CN108430519B - SynP159，用于基因在视杆光感受器中特异性表达的启动子 - Google Patents

SynP159，用于基因在视杆光感受器中特异性表达的启动子 Download PDF

Info

Publication number
CN108430519B
CN108430519B CN201680077464.XA CN201680077464A CN108430519B CN 108430519 B CN108430519 B CN 108430519B CN 201680077464 A CN201680077464 A CN 201680077464A CN 108430519 B CN108430519 B CN 108430519B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
cell
vector
gene
expression cassette
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680077464.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN108430519A (zh
Inventor
D·哈特尔
D·舒伯勒
B·罗斯卡
A·克雷布斯
J·于特纳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research
Original Assignee
Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research filed Critical Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research
Publication of CN108430519A publication Critical patent/CN108430519A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108430519B publication Critical patent/CN108430519B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/405—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO:1的核酸序列或与SEQ ID NO:1的所述序列具有至少80％同一性的至少400bp的核酸序列，或由SEQ ID NO:1的核酸序列或与SEQ ID NO:1的所述序列具有至少80％同一性的至少400bp的核酸序列组成，其中，当所述分离的核酸分子可操作地连接编码基因的核酸序列时，所述分离的核酸分子特异性地导致所述基因在视杆光感受器中的表达。

Description

SynP159，用于基因在视杆光感受器中特异性表达的启动子
发明领域
本发明涉及导致基因在视杆光感受器细胞中特异性地表达的核酸序列。发明背景
为了表达目的，通常将重组基因作为活性表达盒中的cDNA构建体，转染至靶细胞、细胞群或组织中，以允许异源基因转录。该DNA构建体被细胞转录机器识别，识别过程涉及许多反式作用转录因子(TF)在顺式调控元件的活性，所述顺式调控元件包括增强子、沉默子、绝缘子和启动子(在本文中总称为“启动子”)。
基因启动子涉及所有这些调控水平，通过整合DNA序列的影响、转录因子结合和表观遗传特征，作为基因转录中的决定子。它们决定例如由质粒载体编码的转基因表达的强度以及其中将要表达所述转基因的细胞类型。用于驱动哺乳动物细胞中的异源基因表达的最常见启动子是人和小鼠巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子。它们给予强表达并且已经在几个细胞类型中证实是稳健的。其他病毒启动子，如SV40立即早期启动子和劳斯肉瘤病毒(RSV)长末端重复(LTR)启动子，也常常用于表达盒中。
替代病毒启动子，也可以使用细胞启动子。已知的启动子包括，来自编码高丰度转录的细胞转录物的管家基因的启动子，所述转录物如β-肌动蛋白、延伸因子-1α(EF-1α)或泛素。与病毒启动子相比，真核基因表达更复杂并且需要许多不同因子的精确协作。
涉及内源性调控元件用于转基因表达的一个方面是，稳定的mRNA的产生和表达可以在宿主细胞的天然环境中进行，因此所述宿主细胞中提供反式作用转录因子。由于真核基因的表达受顺式-和反式-作用调控元件的复杂机制控制，因此大部分细胞启动子缺乏广泛的功能表征。真核启动子的部分通常位于其转录的序列的紧上游并且作为转录起始点。核心启动子直接地围绕转录起始位点(TSS)，其足以被转录机制识别。近端启动子(proximal promoter)包括核心启动子上游的区域并含有TSS和转录调控需要的其他序列部分。转录因子通过结合启动子和增强子序列中的调控基序表现为序列特异性，并且由此激活染色质和组蛋白修饰酶，这改变核小体结构及其位置，最终允许转录的启动。功能性启动子的鉴别主要取决于相关上游或下游增强子元件的存在。
