CN102036690B - 新型可溶性cd83多肽、制剂及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗或预防不希望的免疫应答的组合物和方法。该组合物涉及新型可溶性CD83(sCD83)多肽和编码该多肽的核酸、改良的(sCD83)制剂，以及该多肽和制剂在治疗或预防变态反应、自身免疫性疾病和移植排斥中的用途。本发明提供了包含SEQ ID NO：7或与SEQ ID NO：7具有至少70％同一性的氨基酸序列的sCD83多肽；其中，SEQ ID NO：7的氨基酸残基12、20、85和92中的一个或多个为半胱氨酸以外的氨基酸；且可选地，氨基酸残基1、2、3、4和130中的一个或多个缺失。

Description

新型可溶性CD83多肽、制剂及使用方法

技术领域

本发明涉及新型可溶性CD83(sCD83)多肽和编码该多肽的核酸、改良的(sCD83)制剂，以及该蛋白质和制剂在治疗或预防变态反应、自身免疫性疾病和移植排斥中的用途。

背景技术

CD83为来自蛋白质的免疫球蛋白(“Ig”)超家族的分子(参见例如Zhou等人(1999)J.Immunol.149：735-742；还参见美国专利No.7,169,898；综述参见Fujimoto和Tedder((2006)J.Med.Dent.Sci.53：86-91)。CD83作为成熟树突细胞的差示标记物。尽管CD83的确切功能还有待确定，但已报导可溶形式的CD83结合未成熟和成熟树突细胞两者(参见Lechmann等人(2001)(J.Exp.Med.194：1813-1821))。作者还报导，该蛋白质降低在体外成熟的树突细胞的CD80和CD83表达，且其在体外抑制树突细胞刺激T细胞的能力(还参见Lechmann等人(2002)Trends in Immunology 23：273-275)。同样，Kruse等人(2000)(J.Exp.Med.191：1581-1589)报导GC7(N(1)-脒基-1，7-二氨基庚烷)干扰CD83mRNA的核质易位，从而阻止CD83的表面表达和显著抑制这些DC对T淋巴细胞的激活。其他人还报导了体内可溶形式的CD83的存在(参见例如Hock等人(2002)Int.Immunol.13：959-967)。用HSV-1-感染的DC进行的研究表明，病毒感染导致CD83降解，并抑制CD83mRNA的转运；通过HSV-1的该可能的逃避机理进一步支持CD83对DC生物学的重要性(参见例如Kruse等人(2000)J.Virol.74：7127-7136)。

成熟的CD83包括三个结构域：胞外Ig样结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。人CD83胞外结构域(hCD83ext，sCD83的一种形式)包含由至少两个外显子编码的单个Ig样(V型)结构域(参见例如Zhou等人(1999)J.Immunol.149：735-742；GenBank ID#Z11697)，且在成熟的树突细胞(“mDC”)的细胞表面上强烈表达。

美国专利No.7,169,898公开了人CD83(hCD83)cDNA的核酸序列(SEQ ID NO：1)。全长hCD83所对应的氨基酸序列示于SEQIDNO：2。SEQ ID NO：2的氨基酸残基1-19对应信号序列，其从成熟蛋白质(氨基酸残基20-205)中切割出来。hCD83胞外结构域(hCD83ext)由SEQ ID NO：3编码。对应的hCD83ext氨基酸序列示于SEQ ID NO：4，同时也是SEQ ID NO：2的氨基酸残基20-144。跨膜结构域和细胞质结构域分别对应SEQ IDNO：2的氨基酸残基145-166和SEQ ID NO：2的氨基酸残基167-205。野生型hCD83ext包含3个糖基化位点(即SEQ ID NO：4的氨基酸残基60、77和98)和5个半胱氨酸残基(即SEQ ID NO：2的氨基酸残基27、35、100、107和129，其对应SEQ ID NO：4的氨基酸残基8、16、81、88和110)。

hCD83ext抑制DC介导的T细胞刺激(Lechmann等人J.Exp.Med.(2001)194：1813-1821)，并对治疗多发性硬化症的小鼠模型有效(实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)；Zinser等人(2004)J.Exp.Med.200：345-351)。这些研究使用hCD83胞外结构域，该结构域另外还包含在蛋白质氨基末端的凝血酶切割位点的4氨基酸部分(Gly-Ser-Pro-Gly；SEQ ID NO：41)和跨膜结构域的第一个氨基酸(Ile)，并且示于SEQ ID NO：5。

PCT公布WO2004/046182公开了可溶性CD83突变体，其中SEQID NO：5的第5个半胱氨酸残基从半胱氨酸突变为丝氨酸，以产生SEQ ID NO：6(以下称为hCD83ext-m5)，并提议在治疗自身免疫性疾病(如多发性硬化症)和移植中使用hCD83ext-m5和野生型hCD83ext。Zinser等人(Immunobiology(2006)211：449-453)公开了野生型hCD83ext形成同型二聚体，借此胞外结构域的前4个半胱氨酸(即SEQ ID NO：2的氨基酸残基27、35、100和107，其对应SEQ IDNO：5和NO：6的氨基酸残基12、20、85和92)参与分子内二硫键的形成，且第5个半胱氨酸(即SEQ IDNO：1的氨基酸残基129或SEQ ID NO：5和NO：6的氨基酸残基114)决定同型二聚体的分子间桥连。Zinser等人还公开了两个hCD83ext同种型(即野生型二聚体和hCD83ext-m5突变单体)在体外测试中具有相似的抑制能力，且两个hCD83ext同种型的生物学(体内)半衰期类似，为2-3小时。此外，通过使用EAE模型，Zinser等人公开了可溶性CD83的单体突变体同种型(即hCD83ext-m5)与二聚体野生型hCD83ext同种型具有相似的体内抑制活性。

考虑到sCD83的重要的治疗应用，本申请人认识到需要用于治疗或预防不希望的免疫应答(例如自身免疫性疾病、变态反应和移植排斥)的改良的sCD83多肽及其制剂。本发明满足了该需求，并提供了其他优势。

发明内容

本发明提供了具有改良的稳定性的新型可溶性CD83(sCD83)多肽。一方面，提供了分离的sCD83多肽，其包含：氨基酸序列SEQID NO：7或与氨基酸序列SEQ ID NO：7具有至少70％同一性的氨基酸序列；其中氨基酸残基1、2、3、4和130中的一个或多个可选地缺失，且氨基酸残基12、20、85、92和114为表1任一排中所示的氨基酸。优选地，氨基酸残基85为半胱氨酸以外的氨基酸，最优选地，氨基酸残基85为丝氨酸。

在另一方面，提供了分离的sCD83多肽，其包含氨基酸序列SEQID NO：7或与氨基酸序列SEQ ID NO：7具有至少70％同一性的氨基酸序列；其中SEQ ID NO：7的氨基酸残基12、20、85和92中的一个或多个缺失或为半胱氨酸以外的氨基酸；且可选地，氨基酸残基1、2、3、4和130中的一个或多个缺失。

优选地，分离的sCD83多肽包含选自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31的氨基酸序列；其中可选地，氨基酸残基126缺失。

在另一方面中，提供了编码本发明的多核苷酸的核酸以及包含该多核苷酸的载体和细胞。该载体和细胞可用于产生本文公开的sCD83组合物。

本文提供的sCD83多肽可用于治疗或预防受试者中不希望的免疫应答，例如自身免疫性疾病、移植排斥和变态反应。因此，提供了包含新型sCD83多肽的药物组合物，以及使用该新型sCD83多肽组合物治疗自身免疫性疾病、移植排斥和变态反应的方法。

在再另一方面中，提供了在哺乳动物移植受体中改善移植结果的方法，包括向所述受体施用治疗有效量的前述sCD83多肽和一种或多种免疫抑制剂，其中该免疫抑制剂与所述多肽协同作用以改善移植结果。

序列表简述

SEQ ID NO：1表示包含信号序列的编码全长人CD83蛋白质的cDNA。

SEQ ID NO：2表示包含信号序列的编码全长人CD83蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3表示编码人CD83胞外结构域(hCD83ext)的氨基酸序列的cDNA。

SEQ ID NO：4表示人CD83胞外结构域(hCD83ext)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5表示在氨基末端还包含氨基酸残基(Gly-Ser-Pro-Gly；SEQ ID NO：41)和在羧基末端还包含跨膜结构域的第一个氨基酸(Ile)的人CD83胞外结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6表示其中在位置114的第5个半胱氨酸已突变为丝氨酸残基的SEQ ID NO：5的变体。

SEQ ID NO：7表示其中残基Xaa表示任何氨基酸的SEQ ID NO：5的变体。

SEQ ID NO：8表示GST-hCD83ext融合蛋白。GST和hCD83ext结构域通过凝血酶切割位点隔开。

SEQ ID NO：9表示还包含跨膜结构域的第一个氨基酸(Ile)的野生型hCD83胞外结构域。

SEQ ID NO：10表示编码SEQ ID NO：9的m5C2S突变体的DNA。

SEQ ID NO：11表示SEQ ID NO：9的m5C2S突变体。

SEQ ID NO：12表示编码SEQ ID NO：9的m2C2S突变体的DNA。

SEQ ID NO：13表示SEQ ID NO：9的m2C2S突变体。

SEQ ID NO：14表示编码SEQ ID NO：9的m3C2S突变体的DNA。

SEQ ID NO：15表示SEQ ID NO：9的m3C2S突变体。

SEQ ID NO：16表示编码SEQ ID NO：9的m4C2S突变体。

SEQ ID NO：17表示SEQ ID NO：9的m4C2S突变体。

SEQ ID NO：18表示编码SEQ ID NO：9的m2，3C2S突变体的DNA。

SEQ ID NO：19表示SEQ ID NO：9的m2，3C2S突变体。

SEQ ID NO：20表示编码SEQ ID NO：9的m3，4C2S突变体的DNA。

SEQ ID NO：21表示SEQ ID NO：9的m3，4C2S突变体。

SEQ ID NO：22表示编码SEQ ID NO：9的m2，5C2S突变体的DNA。

SEQ ID NO：23表示SEQ ID NO：9的m2，5C2S突变体。

SEQ ID NO：24表示编码SEQ ID NO：9的m3，5C2S突变体的DNA。

SEQ ID NO：25表示SEQ ID NO：9的m3，5C2S突变体。

SEQ ID NO：26表示编码SEQ ID NO：9的m4，5C2S突变体的DNA。

SEQ ID NO：27表示SEQ ID NO：9的m4，5C2S突变体。

SEQ ID NO：28表示编码SEQ ID NO：9的m2，3，5C2S突变体的DNA。

SEQ ID NO：29表示SEQ ID NO：9的m2，3，5C2S突变体。

SEQ ID NO：30表示编码SEQ ID NO：9的m3，4，5C2S突变体的DNA。

SEQ ID NO：31表示SEQ ID NO：9的m3，4，5C2S突变体。

SEQ ID NO：32表示用于在SEQ ID NO：9的第2个半胱氨酸上进行C2S诱变的引物。

SEQ ID NO：33表示用于在SEQ ID NO：9的第3个半胱氨酸上进行C2S诱变的引物。

SEQ ID NO：34表示用于在SEQ IDNO：9的第四个半胱氨酸上进行C2S诱变的引物。

SEQ ID NO：35表示来自Pan trogloytes(黑猩猩)的CD83蛋白质，且对应NCBI参考序列：XP_518248.2。

SEQ ID NO：36表示来自Canis lupus familiaris(狗)的CD83蛋白质，且对应NCBI参考序列：XP_852647.1。

SEQ ID NO：37表示来自Bos taurus(牛)的CD83蛋白质，且对应NCBI参考序列：NP_001040055.1。

SEQ ID NO：38表示来自Mus musculus(小鼠)的CD83蛋白质，且对应NCBI参考序列：NP_033986.1。

SEQ ID NO：39表示来自Rattus norvegicus(挪威大鼠)的CD83蛋白质，且对应NCBI参考序列：XP_341510.2。

SEQ ID NO：40表示来自Gallus gallus(红原鸡)的CD83蛋白质，且对应NCBI参考序列：XP_41829.1。

SEQ ID NO：41对应Gly-Pro-Ser-Gly。

附图说明

图1为使用选项：-maxitiers 2、通过MUSCLE版本3.6产生的蛋白质序列比对(参见Edgar RC(2004)Nucleic Acids Res 32(5)：1792-7)。NP_00424.1(SEQ ID NO：2)为人CD83蛋白质(SEQ IDNO：2)。XP_518248.2为黑猩猩CD83蛋白质(SEQ ID NO：35)。XP_852647.1为狗CD83蛋白质(SEQ ID NO：37)。NP_001040055.1为牛CD83(SEQIDNO：37)。NP_033986.1为小鼠CD83(SEQ ID NO：38)。XP_341510.2为大鼠CD83(SEQIDNO：39)。XP_41829.1为红原鸡CD83(SEQ ID NO：40)。加下划线的氨基酸残基可被任意氨基酸取代。加下划线和粗体氨基酸优选可被保守氨基酸取代。未加下划线的氨基酸残基为未取代的。

图2为质粒pGEX2ThCD83ext的示意图。

图3显示使用80(泳道2)、40(泳道3)、20(泳道4)、10(泳道5-8)或5(泳道9-13)U/mL的凝血酶在柱上进行凝血酶切割GST-hCD83ext后，被洗脱的级分的SDS-PAGE解析图。泳道7和8显示用10U/mL凝血酶消化和谷胱甘肽洗脱后获得的GST级分。泳道11-13显示用5U/mL凝血酶消化和谷胱甘肽洗脱后获得的GST级分。泳道1：分子量标记。凝血酶(Sigma)中存在的污染物蛋白质示于虚线框内。

图4A显示通过使用阴离子交换色谱法的hCD83ext的精制(polishing)步骤的典型的二峰色谱图包括两个主要的峰。图4B显示每个精制级分的SDS-PAGE分析。泳道2-5表示第一个峰，泳道6-9表示第二个峰。泳道1表示上样到阴离子交换色谱柱进行精制的GST处理后(post-GST)样品。请注意：hCD83ext在第一个峰中，而其他污染物蛋白质在第二个峰中。用硝酸银染色凝胶。

