BR112020009579A2

BR112020009579A2 - promotor específico de célula do epitélio de pigmento da retina de primata

Info

Publication number: BR112020009579A2
Application number: BR112020009579-6A
Authority: BR
Inventors: Josephine Juettner; Jacek Krol; Botond Roska
Original assignee: Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research
Priority date: 2017-11-15
Filing date: 2018-11-15
Publication date: 2020-10-13
Also published as: JP2023075139A; CN111726985A; KR20200084028A; CR20200210A; RU2020119176A; CA3082080A1; CN111726985B; RU2020119176A3; MX2020005033A; US11739349B2; SG11202004205YA; US20210054408A1; PH12020550757A1; JP7348176B2; AU2018369975B2; EP3709798A1; AU2018369975A1; IL274460A; WO2019097454A1; JP2021502813A

Abstract

A presente invenção refere-se a um método para expressar um gene exógeno especificamente em células do epitélio de pigmento da retina de um primata, em que esse método é compreende a etapa de entregar uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende a, ou consiste em, sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1, ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 400 pares de bases que tem pelo menos 80% de identidade geral com a sequência da SEQ ID NO:1, a células do epitélio de pigmento da retina do primata, em que essa molécula de ácido nucleico isolada leva especificamente à expressão de um gene exógeno em células do epitélio de pigmento da retina de primatas quando uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o gene exógeno está ligada de maneira funcional à essa molécula de ácido nucleico isolada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “PROMOTOR ESPECÍFICO DE CÉLULA DO EPITÉLIO DE PIGMENTO DA RETINA DE PRIMATA”.

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos que resulta na expressão de genes especificamente em células do epitélio de pigmento da retina (RPE).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Para fins de expressão, genes recombinantes são normalmente transfectados para as células-alvo, populações ou tecidos celulares, como construtos de cDNA no contexto de um cassete de expressão ativo para permitir transcrição do gene heterólogo. O construto de DNA é reconhecido pela maquinaria de transcrição celular em um processo que envolve a atividade de diversos fatores de transcrição de ação trans (TF) em elementos cis-regulatórios, que incluem intensificadores, silenciadores, isoladores e promotores (denominados globalmente no presente documento como "promotores").

[003] Promotores de gene estão envolvidos em todos esses níveis de regulação, que servem como o determinante na transcrição de gene integrando-se as influências da sequência de DNA, ligação de fator de transcrição e recursos epigenéticos. Os mesmos determinam a força, por exemplo, da expressão de transgene que é codificada por um vetor de plasmídeo, assim como em qual tipo ou tipos celulares o dito transgene será expresso.

[004] Os promotores mais comuns usados para conduzir a expressão genética heteróloga em células mamíferas são os promotores precoces imediatos principais de citomegalovírus (CMV) de ser humano e camundongo. Os mesmos conferem uma forte expressão e se mostraram robustos em diversos tipos celulares. Outros promotores virais, tais como o promotor precoce imediato SV40 e o promotor de repetição de terminal longo (LTR) do Vírus do Sarcoma de Rous (RSV) também são usados frequentemente em cassetes de expressão.

[005] Em vez de promotores virais, promotores celulares também podem ser usados. Dentre os promotores conhecidos estão aqueles de genes de manutenção que codificam transcrições celulares transcritas de maneira abundante, tais como beta-actina, fator de alongamento 1- alfa (EF-1alfa) ou ubiquitina. Em comparação com promotores virais, expressão genética eucariótica é mais complexa e necessita de uma coordenação precisa de diversos fatores diferentes.

[006] Um dos aspectos relativos ao uso de elementos regulatórios endógenos para expressão de transgene é a geração de mRNA estável e essa expressão pode ocorrer no ambiente nativo da célula hospedeira, onde fatores de transcrição de ação trans são consequentemente fornecidos. Visto que a expressão de genes eucarióticos é controlada por uma maquinaria complexa de elementos regulatórios de ação cis e trans, a maior parte dos promotores celulares sofre de uma falta de caracterização funcional extensiva. Partes do promotor eucariótico estão normalmente localizadas imediatamente a montante de sua sequência transcrita e servem como o ponto de iniciação transcricional. O promotor nuclear cerca imediatamente o sítio de início de transcrição (TSS) que é suficiente para ser reconhecido pela maquinaria de transcrição. O promotor proximal compreende a região a montante do promotor nuclear e contém o TSS e outros recursos de sequência necessários para a regulação transcricional. Fatores de transcrição atuam a sequência específica através de ligação a motivos regulatórios no promotor e sequência intensificadora, desse modo, se ativa as enzimas de modificação de cromatina e histona que alteram a estrutura de nucleossoma e sua posição que finalmente permite a iniciação de transcrição. A identificação de um promotor funcional é principalmente dependente da presença de elementos intensificadores a montante ou a jusante associados.

[007] Outro aspecto crucial relativo ao uso de elementos regulatórios endógenos para expressão de transgene é que alguns promotores podem atuar de uma maneira específica de célula e resultarão na expressão do transgene em células de um tipo específico ou, dependendo do promotor, em células de um subconjunto particular.

[008] Portanto, um objetivo da presente invenção é obter novas sequências adequadas para expressão de genes recombinantes em células mamíferas da retina com altos níveis de expressão e de uma maneira específica para tipo celular.

[009] Tal sequência atende a uma necessidade na técnica por promotor específico de células retinianas para desenvolver sistemas para o estudo de distúrbios neurodegenerativos, restauração da visão, descoberta de fármacos, terapias tumorais e diagnóstico de distúrbios.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[010] Os presentes inventores divulgaram agora acidentalmente que um promotor artificial que era conhecido por conduzir a expressão genética especificamente em células amácrinas da retina em um modelo murino conforme descrito no documento no WO 2015/118507 tem, inesperada e atipicamente, uma especificidade totalmente diferente em primatas. Em primatas, esse promotor conduz especificamente a expressão genética em células do epitélio de pigmento da retina (RPE). Essa especificidade é extremamente útil para abordar e alvejar a expressão genética em células do epitélio de pigmento da retina na retina doente de, por exemplo, pacientes com degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa, retinopatia diabética ou hipertrofia do epitélio de pigmento da retina.

[011] A sequência de ácidos nucleicos desse promotor é:

TCAAGCCTCCTACCGCCTTTGTTATGCAAACATATCAAACGCCCTC CTTTGTTATGCAAAAGGGCTGGAACGGGGCCTTTGTTATGCAAAT CGCCCTCCCCGATCCCTTTGTTATGCAAATTTGACGAATTCCCACC TTTGTTATGCAAACAAATCTCCTACCCTCCTTTGTTATGCAAAGTG AGAGGGGCTGCACCTTTGTTATGCAAAATGCGGCCCCTGAGACCT TTGTTATGCAAAAACCATGTACGCTTGCCTTTGTTATGCAAACCGC CTGTTGCTTGGCCTTTGTTATGCAAAGCCACGCGATTGGCGCCTT TGTTATGCAAAGCTCGGTTATGTACACCTTTGTTATGCAAAGCTAC TTTAAACTTGCCTTTGTTATGCAAATCACGACCTGACCGTCCTTTG TTATGCAAAAACGGTTGAAATAGTCCTTTGTTATGCAAAATGATATT GAATAGTCCTTTGTTATGCAAAAATTTAGATGCCGACCCTTTGTTA TGCAAAGGAATGGGCGTGCTGCCTTTGTTATGCAAATTTTCGCTG CGACAGCCTTTGTTATGCAAACATGCTCGCCACTCACCTTTGTTAT GCAAAGGTCTAACAATGACCCCTTTGTTATGCAAACTACGTGGAAT AGATCCTTTGTTATGCAAACCCCGAGTTTTTGAACCTTTGTTATGC

AAAATCAGTAACTTCATTCCTTTGTTATGCAAAATGTGACTTAACCT CCCTTTGTTATGCAAA (SEQ ID NO:1).

