BRPI0913577B1 - Polipeptídeo scd83 isolado, seus usos, bem como composição farmacêutica e polinucleotídeo - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEOS SCD83, SUA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, SEUS USOS, BEM COMO POLINUCLEOTÍDEO. A presente invenção refere-se a composições e métodos para o tratamento ou a prevenção de repostas imunes indesejadas. As composições referem-se aos novos polipeptídeos solúveis (sCD83) polipeptídeos e aos ácidos nucleicos codificando tais polipeptídeos, formulações melhoradas (sCD83) e ao uso de tais polipeptídeos e formulações no tratamento ou prevenção de alergias, doenças autoimunes e rejeição ao transparente. Um polipeptídeos sCD83 é fornecido, compreendendo SEQ ID N°, 7 ou uma sequência de aminoácido possuindo uma identidade de, pelo menos 70% de SEQ ID°: 7 são um aminoácido diferentes de cisteína, e, opcionalmente, um ou mais resíduos de aminiácidos 1,2,3,4 e 130 estão ausentes.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se aos novos polipeptídeos CD83 (sCD83) solúveis e aos ácidos nucleicos codificando tais polipeptídeos, as formulações (sCD83) melhoradas e ao uso de tais proteínas e formulações no tratamento ou prevenção de alergias, doenças autoimunes e rejeição ao transplante.

Antecedentes da Invenção

[002] CD83 é uma molécula da superfamília de imunoglobulina (Ig) das proteínas (vide, por exemplo, Zhou e outros (1999) J. Immunol. 149: 735-742; vide também a Patente US No 7.169.898; para revisão, vide Fujimoto e Tedder ((2006) J. Med. 53 Dent. Sci 86-91). CD83 serve como um marcador diferencial para células dendríticas maduras. Embora a função precisa de CD83 continua a ser determinada, uma forma solúvel de CD83 tem sido relatada para ligar, também, as duas células dendríticas imaturas e maduras (vide Lechmann e outros. (2001) (J. 194 Exp. MED 1813-1821). Os autores também afirmaram que esta proteína diminuiu a expressão de CD80 e CD83 pelas células dendríticas (DCs) maduras in vitro e que inibiu a capacidade das células dendríticas de estimular as células T in vitro (vide também, Lechmann e outros. (2002) Trends in Immunology 23 273-275). Similarmente, Kruse e outros. (2000) (J. Exp. Med. 191: 1581-1589) relataram que GC7 (N (1)-guanil-1,7-diaminoeptano) interferiu na translocação do núcleo citoplasmático do mRNA de CD83, impedindo a expressão da superfície de CD83 e inibindo, significativamente, a ativação dos linfócitos T por estas DCs. Outros afirmaram a presença de uma forma solúvel de CD83 in vivo (vide, por exemplo, Hock e outros. (2002) Int. Immunol. Immunol. 13: 959-967). Estudos com DCs infectadas por HSV-1 demonstram que a infecção viral leva à degradação do CD83 e a inibição do transporte do mRNA de CD83, este possível mecanismo de escape pelo HSV-1 ainda suporta a importância de CD83 à biologia de DC (vide, por exemplo, Kruse e outros 74. (2000) J. Virol. 7127-7136).

[003] O CD83 maduro inclui três domínios estruturais: um domínio extracelular semelhante a Ig; um domínio transmembrana; e um domínio citoplasmático. O domínio extracelular de CD83 humano (hCD83ext, uma forma de sCD83) compreende um domínio simples semelhante a Ig (tipo V) que é codificado por pelo menos dois éxons (vide, por exemplo, Zhou e outros (1999) J. Immunol. 149: 735-742; GenBank ID #Z11697) e é fortemente expresso na superfície celular das células dendríticas maduras ("mDCs").

[004] A patente US No 7.169.898 descreve uma sequência de ácido nucleico de cDNA de CD83 humano (hCD83) (SEQ ID NO: 1). A sequência de aminoácidos correspondente do comprimento total de hCD83 é mostrada na SEQ ID NO: 2. Os resíduos de aminoácidos 1 a 19 da SEQ ID NO: 2 correspondem a uma sequência de sinais, que é clivada da proteína madura (resíduos de aminoácidos 20 a 205). Um domínio extracelular hCD83 (hCD83ext) é codificado pela SEQ ID NO:3. A sequência de aminoácido hCD83 correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 4 e também nos resíduos de aminoácidos 20 a 144 da SEQ ID NO:2. O domínio transmembrana e o domínio citoplasmático correspondem aos resíduos de aminoácidos 145 a 166 da SEQ ID NO: 2 e aos resíduos de aminoácidos 167 a 205 da SEQ ID NO:2, respectivamente. O hCD83ext do tipo selvagem contém três sítios de glicosilação (ou seja, os resíduos de aminoácido 60, 77 e 98 da SEQ ID NO: 4) e cinco resíduos de cisteínas (ou seja, os resíduos de aminoácidos 27,35, 100, 107 e 129 da SEQ ID NO: 2, que correspondem aos resíduos de aminoácidos 8, 16, 81, 88 e 110 da SEQ ID NO: 4).

[005] hCD83ext inibe a estimulação das células T mediada por DC (Lechmann e outros. J. Exp. MED. (2001) 194:1813-1821) e é eficaz no tratamento do modelo de camundongo para a esclerose múltipla (encefalomielite autoimune experimental (EAE); Zinser Med e outros (2004) J. Exp: 200. 345-351). Estes estudos utilizaram um domínio extracelular hCD83 que compreendeu, adicionalmente, uma porção de quatro aminoácidos (Gly-Ser-Pro-Gly; SEQ ID NO:41) de um sítio de clivagem da trombina no terminal amino da proteína, assim como o primeiro aminoácido do domínio transmembrana (Ile), e é mostrado na SEQ ID NO: 5.

[006] A publicação do PCT WO2004/046182 descreve um mutante CD83 solúvel em que o quinto resíduo de cisteína da SEQ ID NO: 5 é mutado de uma cisteína para uma serina para produzir a SEQ ID NO: 6 (daqui por diante hCD83ext-M5) e propõe a utilização de hCD83ext-M5 e hCD83ext do tipo selvagem no tratamento de doenças autoimunes, tais como esclerose múltipla e transplante. Zinser e outros (Immunobiology (2006) 211:449-453) descreve que hCD83ext do tipo selvagem forma um homodímero, em que as primeiras quatro cisteínas do domínio extracelular (ou seja, os resíduos de aminoácidos 27, 35, 100 e 107 da SEQ ID NO: 2; que correspondem aos resíduos de aminoácidos 12, 20, 85 e 92 das SEQ ID NOs: 5 e 6) estão envolvidas na formação de ligações dissulfeto intramoleculares e a quinta cisteína (ou seja, o resíduo de aminoácido 129 da SEQ ID NO: 1 ou o resíduo de aminoácido 114 da SEQ ID NOs: 5 e 6) é responsável pela ligação intermolecular do homodímero. Zinser e outros. Ainda descrevem que as duas isoformas hCD83ext, ou seja, o dímero do tipo selvagem e o monômero mutante hCD83ext-m5, possuem uma capacidade semelhante inibitória quando testadas in vitro e que a meia-vida biológica (in vivo) das duas isoformas hCD83ext é comparável e foi entre 2 e 3 horas. Além disso, usando o modelo EAE, Zinser e outros descrevem que uma isoforma mutante monomérica de CD83 solúvel (ou seja, hCD83ext-m5) tem uma atividade inibitória in vivo semelhante quando comparada com uma isoforma hCD83ext dimérica do tipo selvagem.

[007] Tendo em vista as aplicações terapêuticas importantes de sCD83, os requerentes reconheceram a necessidade de polipeptídeos sCD83 melhorados e formulações do mesmo para o tratamento ou a prevenção de uma resposta imune indesejada, tais como as doenças autoimunes, alergias e rejeição ao transplante. A presente invenção atende a esta necessidade e fornece vantagens adicionais também.

Breve Descrição da Listagem de Sequência

[008] SEQ ID NO:1 representa um cDNA codificando uma proteína CD83 humana de comprimento total, incluindo a sequência do sinal.

[009] SEQ ID NO:2 representa a sequência de aminoácidos de uma proteína CD83 humana de comprimento total, incluindo a sequência do sinal.

[0010] SEQ ID NO: 3 representa um cDNA codificando a sequência de aminoácidos de um domínio extracelular CD83 humano (hCD83ext).

[0011] SEQ ID NO: 4 representa a sequência de aminoácidos de um domínio extracelular CD83 humano (hCD83ext).

[0012] SEQ ID NO: 5 representa a sequência de aminoácidos de um domínio extracelular CD83 humano, que compreende ainda, no terminal amino, resíduos de aminoácidos (Gly-Ser-Pro-Gly, SEQ ID NO: 41), e no terminal carbóxi, o primeiro aminoácido do domínio transmembrana (Ile).

[0013] SEQ ID NO: 6 representa uma variante da SEQ ID NO: 5, em que o quinto resíduo de cisteína na posição 114 foi mutado em um resíduo de serina.

[0014] SEQ ID NO: 7 representa uma variante de SEQ ID NO: 5, em que o resíduo Xaa representa qualquer aminoácido.

[0015] SEQ ID NO: 8 representa uma proteína de fusão hCD83ext. Os domínios GST e hCD83ext são separados pelo sitio de clivagem da trombina.

[0016] SEQ ID NO: 9 representa um domínio extracelular hCD83 do tipo selvagem, que compreende ainda o primeiro aminoácido (Ile) do domínio transmembrana.

[0017] SEQ ID NO: 10 representa um DNA codificando um mutante m5 C2S mutante de SEQ ID NO: 9.

[0018] SEQ ID NO: 11 representa um mutante m5 C2S da SEQ ID NO: 9.

[0019] SEQ ID NO: 12 representa um DNA codificando um mutante m2 C2S mutante de SEQ ID NO: 9.

[0020] SEQ ID NO: 13 representa um mutante m2 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0021] SEQ ID NO: 14 representa um DNA codificando um mutante m3 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0022] SEQ ID NO: 15 representa um mutante m3 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0023] SEQ ID NO: 16 representa um DNA codificando um mutante m4 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0024] SEQ ID NO: 17 representa um mutante m4 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0025] SEQ ID NO: 18 representa um DNA codificando um mutante m2,3 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0026] SEQ ID NO: 19 representa um mutante m2, 3 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0027] SEQ ID NO: 20 representa um DNA codificando um mutante m3,4 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0028] SEQ ID NO: 21 representa um mutante m3,4 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0029] SEQ ID NO: 22 representa um DNA codificando um mutante m2,5 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0030] SEQ ID NO: 23 representa um mutante m2,5 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0031] SEQ ID NO: 24 representa um DNA codificando um mutante m3,5 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0032] SEQ ID NO: 25 representa um mutante m3,5 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0033] SEQ ID NO: 26 representa um DNA codificando um mutante M4,5 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0034] SEQ ID NO: 27 representa um mutante M4,5 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0035] SEQ ID NO: 28 representa um DNA codificando um mutante m2, 3,5 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0036] SEQ ID NO: 29 representa um mutante m2, 3,5 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0037] SEQ ID NO: 30 representa um DNA codificando um mutante m3, 4,5 C2S de SEQ ID NO:9

[0038] SEQ ID NO: 31 representa um mutante m3,4,5 C2S de SEQ ID NO: 9.

[0039] SEQ ID NO: 32 representa um iniciador para mutagênese C2S na segunda cisteína de SEQ ID NO: 9.

[0040] SEQ ID NO: 33 representa um iniciador para mutagênese C2S na terceira cisteína de SEQ ID NO: 9.

[0041] SEQ ID NO: 34 representa um iniciador para mutagênese C2S na quarta cisteína de SEQ ID NO: 9.

[0042] SEQ ID NO: 35 representa uma proteína CD83 de Pan trogloytes (chimpanzé) e corresponde à sequência de Referência NCBI: XP_518248.2.

[0043] SEQ ID NO: 36 representa uma proteína CD83 da família Canis lupus (cão) e corresponde à sequência de Referência NCBI: XP_852647.1.

[0044] SEQ ID NO: 37 representa uma proteína CD83 de Bos taurus (bovino) e corresponde à sequência de Referência NCBI: NP_001040055.1.

[0045] SEQ ID NO: 38 representa uma proteína CD83 de Mus musculus (camundongo) e corresponde à sequência de Referência NCBI: NP_033986.1.

[0046] SEQ ID NO: 39 representa uma proteína CD83 de Rattus norvegicus (ratazana) e corresponde à sequência de Referência NCBI: XP_341510.2.

[0047] SEQ ID NO: 40 representa uma proteína CD83 de Gallus gallus ('galinha selvagem vermelha') e corresponde à sequência de Referência NCBI: XP_41829.1.

[0048] SEQ ID NO: 41 corresponde ao Gly-Pro-Ser-Gly. Breve Descrição das Figuras

[0049] A figura 1 é um alinhamento da sequência de proteínas geradas pela versão MUSCLE, versão 3.6, utilizando a opção: -maxitiers 2 (vide Edgar RC (2004) Nucleic Acids Res 32 (5) :1792-7)). NP_00424.1 (SEQ ID NO: 2) é uma proteína CD83 humana (SEQ ID NO: 2). XP_518248.2 é uma proteína CD83 do chimpanzé (SEQ ID NO: 35). XP_852647.1 é uma proteína CD83 do cão (SEQ ID NO: 37). NP_001040055.1 é uma proteína CD83 bovina (SEQ ID NO: 37). NP_033986.1 é uma proteína CD83 do camundongo (SEQ ID NO:38). XP_341510.2 é uma proteína CD83 do rato (SEQ ID NO: 39). XP_41829.1 é uma proteína CD83 da galinha selvagem vermelha (SEQ ID NO: 40). Os resíduos de aminoácidos sublinhados podem ser substituídos por qualquer aminoácido. Os aminoácidos sublinhados e em negrito podem ser preferencialmente substituídos por uma substituição de aminoácido conservadora. Os resíduos de aminoácidos que não estão sublinhados não são substituídos, preferencialmente.

[0050] A figura 2 é um diagrama esquemático do plasmídeo pGEX2ThCD83ext.

[0051] A figura 3 mostra a resolução SDS-PAGE das frações eluídas após a clivagem da trombina na coluna de GST-hCD83ext utilizando trombina a 80 (faixa 2), 40 (faixa 3), 20 (faixa 4), 10 (faixas 5 a 8) ou 5 (faixas 9 a 13) U/mL. As faixas 7 e 8 mostram as frações GST obtidas após a digestão de trombina e eluição de glutationa a 10 U/mL. Faixa 1: marcadores de peso molecular. As proteínas contaminantes presentes na trombina (Sigma) são mostradas na caixa tracejada.

[0052] A figura 4A mostra uma cromatografia de dois picos típica para a etapa de polimento de hCD83ext usando cromatografia de troca de ânion contendo os dois maiores picos. A figura 4B mostra a análise SDS-PAGE de cada uma das frações de polimento. As faixas 2 a 5 representam o primeiro pico e as faixas 6 a 9 representam o segundo pico. A faixa 1 representa a amostra pós GST carregada na coluna de cromatografia de troca de ânion para o polimento. Nota-se que hCD83ext está localizada no primeiro pico, enquanto as outras proteínas contaminantes estão localizadas no segundo pico. O gel foi manchado com nitrato de prata.

[0053] A figura 5 mostra uma análise dos diferentes lotes das amostras hCD83ext utilizando a redução SDS-PAGE e a coloração azul de Coomassie. As amostras de proteína foram armazenadas a -20°C e foram formuladas em Tris a 20mM, NaCl a 50mM, 50% de glicerol, a amostra estava livre de glicerol na faixa 3. Os lotes foram feitos em várias datas diferentes e, portanto, foram armazenados em diferentes períodos de tempo (ou seja, 4, 3, 3, 2, 10,5, 9,5, 6,5, 6, 6 meses nas faixas 2 ~ 10, respectivamente) antes da realização da análise. A seta indica a posição do monômero. Além disso, as maiores espécies em peso molecular podem ser vistas, correspondendo, possivelmente, às formas multiméricas. As formas em peso molecular mais baixas correspondem aos produtos de degradação ou aos monômeros modificados possivelmente mediados pelas ligações dissulfeto intramoleculares não-convencionais.

[0054] A figura 6 mostra uma análise dos diferentes lotes das amostras hCD83ext utilizando a redução SDS-PAGE e a coloração azul de Coomassie. As amostras de proteína foram armazenadas a -20°C e foram formuladas em Tris a 20mM, NaCl a 50mM, 50% de glicerol, exceto a amostra da faixa 3 que estava livre de glicerol. Os lotes foram feitos em várias datas diferentes e, portanto, possuíam diferentes "idades" (ou seja, 4, 3, 3, 2, 10,5, 9,5, 6,5, 6, 6 meses nas faixas 2 ~ 10, respectivamente) na realização da análise. As setas nas faixas 3, 6 e 7 realçam as várias espécies hCD83ext não-comuns possivelmente mediadas pelas ligações dissulfeto intramoleculares não-convencionais.

[0055] A figura 7 mostra uma análise de uma amostra hCD83ext com (A) SDS-PAGE reduzido, (B) SDS-PAGE não-reduzido e (C) Western blotting. Os géis SDS foram manchados com nitrato de prata a fim de tornar as maiores espécies multiméricas (tais como trímero e tetrâmero) visíveis. Todas estas espécies foram verificadas de se associarem a hCD83ext por Western blotting.

[0056] A figura 8 é um cromatograma AEC mostrando os picos da etapa de polimento para hCD83m-2,5.

[0057] A figura 9 mostra a redução da análise SDS-PAGE das frações CD83m-2,5 purificadas.

[0058] A figura 10 mostra a análise SDS-PAGE não-reduzida das frações CD83m-2, 5 purificadas.

[0059] A figura 11 mostra a análise espectroscópica de CD83m-2, 5 utilizando dicroísmo circular (CD).

[0060] A figura 12 mostra a análise de espectrofluométrica de CD83m-2, 5.

[0061] A figura 13 mostra a análise espectroscópica de CD83m-2 utilizando dicroísmo circular.

[0062] A figura 14 é um cromatograma AEC mostrando os picos da etapa de polimento para hCD83m-3.

[0063] A figura 15 mostra que a análise SDS-PAGE de CD83m-3 purificado foi submetida a caracterização estrutural utilizando SDS-PAGE (figura 15), CD (figuras 16 e 17) e espectrofluometria (figura 18) com resultados semelhantes aos de hCD83ext do tipo selvagem e CD83m-5.

[0064] A figura 16 mostra a análise espectroscópica de CD83m-3 e CD83 do tipo selvagem (batelada 004 - 04) formulada em Tris a 20 mM, NaCl a 50 mM no pH 7,5 utilizando CD.

[0065] A figura 17 mostra a análise espectroscópica de CD83m-3 (formulada tanto no pH 7,0 quanto no 7.5), utilizando o CD.

[0066] A figura 18 mostra a análise espectrofluométrica de CD83m- 3 formulada tanto no pH 7,0 quanto no 7,5.

[0067] A figura 19 mostra a análise SDS-PAGE não-reduzida das formas monoméricas hCD83ext-m3, hCD83ext-m5 e das formas monoméricas e do dímero de hCD83ext do tipo selvagem.