涉及内源性调控元件用于转基因表达的另一个关键方面是一些启动子可以以细胞特异性方式起作用并将导致转基因在特定类型的细胞中表达，或根据启动子，在特定细胞子集中表达。
因此，本发明的一个目的是获得适用于在哺乳动物细胞中以高表达水平和细胞类型特异性方式表达重组基因的新序列。这样的序列解决本领域对于视网膜细胞特异性启动子的需求，以研发用于神经退行性疾病、视力恢复、药物发现、肿瘤治疗和疾病诊断研究的系统。
发明概述
本发明人通过结合表观遗传学、生物信息学和神经科学，来发现在眼中时仅在视杆光感受器中驱动基因表达的启动子。
本发明序列的核酸序列为：
Figure BDA0001715593430000021
本发明因此提供了包含SEQ ID NO:1的核酸序列或与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少70％同一性的至少400bp的核酸序列或由SEQ IDNO:1的核酸序列或与所述SEQID NO:1的核酸序列具有至少70％同一性的至少400bp的核酸序列组成的分离核酸分子，其中所述分离核酸分子特异性地导致基因在视杆光感受器中表达，其中所述分离核酸分子可操作地连接编码所述基因的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少80％同一性。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，并与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少85％同一性。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，并与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少96％同一性。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少97％同一性。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少98％同一性。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少99％同一性。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有100％同一性。
本发明的分离核酸可以另外包含最小启动子，例如，SV40最小启动子，例如，实施例中使用的SV40最小启动子或其他启动子。
本发明还提供了包含在严格条件下与如上所述的本发明的分离核酸分子杂交的序列的分离核酸分子。
本发明还提供了包含如上所述的本发明的分离核酸的表达盒，其中所述启动子至少可操作地连接编码待特异性地在视杆光感受器中表达的基因的核酸序列。
本发明进一步提供了包含本发明的表达盒的载体。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。
本发明还涵盖本发明的核酸、本发明的表达盒或本发明的载体用于基因在视杆光感受器中表达的用途。
本发明进一步提供了在视杆光感受器中表达基因的方法，包括用本发明的表达盒转染分离的细胞、细胞系或细胞群(例如，组织)的步骤，其中如果所述细胞是视杆光感受器，或所述细胞包含视杆光感受器，则待表达的基因将通过该分离的细胞、细胞系或细胞群表达。在一些实施方案中，分离的细胞、细胞系或细胞群或组织是人的。
本发明还提供了包含本发明的表达盒的分离细胞。在一些实施方案中，表达盒或载体稳定地整合至所述细胞的基因组中。
可以可操作地连接本发明的启动子的典型基因是编码盐细菌视紫红质(halorhodopsin)或视紫红质通道蛋白(channelrhodosin)的基因。
此外，本发明还提供了用于在视杆光感受器中表达基因的药盒，该药盒包括本发明的分离核酸分子。
附图简述
图1：在成年C57BL/6小鼠眼中视网膜下注射AAV-synP159-ChR2-EGFP后3周，自具有SEQ ID NO:1的启动子的EGFP表达的激光扫描共聚焦显微镜图像，显示光感受器层中的侧向投影和顶视图。可以观察到在视杆光感受器中诱导的表达。绿色＝SEQ ID NO:1驱动的EGFP，红色＝mCAR，白色＝Hoechst。
发明详述
本发明人通过结合表观遗传学、生物信息学和神经科学，来发现在眼中时仅在视杆光感受器中驱动基因表达的启动子。
本发明序列的核酸序列为：
Figure BDA0001715593430000051
