de ECSM4 por hipoxia. Como tal, ECSM4 poderá ser um novo gene regulado por hipoxia. O padrão de expressão extremamente restrito de ECSM4 nos vasos angiogénicos, em tecidos normais e tumorais no adulto, é totalmente consistente com o padrão de expressão selectivo das células endoteliais determinado pela análise in silico descrita no Exemplo 1. Métodos

Os blocos de tecidos e de tumores embutidos em parafina e fixados com formalina foram obtidos dos arquivos do grupo de patologia da mama do Imperial Câncer Research Fund, no Guys 107 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Hospital, Londres, Reino Unido. Preparou-se uma ribossonda anti-sentido para o ADNc de ECSM4 destinada à localização especifica do ARNm de ECSM4 por hibridação in situ. Os métodos para pré-tratamento, hibridação, lavagem e imersão dos slides em Ilford K5 para autorradiografia foram previamente descritos (Poulsom, R., Longcroft, J.M., Jeffrey, R.E., Rogers, L. & Steel, J.H. (1998) Eur. J. Histochem. 42, 121-132). Os filmes foram expostos durante 7 a 15 dias antes da revelação em Kodak D19 e contra-coloração com Giemsa. As secções foram examinadas sob condições de fundo escuro com luz reflectida ou condições convencionais (Olympus BH2 com epi-iluminação), sob uma objectiva de 5x, lOx ou 20x que permitiu que os grãos de prata autorradiográficos individuais fossem vistos como objectos brilhantes num fundo escuro.

Exemplo 3. O polipéptido ECSM4 é detectado apenas em células endoteliais.

Anticorpos capazes de se ligarem selectivamente ao polipéptido ECSM4 foram produzidos e utilizados em imuno-histoquímica, para demonstrar a presença do polipéptido ECSM4 em vários tipos de células (Figuras 21 a 26) . As amostras de tecidos foram preparadas através de técnicas Standard na arte da imuno-histoquímica.

Produção de anticorpos que reconhecem ECSM4.

Os péptidos MR 165, MR 311 e mr 336 foram fundidos com hemocianina de lapa (KLH), antes da imunização de coelhos para a produção de anticorpos policlonais. O anticorpo MGO-5 foi derivado de coelhos imunizados com o péptido MR 165, enquanto MGO-7 foi derivado de coelhos imunizados com uma mistura de MR 311 e MR 336. As sequências dos péptidos utilizados para produzir os anticorpos policlonais estão apresentadas abaixo; a sua referência na sequência de aminoácidos do ECSM4 humano completo é como apresentada na Figura 12. MR 165 = LSQSPGAVPQALVAWRA (681-697) MR 274 = DSVLTPEEVALCLEL (790-804) MR 311 = TYGYISVPTA (827-836) MR 336 = KGGVLLCPPRPCLTPT (852-867) 108 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Exemplo 4. A sequência EST do "carrossel mágico" identificada na pesquisa bioinformática de transcritos específicos do endotélio foi utilizada para isolar um ADNc de 3800 pares de bases, a partir de uma biblioteca de ADNc de coração humano. Um rastreio utilizando iniciadores específicos para o gene mostrou que o gene estava presente em bibliotecas de coração, de cérebro de feto e de adulto, de fígado, de pulmão, de rim, de músculo, de placenta e de intestino delgado, mas ausente de bibliotecas de leucócitos do sangue periférico, de baço e de testículos. A expressão mais elevada ocorreu na biblioteca placentária. A comparação da sequência do "carrossel mágico" com a do "carrossel" revelou uma proteína transmembranar com homologia completa, mas que não possui alguns domínios extracelulares. Assim, o MR possui dois domínios imunoglobulina e dois domínios fibronectina no domínio extracelular, em comparação com cinco domínios imunoglobulina e dois domínios fibronectina nos domínios extracelulares dos "carrosséis" neuronais específicos. Um domínio transmembranar foi identificado (i) utilizando o software de previsão transmembranar PRED-TMR e (ii) utilizando um alinhamento entre as sequências peptídicas do MR humano e do ROBOl humano. Ambos os métodos identificaram os mesmos resíduos como a região transmembranar do MR humano, nos aminoácidos 468-490. Assim, os aa 1-467 são extracelulares, e os aa 491-1007 são intracelulares. O domínio intracelular contém uma região putativa rica em prolina, que é homóloga daquelas no "carrossel" que se pensa acoplarem com c-abl (Bashaw et al (2000) Cell 101: 703-715). A STS SHGC-11739 humana (n.° acesso ao GenBank G14646) foi mapeada no ARNm do "carrossel mágico", numa pesquisa BLAST da base de dados dbSTS. Esta STS é mapeada no cromossoma 11 no mapa físico G3 de Stanford (região 5647.00 CR10000 LOD 1.09 bin 129). No entanto, grande parte da sequência está em falta e a estrutura genómica não é conhecida. A pesquisa na base de dados RIKEN identificou o "carrossel mágico" murino. O peso molecular previsto para o núcleo peptídico do MR humano foi de 107.457 kDa. Este resultado foi confirmado por tradução in vitro (Figura 3). 109 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Exemplo 5. A expressão de ECSM4 é detectável em tumores A hibridação in situ foi utilizada para caracterizar a expressão de ECSM4 in vivo. Verificou-se que a expressão de ECSM4 é muito restrita (Tabela 13), sem qualquer sinal detectável em muitos tecidos, incluindo o tecido neuronal. Em contraste, foi detectada uma expressão forte na placenta e em vários tumores, incluindo tumores do cérebro, da bexiqa e metástases do cancro colorrectal para o fiqado (Fiqura 27) . A expressão nos tumores encontrou-se limitada à vasculatura tumoral. A coloração imuno-histoquímica da placenta confirmou a expressão especifica endotelial da proteína.

Uma pesquisa de ECSM4 nas bibliotecas SAGE-CGAP detectou este gene apenas em bibliotecas endoteliais e de tumores (Tabela 14). Isto foi consistente com os resultados da hibridação in situ no adulto, mostrando que a expressão estava restringida aos vasos de tumores (metástases de cancro colorrectal para o fígado, ganglioma, carcinoma da bexiga e da mama).

Tabela 13 Expressão do "carrossel mágico" em tecido humano in vivo.

Expressão detectada

Placenta e tecido fetal do cordão umbilical (10,8 semanas de idade menstrual)

Vasos nas metástases do cancro colorrectal para o fígado, ganglioma, carcinoma da bexiga e da mama.

Expressão não detectada Fígado, cérebro e grandes vasos, próstata, cólon, intestino delgado, coração, coróide e esclerótica, ovário, estômago, mama no adulto. 110 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Tabela 14 Bibliotecas SAGE-CGAP em que o "carrossel mágico" foi detectado com base em mapeamento gene para marca

Biblioteca Marcas/milhão marcas HDMEC 171 HDMEC + VEGF 224 Meduloblastoma 102 Glioblastoma multiforme 85 Ovário, adenocarcinoma seroso 59 Glioblastoma multiforme, combinado 48 HDMEC: células endoteliais microvasculares da derme humana; VEGF: factor de crescimento endotelial vascular.

Exemplo 6.

Indução de ECSM4 em células endoteliais hipóxicas. A reacção de RT-PCR inicial detectou a expressão de ECSM4 em linhas de células endoteliais, mas não em outras linhas de células como os fibroblastos (endometriais normais e FEK4), o carcinoma do cólon (SW480 e HCT116), o carcinoma da mama (MDA453 e MDA468) e as células HeLa. O ensaio de protecção da ribonuclease confirmou e ampliou este resultado (Figura 11a). Observou-se que a expressão de ECSM4 estava restringida ao endotélio (três isolados diferentes) e ausente dos fibroblastos, do carcinoma e das células neuronais.

Observou-se a indução de ECSM4 em hipoxia em células endoteliais (mas não em células não endoteliais), quando a expressão de ECSM4 foi analisada utilizando duas sondas diferentes de protecção da ARNase. A expressão foi, em média, 5,5 e 2,6 vezes superior em hipoxia para as células HUVEC e HDMEC, respectivamente. A análise de Western identificou uma banda fraca de 110 kD nas células endoteliais microvasculares da derme humana (HDMEC), que estava ausente nos tipos de células não endoteliais (Figura 11b). A banda foi mais intensa quando as células HDMEC foram expostas a 18 horas de hipoxia, o que é consistente com o facto de ECSM4 ser um gene regulado por hipoxia. 111 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Imperial Câncer Research Technology Limited <120> Imagiologia, diagnóstico e tratamento de doença

<130> IMPW/P25480PC <140> <141> <160> 50 <170> Patentln Ver. 2.0

<210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Péptido < 4 0 0 > 1

Gly Gly Asp Ser Leu Leu Gly Gly Arg Gly Ser Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial < 4 0 0 > 2

Leu Leu Gin Pro Pro Ala Arg Gly His Ala His Asp Gly Gin Ala Leu 15 10 15

Ser Thr Asp Leu 20

<210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Péptido 112 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ < 4 Ο Ο > 3

Glu Pro Gin Asp Tyr Thr Glu Pro Vai Glu 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial : Péptido <400> 4 Thr Ala Pro Gly Gly Gin Gly Ala Pro Trp Ala Glu Glu 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial : Péptido < 4 0 0 > 5 Glu Arg Ala Thr Gin Glu Pro Ser Glu His Gly Pro 1 5 10 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial : Péptido < 4 0 0 > 6 Leu Ser Gin Ser Pro Gly Ala Vai Prc Gin Ala Leu Val Ala Trp Arg 1 5 10 15 Ala <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial : Péptido 113 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ < 4 Ο Ο > 7

Asp Ser Vai Leu Thr Pro Glu Glu Vai Ala Leu Cys Leu Glu Leu 15 10 15

<210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Péptido <400> 8

Thr Tyr Gly Tyr Ile Ser Vai Pro Thr Ala 15 10

<210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Péptido < 4 0 0 > 9

Lys Gly Gly Vai Leu Leu Cys Pro Pro Arg Pro Cys Leu Thr Pro Thr 15 10 15

<210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Péptido < 4 0 0 > 10

Trp Leu Ala Asp Thr Trp 1 5

<210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Péptido 114 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ < 4 Ο Ο > 11

Trp Leu Ala Asp Thr Trp Arg Ser Thr Ser Gly Ser Arg Asp 1 5 10

<210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Péptido <400> 12

Ser Pro Pro Thr Thr Tyr Gly Tyr Ile Ser 1 5 10

<210> 13 <211> 33 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Péptido < 4 0 0 > 13

Gly Ser Leu Ala Asn Gly Trp Gly Ser Ala Ser Glu Asp Asn Ala Ala 15 10 15

Ser Ala Arg Ala Ser Leu Vai Ser Ser Ser Asp Gly Ser Phe Leu Ala 20 25 30

Asp

<210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Péptido < 4 0 0 > 14

Phe Ala Arg Ala Leu Ala Vai Ala Vai Asp 15 10

<210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 115 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador < 4 0 0 > 15 tgcagcttcc ttctcacctt 20

<210> 16 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador <400> 16 tcacatcccc attcacactg 20

<210> 17 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador < 4 0 0 > 17 tgtaccatga ggttctcaat gc 22

<210> 18 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador < 4 0 0 > 18 ttattgtggg ctcagaaggg 20

<210> 19 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador < 4 0 0 > 19 caaatgcttc caggtgaaaa a 21

<210> 20 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 116 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ < 2 2 Ο >

Artificial: Iniciador <223> Descrição de Sequência <400> 20 cgttcaaagc atgaaatgga 20

<210> 21 <211> 1100 <212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 21 caggatgg cagagatgag caccaccatc 60 gtcatctgtt tcatggaatt caccagtctg 120 gatggcagga aggaggaaga gggtaatctg 180 gattaaacaa ccaccaggaa attttgatga 240 ggggaagaaa agcattgaaa ctacaaaaat 300 tgtctgctta tgcggtggct cgctgctcag 360 ctttgaaggc ttacagtgga atgaattcaa 420 tgtctgctta tgcggtggct cgctgctcag aaaaactcaa ggaccagtgc tgtgggtcca gtatcttcaa aatccagaag gatgatggca gaagagtttc cggacctact ctgctgctgt cactgttctc ctgagctcct ccctttcctc aaagtgttat ttggctggag tgaggtctca aacagggaac cattggagat actcatiact atacgactta tttgaggaat tgaagttgac aaaaaaagac tggtacttct gaattaacca aagcctgctg tttctacaaa ggctgctgat gtgçcctctg cttaaaaaag tagaaaacac tgcctaaagg cctcaggggc ccctccttgg aagagcccga attagggggg gatgggagtg tgggatgctc accctgccca aattgacctt ccctacagtt acctactttc accctaaacc aagcaatcaa cttcaattcc ttgtataacc atcctattgc atgtaagcct tgggtttggg ttccctgcca cccaaacatg cctgtttttt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tttatggagc tgataagaat cttcttggag 480 aaatcacagt attctgaaga tgattctaca 540 gatttctaca aagcctgctg tagtgttgct 600 attgatgcag catgttcacc ccaacctccc 660 gaagagggaa gggcgccgtg aggattggta 720 gtgggagaat aaggggacac cttccatcct 780 cctgatgaaa ggccagctcc cagaaatgtg 840 ctgcccttag tcaaatcctt ttcttttttt 900 cccagtataa aagggctttt ataccattct 960 aggtaacagt gtgggattcc cccatttcat 1020 tttaagcaat attaaatgtt tgtacttcag 1080 1100

<210> 22 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens 117 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ <4Ο Ο> 22

Met Ala Gly Arg Arg Lys Arg Vai Ile Trp Lys Ser Phe Arg Thr Tyr 1 5 10 15 Ser Ala Ala Vai Ile Lys Gin Pro Pro Gly Asn Phe Asp Asp Thr Val 20 25 30 Leu Leu Ser Ser Ser Ijeu Ser Ser Gly Lys Lys Ser Ile Glu Thr Thr 35 40 45 Lys Ile Lys Cys Tyr Leu Ala 'Gly Vai Arg Ser His val Cys Leu Cys 50 55 60 Gly Gly Ser Leu Leu Arg Thr Gly Asn His Trp Arg Tyr Ser Leu Leu _65_ 70 76 RO Phe Glu Gly Leu Gin Trp Asn Glu Phe Lys Tyr Asp Leu Phe Glu Glu 85 90 95 Leu Lys Leu Thr Leu Trp Ser 100 < 210 > 23 <211> 1496 < 212 > ADN <213> Homo sapiens <400> 23 aactggttgc gacactgcgg tgttgcactc tggctgctgc ttctgggcac cgctgtgtgt 60 118 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ atccaccgcc gtcgccgagc tagggtgctt ctgggcccag gtctgtacag atataccagt 120 gaçgatgcca tcctaaaaca caggatggat cacagtgact cccagtggtt ggcagacact 180 tggcgttcca cctctggctc tcgggacctg agcagcagca gcagcctcag cagtcggctg 240 ggggcggatg cccgggaccc actagactgt cgtcgctcct tgctctcctg ggactcccga 300 agccccggcg tgcccctgct tccagacacc agcacttttt atggctccct catcgctgag 360 ctgccctcca gtaccccagc caggccaagt ccccaggtcc cagctgtcag gcgcctccca 420 ccccagctgg cccagctctc cagcccctgt tccagctcag acagcctctg cagccgcagg 480 ggactctctt ctccccgctt gtctctggcc cctgcagagg cttggaaggc caaaaagaag 540 caggagctgc agcatgccaa cagttcccca ctgctccggg gcagccactc cttggagctc 600 cgggcctgtg agttaggaaa tagaggttcc aagaaccttt cccaaagccc aggggctgtg 660 ccceaagctc tggttgcctg gcgggccctg ggaccgaaac tcctcagctc ctcaaatgag 720 ctggttactc gtcatctccc tccagcaccc ctctttcctc atgaaactcc cccaactcag 780 agtcaacaga cccagcctcc ggtggcacca caggctccct cctccatcct gctgccagca 840 gcccccatcc ccatccttag cccctgcagt ccccctagcc cccaggcctc ttccctctct 900 ggcccçagcc cagcttccag tcgcctgtcc agctcctcac tgtcatccct gggggaggat 960 caagacagcg tgctgacccc tgaggaggta gccctgtgct tggaactcag tgagggtgag 1020 gagactccca ggaacagcgt ctctcccatg ccaagggctc cttcaccccc caccacctat TOTO gggtacatca gcgtcccaac agcctcagag ttcacggaca tgggcaggac tggaggaggg 1140 gtggggccca aggggggagt ctcgctgtgc ccacctcggc cctgcctcac ccccaccccc 1200 agcgagggct ccttagccaa tggttggggc tcagcctctg aggacaatgc cgccagcgcc 1260 açagccagcc ttgtcagctc ctccgatggc tccttcctcg ctgatgçtca ctttgcccgg 1320 gccctggcag tggctgtgga tagctttggt ttcggtctag agcccaggga ggcagactgc 1380 gtcttcatag gtatgtgagg tctccccatc ttactcctca cècatgcccc ttgcctttct 1440 aacaactgtt atcatgtcat cattgttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1496 <210> 24 <211> 465