[0068] A figura 20 mostra a análise SDS-PAGE não-reduzida das formas monoméricas hCD83ext-m3 (m3), hCD83ext-m5 (m5) das formas monoméricas e do dímero das três preparações de hCD83ext do tipo selvagem (004-4, 007 e 023) realizadas em dias diferentes, com ou sem pré-tratamento com NEM para evitar o embaralhamento da ligação dissulfeto.

[0069] A figura 21 mostra os resultados da cromatografia por exclusão de tamanho de hCD83ext-m3, hCD83ext-M5 e três diferentes preparações de hCD83ext do tipo selvagem. Todas as preparações foram tratadas com NEM para evitar o embaralhamento da ligação dissulfeto. O primeiro pico (à esquerda) representa os dímeros, enquanto que o segundo pico (à direita) representa os monômeros.

[0070] A figura 22 mostra a análise SDS-PAGE reduzida de hCD83ext-m3 (m3), hCD83ext-m5 (m5) e três diferentes preparações de hCD83ext do tipo selvagem (wt 004-4,wt 007 e wt 023).

[0071] A figura 23 mostra os resultados da cromatografia por exclusão de tamanho do monômero hCD83ext-m5 mutante e duas diferentes preparações de hCD83ext do tipo selvagem (004-4 e 023).

[0072] A figura 24 mostra a análise SDS-PAGE não-reduzida de duas diferentes preparações de hCD83ext-m5 (501 e 502) e seis diferentes preparações de hCD83ext do tipo selvagem (007, 100, 021, 023, 80 e 90). 021, 023, 80 e 90).

[0073] A figura 25 mostra a análise Western blot não-redutora de diferentes preparações de hCD83ext-m5 e hCD83ext do tipo selvagem.

[0074] A figura 26 mostra a capacidade de várias formulações de hCD83ext do tipo selvagem, hCD83ext-m3 e hCD83ext-m5 de inibirem a produção de TNFa pelos PBMCs primatas estimulados por LPS/IFNY, como medidas tanto por uma porcentagem de monócitos produzindo TNFa quanto pela quantidade média de TNFα produzido por célula.

[0075] A figura 27 mostra a capacidade de hCD83ext do tipo selvagem, hCD83ext-m3 e hCD83ext-m5, todos formulado em pH 7,6, de inibirem a produção de TNFa pelos PBMCs primatas estimulados por LPS/IFNY, como medidas tanto por uma porcentagem de monócitos produzindo TNFa quanto pela quantidade média de TNFa produzida por células (MFU).

[0076] A figura 28 mostra a capacidade de hCD83ext do tipo selvagem (formulada em pH 4,5 ou 5,5) e hCD83ext-m5 (formulada em pH 7,6) de inibirem a produção de TNFa pelos PBMCs primatas estimulados por LPS/IFNy, como medidas tanto por uma porcentagem de monócitos produzindo TNFa quanto pela quantidade média de TNFa produzida por células (MFU).

[0077] A figura 29 mostra a diferença entre a capacidade de hCD83ext do tipo selvagem (formulada em pH 4,5 ou 5,5), ou as formas hCD83ext-m3 mutantes (formulada em pH 5,5) e hCD83ext-m5, duas preparações (formuladas em pH 7,6) de inibirem a produção de TNFa pelos PBMCs primatas estimulados por LPS/IFNY, como medidas tanto por uma porcentagem de monócitos produzindo TNFa quanto pela quantidade média de TNFa produzida por células (MFU).

[0078] A figura 30 mostra as diferenças entre a capacidade de hCD83ext do tipo selvagem (batelada ARG-021; formulada em pH 7,6) e quatro preparações do mutante hCD83ext-m3 monomérico (formulado em pH 4,5 ou 5,5) de inibirem a produção de TNFa pelos PBMCs estimulados por LPS/IFNY humano, como medidas pela porcentagem de monócitos produzindo TNFa.

[0079] As figuras 31 a 35 mostram o efeito do pH e da temperatura no hCD83ext do tipo selvagem (lote 021), como analisado pelo SDS- PAGE não-reduzido (faixa esquerda) e reduzido (faixa direita).

[0080] A figura 36 é o gráfico mostrando a classificação patológica de aloenxertos renais em ratos no POD140: Pontuação média: 0 = normal, 1 = variação mínima, 2 = mudança leve, 3 = mudança moderada, 4 = alteração acentuada.

[0081] A figura 37 é o gráfico mostrando a classificação imuno- histoquímica de aloenxertos renais em ratos no POD140: Pontuação média: 0 = normal, 1 = variação mínima, 2 = mudança leve, 3 = mudança moderada, 4 = alteração acentuada.

Sumário da Invenção

[0082] São fornecidos novos polipeptídeos CD83 solúveis (sCD83) possuindo melhor estabilidade. Em um aspecto, é fornecido um polipeptídeo sCD83 isolado, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 70% de identidade na SEQ ID NO: 7, em que um ou mais resíduos de aminoácidos 1, 2, 3, 4 e 130 estão, opcionalmente, ausentes e resíduos de aminoácidos 12, 20, 85, 92 e 114 são os aminoácidos especificados em qualquer uma das linhas da Tabela 1. Preferencialmente, o resíduo de aminoácido 85 é um aminoácido que não cisteína e, mais preferivelmente, o resíduo de aminoácido 85 é serina.

[0083] Em um outro aspecto, um polipeptídeo sCD83 isolado compreende a SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 70% de identidade na SEQ ID NO: 7, em que um ou mais resíduos de aminoácidos 12, 20, 85 e 92 de SEQ ID NO: 7 está ausente ou é um aminoácido que não cisteína, e, opcionalmente, um ou mais resíduos de aminoácidos 1, 2, 3, 4 e 130 estão ausentes.

[0084] Preferencialmente, o polipeptídeo sCD83 isolado compre ende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 31, em que, opcionalmente, o resíduo de aminoácido 126 está ausente.

[0085] Em ainda um outro aspecto, são fornecidos os ácidos nuclei- cos codificando os polinucleotídeos da invenção, bem como os vetores e as células compreendendo tais polinucleotídeos. Os vetores e as células são úteis para a produção das composições de sCD83 descritas aqui.

[0086] Os polipeptídeos sCD83, aqui fornecidos, são úteis para o tratamento ou a prevenção de uma resposta imune indesejada em um sujeito, tais como doenças autoimunes, rejeição de transplantes e alergia. Consequentemente, são fornecidas as composições farmacêuticas compreendendo os novos polipeptídeos sCD83, bem como os métodos para usar as composições dos novos polipeptídeos sCD83 para o tratamento de doenças autoimunes, rejeição de transplantes e alergia.

[0087] Em ainda um outro aspecto, é fornecido um método para melhorar o resultado de transplante em um receptor de transplante de mamíferos, compreendendo a administração a um dito receptor de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo sCD83 precedente e um ou mais agentes imunossupressores, em que o agente imunossupressor atua de forma sinérgica com o dito polipeptídeo para melhorar o resultado do transplante.

Descrição Detalhada

[0088] Os presentes inventores descobriram que CD83 solúvel (sCD83), em especial os polipeptídeos hCD83ext, correspondendo a SEQ ID NO:5 e 6, perdem a estabilidade durante o armazenamento. Surpreendentemente, verificou-se que a mutação do terceiro resíduo de cisteína hCD83ext resulta em uma estabilidade melhorada e bioatividade comparável. Este resultado foi inesperado, porque, como discutido acima, Zinser e outros (Immunobiology (2006) 211:449-453) descrevem que hCD83ext forma um homodímero, em que as primeiras quatro cisteínas de hCD83ext estão envolvidas na formação de ligações dissulfeto intramoleculares. Assim, tendo em vista Zinser, seria de se esperar que cada uma das quatro primeiras cisteínas de hCD83ext fossem críticas para a manutenção da conformação adequada do domínio extracelular. Inesperadamente, as mutações para estes resíduos de cisteína podem melhorar a estabilidade. Além disso, a estabilidade foi encontrada para ser ainda mais reforçada quando tamponada em pH baixo, de preferência com pH 4,0 a 5,0, mais preferivelmente em um pH de cerca de 4,5. A proteína sCD83 do tipo selvagem parece ser instável e sensível às condições que influenciam a temperatura, o pH, a desamidação e a hidrólise.

[0089] Alguns dos novos polipeptídeos sCD83 da invenção possuindo substituições de aminoácidos para um ou mais dos cinco resíduos de cisteína em hCD83ext são mostrados na Tabela 1. O termo "Não Cys "refere-se a qualquer aminoácido padrão ou não-padrão diferente de cisteína. Preferencialmente, a substituição de um resíduo de cisteína é uma substituição conservadora de tal forma que um aminoácido possuindo um grupo R polar, não-carregado (por exemplo, serina, treonina, metionina, asparagina, glutamina e o aminoácido selenocisteína não-padrão) substitui a cisteína. Alternativamente, o resíduo pode ser eliminado sem substituição. A Tabela 1 mostra cinco posições de aminoácidos na SEQ ID NO: 7 que são sítios potenciais para a substituição ou a supressão dos resíduos de cisteína. A SEQ ID NO: 7 é uma variante da SEQ ID NO: 5, em que um ou mais dos cinco resíduos que são cisteínas na SEQ ID NO: 5 (ou seja, os resíduos 12, 20, 85, 92 e 114) podem ser excluídos ou substituídos por um aminoácido alternativo. Tabela 1

* Não Cys = qualquer aminoácido diferente de cisteína. ** Os resíduos de aminoácidos 12, 20, 85, 92 e 114 correspondem às posições dos primeiro, segundo, terceiro, quarto e quinto resíduos de cisteína do domínio extracelular hCD83, como representado pela SEQ ID NO: 7, em que a numeração destes resíduos é desviada por +4 em comparação com a SEQ ID NO: 4 devido à adição dos resíduos Gly-Ser-Pro-Gly (SEQ ID NO: 41) no N-terminal de SEQ ID NO: 7.

[0090] A Tabela 2 mostra a correlação da numeração dos cinco resíduos de cisteína (ou sítios, onde um outro resíduo de aminoácido pode ser substituído por um resíduo de cisteína) nas SEQ ID NOs: 2 e 4 a 8. A numeração varia devido à presença ou à ausência de diferentes porções de fusão do N-terminal. Por exemplo, a SEQ ID NO: 2 é uma sequência de comprimento total de hCD83, e contém uma sequência sinal de 19 aminoácidos do N-terminal, bem como os domínios citoplásmicos e transmembrana, que estão ausentes nas SEQ ID NOs: 4 a 8. O primeiro resíduo do aminoácido de um domínio extracelular de hCD83 (Thr) está no resíduo de aminoácido 20 de SEQ ID NO: 2. A SEQ ID NO: 4 é o domínio extracelular do amino ácido 125 de uma proteína hCD83, e corresponde aos resíduos de aminoácidos 20 a144 de SEQ ID NO: 2. As SEQ ID NOs:5 a 7 incluem a sequência dos quatro aminoácidos do N- terminal (Gly-Ser-Pro-Gly, SEQ ID NO: 41) fundida em um domínio hCD83ext (resíduos de aminoácidos 5 a 129), que é seguido pelo primeiro resíduo de aminoácido do domínio transmembrana (Ile de resíduo de aminoácido 130). A SEQ ID NO: 8 contém uma etiqueta GST do N-terminal e o sítio de clivagem da trombina (resíduos de aminoácidos 1 a 13) fundida em um domínio hCD83ext (iniciando nos resíduos de aminoácidos 14 a 138), que é seguido pelo primeiro resíduo do aminoácido do domínio transmembrana (Ile de resíduo de aminoácido 139). Tabela 2

[0091] A figura 1 mostra um alinhamento de polipeptídeos CD83 para ser humano (NP_004224.1; SEQ ID NO: 2), chimpanzé (XP_518248.2; SEQ ID NO: 35), cão (XP_852647.1; SEQ ID NO: 36), bovino (NP_001040055.1; SEQ ID NO: 37), camundongo (NP_033986.1; SEQ ID NO: 38), rato (XP_341510.2; SEQ ID NO: 39) e galinha vermelha selvagem (XP_418929.1; SEQ ID NO: 40). Com referência à sequência CD83 humana mostrada na figura 1, o domínio extracelular corresponde aos resíduos de aminoácidos 20 a 144. Os resíduos sublinhados identificam as posições onde ocorrem as substituições ou as exclusões de aminoácido conservativo e não- conservativo no domínio extracelular e o primeiro resíduo de aminoácido de transmembrana dos polipeptídeos CD83 de mamíferos alinhados. Os resíduos sublinhados e em negrito identificam as posições onde ocorrem as substituições ou as exclusões de aminoácido conservativo. As proteínas CD83 humanas e de camundongo possuem 63% da sequência de identidade. A capacidade dos polipeptídeos CD83ext humanos (por exemplo, do tipo Silvestre (wt) ou m3) para suprimir a rejeição de transplantes em camundongos, ratos e primatas não- humanos (vide exemplos) indica uma conservação da estrutura CD83 e a função entre as espécies de mamíferos.

[0092] Consequentemente, em um aspecto, é fornecido um polipeptídeo sCD83, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 70% de identidade na SEQ ID NO: 7, em que os resíduos de ácido amino 12, 20, 85, 92 e 114 são os aminoácidos especificados em qualquer uma das linhas da Tabela 1; e, opcionalmente, um ou mais dos resíduos de aminoácidos 1, 2, 3, 4 e 130 estão ausentes. Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado sCD83 consiste, essencialmente, em uma sequência de aminoácidos precedente. Preferencialmente, o aminoácido 85 é serina e os aminoácidos 12, 20, 92 e 144 são cisteína.

[0093] Em outro aspecto, é fornecido um polipeptídeo sCD83, compreendendo os aminoácidos da sequência de SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 70% de identidade para SEQ ID NO: 7, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos 12, 20, 85 e 92 estão ausentes ou sejam um aminoácido diferente de cisteína, e, opcionalmente, um ou mais dos resíduos de aminoácidos 1, 2, 3, 4 e 130 estão ausentes. Preferencialmente, o resíduo de aminoácido 85 é um aminoácido diferente de cisteína, e os resíduos de aminoácidos 12, 20, 92 e 114 são cisteína. Mais preferivelmente, o resíduo de aminoácido 85 é serina. Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado sCD83 consiste, essencialmente em uma sequência de aminoácidos precedentes. Nas modalidades preferidas, o polipeptídeo sCD83 consiste na SEQ ID NO: 7, nos resíduos de aminoácidos 1 a 129 de SEQ ID NO: 7, nos resíduos de aminoácido 5 a 129 de SEQ ID NO: 7 ou nos resíduos de aminoácidos 5 a 130 da SEQ ID NO: 7.

[0094] Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado sCD83 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 31, em que, opcionalmente, o resíduo de aminoácido 126 está ausente.

[0095] A sequência de identidade dos novos polipeptídeos sCD83 da invenção com SEQ ID NO: 7 pode ser de 70% a 100%. Preferencialmente, a sequência de identidades é de, pelo menos 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou, pelo menos 99%. Os resíduos de aminoácidos na SEQ ID NO 7 podem ser conservativa ou não- conservativamente substituídos. Preferencialmente, as substituições são conservativas. Quando um ou mais dos resíduos de aminoácidos 12, 20, 85, 92 e 114 de SEQ ID NO: 7 não são cisteína, eles são, preferencialmente, selecionados do grupo de aminoácido pequeno e/ou polar, tal como alanina, glicina, valina, treonina, metionina, lisina, arginina, glutamina, asparagina, glutamato, aspartato e, mais preferivelmente, serina.

[0096] Em outras modalidades, a invenção fornece moléculas quiméricas compreendendo qualquer um dos polipeptídeos descritos aqui fundidos a uma sequência de polipeptídeo ou aminoácido heteróloga. Os exemplos não- limitantes de tais moléculas quiméricas compreendem qualquer um dos polipeptídeos descritos aqui fundidos, tanto no N-terminal quanto no C-terminal, a uma sequência de aminoácidos que transmite propriedades de funcionalidade e estabilidade adicionais. Em algumas modalidades, os polipeptídeos sCD83 da invenção compreende, tanto no N-terminal quanto no C- terminal, uma sequência de sinal e/ou uma ou mais sequências de aminoácidos úteis para isolamento de proteínas (por exemplo, uma etiqueta de afinidade, tal como a glutationa-S-transferase, poli-His, FLAG, domínio de ligação de celulose, domínio Fc, Ig, etc), ou uma parte da tal sequência de tal forma que podem permanecer após o processamento da proteína. As porções de peptídeo adicionadas para facilitar a purificação podem, opcionalmente, serem removidas antes da preparação final do polipeptídeo. Como um exemplo não-limitante, o polipeptídeo sCD83 pode compreender, começando no N-terminal, uma etiqueta GST, um sítio de clivagem da trombina e uma sequência hCD83ext (vide, por exemplo, a SEQ ID NO: 8). Esta fusão do polipeptídeo de etiqueta GST pode ser isolada pela ligação à glutationa imobilizada e, em seguida, clivada com trombina). O produto da clivagem conteria, então, a porção carbóxi do sítio de clivagem da trombina (por exemplo, Gly-Ser-Pro-Gly, SEQ ID NO: 41 fundida no N- terminal de hCD83ext. Uma grande variedade de etiquetas de afinidade e métodos para a sua utilização na purificação de proteínas são conhecidas por aqueles versados na técnica. (Vide, por exemplo, Terpe (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:523-533.

[0097] Em algumas modalidades de polipeptídeos quiméricos sCD83, o polipeptídeo sCD83 é fundido no N ou C-terminal a um domínio Fc ou Ig de uma imunoglobulina (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgGA2), de preferência uma imunoglobulina humana. Os métodos para fazer tais proteínas de fusão são conhecidos por aqueles versados na técnica (Vide, por exemplo, Patentes US Nos 5.428.130 e EPA 0 464 533). SCD83-Fc quimérico ou as proteínas de fusão sCD83-Ig pode melhorar as propriedades farmacocinéticas (EPA 0 232 262).

[0098] Os termos "CD83 solúvel", "sCD83" e "CD83ext", como aqui utilizados, referem-se a um polipeptídeo que compreende pelo menos uma parte do domínio extracelular de um membro da família de proteínas CD83 e, em que o polipeptídeo CD83 solúvel não possui um domínio transmembrana CD83 que é capaz de fixar com firmeza a dita molécula na membrana de uma célula na qual é expressa. No entanto, um polipeptídeo solúvel CD83 pode incluir outros resíduos adicionais da proteína CD83 nativa de comprimento total que estão fora do domínio extracelular, tal como uma porção do domínio transmembrana que não é suficiente para fixar com firmeza a proteína CD83 solúvel à membrana de uma célula na qual é expressa. Além disso, os polipeptídeos sCD83 da invenção possuem atividade sCD83.