本发明因此提供了包含SEQ ID NO:1的核酸序列或与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少70％同一性的至少400bp的核酸序列或由SEQ IDNO:1的核酸序列或与所述SEQID NO:1的核酸序列具有至少70％同一性的至少400bp的核酸序列组成的分离核酸分子，其中所述分离核酸分子特异性地导致基因在视杆光感受器中表达，所述分离的核酸分子可操作地连接编码所述基因的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，与所述SEQID NO:1的核酸序列具有至少80％同一性。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，并与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少85％同一性。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，并与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少96％同一性。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少97％同一性。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少98％同一性。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少99％同一性。在一些实施方案中，核酸序列为至少400bp，与所述SEQ ID NO:1的核酸序列具有100％同一性。
本发明的分离核酸分子可以另外包含最小启动子，例如，SV40最小启动子，例如，实施例中使用的SV40最小启动子或其他启动子。
还提供了包含在严格条件下与如上所述的本发明的分离核酸分子杂交的序列的分离核酸分子。
本发明还提供了包含如上所述的本发明的分离核酸的表达盒，其中所述启动子至少可操作地连接编码待特异性地在视杆光感受器中表达的基因的核酸序列。
本发明进一步提供了包含本发明的表达盒的载体。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。
本发明还包括本发明的核酸、本发明的表达盒或本发明的载体用于基因在视杆光感受器中表达的用途。
本发明进一步提供了在视杆光感受器中表达基因的方法，包括用本发明的表达盒转染分离的细胞、细胞系或细胞群(例如，组织)的步骤，其中当所述细胞是视杆光感受器，或所述细胞包括视杆光感受器，待表达的基因将通过该分离的细胞、细胞系或细胞群表达。在一些实施方案中，分离的细胞、细胞系或细胞群或组织是人的。
本发明还提供了包含本发明的表达盒的分离细胞。在一些实施方案中，表达盒或载体稳定地整合至所述细胞的基因组中。
可以可操作地连接本发明的启动子的典型基因是编码盐细菌视紫红质或视紫红质通道蛋白的基因。
此外，本发明还提供了用于在视杆光感受器中表达基因的药盒，该药盒包括本发明的分离核酸分子。
如本文中使用的，术语“启动子”是指任何顺式调控元件，包括增强子、沉默子、绝缘子和启动子。启动子是通常位于需要转录的基因的上游(朝向5’区)的DNA区域。启动子允许其控制的基因的正确激活或抑制。在本发明中，启动子导致与其可操作地连接的基因在视杆光感受器中的特异性表达。“特异性表达”也称为“仅在某类细胞中表达”，表示超过75％的表达目标基因的细胞是所述的类型，在本发明情况中，即视杆光感受器。
通常将表达盒引入可以促进表达盒进入宿主细胞中并在宿主细胞中维持的载体中。这样的载体是本领域技术人员常用的和公知的。许多这样的载体是商业上可购得的，例如，可购自Invitrogen、Stratagene、Clontech等，并且描述于许多指南中，如Ausubel、Guthrie、Strathem或Berger，全部见上。这样的载体通常包括启动子、多腺苷酸化信号等等，以及多克隆位点，和另外的元件，如复制起点、选择标记基因(例如，LEU2、URA3、TRP1、HIS3、GFP)、着丝粒序列等。
病毒载体，例如，AVV、PRV或慢病毒，适于使用本发明的启动子将基因靶向和递送至视杆光感受器中。
可以使用电学方法，如多电极阵列或膜片钳，或使用视觉方法，如荧光的检测，来测量视网膜细胞的输出。
使用本发明的核酸序列的方法可以用于鉴定用于治疗涉及视杆光感受器的神经学病症或视网膜病症的治疗剂，所述方法包括以下步骤：将测试化合物接触在本发明的启动子下表达一个或多个转基因的视杆光感受器，并将在所述测试化合物存在下获得的视杆光感受器的至少一个输出与所述测试化合物不存在下获得的相同输出进行比较。
此外，使用本发明启动子的方法还可以用于视力恢复的体外测试，所述方法包括以下步骤：将在本发明启动子控制下表达一个或多个转基因的视杆光感受器接触试剂，并且将接触所述试剂后获得的至少一个输出与接触所述试剂前获得的相同输出进行比较。