[012] A presente invenção fornece, portanto, um método para expressar um gene exógeno especificamente em células do epitélio de pigmento da retina de um primata, em que o dito método compreende a etapa de entregar uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende a, ou consiste em, sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1, ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 400 pares de bases que tem pelo menos 80% de identidade geral com a dita sequência da SEQ ID NO:1, a células do epitélio de pigmento da retina do dito primata, em que a dita molécula de ácido nucleico isolada leva especificamente à expressão de um gene exógeno em células do epitélio de pigmento da retina de primatas quando uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o dito gene exógeno está ligada de maneira funcional à dita molécula de ácido nucleico isolada. A molécula de ácido nucleico isolada pode compreender adicionalmente,

ligado de maneira funcional à dita molécula de ácido nucleico isolada, um promotor mínimo, por exemplo, o promotor mínimo da SEQ ID NO:2. A molécula de ácido nucleico isolada pode ser parte de um cassete de expressão, que, por sua vez, parte de um vetor, por exemplo, um vetor viral.

[013] A presente invenção também fornece o uso de uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende a, ou consiste em, sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1, ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 400 pares de bases que tem pelo menos 80% de identidade geral com a dita sequência da SEQ ID NO:1, em que a dita molécula de ácido nucleico isolada leva especificamente à expressão de um gene exógeno em células do epitélio de pigmento da retina de primatas quando uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o dito gene exógeno está ligada de maneira funcional à dita molécula de ácido nucleico isolada, para expressar um gene exógeno especificamente em células do epitélio de pigmento da retina de um primata. Nesse uso, a molécula de ácido nucleico isolada pode compreender, ainda, um promotor mínimo, por exemplo, o promotor mínimo da SEQ ID NO:2. A molécula de ácido nucleico isolada pode ser parte de um cassete de expressão, que pode ser parte de um vetor, por exemplo, um vetor viral.

[014] A presente invenção fornece, ainda, uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende a, ou consiste em, sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1, ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 400 pares de bases que tem pelo menos 80% de identidade geral com a dita sequência da SEQ ID NO:1, em que a dita molécula de ácido nucleico isolada leva especificamente à expressão de um gene exógeno em células do epitélio de pigmento da retina de primatas quando uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o dito gene exógeno está ligada de maneira funcional à dita molécula de ácido nucleico isolada, para uso no tratamento de uma doença associada ao epitélio de pigmento da retina. A doença associada a epitélio de pigmento da retina pode ser selecionada dentre o grupo que consiste em degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa, retinopatia diabética e hipertrofia de epitélio de pigmento da retina.

[015] A molécula de ácido nucleico isolada que compreende a, ou consiste em, sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1 ou uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 400 pb que tem pelo menos 80% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1, em que a dita molécula de ácido nucleico isolada leva especificamente à expressão em células do epitélio de pigmento da retina de primatas de um gene ligado de maneira funcional à dita sequência de ácidos nucleicos que codifica o dito gene pode ter pelo menos 400 pb, pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 750 pb, pelo menos 800 pb pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb, tem pelo menos 80% de identidade com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 400 pb, pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 800 pb, pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb e tem pelo menos 85% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 400 pb,

pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 800 pb, pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb e tem pelo menos 90% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 400 pb, pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 800 pb, pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb e tem pelo menos 95% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 400 pb, pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 800 pb, pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb e tem pelo menos 96% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 400 pb, pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 800 pb, pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb e tem pelo menos 97% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 400 pb, pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 800 pb, pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb e tem pelo menos 98% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 400 pb, pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 800 pb, pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb e tem pelo menos 99% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 400 pb, pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 800 pb, pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb e tem 100% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1.

[016] A molécula de ácido nucleico isolada da invenção pode compreende um promotor mínimo, por exemplo, um promotor mínimo de SV40, por exemplo, o promotor mínimo de SV40

GCTCGAGATCTGCGATCTGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGT CCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTT CCGCCCATTCTCCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGC AGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGT

GAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAA (SEQ ID NO:2), de preferência, ligado de maneira funcional à dita molécula de ácido nucleico isolada.

[017] Um gene típico que pode ser ligado de maneira funcional ao promotor da invenção é um gene que codifica um fotorreceptor. Por exemplo, o mesmo pode ser uma molécula fotossensível, tal como uma canal-rodopsina ou uma halorrodopsina.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[018] Figura 1: Expressão alvejada a células do epitélio pigmentado da retina na retina de primata de um promotor que compreende a SEQ ID NO:1. Imagens de microscópio confocal de varredura a laser de expressão de EGFP do promotor que compreende a SEQ ID NO:1 3 meses após injeção sub-retiniana de AAV-synP12- ChR2-EGFP nos olhos de macaco adulto (Macaca mulatta). A expressão induzida em células do epitélio pigmentado da retina pode ser observada. Verde = EGFP acionada pela SEQ ID NO:3. Branco = Hoechst.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[019] Os presentes inventores divulgaram agora acidentalmente que um promotor artificial que era conhecido por conduzir a expressão genética especificamente em células amácrinas da retina em um modelo murino conforme descrito no documento no WO 2015/118507 tem, inesperada e atipicamente, uma especificidade totalmente diferente em primatas. Em primatas, esse promotor conduz especificamente a expressão genética em células do epitélio de pigmento da retina. Essa especificidade é extremamente útil para abordar e alvejar a expressão genética em células do epitélio de pigmento da retina na retina doente de, por exemplo, pacientes com degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa, retinopatia diabética ou hipertrofia do epitélio de pigmento da retina.

[020] A sequência de ácidos nucleicos desse promotor é:

AAAATCAGTAACTTCATTCCTTTGTTATGCAAAATGTGACTTAACCT CCCTTTGTTATGCAAA (SEQ ID NO:1).

[021] A presente invenção fornece, portanto, um método para expressar um gene exógeno especificamente em células do epitélio de pigmento da retina de um primata, em que o dito método compreende a etapa de entregar uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende a, ou consiste em, sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1, ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 400 pares de bases que tem pelo menos 80% de identidade geral com a dita sequência da SEQ ID NO:1, a células do epitélio de pigmento da retina do dito primata, em que a dita molécula de ácido nucleico isolada leva especificamente à expressão de um gene exógeno em células do epitélio de pigmento da retina de primatas quando uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o dito gene exógeno está ligada de maneira funcional à dita molécula de ácido nucleico isolada. A molécula de ácido nucleico isolada pode compreender, ainda, um promotor mínimo, por exemplo, o promotor mínimo da SEQ ID NO:2. A molécula de ácido nucleico isolada pode ser parte de um cassete de expressão, que, por sua vez, parte de um vetor, por exemplo, um vetor viral.

[022] A presente invenção também fornece o uso de uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende a, ou consiste em, sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1, ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 400 pares de bases que tem pelo menos 80% de identidade geral com a dita sequência da SEQ ID NO:1, em que a dita molécula de ácido nucleico isolada leva especificamente à expressão de um gene exógeno em células do epitélio de pigmento da retina de primatas quando uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o dito gene exógeno está ligada de maneira funcional à dita molécula de ácido nucleico isolada, para expressar um gene exógeno especificamente em células do epitélio de pigmento da retina de um primata. Nesse uso, a molécula de ácido nucleico isolada pode compreender, ainda, um promotor mínimo, por exemplo, o promotor mínimo da SEQ ID NO:2. A molécula de ácido nucleico isolada pode ser parte de um cassete de expressão, que pode ser parte de um vetor, por exemplo, um vetor viral.

[023] A presente invenção fornece, ainda, uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende a, ou consiste em, sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1, ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 400 pares de bases que tem pelo menos 80% de identidade geral com a dita sequência da SEQ ID NO:1, em que a dita molécula de ácido nucleico isolada leva especificamente à expressão de um gene exógeno em células do epitélio de pigmento da retina de primatas quando uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o dito gene exógeno está ligada de maneira funcional à dita molécula de ácido nucleico isolada, para uso no tratamento de uma doença associada ao epitélio de pigmento da retina. A doença associada a epitélio de pigmento da retina pode ser selecionada dentre o grupo que consiste em degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa, retinopatia diabética e hipertrofia de epitélio de pigmento da retina.