[0099] Um polipeptídeo sCD83 é dito possuir "atividade sCD83" se apresentar, pelo menos, uma atividade do polipeptídeo sCD83 de SEQ ID NO: 5, medida por qualquer ensaio apropriado. Um polipeptídeo sCD83 é dito possuir "atividade sCD83" se em tal um ensaio possuir pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais da atividade do polipeptídeo sCD83 de SEQ ID NO: 5, medida no mesmo ensaio. Preferencialmente, os polipeptídeos sCD83 da presente invenção são capazes de se ligar a células dendríticas maduras imunoestimulatórias e diminuir a capacidade destas células dendríticas em estimular a proliferação de células T. A atividade sCD83 pode ser avaliada direta ou indiretamente, e pode ser medida in vivo ou in vitro; os ensaios adequados são conhecidos na técnica (Vide, por exemplo, Kruse e outros (2000) J. Virol 74: 7127-7136; Lechmann e outros. (2001) J. Exp Med 194: 1813-1821, que descrevem um ensaio preferido para determinar a ligação das células dendríticas às células T e a formação dos grupos de células dendríticas de células T). O Pedido de Patente US 20040110673, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência, descreve os ensaios para atividade sCD83, tais como: 1) inibição da maturação de DC imatura para amadurecer as DCs na presença de um coquetel de maturação; 2) perda da expressão de CD80 e CD83 por DC madura na cultura com sCD83; 3) inibição da capacidade de DC madura em estimular a proliferação de células T em ensaios de MLR; 4) inibição da formação do grupo típico pelas DCs e a proliferação das células T e 5) inibição da encefalite autoimune experimental(EAE) em camundongos. O exemplo 4 do presente pedido de patente descreve um ensaio para atividade sCD83 que mede a capacidade de sCD83 em diminuir a produção de TNFa pelos PBMCs estimulados por LPS/IFNY.

[00100] Assim, os polipeptídeos sCD83 da invenção podem diminuir a capacidade das células dendríticas maduras imunoestimulatórias em estimular a proliferação de células T para pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% ou mais em comparação a um controle adequado, tal como, por exemplo, uma interação entre células dendríticas maduras imunoestimulatórias e células T na ausência de sCD83.

[00101] Em algumas modalidades, a proteína de sCD83 da invenção pode diminuir a expressão de TNF-α, CD80 e/ou CD83 para células dendríticas maduras imunoestimulatórias in vitro na presença de CD83 solúvel, durante pelo menos uma etapa do processo de maturação de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% ou mais em comparação a um controle adequado (Vide, por exemplo, Lechmann e outros. (2001) J. Exp. Med. 194: 1813-1821; WO 2004/046182; Exemplo 4). Por exemplo, a adição de sCD83 às células dendríticas imaturas altera a expressão de superfície, de maneira tal que a expressão CD80 CD83 são diminuídas. A adição de sCD83 para amadurecer as células dendríticas reduz a expressão de CD83, e as DCs tratadas com sCD83 perdem a capacidade de estimular a proliferação de células T. Desta maneira, pode-se dizer em relação ao sCD83 que o mesmo alterou o imunofenótipo das células tratadas. É para ser entendido por aqueles versados na técnica que as técnicas comumente utilizadas para a análise da expressão dos marcadores da superfície da célula (por exemplo, análise FACS) às vezes pode produzir dados que representam as populações mistas das células, e deve ser tomado cuidado ao identificar quais as populações que podem ser representadas em um determinado conjunto de dados.

[00102] De acordo com a invenção, os derivados de um polipeptídeo sCD83 podem possuir um ou mais aminoácidos com uma cadeia lateral alterada. Tais polipeptídeos derivados incluem, por exemplo, aqueles compreendendo aminoácidos, nos quais os grupos livres de amino formam cloridratos, grupos sulfonil p-tolueno, grupos carobenzóxi; os grupos livres de carbóxi formam sais, metila, e de etil ésteres; os grupos livres de hidroxilas formam os derivados de O-acila ou O-alquila, assim como os aminoácidos de ocorrência natural, por exemplo, 4- hidroxiprolina para prolina, 5-hidroxilisina para lisina, homosserina para serina, ornitina para lisina, etc. Também estão incluídos os derivados do aminoácido que podem alterar a ligação covalente, por exemplo, a ligação dissulfeto que se forma entre dois resíduos de cisteína, que produz um polipeptídeo ciclizado. Um polipeptídeo sCD83 solúvel ou seus derivados, pode ter um padrão de glicosilação nativo de uma molécula CD83 ou um padrão de glicosilação alterado ou pode ser não- glicosilado.

[00103] Os polipeptídeos sCD83 da invenção podem ser um monômero, dímero ou multímero de um polipeptídeo sCD83. A dimerização ou a multimerização pode ser alcançada através da formação de uma ou mais pontes dissulfeto entre os resíduos de cisteína presentes na forma monomérica de uma proteína sCD83 (que estão presentes, por exemplo, nas posições 12, 20, 85, 92 e 114 de SEQ ID NO: 5), ou por meio de uma molécula ligante bifuncional (por exemplo, uma diamina, um composto de ácido dicarboxílico ou similares), ligando as porções funcionais semelhantes ou diferentes (por exemplo, grupos carbóxi, grupos amino, grupos hidróxi, grupos tio, etc.) dentro da forma monomérica do polipeptídeo sCD83. Este último inclui também o uso de polipeptídeos ligantes, por exemplo, de pequenos resíduos de aminoácidos polares tais como: -[(Gly)xSer] y- (em que x é, por exemplo, 3 ou 4, e Y é, por exemplo, 1 a 5)) para produzir estruturas diméricas que podem ser, diretamente, produzidas por técnicas recombinantes. Em modalidades preferidas, o sCD83 é um monômero.

[00104] Polipeptídeos sCD83 podem ser proteínas de fusão de pelo menos uma parte do domínio extracelular de CD83 e seus derivados (Vide, por exemplo, WO 2004/046182), enquanto a proteína de fusão retém uma ou mais atividades sCD83, conforme definidas aqui. Em algumas modalidades, as proteínas compreendendo os resíduos adicionais de CD83 fora do domínio extracelular são abrangidas pelo termo "CD83 solúvel." Dessa maneira, os derivados apropriados incluem, mas não são limitados, as proteínas possuindo sequências adicionais fixadas aos terminais C ou N, por exemplo, as que carregam parte de um domínio transmembrana em seu C-terminal ou as que carregam no N-terminal um peptídeo curto (por exemplo, Gly-Ser-Pro- Gly (SEQ ID NO: 41)), que podem resultar na clivagem de um sítio da trombina pela trombina, por exemplo, como produto de uma engenharia da proteína de fusão, ou um peptídeo curto resultante de um fragmento de GST seguindo a clivagem de uma proteína de fusão), assim como as fusões Ig e Fc.

[00105] Em outra modalidade, são fornecidos os polinucleotídeos isolados codificando os polipeptídeos sCD83 da invenção. Dessa maneira, uma modalidade proporciona um polinucleotídeo isolado que compreende um ácido nucleico codificando um polipeptídeo que pode compreender, consistir na, ou consistir essencialmente na SEQ ID NO: 7 ou em um aminoácido possuindo, pelo menos, 70% da identidade da sequência de SEQ ID NO: 7; em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos 12, 20, 85 e 92 estão ausentes ou é um aminoácido diferente de cisteína; e, opcionalmente, um ou mais resíduos de aminoácidos 1, 2, 3, 4 e 130 estão ausentes. Preferivelmente, o resíduo de aminoácido 85 é um aminoácido diferente de cisteína; os resíduos de aminoácidos 12, 20, 92 e 114 são cisteína. Mais preferivelmente, o resíduo de aminoácido 85 é serina. Preferencialmente, a identidade da sequência é, no mínimo, 75%, 80%. 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou, pelo menos, 99%. Utilizando o código genético, pode-se facilmente imaginar todos os ácidos nucleicos que correspondem a uma estrutura de leitura aberta codificando um polipeptídeo dado.

[00106] Em ainda um outro aspecto, são fornecidos os vetores que compreendem os polinucleotídeos da invenção, bem como as células que compreendem tais vetores. Os vetores e as células são úteis para produzir as composições CD83ext descritas aqui.

[00107] As proteínas CD83, as sequências de ácido nucleico e as estruturas são conhecidas na técnica. A sequência de ácido nucleico de um cDNA de CD83 humano (GenBank No. de Acesso. Z11697) está estabelecida na SEQ ID NO: 1. Esta sequência inclui uma sequência de codificação da posição 11 a 628 de SEQ ID NO: 1 (incluindo o códon de parada). Uma sequência de sinal é codificada nas posições 11 a 67 de SEQ ID NO: 1. A codificação de uma sequência de peptídeo CD83 maduro estende a partir da posição 68 a 625. Os sítios de reconhecimento da enzima de restrição estão presentes no início e no final da SEQ ID NO: 1 (nas posições 1 a 6 e 1755 a 1760). A sequência de aminoácidos de um CD83 humano (conforme estabelecido no GenBank No. de Acesso Q01151 e codificado pela sequência de ácidos nucleicos estabelecida na SEQ ID NO: 1) é estabelecida na SEQ ID NO: 2. Outras sequências de CD83 humano estão disponíveis no Genbank No. de Acesso: NP_001035370 [isoforma b de antígeno CD83, Homo sapiens: SEQ ID NO: 2]; NP_004224 [isoforma a de antígeno CD83, Homo sapiens], EAW55353 [isoforma CRA_c de antígeno CD83, Homo sapiens]; EAW55352 [isoforma CRA_b de antígeno CD83 Homo sapiens]; EAW55351 [isoforma CRA_a de antígeno CD83 Homo Sapens]. Tais sequências podem ser alinhadas para determinar os domínios conservados.

[00108] As sequências CD83 de outros organismos estão disponíveis nos seguintes Genbank Nos. de acesso: ABC68619 [Salmo salar]; CAB63843 e NP_033986.1 (SEQ ID NO: 38 [Mus musculus]; ABM67085 [Sparus aurata]; AAP93912 [Oncorhynchus mykiss], AAO62993 [Ginglymostoma cirratum]; NP_001040055 [Bos taurus, SEQ ID NO: 37]; XP_518248 [Pan trogloditos, SEQ ID NO: 35]; XP_001093364 [Macaca mulatta]; XP_418929 [Gallus gallus; SEQ ID NO: 40]; NP_001101880 e XP_341510.2 [Rattus norvegicus, SEQ ID NO: 39]; AAZ06133 [Mesocricetus auratus]; ACC60995 [Marmota monax] e XP_852647 [Canis familiaris, SEQ ID NO: 36].

[00109] Outros membros da família CD83 de proteínas podem ser obtidos pela hibridização de um ácido nucleico que compreende, por exemplo, a totalidade ou uma parte da região codificadora de CD83 humano que codifica a porção extracelular em diferentes fontes de ácidos nucleicos (por exemplo, o DNA, cDNA ou RNA genômico) de outros animais, tais como os mamíferos, ou de outros tecidos do mesmo organismo. Os polinucleotídeos adicionais codificando os polipeptídeos sCD83 podem ser feitos pela mutação in vitro ou in vivo de polinucleotídeos sCD83 conhecidos e/ou isolados, ou as tais sequências de polinucleotídeos podem ser sintetizadas in vitro.

[00110] Uma vez que uma codificação de ácidos nucleicos de uma proteína CD83 de ocorrência natural ter sido sequenciada, o domínio extracelular pode ser determinado pela comparação entre o domínio extracelular de moléculas CD83 conhecidas com o da sequência CD83 clonada. A forma solúvel de uma dada proteína CD83 de ocorrência natural pode ser expressada de forma recombinante utilizando as técnicas descritas aqui. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica CD83 solúvel da invenção pode ser produzido e inserido em um vetor e transformado em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, utilizando técnicas bem-conhecidas descritas aqui e conhecidas ainda na área (Sambrook e outros. Molecular cloning:. A Laboratory Manual, Laboratório de Cold Spring Harbor, NY, 1989).

[00111] Um ácido nucleico de interesse que codifica uma forma solúvel de um membro da família de proteínas CD83 para uso de acordo com a presente invenção, pode ser inserido em um vetor de expressão para expressão in vitro (por exemplo, utilizando, ensaios de transcrição/translação in vitro ou kits comercialmente disponíveis), ou pode ser inserido em um vetor de expressão que contenha uma sequência promotora que facilita a transcrição e/ou a translação tanto em procariontes quanto em eucariontes pela transferência do vetor de expressão em uma célula apropriada. O termo "vetor" refere-se a um plasmídeo, vírus ou outro veículo conhecido na técnica que pode ser manipulado pela inserção ou a incorporação de um polinucleotídeo. Tais vetores podem ser usados para a manipulação genética (ou seja, "vetores de clonagem") ou podem ser usados para transcrever ou transladar o polinucleotídeo inserido ("vetores de expressão"). Um vetor, geralmente, contém pelo menos uma origem de replicação para a propagação em uma célula e um promotor. Os elementos de controle, incluindo os elementos de expressão de controle estabelecidos aqui, presentes dentro de um vetor de expressão são incluídos para facilitar a transcrição e a translação (por exemplo, o sinal de junção para íntrons, a manutenção da estrutura de leitura correta do gene para permitir a translação do mRNA na estrutura e, códons de parada, etc.) O "elemento de controle" é pretendido incluir, no mínimo, um ou mais componentes, cuja presença pode influenciar a expressão, e também pode incluir componentes adicionais, por exemplo, sequências líder e sequências de parceiro de fusão.

[00112] Uma célula na qual um vetor pode ser propagado e seus ácidos nucleicos transcritos, ou os polipeptídeos codificados expressados, é referida aqui como uma "célula hospedeira". O termo inclui também qualquer descendência da célula hospedeira em assunto. Mais além, um ácido nucleico de interesse, de acordo com a presente invenção, pode ser inserido em um vetor de expressão para a expressão in vivo para a terapia do gene somática. Com estes vetores, por exemplo, os vetores retrovirais, vetores de adenovírus, vetores de vírus adenoassociados, vetores de expressão de plasmídeo, os ácidos nucleicos da invenção são expressos na infecção/introdução do vetor em DC.

[00113] As células hospedeiras incluem, mas não estão limitadas, aos microrganismos, tais como bactérias, fungos, insetos e organismos de mamíferos. Em modalidades preferidas, a célula hospedeira é Escherichia coli. Por exemplo, as bactérias transformadas com o ácido nucleico bacteriófago recombinante, o ácido nucleico de plasmídeo ou vetores de expressão de ácido nucleico cosmídeo contendo um ácido nucleico de interesse; fungos transformados com os vetores de expressão de fungo recombinantes contendo um ácido nucleico de interesse; sistemas de células vegetais infectados pelo vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformados com os vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, plasmídeo Ti), contendo um ácido nucleico de interesse; sistemas de células de insetos infectados pelos vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, um baculovírus) contendo um ácido nucleico de interesse; ou sistemas de células de animais infectados pelos vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, os retrovírus, adenovírus, vírus vaccínia), contendo um ácido nucleico de interesse ou uma engenharia de sistemas de células animais transformadas para expressão estável.

[00114] Para a expressão a longo prazo das formas solúveis dos membros da família de proteínas CD83 nas células hospedeiras, é preferida a expressão estável. Dessa maneira, utilizando os vetores de expressão que contenham as replicações de origens virais, por exemplo, as células podem ser transformadas com um ácido nucleico de interesse controlado pelos elementos de controle adequados (por exemplo, sequências promotoras/potenciadoras, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.). Opcionalmente, o vetor de expressão também pode conter um ácido nucleico codificando um marcador selecionável ou identificável que confere resistência a uma pressão seletiva, assim, permitindo que as células possuindo o vetor a ser identificado, cresçam e se expandam. Alternativamente, o marcador selecionável pode ser um segundo vetor que é cotransfectado em uma célula hospedeira com um primeiro vetor contendo um polinucleotídeo da invenção.

[00115] Uma série de sistemas de seleção pode ser utilizada, incluindo, mas não limitado, ao gene timidina quinase do vírus de herpes simples, ao gene hipoxantina-guanina fosforibosil transferase e aos genes adenina fosforibosi ltransferase podem ser utilizados nas células tk, hgrpt ou aprt, respectivamente. Adicionalmente, a resistência antimetabólita pode ser usada como a base da seleção para dhfr, que confere resistência ao metotrexato; o gene gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico; o gene de neomicina, que confere resistência aos aminoglicosídeos G-418; e o gene higromicina, que confere resistência à higromicina. Os genes selecionáveis adicionais foram descritos, ou seja, trpB, que permite as células utilizarem indol no lugar de triptofano; hisD, que permite as células utilizarem histinol no lugar de histidina; e ODC (ornitina descarboxilase) que confere resistência aos inibidores da ornitina descarboxilase, 2-(difluormetil)-DL-onitina, DFMO.

[00116] Os métodos para transformar as células procarióticas e as eucarióticas com os ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos sCD83 da invenção, são conhecidos por aqueles versados na técnica. Após a transformação, a forma solúvel de CD83 pode ser isolada e purificada de acordo com os métodos convencionais. Os métodos de produção, purificação e manipulação de várias proteínas e derivados dos mesmos, bem como os ácidos nucleicos codificando os mesmos também são bem-conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook e outros. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Laboratório Cold Spring Harbor, NY); vide também Patente US N° 7169898; EUA Pat. App. App. N° 10/382, 397 e EUA Pat. App. App. N° 10/535. 522. Por exemplo, o lisado preparado a partir de uma expressão hospedeira (por exemplo, as bactérias) pode ser purificado por HPLC, cromatografia de exclusão por tamanho, eletroforese em gel, cromatografia de afinidade ou outras técnicas de purificação. As proteínas substancialmente puras também podem ser obtidas pela síntese química utilizando um sintetizador de peptídeo (por exemplo, Applied Biosystems, Inc., Foster City, Califórnia; modelo 430A ou similares).

Formulações de sCD83

[00117] As composições de CD83ext podem ser processadas em conjunto com adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, adequados e/ou veículos para fornecer as formas farmacêuticas adequadas para as várias indicações e tipos de vias de administração. Uma composição farmacêutica adequada pode incluir veículos, qualquer solução fisiológica adequada ou dispersante ou similares, solubilizantes, adjuvantes, estabilizantes, conservantes, formulações de liberação sustentada, etc. As soluções fisiológicas compreendem qualquer solução aceitável ou meios de dispersão, tais como a solução salina ou a solução salina tamponada. O veículo também pode incluir agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e agentes que atrasam a adsorção, e similares. Exceto na medida em que qualquer meio convencional, veículo ou o agente é incompatível com o ingrediente ativo, a sua utilização é contemplada. O veículo pode ainda compreender um ou mais compostos adicionais, incluindo, mas não estão limitados, as citocinas, tais como, por exemplo, a interleucina-10 (IL-10) e TGF-β. Os exemplos de tais formulações e métodos de sua preparação são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 ed. (1985) Mack Pub. Co., Easton, PA, EUA).

[00118] O Pedido de Patente PCT WO2004/046182 descreve hCD83ext do tipo selvagem purificado e os polipeptídeos hCD83m-5 (possuindo as SEQ ID NOs: 5 e 6, respectivamente) formulados em uma solução salina de fosfato tamponada (PBS) com pH 7,6. No entanto, conforme descrito aqui, CD83ext e as variantes do mesmo possuem maior estabilidade quando formulados em um pH mais baixo. Por exemplo, o polipeptídeo hCD83ext purificado, tal como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, está predominantemente na forma monomérica quando pela primeira vez purificado de acordo com o método descrito no Exemplo 1. Após a armazenagem em PBS em um pH de 7,3 a 7,6, a proteína progressivamente dimeriza e perde a bioatividade. Em contraste, hCD83ext armazenado em pH mais baixo, não apresentou a mesma perda em atividade. Surpreendentemente, CD83ext-m5 (SEQ ID NO: 6) foi menos sensível ao pH elevado do que o equivalente de tipo selvagem (SEQ ID NO: 5).