< 212 > PRT <213> Homo sapiens < 4 Ο Ο > 24

Asn Trp Leu Arg His Cys Gly Vai Ala Leu Trp Leu Leu Leu Leu Gly 15 10 15

Thr Ala Vai Cys Ile His Arg Arg Arg Arg Ala Arg Vai Leu Leu Gly 20 25 30

Pro Gly Leu Tyr Arg Tyr Thr Ser Glu Asp Ala Ile Leu Lys His Arg 35 40 45

Met Asp His Ser Asp Ser Gin Trp Leu Ala Asp Thr Trp Arg Ser Thr 50 55 60

Ser Gly Ser Arg Asp Leu Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Arg Leu 65 70 75 80

Gly Ala Asp Ala Arg Asp Pro Leu Asp Cys Arg Arg Ser Leu Leu Ser 85 90 95 119 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Trp Asp Ser Arg Ser Pro Gly Vai Pro Leu Leu Pro Asp Thr Ser Thr 100 105 110

Phe Tyr Gly Ser Leu Ile Ala Glu Leu Pro Ser Ser Thr Pro Ala Arg 115 120 125

Pro Ser Pro Gin Vai Pro Ala Vai Arg Arg Leu Pro Pro Gin Leu Ala 130 135 140

Gin Leu Ser Ser Pro Cys Ser Ser Ser Asp Ser Leu Cys Ser A.rg Arg 145 150 155 160

Gly Leu Ser Ser Pro Arg Leu Ser Leu Ala Pro Ala Glu Ala Trp Lys 155 170 175

Ala Lys Lys Lys Gin Glu Leu Gin Hls Ala Asn Ser Ser Pro Leu Leu 180 185 190

Arg Gly Ser His Ser Leu Glu Leu Arg Ala Cys Glu Leu Gly Asn Arg 195 200 205

Gly Ser Lys Asn Leu Ser Gin Ser Pro Gly Ala Vai Pro Gin Ala Leu 210 215 220

Vai Ala Trp Arg Ala Leu Gly Pro Lys Leu Leu Ser Ser Ser Asn Glu 225 230 235 240

Leu Vai Thr Arg His Leu Pro Pro Ala Pro Leu Phe Pro His Glu Thr 245 250 255

Pro Pro Thr Gin Ser Gin Gin Thr Gin Pro Pro Vai Ala Pro Gin Ala 260 265 270

Pro Ser Sor Ile Leu Leu Pro Ala Ala Pro Ile Pro Ile Leu Ser Pro 275 280 285

Cys Ser Pro Pro Ser Pro Gin Ala Ser Ser Leu Ser Gly Pro Ser Pro 290 295 300

Ala Ser Ser Arg Leu Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Leu Gly Glu Asp 305 310 315 320

Gin Asp Ser Vai Leu Thr Pro Glu Glu Vai Ala Leu Cys Leu Glu Leu 325 330 335

Ser Glu Gly Glu Glu Thr Pro Arg Asn Ser Vai Ser Pro Met Pro Arg 340 345 350 120 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Ala Pro Ser Pro Pro Thr Thr Tyr Giy Tyr Ile Ser Vai Pro Thr Ala 355 360 365

Ser Glu Phe Thr Asp Met Gly Arg Thr Gly Gly Gly Vai Gly Pro Lys 370 375 380

Gly Gly Vai Leu Leu Cys Pro Pro Arg Pro Cys Leu Thr Pro Thr Pro 385 390 395 400

Ser Glu Gly Ser Leu Ala Asn Gly Trp Gly Ser Ala Ser Glu Asp Asn 405 410 415

Ala Ala Ser Ala Arg Ala Ser Leu Vai Ser Ser Ser Asp Gly Ser Phe 420 425 430

Leu Ala Asp Ala His Phe Ala Arg Ala Leu Ala Vai Ala Vai Asp Ser 435 440 445

Phe Gly Phe Gly Leu Glu Pro Arg Glu Ala Asp Cys Vai Phe Ile Gly 450 455 460

Met 465

<210> 25 <211> 2076 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 25 aggggactct cttctccccg cttgtctctg gcccctgcag aggcttggaa ggccaaaaag 60 aaagcaggag ctgcagcatg ccaacagttc cccactgctc cggggcagcc actccttaga 120 gctccgggcc tgtgagttag gaaatagagg ttccaagaac ctttcccaaa gcccaggagc 180 tgtgccccaa gctctggttg cctggcgggc cctgggaccg aaactcctca gctcctcaaa 240 tgagctggtt actcgtcatc tccctccagc acccctcttt cctcatgaaa ctcccccaac 300 tcagagtcaa cagacccagc ctccggtggc accacaggct ccctcctcca tcctgctgcc 360 agcagccccc atccccatcc ttagcccctg cagtccccct agcccccagg cctcttccct 420 ctctggcccc agcccagctt ccagtcgcct gtccagctcc tcactgtcat ccctggggga 480 ggatcaagac agcgtgctga cccctgagga ggtagccctg tgcttggaac tcagtgaggg 540 tgaggagact cccaggaaca gcgtctctcc catgccaagg gttccttcac cccccaccac 600 ctatgggtac atcagcgtcc caacagcctc agagttcacg gacatgggca ggactggagg 660 aggggtgggg cccaagggçg gagtcttgct gtgcccacct cggccctgcc tcacccccac 720 ccccagcgag ggctccttag ccaatggrtg gggctcagcc tctgaggaca atgccgccag 780 cgccagagcc agccttgtca gctcctccga tggctccttc ctcgctgatg ctcactttgc 840 ccgggccctg gcagtggctg tggatagctt tggtttcggt ctagagccca gggaggcaga 900 ctgcgtcttc atagatgcct catcacctcc ctccccacgg gattgagatc ttcctgaccc 960 121 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ ccaacctctc cctgcccctg tgggaagtgg aggccagact ggttggaaga caatggaagg 1020 tcagccacac ccagcggctg ggaaggggga tgcctccctg gccccctgac tctcagatct 1080 cttcccagag aagtcagctc cactgtcgta tgcccaaggg tgggtgcttc tcctgtagat 1140 tactcctgaa ccgtçtccct gagacttccc agacgggaat cagaaccact tctcctgtcc 1200 acccacaaga cctgggctgt ggtgtgtggg tcttggcctg tgtttctctg cagctggggt 1260 ccaccttccc aagcctccag agagttctcc ctccacgatt gtgaaaacaa atgaaaacaa 1320 aattagagca aagctgtacc tgggagccct cagggagcaa aacatcatct ccacctgact 1380 cctagccact gctttctcct ctgtgccatc cactcccacc acccaggttg tttttggcct 1440 gaaggagcaa gccctgcctg ctggcttttc cccccaacca tttgggattc acagggaagt 1500 gggagggagc ccagagggtg gccttttgtg ggagggacag cagtggctgc tgggggagag 1560 ggctgtggag gaaggagctt ctcggagccc cctctcagcc ttacctgggc ccctcctcta 1620 gagaagagct caactctctc ccaaccctca ccaatggaaa gaaaataatt atgaatgccg 1680 actgagqcac tqagqcccct acctcatqcc caaaacaaag ggqttcaaqg ctgggtctag 1740 cgaggatgct tgaaggaagg gaggtatgga gcccgtaggt caaaagcacc catcctcgta 1800 ctgttgtcac tatgagctta agaaatttga taccataaaa tggtaaagac ttgagttctg 1860 tgagatcatt ccccggagca ccatttttag gggagcacct ggagagatgg caagaatttc 1920 ctgagttagg cagggatcag gcattcattg acactcaggg agtgtcacac atttctgttc 1980 tgcaattaaa gggagaatga ggttcatcca ccaaatttta agcagaatat aggaagggca 2040 ggggtgggga gtrtcagggt ctgctggtcc tgggca 2076

<210> 26 <211> 314 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26

Gly Asp Ser Leu Leu Pro Ala Cys Leu Trp Pro Leu Gin Arg Leu Gly 1 5 10 15 Arg Pro Lys Arg Lys Gin Glu Leu Gin His Ala Asr. Ser Ser Pro Leu 20 25 30 Leu Arg Gly Ser His Ser Leu Glu Leu Arg Ala Cys Glu Leu Gly Asn 35 40 45 Arg Gly Ser Lys Asn Leu Ser Gin Ser Pro Gly Ala Val Pro Gin Ala 50 55 60 Leu Vai Ala Trp Arg Ala Leu Gly Pro Lys Leu Leu Ser Ser Ser Asn 65 70 75 80 Glu Leu Val Thr Arg His Leu Pro Pro Ala Pro Leu Phe Pro His Glu 85 90 95 Thr Pro Pro Thr Gin Ser Gin Gin Thr Gin Pro Pro val Ala Pro Gin 100 105 110 Ala Pro Ser Ser lie Leu Leu Pro Ala Ala Pro Ile Pro lie Leu Ser 122 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 115 120 125

Pro Cys Ser Pro Pro Ser Pro Gin Ala Ser Ser Leu Ser Gly Pro Ser 130 135 140

Pro Ala Ser Ser Arg Leu Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Leu Gly Glu 145 150 155 160

Asp Gin Asp Ser Vai Leu Thr Pro Glu Glu Vai Ala Leu Cys Leu Glu 165 170 175

Leu Ser Glu Gly Glu Glu Thr Pro Arg Asn Ser Vai Ser Pro Met Pro 180 185 190

Arg Vai Pro Ser Pro Pro Thr Thr Tyr Gly Tyr Ile Ser Vai Pro Thr 195 200 205

Ala Ser Glu Phe Thr Asp Met Gly Arg Thr Gly Gly Gly Vai Gly Pro 210 215 220

Lys Gly Gly Vai Leu Leu Cys Pro Pro Arg Pro Cys Leu Thr Pro Thr 225 230 235 240

Pro Ser Glu Gly Ser Leu Ala Asn Gly Trp Gly Ser Ala Ser Glu Asp 245 250 255

Asn Ala Ala Ser Ala Arg Ala Ser Leu Vai Ser Ser Ser Asp Gly Ser 260 265 270

Phe Leu Ala Asp Ala His Phe Ala Arg Ala Leu Ala Vai Ala Vai Asp 275 280 285

Ser Phe Gly Phe Gly Leu Glu Pro Arg Glu Ala Asp Cys Vai Phe Ile 290 295 300

Asp Ala Ser Ser Pro Pro Ser Pro Arg Asp 305 310

<210> 27 <211> 1046 <212> ADN <213> Homo sapíens <400> 27 tccagctoag acagcctctg cagccgcagg ggactctctt ctccccgctt gtctctggcc 60 cctgcagagg cttggaaggc caaaaagaag caggagctgc agcatgccaa cagttcccca 120 ctgctccggg gcagccactc cttggagctc cgggcctgtg agttaggaaa tagaggttcc 180 123 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ aagaaccttt cccaaagccc aggggctgtg ccccaagctc tggttgcctg gcgggccctg 240 ggaccgaaac tcctcagctc ctcaaatgag ctggttactc gtcatctccc tccagcaccc 300 ctctttcctc atgaaactcc cccaactcag agtcaacaga cccagcctcc ggtggcacca 360 caggctccct cctccatcct gctgccagca gcccccatcc ccatccttag cccctgcagt 420 ccccctagcc cccaggcctc ttccctctct ggccccagcc cagottccag tcgcctgtcc 480 agctcctcac tgtcatccct çggggaggat caagacagcg tgctgacccc tgaggaggta 540 gccctgtgct tggaactcag tgagggtgag gagactccca ggaacagcgt ccctcccatg 600 ccaagggctc cttcaccccc caccacctat gggtacatca gcgtcccaac agcctcagag 660 ttcacggaca tgggcaggac tggaggaggg gtggggccca aggggggagt cttgctgtçc 720 ccacctcggc cctgcctcac ccccaccccc agcgagggct ccttagccaa tggttggggc 780 tcagcctctg aggacaatgc cgccagcgcc agagccagcc ttgtcagctc ctccgatggc 840 tccttcctcg ctgatgctca ctttgcccgg gccctggcag tggctgtgga tagctttggt 900 ttcggtctag agcccaggga ggcagactgc gtcttcatag gtatgtgagg tctccccatc 960 ttactcctca ctcatgcccc ttgcctttct aacaactgtt atcatgtcat cattgttaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1046

<210> 28 <211> 1023 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 28 aggggactct cttctccccg cttgtctctg aaagcaggag ctgcagcatg ccaacagttc gctccgggcc tgtgagttag gaaatagagg tgtgccccaa gctctggttg cctggcgggc tgagctggtt actcgtcatc tccctccagc tcagagtcaa cagacccagc ctccggtggc agcagccccc atccccatcc ttagcccctg ctctggcccc agcccagctt ccagtcgcct ggatcaagac agcgtgctga cccctgagga tgaggagact cccaggaaca gcgtctctcc ctatgggtac atcagcgtcc caacagcctc aggggtgggg cccaaggggg gagtcttgct ccccagcgag ggctccttag ccaatggttg cgccagagcc agccttgtca gctcctccga ccgggccctg gcagtggctg tggatagctt ctgcgtcttc atagatgcct catcacctcc ccaacctctc cctgcccctg tgggaagtgg tca gcccctgcag aggcttggaa ggccaaaaag 60 cccactgctc cggggcagcc actccttaga 120 ttccaagaac ctttcccaaa gcccaggagc 180 cctgggaccg aaactcctca gctcctcaaa 240 acccctcttt cctcatgaaa ctcccccaac 300 accacaggct ccctcctcca tcctgctgcc 360 cagtccccct agcccccagg cctcttccct 420 gtccagctcc tcactgtcat ccctggggga 480 ggtagccctg tgcttggaac tcagtgaggg 540 catgccaagg gttccttcac cccccaccac 600 agagttcacg gacatgggca ggactggagg 660 gtgcccacct cggccctgcc tcacccccac 720 gggctcagcc tctgaggaca atgccgccag 780 tggctccttc ctcgctgatg ctcactttgc 840 tggtttcggt ctagagccca gggaggcaga 900 ctccccacgg gattgagatc ttcctgaccc 960 aggccagact ggttggaaga caatggaagg 1020 1023