图5显示使用还原SDS-PAGE和考马斯蓝染色的不同hCD83ext样品批次的分析。蛋白质样品储存在-20℃，并在20mM Tris、50mMNaCl、50％甘油中配制，泳道3的样品不含甘油。这些批次是在几个不同的日期制成的，因此在进行分析之前已被储存不同的时间长度(即泳道2-10分别为4、3、3、2、10.5、9.5、6.5、6、6个月)。箭头指示单体的位置。此外，可以看见较高分子量的物质，可能对应多聚体形式。较低分子量形式对应降解产物，或可能通过非常规的分子内二硫键介导的修饰的单体。

图6显示使用非还原SDS-PAGE和考马斯蓝染色的不同hCD83ext样品批次的分析，且突出显示单体和二聚体的迁移。蛋白质样品储存在-20℃，并且除了不含甘油的泳道3的样品以外，在20mM Tris、50mM NaCl、50％甘油中配制。这些批次是在几个不同的日期制成的，因此在进行分析时已具有不同的“年龄”(即泳道2-10分别为4、3、3、2、10.5、9.5、6.5、6、6个月)。泳道3、6和7中的箭头突出显示几种可能通过非常规分子内二硫键介导的不常见的hCD83ext物质。

图7显示通过(A)还原SDS-PAGE、(B)非还原SDS-PAGE和(C)Western印迹法的hCD83ext样品的分析。SDS凝胶用硝酸银进行染色，以使得较高多聚合物质(如三聚体和四聚体)可见。通过Western印迹法确定所有的这些物质与hCD83ext有关。

图8为显示来自hCD83m-2，5的精制步骤的峰的AEC色谱图。

图9显示纯化的CD83m-2，5级分的还原SDS-PAGE分析。

图10显示纯化的CD83m-2，5级分的非还原SDS-PAGE分析。

图11显示使用圆二色性(CD)的CD83m-2，5的光谱分析。

图12显示CD83m-2，5的分光荧光分析。

图13显示使用圆二色性的CD83m-2的光谱分析。

图14为显示来自hCD83m-3的精制步骤的峰的AEC色谱图。

图15显示使用SDS-PAGE(图15)、CD(图16和图17)和分光荧光法(图18)对纯化的CD83m-3SDS-PAGE分析进行结构表征，结果与野生型hCD83ext和CD83m-5相似。

图16显示使用CD，对配制在20mM Tris、50mM NaCl、pH 7.5中的CD83m-3和野生型CD83(批次004-04)的光谱分析。

图17显示使用CD的CD83m-3(配制为pH 7.0或7.5)的光谱分析。

图18显示配制为7.0或7.5的CD83m-3的分光荧光分析。

图19显示单体形式的hCD83ext-m3、hCD83ext-m5和单体和二聚体形式的野生型hCD83ext的非还原SDS-PAGE分析。

图20显示单体形式的hCD83ext-m3(m3)、hCD83ext-m5(m5)和单体和二聚体形式的不同日制成的三种野生型hCD83ext制剂(004-4、007和023)的非还原SDS-PAGE分析，其经过或未经过NEM的预处理以防止二硫键的扰乱。

图21显示hCD83ext-m3、hCD83ext-m5和三种不同的野生型hCD83ext制剂的大小排阻色谱法的结果。所有的制剂均经过NEM处理，以防止二硫键的扰乱。第一个(左)峰表示二聚体，而第二个(右)峰表示单体。

图22显示hCD83ext-m3(m3)、hCD83ext-m5(m5)和三种不同的野生型hCD83ext制剂(wt 004-4、wt 007和wt 023)的还原SDS-PAGE分析。

图23显示突变单体hCD83ext-m5和两种不同的野生型hCD83ext制剂(004-4和023)的大小排阻色谱法的结果。

图24显示两种不同的hCD83ext-m5制剂(501和502)和6种不同的野生型hCD83ext制剂(007、100、021、023、80和90)的非还原SDS-PAGE分析。

图25显示不同的hCD83ext-m5和野生型hCD83ext制剂的非还原Western印迹分析。

图26显示通过产生TNFα的单核细胞的百分比或通过每个细胞产生的TNFα的平均量测量的，不同的野生型hCD83ext、hCD83ext-m3和hCD83ext-m5制剂通过LPS/IFNγ刺激的灵长类PBMC来抑制TNFα的产生的能力。

图27显示通过产生TNFα的单核细胞的百分比或通过每个细胞产生的TNFα的平均量(MFU)测量的，野生型hCD83ext、hCD83ext-m3和hCD83ext-m5(均配制为pH7.6)通过LPS/IFNγ刺激的灵长类PBMC来抑制TNFα的产生的能力。

图28显示通过产生TNFα的单核细胞的百分比或通过每个细胞产生的TNFα的平均量(MFU)测量的，野生型hCD83ext(配置为pH4.5或5.5)和hCD83ext-m5(配置为pH 7.6)通过LPS/IFNγ刺激的灵长类PBMC来抑制TNFα的产生的能力。

图29显示通过产生TNFα的单核细胞的百分比或通过每个细胞产生的TNFα的平均量(MFU)测量的，野生型hCD83ext(配置为pH4.5或5.5)或突变体形式的hCD83ext-m3(配置为pH 5.5)和hCD83ext-m5两种制剂(配置为pH 7.6)通过LPS/IFNγ刺激的灵长类PBMC来抑制TNFα的产生的能力的差异。

图30显示通过产生TNFα的单核细胞的百分比测量的，野生型hCD83ext(批次ARG-021，配制为pH 7.6)和4种单体突变hCD83ext-m3(配置为pH 4.5或5.5)通过LPS/IFNγ刺激的人PBMC来抑制TNFα的产生的能力的差异。

图31-35显示通过非还原(左泳道)和还原(右泳道)SDS-PAGE分析的pH和温度对野生型hCD83ext(批次021)的影响。

图36为显示POD140上大鼠肾脏同种异体移植的病理分级的图。中值分数：0＝正常；1＝最小改变；2＝轻度改变；3＝中等改变；4＝显著改变。

图37为显示POD140上大鼠肾脏同种异体移植的免疫组织化学分级的图。0＝正常；1＝最小改变；2＝轻度改变；3＝中等改变；4＝显著改变。

具体实施方式

本发明人已发现，可溶性CD83(sCD83)、特别是对应SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6的hCD83ext多肽在储存中失去稳定性。令人惊奇的是，据发现，hCD83ext的第3个半胱氨酸残基的突变导致提高的稳定性和类似的生物活性。该结果是意想不到的，因为如上讨论，Zinser等人(Immunobiology(2006)211：449-453)公开了hCD83ext形成同型二聚体，而hCD83ext的前4个半胱氨酸参与分子内二硫键的形成。因此，根据Zinser所述，人们将会预期，hCD83ext的前四个半胱氨酸中的每一个对维持胞外结构域的适当的构型都是关键的。意想不到的是，对这些半胱氨酸残基的突变会提高稳定性。此外，发现当在低pH下、优选在pH 4.0-5.0，最优选在pH约4.5缓冲时，还可以进一步提高稳定性。野生型sCD83蛋白质看起来是不稳定的，且对影响温度、pH、脱酰胺作用和水解的条件敏感。

表1示出了在hCD83ext的5个半胱氨酸残基中的一个或多个具有氨基酸取代的一些本发明的新型sCD83多肽。术语“不是Cys”是指半胱氨酸以外的任意标准或非标准的氨基酸。优选地，半胱氨酸残基的取代为保守取代，从而具有极性、不带电R基团的氨基酸(如丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺，和非标准氨基酸硒代半胱氨酸)取代半胱氨酸。可选地，半胱氨酸残基可以缺失，而不被取代。表1显示SEQ ID NO：7中为半胱氨酸残基的取代或缺失的潜在位点的5个氨基酸位置。SEQ ID NO：7为SEQ IDNO：5的变体，其中SEQ ID NO：5的5个半胱氨酸残基(即残基12、20、85、92和114)中的一个或多个可缺失或被可替代的氨基酸取代。

表1

SEQ ID NO：7的CD83ext变体的非限定性实例

*不是Cys＝半胱氨酸以外的任何氨基酸

**氨基酸残基12、20、85、92和114对应SEQ ID NO：7所表示的hCD83胞外结构域的第一个、第二个、第三个、第四个和第五个半胱氨酸残基的位置，其中这些残基的编号与SEQ ID NO：4相比位移了+4，这是因为在SEQ IDNO：7的N末端添加了Gly-Ser-Pro-Gly(SEQ ID NO：41)残基。

表2显示SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4-8中5个半胱氨酸残基(或可替换半胱氨酸残基的其他氨基酸残基的位置)的编号关系。编号由于存在或不存在不同的N末端融合部分而不同。例如，SEQ IDNO：2为全长hCD83序列，且包含N末端19个氨基酸的信号序列和跨膜结构域和细胞质结构域，它们在SEQ ID NO：4-8中缺失。hCD83胞外结构域的第一个氨基酸残基(Thr)为SEQ ID NO：2的氨基酸残基20。SEQ ID NO：4为hCD83蛋白质的125个氨基酸的胞外结构域，且对应SEQ ID NO：2的氨基酸残基20-144。SEQ ID NO：5-7包含融合到hCD83ext结构域(氨基酸残基5-129)的4氨基酸的N末端序列(Gly-Ser-Pro-Gly；SEQ ID NO：41)，然后是跨膜结构域的第一个氨基酸残基(氨基酸残基130的Ile)。SEQ ID NO：8包含融合到hCD83ext结构域(从氨基酸残基14-138开始)的N末端GST标签和凝血酶切割位点(氨基酸残基1-13)，然后是跨膜结构域的第一个氨基酸残基(氨基酸残基139的Ile)。

表2

不同的全长或可溶性CD83序列的半胱氨酸或Xaa残基的比对

图1显示来自人(NP_004224.1；SEQ ID NO：2)、黑猩猩(XP_518248.2；SEQ ID NO：35)、狗(XP_852647.1；SEQ ID NO：36)、牛(NP_001040055.1；SEQ  IDNO：37)、小鼠(NP_033986.1；SEQIDNO：38)、大鼠(XP_341510.2；SEQ IDNO：39)和红原鸡(XP_418929.1；SEQ IDNO：40)的CD83多肽的比对。参照图1中所示的人CD83序列，胞外结构域对应氨基酸残基20-144。加下划线的残基为在胞外结构域中出现非保守和保守氨基酸取代或缺失的位置和比对的哺乳动物CD83多肽的跨膜区的第一个氨基酸残基。加下划线粗体残基为出现保守氨基酸取代或缺失的位置。小鼠和人CD83蛋白质具有63％的序列同一性。人CD83ext多肽(例如野生型(wt)或m3)在小鼠、大鼠和非人灵长类中抑制移植排斥的能力(参见实施例)表明了CD83结构和功能在哺乳动物种类之间的保守性。

因此，一方面，提供了分离的sCD83多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或与氨基酸序列SEQ ID NO：7具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中氨基酸残基12、20、85、92和114为表1任一排中所示的氨基酸；可选地，氨基酸残基1、2、3、4和130中的一个或多个缺失。在一些实施方式中，分离的sCD83多肽基本上由或由上述氨基酸序列组成。优选地，氨基酸85为丝氨酸，且氨基酸12、20、92和114为半胱氨酸。

在另一方面，提供了sCD83多肽，其包含氨基酸序列SEQ IDNO：7或与氨基酸序列SEQ ID NO：7具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中氨基酸残基12、20、85和92中的一个或多个缺失或为半胱氨酸以外的氨基酸；且可选地，氨基酸残基1、2、3、4和130中的一个或多个缺失。优选地，氨基酸残基85为半胱氨酸以外的氨基酸，且氨基酸残基12、20、92和114为半胱氨酸。最优选地，氨基酸残基85为丝氨酸。在一些实施方式中，分离的sCD83多肽基本上由或由上述氨基酸序列组成。在优选的实施方式中，sCD83多肽由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：7的氨基酸残基1-129、SEQ ID NO：7的氨基酸残基5-129或SEQ ID NO：7的氨基酸残基5-130组成。

在一些实施方式中，分离的sCD83多肽包含选自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31的氨基酸序列；其中可选地，氨基酸残基126缺失。

本发明的新型sCD83多肽的序列与SEQ ID NO：7的序列同一性可为70％-100％。优选地，序列同一性为至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％，或至少99％。SEQ ID NO：7中的氨基酸残基可为保守或不保守取代的。优选地，取代为保守的。当SEQID NO：7的氨基酸残基12、20、85、92和114中的一个或多个不是半胱氨酸时，它们优选选自小和/或极性氨基酸的组，例如丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸，且最优选是丝氨酸。

在其他实施方式中，本发明提供了包含融合到异源多肽或氨基酸序列的本文描述的任意多肽的嵌合分子。这些嵌合分子的非限定性的例子包括在N末端或C末端融合到赋予另外的功能性、稳定性或归巢(homing)性质的氨基酸序列的本文描述的任何多肽。在一些实施方式中，本发明的sCD83多肽在N末端或C末端包含信号序列和/或用于蛋白质分离的一个或多个氨基酸序列(例如亲和性标签，如谷胱甘肽-S-转移酶、聚-His、GLAG、纤维素结合结构域、Fc结构域、Ig等)，或在蛋白加工之后可能保留的这样的序列的部分。在最终的多肽制备之前，可选地可除去为有助于纯化而添加的肽部分。作为非限定性的例子，sCD83多肽可从N末端开始包含GST标签、凝血酶切割位点和hCD83ext序列(参见例如SEQ ID NO：8)。该GST标记的融合多肽可通过结合到固定的谷胱甘肽上分离，然后用凝血酶切割。于是切割产物包含凝血酶切割位点的羧基部分(例如Gly-Ser-Pro-Gly；SEQ ID NO：41)，其融合到hCD83ext的N末端。多种亲和性标签以及它们在蛋白质纯化中使用的方法是本领域已知的。例如参见Terpe(2003)Appl.Microbiol.Biotechnol.60：523-533。

在嵌合sCD83多肽的一些实施方式中，sCD83多肽在N或C末端融合到免疫球蛋白、优选人免疫球蛋白的Ig或Fc结构域(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgGA2)。用于制备这样的融合蛋白质的方法是本领域已知的(参见例如美国专利5,428,130和EPA0464533)。嵌合sCD83-Fc或sCD83-Ig融合蛋白质可改善药物动力学性质(EPA 0232262)。