[00119] Consequentemente, é fornecida uma composição farmacêutica, que compreende: um polipeptídeo CD83ext e um tampão fisiologicamente aceitável possuindo um pH de 4,0 a 5,0. Preferivelmente, o pH 4,3 a 4,7. Mais preferivelmente, o pH é cerca de 4,5. Em modalidades preferidas, o polipeptídeo CD83ext é o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, 5, 6 ou 7. De preferência, o tampão é tampão de acetato, mais preferivelmente tampão de acetato a 20mM, pH ~ 4,5.

[00120] Os requerentes também descobriram que a estabilidade e bioatividade de hCD83ext é melhorada pela formulação de uma composição compreendendo trealose. Dessa maneira, a composição é fornecida compreendendo um polipeptídeo sCD83 formulado em 1 a 15% (w/v) de trealose. Preferivelmente, a trealose está presente em cerca de 5 a 12% w/v, mais preferivelmente em cerca de 10% w/v.

[00121] Algumas modalidades das composições de sCD83 da invenção podem ainda compreender um ou mais excipientes, tais como, mas não limitado aos tampões, sais, tensoativos, poliálcoois, açúcares metais polivalentes, modificador de viscosidade, antioxidante e crio- protetores e combinações dos mesmos. Tais excipientes incluem, mas não estão limitados a glicina, histidina, Fe (3+), Mg (2+), ácido ascórbico, metionina, vitamina E, EDTA e a combinação de arginina mais o ácido glutâmico.

[00122] Em modalidades preferidas, os polipeptídeos CD83ext são formulados de 1,5 a 2,5 (de preferência 2,0) mg/mL em um tampão acetato a 20 mM, pH 4,5, 10% w/v de trealose, 0,5% w/v de ácido ascórbico e, opcionalmente, arginina a 50 mm mais ácido glutâmico a 50 mM, e armazenados congelados (preferivelmente em cerca de - 20°C). Tais formulações são estáveis após vários ciclos de congelamento e descongelamento e são adequadas para administração a um sujeito. Todos os excipientes preferidos estão tanto na lista do FDA de ingredientes inativos quanto estão presentes em produtos de fármaco intravenosos aprovados.

[00123] Qualquer via de administração pode ser usada incluindo, mas não limitada a transcutânea, intracutânea (i.c), intraperitoneal (i.p), subcutânea (s.c), intramuscular (i.m), intravenosa (i.v), internodal (i.n), etc., pode ser escolhida para a entrega de CD83ext e derivados do mesmo. Preferivelmente, CD83ext é administrado i.v. um dos versados na técnica irá apreciar que as diferentes formas de administração serão adequadas para diferentes compostos e/ou indicações, e será capaz de selecionar o método mais adequado de administração. Por exemplo, a psoríase pode ser tratada topicamente com uma formulação adequada para administração à pele, enquanto o lúpus eritematoso sistêmico pode ser tratado pela administração a um sujeito de uma formulação adequada para injeção intraperitoneal. Os profissionais versados na técnica estão familiarizados com os critérios e os métodos de ajuste das doses e da administração dos compostos, como, por exemplo, a avaliação dos resultados dos testes convencionais clínicos e laboratoriais, incluindo ensaios bioquímicos e imunológicos. Onde for apropriado, os componentes de um medicamento podem ser administrados separadamente.

[00124] Para o uso terapêutico ou profilático, os compostos da presente invenção sozinhos ou em combinação com outros compostos moduladores imunes (por exemplo, os antígenos induzindo tolerância, Ciclosporina A, além de FK506 mais MMF, rapamicina mais CD45RB, corticosteroides, etc.), são administrados a um indivíduo, preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um paciente humano, para tratamento ou prevenção em uma maneira apropriada para a indicação médica.

[00125] Em algumas modalidades, sCD83 é administrado a um indivíduo, fornecendo ao indivíduo um ácido nucleico que codifica uma proteína sCD83. Por exemplo, sCD83 pode ser administrado a um indivíduo como um DNA ou mRNA codificando o polipeptídeo sCD83 de SEQ ID NO: 7. Da mesma forma, em algumas modalidades, sCD83 é fornecido para as células in vitro ou in vivo através da transformação de uma célula hospedeira (isto é, uma célula) com um ácido nucleico que codifica uma proteína sCD83; a célula hospedeira transformada pode então expressar proteína sCD83, proporcionando assim proteína sCD83 com outras células, bem como a si mesmo (isto é, a célula hospedeira transformada). Em tais modalidades, as células hospedeiras adequadas incluem as células dendríticas. Em modalidades onde sCD83 é fornecido como uma proteína CD83 codificando o ácido nucleico, o termo "sCD83" pode também referir-se ao ácido nucleicos codificando a proteína sCD83. Qualquer ácido nucleico adequado pode ser utilizado, incluindo DNA, RNA ou um ácido nucleico sintético, desde que codifique uma proteína CD83. Um ácido nucleico pode ser fornecido em um vetor apropriado para a expressão da proteína codificada ou do fragmento de proteína. Os vetores e métodos adequados para produzi- los são conhecidos na técnica.

Usos terapêuticos de sCD83

[00126] As composições de sCD83, descritas aqui, são úteis para a prevenção, cura, redução e/ou alívio de pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio causado pela disfunção ou função indesejada de uma resposta imune. Por exemplo, o polipeptídeo hCD83ext de SEQ ID NO: 5, foi avaliado em uma série de modelos animais. Utilizando o modelo de encefalite autoimune experimental (EAE) em camundongo (um modelo para a esclerose múltipla humana), a paralisia pode ser inibida por sCD83 na definição tanto em um pré-tratamento quanto em um tratamento ativo. Os dados recentes também demonstram que sCD83 é capaz de prolongar a sobrevida do enxerto cardíaco e da pele em camundongos, e quando usado em combinação com doses subterapêuticas de agentes imunossupressores bem-caracterizados, sCD83 é capaz de um efeito a longo prazo na sobrevida do enxerto em um modelo de transplante cardíaco murina. Os dados experimentais indicam também que sCD83 pode inibir o aparecimento de diabetes em um modelo de comando tipo 1. Além disso, os resultados estão disponíveis, aos quais sugerem que o tratamento com sCD83 não resulta em imunossupressão global. Os exemplos aqui demonstram que o polipeptídeo CD83ext de SEQ ID NO: 7 (em que os resíduos de aminoácidos 1, 2, 3, 4 e 130 estão presentes, o resíduo de aminoácido 85 é Ser e os resíduos de aminoácidos 12, 20, 92 e 114 são Cys) é eficaz na prevenção da rejeição de enxerto em modelos de mamíferos de coração e transplante renal.

[00127] Dessa maneira, algumas modalidades fornecem um método para tratar ou prevenir pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio causado pela disfunção ou função indesejada de uma resposta imune em um indivíduo, compreendendo a administração de um polipeptídeo sCD83 da invenção ao referido indivíduo. As disfunções ou funções indesejadas de uma resposta imune incluem doenças autoimunes, rejeição de transplante, doença e alergia do versus hospedeiro. A doença autoimune que pode ser tratada utilizando os novos polipeptídeos sCD83 da invenção incluem, mas não estão limitadas aos, lúpus eritematoso sistêmico, diabetes autoimune (tipo I), esclerose Pênfigo, doença de Grave, tireoidite de Hashimoto, miastenia grave, automiocardite, esclerose múltipla, artrite reumatoide, psoríase, uveoretinite autoimune, vasculite, uma doença inflamatória crônica intestinal, tais como doença de Crohn ou colite ulcerativa, autoimunopatias associadas a B27 HLA, tais como Morbus Bechterew, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), espondilite anquilosante e AIDS.

[00128] Consequentemente, os polipeptídeos CD83 solúveis da invenção e/ou ácidos nucleicos codificando tais polipeptídeos sCD83 podem ser utilizados para a produção de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de uma doença ou condição médica causada pela disfunção ou função indesejada de uma resposta imune. Por exemplo, tais medicamentos podem ser utilizados para a prevenção ou tratamento de doenças autoimunes, alergias, asma, rejeição de um tecido ou transplante de órgãos, ou uma resposta imune indesejada para uma composição terapêutica, de tal forma que a resposta imune indesejada é reprimida.

[00129] Em algumas modalidades, a resposta imune indesejada é direcionada para uma composição terapêutica, e um objetivo da invenção é tolerar o indivíduo à tal composição terapêutica. Um indivíduo é considerado para ser tolerado e/ou ter sido imunossuprimido (ou seja, a tolerância imunológica é considerada ter sido induzida ou adquirida) se pelo menos um desses objetivos for alcançado.

[00130] Induzindo a "imunossupressão" ou "tolerando" a um indivíduo, como utilizado aqui, significa que pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio causado pela disfunção ou função indesejada de uma resposta imune envolvendo células dendríticas, células B e células T é impedido, curado, reduzido ou aliviado em comparação a um controle não-tratado ou um outro controle adequado, (por exemplo, em comparação com o sintoma anterior ao tratamento ou a gravidade esperada do sintoma sem tratamento, se o tratamento for destinado a impedir o desenvolvimento ou a reduzir a gravidade de uma resposta imune). Aqueles versados na técnica estão familiarizados com a seleção e a aplicação dos métodos de medição e avaliação dos sintomas, bem como com a seleção de controles adequados.

[00131] Dessa maneira, o sujeito é considerado a ser tolerado e/ou a imunossupressão é considerada ter ocorrido onde pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio causado pela disfunção ou função indesejada de uma resposta imunológica é reduzido ou aliviados em, pelo menos, 10%, 20 %, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% em comparação a um controle adequado. Em modalidades em que o tratamento se destina a reduzir o risco de um indivíduo em desenvolver um distúrbio autoimune, o risco é reduzido ou aliviado em, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% em comparação a um controle adequado; esta avaliação pode ser realizada estatisticamente em uma população de indivíduos. Em modalidades onde o tratamento destina-se a tolerar um indivíduo para uma composição terapêutica, uma função indesejada de uma resposta imunológica é reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80 %, 90%, 95% ou 100% em comparação a um controle adequado. Em outras modalidades, os objetivos da invenção incluem a produção de células dendríticas tolerogênicas; nestas modalidades, "sintoma" refere-se a um parâmetro do comportamento das células, tanto in vivo quanto em in vitro.

[00132] Os métodos da invenção são úteis para fins terapêuticos e, dessa maneira, são destinados a prevenir, curar ou aliviar pelo menos um sintoma de uma doença ou um distúrbio causado pela disfunção ou função indesejada de uma resposta imune. Um sintoma de uma doença ou um distúrbio é considerado ser reduzido ou aliviado se o sintoma for diminuído, aumentado ou melhorado, conforme o caso, em, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 70%, 90% ou mais em comparação a um controle adequado, tal como em comparação com o sintoma anterior ao tratamento ou em comparação com a gravidade esperada do sintoma, onde o tratamento destina-se a ser preventivo. Um versado na técnica está familiarizado com as técnicas e os critérios para avaliar as mudanças nos sintomas. Os sintomas das doenças ou dos distúrbios causados pela disfunção ou função indesejada de uma resposta imune são conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem o seguinte: histologia anormal de um tecido transplantado, função anormal de um tecido transplantado; duração breve de tempo de sobrevida após o evento, tal como, por exemplo, o diagnóstico ou a transplantação; nível anormal ou indesejavelmente alto ou baixo ou número de proteína(s) indicadora(s) ou outro(s) composto(s) no sangue, tais como anticorpos indesejáveis ou células indesejáveis (por exemplo, o antígeno específico de células dendríticas ou células T); nível anormal ou indesejavelmente alto ou baixo ou o número de células indicadoras no sangue ou em outras partes do corpo, por exemplo, um nível indesejavelmente baixo ou o número de células T reguladoras, de modo que uma resposta imune indesejada é iniciada ou mantida.

[00133] Se necessário, a tolerização ou a tolerância e/ou a imunossupressão in vivo pode ser medida utilizando ensaios in vitro, tais como, por exemplo, em uma reação mista de linfócitos utilizando células isoladas de um indivíduo. Da mesma forma, a tolerização ou a tolerância e/ou a imunossupressão alcançadas em células ex vivo também podem ser medidas em ensaios ex vivo, utilizando diversos tipos de células, tais como, por exemplo, as células dendríticas, as células T ou as células B. Se a tolerização ou a tolerância e/ou a imunossupressão são medidas utilizando um método ex vivo, a tolerização ou tolerância é considerada ter ocorrido se a resposta das células a um estímulo imunológico for reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 70%, 90% ou mais em comparação a um controle adequado. Os ensaios direta ou indiretamente apropriados medem a resposta imune e são conhecidos na técnica; eles incluem, mas não estão limitados a: ensaios de reação mista de linfócitos; ensaios de citotoxicidade; ensaios de titulação de anticorpos; ensaios para a produção de IL-10; ensaios para a produção de TGF-β; avaliação dos marcadores da superfície de célula; e ensaios para a expressão de Foxp3.

[00134] As proteínas de sCD83 da invenção podem ser coadministradas com outros compostos imunossupressores. O termo "composto imunossupressor" refere-se a um composto que é capaz de esgotar o tamanho de uma população de clones de linfócitos T e/ou B, ou que é capaz de suprimir a sua reatividade, expansão ou diferenciação. Os compostos imunossupressores para uso nos métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a: inibidores da calcineurina, incluindo a ciclosporina (também conhecida como "CsA", comercializado como Neoral® ou Sandimmun®) e tacrolimus (também conhecido como "FK506," comercializado como Prograf®), inibidores de metabolismo purina, tais como o micofenolato de mofetil (também conhecido como "MMF," comercializado como CellCept®) e azatioprina (comercializado como Azasan® ou Imuran®), inibidores da proliferação, tais como everolimus (comercializado como Certican®) e sirolimus (também conhecido como "rapamicina" ou "Rapa", comercializado como Rapamune®); anticorpos monoclonais ("mAb"), tais como anti-CD45 e anti-CD45RB (vide, por exemplo, Patente US No. 7.160.987); anticorpos monoclonais dirigidos contra as células T, tais como OKT3; anticorpos monoclonais dirigidos contra o receptor IL-2, incluindo anticorpos antiTat humanizados, tais como basilixamab e daclizumab; substâncias que bloqueiam as vias da célula T coestimulatórias, tais como proteína de fusão CTLA-4-Ig1; substâncias que são capazes de induzir quimerismo (ou seja, a coexistência entre o doador e o receptor de células imune, em que o tecido do enxerto é reconhecido por si mesmo); e os tratamentos de pré-transplante não-mieloblativos, tais como a ciclofosfamida (comercializado como Cytoxan®). Para uma discussão sobre os imunossupressores e os seus alvos, vide, por exemplo, Stepkowski (2000) Expert Rev. Mol. Med. 21 de junho de 2000: 1-23).

[00135] Por "quantidade eficaz" de uma substância entende-se que uma quantidade é, no mínimo, suficiente para atingir pelo menos um objetivo da invenção, quando administrada a um indivíduo de acordo com os métodos da invenção. Dessa maneira, por exemplo, uma "quantidade eficaz" de uma composição terapêutica sCD83 é, no mínimo, suficiente para tolerar ao indivíduo uma composição terapêutica, quando é coadministrada a um indivíduo com CD83 ou produz um efeito mensurável sobre pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio causada pela disfunção ou função indesejada de uma resposta imune. A quantidade eficaz de um composto imunossupressor sCD83 pode ser determinada com relação aos sintomas exibidos em um indivíduo ou pode ser determinada a partir de estudos clínicos ou extrapolados de estudos adequados em sistemas modelo. Dessa maneira, por exemplo, uma quantidade eficaz de um composto imunossupressor sCD83 inclui uma quantidade que seria esperada para produzir um efeito mensurável em pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio com base em um intervalo de dosagem determinado em um estudo clínico utilizando um método da invenção.

[00136] Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens. As administrações, aplicações e dosagens adequadas podem variar em função de uma série de fatores, incluindo, mas não limitados a: atividade específica das composições; a formulação das composições; o peso corporal, idade, saúde, doença e condição do sujeito a ser tratado; e a via de administração das composições para um indivíduo. Em alguns casos, a quantidade mínima de sCD83 necessária para ser uma quantidade eficaz pode ser reduzida devido à presença de CD83 solúvel preexistente no paciente (vide, por exemplo, Hock e outros (2006) (Tissue Antigens 67: 57 - 60)); um dos versados na técnica será prontamente capaz de ajustar a dosagem e a administração, etc., a fim de alcançar os melhores resultados. Por exemplo, sCD83 pode ser administrado a um paciente dentro de um intervalo possuindo: uma extremidade inferior de 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 7, 10, 20, 50, 70, 100, 200, 500 ou 700 mg/kg, ou 1, 2, 5, 7, 10, 20, 50 ou 100 g/kg; e uma extremidade superior de 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 7, 10, 20, 50, 70, 100, 200, 500 ou 700 mg/kg ou 1, 2, 5, 7, 10, 20, 50, 100 ou 200 g/kg.

[00137] Como o indivíduo pode ser tolerado aos compostos exógenos por CD83, para fins terapêuticos, é importante que o indivíduo seja exposto, pelo menos, durante o tratamento ou, pelo menos durante a janela da eficácia de CD83, aos compostos aos quais a tolerização não é desejada. Dessa maneira, por exemplo, o indivíduo não deve ser exposto aos antígenos de tumor específicos e aos micro-organismos que causam doenças, incluindo vírus, bactérias, fungos, etc. Geralmente, como utilizado aqui, por "indivíduo" entende-se qualquer animal que necessite de tratamento. Dessa maneira, por exemplo, um "indivíduo" pode ser um paciente humano ou um paciente não-humanos ou mamífero ou pode ser outro paciente que é um animal. Quando a prevenção de uma doença ou de uma condição médica é desejada, um indivíduo pode ser tratado em intervalos regulares (por exemplo, aproximadamente: a cada dois anos, a cada ano, a cada seis meses, a cada dois a quatro meses ou a cada mês). No entanto, em todas as modalidades da invenção, os métodos e as composições da invenção são administrados a um indivíduo que foi identificado como possuindo uma determinada doença ou distúrbio causado pela disfunção ou função indesejada de uma resposta imune ou a um indivíduo que foi identificado como sendo susceptíveis de desenvolver uma determinada doença ou distúrbio. Por exemplo, um indivíduo pode ser identificado como suscetível de desenvolver uma determinada doença ou distúrbio como um resultado do exame do histórico familiar do indivíduo, de um teste médico, tal como um teste genético ou um teste para determinar a enzima do indivíduo ou os níveis de metabólito, ou de ser diagnosticado com uma outra doença ou distúrbio. Desta maneira, por exemplo, os métodos da invenção podem ser usados para tratar uma doença autoimune, para evitar o desenvolvimento de uma doença autoimune ou para reduzir o risco de um indivíduo para desenvolver uma doença autoimune. Geralmente, um curso de tratamento termina quando o indivíduo não está sendo tratado para aliviar ou prevenir uma determinada doença ou condição médica causada pela disfunção ou função indesejada de uma resposta imune. Dessa maneira, a invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição médica causada pela disfunção, a resposta imune indesejada ou a função indesejada de uma resposta imune, em que uma quantidade eficaz de sCD83 é administrada a um indivíduo assim que a imunossupressão for alcançada. Em uma modalidade, a resposta imune indesejada é selecionada do grupo consistindo em doenças autoimunes, rejeição de transplantes e alergia. Tais métodos podem ainda compreender a administração de uma ou mais ciclosporina A (CsA); rapamicina mais anticorpo anti-CD45RB monoclonal; e tacrolimus (FK506) mais micofenolato mofetil (MMF).