<210> 29 <211> 1271 < 212 > ADN <213> Mus musculus <400> 29 gggtctttac agttttatag aattaagttc crtaagctca gagtgggggt agaaatgaga 60 124 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ atagggaatt ggttccctgt cttcctgcgt ccttatcctt tcagtctcct ccaatgattt 120 cactttgaag gattgaatgt gaggctgtat aggggccagt gcatccagaa cgtttctcca 180 taagtttcct tggatggttg tgaatgggga aagggttgag ttggtgttgt aagçgaggag 240 tccaagttaa tattagaggg gtcttccaca ggtccaccaa cagaggccct caccaaaaaa 300 catttctgtc cttcctgaag acctggttgg cttcccttct ttccatgatc cacttaggcg 360 ggagctccgg agccaggctt acttaggcca aaggttctgg ttgtggagag tctgctgtcc 420 _tgaagatact gtcttgttct cagtgggaat ccaaaactcc cgtgatcata ttttggtttg 480 ctttcattta ttttaacaat cccaatgaca gagctctcca gaagcctagt gacagtggac 540 ttctattaca gagaagcata ggccaagacc tccacatgtg agaaagccag gggacagaca 600 ggagagtggt ctgggtgctc ttctggcctt ctcagggaca attcaggagg aatcacacag 660 ccttgggcac agcaccagtt agccaacttc gctgggaaga ggccctagaa tcaggaggcc 720 agggaggcag ccccctcccc agcctctggg tgtggctgat ctcagcatct tccaaccagt 780 ctggcctcca ctcccacaaa ggcagagaga agcttcgggt cagggagaga tcaccccgag 840 gggagggagg tgatgaggca tcagtgaaga cacagtcagc ttccctggga tccagactga 900 ggccaaagct atccacagcc actgccaggg cacgagcaaa gtgagtatca gcgaggaagg 960 agccatcaga agagctaacc aggctggccc tggcgctggg gacattgtcc tcagaagctg 1020 agccccaacc attggccagg gagccctcgc tgggtgtagg ggtggggcag ggccgaggtg 1080 gatacagtaa gttcccaacc tcagacccca cgcccccgcc agctctgccc atgtctgcca 1140 gtcctgagca ggttggtatg ctgatatagc cataggttgt tggcggggaa ggagctcttg 1200 gcataggaga tacactgttc gtgggtgtct cctccccatc actgagctcc agacacaggg 1260 ctacctcctc g 1271

<210> 30 <211> 205 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30_

Glu Glu Vai Ala Leu Cys Leu Glu Leu Ser Asp Gly Glu Glu Thr Pro 15 10 15

Thr Asn Ser Vai Ser Pro Met Pro Arg Ala Pro Ser Pro Pro Thr Thr 20 25 30

Tyr Gly Tyr Ile Ser Ile Pro Thr Cys Ser Gly Leu Ala Asp Met Gly 35 40 45

Arg Ala Gly Gly Gly Vai Gly Ser Glu Vai Gly Asn Leu Leu Tyr Pro 50 55 60

Pro Arg Pro Cys Pro Thr Pro Thr Pro Ser Glu Gly Ser Leu Ala Asn 65 70 75 80

Gly Trp Gly Ser Ala Ser Glu Asp Asn Vai Pro Ser Ala Arg Ala Ser 85 90 95

Leu Vai Ser Ser Ser Asp Gly Ser Phe Leu Ala Asp Thr His Phe Ala 100 105 110 125 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Arg Ala Leu Ala Vai Ala Vai Asp Ser Phe Gly Leu Ser Leu Asp Pro 115 120 125 Arg Glu Ala Asp Cys Vai Phe Thr Asp Ala Ser Ser Pro Pro Ser Pro 130 135 140 Arg Gly Asp Leu Ser Leu Thr Arg Ser Phe Ser Leu Pro Leu Trp Glu 145 150 155 160 Trp Arg Pro Asp Trp Leu Glu Asp Ala Glu Ile Ser His Thr Gin Arg 165 170 175 Leu Gly Arg Gly Leu Pro Pro Trp Pro Pro Asp Ser Arg Ala Ser Ser 180 185 190 Gin Arg Ser Trp Leu Thr Gly Ala Vai Pro Lys Ala Vai 195 200 205 < 210 > 31 <211> 417 <212> PRT < 213 > Homo sapiens < 4 0 0 > 31

Met Asp His Ser Asp Ser Gin Trp Leu Ala Asp Thr Trp Arg Ser Thr 15 10 15

Ser Gly Ser Arg Asp Leu Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Arg Leu 20 25 30

Gly Ala Asp Ala Arg Asp Pro Leu Asp Cys Arg Arg Ser Leu Leu Ser 35 40 45

Trp Asp Ser Arg Ser Pro Gly Vai Pro Leu Leu Pro Asp Thr Ser Thr 50 55 60

Phe Tyr Gly Ser Leu Ile Ala Glu Leu Pro Ser Ser Thr Pro Ala Arg 65 70 75 80

Pro Ser Pro Gin Vai Pro Ala Vai Arg Arg Leu Pro Pro Gin Leu Ala 85 90 95

Gin Leu Ser Ser Pro Cys Ser Ser Ser Asp Ser Leu Cys Ser Arg Arg 100 105 110

Gly Leu Ser Ser Pro Arg Leu Ser Leu Ala Pro Ala Glu Ala Trp Lys 126 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 115 120 125

Ala Lys Lys Lys Gin Glu Leu Gin His Ala Asn Ser Ser Pro Leu Leu 130 135 140

Arg Gly Ser His Ser Leu Glu Leu Arg Ala Cys Glu Leu Gly Asn Arg

145 150 155 ISO

Gly Ser Lys Asn Leu Ser Gin Ser Pro Gly Ala Vai Pro Gin Ala Leu 165 170 175

Vai Ala Trp Arg Ala Leu Gly Pro Lys Leu Leu Ser Ser Ser Asn Glu 180 185 190

Leu Val Thr Arg His Leu Pro Pro Ala Pro Leu Phe Pro His Glu Thr 195 200 205

Pro Pro Thr Gin Ser Gin Gin Thr Gin Pro Pro Val Ala Pro Gin Ala 210 215 220

Pro Ser Ser Ile Leu Leu Pro Ala Ala Pro lie Pro Ile Leu Ser Pro 225 230 235 240

Cys Ser Pro Pro Ser Pro Gin Ala Ser Ser Leu Ser Gly Pro Ser Pro 245 250 255

Ala Ser Ser Arg Leu Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Leu Gly Glu Asp 260 265 270

Gin Asp Ser Val Leu Thr Pro Glu Glu Val Ala Leu Cys Leu Glu Leu 275 280 285

Ser Glu Gly Glu Glu Thr Pro Arg Asn Ser Val Ser Pro Met Pro Arg 290 295 300

Ala Pro Ser Pro Pro Thr Thr Tyr Gly Tyr Ile Ser Val Pro Thr Ala 305 310 315 320

Ser Glu Phe Thr Asp Met Gly Arg Thr Gly Gly Gly Val Gly Pro Lys 325 330 335

Gly Gly Val Leu Leu Cys Pro Pro Arg Pro Cys Leu Thr Pro Thr Pro 340 345 350

Ser Glu Gly Ser Leu Ala Asn Gly Trp Gly Ser Ala Ser Glu Asp Asn 355 360 365

Ala Ala Ser Ala Arg Ala Ser Leu Val Ser Ser Ser Asp Gly Ser Phe 127 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 370 375 380 Leu Ala Asp Ala Mis Phe Ala Arg Ala Leu Ala Vai Ala Vai Asp Ser 385 390 395 400 Phe Gly Phe Gly Leu Glu Pro Arg Glu Ala Asp Cys Vai Phe Ile Gly 405 410 415 Met

<210> 32 <211> 516 < 212 > PRT <213> Mus musculus <400> 32_

Pro Thr Vai Thr Tyr Gin Arg Gly Gly Glu Ala Vai Ser Ser Gly Gly 15 10 15

Arg Pro Gly Leu Leu Asn Ile Ser Glu Pro Ala Thr Gin Pro Trp Leu 20 25 30

Ala Asp Thr Trp Pro Asn Thr Gly Asn Asn His Asn Asp Cys Ser Ile 35 40 45

Asn Cys Cys Thr Ala Gly Asn Gly Asn Ser Asp Ser Asn Leu Thr Thr 50 55 60

Tyr Ser Arg Pro Ala Asp Cys Ile Ala Asn Tyr Asn Asn Gin Leu Asp 65 70 75 80

Asn Lys Gin Thr Asn Leu Met Leu Pro Glu Ser Thr Vai Tyr Gly Asp 85 90 95

Vai Asp Leu Ser Asn Lys Ile Asn Glu Met Lys Thr Phe Asn Ser Pro 100 105 110

Asn Leu Lys Asp Gly Arg Phe Vai Asn Pro Ser Gly Gin Pro Thr Pro 115 120 125

Tyr Ala Thr Thr Gin Leu Ile Gin Ala Asn Leu Ser Asn Asn Met Asn 130 135 140

Asn Gly Ala Gly Asp Ser Ser Glu Lys Hís Trp Lys Pro Pro Gly Gin 145 150 155 160 128 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Gin Lys Pro Glu Vai Ala Pro Ile Gin Tyr Asn Ile Met Glu Gin Asn 165 170 175

Lys Leu Asn Lys Asp Tyr Arg Ala Asn Asp Thr Ile Pro Pro Thr Ile 180 185 190

Pro Tyr Asn Gin Ser Tyr Asp Gin Asn Thr Gly Gly Ser Tyr Asn Ser 195 200 205

Ser Asp Arg Gly Ser Ser Thr Ser Gly Ser Gin Gly His Lys Lys Gly 210 215 220

Ala Arg Thr Pro Lys Ala Pro Lys Gin Gly Gly Met Asn Trp Ala Asp 225 230 235 240

Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala His Pro Pro Pro His Ser Asn Ser Glu 245 250 255

Glu Tyr Asn Met Ser Vai Asp Glu Ser Tyr Asp Gin Glu Met Pro Cys 260 265 270

Pro Vai Pro Pro Ala Pro Met Tyr Leu Gin Gin Asp Glu Leu Gin Glu 275 280 285

Glu Glu Asp Glu Arg Gly Pro Thr Pro Pro Vai Arg Gly Ala Ala Ser 290 295 300

Ser Pro Ala Ala Vai Ser Tyr Ser His Gin Ser Thr Ala Thr Leu Thr 305 310 315 320

Pro Ser Pro Gin Glu Glu Leu Glr. Pro Met Leu Gin Asp Cys Pro Glu 325 330 335

Asp Leu Gly His Met Pro His Pro Pro Asp Arg Arg Arg Gin Pro Vai 340 345 350

Ser Pro Pro Pro Pro Pro Arg Pro Ile Ser Pro Pro His Thr Tyr Gly 355 360 365

Tyr Ile Ser Gly Pro Leu Vai Ser Asp Met Asp Thr Asp Ala Pro Glu 370 375 380

Glu Glu Glu Asp Glu Ala Asp Met Glu Vai Ala Lys Met Gin Thr Arg 385 390 395 400

Arg Leu Leu Leu Arg Gly Leu Glu Gin Thr Pro Ala ser Ser Vai Giy 405 410 415 129 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Asp Leu Glu Ser Ser Vai Thr Gly Ser Met Ile Asn Gly Trp Gly Ser 420 425 430

Ala Ser Glu Glu Asp Asn Ile Ser Ser Gly Arg Ser Ser Vai Ser Ser 435 440 445

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Thr Asp Ala Asp Phe Ala Gin Ala Vai Ala 450 455 460

Ala Ala Ala Glu Tyr Ala Gly Leu Lys Vai Ala Arg Arg Gin Met Gin 465 470 475 480

Asp Ala Ala Gly Arg Arg His Phe His Ala Ser Gin Cys Pro Arg Pro 485 490 495

Thr Ser Pro Vai Ser Thr Asp Ser Asn Met Ser Ala Vai Vai Ile Gin 500 505 510

Lys Ala Arg Pro 515 <210> 33 <211> 297 <212> PRT < 213 > Mus musculus < 4 0 0 > 33

Thr Ala Thr Leu Thr Pro Ser Pro Gin Glu Glu Leu Gin Pro Met Leu 1 5 10 15 Gin Asp Cys Pro Glu Asp Leu Gly His Met Pro His Pro Pro Asp Arg 20 25 30 Arq Arq Gin Pro Vai Ser Pro Pro Pro Pro Pro Arq Pro Ile Ser Pro 35 40 45 Pro His Thr Tyr Gly Tyr Ile Ser Gly Pro Leu Vai Ser Asp Met Asp 50 55 60 Thr Asp Ala Pro Glu Glu Glu Glu Asp Glu Ala Asp Met Glu Vai Ala 65 70 75 80 Lys Met Gin Thr Arg Arg Leu Leu Leu Arg Gly Leu Glu Gin Thr Pro 85 90 95 Ala Ser Ser Vai Gly Asp Leu Glu Ser Ser Vai Thr Gly Ser Met Ile 100 105 110 130 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Asn Gly Trp Gly Ser Ala Ser Glu Glu Asp Asn Ile Ser Ser Gly Arg 115 120 125 Ser Ser Vai Ser Ser Ser Asp Gly Ser Phe Phe Thr Asp Ala Asp Phe 130 135 140 Ala Gin Ala Vai Ala Ala Ala Ala Glu Tyr Ala Gly Leu Lys Vai Ala 14 5 150 155 160 Arg Arg Gin Met Gin Asp Ala Ala Gly Arg Arg His Phe His Ala Ser 165 170 175 Gin Cys Pro Arg Pro Thr Ser Pro Vai Ser Thr Asp Ser Asn Met Ser 180 135 190 Ala Vai Vai Ile Gin Lys Ala Arg Pro Ala Lys Lys Gin Lys His Gin 195 200 205 Pro Gly His Leu Arg Arg Glu Ala Tyr Ala Asp Asp Leu Pro Pro Pro 210 215 220 Pro Vai Pro Pro Pro Ala Ile Lys Ser Pro Thr Vai Gin Ser Lys Ala 225 230 235 240 Gin Leu Glu Vai Arg Pro Vai Met Vai Pro Lys Leu Ala Ser Ile Glu 245 250 255 Ala Arg Thr Asp Arg Ser Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Lys Gly 260 265 270 Arg Glu Ala Leu Asp Gly Arg Gin Vai Thr Asp Leu Arg Thr Asn Pro 275 280 285 Ser Asp Pro Arg Glu Ala Gin Glu Gin 290 295

<210> 34 <211> 135 < 212 > PRT <213> Mus musculus <400> 34

Glu Glu Vai Ala Leu Cys Leu Glu Leu Ser Asp Gly Glu Glu Thr Pro 15 10 15

Thr Asn Ser Vai Ser Pro Met Pro Arg Ala Pro Ser Pro Pro Thr Thr 131 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 20 25 30 Tyr Gly Tyr Ile Ser lie Pro Thr Cys Ser Gly Leu Ala Asp Met Gly 35 40 45 Arg Ala Gly Gly Gly Vai Gly Ser Glu Val Gly Asn Leu Leu Tyr Pro 50 55 60 ?ro Arg Pro Cys Pro Thr Pro Thr Pro Ser Glu Gly Ser Leu Ala Asn 65 70 75 80 Gly Trp Gly Ser Ala Ser Glu Asp Asn Val Pro Ser Ala Arg Ala Ser 85 90 95 Leu Vai Ser Ser Ser Asp Gly Ser Phe Leu Ala Asp Thr His Phe Ala 100 105 110 Arg Ala Leu Ala Vai Ala Val Asp Ser Phe Gly Leu Ser Leu Asp Pro 115 120 125 Arg Glu Ala Asp Cys Val Phe 130 135