视紫红质通道蛋白是视蛋白亚家族的蛋白，作为光控门控离子通道起作用。它们在单细胞绿藻中作为感觉光感觉器，控制趋光性，即，响应光的移动。在其他生物体的细胞中表达时，它们能够利用光来控制胞内酸度、钙内流、电兴奋性和其他细胞过程。至少三种“天然”视紫红质通道蛋白是目前已知的：视紫红质通道蛋白-1(ChR1)、视紫红质通道蛋白-2(ChR2)和Volvox视紫红质通道蛋白(VChR1)。此外，还存在这些蛋白的一些修饰/改进形式。所有已知的视紫红质通道蛋白是非特异性的阳离子通道，引导H+、Na+、K+和Ca2+离子。
盐细菌视紫红质是光驱动的离子泵，是氯离子特异性的，并且在称为盐细菌(halobacteria)的在系统发生上古代的“细菌”(古细菌)中发现。其是亚视黄基(retinylidene)蛋白家族的七跨膜蛋白，与光驱动质子泵细菌视紫红质同源，并且三级结构(而不是一级序列结构)与脊椎动物视紫红质(在视网膜中感觉光的色素)相似。盐细菌视紫红质与视紫红质通道蛋白(光驱动的离子通道)也共享序列相似性。盐细菌视紫红质含有必需的光可异构化维生素A衍生物全反式视黄醛。盐细菌视紫红质是晶体结构已知的几个膜蛋白之一。盐细菌视紫红质同种型可以在多个盐细菌物种中发现，包括H.salinarum和N.pharaonis。许多正在进行中的研究正在探索这些差异，并使用它们来剖析光循环和泵特性。细菌视紫红质后，盐细菌视紫红质可能是研究的最佳I型(微生物)视蛋白。盐细菌视紫红质视黄醛复合物的峰吸收值为约570nm。最近，盐细菌视紫红质已经成为光遗传学中的工具。正如蓝光激活的离子通道视紫红质通道蛋白-2打开了使用蓝光短脉冲激活可兴奋细胞(如神经元、肌细胞、胰腺细胞和免疫细胞)的能力，盐细菌视紫红质打开了用黄光短脉冲沉默可兴奋细胞的能力。因此，盐细菌视紫红质和视紫红质通道蛋白一起使得能够进行神经活动的多色光激活、沉默和去同步化，构成了一个有力的神经工程化工具箱。
在一些实施方案中，启动子是靶向视网膜的载体的一部分，所述载体表达至少一个在活的视杆光感受器中可检测的报告基因。
用于本发明的合适病毒载体是本领域公知的。例如，AAV、PRV或慢病毒，适用于将基因靶向和递送至视杆光感受器。
用分离的视网膜工作时，可以通过将神经节细胞侧向下安放，使得视网膜的光感受器侧暴露，并且因此可以更好地转染，从而实现视网膜细胞的最佳病毒递送。另一种技术是薄切视网膜的内界膜，例如，使用刀片，使得递送病毒可以穿透内膜。再一种方式是将视网膜包埋在琼脂中，将所述视网膜切片，并从切片侧施加递送病毒。
可以使用公知的方法，例如，使用电学方法，如多电极阵列或膜片钳，或使用视觉方法，如荧光的检测，来测量转染的细胞的输出。在一些情况中，通过对内界膜的显微手术，除去内界膜。在其他情况中，通过对内界膜进行的切片来实现记录。
任何来源的视网膜细胞均可以用于本发明。在本发明的一些实施方案中，视网膜细胞来自人视网膜，或在人视网膜中。在其他实施方案中，视网膜来自动物，例如，牛或啮齿动物来源的。人视网膜可以容易地从角膜库获得，在角膜库中在解剖角膜后通常视网膜被丢弃。成人视网膜具有大的表面积(约1100mm2)并且因此可以容易地分成许多实验子区。此外，视网膜也可以用作突触通讯的精致(exquisite)模型，因为视网膜具有与其余大脑部分相同的突触。
如本文中使用的，术语“动物”在本文中用于包括所有动物。在本发明的一些实施方案中，非人动物是脊椎动物。动物的实例是人、小鼠、大鼠、奶牛、猪、马、鸡、鸭、鹅、猫、狗等。术语“动物”还包括所有发育阶段的个体动物，包括胚胎和胎儿阶段。“遗传修饰的动物”是含有一个或多个如下细胞的任何动物，所述细胞带有通过在亚细胞水平的有意遗传操纵(如通过靶向重组、微注射或用重组病毒感染)直接或间接改变或接受的遗传信息。术语“遗传修饰的动物”不旨在涵盖经典的杂交育种或体外受精，但旨在涵盖其中一个或多个细胞被重组DNA分子改变或接受重组DNA分子的动物。该重组DNA分子可以特异性地靶向确定的遗传位点，或可以在染色体内随机整合，或可以是染色体外复制DNA。术语“种系遗传修饰的动物”是指，生殖系细胞中已经引入了遗传改变或遗传信息的遗传修饰动物，由此赋予将该遗传信息转移给其后代的能力。如果这样的后代实际上具有一些或全部的该改变或遗传信息，则它们也是遗传修饰的动物。
所述改变或遗传信息可以是对于接受者所属动物物种而言外源的，或只是对该特定个体接受者而言外源的，或可以是接受者已经拥有的遗传信息。在最后一种情况中，改变的或引入的基因可以具有与天然基因不同的表达，或根本不表达。可以通过各种技术来获得用于改变靶基因的基因，所述技术包括，但不限于，从基因组来源分离、从分离的mRNA模板制备cDNA、直接合成，或其组合。