[024] A molécula de ácido nucleico isolada que compreende a, ou consiste em, sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1 ou uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 400 pb que tem pelo menos 80% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1, em que a dita molécula de ácido nucleico isolada leva especificamente à expressão em células do epitélio de pigmento da retina de primatas de um gene ligado de maneira funcional à dita sequência de ácidos nucleicos que codifica o dito gene pode ter pelo menos 400 pb, pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 750 pb, pelo menos 800 pb pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb, tem pelo menos 80% de identidade com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 400 pb, pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 800 pb, pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb e tem pelo menos 85% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 400 pb, pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 800 pb, pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb e tem pelo menos 90% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 400 pb, pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 800 pb, pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb e tem pelo menos 95% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 400 pb, pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 800 pb, pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb e tem pelo menos 96% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 400 pb, pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 800 pb, pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb e tem pelo menos 97% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 400 pb, pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 800 pb, pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb e tem pelo menos 98% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 400 pb, pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 800 pb, pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb e tem pelo menos 99% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 400 pb, pelo menos 500 pb, pelo menos 600 pb, pelo menos 700 pb, pelo menos 800 pb, pelo menos 900 pb, pelo menos 1.000 pb, pelo menos 1.100 pb, pelo menos 1.200 pb, pelo menos 1.300 pb, pelo menos 1.400 pb, pelo menos 1.500 pb, pelo menos 1.600 pb, pelo menos 1.700 pb, pelo menos 1.800 pb, pelo menos 1.900 pb ou pelo menos 2.000 pb e tem 100% de identidade geral com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1.

[025] A molécula de ácido nucleico isolada da invenção pode compreender um promotor mínimo, por exemplo, um promotor mínimo de SV40, por exemplo, o promotor mínimo de SV40

GCTCGAGATCTGCGATCTGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGT CCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTT CCGCCCATTCTCCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGC

AGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGT GAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAA (SEQ ID NO:2).

[026] Um gene típico que pode ser ligado de maneira funcional ao promotor da invenção é um gene que codifica um fotorreceptor. Por exemplo, o mesmo pode ser uma molécula fotossensível, tal como uma canal-rodopsina ou uma halorrodopsina.

[027] A expressão dos genes exógenos com o uso do promotor da invenção pode ser feita in vitro, in vivo ou ex vivo.

[028] Conforme usado no presente documento, o termo "promotor" se refere a quaisquer elementos cis-regulatórios, que incluem intensificadores, silenciadores, isoladores e promotores. Um promotor é uma região de DNA que está geralmente localizada a montante (na direção da região 5’) do gene que precisa ser transcrito. O promotor permite a ativação ou repressão apropriada do gene que controla. No contexto da presente invenção, os promotores resultaram na expressão específica de genes ligados de maneira funcional aos mesmos nos interneurônios. "Expressão específica", também denominada "expressão apenas em um determinado tipo de célula" significa que pelo menos mais que 75% das células que expressam o gene de interesse são do tipo especificado, isto é, células do epitélio de pigmento da retina (RPE) no presente caso.

[029] A camada pigmentada da retina ou epitélio de pigmento da retina (RPE), também conhecido como o pigmentum nigrum, é a camada celular pigmentada fora da retina neurossensorial que nutre as células visuais da retina está firmemente fixada ao coroide subjacente e células visuais da retina subjacentes. O RPE é composto de uma única camada de células hexagonais que são densamente embaladas com grânulos de pigmento. Na ora serrata, o RPE continua como uma membrana que passa sobre o corpo ciliar e continua como a superfície posterior da íris. Isso gera as fibras do dilatador. Diretamente abaixo desse epitélio está o neuroeptélio (isto é, hastes e cones) que passa em conjunto com o RPE. Ambos, combinados, são entendidos como sendo o epitélio ciliar do embrião. A continuação da extremidade frontal da retina é o epitélio da íris posterior, que adquire pigmento quando o mesmo entra na íris. Quando vistas a partir da superfície externa, essas células são lisas e hexagonais no formato. Quando vistas em seção, cada célula consiste em uma parte não pigmentada que contém um núcleo oval grande e uma porção pigmentada interna que se estende como uma série de processos em linha reta entre as hastes, isso sendo especialmente o caso quando o olho é exposto à luz. O RPE tem diversas funções, a saber, absorção de luz, transporte epitelial, tamponamento de íon espacial, ciclo visual, fagocitose, secreção e modulação imunológica.

[030] Cassetes de expressão são tipicamente introduzidos em um vetor que facilita a entrada do cassete de expressão em uma célula hospedeira e manutenção do cassete de expressão na célula hospedeira. Tais vetores são normalmente usados e são bastante conhecidos por aqueles versados na técnica. Diversos dos tais vetores estão comercialmente disponíveis, por exemplo, pela Invitrogen, Stratagene, Clontech, etc., e são descritos em diversos guias, tais como Ausubel, Guthrie, Strathem ou Berger, todos acima. Tais vetores incluem tipicamente promotores, sinais de poliadenilação, etc., em conjunto com múltiplos sítios de clonagem, assim como elementos adicionais, tais como origens de replicação, genes marcadores selecionáveis (por exemplo, LEU2, URA3, TRP 1, HIS3, GFP), sequências centroméricas, etc.

[031] Vetores virais, por exemplo, um AAV, um PRV ou um lentivírus, são adequados para alvejar e entregar genes às células do epitélio de pigmento da retina com o uso de um promotor da invenção.

[032] O estímulo de células retinianas pode ser medido com o uso de um método elétrico, tal como uma matriz de multieletrodos ou um patch-clamp, ou com o uso de um método visual, tal como a detecção de fluorescência.

[033] Os métodos que usam sequência de ácidos nucleicos da invenção podem ser usados para identificar agentes terapêuticos para o tratamento de um distúrbio neurológico ou de um distúrbio da retina que envolve células do RPE, sendo que o dito método compreende as etapas de colocar um composto de teste em contato com as células do epitélio de pigmento da retina que expressam um ou mais transgenes sob um promotor da invenção, e comparar pelo menos um estímulo de células do epitélio de pigmento da retina obtido na presença do dito composto de teste com o mesmo estímulo obtido na ausência do dito composto de teste.

[034] Além disso, os métodos que usam promotores da invenção também podem ser usados para teste in vitro de restauração de visão, sendo que o dito método compreende as etapas de colocar as células do epitélio de pigmento da retina, que expressam um ou mais transgenes sob o controle de um promotor da invenção, em contato com um agente, e comparar pelo menos um estímulo obtido após o contato do dito agente com o mesmo estímulo obtido antes do dito contato com o dito agente.

[035] Canal-rodopsinas são uma subfamília de proteínas opsina que funcionam como canais iônicos dependentes de luz. As mesmas servem como fotorreceptores sensoriais em algas verdes unicelulares, que controlam fototaxia, isto é, movimento em resposta à luz. Expressadas em células de outros organismos, as mesmas permitem o uso de luz para controlar acidez intracelular, influxo de cálcio, excitabilidade elétrica e outros processos celulares. Pelo menos três canal-rodopsinas "naturais" são atualmente conhecidas: Canal- rodopsina-1 (ChR1), Canal-rodopsina-2 (ChR2) e Volvox Canal-

rodopsina (VChR1). Além disso, algumas versões modificadas/melhoradas dessas proteínas também existem. Todas as Canal-rodopsinas conhecidas são canais de cátion não específicos, que conduzem íons H+, Na+, K+ e Ca2+.

[036] Halorrodopsina é uma bomba de íon conduzida pela luz, específica para íons de cloreto e encontrada em "bactérias" (archaea) filogeneticamente antigas, conhecidas como halo-bactérias. A mesma é uma proteína de sete transmembranas da família de proteína retinilideno, homóloga à bacteriorrodopsina de bomba de próton conduzida pela luz, e similar em estrutura terciária (porém, não em estrutura de sequência primária) às rodopsinas de vertebrado, os pigmentos que detectam luz na retina. Halorrodopsina também compartilha similaridade de sequência com canal-rodopsina, um canal de íon conduzido por luz. Halorrodopsina contém o derivado de vitamina A isomerizável por luz essencial totalmente trans-retiniana. Halorrodopsina é uma dentre algumas proteínas de membrana cuja estrutura de cristal é conhecida. Isoformas de halorrodopsina podem ser encontradas em múltiplas espécies de halo-bactérias, que incluem H. salinarum e N. pharaonis. Diversas pesquisas em andamento exploram essas diferenças, e usam as mesmas para analisar separadamente as propriedades de fotociclo e bomba. Após bacteriorrodopsina, halorrodopsina pode ser a melhor opsina de tipo I (microbiana) estudada. O pico de absorção do complexo retiniano de halorrodopsina é de cerca de 570 nm. Recentemente, halorrodopsina se tornou uma ferramenta em optogenética. Logo que o canal-rodopsina-2 de canal de íon ativado por luz azul abre a habilidade de ativar células excitáveis (tais como neurônios, células musculares, células pancreáticas e células imunológicas) com breves pulsações de luz azul, a halorrodopsina abre a habilidade para silenciar células excitáveis com breves pulsações de luz amarela. Assim, halorrodopsina e canal-rodopsina, juntas, permitem ativação óptica por múltiplas cores, silenciamento e dessincronização de atividade neural, o que cria um arsenal de neuroengenharia poderoso.