<210> 35 <211> 135 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <4Ο Ο> 35

Glu Glu Val Ala Leu Cys Leu Glu Leu Ser Glu Gly Glu Glu Thr Pro 1 5 10 15 Arg Asn Ser Val Ser Pro Met Pro Arg Ala Pro Ser Pro Pro Thr Thr 20 25 30 Tyr Gly Tyr Ile Ser Val Pro Thr Ala Ser Glu Phe Thr Asp Met Gly 35 40 45 Arg Thr Gly Gly Gly Val Gly Pro Lys Gly Gly Val Leu Leu Cys Pro 50 55 60 Pro Arg Pro Cys Leu Thr Pro Thr Pro Ser Glu Gly Ser Leu Ala Asn 65 70 75 80 Gly Trp Gly Ser Ala Ser Glu Asp Asn Ala Ala Ser Ala Arg Ala Ser 85 90 95 132 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Leu Vai Ser Ser Ser Asp Gly Ser Phe Leu Ala Asp Ala His Phe Ala 100 105 110 Arg Ala Leu Ala Vai Ala Vai Asp Ser Phe Gly Phe Gly Leu Glu Pre 115 120 125 Arg Glu Ala Asp Cys Vai Phe 130 135

<210> 36 <211> 3715 < 212 > ADN <213> Homo sapiens <4Ο Ο> 36 gcggccgcga attcggcacg agcagcagga caaagtgctc gggacaagga catagggctg 60 agagtagcca tgggctctgg aggagacagc ctcctggggg gcaggggttc cctgcctctg 120 ctgctcctgc rcatcatggg aggcatggct caggactccc cgccccagat cctagtccac 180 ccccaggacc agctgttcca gggccctggc cctgccagga tgagctgcca agcctcaggc 240 cagccacctc ccaccatccg ctggttgctg aatgggcagc ccctgagcat ggtgccccca 300 gacccacacc acctcctgcc tgatgggacc cttctgctgc tacagccccc tgcccgggga 360 catgcccacg atggccaggc cctgtccaca gacctgggtg tctacacatg tgaggccagc 420 aaccggcttç gcacggcagt cagcagaggc gctcggctgt ctgtggctgt cctccgggag 480 gatttccaga tccagcctcg ggacatggtg gctgtggtgg gtgagcagtt tactctggaa 540 tgtgggccgc cctggggcca cccagagccc acagtctcat ggtggaaaga tgggaaaccc 600 ctggccctcc agcccggaag gcacacagtg tccçgggggt ccctgctgat ggcaagagca 660 gagaaçagtg acgaagggac ctacatgtgt gtggccacca acagcgcagg acatagggag 720 agccgcgcag cccgggtttc catccaggag ccccaggact acacggagcc tgtggagctt 780 ctggctgtgc gaattcagct ggaaaatgtg acactgctga acccggatcc tgcagagggc 840 cccaagccta gaccggcggt gtggctcagc tggaaggtca gtggccctgc tgcgcctgcc 900 caatcttaca cggccttgtt caggacccag actgccccgg gaggccaggg agctccgtgg 960 gcagaggagc tgctggccgg ctggcagagc geagagettg gaggcctcca ctggggccaa 1020 gactacgaçt tcaaagtgag accatcctct ggccgggctc gaggccctga cagcaacgtg 1080 ctgctcctga ggctgccgga aaaagtgccc agtgccccac ctcaggaagt gactctaaag 1140 cctggcaatg gcactgtctt tgtgagctgg gtcccaccac ctgctgaaaa ccacaatggc 1200 atcatccgtg gctaccaggt ctggagcctg ggcaacacat cactgccacc agccaactgg 1260 actgtagttg gtgagcagac ccagctggaa atcgccaccc atatgccagg ctcctactgc 1320 gtgcaagtgg ctgcagtcac tggtgctgga gctggggagc ccagtagacc tgtctgcctc 1380 cttttagagc aggccatgga gcgagccacc caagaaccca gtgagcatgg tccctggacc 1440 ctggagcagc tgagggctac cttgaagcgg cctgaggtca ttgccacctg cggtgttgca 1500 ctctggctgc tgcttctggg caccgccgtg tgtatccacc gccggcgccg agctagggtg 1560 cacctgggcc caggtctgta cagatatacc agtgaggatg ccatcctaaa acacaggatg 1620 gatcacagtg actcccagtg gttggcagac acttggcgtt ccacctctgg ctctcgggac 1680 ctgagcagca gcagcagcct cagcagtcgg ctgggggcgg atgcccggga cccactagac 1740 tgtcgtcgct ccttgctctc ctgggactcc cgaagccccg gcgtgcccct gcttccagac 1800 accagcactt tttatggctc cctcatcgct gagctgccct ccagtacccc agccaggcca 1860 agtccccagg tcccagctgt caggcgcctc ccaccccagc tggcccagct ctccagcccc 1920 133 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ tgttccagct cagacagcct ctgcagccgc aggggactct cttctccccg cttgtctctg 1980 gcccctgcag aggcttggaa ggccaaaaag aagcaggagc rgcagcatgc caacagttcc 2040 ccactgctcc ggggcagcca ctccttggag ctccgggcct gtgagttagg aaatagaggt 2100 tccaagaacc tttcccaaag cccaggagct gtgccccaag ctctggttgc ctggcgggcc 2160 ctgggaccga aactcctcag ctcctcaaat gagctggtta ctcgtcatct ccctccagca 2220 cccctctttc ctcatgaaac tcccccaact cagagtcaac agacccagcc tccggtggca 2280 ccacaggctc cctcctccat cctgctgcca gcagccccca tccccatcct tagcccctgc 2340 agtcccccta gcccccaggc ctcttcçctc tctggcccca gcccagcttc cagtcgcctg 2400 tccagctcct cactgtcatc cctgggggag gatcaagaca gcgtgctgac ccctgaggag 2460 gtagccctgt gcttggaact cagtgagggt gaggagactc ccaggaacag cgtctctccc 2520 atgccaaggg ctccttcacc ccccaccacc tatgggtaca tcagcgtccc aacagcctca 2580 gagttcacgg acatgggcag gactggagga ggggtggggc ccaagggggg agtcttgctg 2640 tgcccacctc ggccctgcct cacccccacc cccagcgagg gctccttagc caatggttgg 2700 ggctcagcct ctgaggacaa tgccgccagc gccagagcca gccttgtcag ctcctccgat 2760 ggctccttcc tcgctgatgc tcactttgcc cgggccctgg cagtggctgt ggatagcttt 2820 ggtttcggtc tagagcccag ggaggcagac tgcgtcttca tagatgcctc atcacctccc 2880 tccccacggg atgagatctt cctgaccccc aacctctccc tgcccctgtg ggagtggagg 2940 ccagactggt tggaagacat ggaggtcagc cacacccagc ggctgggaag ggggatgcct 3000 ccctggcccc ctgaactctc agatctcttc ccagagaagt cagctccact gtcgtatgcc 3060 caaggctggt gcttctcctg tagattactc ctgaaccgtg tccctgagac ttcccagacg 3120 ggaatcagaa ccacttctcc tgttccaccc acaagacctg ggctgtggtg tgtgggtctt 3180 ggcctgtgtt tctctgcagc tggggtccac cttcccaagc ctccagagag ttctccctcc 3240 acgattgtga aaacaaatga aaacaaaatt agagcaaagc tgacctggag ccctcaggga 3300 gcaaaacatc atctccacct gactcctagc cactgctttc tcctctgtgc catccactcc 3360 caccaccagg ttgttttggc ctgaggagca gccctgcctg ctgctcttcc cccaccattt 3420 ggatcacagg aagtggagga gccagaggtg cctttgtgga ggacagcagt ggctgctggg 3480 agagggctgt ggaggaagga gcttctcgga gccccctctc agccttacct gggcccctcc 3540 tctagagaag agctcaactc tctcccaacc tcaccatgga aagaaaataa ttatgaatgc 3600 cactgaggca ctgaggccct'acctcatgcc aaacaaaggg ttcaaggctg ggtctagcga 3660 ggatgctgaa ggaagggagg tatgagaccc gtaggtcaaa agcaccatcc tcgta 3715

<210> 37 <211> 1104 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37

Met Gly Ser Gly Gly Asp Ser Leu Leu Gly Gly Arg Gly Ser Leu Pro 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Ile Met Gly Gly Met Ala Gin Asp Ser Pro Pro 20 25 30 Gin Ile Leu Vai His Pro Gin Asp Gin Leu Phe Gin Gly Pro Gly Pro 35 40 45 Ala Arg Met Ser Cys Gin Ala Ser Gly Gin Pro Pro Pro Thr Ile Arg 50 55 60 134 134 Ser Met Vai Pro Pro Asp Pro His 75 80 Leu Leu Leu Gin Pro Pro Ala Arg 90 95 Leu Ser Thr Asp Leu Gly Vai Tyr 105 110 Gly Thr Ala Vai Ser Arg Gly Ala 125 Glu Asp Phe Gin Ile Gin Pro Arg 140 Gin Phe Thr Leu Glu Cys Gly Pro 155 160 Vai Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys 170 175 His Thr Vai Ser Gly Gly Ser Leu 185 190 Asp Glu Gly Thr Tyr Met Cys Vai 205 Glu Ser Arg Ala Ala Arg Vai Ser 220 Glu Pro Vai Glu Leu Leu Ala Vai 235 240 Leu Leu Asn Pro Asp Pro Ala Glu 250 255 Trp Leu Ser Trp Lys Vai Ser Gly 265 270 Thr Ala Leu Phe Arg Thr Gin Thr 285 Trp Ala Glu Glu Leu Leu Ala Gly 300 Leu His Trp Gly Gin Asp Tyr Glu 315 320 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Trp Leu Leu Asn Gly Gin Pro Leu 65 70

His Leu Leu Pro Asp Gly Thr Leu 85

Gly His Ala His Asp Gly Gin Ala 100

Thr Cys Glu Ala Ser Asn Arg Leu 115 120

Arg Leu Ser Vai Ala Vai Leu Arg 130 135

Asp Met Vai Ala Vai Vai Gly Glu 145 150

Pro Trp Gly His Pro Glu Pro Thr 165

Pro Leu Ala Leu Gin Pro Gly Arg 180

Leu Met Ala Arg Ala Glu Lys Ser 195 200

Ala Thr Asn Ser Ala Gly His Arg 210 215

Ile Gin Glu Pro Gin Asp Tyr Thr 225 230

Arg Ile Gin Leu Glu Asn Vai Thr 245

Gly Pro Lys Prc Arg Pro Ala Vai 260

Pro Ala Ala Pro Ala Gin Ser Tyr 275 280

Ala Pro Gly Gly Gin Gly Ala Pro 290 295

Trp Gin Ser Ala Glu Leu Gly Gly 305 310 135 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Phe T.,ys Vai Arg Pro Ser Ser Gly 325 Vai Leu Leu Leu Arg Leu Pro Glu 340 Glu Vai Thr Leu Lys Pro Gly Asn 355 360 Pro Pro Pro Ala Glu Asn His Asn 370 375 Trp Ser Leu Gly Asn Thr Ser Leu 385 390 Gly Glu Gin Thr Gin Leu Glu Ile 405 Cys Vai Gin Vai Ala Ala Vai Thr 420 Arg Pro Vai Cys Leu Leu Leu Glu 435 440 Glu Pro Ser Glu His Gly Pro Trp 450 455 Leu Lys Arg Pro Glu Vai Ile Ala 465 470 Leu Leu Leu Gly Thr Ala Vai Cys 485 Vai His Leu Gly Pro Gly Leu Tyr 500 Leu Lys His Arg Mer Asp His Ser 515 520 Trp Arg Ser Thr Ser Gly Ser Arg 530 535 Ser Ser Arg Leu Gly Ala Asp Ala 545 550 Ser Leu Leu Ser Trp Asp Ser Arg 565 575

Arg Ala Arg Gly Pro Asp Ser Asn 330 333

Lys Vai Pro Ser Ala Pro Pro Gin 345 350

Gly Thr Vai Phe Vai Scr Trp Vai 365

Gly Ile Ile Arg Gly Tyr Gin Vai 380

Pro Pro Ala Asn Trp Thr Vai Vai 395 400

Ala Thr His Met Pro Gly Ser Tyr 410 415

Gly Ala Gly Ala Gly Glu Pro Ser 425 430

Gin Ala Met Glu Arg Ala Thr Gin 445

Thr Leu Glu Gin Leu Arg Ala Thr 460

Thr Cys Gly Vai Ala Leu Trp Leu 475 480

Ile His Arg Arg Arg Arg Ala Arg 490 495

Arg Tyr Thr Ser Glu Asp Ala lie 505 510

Asp Ser Gin Trp Leu Ala Asp Thr 525

Asp Leu Ser Ser Ser Ser Ser Leu 540

Arg Asp Pro Leu Asp Cys Arg Arg 555 560

Ser Prc Gly Vai Pro Leu Leu Pro 570 136 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Asp Thr Ser Thr Phe Tyr Gly Ser Leu Ile Ala Glu Leu Pro Ser Ser 580 585 5S0

Thr Pro Ala Arg Pro Ser Pro Gin Vai Pro Ala Vai Arg Arg Leu Pro 595 600 605

Pro Gin Leu Ala Gin Leu Ser Ser Pro Cys Ser Ser Ser Asp Ser Leu 610 615 620

Cys Ser Arg Arg Gly Leu Ser Ser Pro Arg Leu Ser Leu Ala Pro Ala 625 630 635 64 0

Glu Ala Trp Lys Ala Lys Lys Lys Gin Glu Leu Gin His Ala Asn Ser 645 650 655

Ser Pro Leu Leu Arg Gly Ser His Ser Leu Glu Leu Arg Ala Cys Glu 660 665 670

Leu Gly Asn Arg Gly Ser Lys Asn Leu Ser Gin Ser Pro Gly Ala Vai 675 680 685

Pro Gin Ala Leu Vai Ala Trp Arg Ala Leu Gly Pro Lys Leu Leu Ser 690 695 700

Ser Ser Asn Glu Leu Vai Thr Arg His Leu Pro Pro Ala Pro Leu Phe 705 710 715 720

Pro His Glu Thr Pro Pro Thr Gin Ser Gin Gin Thr Gin Pro Pro Vai 725 730 735

Ala Pro Gin Ala Pro Ser Ser Ile Leu Leu Pro Ala Ala Pro Ile Pro 740 745 750

Ile Leu Ser Pro Cys Ser Pro Pro Ser Pro Gin Ala Ser Ser Leu Ser 755 760 765

Gly Pro Ser Pro Ala Ser Ser Arg Leu Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser 770 775 780

Leu Gly Glu Asp Gin Asp Ser Vai Leu Thr Pro Glu Glu Vai Ala Leu 785 790 795 800

Cys Leu Glu Leu Ser Glu Gly Glu Glu Thr Pro Arg Asn Ser Vai Ser 805 810 815

Pro Met Pro Arg Ala Pro Ser Pro Pro Thr Thr Tyr Gly Tyr Ile Ser 820 825 830 137 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Vai Pro Thr Ala Ser Glu Phe Thr Asp Met Gly Arg Thr Gly Gly Gly B35 840 845