本文使用的术语“可溶性CD83”、“sCD83”和“CD83ext”是指至少包含CD83蛋白质家族成员胞外结构域的一部分的多肽，其中可溶性CD83多肽不具有能够将所述分子锚定在其表达的细胞膜上的CD83跨膜结构域。但是，可溶性CD83多肽可包含全长、天然CD83蛋白质的胞外结构域以外的另外的残基，例如足以将可溶性CD83蛋白质锚定在其表达的细胞膜上的跨膜结构域的部分。此外，本发明的sCD83多肽具有sCD83活性。

如果通过任何合适的测定其显示SEQ ID NO：5的sCD83多肽的至少一种活性，则认为sCD83多肽具有“sCD83活性”。如果在这样的测定中，其具有在同样的测定中测量的SEQ ID NO：5的sCD83多肽的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多活性，则认为sCD83多肽具有“sCD83活性”。优选地，本发明的sCD83多肽能够结合成熟的免疫刺激性树突细胞，并降低这些树突细胞刺激T细胞增殖的能力。可直接或间接评估sCD83活性，并可在体内或体外进行测量；合适的测定是本领域已知的(参见例如Kruse等人(2000)J.Virol.74：7127-7136；Lechmann等人(2001)J.Exp.Med.194：1813-1821，其公开了用于确定树突细胞与T细胞的结合和形成树突细胞-T细胞簇的优选测定)。美国专利公布20040110673(其内容通过引用方式结合到本文中)公开了用于sCD83活性的测定，例如1)在成熟混合物(cocktail)的存在下抑制不成熟DC向成熟DC的成熟；2)在与sCD83培养后成熟DC的CD80和CD83表达丧失；3)抑制成熟DC在MLR测定中刺激T细胞增殖的能力；4)抑制DC的典型簇形成和T细胞增殖，以及5)抑制小鼠中实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。该申请的实施例4公开了用于sCD83活性的测定，其通过LPS/IFNγ刺激的PBMC测量了sCD83降低TNFα的产生的能力。

因此，与适当的对照(例如如在不存在sCD83的情况下成熟的免疫刺激性树突细胞和T细胞之间的相互作用)相比，本发明的sCD83多肽可以降低成熟的免疫刺激性树突细胞刺激T细胞增殖的能力至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多。

在一些实施方式中，与适当的对照相比(例如参见Lechmann等人(2001)J.Exp.Med.194：1813-1821；WO 2004/046182；实施例4)，在成熟过程的至少一步中在可溶性CD83的存在下，本发明的sCD83蛋白质可降低在体外成熟的免疫抑制性树突细胞TNF-α、CD80和/或CD83的表达至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多。例如，向不成熟的树突细胞加入sCD83改变表面表达，从而CD83和CD83的表达降低。向成熟的树突细胞加入sCD83降低了CD83的表达，且用sCD83处理的DC丧失了它们刺激T细胞增殖的能力。以这种方式，可以说sCD83已改变了处理的细胞的免疫表型。本领域普通技术人员知道，用于分析细胞表面标记物的表达的常用的技术(例如FACS分析)有时可以产生代表混合的细胞群的数据，且应该注意识别特定的数据组中可以代表哪些群体。

根据本发明，sCD83多肽衍生物可具有含改变的侧链的一个或多个氨基酸。这样的衍生化多肽包括例如包含其中游离的氨基形成胺盐酸盐、对-甲苯磺酰基、苄氧羰基(carobenzoxy group)；游离的羧基形成盐、甲酯和乙酯；游离的羟基形成O-酰基或O-烷基衍生物和天然存在的氨基酸衍生物(例如对于脯氨酸的4-羟基脯氨酸、对于赖氨酸的5-羟基赖氨酸、对于丝氨酸的高丝氨酸、对于赖氨酸的鸟氨酸等)的氨基酸的那些多肽。还包括可以改变共价键(例如产生环化多肽的在两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键)的氨基酸衍生物。可溶性sCD83多肽及其衍生物可以具有CD83分子的天然糖基化模式或改变的糖基化模式，或可以为非糖基化的。

本发明的sCD83多肽可为sCD83多肽的单体、二聚体或多聚体。二聚化或多聚化可通过在sCD83蛋白质的单体形式内存在的半胱氨酸残基之间(例如存在于SEQ ID NO：5的位置12、20、85、92和114)形成一个或多个二硫键而实现，或通过连接sCD83多肽的单体形式内的相同或不同功能性部分(例如羧基、氨基、羟基、硫代基等)的双功能连接分子(例如二胺、二羧酸化合物等)而实现。后者还包括使用例如小的极性氨基酸残基以外的多肽连接体(例如-[(Gly)xSer]y-(其中x为例如3或4，且y为如1-5))，以产生可直接通过重组技术产生的二聚结构。在优选的实施方式中，sCD83为单体。

sCD83多肽可为CD83和衍生物的胞外结构域的至少一部分的融合蛋白质(例如参见WO 2004/046182)，只要融合蛋白保留本文所限定的一种或多种sCD83活性。在一些实施方式中，含胞外结构域以外的CD83的另外的残基的蛋白质包括在术语“可溶性CD83”内。因此，合适的衍生物包括但不局限于具有连接到C末端或N末端的附加序列的蛋白质，例如在它们的C末端携带跨膜结构域的部分或在N末端携带短肽(如Gly-Ser-Pro-Gly(SEQ ID NO：41))的蛋白质，该蛋白质可来自用凝血酶切割凝血酶位点，如作为工程化的融合蛋白质的产物；或短肽来自切割融合蛋白质之后的GST的片段，以及Ig和Fc融合蛋白。

在另一实施方式中，提供了编码本发明的sCD83多肽的分离的多核苷酸。因此，一个实施方式提供了包含编码多肽的核酸的分离的多核苷酸，该多肽可包含、由或基本由SEQ ID NO：7或与SEQ IDNO：7具有至少70％序列同一性的氨基酸组成；其中氨基酸残基12、20、85和92中的一个或多个缺失或为半胱氨酸以外的氨基酸；且可选地，氨基酸残基1、2、3、4和130中的一个或多个缺失。优选地，氨基酸残基85为半胱氨酸以外的氨基酸；氨基酸残基12、20、92和114为半胱氨酸。最优选地，氨基酸残基85为丝氨酸。优选地，序列同一性为至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％。使用遗传密码，人们可以容易地想到对应编码特定多肽的开放阅读框的所有核酸。

在再另一方面，提供了包含本发明的多核苷酸的载体以及包含该载体的细胞。该载体和细胞可用于产生本文公开的CD83ext组合物。

CD83蛋白质、核酸序列和结构是本领域已知的。人CD83cDNA的核酸序列(GenBank登录No.Z11697)如SEQ ID NO：1所示。该序列包括SEQ ID NO：1的位置11-628的编码序列(包括终止密码子)。信号序列是由SEQ IDNO：1的位置11-67编码的。编码成熟的CD83肽的序列从位置68延伸到位置625。限制性内切酶识别位点存在于SEQ ID NO：1的开始和结尾(在位置1-6和位置1755-1760)。人CD83的氨基酸序列(如GenBank登录No.Q01151所示，且由SEQID NO：1所示的核酸序列编码)如SEQ ID NO：2所示。其他人CD83序列可在Genbank登录No：NP_001035370[CD83抗原同种型b，人类：SEQ ID NO：2]；NP_004224[CD83抗原同种型a，人类]；EAW55353[CD83抗原同种型CRA_c人类]；EAW55352[CD83抗原同种型CRA_b人类]；EAW55351CD83抗原同种型CRA_a，人类]获得。可以比对这样的序列以确定保守结构域。

来自其他有机体的CD83可在以下GenBank登录No获得：ABC68619[大西洋鲑(Salmo salar)]；CAB63843和NP_033986.1(SEQ ID NO：38[小家鼠]；ABM67085[金头鲷(Sparus aurata)]；AAP93912[虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)]；AAO62993[绞口鲨(Ginglymostoma cirratum)]；NP_001040055[牛(Bos taurus)；SEQ IDNO：37]；XP_518248[黑猩猩；SEQ ID NO：35]；XP_001093364[恒河猴(Macaca mulatta)]；XP_418929[原鸡(Gallus gallus)；SEQ IDNO：40]；NP_001101880和XP_341510.2[大鼠(Rattus norvegicus)；SEQ ID NO：39]；AAZ06133[金仓鼠(Mesocricetus auratus)]；ACC60995[土拨鼠(Marmota monax)]和XP_852647[家犬(Canisfamiliaris)；SEQ ID NO：36]。

CD83蛋白家族的其他成员可以通过将包含例如编码细胞外部分的所有或部分人CD83编码区的核酸与来自其他动物(例如哺乳动物)或来自相同有机体的其他组织的核酸(例如基因组DNA、cDNA或RNA)的不同来源进行杂交而获得。编码sCD83多肽的其他的多核苷酸可通过已知的和/或分离的sCD83多核苷酸的体外或体内突变制成，或者这样的多核苷酸序列可在体外合成。

一旦编码天然存在的CD83蛋白质的核酸已被测序，则可通过对比已知的CD83分子的胞外结构域和克隆的CD83序列的胞外结构域来确定胞外结构域。然后可通过使用本文描述的技术来重组表达特定的天然存在的CD83蛋白质的可溶形式。例如，通过使用本文描述的以及本领域已知的公知技术(Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，1989)，编码本发明的可溶性CD83的核酸可以产生、插入载体中，并转化到原核或真核宿主细胞中。

编码根据本发明使用的可溶形式的CD83蛋白家族成员的目的核酸可被插入表达载体用于体外表达(例如使用体外转录/翻译测定或商业可获得的试剂盒)，或可被插入包含启动子序列的表达载体中，该启动子序列通过将表达载体转移至合适的细胞而有助于在原核或真核中转录和/或翻译。术语“载体”是指通过插入或引入多核苷酸可被操作的质粒、病毒或本领域已知的其他载体。这样的载体可用于遗传学操作(即“克隆载体”)或可用于转录或翻译被插入的多核苷酸(“表达载体”)。载体通常至少包含用于在细胞内繁殖的复制起点和启动子。包括在表达载体中存在的控制元件，包括本文所示的表达控制元件，以有助于适当的转录和翻译(例如用于内含子的剪接信号，维持正确的基因读框以允许mRNA的框内翻译和终止密码子等)。术语“控制元件”意图最少包括其存在可影响表达的一个或多个组件，还包括附加的组件，例如先导序列和融合伴侣序列。

在其中载体可以繁殖且其核酸可被转录或编码的多肽被表达的细胞，在本文中被称为“宿主细胞”。该术语还包括受试者宿主细胞的任何后代。此外，根据本发明的目的核酸可被插入用于体细胞基因治疗的体内表达的表达载体。使用这些载体(例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关的病毒载体、质粒表达载体)，本发明的核酸在感染/引入载体到DC后被表达。

宿主细胞包括但不限于微生物，例如细菌、酵母、昆虫和哺乳动物有机体。在优选的实施方式中，宿主细胞为大肠杆菌。例如，用重组噬菌体核酸、含目的核酸的质粒核酸或粘粒核酸表达载体转化的细菌；用含目的核酸的重组酵母表达载体转化的酵母；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含目的核酸的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；用含目的核酸的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；或用含目的核酸的重组病毒表达载体(例如逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒)感染的动物细胞系统，或被工程化以用于稳定表达的转化的动物细胞系统。

为了在宿主细胞中长期表达可溶形式的CD83蛋白家族成员，稳定的表达是优选的。因此，例如使用包含病毒复制起点的表达载体，细胞可以用由合适的控制元件(例如启动子/增强子序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的目的核酸转化。可选地，表达载体还包含编码对选择性压力产生抗性的可选择的或可识别的标记物的核酸，从而允许具有该载体的细胞能被识别、生长和扩增。可选地，可选择性标记物可在第二载体上，该第二载体与含本发明的多核苷酸的第一载体共转染到宿主细胞中。

可以使用多个选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶基因、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因可分别在tk、hgprt或aprt细胞中使用。此外，抗代谢物抗性可用作选择如下基因的基础：提供对氨甲喋呤的抗性的dhfr；提供对霉酚酸的抗性的gpt基因；提供对氨基糖苷G-418的抗性的新霉素基因；和提供对潮霉素的抗性的潮霉素基因。还描述了其他可选择性基因：即允许细胞使用吲哚替代色氨酸的trpB；允许细胞使用组氨醇(histinol)替代组氨酸的hisD；和提供对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸DFMO的抗性的ODC(鸟氨酸脱羧酶)。

用编码本发明的sCD83多肽的核酸转化原核和真核细胞的方法是本领域普通技术人员已知的。转化以后，可根据常规方法分离和纯化可溶形式的CD83。用于产生、纯化和操作不同的蛋白质及其衍生物和编码它们的核酸的方法是本领域已知的。参见例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory，N.Y.)；还参见美国专利No.7,169,898；美国专利申请No.10/382,397；和美国专利申请No.10/535,522。例如，从表达宿主(例如细菌)制备的裂解产物可使用HPLC、大小排阻色谱法、凝胶电泳、亲和色谱法或其他纯化技术进行制备。通过使用肽合成仪(例如Applied Biosystems，Inc.，Foster City，Calif；型号430A等)的化学合成也可获得基本纯的蛋白质。

sCD83制剂

CD83ext组合物可与合适的药学上可接受的佐剂和/或载体一起进行加工，以提供适于不同适应症和给药途径类型的药物形式。合适的药物组合物可包括载体、任意合适的生理溶液或分散剂等、增溶剂、佐剂、稳定剂、防腐剂、缓释制剂等。生理溶液包括任何可接受的溶液或分散介质，例如盐水或缓冲盐水。载体还可包括抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。除非任何常规介质、载体或试剂与活性成分不相容，可以想到使用它们。载体还进一步包括一种或多种附加化合物，包括但不限于细胞因子，例如白细胞介素-10(IL-10)和TGF-β。这样的制剂的例子和它们的制备方法是本领域已知的(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th ed.(1985)Mack Pub.Co.，Easton，PA，美国)。