[037] Em algumas modalidades, o promotor é parte de um vetor que alvejou uma retina, sendo que o dito vetor expressa pelo menos um gene repórter que é detectável em células do epitélio de pigmento da retina vivas. Tais genes-repórter podem ser indicativos de um circuito neural em funcionamento. Os exemplos de tais vetores são sensores de atividade ou vírus iridescentes (Nature Methods 6, 127 a 130 (2009)). Os exemplos de tais vírus são vírus da pseudorraiva transinápticos retrógrados (PRVs) com sensores de atividade geneticamente codificados que relatam opticamente a atividade de neurônios conectados dentre neurônios espacialmente entremesclados no cérebro. Tal sensor de atividade pode ser um vírus transináptico isolado que expressa um sensor de atividade fluorescente exógeno. O vírus transsináptico pode ser um rabdovírus, por exemplo, vírus da raiva, ou um herpesvírus, por exemplo, um alfa herpesvírus, por exemplo, vírus da pseudorraiva.

[038] O sensor de atividade exógeno fluorescente pode ser um sensor de proteína fluorescente Ca2+, por exemplo, yellow cameleon, camgaroo, G-CaMP/Pericam ou TN-L15, ou um sensor de tensão de proteína fluorescente, por exemplo, FlaSh, SPARC ou um VSP, de preferência, VSP1.

[039] Vetores virais adequados para a invenção são bastante conhecidos na técnica. Por exemplo, um AAV, um PRV ou um lentivírus são adequados para alvejar e entregar genes a células do epitélio de pigmento da retina.

[040] Ao trabalhar com a retina isolada, a entrega viral ideal para fotorreceptores pode ser obtida montando-se o lado de célula ganglionar para baixo, de modo que o lado fotorreceptor da retina seja exposto e possa, assim, ser mais bem transfectado. Outra técnica é cortar, por exemplo, com uma lâmina, a membrana de limitação interna da retina, de modo que os vírus de entrega possam penetrar nas membranas internas. Uma maneira adicional é inserir a retina em ágar, cortar a dita retina e aplicar os vírus de entrega a partir do lado da fatia.

[041] O estímulo de células transfectadas pode ser medido com o uso de métodos bastante conhecidos, por exemplo, com o uso de um método elétrico, tal como uma matriz de multieletrodos ou um patch- clamp, ou com o uso de um método visual, tal como a detecção de fluorescência. Em alguns casos, a membrana de limitação interna é removida por microcirurgia da membrana de limitação interna. Em outros casos, a gravação é alcançada através de cortes realizados na membrana de limitação interna.

[042] A fonte de células retinianas a serem usadas para a presente invenção é um primata. Em algumas modalidades da invenção, as células retinianas são provenientes de, ou estão em, uma retina humana. Em outras modalidades, a retina é de outro primata de qualquer uma das duas linhagens distintas, estrepsirrinos e haplorrinos. Retina humana pode ser facilmente obtida a partir de bancos de córnea onde as ditas retinas são normalmente descartadas após a dissecação da córnea. Retina de ser humano adulto tem uma grande superfície (cerca de 1.100 mm2) e pode, portanto, ser facilmente separada em diversas sub-regiões, experimentalmente. Além disso, as retinas também podem ser usadas como um modelo diferenciado para comunicação sináptica visto que a retina tem sinapses que são idênticas ao resto do cérebro.

[043] Conforme usado no presente documento, o termo "animal" é usado no presente documento para incluir todos os animais. Em algumas modalidades, o animal não humano é um vertebrado. Exemplos de animais são humanos, camundongos, ratos, vacas, porcos, cavalos, galinhas, patos, gansos, gatos, cães, etc. O termo "animal" também inclui um animal individual em todos os estágios de desenvolvimento, que inclui os estágios embrionário e fetal. Um "animal geneticamente modificado" é qualquer animal que contém uma ou mais células que carregam informações genéticas alteradas ou recebidas, diretamente ou indiretamente, através de manipulação genética deliberada em um nível subcelular, tal como através de recombinação alvejada, microinjeção ou infecção com vírus recombinante. O termo "animal geneticamente modificado" não se destina a englobar cruzamento clássico ou fertilização in vitro, porém, em vez disso significa englobar animais nos quais uma ou mais células são alteradas por, ou recebem, uma molécula de DNA recombinante. Essa molécula de DNA recombinante pode ser especificamente alvejada em um local genético definido, pode ser aleatoriamente integrada a um cromossomo, ou pode ser DNA extracromossomicamente replicante. O termo "animal geneticamente modificado de linhagem germinal" se refere a um animal geneticamente modificado no qual a alteração genética ou informações genéticas foram introduzidas em células de linhagem germinal, desse modo, conferindo a habilidade em transferir as informações genéticas para sua prole. Se tal prole, de fato, tem alguma ou toda dessa alteração ou informações genéticas, as mesmas também são animais geneticamente modificados.

[044] A alteração ou informações genéticas podem ser estranhas para a espécie de animal à qual o recipiente pertence, ou estranhas apenas ao recipiente individual particular, ou podem ser informações genéticas já tidas pelo recipiente. No último caso, o gene alterado ou introduzido pode ser expressado de maneira diferente do gene nativo, ou não expressado de todo.

[045] Os genes usados para alterar um gene-alvo podem ser obtidos através de uma ampla variedade de técnicas que incluem, porém, sem limitação a isolamento de fontes genômicas, preparação de cDNAs a partir de modelos de mRNA isolado, síntese direta ou uma combinação das mesmas.

[046] Um tipo de células-alvo para introdução de transgene são as células ES. Células ES podem ser obtidas a partir de embriões de pré- implantação cultivados in vitro e fundidas com embriões (Evans et al., (1981), Nature 292:154 a 156; Bradley et al., (1984), Nature 309:255 a 258; Gossler et al., (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:9.065 a

9.069; Robertson et al., (1986), Nature 322:445 a 448; Wood et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4.582 a 4.584). Transgenes podem ser introduzidos de maneira eficiente nas células ES por técnicas padrão, tais como transfecção de DNA com o uso de eletroporação ou por transdução mediada por retrovírus. As células ES transformadas resultantes podem, após isso, ser combinadas com mórulas através de agregação ou injetadas em blastocistos a partir de um animal não humano. As células ES introduzidas, após isso, colonizam o embrião e contribuem para a linhagem germinal do animal quimérico resultante (Jaenisch (1988), Science 240:1.468 a 1.474). O uso de células ES de gene alvejado na geração de camundongos geneticamente modificados de gene alvejado foi descrito 1987 (Thomas et al., (1987), Cell 51:503 a 512) e é revisto em outro lugar (Frohman et al., (1989), Cell 56:145 a 147; Capecchi (1989), Trends in Genet. 5:70 a 76; Baribault et al., (1989), Mol. Biol. Med. 6:481 a 492; Wagner (1990), EMBO J. 9:3.025 a 3.032; Bradley et al., (1992), Bio/Technology 10:534 a 539).

[047] Técnicas estão disponíveis para inativar ou alterar qualquer região genética em qualquer mutação desejada com o uso de recombinação homóloga alvejada para inserir alterações específicas em alelos cromossômicos.

[048] Conforme usado no presente documento, um "gene alvejado" é uma sequência de DNA introduzida na linhagem germinal de um animal não humano através de intervenção humana, que inclui, porém, sem limitação os métodos descritos no presente documento. Os genes alvejados da invenção incluem sequências de DNA que são projetadas para alterar especificamente alelos endógenos cognatos.