[00138] Em modalidades preferidas, a doença autoimune é selecionada do grupo consistindo em lúpus eritematoso sistêmico, diabetes tipo I, Pênfigo, doença de Graves, tireoide de Hashimoto, miastenia grave, automiocardite, esclerose múltipla, artrite reumatoide, psoríase, uveoretinite autoimune, vasculite, uma doença crônica inflamatória intestinal, doença de Crohn ou colite ulcerativa, Morbus Bechterew, espondilite anquilosante e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).

[00139] Em algumas modalidades, é fornecido o uso de um novo polipeptídeo sCD83 da invenção para a fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir uma resposta imune indesejada em um indivíduo mamífero.

[00140] Em outro aspecto, é fornecido um método para melhorar o resultado de transplante em um receptor de transplante de mamíferos, compreendendo administrar ao dito receptor uma quantidade terapeuti- camente eficaz do polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e um ou mais agentes imunossupressores, em que o agente imunossupressor atua de forma sinérgica com o dito polipeptídeo para melhorar o resultado do transplante. Em uma modalidade, o dito agente imunossupressor é ciclosporina A. Em outras modalidades, os ditos agentes imunossupressores são rapamicina mais anticorpo anti- CD45RB monoclonal; ou tacrolimus (FK506) mais micofenolato mofetil (MMF).

[00141] Os métodos da invenção podem ser utilizados a fim de tratar indivíduos que são ou podem ser afetados por uma doença ou distúrbio causado pela disfunção ou função indesejada de uma resposta imune, tal como, por exemplo: alergia, asma, rejeição de uma transplante de tecido, uma resposta imune a uma substância administrada cronicamente, uma doença autoimune, tais como miastenia grave, esclerose múltipla, vasculite, uma doença inflamatória crônica intestinal, tais como doença de Crohn ou colite ulcerativa, espondilite anquilosante, lúpus eritematoso sistêmico, doenças de pele tais como psoríase, artrite reumatoide e diabetes mellitus dependente de insulina e AIDS. Os métodos da invenção podem ser usados para tratar os indivíduos afetados por uma doença ou distúrbio que envolve as células B ou funções de células B, tais como, por exemplo: hiperplasia de células B, tal como a leucemia (incluindo mieloma múltiplo e leucemia linfoide aguda); células B de hiperatividade associada a AIDS, síndrome do choque tóxico, doença do soro e doença periodontal (vide, por exemplo, Mahanadi e outros (2002) J. Periodontal Res 37: 177-183). A doença do soro é um grupo de sintomas causado por uma resposta imune indesejada a certos medicamentos ou soro. Ou seja, a doença do soro pode resultar quando o antissoro de outro animal ou de ser humano é dado a um indivíduo em um esforço para induzir a imunização passiva. Em algumas modalidades, os métodos da invenção proporcionam tratamento para uma doença ou distúrbio que envolve as células B ou as funções da célula B, em que o tratamento não resulta em depleção de células B, ou seja, uma diminuição no número e/ou subtipo de células B no indivíduo.

[00142] Dessa maneira, em algumas modalidades, os métodos da invenção são usados para prevenir, curar ou aliviar, pelo menos, um sintoma de rejeição de um transplante de tecido em um receptor de tecidos. Em tais modalidades, o receptor de transplante ("receptor" ou sujeito) pode ser tratado com sCD83 e, opcionalmente, um antígeno associado com o tecido transplantado, tal como, por exemplo, um antígeno preparado a partir de ou extraído do tecido transplantado, por exemplo, por lise ou homogeneização de uma amostra do tecido transplantado. Geralmente, o tratamento dos receptores do transplante de acordo com os métodos da invenção pode incluir um tratamento prévio, em conjunto com (ou seja, ao mesmo tempo), e/ou após o transplante do tecido. Em algumas modalidades, os métodos da invenção previnem, curam ou aliviam todos os sintomas adversos da rejeição de um transplante de tecido, de forma tal que o tratamento contínuo do indivíduo transplantado para evitar a rejeição se torne desnecessário; em tais modalidades, diz-se que a tolerância de enxerto foi induzida no indivíduo.

[00143] Em algumas modalidades, o doador do tecido a ser transplantado ("doador do transplante") pode ser tratada com sCD83 antes de remover o tecido para transplante no receptor pretendido, em que o objetivo do tratamento é induzir a tolerância e/ou a imunos- supressão no receptor do transplante. Em algumas modalidades, tanto o doador do transplante quanto o receptor do transplante podem ser tratados de acordo com os métodos da invenção.

[00144] O termo "tecido", como usado aqui, engloba os órgãos distintos e/ou tecidos especializados (por exemplo, fígado, rim, coração, pulmão, pele, ilhotas pancreáticas, etc.), bem como o termo tecidos "líquidos" (por exemplo, sangue, componentes do sangue, tais como plasma, células, tais como células dendríticas, etc.); o termo "tecido" também abrange partes e subpartes dos órgãos distintos e dos tecidos "líquidos".

[00145] Aqueles versados na técnica estão familiarizados com os métodos de avaliação e tratamento dos receptores e doadores de transplante, a fim de alcançar o melhor resultado possível para tanto os receptores quanto os doadores. Dessa maneira, os versados na técnica prontamente são prontamente capazes de avaliar e ajustar as dosagens e a administração de CD83, pelo menos um outro composto imunos- supressor e, opcionalmente, uma composição terapêutica como adequado para um determinado indivíduo. Como será prontamente apreciado a partir da discussão acima, os métodos da invenção compreendem uma série de etapas; estas etapas podem ser executadas em qualquer ordem, desde que pelo menos um objetivo da invenção seja alcançado. Como os métodos podem envolver várias administrações de vários compostos, uma certa sobreposição das etapas também pode ocorrer.

[00146] Os métodos de tratamento fornecidos pela invenção incluem o uso de CD83 e pelo menos um outro composto imunossupressor e a indução da tolerância e/ou imunossupressão em um indivíduo in vivo. Os meios da administração destas substâncias para um indivíduo incluem, mas não são limitados às vias convencionais e fisiologicamente aceitáveis, tais como, por exemplo, oral, pulmonar, parenteral (por exemplo, intramuscular, intra-articular, intraperitoneal, intravenosa (IV) ou injeção subcutânea), inalação (através de uma formulação de pó fino ou uma névoa fina (aerossol)), transdérmico, intradérmico, nasal, vaginal, retal ou rotas de administração sublingual.

[00147] Quando a composição farmacêutica compreende um ácido nucleico para a administração de uma determinada espécie de animal, o ácido nucleico para o uso da invenção pode ser derivado a partir desta espécie. Por exemplo, quando uma composição farmacêutica compreendendo um ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA) codificando sCD83 é para ser administrada aos seres humanos, o ácido nucleico pode codificar um polipeptídeo compreendendo sCD83 de SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de aminoácidos possuindo, pelo menos, 65% identidade de aminoácido de SEQ ID NO: 7. Os ácidos nucleicos para a utilização da invenção podem ser administrados juntamente com os agentes que aumentam a permeabilidade da membrana celular e/ou a captação celular dos ácidos nucleicos. Os exemplos destes agentes são poliaminas, conforme descrito, por exemplo, em Antony e outros (1999) Biochemistry 38: 10775-10784; poliaminas ramificada, conforme descrito, por exemplo em Escriou e outros. (1998) Biochem. Biophys. Acta 1368: 276-288; poliaminolipídeos conforme descrito, por exemplo, em Guy-Caffey e outros (1995) J. Biol. Chem. 270: 31391-31396; DOTMA conforme descrito em Feigner e outros (1987) Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 84: 7413-7417 e porfirinas catiônicas, conforme descrito, por exemplo, em Benimetskaya e outros (1998) Nucl. Acids Res. 26 (23): 5310-5317.

Definições

[00148] Como usados no relatório descritivo e nas reivindicações, as formas singulares "um", "uma", "a" e "o" incluem referências no plural a menos que o contexto claramente indique de outra maneira. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo as respectivas misturas das mesmas.

[00149] Como usado aqui, o termo "compreendendo" destina-se a dizer que as composições e os métodos incluem os elementos citados, mas não excluindo outros. "Consistindo essencialmente em" quando usado para definir as composições e os métodos, deve entender-se excluindo outros elementos de qualquer importância fundamental à combinação. Dessa maneira, uma composição consistindo essencialmente nos elementos como definidos aqui, não poderia excluir os traços de contaminantes a partir do método de isolamento e purificação e veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como uma solução salina de fosfato tamponada, conservantes e similares. Os polipeptídeos ou as proteínas que "consistem essencialmente em" uma dada sequência de aminoácidos são aqui definidos para conter de 0 a 10 aminoácidos adicionais em cada extremidade tanto no N-terminal quanto no C-terminal de uma dada sequência de aminoácidos. Preferivelmente, eles não contêm mais de cinco, preferivelmente não mais que dois, e mais preferivelmente ainda não mais que um aminoácido adicional no terminal amino e/ou carbóxi da proteína ou do polipeptídeo. Os ácidos nucleicos ou polinucleotídeos que "consistem essencialmente em" uma dada sequência de ácido nucleico são aqui definidos para conter não mais que trinta, preferivelmente não mais de seis, mais preferivelmente não mais que três, e mais preferivelmente ainda não mais que um nucleotídeo adicional no terminal 5' ou 3' da sequência de ácidos nucleico. "Consistindo em" significa excluir mais do que elementos de traço dos outros ingredientes e etapas substanciais do método para administrar as composições da presente invenção. As modalidades definidas por cada um destes termos de transição.

[00150] O termo "células dendríticas (DCs)" refere-se a uma população diversificada dos tipos de células morfologicamente semelhantes encontrados em uma variedade de tecidos linfoides e tecidos não-linfoides, Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:271-296. As células dendríticas constituem os APCs mais potentes e preferenciais no organismo. Enquanto as células dendríticas podem ser diferenciadas a partir de monócitos, as mesmas possuem fenótipos distintos. Por exemplo, um marcador específico de diferenciação, o antígeno CD14, não é encontrado nas células dendríticas, mas é possuído por monócitos. Além disso, as células dendríticas maduras não são fagocíticas, enquanto que os monócitos estão fortemente fagocitando as células. Demonstrou-se que DCs maduras podem fornecer todos os sinais necessários para a ativação e proliferação das células T.

[00151] O termo "resposta imune" refere-se, amplamente, as respostas de linfócitos específicas de antígenos às substâncias estranhas. Qualquer substância que pode desencadear uma resposta imune é dita ser "imunogênica" e é referida como um "imunógeno". Todos os imunógenos são antígenos, no entanto, nem todos os antígenos são imunogênicos. Uma resposta imune desta invenção pode ser humoral (através da atividade de anticorpo) ou mediada por células (através da ativação das células T).

[00152] Como usado aqui, o termo "substituição de aminoácido conservadora" refere-se à substituição de um aminoácido por outro aminoácido dentro do mesmo grupo de aminoácidos. Os aminoácidos podem ser classificados de acordo com seus grupos R, da seguinte forma: 1) grupos R não-polares, alifáticos; 2) grupos R polares, não- carregados; 3) grupos R aromáticos; 4) grupos R carregados positivamente; e 5) grupos R carregados negativamente. Os aminoácidos dos grupos R não-polares, alifáticos incluem: glicina, alanina, valina, lucina, isoleucina e prolina. Os aminoácidos dos grupos R polares, não-carregados incluem serina, treonina, cisteína, metionina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos com os grupos R aromáticos incluem fenilalnina e tirosina. Os aminoácidos com grupos R carregados positivamente incluem lisina, arginina e histidina. Os aminoácidos com grupos R carregados negativamente incluem aspartato e glutamato.

[00153] Os termos "polinucleotídeo", "ácidos nucleicos" e "molécula de ácido nucleico" são utilizados indiferentemente para referirem-se às formas poliméricas de nucleotídeos de qualquer tamanho. Os polinucleotídeos podem conter desoxirribonucleotídeos, ribonucleo- tídeos e/ou seus análogos. Os nucleotídeos podem possuir qualquer estrutura tridimensional, e podem executar qualquer função, conhecida ou não-conhecida. O termo "polinucleotídeo" inclui, por exemplo, moléculas de filamento simples, filamento duplo e de hélice tripla, um gene ou um fragmento do gene, éxons, íntrons, mRNA, tRNA, rRNA, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Além de uma molécula de ácido nucleico nativa, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção também pode compreender moléculas de ácido nucleico modificadas. Como usado aqui, mRNA refere-se a um RNA que pode ser traduzido em uma célula.

[00154] O termo "peptídeo" é usado em seu sentido mais amplo para referir-se a um composto de dois ou mais aminoácidos da subunidade, análogos de aminoácidos ou peptídeomiméticos. As subunidades podem ser ligadas por ligações peptídicas. Em outra modalidade, a subunidade pode ser ligada por quaisquer outras ligações, por exemplo, éster, éter, etc. Quando usados aqui, o termo "aminoácido" refere-se tanto aos aminoácidos naturais e/ou artificiais quanto aos sintéticos, incluindo a glicina e tanto os isômeros ópticos D quanto L, análogos de aminoácidos e peptídeomiméticos. Um peptídeo de três ou mais aminoácidos é comumente chamado de oligopeptídeo se a cadeia do peptídeo for curta. Se a cadeia do peptídeo for longa, o peptídeo é comumente chamado de um polipeptídeo ou proteína.

[00155] O termo "veículo de entrega do gene" é definido como qualquer molécula que pode levar os polinucleotídeos inseridos em uma célula hospedeira. Os exemplos de veículos de entrega de genes são lipossomas, polímeros biocompatíveis, incluindo os polímeros naturais e os polímeros sintéticos; lipoproteínas; polipeptídeos; polissacarídeos; lipopolissacarídeos; envelopes virais artificiais; partículas de metal; e as bactérias ou vírus, tais como baculovírus, adenovírus e retrovírus, bacteriófago, cosmídeo, plasmídeo, vetores de fungos e outros veículos de recombinação tipicamente utilizados na técnica, que foram descritos para a expressão em uma variedade de hospedeiros eucarióticos e procarióticos, e pode ser usado para a terapia do gene, bem como para a expressão da proteína simples.

[00156] O termo "entrega do gene", "transferência dos genes", "transfecção" e similares, como aqui utilizados, são os termos que referem-se à introdução de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independentemente do método utilizado para a introdução. A transfecção refere-se à entrega de qualquer ácido nucleico no interior de uma célula. A entrega do gene refere-se à entrega de um ácido nucleico que pode ser integrado no genoma da célula hospedeira, ou que pode se replicar independentemente do genoma da célula hospedeira. A entrega do gene ou a transferência do gene não refere- se à introdução de um mRNA em uma célula. Os métodos de transfecção incluem uma variedade de técnicas, tais como a eletroporação, os complexos de entrega de ácido nucleico com base no íon catiônico, com base no lipídeo e com base na proteína, vetores virais, entrega do "gene gun" e várias outras técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica. O polinucleotídeo introduzido pode ser mantido de forma estável na célula hospedeira ou pode ser expresso de forma transitória. Em algumas modalidades, um mRNA codificando um polipeptídeo sCD83 é introduzido em uma célula e é expressado de forma transitória. A manutenção estável geralmente requer que o polinucleotídeo introduzido tanto contenha uma origem de replicação compatível com a célula hospedeira quanto se integre em um replicon da célula hospedeira, tal como um replicon extracromossômico (por exemplo, um plasmídeo) ou um cromossomo nuclear ou mitocondrial. Um número de vetores é capaz de mediar a transferência dos genes para as células de mamíferos, como é conhecido na técnica e descrito aqui.

[00157] O termo "vetor viral" é definido como um vírus produzido de forma recombinante ou uma partícula viral que compreende um polinucleotídeo a ser entregue em uma célula hospedeira, tanto in vivo, ex vivo quanto in vitro. Os exemplos de vetores virais incluem os vetores retrovirais, vetores de adenovírus, vetores de vírus adenoassociados, vetores alfavírus e similares. Os vetores alfavírus, tais como os vetores com base nos vírus Semliki Forest e os vetores com base no vírus Sindbis, também foram desenvolvidos para uso em terapia e imunoterapia do gene. Vide Schlesinger e Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 e Zaks e outros (1999) Nat. Med. 7:823-827. Nos aspectos onde a transferência dos genes é mediada por um vetor retroviral, um constructo do vetor refere-se ao polinucleotídeo compreendendo o genoma retroviral ou parte do mesmo, e um gene terapêutico. Como usado aqui, a "transferência do gene mediada retroviral" ou a "transdução retroviral" tem o mesmo significado e refere- se ao processo pelo qual um gene ou as sequências de ácidos nucleicos são transferidos de forma estável dentro da célula hospedeira através da força do vírus entrando na célula e integrando seus genomas no genoma da célula hospedeira. O vírus pode entrar na célula hospedeira através do seu mecanismo normal de infecção ou pode ser modificado de tal forma que ele se liga a um receptor ou ligando da superfície da célula hospedeira diferente para entrar na célula. Como usado aqui, o termo "vetor retroviral" refere-se a uma partícula viral capaz de introduzir o ácido nucleico exógeno em uma célula através de um mecanismo de entrada do tipo viral ou viral.

[00158] Os retrovírus transportam a informação genética na forma de RNA; no entanto, uma vez que o vírus infecta a célula, o RNA é transcrito reversamente na forma de DNA que se integra ao DNA genômico da célula infectada. A forma integrada de DNA é chamada provírus. Nos aspectos onde a transferência dos genes é mediada por um vetor de DNA viral, tal como um adenovírus (Ad), pseudoadenoviral ou vírus adenoassociado (MV), o constructo do vetor refere-se aos polinucleotídeos compreendendo o genoma viral ou parte do mesmo, e um transgene. Adenovírus (Ads) são um grupo de vírus relativamente bem-caracterizado e homogêneo, incluindo mais de 50 sorotipos. (Vide, por exemplo, WO 95/27071). Os Ads são fáceis de crescer e não exigem a integração no genoma da célula hospedeira. Os vetores recombinantes derivados de Ad, particularmente aqueles que reduzem o potencial de recombinação e geração de vírus do tipo selvagem, também foram construídos. (Vide, WO 95/00655 e WO 95/11984). MV do tipo selvagem possui alta infectividade e especificidade de integração no genoma da célula hospedeira. (Vide, Hermonat e Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 81:6466-6470 e Lebkowski e outros (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996).

[00159] Os vetores que contêm tanto um promotor quanto um sítio de clonagem, no qual um polinucleotídeo pode ser ligado operacionalmente, são conhecidos na técnica. Tais vetores são capazes de transcrever o RNA in vitro ou in vivo, e estão comercialmente disponíveis a partir de fontes tais como Stratagene (La Jolla, CA) e Biotech Promega (Madison, WI). A fim de otimizar a expressão e/ou transcrição in vitro, pode ser necessário remover, adicionar ou alterar as porções não-traduzidas 5 'e/ou 3' dos clones ou de outras sequências que podem interferir com ou reduzir a expressão, tanto no nível da transcrição quanto no nível de tradução. Alternativamente, o consenso dos sítios de ligação de ribossomo pode ser inserido imediatamente no códon de partida 5' para realçar a expressão.