PCT公布WO2004/046182描述了配制在磷酸缓冲盐水(PBS)、pH7.6中的纯化的hCD83ext野生型和hCD83m-5多肽(分别具有SEQID No：5和SEQ ID No：6)。但是，如本文所公开的，当配制在较低pH时，CD83ext及其变体具有更好的稳定性。例如，纯化的hCD83ext多肽如SEQ ID NO：5的多肽，当根据实施例1描述的方法进行第一次纯化时，其主要是单体形式。在pH 7.3-7.6的PBS中储存后，蛋白质逐渐二聚化，且丧失生物活性。相反，在较低pH下储存的hCD83ext不会经受相同的活性丧失。令人惊奇的是，CD83ext-m5(SEQ ID NO：6)相比野生型对应物(SEQ ID NO：5)对高pH的敏感性较低。

因此，提供了药物组合物，其包含：CD83ext多肽和pH 4.0-5.0的生理学上可接受的缓冲液。优选地，pH为4.3-4.7。最优选地，pH为约4.5。在优选的实施方式中，CD83ext多肽为SEQ ID NO：4、5、6或7的多肽。优选地，缓冲液为醋酸盐缓冲液，最优选地为20mM、pH～4.5的醋酸盐缓冲液。

申请人还发现，通过在含海藻糖的组合物中进行配制，hCD83ext的稳定性和生物活性提高。因此，提供了包含配制在1-15％(w/v)海藻糖中的sCD83多肽的组合物。优选地，存在的海藻糖为约5-12％w/v，最优选为约10％w/v。

在一些实施方式中，本发明的sCD83组合物可进一步包含一种或多种赋形剂，例如但不限于缓冲液、盐、表面活性剂、多元醇(poly-alcohol)、多价金属糖、粘度调节剂、抗氧化剂和冷冻保护剂及其组合。这样的赋形剂包括但不限于甘氨酸、组氨酸、Fe(3+)、Mg(2+)、抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、EDTA和精氨酸加上谷氨酸的组合。

在优选的实施方式中，CD83ext多肽在20mM的醋酸盐缓冲液pH 4.5、10％w/v海藻糖、0.5％w/v抗坏血酸和可选的50mM精氨酸加上50mM谷氨酸中配制为1.5-2.5(优选2.0)mg/mL，且冷冻储存(优选在约-20℃)。这样的制剂在多次冷冻融化循环后依旧稳定，且适于向受试者施用。所有优选的赋形剂存在于FDA非活性成分列表中或存在于批准的静脉药物产品中。

可以使用任何施用途径，包括但不限于透皮、皮内(i.e.)、腹膜内(i.p.)、皮下(s.c)、肌肉内(i.m.)、静脉内(i.v.)、节间(i.n.)等可被选择用于递送CD83ext及其衍生物。优选地，CD83ext经i.v.施用。本领域普通技术人员知道，不同的施用形式适于不同的化合物和/或适应症，且能够选择最适宜的施用方法。例如，牛皮癣可用适于皮肤施用的制剂进行局部治疗，而系统性红斑狼疮可通过向受试者施用适于腹膜内注射的制剂来治疗。具有本领域普通技术的医生熟悉调节剂量和施用化合物的标准和方法，例如评估来自常规临床和实验室测试的结果，包括生物化学和免疫学测定。当合适的情况下，可以分开施用药物的组分。

对于治疗或预防用途，将本发明的化合物单独或与其他免疫调节化合物(例如耐受诱导抗原、环孢菌素A、FK506加上MMF、雷帕霉素加上CD45R.B、皮质类固醇等)组合施用到受试者中，优选哺乳动物，更优选人类患者，用于以适于医疗适应症的方式进行治疗或预防。

在一些实施方式中，通过向受试者提供编码sCD83蛋白质的核酸，将sCD83施用给受试者。例如，sCD83可作为编码SEQ ID NO：7的sCD83多肽的DNA或mRNA被施用给受试者。同样，在一些实施方式中，通过用编码sCD83蛋白质的核酸转化宿主细胞(即细胞)，在体外或体内向细胞提供sCD83；然后，转化的宿主细胞可表达sCD83蛋白质，从而向其他细胞和自己(即转化的宿主细胞)提供sCD83蛋白质。在这样的实施方式中，合适的宿主细胞包括树突细胞。在其中sCD83被作为编码CD83蛋白质的核酸提供的实施方式中，术语“sCD83”还可以指编码sCD83蛋白质的核酸。可以使用任何合适的核酸，包括DNA、RNA或合成核酸，只要其编码CD83蛋白质即可。核酸可以在用于表达编码的蛋白质或蛋白质片段的合适的载体中提供。合适的载体和用于制备它们的方法是本领域已知的。

sCD83的治疗用途

本文公开的sCD83组合物适于预防、治疗、降低和/或减轻由免疫应答的功能障碍或不希望的功能而引起的疾病或紊乱的至少一种症状。例如，SEQ ID NO：5的hCD83ext多肽已在多种动物模型中评估过。使用实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型(用于人类多发性硬化症的模型)，sCD83可在预先治疗和活性治疗情况下抑制麻痹。近期数据还显示，sCD83能够延长小鼠的心脏和皮肤移植的存活时间，且当与亚治疗剂量的良好表征的免疫抑制剂组合使用时，sCD83能够在鼠科心脏移植模型中导致长期的移植存活时间。实验室数据还表明，sCD83可以在1型小鼠模型中抑制糖尿病的发作。此外，可获得的结果表明，用sCD83治疗不会造成全身免疫抑制。本文的实施例证明，SEQ ID NO：7的CD83ext多肽(其中氨基酸残基1、2、3、4和130存在，氨基酸残基85为Ser，且氨基酸残基12、20、92和114为Cys)在哺乳动物心脏和肾脏移植模型中对预防移植排斥有效。

因此，一些实施方式提供用于治疗或预防受试者中由免疫应答的功能障碍或不希望的功能而导致的疾病或紊乱的至少一种症状的方法，包括向所述受试者使用本发明的sCD83多肽。免疫应答的功能障碍或不希望的功能包括自身免疫性疾病、移植排斥、移植物抗宿主疾病和变态反应。可使用本发明的新型sCD83多肽治疗的自身免疫性疾病包括但不限于系统性红斑狼疮、自身免疫性(1型)糖尿病、天疱疮、格雷夫斯病(Grave′s disease)、桥本甲状腺炎、重症肌无力、自体心肌炎(automyocarditis)、多发性硬化症、类风湿性关节炎、牛皮癣、自身免疫性葡萄膜视网膜炎(uveoretinitis)、血管炎、慢性炎性肠病如克罗恩病(Crohn′s disease)或溃疡性结肠炎、HLA B27-相关的自身免疫病(autoimmunopathies)如白赫铁列夫症(Morbus Bechterew)、阻塞性肺病(COPD)、强直性脊柱炎和AIDS。

因此，本发明的可溶性CD83多肽和/或编码该sCD83多肽的核酸可用于制备用于治疗或预防由免疫应答的功能障碍或不希望的功能引起的疾病或医疗状况的药物。例如，这样的药物可用于预防或治疗自身免疫性疾病、变态反应、哮喘、组织或器官移植排斥或对治疗组合物的不希望的免疫应答，从而不希望的免疫应答被抑制。

在一些实施方式中，针对治疗组合物产生了不希望的免疫应答，本发明的目的为使受试者对这样的治疗组合物耐受化(tolerize)。如果这些目的中的至少一个实现的话，受试者被认为是耐受化的(tolerized)和/或已被免疫抑制的(即被认为已诱导或获得了免疫耐受性)。

本文所使用的诱导“免疫抑制”或“耐受化”的受试者是指与未治疗的对照或其他适当的对照相比(例如与治疗前的症状或与未经治疗的预期的症状严重程度相比，如果治疗旨在防止免疫应答的发展或减轻其严重程度)，涉及树突细胞、B细胞或T细胞的由免疫应答的功能障碍或不希望的功能引起的疾病或紊乱的至少一种症状被防止、治愈、降低或减轻。本领域普通技术人员熟悉测量和评估症状的方法的选择和应用，以及适当的对照的选择。

因此，当与适当的对照相比，由免疫应答的功能障碍或不希望的功能引起的疾病或紊乱的至少一种症状降低或减轻至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％时，受试者被认为耐受化和/或免疫抑制被认为已经发生。在治疗意图降低受试者发展自身免疫性紊乱的风险的实施方式中，该风险与适当的对照相比降低或减轻至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％；该评估可在受试者群体中统计学地进行。在其中治疗意图使受试者对治疗组合物耐受化的实施方式中，与适当的对照相比，免疫应答的不希望的功能降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。在其他实施方式中，本发明的目的包括产生致耐受性的树突细胞；在这些实施方式中，“症状”是指体内或体外的细胞行为的参数。

本发明的方法用于治疗目的，因此意图预防、治愈或减轻免疫应答的功能障碍或不希望的功能引起的疾病或紊乱的至少一种症状。当治疗意图是预防性时，如果与适当的对照相比(如与治疗之前的症状相比或与症状的预期严重性相比)，症状适当地降低、增加或改善至少10％、20％、30％、40％、50％、70％、90％或更多，则该疾病或紊乱的症状被认为是降低或减轻。本领域普通技术人员熟悉用于评估症状改变的技术和标准。由免疫应答的功能障碍或不希望的功能引起的疾病或紊乱的症状是本领域已知的，并包括如下：移植组织的异常组织学；移植组织的异常功能；事件例如诊断或移植之后存活时间的短暂长度；血液中指示蛋白质或其他化合物的异常或不希望地高或低的水平或数目，例如不希望的抗体或不希望的细胞(例如抗原特异性树突细胞或T细胞)；血液中或身体其他部分中指示细胞的异常或不希望地高或低的水平或数目(例如不希望地低水平或数目的调控T细胞)，从而不希望的免疫应答开始或维持。

当合适的时候，体内耐受化或耐受性和/或免疫抑制可使用体外测定进行测量，例如，使用从受试者分离的细胞的混合淋巴细胞反应。类似地，离体细胞中获得的耐受化或耐受性和/或免疫抑制也可使用不同类型的细胞(例如树突细胞、T细胞或B细胞)在体外测定中测量。如果使用体外方法测量耐受化或耐受性和/或免疫抑制，则如果与适当的对照相比，细胞对免疫刺激物的应答降低至少10％、20％、30％、40％、50％、70％、90％或更多时，被认为发生耐受化或耐受性。合适的测定直接或间接测量免疫应答，且是本领域已知的；它们包括但不限于：混合淋巴细胞反应测定；细胞毒性测定；抗体效价测定；IL-10的产生的测定；TGF-β的产生的测定；细胞表面标记物的评价；和Foxp3的表达的测定。

本发明的sCD83蛋白质可与其他免疫抑制性化合物共施用。术语“免疫抑制化合物”是指能够损害淋巴细胞T和/或B克隆群的大小的化合物，或能够抑制它们的反应性、扩增或分化的化合物。本发明方法中使用的免疫抑制性化合物包括但不限于：神经钙蛋白抑制剂，包括环孢菌素(也称为“CsA”，商品名为

或

)和他克莫司(也称为“FK.506”，商品名为

)；嘌呤代谢抑制剂，如吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil)(也称为“MMF”，商品名为

)和咪唑硫嘌呤(商品名为

或

)；增殖抑制剂如依维莫司(商品名为)和西罗莫司(也称为“雷帕霉素”或“Rapa”，商品名为

)；单克隆抗体(“mAb”)，如抗-CD45和抗-CD45RB(参考如美国专利No.7,160,987)；针对T细胞的单克隆抗体，如OKT3；针对IL-2受体的单克隆抗体，包括人源化抗-TaT抗体，如巴利昔单抗和达珠单抗；阻断T细胞共刺激性通路的物质，例如CTLA-4-Igl融合蛋白；能够诱导嵌合性(即供体和受体免疫细胞的共存，其中移植组织被识别为自身的)的物质；和非清髓性(non-myeloblative)移植前处理，如环磷酰胺(商品名

)。对于免疫抑制性和它们的靶点的讨论，参见例如Stepkowski(2000)Expert Rev.Mol.Med.June 21，2000：1-23。

物质的“有效量”是指当根据本发明的方法向受试者施用时，该量至少足以实现本发明的至少一个目的。因此，例如，当向受试者共同施用CD83时，治疗组合物的“有效量”至少足以使受试者对治疗组合物耐受化，或对由免疫应答的功能障碍或不希望的功能引起的疾病或紊乱的至少一种症状产生可测量的效果。免疫抑制性sCD83化合物的有效量可根据个体受试者显示的症状确定，或其可从临床研究确定或从模型系统中的适当的研究推断。因此，例如，免疫抑制性sCD83化合物的有效量包括预期对疾病或紊乱的至少一种症状产生可测量的效果的量，其是基于使用本发明的方法在临床研究中确定的剂量范围。

有效的量可以一种或多种给药、应用或剂量施用。合适的给药、应用和剂量根据多种因素而不同，包括但不限于：组合物的特定活性；组合物的配方；待治疗的受试者的体重、年龄、健康、疾病和状况；向受试者施用组合物的途径。在一些情况下，有效量需要的sCD83的最小量可能由于在患者中存在预先存在的可溶性CD83而降低(参见例如Hock等人(2006)(Tissue Antigens 67：57-60))；本领域普通技术人员能够容易地调节剂量和给药等，以获得最好的结果。例如，可向患者施用的sCD83的范围为：下限为0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、7、10、20、50、70、100、200、500或700mg/kg，或1、2、5、7、10、20、50或100g/kg；和上限为0.05、0.1、0.5、1、2、5、7、10、20、50、70、100、200、500或700mg/kg，或1、2、5、7、10、20、50、100或200g/kg。