[049] Na presente invenção, "isolado" se refere a material removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se for de ocorrência natural) e, assim, é alterado "pela mão do homem" a partir de seu estado natural. Por exemplo, um polinucleotídeo isolado poderia ser parte de um vetor ou uma composição de matéria, ou poderia estar contido em uma célula, e ainda estar "isolado" pois aquele vetor, composição de matéria ou célula particular não é o ambiente original do polinucleotídeo. O termo "isolado" não se refere às bibliotecas genômicas ou de cDNA, o total de célula inteira ou preparações de mRNA, preparações de DNA genômico (que incluem aquelas separadas por eletroforese e transferidas em manchas), preparações de DNA genômico de célula inteira quebrada ou outras composições em que a técnica não demonstra nenhum recurso de distinção do polinucleotídeo/sequências da presente invenção. Exemplos adicionais de moléculas de DNA isoladas incluem moléculas de DNA recombinante mantidas em células hospedeiras heterólogas ou moléculas de DNA purificadas (parcial ou substancialmente) em solução. Moléculas de RNA isoladas incluem transcrições de RNA in vivo ou in vitro das moléculas de DNA da presente invenção. No entanto, um ácido nucleico contido em um clone que é um membro de uma biblioteca (por exemplo, uma biblioteca genômica ou de cDNA) que não foi isolado de outros membros da biblioteca (por exemplo, na forma de uma solução homogênea que contém o clone e outros membros da biblioteca) ou um cromossomo removido de uma célula ou um lisado celular (por exemplo, uma "dispersão de cromossomo", como em um cariótipo), ou uma preparação de DNA genômico aleatoriamente compartilhado ou uma preparação de corte de DNA genômico com uma ou mais enzimas de restrição não é "isolada" para os fins desta invenção. Conforme abordado adicionalmente no presente documento, moléculas de ácido nucleico isoladas, de acordo com a presente invenção, podem ser produzidas de maneira natural, recombinante ou sintética.

[050] "Polinucleotídeos" podem ser compostos por DNA de fita dupla e única, DNA que é uma mistura de regiões de fita dupla e única, RNA de fita dupla e única, e RNA que é uma mistura de regiões de fita dupla e única, moléculas híbridas que compreendem DNA e RNA que podem ser de fita única ou, mais tipicamente, de fita dupla ou uma mistura de regiões de fita dupla e única. Adicionalmente, os polinucleotídeos podem ser compostos por de fita tripla regiões de fita tripla que compreendem RNA ou DNA ou tanto RNA quanto DNA. Polinucleotídeos também podem conter uma ou mais bases modificadas ou cadeias principais de DNA ou RNA modificadas para estabilidade ou por outras razões. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases incomuns, tais como inosina. Uma variedade de modificações pode ser feitas em DNA e RNA; assim, "polinucleotídeo" engloba formas química, enzimática ou metabolicamente modificadas.

[051] A expressão "polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo" engloba um polinucleotídeo que inclui apenas sequência de codificação para o polipeptídeo, assim como um polinucleotídeo que inclui sequência de codificação e/ou não codificação adicional.

[052] "Condições de hibridização estringentes" se refere a uma incubação de um dia para o outro a 42 graus C em uma solução que compreende 50% de formamida, 5x de SSC (750 mM de NaCl, 75 mM de citrato trissódico), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5x de solução de Denhardt, 10% de sulfato de dextrana e 20 µg/ml de DNA de esperma de salmão quebrado e desnaturado, seguido por lavagem dos filtros em 0,1x de SSC a cerca de 50 graus C. Alterações na estringência de hibridização e detecção de sinal são principalmente concluídas através da manipulação de concentração de formamida (porcentagens inferiores de formamida resultam em estringência diminuída); condições de sal ou temperatura. Por exemplo, condições de estringência moderadamente alta incluem uma incubação de um dia para o outro a 37 graus C em uma solução que compreende 6X de SSPE (20X de SSPE = NaCl a 3 M; NaH2PO4 a 0,2 M; EDTA a 0,02 M, pH 7,4), 0,5% de SDS, 30% de formamida, 100 µg/ml de DNA de bloqueio de esperma de salmão; seguido por lavagens a 50 graus C com 1X de SSPE, 0,1% de SDS. Adicionalmente, para atingir estringência ainda menor, lavagens realizadas depois de hibridização estringente podem ser realizadas em concentrações de sal superiores (por exemplo, 5X de SSC). Variações nas condições acima podem ser alcançadas através da inclusão e/ou substituição de reagentes de bloqueio alternativos usados para suprimir os antecedentes em experimentos de hibridização. Reagentes de bloqueio típicos incluem reagente de Denhardt, BLOTTO, heparina, DNA de esperma de salmão desnaturado e formulações proprietárias comercialmente disponíveis. A inclusão de reagentes de bloqueio específicos pode necessitar modificação das condições de hibridização descritas acima, devido a problemas com compatibilidade.

[053] Os termos "fragmento", "derivado" e "análogo" ao se referirem aos polipeptídeos significam polipeptídeos que mantêm substancialmente a mesma função ou atividade biológica que tais polipeptídeos. Um análogo inclui uma pró-proteína que pode ser ativada por clivagem da porção de pró-proteína para produzir um polipeptídeo maduro ativo.

[054] O termo "gene" significa o segmento de DNA envolvido na produção de uma cadeia de polipeptídeo; o mesmo inclui regiões anteriores e posteriores à região de codificação "principal e atrelada", assim como sequências de intervenção (íntrons) entre segmentos de codificação individuais (éxons).

[055] Polipeptídeos podem ser compostos de aminoácidos unidos uns aos outros por ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, isto é, isoésteres de peptídeo, e podem conter aminoácidos diferentes dos aminoácidos codificados por 20 genes.

Os polipeptídeos podem ser modificados por processos naturais, tais como processamento pós-translacional, ou por técnicas de modificação química que são bem conhecidas na arte.

Tais modificações são bem descritas nos textos básicos e em monografias mais detalhadas, assim como em uma literatura de pesquisa voluminosa.

Modificações podem ocorrer em qualquer lugar no polipeptídeo, que incluem a cadeia principal de peptídeo, as cadeias laterais de aminoácido e as terminações amino ou carboxila.

Será verificado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente em graus iguais ou variados em diversos sítios em um dado polipeptídeo.

Além disso, um dado polipeptídeo pode conter diversos tipos de modificações.

Polipeptídeos podem ser ramificados, por exemplo, como um resultado de ubiquitinação, e podem ser cíclicos, com ou sem ramificação.

Polipeptídeos cíclicos, ramificados e cíclicos ramificados podem resultar de processos naturais pós-translacional ou podem ser produzidos por métodos sintéticos.

Modificações incluem, porém, sem limitação a acetilação, acilação, biotinilação, ribosilação de ADP, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção química heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, ligação covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, denivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, formação de ligação de dissulfeto, desmetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama- carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro ligante celular,

metilação, miristoílação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico (por exemplo, clivagem), fosforilação, prenilação, racemização, selenoílação, sulfação, adição mediada por RNA de transferência de aminoácidos a proteínas, tais como arginilação, e ubiquitinação. (Consultar, por exemplo, PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2a Edição, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nova Iorque (1993); POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque, páginas 1 a 12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626 a 646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48 a 62 (1992).)

[056] Um fragmento de polipeptídeo "que tem atividade biológica" se refere a polipeptídeos que exibem atividade similar, porém, não necessariamente idêntica a uma atividade do polipeptídeo original, que inclui formas maduras, conforme medido em um ensaio biológico particular, com ou sem dependência de dose. No caso em que a dependência de dose existe, a mesma não precisa ser idêntica àquela do polipeptídeo, porém, em vez disso substancialmente similar à dependência de dose em uma dada atividade em comparação com o polipeptídeo original (isto é, o polipeptídeo candidato exibirá maior atividade ou não mais que cerca de 25 vezes menos e, em algumas modalidades, não mais que cerca de dez vezes menos atividade, ou não mais que cerca de três vezes menos atividade em relação ao polipeptídeo original).

[057] Espécies homólogas podem ser isoladas e identificadas produzindo-se sondas ou iniciadores adequados a partir das sequências fornecidas no presente documento e analisando-se uma fonte de ácido nucleico adequada para o homólogo desejado.

[058] "Variante" se refere a um polinucleotídeo ou polipeptídeo que se difere do polinucleotídeo ou polipeptídeo original, porém, que retém propriedades essenciais do mesmo. De modo geral, variantes são globalmente bastante similares, e, em várias regiões, idênticas ao polinucleotídeo ou polipeptídeo original.