Vai Gly Pro Lys Gly Gly Vai Leu Leu Cys Pro Pro Arg Pro Cys Leu 850 855 860

Thr Pro Thr Pro Ser Glu Gly Ser Leu Ala Asn Gly Trp Gly Ser Ala 865 870 875 880

Ser C-lu Asp Asn Ala Ala Ser Ala Arg Ala Ser Leu Vai Ser Ser Ser 885 890 895

Asp Gly Ser Phe Leu Ala Asp Ala Hís Phe Ala Arg Ala Leu Ala Vai 900 905 910

Ala Vai Asp Ser Phe Gly Phe Gly Leu Glu Pro Arg Glu Ala Asp Cys 915 920 925

Vai Phe Ile Asp Ala Ser Ser Pro Pro Ser Pro Arg Asp Glu Ile Phe 930 935 940

Leu Thr Pro Asn Leu Ser Leu Pro Leu Trp Glu Trp Arg Pro Asp Trp 945 950 955 960

Leu Glu Asp Met Glu Vai Ser His Thr Gin Arg Leu Gly Arg Gly Met 965 970 975

Pro Pro' Trp Pro Pro Glu Leu Ser Asp Leu Phe Pro Glu Lys Ser Ala 980 985 990

Pro Leu Ser Tyr Ala Gin Gly Trp Cys Phe Ser Cys Arg Leu Leu Leu 995 1000 1005

Asn Arg Vai Pro Glu Thr Ser Gin Thr Gly Ile Arg Thr Thr Ser Pro 1010 1015 1020

Vai Pro Pro Thr Arg Pro Gly Leu Trp Cys Vai Gly Leu Gly Leu Cys 1025 1030 1035 1040

Phe Ser Ala Ala Gly Vai His Leu Pro Lys Pro Pro Glu Ser Ser Pro 1045 1050 1055

Ser Thr Ile Vai Lys Thr Asn Glu Asn Lys Ile Arg Ala Lys Leu Thr 1060 1065 1070

Trp Ser Pro Gin Gly Ala Lys Ilis His Leu His Leu Thr Pro Ser His 1075 1080 1085

Cys Phe Leu Leu Cys Ala Ile His Ser His His Gin Vai Vai Leu Ala 1090 1095 1100

<210> 38 <211> 3688 <212> ADN <213> Mus musculus 138 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ < 4 Ο Ο > 38 agtgtatggg acaaggagag gagccgagag cagccatggg ctctggagga acgggcctcc 60 tggggacgga gtggcctctg cctctgctgc tgcttttcat catgggaggt gaggctctgg 120 attctccacc ccagatccta gttcaccccc aggaccagct acttcagggc tctggcccag 180 ccaagatgag gtgcagatca tccggccaac cacctcccac tatccgctgg ctgctgaatg 240 ggcagcccct cagcatggcc accccagacc tacattacct tttgccggar gggaccctcc 300 tgttacatcg gccctctgtc cagggacggc cacaagatga ccagaacatc ctctcagcaa 360 tcctgggtgt ctacacatgt gaggccagca accggctggg cacagcagtg agccggggtg 420 ctaggctgtc tgtggctgtc ctccaggagg acttccagat ccaacctcgg gacacagtgg 480 ccgtggtggg agagagcttg gttcttgagt gtggtcctcc ctggggotac ocaaaaccct 540 cggtctcatg gtggaaagac gggaaacccc tggtcctcca gccagggagg cgcacagtat 600 ctggggattc cctçatggtg tcaagagcag agaagaatga ctcggggacc tatatgtgta 660 tggccaccaa caatgctggg caacgggaga gccgagcagc cagggtgtct atccaggaat 720 cccaçgacca caaggaacat ctagagcttc tggctgttcg cattcagctg gaaaatgtga 780 ccctgctaaa ccccgaacct gtaaaaggtc ccaagcctgg gccatccgtg tggcteaget 840 ggaaggtgag cggccctgct gcacctgctg agtcatacac agctctgttc aggactcaga 900 ggtcccccag ggaccaagga tctccatgga cagaggtgct gctgcgtggc ttgcagagtg 960 caaagcttgg gggtctccac tggggccaag actatgaatt caaagtgaga ccgtcctccg 1020 gccgggctcg aggccctgac agcaatgtgt tgctcctgag gctgcctgaa caggtgccca 1080 gtgccccacc tcaaggagtg accttaagat ctggcaacgg tagtgtcttt gtgagttggg 1140 ctccaccacc tgctgaaagc cataatggtg tcatccgtgg ttaccaggtc tggagcctgg 1200 gcaatgcctc attgcctgct gccaactgga ccgtagtggg tgaacagacc cagctggaga 1260 tcgccacacg actgccaggc tcctattgtg tgcaagtggc tgcagtcact ggagctggtg 1320 ctggagaact cagtacccct gtctgcctcc ttttagagca ggccatggag caatcagcac 1380 gagaccccag gaaacatgtt ccctggaccc tggaacagct gagggccacc ttgagacgac 1440 cagaagtcat tgccagtagt gctgtcctac tctggttgct gctactaçgc attactgtgt 1500 gtatctacag acgacgcaaa gctggggtgc acctgggccc aggtctgtac agatacacca 1560 gcgaggacgc cattctaaaa cacaggatgg accacagtga ctccccatgg ctggcagaca 1620 cctggcgttc cacctctggc tctcgagacc tgagcagcag cagcagcctt agtagtcggc 1680 tgggattgga ccctcgggac ccactagagg gcaggcgctc cttgatctcc tgggaccctc 1740 ggagccccgg tgtacccctg cttccagaca cgagcacgtt ttacggctcc ctcattgcag 1800 agcagccttc cagccctcca gtccggccaa gccccaagac accagctgct aggcgctttc 1860 catccaagtt ggctggaacc tccagcccct gggctagctc agatagtctc tgcagccgca 1920 ggggactctg ttccccacgc atgtctctga cccctacaga ggcttggaag gccaaaaaga 1980 agcaggaatt gcaccaagci: aacagctccc cactgctccg gggcagccac cccatggaaa 2040 139 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ tctgggcctg ggagttggga agcagagcct ccaagaacct ttctcaaagc ccaggagaag 2100 cgccccgagc cgtggtatcc tggcgtgctg tgggaccaca acttcaccgc aactccagtg 2160 agctggcatc tcgtccactc cctccaacac ccctttctct tcgtggagct tccagtcatg 2220 acccacagag ccagtgtgtg gagaagctcc aagctccctc ctctgaccca ctgccagcag 2280 cccctctctc cgtcctcaac tcttccagac cttccagccc ccaggcctct ttcctctcct 2340 gtcctagccc atcctccagc aacctgtcca gctcctcgct gtcatcctta gaggaggagg 2400 aggatcagga cagcgtgctc acccccgagg aggtagccct gtgtctggag ctcagtgatg 24 60 gggaggagac acccacgaac agtgtatctc ctatgccaag agctccttcc ccgccaacaa 2520 cctatggcta tatcagcata ccaacctgct caggactggc agacatgggc agagctggcg 2580 ggggcgtggg gtctgaggtt gggaacttac tgtatccacc tcggccctgc cccaccccta 2640 cacccagcga gggctccctg gccaatggtt ggggctcagc tcctgaggac aatgtcccca 2700 gcgccagggc cagcctggtt agctcttctg atggctcctt cctcgctgat actcactttg 2760 ctcgtgccct ggcagtggct gtggatagct ttggcctcag tctggatccc agggaagctg 2820 actgtgtctt cactgatgcc tcatcacctc cctcccctcg gggtgatctc tccctgaccc 2880 gaagcttctc tctgcctttg tgggagtgga ggccagactg gttggaagat gctgagatca 2940 gccacaccca gaggctgggg agggggetgc ctccctggcc tcctgattct agggcctctt 3000 cccagcgaag ttggctaact ggtgctgtgc ccaaggctgg tgattcctcc tgaattgtcc 3060 ctgagaaggc cagaagagca cccagaccac tctcctgtct gtcccctggc tttctcacat 3120 gtggaggtct tggcctatgc ttctctgtaa tagaagtcca ccgtcactag gcttctggag 3180 agctctgtca ttgggattgt taaaataaat gaaagcaaac caaaatatga tcacgggagt 3240 cttggattcc cactgagaac aagacagcat cttcaggaca gcagactctc cacaaccaga 3300 acctttggcc taagtaagcc tggctccgga gctcccacct aagtggatca tggaaagaag 13360 ggaagccaac caggtcttca ggaaggacag aaatgttttt tggtgagggc tatggtggag 3420 gacctgtgga agagccctct catatctact tggactcctc ccttagaggc cagctcaacc 3480 ctttccccag tcacaccatg caaggaaact aaaggagaaa ggtcgtggat gcagtgggcc 3540 ctatacagcg tcacagtcaa tgcttcaaag tgagatcaat ggaggagact gaaggaaagg 3600 acgcagggaa acagggaacc aatgcgctat tctcattcta ccgccactct gagcttaagg 3660 aacttaattc tataaaactg taaagacg 3688 <210> 39 <211> 3688

< 212 > ADN <213> Mus musculus < 4 Ο Ο > 39 tcacataccc tgttcctctc ctcggctctc gtcggtaccc gagacctcct tgcccggagg 60 acccctgcct caccggagac ggagacgacg acgaaaagta gtaccctcca ctccgagacc 120 taagaggtgg ggtctaggat caagtggggg tcctggtcga tgaagtcccg agaccgggtc 180 ggttctactc cacgtctagt aggccggttg gtggagggtg ataggcgacc gacgacttac 240 ccgtcgggga gtcgtaccgg tggggtctgg atgtaatgga aaacggccta ccctgggagg 300 acaatgtagc cggçagacag gtccctgccg gtgttctact ggtcttgtag gagagtcgtt 360 aqgacccaca gatgtgtaca ctccqgtcqt tqgccqaccc qtqtcqtcac tcqqccccac 420 gatccgacag acaccgacag gaggtcctcc tgaaggtcta ggttggagcc ctgtgtcacc 480 ggcaccaccc tctctcgaac caagaactca caccaggagg gaccccgatg ggttttggga 540 gccagagtac cacctttctg ccctttgggg accaggaggt cggtccctcc gcgtgtcata 600 gacccctaag ggactaccac agttctcgtc tcttcttact gagcccctgg atatacacat 660 accggtggtt gttacgaccc gttgccctct cggctcgtcg gtcccacaga taggtcctta 720 gggtcctggt gttccttgta gatctcgaag accgacaagc gtaagtcgac cttttacact 780 140 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ gggacgattt ggggcttgga cattttccag ccttccactc gccggqacga cgtggacgac ccagggggtc cc-ggttcct agaggtacct gtttcgaacc cccagaggtg accccggtic cggcccgagc tccgggactg tcgttacaca cacggggtgg agttcctcac tggaattcta gaggtggtgg acgactttcg gtattaccac cgttacggag taaoggacga cggttgacct agoggtgtgc tgacggtccg aggataacac gacctcttga gtcatgggga cagacggagg ctctggggtc cttrgtacaa gggacctggg gtcttcaçta acggtcatca cgacaggatg catagatçtc tgctgcgttt cgaccccacg cgctcctgog gtaagatttt gtgtcctacc ggaccgcaag gtggagaccg agagctctgg accctaacct gggagccctg ggtgatctcc cctcggggcc acatggggac gaaggtctgt tcgtcggaag gtcgggaggt caggccggtt gtaggttcaa ccgaccttgg aggtcgggga cccctgagac aaggggtgcg tacagagact tcgtccttaa cgtggttcga ttgtcgaggg agacccggac cctcaaccct tcgtctcgga gcçgggctcg gcacoataçg accgcacgac tcgaccgtag agcaggtgag ggaggttgtg tgggtgtete ggtcacacac ctíttcgagg ggggagagag gcaggagttg agaaggtctg caggatcggg taggaggtcg ttggacaggt tcctagtcct gtcgcacgag tçggggctcc ccctcctctg tgggcgcttg t-cacatagag ggataccgat atagtcgtat ggttggacga ccccgcaccc cagactccaa cccttgaatg gtgggtcgct cccgagggac cggttaccaa cgcggtcccg gtcggaccaa tcgagaagac gagcacggga ccgtcaccga cacctatcga tgacacagaa gtgactacgg agtaçtggag cttcgaagag agacggaaac accctcacct oggtgtgggt ctccgacccc tcccccgacg gggtcgcttc aaccgattga ccacgacacg gactcttccg gt-.cttctcgt gggtctggtg cacctccaga accggatacg aagagacatt tcgagacagt aaccctaaca at~ttattta gaacotaagg gtgactcttg ttctgtcgta tggaaaccgg attcattcgg accgaggcct ccttcggttg gtccagaagt ccttcctgtc ctggacacct tctcgggaga gtatagatga gaaagggotc agtgtggtac gttcctttga gatatgtcgc agtgtcagtt acgaagtttc tgcgtccctt tgtcccttgg ttacgcgata ttgaattaag atattttgac atttctgc

<210> 40 <211> 1015 <212> PRT <213> Mus musculus ggttcggacc cggtaggcac accgagtcga 840 tcagtatgtg tcgagacaag tcctgagtct 900 gtctccacga cgacgcaccg aaogtctcac 960 tgatacttaa gtttcactct ggcaggaggo 1020 acgaggactc cgacgaactt gtccacgggt 1080 gaccgttgcc atcacagaaa cactcaaccc 1140 agtaggcacc aatggtccag acctcggacc 1200 ggcatcaccc acttgtctgg gtcgacctct 1260 acgttcaccg acgtcagtga cctcgaccac 1320 aaaatctcgt ccggtacctc gttagtcgtg 1380 accttgtcga ctcccggtgg aactctgctg 1440 agaccaacga cgatgatccg taatgacaca 1500 tggacccggg tccagacatg tctatgtggt 1560 tggtgtcaot gaggggtacc gaccgtctgt 1620 actcgtcçtc gtcgrcgçaa tcatcagccg 1630 cgtccgcgag gaacaagagg accctgggag 1740 gctcgtgcaa aatgccgagg gagtaacgtc 1800 cggggttctg tggtcgacça tccgcgaaag 1860 cccgatcgag tctatcagag acgtcggcgt 1920 ggggatgtct ccgaaccttc cggtttttct 1980 gtgacgaggc cccgtcggtg gggtaccttt 2040 ggttcttgga aagagtttcg ggtcctcttc 2100 acgctggtgt tgaagtggcg ttgaggtcac 2160 gggaaagaga agcacctcga aggtcagtac 2220 ttcgagggag gagactggg·: gacggtcgtc 2280 gaaggtcggg gçtccggaga aaggagagga 2340 cgaggagcga cagtaggaat ctcctcctcc 2400 tccatcggga oacagacctc gagtcactac 2460 gatacggttc tcgaggaagg ggcggttgtt 2520 gtcctgaccg tctgtacccg tctcgaccgc 2580 auataggtgg agccgggacg gggtggggat 2640 ccccgagtcg aagactcctg ttacaggggt 2700 taccgaggaa ggagcgacta tgagtgaaac 2760 aaccggagtc agacctaggg tcccttcgac 2820 ggaggggagc cccactagag agggactggg 2880 ccçgtctgac caaccttcta cgactctagt 2940 gagggaccgg agçactaaga tcccggagaa 3000 ggatccgacc actaaggagg acttaacagg 3060 agaggacaga caggggaccg aaagagtgta 3120 atcttcaggt ggcagtgatc cgaagacctc 3180 ctttcgtttg gttttatact agtgccctca 3240 gaagtcctgt cgicígagag gtgttggtct 3300 cgagggtgga ttcacctagt acctttcttc 3360 tttacaaaaa accactcccg ataccacctc 3420 acctgaggag ggaatctccg gtcgagttgg 3480 tttcctcttt ccagcaccta cgtcacccgg 3540 actctagtta cctcctctga cttcctttcc 3600 agaçtaagat ggcggtgaga ctcgaattcc 3660 3688 141 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ <400> 40