由于为了治疗目的，受试者可以通过CD83对外源性化合物耐受化，重要的是受试者至少在治疗期间，或至少在CD83有效性的窗口内，不会接触不希望对其耐受化的化合物。因此，例如，受试者应该不接触肿瘤特异性抗原和引发疾病的微生物，包括病毒、细菌、霉菌等。一般而言，如本文所使用的，“受试者”是指任何需要治疗的动物。因此，例如，“受试者”可为人类患者或非人类哺乳动物患者，或可为另一动物患者。当需要预防疾病或医疗状况时，受试者可在不定期的间隔(例如大约每两年、每年、每6个月、每2-4个月或每个月)进行治疗。但是，在本发明的所有的实施方式中，本发明的方法和组合物施用至已确定具有由免疫应答的功能障碍或不希望的功能引起的特定的疾病或紊乱的受试者，或已确定为有可能发展特定的疾病或紊乱的受试者。例如，作为检查受试者家族史、医疗测试如遗传测试或确定受试者的酶或代谢物水平的测试，或被诊断为另一疾病或紊乱的结果，受试者可被确定为有可能发展这样的特定的疾病或紊乱。以这种方式，例如，本发明的方法可用于治疗自身免疫性疾病，以防止自身免疫性疾病的发展或降低受试者发展自身免疫性疾病的风险。一般而言，当受试者不再接受治疗以减轻或防止由免疫应答的功能障碍或不希望的功能引起的特定的疾病或医疗状况时，治疗过程结束。因此，本发明提供了治疗或预防由免疫应答的功能障碍、不希望的免疫应答或不希望的功能引起的特定的疾病或医疗状况的方法，其中向受试者施用有效量的sCD83，从而获得免疫抑制。在另一实施方式中，不希望的免疫应答选自自身免疫性疾病、移植排斥和变态反应。这样的方法可进一步包括施用以下一种或多种：环孢菌素A(CsA)；雷帕霉素加上抗-CD45RB单克隆抗体；和他克莫司(FK506)加上吗替麦考酚酯(MMF)。

在优选的实施方式中，自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、1型糖尿病、天疱疮、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、重症肌无力、自体心肌炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、牛皮癣、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、血管炎、慢性炎性肠病、克罗恩病或溃疡性结肠炎、白赫铁列夫症、强直性脊柱炎和慢性阻塞性肺病(COPD)。

在一些实施方式中，提供了本发明的新型sCD83多肽在制备用于治疗或预防哺乳动物受试者中不希望的免疫应答的药物中的应用。

在另一方面，提供了用于改善哺乳动物移植受体中移植结果的方法，包括向所述受体施用治疗有效量的权利要求1-10中任一项所述的多肽和一种或多种免疫抑制剂，其中该免疫抑制剂与所述多肽协同作用以改善移植结果。在一个实施方式中，所述免疫抑制剂为环孢菌素A。在另一个实施方式中，所述免疫抑制剂为雷帕霉素加上抗-CD45RB单克隆抗体；或他克莫司(FK506)加上吗替麦考酚酯(MMF)。

可以使用本发明的方法，以治疗由或可由免疫应答的功能障碍或不希望的功能引起的疾病或紊乱所影响的受试者，所述疾病或紊乱例如是变态反应；哮喘；组织移植的排斥；对慢性施用物质的免疫应答；自身免疫性疾病如重症肌无力、多发性硬化症、血管炎、慢性炎性肠病如克罗恩病或溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、皮肤疾病如牛皮癣、类风湿性关节炎和胰岛素依赖性糖尿病；和AIDS。本发明的方法可用于治疗受涉及B细胞或B细胞功能的疾病或紊乱困扰的受试者，例如：B细胞增生如白血病(包括多发性骨髓瘤和急性成淋巴细胞白血病)；与AIDS相关的B细胞活性过度；中毒性休克综合征；血清病；和牙周病(参见例如Mahanonda等人(2002)J.Periodontal Res.37：177-183)。血清病是一组由对某些药物或抗血清的不希望的免疫应答引起的症状。也就是说，当来自另一动物或人类的抗血清被给予受试者以试图诱导被动免疫时，可引起血清病。在一些实施方式中，本发明的方法提供涉及B细胞或B细胞功能的疾病或紊乱的治疗，其中该治疗不会导致受试者中的B细胞排除，即B细胞数目和/或亚型的减少。

因此，在一些实施方式中，本发明的方法用于预防、治愈或减轻组织受体中组织移植排斥的至少一种症状。在这样的实施方式中，可用sCD83和可选的与移植组织相关的抗原治疗移植受体(“受体”或受试者)，该抗原例如是通过例如裂解或均化移植组织的样品，从移植的组织制备或提取的抗原。一般而言，根据本发明的方法的移植受体的治疗可包括在移植组织之前、联合(即同时)，和/或之后进行的治疗。在一些实施方式中，本发明的方法预防、治愈或减轻组织移植排斥的所有不利症状，从而使得不必连续治疗移植受试者以防止排斥；在这样的实施方式中，被认为已在受试者中诱导了移植耐受性。

在一些实施方式中，在取出用于在目的受体中移植的组织之前，可用sCD83处理待移植组织的供体(“移植供体”)，其中治疗的目的在于在移植受体中诱导耐受性和/或免疫抑制。在一些实施方式中，移植供体和移植受体两者均可使用本发明的方法处理。

本文所述的“组织”包括分散的器官和/或特化的组织(例如肝、肾、心脏、肺、皮肤、胰岛等)以及“液体”组织(例如血液、血液成分如血浆、细胞如树突细胞等)；术语“组织”还包括分散器官和“液体”组织的部分和亚部分。

本领域普通技术人员熟悉评估和处理移植受体和供体的方法，以获得对于受体和供体两者均为最佳的可能的结果。因此，本领域普通技术人员能够容易地评估和调节适于特定受试者的CD83、至少一种其他免疫抑制性化合物和可选的治疗组合物的剂量和用药。从上面的讨论可以容易地看出，本发明的方法包括多个步骤；这些步骤可以任意顺序进行，只要本发明的至少一个目的能够实现即可。因为该方法可能涉及多种化合物的多次施用，还有可能出现步骤的一些重叠。

本发明提供的治疗方法包括施用CD83和至少一种其他免疫抑制性化合物，以在受试者体内诱导耐受性和/或免疫抑制。向受试者施用这些物质的方式包括但不限于常规和生理学可接受的途径，例如口服、经肺部、肠胃外(例如肌肉内、关节内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、吸入(经过细粉制剂或细雾(气溶剂))、透皮、皮内、鼻腔、阴道、直肠或舌下施用途径。

当药物组合物包含用于向某些种类的动物施用的核酸时，本发明中使用的核酸可来自该种类。例如，当向人类使用包含编码sCD83的核酸(例如DNA或RNA)的药物组合物时，该核酸可编码包含SEQ ID NO：7的sCD83或与SEQ ID NO：7具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列的多肽。本发明中使用的核酸可与增加细胞膜透过性和/或核酸的细胞吸收的试剂共同使用。这些试剂的例子为如Antony等人(1999)Biochemistry 38：10775-10784描述的聚胺；如Escriou等人(1998)Biochem.Biophys.Acta 1368：276-288描述的支链聚胺；如Guy-Caffey等人(1995)J.Biol.Chem.270：31391-31396描述的聚氨基脂质；如Feigner等人(1987)Proc.Nat′1.Acad.Sci.USA 84：7413-7417描述的DOTMA和如Benimetskaya等人(1998)Nucl.AcidsRes.26(23)：5310-5317描述的阳离子卟啉。

定义

如说明书和权利要求书所使用的，单数形式的“一(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数含义，除非上下文清楚表明不含复数含义。例如，术语“一种细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

如本文所使用的，术语“包括”意图指：组合物和方法包括所述元素，但不排除还有其他元素。当使用“基本由......组成”来限定组合物和方法时，应该指排除与所述组合具有任何根本显著性的其他元素。因此，基本由如本文所限定的元素组成的组合物将不会排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载体，例如磷酸缓冲盐水、防腐剂等。“基本由特定的氨基酸序列组成的”多肽或蛋白质在此被定义为在特定的氨基酸序列的N末端或C末端包含0-10个附加的氨基酸。优选地，它们在蛋白质或多肽的氨基和/或羧基末端包含不多于5个、优选不多于2个、且最优选不多于1个附加的氨基酸。“基本由特定的核酸序列组成的”核酸或多核苷酸在此被定义为在核酸序列的5’或3’末端包含不多于30个、优选不多于6个、更优选不多于3个和最优选不多于1个附加的核苷酸。“由......组成”应指排除痕量的其他成分和用于施用本发明组合物的基本方法步骤之外的其他元素。实施方式由这些连接词的每一个限定。

术语“树突细胞(DC)”是指在多种淋巴组织和非淋巴组织中发现的形态学上类似的细胞类型的不同群体，Steinman(1991)Ann.Rev.Immunol.9：271-296。树突细胞构成了有机体中最有效的和最优选的APC。尽管树突细胞可从单核细胞分化，但是它们具有截然不同的表型。例如，特定的分化标记物CD14抗原在树突细胞中未发现，但是在单核细胞中存在。此外，成熟的树突细胞并不是吞噬性的，而单核细胞为强吞噬性细胞。已显示，成熟的DC可以提供T细胞激活和增殖所需的所有信号。

“免疫应答”广义指淋巴细胞对外源物质的抗原特异性响应。可引发免疫应答的任何物质被认为是“免疫原性的”，且被称为“免疫原”。所有的免疫原都是抗原；但是，并不是所有的抗原都是免疫原性的。本发明的免疫应答可为体液的(通过抗体活性)或细胞介导的(通过T细胞激活)。

如本文所使用的，“保守氨基酸置换”是指将一个氨基酸置换为在相同氨基酸组内的另一氨基酸。根据它们的R基团可以将氨基酸分类如下：1)非极性的、脂肪族的R基团；2)极性的、不带电荷的R基团；3)芳香族的R基团；4)带正电荷的R基团；和5)带负电荷的R基团。具有非极性的、脂肪族的R基团的氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸。具有极性的、不带电荷的R基团的氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。具有芳香族的R基团的氨基酸包括苯丙氨酸和酪氨酸。具有带正电荷的R基团的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。具有带负电荷的R基团的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互换使用，是指任意长度的核苷酸的多聚化形式。多核苷酸可包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸，和/或它们的类似物。核苷酸可具有任意的三维结构，且可行使任意已知的或未知的功能。术语“多核苷酸”包括例如单链、双链和三股螺旋分子、基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离的DNA、任意序列的分离的RNA、核酸探针和引物。除了天然核酸分子以外，本发明的核酸分子还可包括修饰的核酸分子。如本文所使用的，mRNA是指可在细胞中翻译的RNA。

术语“肽”最广义地指两个或更多个亚单元氨基酸、氨基酸类似物或拟肽的化合物。亚单元可通过肽键连接。在另一实施方式中，亚单元可通过其他键如酯、醚等连接。如本文所使用的，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D和L光学异构体两者、氨基酸类似物和拟肽。如果肽链短的话，三个或更多个氨基酸的肽通常被称为寡肽。如果肽链长的话，肽通常被称为多肽或蛋白质。

“基因递送载体”被定义为能够将插入的多核苷酸载入宿主细胞的任意分子。基因递送载体的例子为脂质体、生物相容性聚合物，包括天然聚合物和合成的聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；金属颗粒；和细菌或病毒，如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒、噬菌体、粘粒、质粒、真菌载体和本领域中通常使用的其他重组载体，它们已被描述在多种真核和原核宿主中表达，并可用于基因疗法和简单的蛋白质表达。

如本文所使用的术语“基因递送”、“基因转移”、“转染”等是指将外源多核苷酸导入宿主细胞，不考虑导入所使用的方法。转染是指将任意核酸递送到细胞的内部。基因递送是指递送可整合入宿主细胞基因组中的核酸，或可独立于宿主细胞基因组复制的核酸。基因递送或基因转移不指将mRNA导入细胞。转染方法包括多种技术，例如电穿孔、基于蛋白质的、基于脂质的和基于阳离子的核酸递送复合物、病毒载体、“基因枪”递送和本领域普通技术人员已知的其他各种技术。导入的多核苷酸可在宿主细胞中稳定地维持，或可暂时地表达。在一些实施方式中，编码sCD83多肽的mRNA被导入细胞，且暂时地表达。稳定的维持通常需要导入的多核苷酸或包含与宿主细胞兼容的复制起点，或整合入宿主细胞的复制子例如染色体外复制子(例如质粒)或核或线粒体染色体。如本领域已知的和本文所描述的多种载体能够介导将基因转移到哺乳动物细胞中。

“病毒载体”被定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，其包含在体内、离体或体外待转运到宿主细胞的多核苷酸。病毒载体的例子包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、α病毒载体等。α病毒载体，如基于西门利克森林病毒的载体和基于辛德毕斯病毒载体，已被研发用于基因疗法和免疫疗法。参见Schlesinger andDubensky(1999)Curr.Opin.Biotechnol.5：434-439和Zaks等人(1999)Nat.Med.7：823-827。在基因转移由逆转录病毒载体介导的方案中，载体构建体是指含逆转录病毒基因组或其部分和治疗性基因的多核苷酸。如本文所使用的，“逆转录病毒介导的基因转移”或“逆转录病毒转导”具有相同的含义，是指通过进入细胞并将其基因组整合到宿主细胞基因组的病毒，基因或核酸序列被稳定地转移到宿主细胞中的过程。病毒可通过其感染的正常机理进入宿主细胞，或可被修饰，从而其结合不同的宿主细胞表面受体或配体以进入细胞。如本文所使用的，“逆转录病毒载体”是指能够通过病毒或病毒样进入机理将外源核酸导入细胞的病毒颗粒。

逆转录病毒携带它们的RNA形式的遗传信息；但是，一旦病毒感染细胞，RNA即被逆转录为被整合到感染细胞的基因组DNA中的DNA形式。整合的DNA形式被称为原病毒。在基因转移由DNA病毒载体(例如腺病毒(Ad)、假腺病毒或腺相关病毒(MV))介导的方案中，载体构建体是指含病毒基因组或其部分和转基因的多核苷酸。腺病毒(Ad)为相对较好表征的、均一的病毒组，包括超过50种血清型。(参见如WO 95/27071)。Ad容易生长，且不需要整合到宿主细胞的基因组中。也已构建了重组Ad衍生的载体、特别是降低重组和产生野生型病毒的可能性的那些载体。(参见WO95/00655和WO 95/11984)。野生型MV在整合到宿主细胞基因组时具有高感染性和特异性。(参见Hermonat和Muzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6466-6470和Lebkowski等人(1988)Mol.Cell.Biol.8：3988-3996)。