一种用于转基因引入的靶细胞是ES细胞。ES细胞可以获自在体外培养的植入前胚胎以及与胚胎融合(Evans等(1981)，Nature 292:154-156；Bradley等(1984)，Nature 309:255-258；Gossler等(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:9065-9069；Robertson等(1986)，Nature 322:445-448；Wood等(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:4582-4584)。可以通过标准技术，如使用电穿孔的DNA转染，或通过逆转录病毒介导的转导，将转基因有效地引入ES细胞中。所得到的转化的ES细胞此后可以通过聚集与桑椹胚组合或注入来自非人动物的胚泡中。引入的ES细胞此后可以定殖在胚胎中并促成所得到的嵌合动物的种系(Jaenisch(1988)，Science 240:1468-1474)。经基因打靶的(gene-targeted)ES细胞在基因打靶的遗传修饰小鼠中的应用描述于1987年(Thomas等(1987)，Cell 51:503-512)并且在别处有综述(Frohman等(1989)，Cell 56:145-147；Capecchi(1989)，Trends inGenet.5:70-76；Baribault等(1989)，Mol.Biol.Med.6:481-492；Wagner(1990)，EMBO J.9:3025-3032；Bradley等(1992)，Bio/Technology 10:534-539)。
可以获得技术，通过使用靶向同源重组，将特定的改变插入染色体等位基因中，以将任何遗传区域失活或改变成任何所需的突变。如本文中使用的，“靶向基因”是通过人为干预引入到非人动物的种系中的DNA序列，所述干预包括但不限于本文中所述的方法。本发明的靶向基因包括设计成特异性地改变关连的(cognate)内源性等位基因的DNA序列。
在本发明中，“分离的”是指从其初始环境(例如，如果是天然产生的，自然环境)取出的物质，并且因此相对于其自然状态而“被人为”改变。例如，分离的多核苷酸可以是载体或物质组合物的一部分，或可以包含在细胞内，并且仍然是“分离的”，因为载体、物质组合物或特定的细胞不是该多核苷酸的初始环境。术语“分离的”不指基因组或cDNA文库、完整细胞总的或mRNA制备物、基因组DNA制备物(包括通过电泳分离并转移至印迹上的那些)、经剪切的完整细胞基因组DNA制备物、或其他组合物，其中可以证明没有本发明的多核苷酸/序列的区别特征。分离的DNA分子的更多实例包括维持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或在溶液中的(部分或基本上)纯化的DNA分子。分离的RNA分子包括本发明的DNA分子的体内或体外RNA转录物。然而，对于本发明的目的，包含在克隆(其中所述克隆是文库(例如，基因组或cDNA文库)的成员，且尚未与文库的其他成员分离(例如，以含有该克隆和文库的其他成员的均质溶液的形式))中的核酸、或包含在取自细胞或细胞裂解物的染色体(例如，如在核型分析中，“染色体铺展物”)中的核酸，或包含在经随机剪切的基因组DNA的制备物中或用一个或多个限制酶切割的基因组DNA的制备物中的核酸，不是“分离的”。如本文中进一步讨论的，根据本发明的分离的核酸分子可以是天然、重组或合成产生的。
“多核苷酸”可以由单链和双链DNA、作为单链和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA、以及作为单链和双链区的混合物的RNA、包含DNA和RNA的杂合分子(可以是单链的、或更常见地双链的，或单链和双链区的混合物)组成。此外，多核苷酸可以由包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区组成。为了稳定性或出于其他原因，多核苷酸还可以含有一个或多个修饰的碱基或修饰的DNA或RNA主链。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化的碱基和稀有碱基，如肌苷。可以对DNA和RNA进行各种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学、酶或代谢修饰的形式。
表述“编码多肽的多核苷酸”涵盖，只包括多肽的编码序列的多核苷酸、以及还包括另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