[00160] Os veículos de entrega de gene também incluem vários vetores não-virais, incluindo os complexos DNA/lipossomos e os complexos proteína-DNA virais alvejados. Os lipossomos que também compreendem um anticorpo-alvo ou fragmento do mesmo podem ser usados nos métodos da presente invenção. Para aumentar a entrega de uma célula, os ácidos nucleicos e proteínas desta invenção podem ser conjugados com os anticorpos ou fragmentos de ligação dos mesmos que ligam os antígenos de superfície da célula, por exemplo, TCR, CD3 ou CD4.

[00161] O termo "hibridização" refere-se a uma reação em que um ou mais polinucleotídeos reagem para formar um complexo que é estabilizado através da ligação de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeos. A ligação de hidrogênio pode ocorrer pelo emparelhamento com base Watson-Crick, ligação Hoogstein, ou em qualquer outra forma de sequência específica. O complexo pode compreender duas fitas que formam uma estrutura duplex, três ou mais fitas que formam um complexo multi-fita, uma fita de auto-hibridização simples ou qualquer combinação destes. Uma reação de hibridização pode constituir uma etapa em um processo mais amplo, tal como o início de uma reação de PCR, ou a clivagem enzimática de um polinucleotídeo por uma ribozima.

[00162] As condições rigorosas de hibridização são as seguintes: a pré-hibridização dos filtros contendo um ácido nucleico de interesse é realizada por 8 horas durante a noite em 65°C em um tampão composto por 6xSSC, Tris-HCl a 50 mM (pH 7,5), EDTA a 1 mM, Ficoll a 0,02%, BSA a 0,02%, e DNA de esperma de salmão desnaturado a 500 μg/mL. Os filtros são hibridizados por 48 horas a 65°C, a temperatura de hibridização preferida, em uma mistura de pré-hibridização contendo DNA de esperma de salmão desnaturado a 100 μg/mL e 5-20x106 da sonda 32 P rotulada. Posteriormente, as lavagens do filtro são realizadas a 37°C por uma hora em uma solução contendo 2xSSC, Ficoll a 0,01% e BSA 0,01%, seguido por uma lavagem em 0,1xSSC a 50°C. por 45 min. Seguindo as etapas de lavagem, as sondas hibridizadas são detectáveis por autorradiografia. Tais métodos são bem-conhecidos na técnica e citados em Sambrook e outros, 1989; e Ausubel e outros, 1989.

[00163] Uma região de polinucleotídeo ou um polinucleotídeo (ou uma região de polipeptídeo ou polipeptídeo) que possui uma certa porcentagem (por exemplo, 80%, 85%, 90% ou 95%) de "identidade de sequência" para outra sequência significa que, quando alinhadas, o percentual das bases (ou aminoácidos) é o mesmo na comparação das duas sequências. Para determinar a identidade da porcentagem das duas sequências de aminoácidos, ou das duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ideal (por exemplo, os intervalos podem ser introduzidos em uma ou tanto em uma primeira quanto em uma segunda sequência de ácido nucleico ou aminoácido para alinhamento ideal e as sequências não-homólogas podem ser desconsideradas para fins de comparação). Em uma modalidade preferida, o comprimento de uma sequência de referência alinhada para fins de comparação, é de, pelo menos, 30%, preferivelmente, pelo menos, 40%, mais preferivelmente, pelo menos, 50%, 60%, e mais preferivelmente ainda, pelo menos, 70%, 80%, 90 %, 100% do comprimento da sequência de referência. Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos nas posições de aminoácidos ou nas posições de nucleotídeos correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas às desta posição (como utilizado aqui, a "identidade" de aminoácido ou ácido nucleico é equivalente ao aminoácido ou ácido nucleico "homólogo"). A identidade da porcentagem entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhada pelas sequências, levando em conta o número de intervalos, bem como o comprimento de cada intervalo, que devem ser introduzidas para o alinhamento ideal das duas sequências.

[00164] A comparação das sequências e a determinação da identidade da porcentagem entre as duas sequências podem ser feitas utilizando um algoritmo matemático. Em uma modalidade preferida, a identidade da porcentagem entre as duas sequências de aminoácidos é determinada utilizando o algoritmo Needleman e Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) o qual foi incorporado ao programa GAP no pacote de software GCG (disponível em gcg.com), utilizando tanto uma matriz Blossum 62 quanto uma matriz PAM250, e um intervalo de peso de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um comprimento de peso de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Em ainda outra modalidade preferida, a identidade da porcentagem entre duas sequências de nucleotídeos é determinada utilizando o programa GAP no pacote de software GCG (disponível em gcg.com), utilizando uma matriz NWSgapdna.CMP e um intervalo de peso de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um comprimento de peso de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Um conjunto particularmente preferido de parâmetros (e o que deve ser utilizado a menos que indicado de outra maneira) é uma matriz de pontuação Blossum 62, com uma penalidade de intervalo de 12, uma penalidade de intervalo estendida de 4, e uma penalidade de intervalo da estrutura de leitura de 5.

[00165] A identidade da porcentagem entre os dois aminoácidos ou as sequências de nucleotídeos pode ser determinada utilizando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17) o qual foi incorporado ao programa ALIGN (versão 2.0), utilizando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade do comprimento de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4.

[00166] O ácido nucleico e as sequências da proteína, descritas aqui, podem ser usadas como uma "sequência de consulta" para realizar uma pesquisa em bancos de dados públicos, por exemplo, para identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Tais buscas podem ser realizadas utilizando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul e outros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. As pesquisas BLAST de nucleotídeo podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento das palavras = 12 para obter sequências de nucleotídeos homólogas às moléculas de ácido nucleico mMafA da invenção. As pesquisas BLAST de proteína pode ser realizada com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento das palavras = 3 para obter as sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína mMafA da invenção. Para obter os alinhamentos de intervalo para fins de comparação, BLAST de intervalo pode ser utilizado, conforme descrito em Altschul e outros, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Quando utilizam-se os programas BLAST e BLAST de intervalo, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser utilizados. Vide ncbi.nlm.nih.gov.

[00167] O termo "isolado" significa separado dos componentes, das células e outros, em que o polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo ou fragmentos dos mesmos, são normalmente associados com os naturais. Por exemplo, no que diz respeito a um polinucleotídeo, um polinucleotídeo isolado é aquele que é separado das sequências 5 'e 3' com o qual é normalmente associado no cromossomo. Como é evidente para aqueles versados na técnica, um polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo ou fragmento (s) do mesmo, ocorrendo de forma artificial, não necessita de "isolamento" para distingui-lo dos que, em contrapartida, ocorrem de forma natural. Além disso, um polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína de anticorpos, ou fragmentos (s) do mesmo "concentrado", "separado" ou "diluído" são distinguíveis dos que, em contrapartida, ocorrem de forma natural, em que a concentração ou o número de moléculas por volume é maior do que o "concentrado" ou menor do que o "separado" dos que, em contrapartida, ocorrem de forma natural. Um polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína de anticorpos, ou fragmento(s) do mesmo, os quais diferem dos que, em contrapartida, ocorrem de forma natural, em sua sequência primária ou, por exemplo, pelo seu padrão de glicosilação, não precisam estar presentes na sua forma isolada, uma vez que é distinguível dos que, em contrapartida, ocorrem de forma natural através da sua sequência primária, ou, alternativamente, por outra característica, tal como glicosilação-padrão. Embora não afirmado explicitamente para cada uma das composições descritas aqui, é preciso entender que todas as modalidades acima para cada uma das composições descritas abaixo e em condições adequadas são fornecidas por esta invenção. Assim, um polinucleotídeo que não ocorre de forma natural é fornecido como uma modalidade separada dos polinucleotídeos isolados que ocorrem de forma natural. Uma proteína produzida em uma célula bacteriana é fornecida como uma modalidade separada da proteína isolada que ocorre de forma natural de uma célula eucariótica ao qual é produzida na natureza. Uma célula de mamíferos, tais como células dendríticas, é isolada, se for removida do sítio anatômico da qual ela é encontrada em um organismo.

[00168] O termo "célula hospedeira", "célula-alvo" ou "célula receptora" destinam-se a incluir qualquer célula individual ou célula de cultura que pode ser ou tenha sido receptores de vetores ou a incorporação de moléculas de ácido nucleico, polinucleotídeos e/ou proteínas exógeno. Também destina-se a incluir a descendência de uma célula simples, e a descendência não pode necessariamente ser completamente idêntica (em morfologia ou no DNA genômico total ou complementar) para a célula-mãe original devido a uma mutação natural, acidental ou deliberada. As células podem ser procarióticas ou eucarióticas, e incluem, mas não estão limitadas, as células de bactérias, células de fungos, células de animais e células de mamíferos, por exemplo, murinos, ratos símios ou seres humanos.

[00169] O termo "indivíduo" é um vertebrado, preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um ser humano. Os mamíferos incluem, mas não estão limitados a murinos, símios, seres humanos, animais de fazenda, animais de esporte e animais de estimação.

[00170] O termo "composição" significa uma combinação de agente ativo e outro composto ou composição, ativa ou inerte (por exemplo, um agente detectável ou rotulado), tal como um adjuvante.

[00171] O termo "composição farmacêutica" destina-se a incluir uma combinação de um agente ativo com um veículo inerte ou ativo, tornando a composição adequada para uso terapêutico ou diagnóstico in vitro, in vivo ou ex vivo.

[00172] Como usado aqui, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" abrange qualquer um dos veículos farmacêuticos padrão, tal como uma solução salina de fosfato tamponada, água e emulsões, tal como uma emulsão óleo/água ou água/óleo, vários tipos de agentes umectantes e outras formulações descritas aqui. As composições também podem incluir estabilizantes e conservantes. Para os exemplos de veículos, estabilizadores e adjuvantes, vide Martin REMINGTON'S PHARM. SCI., 18 ed. (Mack Publ. Co., Easton (1990))

[00173] O termo "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para efeito de resultados benéficos ou desejados, tais como a supressão da resposta imune, tratamento, prevenção ou melhora de uma condição médica (infecção, doença, etc.). Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens. As dosagens apropriadas podem irão variar dependendo do peso corporal, idade, saúde, doença ou condição a ser tratada e a via de administração.

[00174] De acordo com a descrição acima, os exemplos a seguir servem para ilustrar, mas não limitar, os vários aspectos da presente invenção. É para ser entendido, embora nem sempre explicitamente, que os reagentes descritos a seguir são meramente exemplificativos e que os equivalentes dos tais são conhecidos na técnica.

Exemplos Experimentais Métodos gerais:

[00175] Para as técnicas gerais, vide Current Protocols in Immunology, eds. Coico e outros (Wiley, Hoboken, New Jersey). Para os métodos de purificação sCD83, vide Lechmann e outros. (2002) Protein Expr. Purif. 24:445-452.

Exemplo 1 Bioprocesso para Produção de hCD83ext recombinante em E. coli e purificação a jusante

[00176] O plasmídeo pGEX2ThCD83ext (descrito no Pedido de Patente US 2007/0167607 e diagramado na figura 2) foi utilizado para a expressão de hCD83ext. Neste plasmídeo, a expressão de uma proteína de fusão GST-hCD83ext está sob a regulação de um promotor tac induzível a IPTG. A sequência da proteína de fusão é mostrada na SEQ ID NO: 8. Nesta sequência, os resíduos de aminoácidos 1 a 5 correspondem à etiqueta GST, os resíduos de aminoácidos 6 a 13 correspondem a um sítio de clivagem da trombina, os resíduos de aminoácidos 14 a 138 correspondem ao domínio extracelular de CD83 humano, e os resíduos de aminoácidos 139 (isoleucina) correspondem ao primeiro aminoácido contíguo do domínio extracelular de CD83 humano. A etiqueta GST permite a captura da proteína de fusão utilizando a cromatografia de afinidade GST. A proteína capturada pode então ser clivada (tanto dentro quanto fora da coluna) pela trombina em um sítio de clivagem da trombina (entre os resíduos de aminoácidos 9 e 10 ou SEQ ID NO: 8) na junção do GST e da fusão hCD83ext, a fim de liberar a porção hCD83ext. Devido ao design de um sítio de clivagem da trombina na junção entre GST e hCD83ext, o produto final de hCD83ext possui quatro aminoácidos extras (ou seja, Gly-Ser-Pro-Gly, SEQ ID NO: 41) no terminal amino.

[00177] pGEX2ThCD83ext foi transformado em várias cepas de Escherichia coli comuns de DH5α JM109, HB101 e BL21, a fim de escolher o hospedeiro ideal para a expressão hCD83ext. E. coli BL21 superou as outras expressões de hospedeiro (dados não mostrados). BL21 (F-ompT-gal-dcm-lon HSDS (rb-mb); ATCC no. de acesso BAA- 1025) é particularmente adequado para a produção de proteínas recombinantes, devido à inativação dos dois genes da protease (lon e ompT), resultando na diminuição da proteólise dos produtos de genes estrangeiros. A redução da proteólise é particularmente importante para as proteínas recombinantes com uma origem eucariótica, tais como hCD83ext, quando E. coli é utilizado como um hospedeiro de expressão.

[00178] Vários parâmetros de cultura, incluindo a receita média, a condição de indução (ou seja, o tempo de indução e a concentração de IPTG), a velocidade de agitação e a temperatura, foram otimizados para aumentar o rendimento de hCD83ext recombinante. No procedimento otimizado, uma colônia isolada de BL21/pGEX2ThCD83ext foi inoculada em um meio LB a 100 mL acrescido de ampicilina (Ap) a 50 μg/mL e incubada a 37 °C em um agitador rotativo a 200 rpm por aproximadamente 12 horas para produzir uma cultura de semente. A cultura de semente (80 mL) foi usada para inocular um biorreator de bancada (Omni-Cultura, VIRTIS, Gardiner, Nova Iorque, EUA), contendo 1 L de volume de trabalho do meio de cultura (NaCl a 5 g/Ll, extrato de levedura Bacto a 20 g/L, Bacto triptona a 20 g/L, glicose a 5 g/L e anti-espumante 289 a 10 uL/L (Sigma, St. Louis, MO, EUA)). Quando a densidade das células chegou a um OD600 ~ 2, foi adicionado isopropil β-D tiogalactopiranosídeo (IPTG) a 0,5 mM na indução. O biorreator foi então removido com filtro de ar esterilizado a 2 L/min para aeração. O pH da cultura foi regulamentado em 7,0 ± 0,1, adicionando 3 N NH4OH ou 3 N HCl utilizando uma combinação de eletrodo de pH (Mettler Toledo, Suíça), um controlador de pH (PC310, Suntex, Taipei, Taiwan) e duas bombas peristálticas (101 U/R, Watson Marlow, Falmouth, Reino Unido). O biorreator foi operado a 28°C e 650 rpm por aproximadamente seis horas após a indução.

[00179] Após a cultivação, as células foram colhidas por centrifugação a 6000 x g e 2°C por 10 min, pesadas e pélete armazenado a -80°C para posterior processamento. Normalmente, um pélete de célula de aproximadamente 20 g em peso celular úmido (wcw) pode ser obtido a partir de 1 L da cultura. O pélete de célula foi ressuspenso em 0,05 g-wcw/mL em tampão de solução salina de fosfato tamponado (pH 7,3). Uma batelada (20 mL) da suspensão de célula a cerca de 20 OD600 foi sonicada intermitentemente (ou seja, 0,5 segundo dentro, 0,5 segundo fora) por 4 minutos, utilizando um processador ultrassônico com ponta regular (Misonix). O lisado de célula sonicado foi então centrifugado a 15.000 x g e 2 °C por 15 minutos para remover os restos de células. O sobrenadante, contendo proteínas solúveis totais foi filtrado com um filtro de 0,45um antes do processamento cromatográfico subsequente para a purificação de proteínas, e também foi analisado por ensaio de GST, SDS-PAGE e Western blotting.

[00180] Após a preparação do extrato de célula, como descrito acima, a proteína de fusão recombinante GST-hCD83ext foi processada e purificada por três etapas principais: 1) capturar utilizando uma coluna de afinidade a GST, 2) clivar na coluna com trombina para liberar a porção hCD83 na fase líquida e 3) polir através da cromatografia de troca iônica, a fim de remover a trombina e outras proteínas contaminantes (por exemplo, endotoxina). (Vide, por exemplo, Bhikhabhai e outros (2005) J. Chromatogr 1080:83-92; e Dian e outros (2002) J. Chromatogr 769:133-144.). Mais especificamente, na etapa de captura, o lisado preparado acima (ou seja, o sobrenadante filtrado a partir de células sonicadas, que contém proteínas solúveis totais, incluindo a fusão GST-hCD83ext em PBS) foi carregado em uma coluna de afinidade cromatográfica GST (GE Healthcare, Baie d'Urfé, Quebec, Canadá). Estima-se que a coluna de afinidade GST seria saturada pelo GST hCD83ext-carregado em aproximadamente 200 U GST/mL de coluna média. Uma vez que o nível de expressão específica de GST- hCD83ext para uma amostra típica de cultura foi de 2,5 U por unidade de GST/OD600, o lisado obtido a partir de 80 células por unidade de OD600 mL de coluna média foi carregado para a coluna GSTrap.

[00181] A concentração da trombina e do tempo ideal de clivagem para a clivagem in situ do GST ligado a hCD83ext foram determinados. Duas colunas saturadas de afinidade a GST a 20 mL com GST hCD83ext foram inicialmente injetadas manualmente com trombina (Sigma) na coluna de resina a 80 U de trombina/mL, uma concentração sugerida pelo fabricante, incubadas em temperatura ambiente por 2 ou 4 horas, e em seguida, o líquido bruto na coluna cromatográfica de afinidade GST contendo hCD83ext e trombina foi expulso utilizando um volume de coluna do tampão de ligação. A porção de GST junto GST- hCD83ext não-digerido foi, então eluída da coluna com o tampão de eluição (Tris a 50 mM, glutationa a 10 mM, pH 8,0). Observou-se que a incubação por duas horas foi o tempo suficiente para a clivagem. Usando o tempo de incubação de duas horas, a trombina, em várias concentrações (ou seja, 80, 40, 20, 10 e 5 U de trombina/mL de coluna média) foi injetada em cinco colunas saturadas de afinidade GST para testar a eficiência de clivagem e os resultados são resumidos na figura 3. Mais de 95% de GST-hCD83ext foram clivados quando a concentração de trombina foi superior a 10 U de trombina/mL de coluna média, que foi determinada como a concentração de trombina ideal para a realização de clivagem na coluna. Com tal concentração de trombina relativamente baixa, o tempo de incubação foi prolongado para 2,5 horas para garantir a clivagem completa. Embora o grau de pureza hCD83ext nesta fração foi elevado de acordo com a análise de SDS- PAGE (faixas 2 a 5 na figura 3), as proteínas nesta fração pós-GST estavam instáveis e tenderam a degradar (dados não-mostrados).