Met Gly Gin Gly Glu Glu Pro Arg Ala Ala Met Gly Ser Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Leu Leu Gly Thr Glu Trp Pro Leu Pro Leu Leu Leu Leu Phe Ile 20 25 30 Met Gly Gly Glu Ala Leu Asp Ser Pro Pro Gin Ile Leu Vai His Pro 35 40 45 Gin Asp Gin Leu Leu Gin Gly Ser Gly Pro Ala Lys Met Arg Cys Arg 50 55 60 Ser Ser Gly Gin Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp Leu Leu Asn Gly Gin 65 70 75 80 Pro Leu Ser Met Ala Thr Pro Asp Leu His Tyr Leu Leu Pro Asp Gly 85 90 95 Thr Leu Leu Leu His Arg Pro Ser Vai Gin Gly Arg Pro Gin Asp Asp 100 105 110 Gin Asn Ile Leu Ser Ala Ile Leu Gly Vai Tyr Thr Cys Glu Ala Ser 115 120 125 Asrr Arg Leu Gly Thr Ala Vai Ser Arg Gly Ala Arg Leu Ser Vai "Alã 130 135 140 vai Leu Gin Glu Asp Phe Gin Ile Gin Pro Arg Asp Thr Vai Ala Vai 145 150 155 160 Vai Gly Glu Ser Leu Vai Leu Glu Cys Gly Pro Pro Trp Gly Tyr Pro 165 170 175 Lys Pro Ser Vai Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys Pro Leu Vai Leu C-ln 180 185 190 Pro Gly Arg Arg Thr Vai Ser Gly Asp Ser Leu Met Vai Ser Arg Ala 195 200 205 Glu Lys Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Met Cys Met Ala Thr Asn Asn Ala 142 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 210 215 220

Gly Gin Arg Glu Ser Arg Ala Ala Arg Vai Ser Ile Gin C-lu Ser Gin 225 230 235 240

Asp His Lys Glu His Leu Glu Leu Leu Ala Vai Arg Ile Gin Leu Glu 245 250 255

Asn Vai Thr Leu Leu Asn Pro Glu Pro Vai Lys Gly Pro Lys Fro Gly 260 265 270

Pro Ser Vai Trp Leu Ser Trp Lys Vai Ser Gly Pro Ala Ala Pro Ala 275 280 285

Glu Ser Tyr Thr Ala Leu Phe Arg Thr Gin Arg Ser Pro Arg Asp Gin 290 295 300

Gly Ser Pro Trp Thr Glu Vai Leu Leu Arg Gly Leu Gin Ser Ala Lys 305 310 315 320

Leu Gly Gly Leu His Trp Gly Gin Asp Tyr Glu Phe Lys Vai Arg Pro 325 330 335

Ser Ser Gly Arg Ala Arg Gly Pro Asp Ser Asn Vai Leu Leu Leu A.rg 340 345 350

Leu Pro Glu Gin Vai Pro Ser Ala Pro Pro Gin Gly Vai Thr Leu Arg 355 360 365

Ser Gly Asn Gly Ser Vai Phe Vai Ser Trp Ala Pro Pro Pro Ala Glu 370 375 380

Ser His Asn Gly Vai Ile Arg Gly Tyr Gin Vai Trp Ser Leu Gly Asn 385 390 395 400

Ala Ser Leu Pro Ala Ala Asn Trp Thr Vai Vai Gly Glu Gin Thr Gin 405 410 415

Leu Glu Ile Ala Thr Arg Leu Pro Gly Ser Tyr Cys Vai Gin Vai Ala 420 425 430

Ala Vai Thr Gly Ala Gly Ala Gly Glu Leu Ser Thr Pro Vai Cys Leu 435 440 445

Leu Leu Glu Gin Ala Met Glu Gin Ser Ala Arg Asp Pro Arg Lys His 450 455 460

Vai Pro Trp Thr Leu Glu Gin Leu Arg Ala Thr Leu Arg Arg Pro Glu 143 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 465 470 475 480

Vai Ile Ala Ser Ser Ala Vai Leu Leu Trp Leu Leu Leu Leu Gly Ile 485 490 495

Thr Vai Cys Ile Tyr Arg Arg Arg Lys Ala Gly Vai His Leu Gly Pro 500 505 510

Gly Leu Tyr Arg Tyr Thr Ser Glu Asp Ala Ile Leu Lys His Arg Met 515 520 525

Asp His Ser Asp Ser Pro Trp Leu Ala Asp Thr Trp Arg Ser Thr Ser 530 535 540

Gly Ser Arg Asp Leu Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Arg Leu Gly 545 550 555 560

Leu Asp Pro Arg Asp Pro Leu Glu Gly Arg Arg Ser Leu Ile Ser Trp 565 570 575

Asp Pro Arg Ser Pro Gly Vai Pro Leu Leu Pro Asp Thr Ser Thr Phe 580 585 590

Tyr Gly Ser Leu Ile Ala Glu Gin Pro Ser Ser Pro Pro Vai Arg Pro 595 600 605

Ser Pro Lys Thr Pro Ala Ala Arg Arg Phe Pro Ser Lys Leu Ala Gly 610 615 620

Thr Ser Ser Pro Trp Ala Ser Ser Asp Ser Leu Cys Ser Arg Arg Gly 625 630 635 640

Leu Cys Ser Pro Arg Met Ser Leu Thr Pro Thr Glu Ala Trp Lys Ala 645 650 655

Lys Lys Lys Gin Glu Leu His Gin Ala Asn Ser Ser Pro Leu Leu Arg 660 665 670

Gly Ser His Pro Met Glu Ile Trp Ala Trp Glu Leu Gly Ser Arg Ala 675 680 685

Ser Lys Asn Leu Ser Gin Ser Pro Gly Glu Ala Pro Arg Ala Vai Vai 690 695 700

Ser Trp Arg Ala Vai Gly Pro Gin Leu His Arg Asn Ser Ser Glu Leu 705 710 715 720

Ala Ser Arg Pro Leu Pro Pro Thr Pro Leu Ser Leu Arg Gly Ala Ser 144 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 725 730 735 Ser HÍS Asp Pro Gin Ser Gin Cys Val C-lu Lys Leu Gin Ala Pro Ser 740 745 750 Ser Asp Pro Leu Pro Ala Ala Pro Leu Ser Val Leu Asn Ser Ser Arg 755 760 765 Prc Ser Ser Pro Gin Ala Ser Phe Leu Ser Cys Pro Ser Pro Ser Ser 770 775 7 80 Ser Asn Leu Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Leu Glu Glu Glu Glu Asp 785 790 795 800 Gin Asp Ser Val Leu Thr Pro Glu Glu Val Ala Leu Cys Leu Glu Leu 805 810 815 Ser Asp Gly Glu Glu Thr Pro Thr Asn Ser Val Ser Pro Met Pro Arg 820 825 830 Ala Pro Ser Pro Pro Thr Thr Tyr Gly Tyr Ile Ser Ile Pro Thr Cys 835 840 845 Ser Gly Leu Ala Asp Met Gly Arg Ala Gly Gly Gly Val Gly Ser Glu 850 855 860 Val Gly Asn Leu Leu Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Pro Thr Pro Thr Pro 865 870 875 880 Ser Glu Gly Ser Leu Ala Asn Gly Trp Gly Ser Ala Ser Glu Asp Asn 885 890 895 Val Pro Ser Ala Arg Ala Ser Leu Val Ser Ser Ser Asp Gly Ser Phe 900 905 910 Leu Ala Asp Thr His Phe Ala Arg Ala Leu Ala Val Ala Val Asp Ser 915 920 925 Phe Gly Leu Ser Leu Asp Pro Arg Glu Ala Asp Cys Val Phe Thr Asp 930 935 940 Ala Ser Ser Pro Pro Ser Pro Arg Gly Asp Leu Ser Leu Thr Arg Ser 945 950 955 960 Phe Ser Leu Pro Leu Trp Glu Trp Arg Pro Asp Trp Leu Glu Asp Ala 965 970 97 5 Glu Ile Ser His Thr Gin Arg Leu Gly Arg Gly Leu Pro Pro Trp Pro 980 985 990 Pro Asp Ser Arg Ala Ser Ser Gin Arg Ser Trp Leu Thr Gly Ala Val 995 1000 1005 Pro Lys Ala Gly Asp Ser Ser 1010 1015 145 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

<210> 41 <211> 39 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 Ο Ο > 41

Met Phe Phe Gly Glu Gly Tyr Gly Gly Gly Pro Vai Glu Glu Pro Ser 15 10 15

His Ile Tyr Leu Asp Ser Ser Leu Arg Gly Gin Leu Asn Pro Phe Pro 20 25 30

Ser His Thr Met Gin Gly Asn 35

<210> 42 <211> 34 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42

Met Glu Glu Thr Glu Gly Lys Asp Ala Gly Lys Gin Gly Thr Asn Ala 15 10 15

Leu Phe Ser Phe Tyr Arg His Ser Glu Leu Lys Glu Leu Asn Ser Ile 20 25 30

Lys Leu

<210> 43 <211> 1075 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43

Met Gly Ser Gly Gly Asp Ser Leu Leu Gly Gly Arg Gly Ser Leu Pro 146 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Ile Met Gly Gly Met Ala Gin Asp Ser Pro Pro 20 25 30

Gin Ile Leu Vai His Pro Gin Asp Gin Leu Phe Gin Gly Pro Gly Pro 35 40 45

Ala Arg Met Ser Cys Gin Ala Ser Gly Gin Pro Pro Pro Thr Ile Arg 50 55 60

Trp Leu Leu Asn Gly Gin Pro Leu 65 70

His Leu Leu Pro Asp Gly Thr Leu 85

Gly His Ala His Asp Gly Gin Ala 100

Thr Cys Glu Ala Ser Asn Arg Leu 115 120

Arg Leu Ser Vai Ala Vai Leu Arg 130 135

Asp Met Vai Ala Vai Vai Gly Glu 145 150

Pro Trp Gly .His Pro Glu Pro Thr 165

Pro Leu Ala Leu Gin Pro Gly Arg 180

Leu Met Ala Arg Ala Glu Lys Ser 195 200

Ala Thr Asn Ser Ala Gly His Arg 210 215

Ser Met Vai Pro Pro Asp Pro His 75 80

Leu Leu Leu Gin Pro Pro Ala Arg 90 95

Leu Ser Thr Asp Leu Gly Vai Tyr 105 110

Gly Thr Ala Vai Ser Arg Gly Ala 125

Glu Asp Phe Gin Ile Gin Pro Arg 140

Gin Phe Thr Leu Glu Cys Gly Pro 155 160

Vai Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys 170 175

His Thr Vai Ser Gly Gly Ser Leu 185 190

Asp Glu Gly Thr Tyr Met Cys Vai 205

Glu Ser Arg Ala Ala Arg Vai Ser 220

Ile Gin Glu Pro Gin Asp Tyr Thr Glu Pro Vai Glu Leu Leu Ala Vai 225 230 235 240

Arg Ile Gin Leu Glu Asn Vai Thr Leu Leu Asn Pro Asp Pro Ala Glu 245 250 255

Gly Pro Lys Pro Arg Pro Ala Vai Trp Leu Ser Trp Lys Vai Ser Gly 147 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 260 265 220

Pro Ala Ala Pro Ala C-ln Ser Tyr Thr Ala Leu Phe Arg Thr Gin Thr 275 2B0 285

Ala Pro Gly Gly Gin Gly Ala Prc Trp Ala Glu Glu Leu Leu Ala Gly 290 295 300

Trp Gin Ser Ala Glu Leu Gly Gly Leu His Trp Gly Gin Asp Tyr Glu 305 310 315 320

Phe Lys Vai Arg Pro Ser Ser Gly Arg Ala Arg Gly Pro Asp Ser Asn 325 330 335

Vai Leu Leu Leu Arg Leu Pro Glu Lys Vai Pro Ser Ala Pro Pro Gin 340 345 350

Glu Vai Thr Leu Lys Pro Gly Asn Gly Thr Vai Phe Vai Ser Trp Vai 355 360 365

Pro Pro Pro Ala Glu Asn His Asn Gly Ile Ile Arg Gly Tyr Gin Vai 370 375 380

Trp Ser Leu G.ly Asn Thr Ser Leu Pro Pro Ala Asn Trp Thr Vai Vai 385 390 395 400

Gly Glu Gin Thr Gin Leu Glu Ile Ala Thr His Met Pro Gly Ser Tyr 405 410 415

Cys Vai Gin Vai Ala Ala Vai Thr Gly Ala Gly Ala Gly Glu Pro Ser 420 425 430

Arg Pro Vai Cys Leu Leu Leu Glu Gin Ala Met Glu Arg Ala Thr Gin 435 440 445

Glu Pro Ser Glu His Gly Pro Trp Thr Leu Glu Gin Leu Arg Ala Thr 450 455 460

Leu Lys Arg Pro Glu Vai Ile Ala Thr Cys Gly Vai Ala Leu Trp Leu 465 470 475 480

Leu Leu Leu Gly Thr Ala Vai Cys Ile His Arg Arg Arg Arg Ala Arg 485 490 495

Vai His Leu Gly Pro Gly Leu Tyr Arg Tyr Thr Ser Glu Asp Ala Ile 500 505 510

Leu Lys His Arg Ket Asp His Ser Asp Ser Gin Trp Leu Ala Asp Thr 148 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 515 520 525

Trp Arg Ser Thr Ser Gly Ser Arg Asp Leu Ser Ser Ser Ser Ser Leu 530 535 510

Ser Ser Arg Leu Gly Ala Asp Ala Arg Asp Pro Leu Asp Cys Arg Arg 545 550 555 560

Ser Leu Leu Ser Trp Asp Ser Arg Ser Pro Gly Vai Pro Leu Leu Pro 565 570 575

Asp Thr Ser Thr Phe Tyr Gly Ser Leu Ile Ala Glu Leu Pro Ser Ser 580 585 590

Thr Pro Ala Arg Pro Ser Pro Gin Vai Pro Ala Vai Arg Arg Leu Pro 595 600 605

Pro Gin Leu Ala Gin Leu Ser Ser Pro Cys Ser Ser Ser Asp Se: Leu 610 615 620

Cys Ser Arg Arg Gly Leu Ser Ser Pro Arg Leu Ser Leu Ala Pro Ala 625 630 635 640

Glu Ala Trp Lys Ala Lys Lys Lys Gin Glu Leu Gin Hís Ala Asn Ser 645 650 655

Ser Pro Leu Leu Arg Gly Ser His Ser Leu Glu Leu Arg Ala Cys Glu 660 665 670

Leu Gly Asn Arg Gly Ser Lys Asn Leu Ser Gin Ser Pro Gly Ala Vai 675 680 685

Pro Gin Ala Leu Vai Ala Trp Arg Ala Leu Gly Pro Lys Leu Leu Ser 69C 695 700

Ser Ser Asn Glu Leu Vai Thr Arg His Leu Pro Pro Ala Pro Leu Phe 705 710 715 720

Pro His Glu Thr Pro Pro Thr Gin Ser Gin Gin Thr Gin Pro Pro Vai 725 730 735

Ala Pro Gin Ala Pro Ser Ser Ile Leu Leu Pro Ala Ala Pro Ile Pro 740 745 750

Ile Leu Ser Pro Cys Ser Pro Pro Ser Pro Gin Ala Ser Ser Leu Ser 755 760 765

Gly Pro Ser Pro Ala Ser Ser Arg Leu Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser 149 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 770 775 780