“严格杂交条件”是指，在包含50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhard’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的剪切鲑鱼精子DNA的溶液中在42℃孵育过夜，接着滤膜在约50℃在0.1×SSC中洗涤。可以主要通过操纵甲酰胺浓度(较低百分比的甲酰胺导致较低的严格性)；盐浓度或温度来实现杂交和信号检测的严格性变化。例如，中高严格条件包括：在包含6×SSPE(20×SSPE＝3M NaCl；0.2MNaH2PO4；0.02M EDTA，pH7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、100μg/ml鲑鱼精子阻断性DNA的溶液中在37℃孵育过夜；接着使用1×SSPE、0.1％SDS在50℃洗涤。此外，为了获得甚至更低的严格性，可以在较高盐浓度(例如，5×SSC)，进行严格杂交后的洗涤。可以通过包含和/或替换用于抑制杂交实验背景的可选阻断试剂，来完成以上条件的改变。典型的阻断试剂包括Denhardt’s试剂、BLOTTO、肝素、变性鲑鱼精子DNA和商业上可购得的专利制剂。由于相容性的问题，包含特定的阻断试剂可能需要改变上述的杂交条件。
术语“片段”、“衍生物”和“类似物”，涉及多肽时，表示保留了与此类多肽基本上相同的生物功能或活性的多肽。类似物包括可以通过切割前蛋白部分以产生活性成熟多肽而被激活的前蛋白。
术语“基因”表示，参与产生多肽链的DNA区段；其包括编码区之前和之后的序列，“前导和非转录尾区”，以及各编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
多肽可以由通过肽键或修饰的肽键(即肽等排物(isosteres))彼此连接的氨基酸组成，并且可以含有除了20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。多肽可以通过天然加工(如翻译后加工)或通过本领域公知的化学修饰技术来修饰。这样的修饰在基础教科书和更详细的专著以及大量研究文献中有充分描述。修饰可以发生在多肽中的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。可以明了，相同类型的修饰可以以相同或不同的程度存在于给定多肽中的几个位点。此外，给定多肽可以含有多种类型的修饰。多肽可以是分支的，例如，作为泛素化的结果，并且它们可以是环状的，具有或不具有分支。环状、分支和分支环状多肽可以从翻译后天然加工获得，或可以通过合成方法制得。修饰包括，但不限于，乙酰化、酰化、生物素化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、通过已知保护/阻断基团衍生化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、连接抗体分子或其他细胞配体、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工(例如，断裂)、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、selenoylation、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸添加至蛋白质，如精氨酰化(arginylation)和泛素化(参见，例如，PROTEINS-STRUCTURE ANDMOLECULAR PROPERTIES，第2版，T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993)；POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS,B.C.Johnson编辑，Academic Press,New York,pgs.I-12(1983)；Seifter等，Meth Enzymol 182:626-646(1990)；Rattan等，Ann NY Acad Sci 663:48-62(1992))。
“具有生物活性的”肽片段是指，呈现出与初始多肽活性相似(但不必需是相同)活性的多肽，包括成熟形式，如在特定的生物测试中测量的，具有或不具有剂量依赖性。在存在剂量依赖性的情况中，与初始多肽相比，不需要与多肽的活性相同，而是与给定活性中的剂量依赖性基本上相似(即，相对于初始多肽，候选多肽可以呈现更高的活性，或低不超过约25倍的活性，并且在一些实施方案中，低不超过约十倍的活性，或低不超过约三倍的活性)。
可以通过从本文中提供的序列制备合适的探针或引物并筛选合适核酸来源以寻找所需同源物，来分离和鉴定物种同源物。
“变体”是指，不同于初始多核苷酸或多肽但保留其实质性特性的多核苷酸或多肽。通常，变体是整体上紧密相似的，并且在许多区域中，与初始多核苷酸或多肽相同。