[00182] A etapa de polimento foi projetada para remover endotoxina, trombina e outras proteínas contaminantes de hCD83ext. Um sistema cromatográfico de baixa pressão (BioLogic LP, BioRad, Hercules, CA, EUA), equipado com uma forte coluna de troca aniônica (Q, GE Healthcare) foi utilizado para o polimento. O tampão Tris (a 20 mM, pH 7,5) com NaCl a 50 mM e tampão Tris com NaCl a 1 M foram utilizados como tampões de carga e eluição, respectivamente. As frações contendo o hCD83ext puro foram reunidas e concentradas com uma ultrafiltração utilizando uma célula agitada de alta pressão (Amicon, modelo 8010 com o disco YM10, Millipore Canadá, Cambridge, Ontário, Canadá). O produto final de hCD83ext foi esterilizado por filtração, antes do armazenamento. Utilizando esta fração do produto final, o coeficiente de extinção de hCD83ext estava determinado a ser de aproximadamente 1,16 OD280-mL/mg/cm. A proteína pode ser ainda mais concentrada e/ou tampão trocado em um tampão de baixo pH utilizando a filtração de fluxo tangencial (ou técnicas semelhantes). Os resultados contendo um cromatograma típica e a análise SDS/PAGE do teor de proteínas de cada fração são resumidos nas figuras 4A e 4B, respectivamente. Como mostrado, um pool do hCD83ext com baixa endotoxina purificado através do fluxo contínuo.

Exemplo 2 Caracterização estrutural de hCD83ext do tipo selvagem

[00183] O hCD83ext do tipo selvagem purificado, quando preparado como descrito no Exemplo 1 e formulado tanto na presença quanto na ausência de 50% de glicerol, degradou quando armazenado a 4°C, talvez devido a uma instabilidade intrínseca desta biomolécula. Dessa maneira, a proteína foi armazenada a -20°C, o que impediu completamente a degradação. No entanto, a dimerização ainda pode acontecer nesta condição congelada durante o armazenamento a longo prazo. Os resultados analíticos utilizando SDS/PAGE reduzidos e não reduzidos de várias amostras de hCD83ext de diferentes bateladas e, portanto, com diferentes idades, estão resumidos nas figuras 5 e 6. Embora essas amostras mostraram um padrão idêntico, quando analisadas por um SDS-PAGE reduzido (figura 5), elas eram bem diferentes em termo da composição de dímero quando analisadas pelo SDS-PAGE não-reduzido (figura 6). Geralmente, a composição de dímero aumentou monotonicamente com a idade da amostra, indicando a conversão progressiva do monômero ao dímero sob esta condição de armazenamento. Note-se que havia pelo menos duas formas diferentes de monômero (faixa 6, figura 6) e três formas diferentes de dímero (faixas 3 e 7, figura 6) provenientes de diversas preparações da amostra.

[00184] Lechmann e outros (Biochem. Biophys. Res. Commun. (2005) 329:132-139) identificaram a quinta cisteína de hCD83ext como o resíduo de aminoácido chave mediando uma ligação dissulfeto intermoleculares para formar dímeros de hCD83ext. No entanto, quando armazenados nas condições relativamente oxidativas armazenadas anteriormente, a análise de SDS/PAGE não-reduzida revelou a tendência das preparações de hCD83ext purificado em formar dímeros, trímeros, tetrâmeros e multímeros ainda maior (figura 7B). A identidade destas bandas de alto peso molecular foi investigada por Western blotting com anticorpos anti-CD83. Resumidamente, as proteínas separadas pelo SDS-PAGE não-reduzido (figura 7B) foram transferidas para uma membrana de PVDF após SDS-PAGE utilizando uma Célula Mini TransBlot® (Bio-Rad) de acordo com um protocolo padrão (Towbin e outros (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 76:4350-4354). A transferência eletroforética foi conduzida em uma voltagem constante de 100 V por 1 h. A hibridização da proteína-anticorpo foi realizada conforme descrito por Sambrook e outros. Cloning Molecular: A Laboratiry Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Nova Iorque, EUA, 1989. Um anticorpo monoclonal anti-CD83 de camundongo (CD83-1G11, laboratórios Cedarlane limitada, Hornby, Ontário, Canadá) foi utilizado como anticorpo primário. O anticorpo secundário foi IgG de cabra anti- camundongo conjugado com a peroxidase de rábano-silvestre (Sigma). Os polipeptídeos hCD83 relacionados (por exemplo, GST-hCD83ext e hCD83ext) foram detectados por um método colorimétrico utilizando tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) como substrato. Como mostrado na figura 7C, as bandas correspondentes aos dímeros, trímeros, tetrâmeros e multímeros ainda maiores eram de fato hCD83ext relatado. Este dado sugere que um ou mais dos quatro primeiros resíduos de cisteína de hCD83ext estão envolvidos na formação de ligações dissulfeto intramoleculares e/ou intermoleculares. As várias formas de monômeros e dímeros nas figuras 6 e 7 podem eventualmente resultar em diferentes emparelhamentos entre estes cinco resíduos de cisteína associados às pontes dissulfeto intramoleculares. Dessa maneira, embora Cys129 seja o resíduo-chave que conduz a formação da ligação dissulfeto intermolecular para a dimerização, outros resíduos de cisteína também poderiam estar envolvidos na formação extensa de pontes dissulfeto intermoleculares para multimerização.

Exemplo 3 Construção, purificação e caracterização dos novos mutantes de Cisteína a Serina de hCD83ext

[00185] Há cinco resíduos de cisteínas (ou seja, os resíduos de aminoácidos 27 (8), 35 (16), 100 (81), 107 (88), e 129 (110) de SEQ ID NO: A (SEQ ID NO: 1), especificados aqui como Cys1, Cys2, Cys3, Cys4 e Cys5, respectivamente) em hCD83ext do tipo selvagem mostrado na SEQ ID NO: A (a qual corresponde aos resíduos de aminoácidos 20 a 144 do hCD83 mostrado na SEQ ID NO: 2). Enquanto Cys 5 foi previamente demonstrado ser importante na formação do dímero hCD83ext (Lechmann e outros (2005)), a presença de multímeros maiores, como mostrados na figura 6, sugere que, além de Cys5, outros resíduos de cisteína podem ser responsáveis pela formação das ligações dissulfeto intermoleculares e intramoleculares. A fim de investigar esta possibilidade, dois plasmídeos, pGEX2ThCD83ext (descrito acima) e pGEX2ThCD83extmutC129S (descrito no Pedido de Patente US 2007/0167607 e gentilmente cedido pelo Dr. Alexander Steinkasserer), foram utilizados para a mutagênese de sítio dirigida a fim de estudar a função dos outros resíduos de cisteína hCD83ext. pGEX2ThCD83ext e pGEX2ThCD83extmutC129S são idênticos, com exceção do códon para o resíduo do ácido aminado 129. Em pGEX2ThCD83ext, este códon especifica o resíduo de cisteína do tipo selvagem, enquanto que em pGEX2ThCD83extmutC129S, este códon foi mutado para codificar um resíduo de serina.

[00186] Dez novos plasmídeos foram construídos a partir pGEX2ThCD83ext ou pGEX2ThCD83extmutC129S utilizando a mutagênese de sítio dirigida a um ou mais dos outros três códons cisteína (ou seja, Cys2 Cys3, e Cys4) para os códons de serina (Nota: Estas cisteínas para as mutações de serina são referidas como mutações "C2S"). As variantes do CD83 mutante C2S foram nomeadas como CD83m-X, Y, Z, em X, Y e Z especificam o número de cisteína (s) com a mutação C2S. O termo "CD83m-X, Y, Z" (por exemplo, CD83m- 3) é utilizado, intercambiavelmente, com o termo "CD83ext-MX, Y, Z" (por exemplo, CD83ext-m3). Por exemplo, CD83m-3,4 é um mutante CD83 com a mutação C2S em tanto em Cys100 (ou seja, Cys3) quanto em Cys107 (ou seja, Cys4), enquanto o mutante original de hCD83extmutC129S pode ser especificado como CD83m-5. Os plasmídeos na Tabela 3 são nomeados pela adição de "p" em frente as variantes mutantes CD83 correspondentes. As sequências de sCD83 referidas na Tabela 3 por SEQ ID NOs correspondem à sequência da região CD83 extracelular mais o primeiro aminoácido do domínio transmembrana (Ile). Nota-se que estas sequências não incluem a porção de GST e o sítio de clivagem da trombina que são fundidos no N-terminal do domínio extracelular, não incluem as sequências do vetor. Tabela 3 Plasmídeos e Oligonucleotídeos

[00187] Três iniciadores (ou seja, CYS2 CYS3 e CYS4 na Tabela 1) foram utilizados para a mutagênese sítio dirigida pelo direcionamento dos códons Cys2, Cys3 e Cys4. As mutações silenciosas também foram introduzidas para gerar novos sítios de restrição (ou seja, Scal para Cys2 e Cys4 e SacI para Cys3) para fins de triagem. A restrição da digestão de vários plasmídeos mutados com SCAI e SacI foi utilizada para rastrear a presença da combinação desejada de mutações C2S (dados não- mostrados). A região de codificação de cada região variante da proteína de fusão hCD83ext foi confirmada pelo sequenciamento de DNA, e as SEQ ID NOs correspondentes à região de codificação (mas não inclinados a etiqueta GST e o sítio de clivagem da trombina) estão listadas na Tabela 2. Nota-se que um códon de arginina "AGG" (no resíduo de aminoácido número 50 de hCD83ext) em todos os plasmídeos derivados (e possivelmente em pGEX2ThCD83ext e pGEX2ThCD83extmutC129S também) é diferente da arginina do códon correspondente de "AGA" na sequência cDNA de CD83 depositada no GenBank, embora essa diferença não afete a sequência da proteína CD83.

[00188] A produção e a purificação de cada mutante CD83 foram realizadas utilizando os protocolos de fermentação e purificação descritos no Exemplo 1. Tipicamente, os dois maiores picos de eluição de proteínas aparecem no perfil do cromatograma da etapa de polimento utilizado a cromatografia de troca iônica (AEC) e as frações correspondentes ao primeiro pico são reunidas e concentradas para formar o produto final hCD83ext. No entanto, o primeiro pico da etapa de polimento para a purificação de CD83m-2,5 pareceu ser reduzido significativamente sob condições normais de funcionamento e a maioria de CD83m-2,5 foi eluída no segundo pico, quando o gradiente de sal foi aplicado (figura 8). Essa baixa produtividade não melhorou quando o pH do tampão foi reduzido para 6,5 (dados não-mostrados). No entanto, CD83m-2,5 ainda pode ser purificado pela junção das frações correspondentes ao primeiro pico menor. A caracterização estrutural mostrou que, embora o padrão de banda de CD83m-2,5 parece ser semelhante ao hCD83ext de tipo selvagem com a análises SDS-PAGE redutoras e não-redutoras (figuras 9 e 10, respectivamente), a proteína apresentou um perfil muito diferente na análise espectroscópica utilizando dicroísmo circular (CD) (figura 11) e espectrofluorimetria (figura 12). Resultados semelhantes foram observados quando purificam-se os dois outros mutantes de CD83m-2 (figura 13) e CD83m- 2, 3,5 (dados não-mostrados). Desde CD83m-2, CD83m-2,5 e CD83m- 2,3,5 dividam a mutação C2S em Cys2, os dados sugerem que esta mutação pode resultar em uma mudança significativa na estrutura da proteína ou nas propriedades bioquímicas, a qual melhoram sua ligação às resinas AEC e, posteriormente, afetarão o perfil de eluição durante a etapa de polimento. Com base na previsão da proteína estrutural, uma ligação dissulfeto intramolecular poderia se formar entre Cys2 e Cys4. A presença desta ligação dissulfeto intramolecular pode ser importante na estabilização da estrutura da proteína ou, até mesmo, melhorar a bioatividade.

[00189] Usando exatamente a mesma da fermentação e os protocolos de processamento a jusante para hCD83ext do tipo selvagem e CD83m-5, CD83m-3 foi produzido e purificado. Os dois picos de eluição principais das proteínas apareceram na etapa de polimento utilizando AEC (figura 14) e a questão da produção acima associada com CD83m-2 não foi observada na produção de CD83m-3, o que implica que a mutação C2S em Cys3 Cys5 e não resultou em uma grande mudança estrutural. CD83m-3 purificado foi submetido a caracterização estrutural utilizando SDS-PAGE (figura 15), CD (figuras 16 e 17), e espectrofluorimetria (figura 18) com resultados semelhantes aos hCD83ext de tipo selvagem e CD83m-5. Nota-se que uma duplicação clara e reprodutível foi observada no SDS-PAGE não- reduzido (figura 15). Além disso, nota-se que nenhuma dessas duas bandas correspondendo aos 3 CD83m duplos pareceram possuir uma mobilidade idêntica às espécies monoméricas de CD83m-5, mas a banda superior CD83m-3 pareceu possuir uma mobilidade idêntica às espécies monoméricas dos hCD83ext do tipo selvagem (figura 19). Para evitar o embaralhamento da ligação dissulfeto potencial durante a preparação da amostra para SDS-PAGE não-reduzido, o protocolo foi modificado pelo pré-tratamento da amostra com N-etilmaleimida (NEM). Os grupos alquilatos NEM livres de tiol nos resíduos de cisteína não formaram ligações dissulfeto e, dessa maneira, evitam a ligação dissulfeto subsequente pelo resíduo de cisteína. Parece que o protocolo modificado utilizando NEM fornece um método mais confiável e consistente para a quantificação de dímeros de CD83, impedindo qualquer embaralhamento da ligação dissulfeto potencial, e o monômero de CD83 é observado como uma única banda, ao invés de dupla (figura 20).

[00190] Anteriormente Zinser e outros. (Immunobiology (2006) 211:449-453) relataram que Cys5 é a cisteína principal responsável pela dimerização de CD83 e que hCD83ext-m5 formou monômeros ao invés de dímeros. No entanto, observou-se uma significativa dimerização de hCD83ext-m5 na análise com cromatografia de exclusão por tamanho (SEC; figura 21) e este resultado foi consistente com o resultado de SDS-PAGE não-reduzido utilizando o protocolo modificado com o pré- tratamento de NEM (figura 20). Surpreendentemente, a dimerização de hCD83ext-m3 ausente ou mínima baseou-se nos resultados de SEC (figura 21) e SDS-PAGE não-reduzido com o protocolo de NEM modificado (figura 20). Estes resultados sugerem que Cys3 ou mesmo outros resíduos de cisteína (ou seja, Cys1, Cys2 e Cys4) também poderiam desempenhar papel relevante na dimerização CD83. Nota-se que a molécula de hCD83ext-m3 parece possuir uma mobilidade idêntica às espécies de monômero de hCD83ext do tipo selvagem, mas uma mobilidade um pouco maior do que CD83m-5 (figura 20). Dessa maneira, as formas monoméricas de hCD83ext-m3 e hCD83ext-m5 podem possuir uma estrutura diferente, enquanto que o monômero de hCD83extm3 poderia possuir uma estrutura de proteínas semelhantes ou até mesmo idênticas ao monômero de hCD83ext do tipo selvagem. Todas estas variantes de CD83 parecem possuir um padrão de banda idêntico na análise com mobilidade SDS-PAGE reduzido (figura 22) e SEC reduzido (figura 23), em que apenas as espécies monoméricas foram observadas.

[00191] Em resumo, observou-se que ao utilizar SDS-PAGE reduzido (figura 24), contraria-se a afirmação anterior de que hCD83ext- m5 está presente apenas como um monômero (Nota para mim mesmo: revisar este pedido de patente), outros resíduos de cisteína nas espécies mutantes podem estar envolvidos na multimerização para formar dímeros, trímeros e até mesmo tetrâmeros. Estas espécies multiméricas mostraram estarem associadas ao CD83 utilizando Western blotting (figura 25).

Exemplo 4 Comparação de hCD83ext do tipo selvagem, hCD83m3 e hCD83m5 e o efeito do pH na estabilidade da proteína

[00192] A capacidade de hCD38ext do tipo selvagem e mutante para inibir a produção de TNFa pelas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) estimuladas por LPS/IFN-y foi avaliada em um ensaio in vitro utilizando PBMCs de macacos cinomólgos. Especificamente, as PBMCs de cinomólgos foram isoladas e pré- tratadas por 12 horas com diferentes concentrações (0,5, 5, 25 e 100 μg/mL) de hCD83ext do tipo selvagem (formulado em pH 4,5 ou 5,5), hCD83ext-m3 ou hCD83ext-m5 (501-1). HCD83ext-m3 e hCD83ext.m5 foram formulados com pH 5,5 ou 7,6, respectivamente. As células foram então ativadas durante 6 horas com LPS (1 μg/mL) mais IFN-y (100 U/mL) na presença de Brefeldina A (4 μg/mL) e depois intracelularmente marcadas por TNFa utilizando um kit Fix/Perm disponível comercialmente. A aquisição e a análise do fluxo de citometria da quantidade de TNFa produzido foi avaliada utilizando tanto células dendríticas mieloides quanto monócitos. Os resultados são expressos na % do mDC ou monócitos produzindo TNFa e na Média de Unidades de Fluorescência (MFU), os quais representam os níveis de TNFa com base em cada célula. Como mostrado na figura 26, hCD83m-3 é mais ativo que o mutante m5, que é mais ativo do que o hCD93ext do tipo selvagem na inibição da produção de TNFa pelas PBMCs estimuladas. Além disso, hCD83ext do tipo selvagem mantém maior atividade quando formulado em pH 4,5 do que quando formulado em pH 5,5. As formulações de hCD83ext do tipo selvagem tanto em pH4,5 quanto em pH 5,5 são mais ativas do que as formulações em pH 7,6 (dados não- mostrados).

[00193] A atividade de hCD83ext-M5 e hCD83ext do tipo selvagem foi comparada em um ensaio de inibição semelhantes a TNFa, como descrito acima, com a exceção de que tanto as proteínas do tipo selvagem quanto as do mutante m3 foram formuladas em pH 7,6. Como mostrado na figura 27, hCD83ext-m5 superou duas preparações de hCD83ext do tipo selvagem na capacidade de inibir a produção de TNFa pelas PBMCs cinomólgas estimuladas por LPS/IFN-y.

[00194] A proteína hCD83ext do tipo selvagem originalmente formulada em pH 7,6 (dados mostrados nas figuras 26 e 27) teve tampão trocado por um tampão com um pH de 4,5 ou 5,5 e re-testada, como descrito acima, para a capacidade de inibir a produção de TNFa pelas PBMCs cinomólgas estimuladas por LPS/IFN-y in vitro. Os dados mostrados na figura 28 demonstram que a bioatividade da proteína do tipo selvagem (WT) pode ser reforçada através da formulação do material em um tampão acídico (pH 4,5 ou pH 5,5). Consequentemente, um pH de cerca de 4,5 a 5,5 pode estabilizar o hCD83ext, por minimizar potencialmente o impacto do estresse do ambiente (por exemplo, oxidação, desaminação, temperatura etc.). No entanto, quando hCD83ext-m3 foi formulado em pH 5,5, foi mais ativo do que o tipo selvagem formulado tanto no pH 4,5 quanto no pH 5,5 (figura 29). HCD83ext-m3 é também mais ativo do que hCD83ext-m5, no entanto, o hCD83m-5 em pH 5,5 não foi testado neste ensaio. Curiosamente, quando a capacidade do tipo hCD38ext do tipo selvagem, hCD83ext- m3 e hCD83ext-m5 para inibir a rejeição do enxerto foi testada em um modelo in vivo de transplante de coração de camundongo (100 ug por mouse por dia, durante 8 dias), pareceu haver uma pequena diferença em sua habilidade de prolongar a sobrevida do enxerto. Quando utilizado como monoterapia, cada uma das formas foi capaz de prolongar a sobrevida do enxerto em um tempo de sobrevida média de 8 dias a aproximadamente 14 dias. Quando combinado com imunossupressores comercializados (inclusive Ciclosporina), todas as formas exibiram perfis sinérgicos semelhantes aos perfis de sobrevida a longo prazo. Assim, um valor de hCD83ext-m3 e ajuste de pH (para o pH baixo) parece ter melhorado a estabilidade da proteína total.