Leu Gly Glu Asp Gin Asp Ser Vai Leu Thr Pro Glu Glu Vai Ala Leu 785 790 795 800

Cys Leu Glu Leu Ser Glu Gly Glu Glu Thr Pro Arg Asn Ser Vai Ser 805 810 815

Pro Met Pro Arg Ala Pro Ser Pro Pro Thr Thr Tyr Gly Tyr Ile Ser 820 825 830

Vai Pro Thr Ala Ser Glu Phe Thr Asp Met Gly Arg Thr Gly Gly Gly 835 840 845

Vai Gly Pro Lys Gly Gly Vai Leu Leu Cys Pro Pro Arg Pro Cys Leu 850 855 860

Thr Pro Thr Pro Ser Glu Gly Ser 865 870

Ser Glu Asp Asn Ala Ala Ser Ala 885

Asp Gly Ser Phe Leu Ala Asp Ala 900

Ala Vai Asp Ser Phe Gly Phe Gly 915 920

Vai Phe Ile Asp Ala Ser Ser Pro 930 935

Leu Ala Asn Gly Trp Gly Ser Ala 875 880

Arg Ala Ser Leu Vai Ser Ser Ser 890 895

His Phe Ala Arg Ala Leu Ala Vai 905 910

Leu Glu Pro Arg Glu Ala Asp Cys 925

Pro Ser Pro Arg Asp Glu Ile Phe 940

Leu Thr Pro Asn Leu Ser Leu Pro 945 950

Leu Glu Asp Met Glu Vai Ser His 965

Pro Pro Trp Pro Pro Glu Leu Ser 980

Pro Leu Ser Tyr Ala Gin Gly Trp 995 1000

Asn Arg Vai Pro Glu Thr Ser Gin 1010 1015

Leu Trp Glu Trp Arg Pro Asp Trp 955 960

Thr Gin Arg Leu Gly Arg Gly Met 970 975

Asp Leu Phe Pro Glu Lys Ser Ala 985 990

Cys Phe Ser Cys Arg Leu Leu Leu 1005

Thr Gly Ile Arg Thr Thr Ser Pro 1020

Vai Pro Pro Thr Arg Pro Gly Leu Trp Cys Vai Gly Leu Gly Leu Cys 150 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 1025 1030 1035 1040

Phe Ser Ala Ala Gly Vai His Leu Pro Lys Pro Pro Glu Ser Ser Pro 1045 1050 1055

Ser Thr Ile Vai Lys Thr Asn Glu Asn Lys Ile Arg Ala Lys Leu Thr 1060 1065 1070

Trp Ser Pro 1075

<210> 44 <211> 38 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44

Ile Vai Pro Glu Lys Ala Arg Arg Ala Pro Arg Pro Leu Ser Cys Leu 1 5 10 15 Ser Pro Gly Phe Leu Thr Cys Gly Gly Leu Gly Leu Cys Phe Ser Vai 20 25 30 Ile Glu Vai His Arg His 35

<210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45

Ala Ser Gly Glu Leu Cys His Trp Asp Cys 15 10 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 46 Lys Gin Thr Lys Ile 1 5 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus 151 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ < 4 Ο Ο > 47

Ser Arg Glu Ser Trp Ile Pro 1 5 < 210 > 48 <211> 1005 < 212 > PRT < 213 > Mus musculus < 4 0 0 > 48

Met Gly Ser Gly Gly Thr Gly Leu Leu Gly Thr Glu Trp Pro Leu Pro 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Phe Ile Met Gly Gly Glu Ala Leu Asp Ser Pro Pro 20 25 30 Gin Ile Leu Vai His Pro Gin Asp Gin Leu Leu Gin Gly Ser Gly Pro 35 40 45 Ala Lys Met Arg Cys Arg Ser Ser Gly Gin Pro Pro Pro Thr Ile Arg 50 55 60 Trp Leu Leu Asn Gly Gin Pro Leu Ser Met Ala Thr Pro Asp Leu His 65 70 75 80 Tyr Leu Leu Pro Asp Gly Thr Leu Leu Leu His Arg Pro Ser Val Gin 85 90 95 Gly Arg Pro Gin Asp Asp Gin Asn Ile Leu Ser Ala Ile Leu Gly Val 100 105 110 Tyr Thr Cys Glu Ala Ser Asn Arg Leu Gly Thr Ala Val Ser Arg Gly 115 120 125 Ala Arg Leu Ser Val Ala Val Leu Gin Glu Asp Phe Gin Ile Gin Pro 130 135 140 Arg Asp Thr Val Ala Val Val Gly Glu Ser Leu Val Leu Glu Cys Gly 145 150 155 160 Pro Pro Trp Gly Tyr Pro Lys Pro Ser Val Ser Trp Trp Lys Asp Gly 165 170 175 152 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Lys Pro Leu Vai leu Gin Pro Gly Arg Arg Thr Vai Ser Gly Asp Ser 180 185 190

Leu Met Vai Ser Arg Ala Glu Lys Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Met Cys 195 200 205

Met Ala Thr Asn Asn Ala Gly Gin Arg Glu Ser Arg Ala Ala Arg Vai 210 215 220

Ser Ile Gin Glu Ser Gin Asp His Lys Glu His Leu Glu Leu Leu Ala 225 230 235 240

Vai Arg Ile Gin Leu Glu Asn Vai Thr Leu Leu Asn Pro Glu Pro Vai 245 250 255

Lys Gly Pro Lys Pro Gly Pro Ser Vai Trp Leu Ser Trp Lys Vai Ser 260 265 270

Gly Pro Ala Ala Pro Ala Glu Ser Tyr Thr Ala Leu Phe Arg Thr Gin 275 280 285

Arg Ser Pro Arg Asp Gin Gly Ser Pro Trp Thr Glu Vai Leu Leu Arg 290 295 300

Gly Leu Gin Ser Ala Lys Leu Gly Gly Leu His Trp Gly Gin Asp Tyr 305 310 315 320

Glu Phe Lys Vai Arg Pro Ser Ser Gly Arg Ala Arg Gly Pro Asp Ser 325 330 335

Asn Vai Leu Leu Leu Arg Leu Pro Glu Gin Vai Pro Ser Ala Pro Pro 340 345 350

Gin Gly Vai Thr Leu Arg Ser Gly Asn Gly Ser Vai Phe Vai Ser Trp 355 360 365

Ala Pro Pro Pro Ala Glu Ser His Asn Gly Vai Ile Arg Gly Tyr Gin 370 375 380

Vai Trp Ser Leu Gly Asn Ala Ser Leu Pro Ala Ala Asn Trp Thr Vai 385 390 395 400

Vai Gly Glu Gin Thr Gin Leu Glu Ile Ala Thr Arg Leu Pro Gly Ser 405 410 415

Tyr Cys Vai Gin Vai Ala Ala Vai Thr Gly Ala Gly Ala Gly Glu Leu 420 425 430 153 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Ser Thr Pro Vai Cys Leu Leu Leu Glu Gin Ala Met Glu Gin Ser Ala 435 440 445

Arg Asp Pro Arg Lys His Vai Pro Trp Thr Leu Glu Gin Leu Arg Ala 450 455 460

Thr Leu Arg Arg Pro Glu Vai Ile Ala Ser Ser Ala Vai Leu Leu Trp 465 470 475 480

Leu Leu Leu Leu Gly Ile Thr Vai Cys Ile Tyr Arg Arg Arg Lys Ala 485 490 495

Gly Vai His Leu Gly Pro Gly Leu Tyr Arg Tyr Thr Ser Glu Asp Ala 500 505 510

Ile Leu Lys His Arg Met Asp His Ser Asp Ser Pro Trp Leu Ala Asp 515 520 525

Thr Trp Arg Ser Thr Ser Gly Ser Arg Asp Leu Ser Ser Ser Ser Ser 530 535 540

Leu Ser Ser Arg Leu Gly Leu Asp Pro Arg Asp Pro Leu Glu Gly Arg 545 550 555 560

Arg Ser Leu Ile Ser Trp Asp Pro Arg Ser Pro Gly Vai Pro Leu Leu 565 570 575

Pro Asp Thr Ser Thr Phe Tyr Gly Ser Leu Ile Ala Glu Gin Pro Ser 580 585 590

Ser Pro Pro Vai Arg Pro Ser Pro Lys Thr Pro Ala Ala Arg Arg Phe 595 600 605

Pro Ser Lys Leu Ala Gly Thr Ser Ser Pro Trp Ala Ser Ser Asp Ser 610 615 620

Leu Cys Ser Arg Arg Gly Leu Cys Ser Pro Arg Met Ser Leu Thr Pro 625 630 635 640

Thr Glu Ala Trp Lys Ala Lys Lys Lys Gin Glu Leu His Gin Ala Asn 645 650 655

Ser Ser Pro Leu Leu Arg Gly Ser His Pro Met Glu Ile Trp Ala Trp 660 665 670

Glu Leu Gly Ser Arg Ala Ser Lys Asn Leu Ser Gin Ser Pro Gly Glu 675 680 685 154 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Ala Pro Arg Ala Vai Vai Ser Trp Arg Ala Vai Gly Pro Gin Leu His 690 695 700

Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ala Ser Arg Pro Leu Pro Pro Thr Pro Leu 705 710 715 720

Ser Leu Arg Gly Ala Ser Ser His Asp Pro Gin Ser Gin Cys Vai Glu 725 730 735

Lys Leu Gin Ala Pro Ser Ser Asp Pro Leu Pro Ala Ala Pro Leu Ser 740 745 750

Vai Leu Asn Ser Ser Arg Pro Ser Ser Pro Gin Ala Ser Phe Leu Ser 755 760 765

Cys Pro Ser Pro Ser Ser Ser Asn Leu Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser 770 775 780

Leu Glu Glu Glu Glu Asp Gin Asp Ser Vai Leu Thr Pro Glu Glu Vai 785 790 795 800

Ala Leu Cys Leu Glu Leu Ser Asp Gly Glu Glu Thr Pro Thr Asn Ser 805 810 815

Vai Ser Pro Met Pro Arg Ala Pro Ser Pro Pro Thr Thr Tyr Gly Tyr 820 825 830

Ile Ser Ile Pro Thr Cys Ser Gly Leu Ala Asp Met Gly Arg Ala Gly 835 840 845

Gly Gly Val Gly Ser Glu Vai Gly Asn Leu Leu Tyr Pro Pro Arg Pro 850 855 860

Cys Pro Thr Pro Thr Pro Ser Glu Gly Ser Leu Ala Asn Gly Trp Gly 855 870 875 880

Ser Ala Ser Glu Asp Asn Val Pro Ser Ala Arg Ala Ser Leu Val Ser 885 890 895

Ser Ser Asp Gly Ser Phe Leu Ala Asp Thr His Phe Ala Arg Ala Leu 900 905 910

Ala Val Ala Val Asp Ser Phe Gly Leu Ser Leu Asp Pro Arg Glu Ala 915 920 925

Asp Cys Val Phe Thr Asp Ala Ser Ser Pro Pro Ser Pro Arg Gly Asp 930 935 940 155 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ

Leu Ser Leu Thr Arg Ser Phe Ser 945 950

Asp Trp Leu Glu Asp Ala Glu Xle 965

Gly Leu Pro Pro Trp Pro Pro Asp 980

Trp Leu Thr Gly Ala Vai Pro Lys 995 1000

Leu Pro Leu Trp Glu Trp Arg Pro 955 960

Ser Hís Thr Gin Arg Leu Gly Arg 970 975

Ser Arg Ala Ser Ser Gin Arg Ser 985 990

Ala Gly Asp Ser Ser 1005

<210> 49 <211> 3651 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 49 agtgctcggg acaaggacat agggctgaga gtagccatgg gotctggagg agacagcctc 60 ctggggggca ggggttccct gcctctgctg ctcctgctca tcatgggagg catggctcag 120 gactccccgc cccagatcct agtccacccc caggaccagc tgttccaggg ccctggccct 180 gccaggatga gctgccaagc ctcaggccag ccacctccca ccatccgctg gttgctgaat 240 gggcagcccc tgagcatggt gcccccagac ccacaccacc tcctgcctga tgggaccctt 300 ctgctgctac agccccctgc ccggggacat gcccacgatg gccaggccct gtccacagac 360 ctgggtgtct acacatgtga ggccagcaac cggcttggca cggcagtcag cagaggcgct 420 cggctgtctg tggctgtcct ccgggaggat ttccagatcc agcctcggga catggtggct 480 gtggtgggtg agcagtttac tctggaatgt gggccgccct ggggccaccc agagcccaca 540 gtctcatggt ggaaagatgg gaaacccctg gccctccagc ccggaaggca cacagtgtcc 600 ggggggtccc tgctgatggc aagagcagag aagagtgacg aagggaccta catgtgtgtg 660 gccaccaaca gcgcaggaca tagggagagc cgcgcagccc gggtttccat ccaggagccc 720 caggactaca cggagcctgt ggagcttctg gctgtgcgaa ttcagctgga aaatgtgaca 780 ctgctgaacc cggatcctgc agagggcccc aagcctagac cggcggtgtg gctcagctgg 840 aaggtcagtg gccctgctgc gcctgcccaa tcttacacgg ccttgttcag gacccagact 900 gccccgggag gccagggagc tccgtgggca gaggagctgc tggccggctg gcagagcgca 960 gagcttggag gcctccactg gggccaagac tacgagttca aagtgagacc atcctctggc 1020 cgggctcgag gccctgacag caacgtgctg ctcctgaggc tgccggaaaa agtgcccagt 1080 gccccacctc aggaagtgac tctaaagcct ggcaatggca ctgtctttgt gaactgggtc 1140 ccaccacctg ctgaaaacca caatggcatc atccgtggct accaggtctg gagcctgggc 1200 aacacatcac tgccaccagc caactggact gtagttggtg agcagaccca gctggaaatc 1260 gccacccata tgccaggctc ctactgcgtg caagtggctg cagtcactgg tgctggagct 1320 ggggagccca gtagacctgt ctgcctcctt ttagagcagg ccatggagcg agccacccaa 1380 gaacccagtg agcatggtcc ctggaccctg gagcagctga gggctacctt gaagcggcct 1440 gaggtcattg ccacctgcgg tgttgcactc tggctgctgc ttctgggcac cgccgtgtgt 1500 atccaccgcc ggcgccgagc tagggtgcac ctgggcccag gtctgtacag atataccagt 1560 gaggatgcca tcctaaaaca caggatggat cacagtgact cccagtggtt ggcagacact 1620 tggcgttcca cctctggctc tcgggacctg agcagcagca gcagcctcag cagtcggctg 1680 156 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ ggggcggatg cccgggaccc actagactgt cgtcgctcct tgctctcctg ggactcccga 1740 agccccggcg tgcccctgct tccagacacc agcacttttt atggctccct catcgctgag 1800 ctgccctcca gtaccccagc caggccaagt ccccaggtcc cagctgtcag gcgcctccoa 1860 ccccagctgg cccagctctc cagcccctgt tccagctcag acagcctctg cagccgcagg 1920 ggactctctt ctccccgctt gtctctggcc cctgcagagg cttggaaggc caaaaagaag 1980 caggagctgc agcatgccaa cagttcccca ctgctccggg gcagccactc cttggagctc 2040 cgggcctgtg agttaggaaa tagaggttcc aagaaccttt cccaaagccc aggagctgtg 2100 ccccaagctc tggttgcctg gcgggccctg ggaccgaaac tcctcagctc ctcaaatgaq 2160 ctggttactc gtcatctccc tccagcaccc ctctttcctc atgaaactcc cccaactcag 2220 agtcaacaga cccagcctcc ggtggcacca caggctccct cctccatcct gctgccagca 2280 gcccccatcc ccatccttag cccctgcagt ccccctagcc cccaggcctc ttccctctct 2340 ggccccagcc cagcttccag tcgcctgtcc agctcctcac tgtcatccct gggggaggat 2400 caagacagcg tgctgacccc tgaggaggta gccctgtgct tggaactcag tgagggtgag 2460 gagactccca ggaacagcgt ctctcccatg ccaagggctc cttcaccccc caccacctat 2520 gggtacatca gcgtcccaac agcctcagag ttcacggaca tgggcaggac tggaggaggg 2580 gtggggccca aggggggagt cttgctgtgc ccacctcggc cctgcctcac ccccaccccc 2640 agcgagggct ccttagccaa tggttggggc tcagcctctg aggacaatgc cgccagcgcc 2700 agagccagcc ttgtcagctc ctccgatggc tccttcctcg ctgatgctca ctttgcccgg 2760 gccctggcag tggctgtgga tagctttggt ttcggtctag agcccaggga ggcagactgc 2820 gtcttcatag atgcctcatc acctccctcc ccacgggatg agatcttcct gacccccaac 2880 ctctccctgc ccctgtggga gtggaggcca gactggttgg aagacatgga ggtcagccao 2940 acccagcggc tgggaagggg gatgcctccc tggccccctg aactctcaga tctcttccca 3000 gagaagtcag ctccactgtc gtatgcccaa ggctggtgct tctcctgtag attactcctg 3060 aaccgtgtcc ctgagacttc ccagacggga atcagaacca cttctcctgt tccacccaca 3120 agacctgggc tgtggtgtgt ggçtcttggc ctgtgtttct ctgcagctgg ggtccacctt 3180 cccaagcctc cagagagttc tccctccacg attgtgaaaa caaatgaaaa caaaattaga 3240 gcaaagctga cctggagccc tcagggagca aaacatcatc tccacctgac tcctagccac 3300 tgctttctcc tctgtgccat ccactcccac caccaggttg ttttggcctg aggagcagcc 3360 ctgcctgctg ctcttccccc accatttgga tcacaggaag tggaggagcc agaggtgcct 3420 ttgtggagga cagcagtggc tgctgggaga gggctgtgga ggaaggagct tctcgçagcc 3480 ccctctcagc cttacctggg cccctcctct agagaagagc tcaactctct cccaacctca 3540 ccatggaaag aaaataatta tgaatgccac tgaggcactg aggccctacc tcatgccaaa 3600 caaagggttc aaggctgggt ctagcgagga tgctgaagga agggaggtat g 3651