[059] De maneira prática, o caso de qualquer molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo particular ser pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico a uma sequência de nucleotídeo da presente invenção pode ser determinado de maneira convencional com o uso de programas de computador conhecidos. Um método preferencial para determinar a melhor correspondência global entre uma sequência de busca (uma sequência da presente invenção) e uma sequência submetida, também denominada alinhamento de sequência global, pode ser determinado com o uso do programa de computador FASTDB com base no algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Blosci. (1990) 6:237 a 245). Em um alinhamento de sequência as sequências de busca e submetida são ambas sequências de DNA. Uma sequência de RNA pode ser comparada convertendo-se Us em Ts. O resultado do dito alinhamento de sequência global está no percentual de identidade. Parâmetros preferenciais usados em um alinhamento FASTDB de sequências de DNA para calcular o percentual de identidade são: Matriz = Unitária, k-tuplo = 4, Penalidade de Incompatibilidade -- 1, Penalidade de União -- 30, Comprimento de Grupo de Aleatorização = 0, Pontuação de Corte = 1, Penalidade de Intervalo -- 5, Penalidade de Tamanho de Intervalo 0,05, Tamanho de Janela = 500 ou o comprimento da sequência de nucleotídeo submetida, qualquer que seja menor. Se a sequência submetida for mais curta que a sequência de busca devido às deleções de 5' ou 3', não devido às deleções internas, uma correção manual deve ser feita nos resultados. Isso ocorre devido ao programa FASTDB não contar os truncamentos 5' e 3’ da sequência submetida ao calcular percentual de identidade. Para sequências submetidas truncadas nas extremidades 5' ou 3', com relação à sequência de busca, o percentual de identidade é corrigido calculando-se o número de bases da sequência de busca que são 5' e 3' da sequência submetida, que não estão correspondidas/alinhadas, como um percentual das bases totais da sequência de busca.

Se um nucleotídeo estiver correspondido/alinhado é determinado por resultados do alinhamento de sequência FASTDB.

Essa porcentagem é, então, subtraída do percentual de identidade, calculada pelo programa FASTDB acima com o uso dos parâmetros especificados, para se chegar a uma pontuação de percentual de identidade final.

Essa pontuação corrigida é a que é usada para os fins da presente invenção.

Apenas bases fora das bases de 5' e 3’ da sequência submetida, conforme exibido pelo alinhamento de FASTDB, que não são correspondidas/alinhadas com a sequência de busca, são calculadas para os fins de ajustar manualmente a pontuação de percentual de identidade.

Por exemplo, uma sequência submetida de 90 bases está alinhada com uma sequência de busca de 100 bases para determinar o percentual de identidade.

As deleções ocorrem na extremidade 5' da sequência submetida e, portanto, o alinhamento de FASTDB não mostra uma correspondência/alinhamento das primeiras 10 bases na extremidade 5'. As 10 bases prejudicadas representam 10% da sequência (número de bases nas extremidades 5' e 3' não correspondidas/número total de bases na sequência de busca), assim, 10% são subtraídos da pontuação de percentual de identidade calculada pelo programa FASTDB.

Se as 90 bases restantes fossem perfeitamente correspondidas, o percentual de identidade final seria 90%. Em outro exemplo, uma sequência submetida de 90 bases é comparada com uma sequência de busca de 100 bases.

Dessa vez as deleções são deleções internas de modo que não haja bases em 5' ou 3' da sequência submetida que não seja correspondida/alinhada com a busca.

Nesse caso o percentual de identidade calculado por FASTDB não é manualmente corrigido. Novamente, apenas bases 5' e 3' da sequência submetida que não estão correspondidas/alinhadas com a sequência de busca são manualmente corrigidas. No entanto, no caso particular, identidade geral refere-se apenas às porções de uma sequência que tem pelo menos alguns graus de similaridades com a sequência, por exemplo, da SEQ ID NO:1. Em outras palavras, a identidade de sequência de uma sequência de busca de 2.000 pb seria apenas calculada para a parte da sequência que compreende a SEQ ID NO:1 ou uma parte bastante similar da mesma.

[060] Através de um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos, por exemplo, 95% "idêntica" a uma sequência de aminoácidos de busca da presente invenção, acredita-se que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo submetido seja idêntica à sequência de busca exceto pelo fato de que a sequência de polipeptídeos submetida pode incluir até cinco alterações de aminoácido para cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos de busca. Em outras palavras, para obter um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos de busca, até 5% dos resíduos de aminoácido na sequência submetida podem ser inseridos, deletados ou substituídos por outro aminoácido. Essas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições de terminal amino ou carbóxi da sequência de aminoácidos de referência ou em qualquer lugar entre essas posições de terminal, intercaladas individualmente entre os resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

[061] De maneira prática, se qualquer polipeptídeo particular for pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico, por exemplo, às sequências de aminoácidos mostradas em uma sequência ou à sequência de aminoácidos codificada por clone de

DNA depositado pode ser determinado convencionalmente com o uso de programas de computador conhecidos.

Um método preferencial para determinar a melhor correspondência global entre uma sequência de busca (uma sequência da presente invenção) e uma sequência submetida, também denominada alinhamento de sequência global, pode ser determinado com o uso do programa de computador FASTDB com base no algoritmo de Brutlag et al. (Comp.

App.

Biosci. (1990) 6:237 a 245). Em um alinhamento de sequência, as sequências de busca e submetidas são ambas sequências de nucleotídeo ou ambas sequências de aminoácidos.

O resultado do dito alinhamento de sequência global está no percentual de identidade.

Parâmetros preferenciais usados em um alinhamento de aminoácido de FASTDB são: Matriz = PAM 0, k-tuplo = 2, Penalidade de Incompatibilidade -- 1, Penalidade de União = 20, Comprimento de Grupo de Aleatorização = 0, Pontuação de Corte = 1, Tamanho de Janela = comprimento de sequência, Penalidade de Intervalo -- 5, Penalidade de Tamanho de Intervalo -- 0,05, Tamanho de Janela = 500 ou o comprimento da sequência de aminoácidos submetida, qualquer que seja menor.

Se a sequência submetida for mais curta que a sequência de busca devido às deleções de terminal N ou C, não devido às deleções internas, uma correção manual deve ser feita nos resultados.

Isso ocorre devido ao programa FASTDB não contar os truncamentos de terminal N e C da sequência submetida ao calcular o percentual de identidade global.

Para sequências submetidas truncadas nos terminais N e C, com relação à sequência de busca, o percentual de identidade é corrigido calculando-se o número de resíduos da sequência de busca que são os terminais N e C da sequência submetida, que não são correspondidos/alinhados com um resíduo submetido correspondente, como um percentual das bases totais da sequência de busca.

Se um resíduo estiver correspondido/alinhado é determinado por resultados do alinhamento de sequência FASTDB. Essa porcentagem é, então, subtraída do percentual de identidade, calculada pelo programa FASTDB acima com o uso dos parâmetros especificados, para se chegar a uma pontuação de percentual de identidade final. Essa pontuação de percentual de identidade final é a que é usada para os fins da presente invenção. Apenas resíduos para os terminais N e C da sequência submetida, que não são correspondidos/alinhados com a sequência de busca, são considerados para os fins de ajustar manualmente a pontuação de percentual de identidade. Isto é, apenas posições de resíduo de busca fora dos resíduos de terminal N e C mais afastados da sequência submetida. Apenas as posições de resíduo fora das extremidades de terminal N e C da sequência submetida, conforme exibido no alinhamento de FASTDB, que não são correspondidas/alinhadas com a sequência de busca são manualmente corrigidas. Nenhuma outra correção manual deve ser feita para os fins da presente invenção.

[062] Variantes de proteína de ocorrência natural são denominadas "variantes alélicas", e se referem a uma dentre diversas formas alternativas de um gene ocupar um dado local em um cromossomo de um organismo. (Genes 11, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nova Iorque (1985).) Essas variantes alélicas podem variar no nível de polinucleotídeo e/ou polipeptídeo. Alternativamente, variantes de ocorrência não natural podem ser produzidas por técnicas de mutagênese ou por síntese direta.