含有启动子和多核苷酸可操作地连接的克隆位点两者的载体是本领域已知的。这样的载体能够在体外或体内转录RNA，且可从例如Stratagene(La Jolla，CA)和Promega Biotech(Madison，W1)来源商购。为了优化表达和/或体外转录，有可能需要除去、添加或改变克隆的5′和/或3′非翻译部分，以除去在转录或翻译水平上可能干扰或降低表达的、多余的、潜在的、不适当的、可替代的翻译起始密码子或其他序列。可选地，共有核糖体结合位点可以紧接着起始密码子的5′端插入，以提高表达。

基因递送载体还包括几种非病毒载体，包括DNA/脂质体复合物和靶向的病毒蛋白质-DNA复合物。还包含靶向抗体或其片段的脂质体可用在本发明的方法中。为了增强向细胞的递送，本发明的核酸或蛋白质可与结合细胞表面抗原(例如TCR、CD3或CD4)的抗体或其结合片段偶联。

“杂交”是指其中一种或多种多核苷酸反应以形成通过核苷酸残基的碱基之间的氢键键合稳定化的复合物的反应。氢键键合可通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或任何其他序列特异性的方式发生。复合物可包括形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的3条或更多条链、自杂交单链或这些的任意组合。杂交反应可为更大范围过程中的步骤，例如PCR反应的起始或核酶对多核苷酸的酶切。

严格性条件如下：含目的核酸的过滤器的预杂交在由6xSSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500μg/ml变性鲑鱼精子DNA组成的缓冲液中在65℃下进行8小时至过夜。过滤器在优选的杂交温度65℃下，在含100μg/ml变性鲑鱼精子DNA和5-20x10⁶cpm的³²P-标记探针的预杂交混合物中，杂交48小时。然后，在含2xSSC、0.01％Ficoll和0.01％BSA的溶液中在37℃下进行过滤器洗涤1小时，然后在50℃下在0.1xSSC中洗涤45分钟。在洗涤步骤之后，杂交的探针可通过放射自显影检测。这样的方法是本领域公知的，并在Sambrook等人，1989；和Ausubel等人，1989中引用。

多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)与另一序列具有一定百分比(例如80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”是指，当比对时，在对比两个序列中相同碱基(或氨基酸)的百分比。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分同一性，为了最佳对比目的比对序列(例如为了最佳的比对可在第一和第二氨基酸或核酸序列中引入空位，且出于对比目的可忽视非同源序列)。在优选的实施方式中，出于对比目的比对的参考序列的长度为参考序列长度的至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、60％和再更优选至少70％、80％、90％、100％。然后对比相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的位置在第二个序列中的对应位置处被相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，分子在该位置处是相同的(如本文所使用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的百分同一性为序列共有的相同位置的数目的函数，考虑到为了两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数目和各个空位的长度。

比较序列和确定两个序列之间的百分同一性可通过使用数学算法完成。在优选的实施方式中，两个氨基酸序列之间的百分同一性的确定是通过使用Needleman and Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法，其已被引入GCG软件包中的GAP程序(可从gcg.com获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一优选的实施方式中，两个氨基酸序列之间的百分同一性的确定是通过使用GCG软件包中的GAP程序(可从gcg.com获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵，空位权重为40、50、60、70或80，长度权重为1、2、3、4、5或6。特别优选的一组参数(和除非特别说明应该使用的一组参数)为Blossum 62评分矩阵，空位罚分为12，空位延伸罚分为4，且移码空位罚分为5。

两个氨基酸或核苷酸序列之间的序列同一性的确定可使用E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS，4：11-17)的算法，其已被引入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。

本文描述的核酸和蛋白质序列可用作“查询序列”以在公共数据库中进行查询，以识别其他家族成员或相关序列。这样的查询可使用Altschul，等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)进行。BLAST核苷酸查询的进行可使用NBLAST程序，评分＝100、字长＝12，以获得与本发明的mMafA核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质查询的进行可使用XBLAST程序，评分＝50，字长＝3，以获得与本发明的mMafA蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于对比目的的空位比对，可使用如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402描述的空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见ncbi.nlm.nih.gov。

术语“分离的”是指从天然常规与多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段相关的细胞和其他组分分离。例如，对于多核苷酸而言，分离的多核苷酸是从通常与染色体相关的5’和3’序列分离的多核苷酸。如本领域普通技术人员知道的，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”就能与其天然存在的对应物区别。此外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段与其天然存在的对应物是可区分的，因为其单位体积的分子浓度或数目比其天然存在的对应物更“浓缩”或较低“分离”。在其一级序列方面或例如通过其糖基化作用模式与天然存在的对应物不同的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要以其分离的形式存在，因为其可与其天然存在的对应物通过一级序列或可选地通过另一特性(如其糖基化作用模式)区分开来。尽管并未对本文公开的每个发明进行明确说明，但是应该认为，本发明提供了以下公开的每种组合物和在适当的条件下的所有的上述实施方式。因此，非天然存在的多核苷酸作为与分离的天然存在的多核苷酸分开的实施方式提供。细菌细胞中产生的蛋白质作为与从天然产生它的真核细胞中分离的天然存在的蛋白质分开的实施方式提供。如果从其被发现的有机体的解剖部位除去它的话，哺乳动物细胞(例如树突细胞)为分离的。

“宿主细胞”、“靶细胞”或“受体细胞”意图包括可为或已为载体的受体或引入外源核酸分子、多核苷酸和/或蛋白质的任意个体细胞或细胞培养物。还意图包括单细胞的后代，且由于天然、偶然或故意的突变，后代不一定与原始母细胞完全相同(在形态学或基因组或总DNA互补体方面)。细胞可为原核或真核的，且可包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、动物细胞和哺乳动物细胞，例如鼠、大鼠、猿或人。

“受试者”为脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为人。哺乳动物包括但不限于鼠、猿、人、家畜、体育动物和宠物。

“组合物”意图指活性剂和另一惰性剂(例如可检测的试剂或标记)或活性化合物或组合物(例如佐剂)的组合。

“药物组合物”意图包括活性剂和使组合物适于在体外、体内或离体(ex vivo)用于诊断或治疗的惰性或活性载体的组合。

如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体，例如磷酸缓冲盐溶液、水和乳剂(例如油/水或水/油乳剂)、不同类型的湿润剂和本文公开的其他制剂。组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂和佐剂的例子参见Martin REMINGTON′SPHARM.SCI.，18th Ed.(Mack Publ.Co.，Easton(1990)。

“有效量”为足以产生有益或理想的结果的量，例如抑制免疫应答、治疗、预防或减轻医疗状况(疾病、感染等)。可在一个或多个给药、应用或剂量中施用有效量。合适的剂量根据体重、年龄、健康、待治疗的疾病或状况和施用途径而不同。

根据上述描述，以下实施例意图显示但不限制本发明的各方面。应该理解的是，尽管并未总是明确说明，但是本文所述的试剂仅仅是示例性的，且其等同物是本领域已知的。

实施例

一般方法：

对于一般技术，参见Current Protocols in Immunology，eds.Coico等人(Wiley，Hoboken，NJ)。对于sCD83的纯化方法，参见Lechmann等人(2002)Protein Expr.Purif.24：445-452。

实施例1

大肠杆菌中产生重组hCD83ext的生物过程和下游纯化

使用质粒pGEX2ThCD83ext(公开在美国专利公布2007/0167607中和绘制在图2中)来表达hCD83ext。在该质粒中，GST-hCD83ext融合蛋白质的表达受IPTG可诱导的tac启动子的调控。该融合蛋白质的序列示于SEQ ID NO：8。在该序列中，氨基酸残基1-5对应GST标签，氨基酸残基6-13对应凝血酶切割位点，氨基酸残基14-138对应人CD83胞外结构域，且氨基酸残基139(异亮氨酸)对应人CD83胞外结构域的第一个邻近氨基酸。GST标签允许通过GST亲和色谱法捕获融合蛋白质。然后，捕获的蛋白质可在GST和hCD83ext融合的连接处的凝血酶切割位点(SEQ ID NO：8的氨基酸残基9和10之间)被凝血酶切割，以释放hCD83ext部分。由于在GST和hCD83ext之间的连接处的凝血酶切割位点的设计，最终的hCD83ext产物在氨基末端具有4个额外的氨基酸(即Gly-Ser-Pro-Gly；SEQ ID NO：41)。

将pGEX2ThCD83ext转化到几种常用的大肠杆菌菌株DH5α、JM109、HB101和BL21中，以选择用于hCD83ext表达的最佳宿主。大肠杆菌BL21优于其他表达宿主(数据未显示)。BL21(F-ompT-gal-dcm-lon-hsdS(rb-mb-)；ATCC登录#BAA-1025)由于两个蛋白酶基因(lon和ompT)的灭活特别适于重组蛋白质的产生，导致外源基因产物的蛋白水解减少。当使用大肠杆菌作为表述宿主时，蛋白水解的减少对于具有真核起点的重组蛋白质(如hCD83ext)而言是特别重要的。

优化几个培养参数，包括培养基配方、诱导条件(即诱导时间和IPTG浓度)、搅拌速度和温度，以增加重组hCD83ext的产率。在优化的过程中，将BL21/pGEX2ThCD83ext的分离的菌落接种在100mL的LB培养基加50μg/mL的氨苄青霉素(Ap)中，37℃下在旋转振荡器上以200rpm培养约12小时，以产生种子培养物。使用种子培养物(80mL)来接种含1L工作体积的培养基(5g/L NaCl、20g/L细菌用酵母提取物、20g/L细菌用胰蛋白胨、5g/L葡萄糖和10μL/L Antifoam 289(Sigma，St.Louis，MO，USA))的台式生物反应器(Omni-Culture，VirTis，Gardiner，NY，USA)。当细胞密度达到OD600～2时，加入0.5mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)用于诱导。然后用过滤器灭菌的空气以2L/min冲洗生物反应器，用于通风。通过加入3N NH₄OH或3N HC1、使用pH电极(Mettler-Toledo，Switzerland)、pH控制器(PC310，Suntex，Taipei，Taiwan)和两个蠕动泵(101U/R，Watson Marlow，Falmouth，UK)的组合，来控制培养物的pH在7.0±0.1。在诱导之后，生物反应器在28℃和650rpm下运行约6小时。

培养之后，以6000×g和2℃离心10分钟来收获细胞，称重，并在-80℃下储存沉淀物用于后续处理。通常而言，从1L培养物中可获得约20g湿细胞重量(wcw)的细胞沉淀物。在磷酸缓冲盐水(pH 7.3)中以0.05g-wcw/mL重新悬浮该细胞沉淀物。使用带常规头(Misonix)的超声处理器对约20OD600的一批细胞悬浮液(20mL)进行间歇(即0.5秒开/0.5秒关)超声处理4分钟。然后在15,000×g和2℃下离心超声处理的细胞裂解产物15分钟，以除去细胞残渣。在后续的色谱法处理进行蛋白质纯化之前，用0.45μm的过滤器过滤含总可溶性蛋白质的上清液，且通过GST测定、SDS-PAGE和Western印迹法进行分析。

在如上所述制备细胞提取物以后，通过三个主要步骤处理和纯化重组GST-hCD83ext重组蛋白质：1)使用GST亲和柱捕获，2)用凝血酶柱上切割，以释放hCD83部分到液相中，和3)通过阴离子交换色谱法进行精制，以除去凝血酶和其他污染蛋白质(例如内毒素)。(参见例如Bhikhabhai等人(2005)J.Chromatogr.1080：83-92；和Dian等人(2002)J.Chromatogr.769：133-144)。更具体而言，在捕获步骤中，将以上制备的裂解产物(即从超声处理的细胞过滤的上清液，其包含PBS中的包括GST-hCD83ext融合蛋白的总可溶性蛋白)上样到GST亲和色谱柱(GE Healthcare，Baie d′Urfé，Québec，Canada)上。据估计，以约200U GST/mL-柱-介质上样的GST-hCD83ext将会饱和GST亲和柱。由于典型的培养物样品的比GST-hCD83ext表达水平为2.5U GST/OD600-单位，将从每mL柱-介质80OD600-单位的细胞中获得的裂解产物上样到GSTrap柱上。

确定用于原位切割结合的GST-hCD83ext的最适凝血酶浓度和切割时间。首先，以厂商建议的浓度80U凝血酶/mL-柱-树脂向用GST-hCD83ext饱和的两个20mL的GST亲和柱手动注射凝血酶(Sigma)，在室温下温育2-4小时，然后用一倍柱体积的结合缓冲液释放含hCD83ext和凝血酶的GST亲和色谱柱中的大部分液体。然后用洗脱缓冲液(50mM Tris，10mM谷胱甘肽，pH 8.0)从柱上洗脱GST部分和未消化的GST-hCD83ext。观察到，2小时的温育时间足够切割。使用2小时的温育时间，将不同浓度(即80、40、20、10和5U凝血酶/mL柱-介质)的凝血酶注射到5个饱和的GST亲和柱上，用于测试切割效率，结果总结在图3中。当凝血酶浓度高于10U凝血酶/mL-柱-介质时，多于95％的GST-hCD83ext被切割，这确定为在柱上进行切割的最佳凝血酶浓度。使用这样相对低的凝血酶浓度，温育时间延长至2.5小时，以确保完全切割。尽管根据SDS-PAGE分析(图3中的泳道2-5)该级分中的hCD83ext纯度高，但是在该GST处理后级分中的蛋白质不稳定，且倾向于降解(数据未显示)。

精制步骤被设计用于除去内毒素、凝血酶和来自hCD83ext的其他污染蛋白质。装有强阴离子交换柱(Q，GE Healthcare)的低压色谱系统(BioLogic LP，BioRad，Hercules，CA，USA)被用于精制。含有50mM NaCl的Tris缓冲液(20mM，pH 7.5)和含有1M NaCl的Tris缓冲液被分别用作上样和洗脱缓冲液。合并含纯的hCD83ext的级分，并通过超滤法使用高压搅拌单元(Amicon，8010型，使用YM10盘，Millipore Canada，Cambridge，Ontario，Canada)进行浓缩。储存前过滤灭菌hCD83ext终产物。使用该终产物级分，hCD83ext的消光系数被确定为约1.16OD280-mL/mg/cm。可进一步浓缩蛋白质，和/或使用切向流过滤(或类似技术)将其缓冲液交换到低pH缓冲液中。含典型的色谱图和各个级分的蛋白质含量SDS/PAGE分析的结果分别总结在图4A和4B中。如图所示，合并的流过物包含纯化的、低内毒素hCD83ext。