<210> 50 <211> 3607 < 212 > ADN <213> Mus musculus <400> 50_ agtgtatggg acaaggagag gagccgagag cagccatggg ctctggagga acgggcctcc 60 tggggacgga gtggcctctg cctctgctgc tgcttttcat catgggaggt gaggctctgg 120 attctccacc ccagatccta gttcaccccc aggaccagct acttcagggc tctggcccag 180 ccaagatgag gtgcagatca tccggccaac cacctcccac tatccgctgg ctgctgaatg 240 ggcagcccct cagcatggcc accccagacc tacattacct tttgccggat gggaccctcc 300 tgttacatcg gccctctgtc cagggacggc cacaagatga ccagaacatc ctctcagcaa 360 tcctgggtgt ctacacatgt gaggccagca accggctggg cacagcagtg agccggggtg 420 ctaggctgtc tgtggotgtc ctccaggagg acttccagat ccaacctcgg gacacagtgg 480 157 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ ccgtggtggg agagagcttg gttcttgagt gtggtcctcc ctggggctac ccaaaaccct 540 cggtctcatg gtggaaagac gggaaacccc tggtcctcca gccagggagg cgcacagtat 600 ctggggattc cctgatggtg tcaagagcag agaagaatga ctcggggacc tatatgtgta 660 tggccaccaa caatgctggg caacgggaga gccgagcagc cagçgtçtct atccaggaat 720 cccaggacca caaggaacat ctagagcttc tggctgttcg cattcaçctg gaaaatgtga 780 ccctgctaaa ccccgaacct gtaaaaggtc ccaagcctgg gccatccgtg tggctcagct 840 ggaaggtgag cggccctgct gcacctgctg agtcatacac agctctgttc aggactcaga 900 ggtcccccag ggaccaagga tctccatgga cagaggtgct gctqcqtgqc ttgcagagtg 960 caaagcttgg gggtctccac tggggccaag actatgaatt caaagtgaga ccgtcctccg 1020 gccgggctcq aggccctgac agcaatgtgt tgctcctgag gctgcctgaa cacgtgccca 1080 gtgccccacc tcaaggagtç accttaagat ctggcaacgg tagtgtcttt gtgagttggg 1140 ctccaccacc tgctgaaagc cataatggtg tcatccgtgg ttaccaggtc tggagcctgg 1200 qcaatgcctc attgcctgct gccaactgga ccgtagtggg tgaacagacc cagctggaga 1260 tcgccacacg actgccaggc tcctattgtg tgcaagtggc tgcagtcact ggagctggtg 1320 ctggagaact cagtacccct gtctgcctcc ttttagagca ggccatggag caatcagcac 1380 gagaccccag gaaacatgtt ccctggaccc tggaacagct gagggccacc ttgagacgac 1440 cagaagtcat tgccagtagt gctgtcctac tctggttgct gctactaggc attactgtgt 1500 gtatctacag acgacgcaaa gctggçgtgc acctgggccc aggtctgtac agatacacca 1560 qcqaqqacqc cattctaaaa cacaacatgq accacaqtqa ctccccatqq ctqqcaqaca 1620 cctggcgttc cacctctggc tctcgagacc tgagcagcag cagcagcctt agtagtcggc 1680 tgggattgga ccctcgggac ccactagagg gcaggcgctc cttgatctcc tgggaccctc 1740 ggagccccgg tgtacccctg cttccagaca cçagcacgtt ttacggctcc ctcattgcag 1800 agcagccttc cagccctcca gtccggccaa gccccaagac accagctçct aggcçctttc 1860 catccaagtt ggctggaacc tccagcccct gggctagctc agatagtctc tgcagccgca 1920 ggggactctg ttccccacgc atgtctctga cccctacaga ggcttggaag gccaaaaaga 1980 agcaggaatt gcaccaagct aacagctccc cactçctccg gggcagccac cccatggaaa 2040 tctgggcctg ggagttggga agcagagcct ccaagaacct ttctcaaagc ccaggagaag 2100 cgccccgagc cgtggtatcc tggcçtgctg tgggaccaca acttcaccgc aactccagtg 2160 agrt-ggrat-r. t-r.gt-r.rsr.tr. qr.trr.aar.ar rrrt-1-1~rtrt- 1-rglggflgrl Inragl-ralg 2220 acccacagag ccagtgtgtg gagaagctcc aagctccctc ctctgaccca ctgccagcag 2280 cccctctctc cgtcctcaac tcttccagac cttccagccc ccaggcctct ttcctctcct 2340 gtcctagccc atcctccagc aacctgtcca gctcctcgct gtcatcctta gaggaggagg 2400 aggatcagga cagcgtgctc acccccgagg aggtagccct gtgtctggag ctcagtgatg 2460 gggaggagac acccacgaac agtgtatctc ctatgccaag agctccttcc ccgccaacaa 2520 cctatggcta tatcagcata ccaacctgct caggactggc agacatgggc agagctggcg 2580 ggggcgtggg gtctgaggtt gggaacttac tgtatccacc tcggcccagc cccaccccta 2640 cacccagcga gggctccctg gccaatggtt ggggctcagc ttctgaçgac aatgtcccca 2700 gcgccagggc cagcctggtt agctcttctg atggctcctt cctcgctgat actcactttg 2760 ctcgtgccct ggcagtggct gtggatagct ttggcctcag tctgqatccc agggaagctg 2820 actgtgtctt cactgatgcc tcatcacctc cctcccctcg gggtgatctc tccctgaccc 2880 gaagcttctc tctgcctttg tgggagtgga ggccagactg gttggaagat gctgagatca 2940 gccacaccca gaggctgggg agggggctgc ctccctggcc tcctgattct agggcctctt 3000 cccagcgaag ttggctaact ggtgctgtgc ccaaggctgg tgattcctcc agaattgtcc 3060 ctgagaaggc cagaagagca cccagaccac tctcctgtct gtcccctggc tttctcacat 3120 gtggaggtct tggcctatgc ttctctgtaa tagaagtcca ccgtcactag gcttctggag 3180 agctctgtca ttgggattçt taaaataaat gaaagcaaac caaaatatga tcacgggagt 3240 cttggattcc cactgagaac aagacagcat cttcaggaca gcagactctc cacaaccaga 3300 acctttggcc taagtaagcc tggcf.ccgga gctcccacct aagtggatca tggaaagaag 3360 158 ΕΡ 1 334 194/ΡΤ ggaagccaac caggtcttca ggaaggacag aaatgttttt tggtgagggc tatggtggag 3420 gacctgtgga agagccctct catatctact tggactcctc ccttagaggc cagctcaacc 3480 ctttccccag tcacaccatg caaggaaact aaaggagaaa çgtcçtggat gcagtgggcc 3540 ctatacagcg tcacagtcaa tgcttcaaag tgagatcaat ggaggagact gaaggaaagg 3600 acgcagg 3607

Lisboa,

Claims (29)

1. ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um composto compreendendo (i) um anticorpo que se liga selectivamente ao polipéptido humano ECSM4 e (ii) uma porção facilmente detectável, em que o referido ECSM4 humano é um polipéptido de ocorrência natural que compreende uma porção de 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência polipeptídica da Figura 4 ou 5, ou suas variantes naturais, no fabrico de um agente destinado a imagiologia da vasculatura no corpo de um indivíduo.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a vasculatura é uma neovasculatura.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a vasculatura é uma neovasculatura de um cancro.
4. 4. Utilização de um composto compreendendo (i) um anticorpo que se liga selectivamente ao polipéptido humano ECSM4 e (ii) uma porção facilmente detectável, em que o referido ECSM4 humano é um polipéptido de ocorrência natural que compreende uma porção de 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência polipeptídica da Figura 4 ou 5, ou suas variantes naturais, no fabrico de um agente de diagnóstico ou de prognóstico para uma afecção que envolve o endotélio vascular.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que a afecção é cancro, psoríase, retinopatia diabética, aterosclerose ou menorragia.
6. 6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, em que a porção facilmente detectável compreende um átomo radioactivo.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o átomo radioactivo é o tecnécio 99m ou o iodo 123.
8. 8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, em que a porção facilmente detectável compreende uma quantidade adequada de qualquer um entre ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 2/5 iodo 123, iodo 131, indio 111, flúor 19, carbono 13, azoto 15, oxigénio 17, gadolinio, manganésio ou ferro.
9. 9. Utilização de um composto compreendendo (i) um anticorpo que se liga selectivamente ao polipéptido humano ECSM4 e (ii) uma porção directa ou indirectamente citotóxica, em que o referido ECSM4 humano é um polipéptido de ocorrência natural que compreende uma porção de 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência polipeptídica da Figura 4 ou 5, ou suas variantes naturais, no fabrico de um medicamento destinado a tratar uma afecção envolvendo o endotélio vascular.
10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que a porção citotóxica é um agente quimioterapêutico directamente citotóxico.
11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o a porção citotóxica é um polipéptido directamente citotóxico.
12. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que a porção citotóxica é uma porção que é capaz de converter uma prodroga relativamente não tóxica numa droga citotóxica.
13. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que a porção citotóxica é um radiossensibilizador.
14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que a porção citotóxica compreende um ácido nucleico directamente citotóxico.
15. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que a porção citotóxica compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido directa ou indirectamente citotóxico.
16. 16. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que a porção citotóxica compreende um átomo radioactivo.
17. 17. Utilização de acordo com a reivindicação 16, em que o átomo radioactivo é qualquer um entre fósforo 32, iodo 125, iodo 131, índio 111, rénio 186, rénio 188 ou ítrio 90. ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 3/5
18. 18. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-17, em que a afecção é cancro, psoriase, retinopatia diabética, aterosclerose ou menorragia.
19. 19. Método de detecção de qualquer condição de entre lesão ou activação endotelial, um tumor ou uma neovasculatura de um tumor, doença cardíaca, endometriose ou aterosclerose num indivíduo, em que o método compreende a detecção da presença de fragmentos de ECSM4 humano numa amostra de fluido do indivíduo, onde o referido ECSM4 humano é um polipéptido de ocorrência natural que compreende uma porção de 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência polipeptídica da Figura 4 ou 5, ou suas variantes naturais.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a detecção emprega um anticorpo que se liga selectivamente ao ECSM4 humano, ou um composto definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4 ou 6-8.
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o anticorpo se liga selectivamente a um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos localizada entre os resíduos 1 e 467 da sequência polipeptídica da Figura 12.
22. 22. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o anticorpo se liga selectivamente a qualquer uma das sequências de aminoácidos GGDSLLGGRGSL, LLQPPARGHAHDGQALSTDL, EPQDYTEPVE, TAPGGQGAPWAEE ou ERATQEPSEHGP.
23. 23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20-22, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
24. 24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20-23, em que o anticorpo está marcado de forma detectável.
25. 25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, em que a lesão endotelial é diagnóstico de cancro, doença cardíaca, endometriose ou aterosclerose no indivíduo. ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 4/5
26. 26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 25, em que o indivíduo é um indivíduo que se encontra a receber tratamento para um cancro, uma doença cardíaca, endometriose ou aterosclerose, e a quantidade de fragmentos de ECSM4 humano na amostra é determinada e comparada com (a) a presente numa amostra de um indivíduo que não tem cancro, doença cardíaca, endometriose ou aterosclerose e/ou com (b) a quantidade numa amostra do indivíduo antes do início do referido tratamento, e a comparação indica a eficácia do tratamento do indivíduo.
27. 27. Método de diagnóstico de uma afecção que envolve um crescimento aberrante ou excessivo do endotélio vascular num indivíduo, que compreende efectuar o contacto de uma amostra contendo ácido nucleico do indivíduo com um polinucleótido que híbrida, em condições de rigor elevado, com um ácido nucleico que codifica o ECSM4 humano, em que o referido ECSM4 humano é um polipéptido de ocorrência natural que compreende uma porção de 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência polipeptídica da Figura 4 ou 5, ou suas variantes naturais.
28. 28. Utilização de ECSM4 humano, ou de um seu fragmento, ou de uma variante do ECSM4 humano possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência, ou um anticorpo que se liga selectivamente ao ECSM4 humano, ou um polinucleótido que é capaz de expressar ECSM4 humano ou um seu fragmento ou variante, ou um polinucleótido que compreende um ácido nucleico anti-sentido de ECSM4 humano, na preparação de um medicamento destinado à modulação da angiogénese num indivíduo, em que o referido ECSM4 humano é um polipéptido de ocorrência natural que compreende uma porção de 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência polipeptídica da Figura 4 ou 5, ou suas variantes naturais.
29. 29. Utilização de um ácido nucleico anti-sentido de ECSM4 que previne selectivamente a expressão de um polinucleótido de ECSM4 humano, em que o referido polinucleótido de ECSM4 humano codifica um polipéptido de ocorrência natural que compreende uma porção de 50 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência polipeptídica da Figura 4 ou 5, ou suas variantes naturais, na preparação de um ΕΡ 1 334 194/ΡΤ 5/5 medicamento destinado à redução da expressão do polinucleótido de ECSM4 humano num indivíduo. Lisboa,