[063] "Marcação" se refere a agentes que têm capacidade de fornecer um sinal detectável, seja diretamente ou através de interação com um ou mais membros adicionais de um sistema de produção de sinal. Marcações que são diretamente detectáveis e podem ser úteis na invenção incluem marcações fluorescentes. Fluoróforos específicos incluem fluoresceína, rodamina, BODIPY, corantes de cianina e semelhantes.

[064] Uma "marcação fluorescente" se refere a qualquer marcação com a habilidade para emitir luz de um determinado comprimento de onda quando ativada por luz de outro comprimento de onda.

[065] "Fluorescência" se refere a qualquer característica detectável de um sinal fluorescente, que inclui intensidade, espectro, comprimento de onda, distribuição intracelular, etc.

[066] "Detectar" fluorescência se refere a avaliar a fluorescência de uma célula com o uso de métodos qualitativos ou quantitativos. Em algumas das modalidades da presente invenção, fluorescência será detectada de uma maneira qualitativa. Em outras palavras, o marcador fluorescente está presente, o que indica que a proteína de fusão recombinante é expressada, ou não. Em outros casos, a fluorescência pode ser determinada com o uso de meios quantitativos, por exemplo, medir a intensidade de fluorescência, espectro ou distribuição intracelular, o que permite a comparação estatística de valores obtidos sob diferentes condições. O nível também pode ser determinado com o uso de métodos qualitativos, tais como a análise visual e comparação por um ser humano de múltiplas amostras, por exemplo, amostras detectadas com o uso de um microscópio fluorescente ou outro detector óptico (por exemplo, sistema de análise de imagem, etc.). Uma "alteração" ou "modulação" em fluorescência se refere a qualquer diferença detectável na intensidade, distribuição intracelular, espectro, comprimento de onda ou outro aspecto de fluorescência sob uma condição particular em comparação com outra condição. Por exemplo, uma "alteração" ou "modulação" é detectada quantitativamente, e a diferença é uma diferença estatisticamente significativa. Quaisquer "alterações" ou "modulações" em fluorescência podem ser detectadas com o uso de instrumentação padrão, tal como um microscópio fluorescente, CCD, ou qualquer outro detector fluorescente, e podem ser detectadas com o uso de um sistema automatizado, tais como os sistemas integrados, ou podem refletir uma detecção subjetiva de uma alteração por um observador humano.

[067] A "proteína verde fluorescente" (GFP) é uma proteína, composta por 238 aminoácidos (26,9 kDa), originalmente isolada de Aequorea victoria/Aequorea aequorea/Aequorea forskalea de água-viva que fluoresce verde quando exposta à luz azul. A GFP de A. victoria tem um pico de excitação maior em um comprimento de onda de 395 nm e um menor em 475 nm. Seu pico de emissão está em 509 nm que está na porção verde inferior do espectro visível. A GFP da amor-perfeito do mar (Renilla reniformis) tem um único pico de excitação maior a 498 nm. Devido ao potencial para uso difundido e as necessidades progressivas de pesquisadores, diversos mutantes diferentes de GFP foram projetados. O primeiro melhoramento principal foi uma mutação de ponto único (S65T) relatada em 1995 em Nature por Roger Tsien. Essa mutação drasticamente melhorou as características espectrais de GFP, que resultam em fluorescência aumentada, fotoestablilidade e uma alteração do pico de excitação maior para 488 nm com o pico de emissão mantido a 509 nm. A adição do mutante de ponto de eficiência de dobragem a 37 °C (F64L) a esse arcabouço rendeu GFP aprimorado (EGFP). EGFP tem um coeficiente de extinção (indicado por ε), também conhecido como seu corte transversal óptico de 9,13 × 10 a 21 m²/molécula, também citado como 55.000 L/(mol•cm). Superfolder GFP, uma série de mutações que permite que GFP rapidamente dobre e amadureça mesmo quando fundida em peptídeos fracamente dobráveis, foi relatada em 2006.

[068] A "proteína fluorescente amarela" (YFP) é um mutante genético da proteína fluorescente verde, derivada de Aequorea victoria. Seu pico de excitação é 514 nm e seu pico de emissão é 527 nm.

[069] Conforme usado no presente documento, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário.

[070] Um "vírus" é um agente infeccioso submicroscópico que não tem capacidade de cultivar ou reproduzir fora de uma célula hospedeira. Cada partícula viral, ou vírion, consiste em material genético, DNA ou RNA, dentro de um revestimento de proteína protetora denominado um capsídeo. O formato de capsídeo varia de formas helicoidal simples e icosaédricas (poliédrico ou próximo a esférico), para estruturas mais complexas com caudas ou um envelope. Vírus infeccionam formas de vida celular e estão agrupados em tipos animal, vegetal e bacteriano, de acordo com o tipo de hospedeiro infectado.

[071] O termo "vírus transsináptico" conforme usado no presente documento se refere a vírus que têm capacidade para migrar de um neurônio para outro, conectando o neurônio através de uma sinapse. Exemplos de tais vírus transsinápticos são rabdovírus, por exemplo, vírus da raiva, e alfa-herpes-vírus, por exemplo, vírus da pseudorraiva ou herpes simples. O termo "vírus transsináptico" conforme usado no presente documento também engloba subunidades virais que têm, por si só, a capacidade de migrar de um neurônio para outro, conectando o neurônio através de uma sinapse e vetores biológicos, tais como vírus modificados, que incorporam tal subunidade e demonstram uma capacidade de migrar de um neurônio para outro, conectando o neurônio através de uma sinapse.

[072] A migração transsináptica pode ser anterógrada ou retrógrada. Durante uma migração retrógrada, um vírus se deslocará de um neurônio pós-sináptico para um pré-sináptico. Consequentemente, durante migração anterógrada, um vírus se deslocará de um neurônio pré-sináptico para um pós-sináptico.

[073] Homólogos se referem a proteínas que compartilham um ancestral em comum. Análogos não compartilham um ancestral em comum, porém, têm alguma similaridade funcional (em vez de estrutural) que faz com que sejam incluídos em uma classe (por exemplo, proteinases de serina semelhantes a tripsina e subtilisina claramente não estão relacionadas - suas estruturas fora do sítio ativo são completamente diferentes, porém, têm sítios ativos virtual e geometricamente idênticos e, assim, são consideradas um exemplo de evolução convergente para análogos).

[074] Essas são duas subclasses de homólogos - ortólogos e parálogos. Ortólogos são o mesmo gene (por exemplo, citocromo 'c'), em diferentes espécies. Dois genes no mesmo organismo não podem ser ortólogos. Parálogos são os resultados de duplicação de gene (por exemplo, beta e delta hemoglobina). Se dois genes/proteínas são homólogos e estão no mesmo organismo, os mesmos são parálogos.

[075] Conforme usado no presente documento, o termo "distúrbio" se refere a uma enfermidade, doença, malignidade, afecção clínica ou afecção patológica.

[076] Conforme usado no presente documento, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a um meio veículo que não interfere na eficácia da atividade biológica do ingrediente ativo, é quimicamente inerte e não é tóxico para o paciente ao qual é administrado.

[077] Conforme usado no presente documento, o termo "derivado farmaceuticamente aceitável" se refere a qualquer homólogo, análogo, ou fragmento de um agente, por exemplo, identificado com o uso de um método de avaliação da invenção, que é relativamente não tóxico ao indivíduo.

[078] O termo "agente terapêutico" se refere a qualquer molécula, composto, ou tratamento, que auxilia na prevenção ou tratamento de distúrbios, ou complicações de distúrbios.

[079] Composições que compreendem tal agente formulado em um veículo farmacêutico compatível podem ser preparadas, embaladas e marcadas para tratamento.

[080] Se o complexo for solúvel em água, então o mesmo pode ser formulado em um tampão apropriado, por exemplo, solução salina tamponada de fosfato ou outras soluções fisiologicamente compatíveis.

[081] Alternativamente, se o complexo resultante tem fraca solubilidade em solventes aquosos, então, o mesmo pode ser formulado com um tensoativo não iônico, tal como Tween, ou polietilenoglicol. Assim, os compostos e seus solvatos fisiologicamente aceitáveis podem ser formulados para administração através de inalação ou insuflação (através da boca ou do nariz) ou administração oral, bucal, parenteral, retal ou, no caso de tumores, diretamente injetados em um tumor sólido.