实施例2

野生型hCD83ext的结构表征

当储存在4℃时，根据实施例1所述制备的并在50％甘油的存在和不存在下配制的纯化的野生型hCD83ext会降解，这可能是由于该生物分子的内在不稳定性。因此，在-20℃下储存蛋白质，这可以完全防止降解。但是，在长期储存期间，在该冷冻条件下仍会发生二聚化。使用还原和非还原SDS-PAGE对来自不同批次、且因此具有不同年龄的几个hCD83ext样品的分析结果总结在图5和图6中。尽管当用还原SDS-PAGE分析时这些样品显示相同的模式(图5)，但当用非还原SDS-PAGE分析时它们在二聚物组成方面显著不同(图6)。-般而言，二聚物组成会随着样品的年龄单调性地增加，表明在该储存条件下不断地发生单体向二聚体的转化。注意，存在来自不同的样品制品的至少两种不同的单体形式(泳道6，图6)和三种不同的二聚体形式(泳道3和7，图6)。

Lechmann等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.(2005)329：132-139)发现hCD83ext的第五个半胱氨酸为介导分子间二硫键以形成hCD83ext二聚体的关键氨基酸残基。但是，当在上述相对氧化性的条件下储存时，非还原SDS-PAGE分析表明纯化的hCD83ext制剂形成二聚体、三聚体、四聚体和甚至更大多聚体的倾向(图7B)。通过Western印迹法、使用抗-CD83抗体来研究这些较高分子量条带的身份。简而言之，在SDS-PAGE之后，根据标准方案(Towbin等人(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76：4350-4354)、使用MiniTrans-

单元(Bio-Rad)将通过非还原SDS-PAGE分离的蛋白质(图7B)电印迹到PVDF膜上。在100V的恒量电压下进行电泳转移1小时。蛋白质-抗体的杂交根据Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press：New York，USA，1989描述的进行。小鼠单克隆抗-CD83抗体(CD83-1G11，Cedarlane laboratories limited，Hornby，Ontario，Canada)被用作一级抗体。二级抗体为与辣根过氧化物酶(Sigma)偶联的山羊抗-小鼠IgG。使用3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)作为底物，通过比色法来检测hCD83相关多肽(例如GST-hCD83ext和hCD83ext)。如图7C所示，对应二聚体、三聚体、四聚体和甚至更高多聚体的条带确实为hCD83ext相关的。该数据暗示，hCD83ext的前四个半胱氨酸残基中的一个或多个参与分子内和/或分子间二硫键的形成。图6和图7中单体和二聚体的多种形式可能是由于与分子内二硫键相关的这五个半胱氨酸残基间的不同配对造成的。因此，尽管Cys 129为使分子间形成二硫键从而二聚化的主要残基，但其他半胱氨酸残基也可能参与导致多聚化的分子间二硫键的广泛形成。

实施例3

新型hCD83ext半胱氨酸到丝氨酸突变体的构建、纯化和表征

在SEQ ID NO：A(其对应SEQ ID NO：2中所示的hCD83的氨基酸残基20-144)中显示的野生型hCD83ext中存在5个半胱氨酸残基(即SEQ ID NO：A(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基27(8)、35(16)、100(81)、107(88)和129(110)，本文分别指定为Cys1、Cys2、Cys3、Cys4和Cys5)。尽管之前证明Cys5在hCD83ext二聚体形成中为重要的(Lechmann等人(2005))，但如图6所示，较高多聚体的存在表明除了Cys5以外，其他半胱氨酸残基也可对分子间和分子内二硫键的形成起作用。为了研究该可能性，两个质粒pGEX2ThCD83ext(以上描述的)和pGEX2ThCD83extmutC129S(美国专利公布2007/0167607中公开的，并由Alexander Steinkasserer博士惠赠)被用于定点诱变，以研究hCD83ext的其他半胱氨酸残基的功能。除了氨基酸残基129的密码子以外，pGEX2ThCD83ext和pGEX2ThCD83extmutC129S是相同的。在pGEX2ThCD83ext中，该密码子指定了野生型半胱氨酸残基，而在pGEX2ThCD83extmutC129S中，该密码子已被突变来编码丝氨酸残基。

使用定点诱变从pGEX2ThCD83ext或pGEX2ThCD83extmutC129S构建了10个新型质粒，以将其他三个半胱氨酸密码子(即Cys2、Cys3和Cys4)中的一个或更多个突变为丝氨酸密码子(注释：这些半胱氨酸到丝氨酸的突变被称为“C2S”突变)。CD83C2S突变体被称为CD83m-X，Y，Z，其中X、Y和Z特指具有C2S突变的半胱氨酸编号。术语“CD83m-X，Y，Z”(例如CD83m-3)与术语“CD83ext-mX，Y，Z”(例如CD83ext-m3)可互换使用。例如，CD83m-3，4为在Cys 100(即Cys3)和Cys 107(即Cys4)两处具有C2S突变的CD83突变体，而hCD83extmutC129S的原始突变体可被称为CD83m-5。表3中的质粒通过在相应的CD83突变体前加上“p”命名。表3中用SEQ ID No命名的sCD83序列对应CD83胞外区的序列加上跨膜结构域的第一个氨基酸(Ile)。应该明白的是，这些序列不包括融合到胞外结构域的N末端的GST部分和凝血酶切割位点，也不包括载体序列。

表3.质粒和寡核苷酸

通过针对Cys2、Cys3和Cys4密码子，使用三种引物(即表1中的CYS2、CYS3和CYS4)用于定点诱变。还引入沉默突变，以产生用于筛选目的的新的限制性位点(即对于Cys2和Cys4的ScaI，和对于Cys3的SacI)。ScaI和SacI对不同突变质粒的限制性消化被用于筛选C2S突变的理想组合的存在(数据未显示)。通过DNA测序确定编码各变体hCD83ext融合蛋白的区域，且对应编码区(但不包括GST标签和凝血酶切割位点)的SEQ ID NO列于表2中。注意，在所有的我们产生的质粒(和还可能在pGEX2ThCD83ext和pGEX2ThCD83extmutC 129S)中的“AGG”的精氨酸密码子(在hCD83ext的氨基酸残基编号50处)与GenBank中登记的CD83cDNA序列中对应的“AGA”的精氨酸密码子不同，尽管该差异不影响CD83蛋白质序列。

使用实施例1描述的发酵和纯化方案进行各CD83突变体的产生和纯化。一般而言，使用阴离子交换色谱法(AEC)在精化步骤的色谱图中出现两个主要洗脱峰，合并和浓缩对应第一个峰的级分，以形成最终的hCD83ext产物。但是，用于纯化CD83m-2，5的精制步骤出现的第一个峰在正常运行条件下显著降低，当施加盐梯度时大部分的CD83m-2，5在第二个峰中洗脱(图8)。当缓冲液pH降到6.5时，这样的低产率不会改善(数据未显示)。但是，仍然可以通过合并对应第一个小峰的级分来纯化CD83m-2，5。结构表征显示，尽管在还原和非还原SDS-PAGE分析(分别为图9和10)下，CD83m-2，5的条带模式看起来与野生型hCD83ext相似，但在使用圆二色谱(CD)(图11)和光谱荧光法(图12)的光谱分析之后，蛋白质显示出非常不同的谱。当纯化CD83m-2(图13)和CD83m-2，3，5(数据未显示)的两个其他突变体时，观察到类似的结果。由于CD83m-2、CD83m-2，5和CD83m-2，3，5在Cys2上共有C2S突变，数据表明，该突变可能导致蛋白质结构或生物化学性质的显著改变，这增强了其与AEC树脂的结合和随后在精制步骤中影响洗脱谱。基于蛋白质结构预测，分子内二硫键可能在Cys2和Cys4之间形成。该分子内二硫键的存在对稳定蛋白质结构或甚至于改善生物活性可能是重要的。

通过使用与野生型hCD83ext和CD83m-5完全相同的发酵和下游加工方案，产生和纯化CD83m-3。使用AEC在精制步骤中出现两个主要的蛋白质洗脱峰(图14)，且在产生CD83m-3以后没有观察到与CD83m-2相关的上述生产问题，表明在Cys3和Cys5上的C2S突变不会导致主要的结构改变。纯化的CD83m-3通过SDS-PAGE(图15)、CD(图16和17)和光谱荧光法(图18)进行结构表征，具有与野生型hCD83ext和CD83m-5类似的结果。注意，在非还原SDS-PAGE上观察到清楚和可重现的双重峰(图15)。同样，注意，对应于CD83m-3双重峰的这两个条带均与单体形式的CD83m-5不具有相同的迁移性，但上面的CD83m-3条带看起来与野生型hCD83ext的单体形式具有相同的迁移率(图19)。为了避免在用于非还原SDS-PAGE的样品制备中的潜在的二硫键扰乱，修改方案，用N-乙基马来酰亚胺(NEM)预处理样品。NEM烷基化未形成二硫键的半胱氨酸残基上的游离巯基，从而防止了通过该半胱氨酸残基的后续的二硫键合。看起来，使用NEM的修改的方案通过防止任何潜在的二硫键扰乱提供了定量CD83二聚体的更可信的和一致的方法，且CD83单体被观察为单个条带，而不是双重峰(图20)。

之前，Zinser等人(Immunobiology(2006)211：449-453)报导，Cys5为决定CD83二聚化的主要的半胱氨酸，且hCD83ext-m5形成单体而不是二聚体。但是，我们观察到在用大小排阻色谱法(SEC；图21)分析后的显著的hCD83ext-m5二聚化，该结果与使用通过NEM预处理修改的方案的非还原SDS-PAGE结果(图20)一致。令人惊奇的是，基于SEC(图21)和使用修改的NEM方案的非还原SDS-PAGE(图20)的结果，hCD83ext-m3的二聚化不存在或非常少。这些结果表明，Cys3或甚至其他半胱氨酸残基(即Cysl、Cys2和Cys4)可能对CD83的二聚化起一定的作用。注意，hCD83ext-m3分子看起来与野生型hCD83ext的单体形式具有相同的迁移率，但是比CD83m-5具有略高的迁移率(图20)。因此，单体形式的hCD83ext-m3和hCD83ext-m5可具有不同的结构，而hCD83ext-m3单体与野生型hCD83ext单体可具有相似或甚至相同的蛋白质结构。在用还原SDS-PAGE(图22)和还原SEC(图23)分析后，所有的这些CD83变体看来具有相同的条带模式，其中仅观察到单体形式。

总之，使用非还原SDS-PAGE(图24)，我们已经证明，与之前的观点-hCD83ext-m5仅以单体存在(自我注释：阅该出版物)-相反，在该突变体形式中的其他半胱氨酸残基可参与多聚化，以形成二聚体、三聚体或甚至四聚体。使用Western印迹法，这些多聚体种类已显示与CD83相关(图25)。

实施例4

hCD83ext野生型、hCD83m3和hCD83m5生物活性的对比和pH对蛋白质稳定性的影响

使用来自短尾猴的PBMC，在体外测定中评估野生型和突变hCD38ext通过LPS/IFN-γ刺激的外周血单核细胞(PBMC)抑制TNFα的产生的能力。具体而言，分离短尾猴PBMC，并使用不同浓度(0.5、5、25和100μg/ml)的hCD83ext野生型(配制为pH 4.5或5.5)、hCD83ext-m3或hCD83ext-m5(501-1)预处理12小时。hCD83ext-m3和hCD83ext-m5分别被配制为pH 5.5或7.6。然后在布雷菲德菌素A(4μg/ml)的存在下，用LPS(1μg/ml)加上IFN-γ(100U/ml)激活细胞6小时，然后使用可商购的Fix/Perm试剂盒对TNFα进行细胞内染色。使用骨髓树突细胞或单核细胞来评估TNFα产量的流式细胞术的获取和分析。结果表示为产生TNFα的mDC或单核细胞的％，单位为平均荧光单位(MFU)，其代表了每个细胞的TNFα的水平。如图26所示，hCD83m-3比m5突变体更有活性，而m5突变体在抑制刺激的PBMC产生TNFα方面比野生型hCD93ext更有活性。此外，当配制为pH 4.5时，hCD83ext野生型比配置为pH 5.5时保留了更好的活性。pH为4.5或pH为5.5的hCD83ext野生型制剂比pH为7.6的制剂更有活性(数据未显示)。

除了野生型和m3突变体蛋白质两者均被配制为pH 7.6以外，根据与上述TNFα的抑制测定相似的测定比较hCD83ext-m5和hCD83ext野生型的活性。如图27所示，hCD83ext-m5在抑制LPS/IFN-γ刺激的短尾猴PBMC产生TNFα的能力方面优于hCD83ext野生型的两个制品。

最初被配制为pH 7.6的hCD83ext野生型蛋白质(数据示于图26和27)被缓冲交换到pH为4.5或5.5的缓冲液中，并如上所述重新测试在体外抑制LPS/IFN-γ刺激的短尾猴PBMC产生TNFα的能力。示于图28中的数据表明，通过将物质配制在酸性缓冲液(pH 4.5或pH 5.5)中可以提高野生型(WT)蛋白质的生物活性。因此，约4.5-5.5的pH通过可能使环境压力(例如氧化、脱氨基化、温度等)的影响最小化，可稳定hCD83ext。但是，当hCD83ext-m3被配制为pH 5.5时，其比被配置为pH 4.5或5.5的野生型更有活性(图29)。hCD83ext-m3也比hCD83ext-m5更有活性，但是在该测定中未测试pH 5.5的hCD83m-5。有意思的是，当在体内小鼠心脏移植模型(每只小鼠每天100μg，8天)中测试hCD38ext野生型、hCD83ext-m3和hCD83ext-m5抑制移植排斥的能力时，看起来在它们延长移植生存时间方面存在很小的差异。当用作单一治疗时，各形式能够延长移植存活时间从平均存活时间8天到约14天。当与市场上的免疫抑制剂(包括环孢菌素)联合使用时，所有形式均显示相似的协同谱、长期生存谱。因此，hCD83ext-m3和pH调节(到低pH)中的一个值看起来改善整体蛋白质的稳定性。