[00195] A estabilidade/atividade melhorada de hCD83ext-m3 quando comparada a hCD83ext do tipo selvagem foi confirmada em um ensaio semelhante, utilizando PBMCs humanas. Como mostrado na figura 30, cada uma das quatro diferentes preparações de hCD83ext-m3 (-002-23 formulado em PBS, pH 5,5; -002-1 formulada em Tris, pH 7,6; -003-22 formulado em PBS pH 5,5 e -003-3-2 formulado em PBS, pH 4,5) superou hCD83ext do tipo selvagem (designado como ARG-021 formulado em PBS pH 7,6) na sua capacidade de inibir a produção de TNFa pelas PBMCs humanas estimuladas por LPS/IFN-y.

Exemplo 5 Glicerol estabiliza as Formulações de hCD83ext

[00196] Quando hCD83ext é formulado para armazenamento com uma concentração final de glicerol a 50% (uma menor concentração de glicerol também pode ser utilizada) e posteriormente testada in vivo em uma concentração final de glicerol a 8% em combinação com a ciclosporina no modelo de transplante de coração de camundongo, foi registrada a sobrevida do enxerto a longo prazo (> 100 dias), enquanto que nos experimentos em que o glicerol foi omitido do estudo de combinação, a sobrevida média foi limitada a aproximadamente 14 dias. Exemplo 6 Degradação da Força de hCD83ext do tipo selvagem

[00197] Um estudo da degradação da força com o lote 021 da solução estoque de hCD83ext do tipo selvagem (alíquotas congeladas em PBS pH 7,6, ~ 6 mg CD83/mL) foi realizado da seguinte forma. Várias alíquotas foram descongeladas e combinadas. As soluções foram preparadas conforme descrito na tabela abaixo: Tabela 4 Condições de Estresse para um Estudo da Degradação da Força

[00198] Na conclusão do tempo de exposição demonstrado, as amostras acídicas e básicas foram neutralizadas. Todas as amostras foram armazenadas a -20°C até serem analisadas utilizando SEC- HPLC e géis de foco isoelétrico (IEF). Os resultados de SEC-HPLC são fornecidos na Tabela 5. Tabela 5 SEC-HPLC: Resumo do Estudo da Degradação da Força

[00199] Os dados gerados utilizando SEC-HPLC e o foco isoelétrico (não-mostrado), indicam que os produtos de degradação de hCD83ext são mais eletronegativos do que o material de partida. Isso pode ser atribuído principalmente às desamidações múltiplas ou a hidrólise e será avaliado em estudos de pré-formulação em curso. Esses dados também sugerem que o pH acídico está se estabilizando tanto no estado de agregação quanto no estado de carga de hCD83ext. Com relação ao estado de carga, IP será de 6,9. Outra banda principal aparece na temperatura ambiente (TA) de controle, com pI de ~6,8.

[00200] Do ponto de vista do tamanho molecular, as condições acídicas (pH ~2) favoreceram o monômero (~ 4% de agregação, mesmo que o controle TA). Todas as outras condições (base, peróxido, luz, calor, TA) mostraram um aumento de agregação. hCD83ext parece ser de luz estável. A degradação observada para esta amostra é mais provável devido à exposição às condições ambientes, ao invés de luz. É claro que tanto o calor (70°C) e a condição básica (pH ~12) causaram uma degradação rápida; e, após quatro horas, as bandas principais estão ausentes e uma infinidade de bandas eletronegativas são observadas. As condições acídicas (pH ~2) pareceu estabilizar a proteína tanto para o estado de agregação quanto para o estado de carga de hCD83ext. O perfil IEF parece intacta, mesmo quando comparado ao controle de TA.

[00201] Para investigar ainda o papel do pH e a sua influência na estabilidade da proteína, hCD83ext do tipo selvagem (lote 021 em PBS, pH 7,6) foi recentemente descongelado e analisado (primeira linha da Tabela 6) ou armazenado em temperatura ambiente em 2 a 8°C, em pH de 4, 5, 6, 7, 8 e 9. As amostras foram mantidas a -70°C até serem analisadas, após 1, 2, 4 e 10 dias de armazenamento. Estas amostras foram então analisadas por SEC-HPLC (Tabela 6) ou utilizando Bioanalisador SDS-PAGE (em condições reduzidas e não reduzidas; figuras 31 a 35). Tabela 6 Resumo do Resultado SEC-HPLC para o Estudo da taxa de degrades do pH

[00202] Estes dados sugerem que as condições são mais favoráveis para apoiar a estabilidade de sCD83 quando sCD83 é tamponado em pH baixo (pH 4 a 5), sob essas condições as alterações na agregação e estado de carga parecem ser minimizadas. Além disso, a exposição à base de peróxido, calor, luz ou às condições de temperatura ambiente parecem aumentar a agregação ou a fragmentação e/ou a degradação.

[00203] Todos os experimentos com animais a seguir foram realizados de acordo com as orientações do Canadian Council on Animal Care. Os experimentos descritos abaixo utilizaram sCD83 recombinante, purificado humano de E. coli, tanto de uma forma do tipo selvagem (hCD83ext-wt; SEQ ID NO: 5) quanto de uma forma mutante m3 (hCD83ext-m3; SEQ ID NO: 7), em os aminoácidos 12, 20, 92 e 114 são cisteína (Cys) e o aminoácido 85 é serina (Ser). Exemplo 7 HCD83ext-m3 Induz Tolerância de Aloenxerto a Longo Prazo no Modelo de Transplante de rim em murino

[00204] O modelo de transplante de rim ortotópico em comando (vide Zhang e outros (2005) Microsurgery 16 (2) :103-109) foi utilizado para avaliar a capacidade de hCD83ext-m3 em induzir a tolerância do aloenxerto. Os camundongos BALB/c receberam aloenxertos de rim de camundongos C57BL/6 doadores. Os camundongos receptores foram tanto não-tratados (dois camundongos) quanto tratados com hCD83ext-m3 (3 camundongos; 100 μg/camundongo/dia, i.v.) um dia antes do transplante (dia 1), o dia do transplante (dia 0) e por sete dias pós-operatório (POD). Os dois camundongos não tratados sobreviveram por 28 e 35 dias, dando um tempo médio de sobrevida (MST) de 31 ± 4,9 dias. Os três camundongos tratados com hCD83ext-m3 cada, sobreviveram por mais de 100 POD. Consequentemente, a monoterapia com hCD83ext-m3 conduz à aceitação do aloenxerto a longo prazo no modelo de transplante de rim ortotópico no camundongo. Em um experimento separado, resultados semelhantes foram obtidos por tratamento com hCD83ext- wt. Exemplo 8 CD83ext-wt ou CD83-m3 sozinho ou em combinação com Ciclosporina A suprime a rejeição do transplante no modelo de Aloenxerto de coração heterotópico em murino

[00205] Modelo animal: modelo de transplante de coração em camundongo C57BL/6-to-BALB/c

[00206] O modelo de Aloenxerto de coração heterotópico em murino foi utilizado para determinar o efeito de hCD83ext-m3 tanto sozinho quanto em combinação com a ciclosporina A (CsA) para prevenir a rejeição dos transplantes de coração ectópicos. Adultos do sexo masculino C57BL / 6 (H-2b) foram utilizados como doadores e camundongos BALB/c (H-2d) foram utilizados como receptores (Jackson Laboratories, Bar Harbor, MA). O transplante de coração heterotópico intra-abdomina foi realizado como descrito anteriormente (Corry e outros (1973) Transplantantion 16 (4) :343- 350 e Wang e outros (2007). J Immunol 179 (7) :4451-4463). Neste estudo, a cirurgia de transplante envolveu o transplante de corações plenamente incompatíveis MHC dos doadores C57BL/6 aos receptores BALB/c, de tal forma que o coração autólogo, bem como o coração alogênico, esteve presente no receptor.

[00207] Os receptores de transplantes de coração foram tratados como segue: Grupo 1 (cinco receptores) não recebeu nenhum tratamento. Grupo 2 (3 receptores) recebeu monoterapia hCD83ext- m3 por i.v. a 100 μg/camundongo/dia, a -1 a +7 POD. Grupo 3 (4 receptores) receberam monoterapia hCD83ext-m3 por i.v. de 100 μg/camundongo/dia, de -1 a +7 POD mais CsA a 15 mg/kg/dia, diariamente até o final do experimento, s.c. As batidas dos corações dos aloenxertos foram monitoradas e avaliadas diariamente por palpação abdominal direta de forma dupla-cega para detectar o estado de rejeição/aceitação do coração. A sobrevida do transplante de coração foi medida em número de dias pós-operatório (POD) no qual o coração alogênico continuou a bater. Os resultados são mostrados na Tabela 7. Tabela 7

[00208] Em um experimento separado, a habilidade de hCD83ext-wt sozinho, Csa sozinho ou hCD83ext-wt mais CsA em suprimir a rejeição ao transplante de coração foi avaliada como descrito acima. Os receptores de transplantes de coração foram tratados como segue: Grupo 4 (4 receptores) receberam monoterapia de hCD83ext-wt (SEQ ID NO: 5) por i.v. a 100 μg/camundongo/dia, a partir do dia anterior ao transplante até a rejeição ao enxerto. Grupo 5 (6 receptores) recebeu monoterapia CsA (15 mg/camundongo/dia, s.c.). Grupo 6 (4 receptores) receberam hCD83ext-wt por i.v. a 100 μg/camundongo/dia mais CsA a 15 mg/kg/dia, s.c., diariamente, do primeiro dia antes do transplante até os setes dias pós-transplante. Os resultados são mostrados na Tabela 8. Tabela 8

t animal mor to por batidas fortes do coração enxertado (não acredita-se ser relacionado com o tratamento)

[00209] Os experimentos acima mostram que hCD83ext-m3 e monoterapia de hCD83ext-wt prolongam a sobrevida do aloenxerto em aproximadamente 2 vezes em comparação aos controles não-tratados. Além disso, hCD83ext-m3 e CD83ext-wt sinergizam com CsA permitindo a sobrevida do aloenxerto a longo prazo em contrapartida à monoterapia de CsA.

[00210] Em outros experimentos, o tratamento dos receptores de transplante de coração de camundongo com CsA até POD 50 mais hCD83ext-m3 (100 ug, IV, i.v. -1 a 7+) leva a concluir a tolerância do aloenxerto, como demonstrado pela falta de rejeição após o encerramento da terapia de CsA diária no dia 50 (dados não- mostrados). Em contraste, a monoterapia de CsA ou a monoterapia de hCD83ext-m3 conduz à rejeição após cerca de 13 a 17 dias, indicando que hCD83ext-m3 sinergiza com CsA (vide Tabelas 7 e 8). Surpreendentemente, a terapia de combinação não conduz à tolerância ao aloenxerto permanente quando o CSA é retirada no dia 28, indicando que um tempo de sobrevida inesperadamente longo livre de rejeição é necessário para alcançar a tolerância completa independentemente do fármaco (dados não-mostrados). Poucas dosagens de hCD83ext-m3 (ou seja, 3 dosagens nos dias -1 a +1) levam a uma sinergia completa com CsA, mas demonstrou-se uma tolerância operacional incompleta pela rejeição rápida quando CsA é retirado no dia 50 (dados não mostrados). Portanto, é demonstrado um efeito da resposta da dosagem para a indução de tolerância ao aloenxerto. Exemplo 9 HCD83ext-m3 evita rejeição crônica aos aloenxertos do rim de rato

[00211] Em seres humanos, a rejeição crônica ocorre meses ou anos após o transplante, e é a causa mais comum da perda do enxerto. A rejeição crônica resulta na lenta deterioração da função do enxerto, caracterizada patologicamente no rim por atrofia tubular, fibrose intersticial e espessamento fibroso íntimo das artérias.

[00212] Um modelo de transplante de rim de rato bem-estabelecido (essencialmente como descrito em Bédard e outros (2006) Transplantantion 81 (6) :908-14) e na Patente US 7.514.405, o conteúdo ao qual está incorporado por referência aqui) foi utilizado para avaliar se hCD83ext-m3 em combinação com CsA pode suprimir a rejeição crônica. Neste modelo, os receptores de transplante de rim são tratados com uma dosagem a curto prazo (11 dias) de ciclosporina (CsA) para prevenir a rejeição aguda inicial. Tais receptores de transplante demonstram, confiavelmente, as alterações patológicas características da rejeição crônica ao enxerto no dia pós- operatório (DPO) 140.

[00213] Os ratos F344 serviram como doadores de rim aos ratos Lewis. Três receptores de transplante de controle foram tratados, sozinhos, com doses subterapêuticas de CsA (0,75 mg/kg/dia; POD 0 a 10). Um segundo grupo de três receptores de transplante foi tratado com tanto CsA (0,75 mg/kg/dia; POD 0 a 10) quatro com hCD83ext-m3 (100 mg/dia, i.v., POD 1 a 7). Os receptores transplantados foram sacrificados no POD 140 e os rins transplantados foram avaliados para a indicação de rejeição crônica através de histologia e imuno-histoquímica. A histologia do rim foi marcada por um patologista independente avaliando a atrofia tubular, atrofia glomerular, fibrose intersticial, espessamento íntimo, infiltrados de células e cicatrização cortical em uma escala de 0 a 4, em que 0 =normal, 1 = variação mínima, 2 = mudança leve, 3 = mudança moderada e 4 = alteração acentuada. Como mostrado na figura 36, o tratamento com CsA mais hCD83ext-m3 melhorou de forma significativa, (p <0,05) a pontuação em cada categoria, em relação ao tratamento com CsA sozinha. Os dados da figura 37 demonstram que hCD83ext-m3, de forma significativa (p <0,05), melhora a classificação imuno-histoquímica em aloenxertos de rins no que diz respeito a deposição dos depósitos do anticorpo de IgG e IgM nos glomérulos (G) e capilares peritubulares (PTC) e reduz a infiltração celular por CD2, CD4 e células ED-1. Em resumo, hCD83ext-m3 em combinação com CsA previne a rejeição crônica do aloenxerto em um modelo de transplante de rim do rato. A prevenção da rejeição crônica pelo hCD83ext-m3 mais o tratamento com CsA está associada com a regulação baixa de deposição de anticorpos intraenxerto e a prevenção da fibrose de atrofia/intersticial tubular, que são as características histológicas da rejeição crônica em receptores de transplante de rim. Estes dados destacam a multifuncionalidade de hCD83ext-m3. Além de sua capacidade de bloquear a rejeição celular aguda, como demonstrado nos estudos acima de transplante de coração e de rim do camundongo, este modelo mostra sua capacidade de suprimir a inflamação crônica e a resposta imune humoral (ou seja, a patologia da rejeição crônica é independente da rejeição celular aguda). Exemplo 10 Tratamento com hCD83ext-m3 mais Ciclosporina A prolonga a sobrevivência do enxerto de rim em primatas não-Humanos

[00214] Um dos rins de cada receptor do macaco cinomólgo foi substituído por um rim que foi removido do outro macaco cinomólgo. Além disso, o rim não-transplantado do receptor é removido cirurgicamente de forma que o rim transplantado é de sustentação da vida. Três pacientes transplantados foram tratados com hCD83ext- m3 (3 mg/kg) i.v. de -1 a +7 POD (9 dosagens), juntamente com CsA subterapêutica diariamente (10 mg/kg i.m.), até o dia 50. Três receptores de transplante no grupo de controle receberam monoterapia de CsA (10 mg/kg, i.m.). Todos os animais foram monitorados pelas rejeições do aloenxerto através de métodos, incluindo a avaliação da produção de urina, os níveis de creatinina sérica e o consumo de alimentos e água. Um animal de cada grupo foi sacrificado prematuramente (não baseado em rejeição aguda), deixando-se dois animais de cada grupo para a análise final do estudo. Os resultados são mostrados na Tabela 9.

[00215] Nenhum dos animais do grupo controle (que receberam a monoterapia de CsA) sobreviveram até a data da rescisão de CsA (dia 50), enquanto ambos hCD83ext-m3 mais os animais tratados com CsA não apresentaram sintomas clínicos de rejeição no dia 50 (ou seja., Apetite normal, creatinina e a produção de urina). No entanto, após a rescisão de CsA ambos os animais tratados por hCD83ext-m3 rejeitaram rapidamente, indicando a indução de tolerância insuficiente para controlar a rejeição aguda.

[00216] Nos próximos experimentos, os receptores de transplante de rim receberão hCD83ext-m3 (10 gm/kg/2 vezes ao dia i.v. -1 a +13 POD) mais CsA (10 mg/kg, i.m.) diariamente por 90 dias, seguido por uma redução de 50% de CsA a cada duas semanas, a fim de (1) demonstrar uma sinergia clinicamente relevante com a CsA e (2) avaliar o nível de tolerância operacional induzido.

Claims (11)

1. Polipeptídeo sCD83 isolado, compreendendo: a) resíduos de aminoácidos 5 a 129 de SEQ ID NO: 7; ou b) resíduos de aminoácidos 5 a 130 de SEQ ID NO: 7; caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido 85 de SEQ ID NO: 7 é serina e os aminoácidos 12, 20, 92 e 114 são cisteína, em que o referido polipeptídeo apresenta atividade sCD38 que envolve inibição da maturação de células dendríticas imaturas para células dendríticas maduras na presença de um coquetel de maturação.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que consiste nos aminoácidos 5 a 130 de SEQ ID NO: 7.

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 7; os resíduos de aminoácido 1 a 29 de SEQ ID NO: 7, os resíduos de aminoácido 5 a 129 de SEQ ID NO: 7 e os resíduos amino resíduos de aminoácido 5 a 130 de SEQ ID NO: 7.

4. Polipeptídeo sCD83 isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 31.

5. Polipeptídeo sCD83 isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é purificado de E. coli.

6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

7. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que é o polinucleotídeo de SEQ ID NO: 14.

8. Uso de um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir uma resposta imune indesejada em um indivíduo mamífero.

9. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de uma resposta imune indesejada em um indivíduo mamífero.

10. Uso de acordo com a reivindicação 8, ou polipeptídeo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a resposta imune indesejada é selecionada do grupo consistindo em doenças autoimunes, rejeição aos transplantes e alergia.

11. Uso ou polipeptídeo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a doença autoimune é selecionada do grupo consistindo em lúpus eritematoso sistêmico, diabetes tipo I, Pênfigo, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, miastenia grave, automiocardite, esclerose múltipla, artrite reumatoide, psoríase, uveoretinite autoimune, vasculite, uma doença inflamatória crônica do intestino, doença de Crohn ou colite ulcerativa, Morbus Bechterew, espondilite anquilosante e doença pulmonar obstrutiva crônica (CPOD).

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