[082] Para administração oral, a preparação farmacêutica pode estar na forma líquida, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou pode ser apresentada como um produto de fármaco para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Tais preparações líquidas podem ser preparadas através de meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras hidrogenadas comestíveis); agentes emulsionantes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos ou óleos vegetais fracionados); e conservantes (por exemplo, metila ou propil-p- hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As composições farmacêuticas podem assumir a forma de, por exemplo, comprimidos ou cápsulas preparados por meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de ligação (por exemplo, amido de maís pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropilmetilcelulose); cargas (por exemplo, lactose, celulose microcristalina ou hidrogenofosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo,

estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (por exemplo, amido de batata ou glicolato de amido de sódio); ou agentes umectantes (por exemplo, sulfato de laurila de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos por métodos bem conhecidos na técnica.

[083] Preparações para administração oral podem ser adequadamente formuladas para gerar liberação controlada do composto ativo.

[084] Para administração por inalação, os compostos para uso de acordo com a presente invenção são convenientemente entregues na forma de uma apresentação de aspersão em aerossol de pacotes pressurizados ou um nebulizador, com o uso de um propelente adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para administrar uma quantidade calibrada. Cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada, tal como lactose ou amido.

[085] Os compostos podem ser formulados para administração parenteral por injeção, por exemplo, por injeção de bolo ou infusão contínua. Formulações para injeção podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de múltiplas doses, com um conservante adicionado.

[086] As composições podem assumir tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou distribuição. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma de pó para a constituição com um veículo adequado, por exemplo, água livre de pirogênio estéril, antes do uso.

[087] Os compostos também podem ser formulados como uma aplicação tópica, tal como um creme ou loção.

[088] Adicionalmente às formulações descritas anteriormente, os compostos também podem ser formulados como uma preparação de depósito. Tais formulações de longa atuação podem ser administradas por implantação (por exemplo, intraocular, subcutânea ou intramuscular) ou por injeção intraocular.

[089] Assim, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados solúveis com moderação, por exemplo, como um sal solúvel com moderação. Lipossomas e emulsões são exemplos bem conhecidos de veículos ou carreadores de entrega para fármacos hidrofílicos.

[090] As composições podem, caso seja desejado, ser apresentadas em uma embalagem ou dispositivo de distribuição que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária que contêm o ingrediente ativo. A embalagem pode, por exemplo, compreender folha de metal ou plástico, tal como uma embalagem alveolar. A embalagem ou dispositivo de distribuição pode estar acompanhado por instruções para administração.

[091] A invenção também fornece kits para conduzir os regimes terapêuticos da invenção. Tais kits compreendem em um ou mais recipientes quantidades terapêutica ou profilaticamente eficazes das composições em forma farmaceuticamente aceitável.

[092] A composição em um frasco de um kit pode estar na forma de uma solução farmaceuticamente aceitável, por exemplo, em combinação com solução salina estéril, solução de dextrose ou solução tamponada, ou outro fluido estéril farmaceuticamente aceitável. Alternativamente, o complexo pode ser liofilizado ou desidratado; nesse caso, o kit opcionalmente compreende, adicionalmente, em um recipiente uma solução farmaceuticamente aceitável (por exemplo, solução salina, solução de dextrose, etc.), preferencialmente estéril, para reconstituir o complexo para formar uma solução para fins de injeção.

[093] Em outra modalidade, um kit compreende, adicionalmente, uma agulha ou seringa, preferencialmente embalada na forma estéril, para injetar o complexo e/ou um coxim de álcool embalado. Instruções estão opcionalmente incluídas para administração de composições por um médico ou pelo paciente.

[094] A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado do comumente compreendido pelos entendidos na técnica à qual esta invenção pertence. Apesar de métodos e materiais similares ou equivalentes a esses aqui descritos poderem ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, que inclui definições, controlará. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitativos.

EXEMPLOS Construto de gene

[095] O promotor usado nesse exemplo (964 pb; SEQ ID NO:3) consiste emquele da SEQ ID NO:1 acoplado ao promotor mínimo SV40 da SEQ ID NO:2. A sequência de codificação de ChR2-eGFP foi inserida imediatamente após esse promotor e a sequência Kozak otimizada (GCCACC), e seguido por um elemento regulador pós- transcricional do vírus da hepatite woodchuck (WPRE) e sítio de poliadenilação de SV40. Neurônios retinianos foram alvejados com o uso de AAVs serótipo 2/8 com uma titulação de 2,9E+10 GC/ml. Transfecção viral e preparação de tecido

[096] Para administração de AAV, os olhos de animais anestesiados foram perfurados na esclera próxima à lente por uma agulha de calibre 30 afiada. 2 l de suspensão de partícula de AAV foram injetados sub-retinalmente por uma seringa de Hamilton.

Após 3 semanas, as retinas isoladas foram fixadas por 30 min em 4% de PFA em PBS, seguido por uma etapa de lavagem em PBS a 4 graus C.

Retinas inteiras foram tratadas com 10% de soro de burro normal (NDS), 1% de BSA, 0,5% de Triton X-100 em PBS por 1 h à temperatura ambiente.

Tratamento com Ab anti-GFP de rato monoclonal (Molecular Probes Inc.; 1:500) e anti-ChAT de cabra policlonal (Millipore: 1:200) em 3% de NDS, 1% de BSA, 0,5% de Triton X-100 em PBS foi conduzido por 5 dias à temperatura ambiente.

Tratamento com Alexa Fluor-488 Ab antirrato de burro secundário (Molecular Probes Inc.; 1:200), Alexa Fluor-633 anticabra e Hoechst, foi realizado por 2 h.

Seções foram lavadas, montadas com reagente antifade ProLong Gold (Molecular Probes Inc.) em lâminas de vidro e fotografadas com o uso de um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss LSM 700 Axio Imager Z2 (Carl Zeiss Inc.).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para expressar um gene exógeno especificamente em células do epitélio de pigmento da retina de um primata, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de entregar uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende a, ou consiste em, sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1, ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 400 pares de bases que tem pelo menos 80% de identidade geral com a dita sequência da SEQ ID NO:1, a células do epitélio de pigmento da retina do dito primata, em que a dita molécula de ácido nucleico isolada leva especificamente à expressão de um gene exógeno em células do epitélio de pigmento da retina de primatas quando uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o dito gene exógeno está ligada de maneira funcional à dita molécula de ácido nucleico isolada.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita molécula de ácido nucleico isolada compreende, ainda, um promotor mínimo, por exemplo, o promotor mínimo da SEQ ID NO:2.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dita molécula de ácido nucleico isolada é parte de um cassete de expressão.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito cassete de expressão é parte de um vetor.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito vetor é um vetor viral.

6. Uso de uma molécula de ácido nucleico isolada, caracterizado pelo fato de que compreende a, ou consiste em, sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1, ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 400 pares de bases que tem pelo menos 80% de identidade geral com a dita sequência da SEQ ID NO:1, em que a dita molécula de ácido nucleico isolada leva especificamente à expressão de um gene exógeno em células do epitélio de pigmento da retina de primatas quando uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o dito gene exógeno está ligada de maneira funcional à dita molécula de ácido nucleico isolada, para expressar um gene exógeno especificamente em células do epitélio de pigmento da retina de um primata.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita molécula de ácido nucleico isolada compreende, ainda, um promotor mínimo, por exemplo, o promotor mínimo da SEQ ID NO:2.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a dita molécula de ácido nucleico isolada é parte de um cassete de expressão.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito cassete de expressão é parte de um vetor.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito vetor é um vetor viral.

11. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende a, ou consiste em, sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1, ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 400 pares de bases que tem pelo menos 80% de identidade geral com a dita sequência da SEQ ID NO:1, em que a dita molécula de ácido nucleico isolada leva especificamente à expressão de um gene exógeno em células do epitélio de pigmento da retina de primatas quando uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o dito gene exógeno está ligada de maneira funcional à dita molécula de ácido nucleico isolada, para uso no tratamento de uma doença associada ao epitélio de pigmento da retina.

12. Molécula de ácido nucleico isolada para uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita doença associada a epitélio de pigmento da retina é selecionada dentre o grupo que consiste em degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa, retinopatia diabética e hipertrofia de epitélio de pigmento da retina.