与hCD83ext野生型相比改善的hCD83ext-m3的稳定性/活性在使用人PBMC的类似的测定中得到证实。如图30所示，四种不同的hCD83ext-m3制剂中的每一种(-002-2-3配制在PBS，pH 5.5中；-002-1配制在Tris，pH 7.6中；-003-2-2配置在PBS pH 5.5中，-003-3-2配置在PBS，pH 4.5中)在抑制LPS/IFN-γ刺激的人PBMC产生TNFα的能力方面均优于hCD83ext野生型(称为ARG-021，配置在PBS pH 7.6中)。

实施例5

甘油稳定化hCD83ext制剂

当hCD83ext被配制为终浓度50％甘油(较低甘油浓度也可使用)用于储存且后续在C57BL/6-至-BALB/c小鼠心脏移植模型中以8％的最终甘油浓度与环孢菌素联合使用进行体内测试时，记录到长期的移植存活时间(大于100天)，而在从该联合研究中省略甘油的实验中，平均存活时间限于约14天。

实施例6

野生型hCD83ext的外力降解(Force-Degradation)

使用批次021野生型hCD83ext储备溶液(在PBS pH 7.6中的冷冻的等分试样，～6mg CD83/mL)如下进行外力降解研究。融化和合并几个等分试样。根据下表中描述的制备溶液：

表4.用于外力降解研究的压力条件

在上述暴露时间结束时，中和酸性和碱性样品。将所有的样品储存在-20℃直到使用SE-HPLC和等电聚焦(IEF)凝胶进行分析。SEC-HPLC结果示于表5中。

表5.SEC-HPLC：外力降解研究总结

使用SE-HPLC和等电聚焦(未显示)产生的数据表明，hCD83ext的降解产物比起始材料为更强电负性。这可能主要是由于多个脱酰胺作用或水解，且在正在进行的配制前研究中进行评价。这些数据还表明，酸性pH稳定hCD83ext的聚集状态和电荷状态两者。关于电荷状态，pI为6.9。在室温(RT)对照中出现另一主要条带，pI约为6.8。

从分子大小方面，酸性条件(pH～2)有利于单体(-4％聚集，与室温对照相同)。所有的其他条件(碱、过氧化物、热、光、室温)显示增加聚集。hCD83ext看起来为光稳定的。该样品观察到的降解最可能是由于暴露在环境条件而不是光。很明显，热(70℃)和碱性条件(pH～12)引起快速降解；在4小时后，主要的条带消失，并观察到多个电负性的条带。酸性条件(pH～2)看起来在hCD83ext的聚集状态和电荷状态两方面稳定蛋白质。IEF谱看起来是完整的，即使当与室温对照相比时。

为了进一步研究pH的作用和其对蛋白质稳定性的影响，新鲜融化和分析(表6的第1列)野生型hCD83ext(批次021，在pH 7.6的PBS中)，或在室温和2-8℃、pH为4、5、6、7、8和9下储存。将样品保持在-70℃直到储存1、2、4和10天后进行分析。然后通过SEC HPLC(表6)或使用SDS-PAGE生物分析仪(在还原和非还原条件下，图31-35)来分析这些样品。

表6.pH降解速率研究的SEC HPLC结果总结

这些数据表明，当sCD83缓冲在低pH(pH 4-5)下时，条件更有利于支持sCD83的稳定性，在这些条件下，聚集和电荷状态的改变看起来被最小化。此外，暴露于碱、过氧化物、热、光或室温条件看起来增加聚集或片段化和/或降解。

以下所有的动物实验是根据加拿大动物管理协会指南(Canadian Council on Animal Care guidelines)进行的。以下描述的实验使用从大肠杆菌纯化的重组人sCD83，为野生型形式(hCD83ext-wt；SEQ ID NO：5)或m3突变体形式(hCD83ext-m3；SEQID NO：7，其中氨基酸12、20、92和114为半胱氨酸(Cys)且氨基酸85为丝氨酸(Ser))。

实施例7

hCD83ext-m3在鼠肾脏移植模型中诱导长期同种异体移植耐受性

使用小鼠原位肾脏移植模型(参见Zhang等人(2005)Microsurgery 16(2)：103-109)来评估hCD83ext-m3诱导同种异体移植耐受性的能力。BALB/c小鼠接受来自C57BL/6小鼠供体的肾脏同种异体移植。受体小鼠为未经治疗的(两只小鼠)或在移植前一天(第-1天)、移植当天(第0天)和手术后天数(POD)为七天时接受hCD83ext-m3(三只小鼠；100μg/小鼠/天，i.v.)。两只未经治疗的小鼠存活28和35天，平均存活时间(MST)为31±4.9天。三只接受hCD83ext-m3的小鼠每只存活多于100POD。因此，使用hCD83ext-m3进行单一治疗在小鼠原位肾脏移植模型中导致长期同种异体移植接受性。在分开的实验中，通过hCD83ext-wt治疗获得相似的结果。

实施例8

CD83ext-wt或CD83-m3单独或与环孢菌素A联合在鼠异位心脏同种异体移植模型中抑制移植排斥

动物模型：C57BL/6-至-BALB/c小鼠心脏移植模型

使用鼠异位心脏同种异体移植模型来确定hCD83ext-m3单独或与环孢霉素A(CsA)联合对防止异位心脏移植物的排斥的作用。雄性成年C57BL/6(H-2b)作为供体，且BALB/c(H-2d)小鼠作为受体(Jackson Laboratories，Bar Harbor，MA)。根据以前描述的(Corry等人(1973)Transplantation 16(4)：343-350和Wang等人(2007)JImmunol 179(7)：4451-4463)进行腹膜内异位心脏移植。在该研究中，移植手术包括将全MHC-错配的心脏从C57BL/6供体转移到BALB/c受体，从而自体心脏和异体心脏在受体中存在。

如下处理心脏移植受体：组I(5个受体)不接受治疗。组2(3个受体)在-1至+7POD通过i.v.100μg/小鼠/天接受hCD83ext-m3单一治疗。组3(4个受体)在-1至+7POD通过i.v.100μg/小鼠/天接受hCD83ext-m3单一治疗，加上每天s.c.CsA 15mg/kg/天，直到实验结束。在双盲模式中通过直接的腹部扪诊来监测和评价移植的心跳，以检测心脏健康/排斥的状态。在术后多天(POD)后，测量心脏移植存活时间，即异体心脏持续跳动。结果示于表7中。

表7

组	心脏移植存活时间(POD)	MST±SD(天)
			1：未经治疗的对照	7，7，8，8，8	7.6±0.6
2：hCD83ext-m3	13，14，14	13.7±0.6
			3：hCD83ext-m3+CsA	＞100x4	＞100

在分开实验中，如上评估了hcD83ext-wt单独、CsA单独或hCD83ext-wt加上CsA抑制心脏排斥的能力。心脏移植受体按照如下治疗：组4(4个受体)从移植前直到移植排斥通过i.v.100μg/小鼠/天接受hcD83ext-wt(SEQ ID NO：5)单一治疗。组5(6个受体)接受CsA单一治疗(15mg/kg/天，每日，s.c.)。组6(4个受体)从移植前到移植后7天通过i.v.100μg/小鼠/天加上CsA 15mg/kg/天，每日，s.c接受hCD83ext-wt。结果示于表8中。

表8

动物死于心脏移植跳动过快(不认为是治疗相关的)

以上实验表明，hCD83ext-m3和hcD83ext-wt单一治疗与未经治疗的对照相比延长了同种异体移植的存活时间约2倍。此外，hCD83ext-m3和CD83ext-wt与CsA协同作用，与CsA单一治疗相比允许长期的同种异体移植存活时间。

在另外的实验中，用CsA治疗小鼠心脏移植受体直到POD 50，其中加上CD83ext-m3(在第-1到+7天，100μg，i.v.)治疗，导致完全的同种异体移植耐受性，正如在第50天每日CsA治疗的停止以后没有排斥所示(数据未显示)。相反，CsA单一治疗或hCD83ext-m3单一治疗在约13-17天后导致排斥，表明hCD83ext-m3与CsA协同作用(参见表7和表8)。令人惊奇的是，当在第28天取消CsA时，联合治疗并未导致永久性的同种异体移植耐受性，表明需要更长的不发生排斥的生存时间以实现完全的药物独立的耐受性(数据未显示)。较少剂量的hCD83ext-m3(即在第-1到+1天，3个剂量)导致与CsA的完全的协同作用，但不完全的操作的耐受性，由在第50天取消CsA的快速排斥得到证明(数据未显示)。因此，表明了诱导同种异体移植耐受性的剂量响应作用。

实施例9

hCD83ext-m3防止大鼠肾脏同种异体移植的慢性排斥

在人类中，慢性排斥出现在移植之后的数月至数年，且是最常见的移植死亡的原因。慢性排斥造成移植功能的慢性恶化，在肾脏中病理特征为肾小管萎缩、间质纤维化和动脉的纤维内膜变厚。

良好建立的大鼠肾脏移植模型(基本如Bedard等人(2006)Transplantation 81(6)：908-14和美国专利7,514,405所述，其内容通过引用方式结合在本文中)用于评估hCD83ext-m3与CsA联合使用是否可以抑制慢性排斥。在该模型中，使用短期(11天)剂量的环孢菌素(CsA)治疗肾脏移植受体，以防止最初的急性排斥。这样的移植受体可靠地表明了到手术后(POD)140天的慢性移植排斥特有的病理改变。

F344大鼠作为Lewis大鼠的肾脏供体。使用低于治疗剂量的CsA(0.75mg/kg/天；POD 0-10)单独治疗三个对照移植受体。使用CsA(0.75mg/kg/天；POD 0-10)和hCD83ext-m3(100μg/天，i.v.，POD 1-7)两者治疗第二组的三个移植受体。在POD 40杀死移植受体，移植的肾脏通过组织学和免疫组织化学来评估慢性排斥的指征。由独立的病理学家评分肾脏组织学，评估肾小管萎缩、间质性纤维化、内膜厚度、细胞渗透和皮层疤痕，分数为0-4，其中0＝正常，1＝最少量改变，2＝少量改变，3＝中等改变和4＝显著改变。如图36所示，与单独使用CsA治疗相比，CsA加上hCD83ext-m3的治疗显著((p＜0.05)改善了各类的评分。图37中的数据表明，hCD83ext-m3显著(p＜0.05)改善了肾脏同种异体移植中的免疫组织化学分级，IgG和IgM抗体沉积在肾小球(G)和小管周微血管(PTC)中，并降低了CD2、CD4和ED-1细胞的细胞浸润。总之，hCD83ext-m3与CsA联合使用防止了大鼠肾脏移植模型中的慢性同种异体移植排斥。通过hCD83ext-m3加上CsA的治疗来防止慢性排斥，与向下调节移植内抗体和防止肾小管萎缩/间质性纤维化有关，其是在肾脏移植受体中慢性排斥的组织学特征。这些数据强调了hCD83ext-m3的多种功能性。除了由以上小鼠心脏和肾脏移植研究所显示的阻断急性细胞排斥的能力以外，该模型表明其抑制慢性炎症和体液免疫应答的能力(即慢性排斥病理学与急性细胞排斥无关)。

实施例10

使用hCD83ext-m3加上环孢菌素A的治疗在非人灵长类动物中延长了肾脏移植的存活时间

各个受体短尾猴的一个肾脏被从另一短尾猴取出的肾脏代替。此外，手术切除受体的非移植的肾脏，从而移植的肾脏为生命依赖的。使用hCD83ext-m3(3mg/kg i.v.，从-1到+7POD，9个剂量)和每日的亚治疗剂量的CsA(10mg/kg，i.m.)直到第50天治疗三个移植受体。对照组中的三个移植受体接受CsA(10mg/kg，i.m.)单一治疗。通过以下方法监测所有动物的同种异体移植排斥，包括：评估排尿量、血清肌酸酐水平，和食物和水消耗。各组的一个动物需要预先安乐死(并非基于急性排斥)，留下各组的两个动物用于终点分析。结果示于表9。

表9

对照组动物(其接受CsA单一治疗)均不能存活到CsA终止当天(第50天)，而两个使用hCD83ext-m3加上CsA-治疗的动物在第50天均不显示排斥的临床症状(即正常饮食、肌酸酐和排尿量)。但是，在CsA终止后，两个hCD83ext-m3-治疗的动物很快发生排斥，表明不足以控制急性排斥的耐受诱导。

在下一步实验中，肾脏移植受体将每日接受hCD83ext-m3(10gm/kg/2x天i.v.从-1到+13POD)加上CsA(10mg/kg，i.m.)到第90天，然后此后每隔两周降低50％的CsA，以(1)证明与CsA的临床相关协同作用，和(2)评估诱导的操作耐受性水平。

Claims (8)

1.一种编码下述多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与编码单体可溶性CD83蛋白的序列可操作地连接的起始密码子，所述序列选自

(a)SEQ ID NO：7的氨基酸残基1至129；

(b)SEQ ID NO：7的氨基酸残基1至130；

(c)SEQ ID NO：7的氨基酸残基5至129；和

(d)SEQ ID NO：7的氨基酸残基5至130，

其中SEQ ID NO：7的氨基酸12、20和92是半胱氨酸，以及其中SEQ ID NO：7的氨基酸85是丝氨酸且氨基酸114是半胱氨酸。

2.一种由权利要求1所述的多核苷酸编码的多肽。

3.如权利要求2所述的多肽，其中所述多肽自大肠杆菌纯化得到。

4.一种含有权利要求2或3所述的多肽的药物组合物。

5.权利要求2或3所述的多肽在制备用于治疗或预防哺乳动物受试者中不希望的免疫应答的药物中的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其中所述不希望的免疫应答选自自身免疫性疾病、移植排斥和变态反应。

7.如权利要求6所述的用途，其中所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、1型糖尿病、天疱疮、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、重症肌无力、自体心肌炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、牛皮癣、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、血管炎、慢性炎性肠病、克罗恩病或溃疡性结肠炎、白赫铁列夫症、强直性脊柱炎和慢性阻塞性肺病(COPD)。

8.如权利要求6所述的用途，其中SEQ ID NO：7的氨基酸85是丝氨酸，其中所述不希望的免疫应答是移植排斥，以及其中所述受试者还接受环孢菌素A给药。

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