实际上，可以使用已知的计算机程序，常规地确定任何特定核酸分子或多肽是否与本发明的核苷酸序列为至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。用于确定查询序列(本发明的序列)和目标序列之间的最佳整体匹配的一个优选方法，也称为整体序列比对，可以基于Brutlag等(Comp.App.Blosci.(1990)6:237-245)的算法，使用FASTDB计算机程序来确定。在序列比对中，查询和目标序列都是DNA序列。可以通过将U’s转变成T’s来比较RNA序列。所述整体序列比对的结果是同一性百分比。在DNA序列的FASTDB比对中用于计算同一性百分比的优选参数是：矩阵＝Unitary，k-tuple＝4，错配罚分--1，连接罚分--30，随机化组长(Randomization Group Length)＝0，截短分值＝1，空位罚分--5，空位大小罚分0.05，窗口大小＝500或目标核苷酸序列的长度(以较短的为准)。如果由于5’或3’缺失，而不是由于内部缺失，目标序列短于查询序列，则必须对结果进行手动校正。这是因为FASTDB程序在计算同一性百分比时不考虑目标序列的5’和3’截短。对于相对于查询序列在5’或3’端截短的目标序列，通过计算未匹配/比对的、位于目标序列的5’和3’的查询序列的碱基数，作为查询序列的总碱基的百分比，来校正同一性百分比。通过FASTDB序列比对的结果来确定核苷酸是否匹配/比对。随后从使用规定参数通过以上的FASTDB程序计算的同一性百分比中减去该百分比，以获得最终的同一性百分比分值。这种校正的分值是用于本发明目的的分值。对于手动调节同一性百分比分值的目的，只计算目标序列的5’和3’碱基外与查询序列不匹配/比对的碱基(如通过FASTDB算法展示的)。例如，将90个碱基的目标序列与100个碱基的查询序列比对来确定同一性百分比。缺失发生在目标序列的5’末端，并且因此，FASTDB比对不显示5’末端的头10个碱基的匹配/比对。这10个受损的碱基代表序列的10％(5’和3’端未匹配的碱基数/查询序列中的碱基总数)，因此从通过FASTDB程序计算的同一系百分比分值中减去10％。如果剩余的90个碱基完全匹配，则最终同一性百分比为90％。在另一个实例中，将90个碱基的目标序列与100个碱基的查询序列比较。这次缺失是内部缺失，在目标序列的5’或3’不存在与查询序列不匹配/比对的碱基。在这种情况中，通过FASTDB计算的同一性百分比不进行手动校正。再一次，只有目标序列5’和3’与查询序列不匹配/比对的碱基才手动校正。
通过具有与本发明的查询氨基酸序列至少(例如)95％“同一”的氨基酸序列的多肽，旨在表示，目标多肽的氨基酸序列与查询序列相同，除了目标多肽序列可以在查询氨基酸序列的每100个氨基酸中包括不超过五个氨基酸改变。换句话说，为了获得具有与查询氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列的多肽，目标序列中不超过5％的氨基酸残基可以插入、缺失，或被其它氨基酸置换。参照序列的这些改变可以出现在参照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，或这些末端位置之间的任何地方，分别地散布在参照序列或参照序列内的一个或多个连续组的残基中间。
实际上，可以使用已知计算机程序，常规地确定任何特定多肽是否与例如序列表中所示的氨基酸序列或与保藏的DNA克隆编码的氨基酸序列至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。用于确定查询序列(本发明的序列)和目标序列之间的最佳整体匹配的一个优选方法，也称为整体序列比对，可以基于Brutlag等(Comp.App.Blosci.(1990)6:237-245)的算法，使用FASTDB计算机程序来确定。在序列比对中，查询和目标序列都是核苷酸序列或都是氨基酸序列。所述整体序列比对的结果是同一性百分比。FASTDB氨基酸比对中使用的优选参数是：矩阵＝PAM 0，k-tuple＝2，错配罚分--1，连接罚分＝20，随机化群长＝0，截短分值＝1，窗口大小＝序列长度，空位罚分--5，空位大小罚分--0.05，窗口大小＝500或目标氨基酸序列的长度(以较短的为准)。如果由于N-或C-末端缺失，而不是由于内部缺失，目标序列短于查询序列，则必须对结果进行手动校正。这是因为FASTDB程序在计算整体同一性百分比时不考虑目标序列的N-和C-末端截短。对于相对于查询序列在N-和C-末端截短的目标序列，通过计算与相应目标残基不匹配/比对的位于目标序列的N-和C-末端的查询序列碱基的数量，作为查询序列的总碱基的百分比，来校正同一性百分比。通过FASTDB序列比对的结果来确定残基是否匹配/比对。随后从使用规定参数通过以上的FASTDB程序计算的同一性百分比中，减去这个百分比，以获得最终的同一性百分比分值。此最终的同一性百分比分值是用于本发明目的的分值。对于手动调节同一性百分比分值的目的，只考虑位于目标序列的N-和C-末端与查询序列不匹配/比对的残基。即，只有位于目标序列的最远N-和C-末端残基外的查询残基位置被考虑。只对位于目标序列的N-和C-末端外的(如FASTDB比对中显示的)，与查询序列不匹配/比对的残基位置，进行手动校正。对于本发明的目的，不进行其他手动校正。
天然产生的蛋白质变体称为“等位基因”变体，并且是指占据生物体染色体上的给定基因座的基因的几种可选形式中的一种(Genes 11，Lewin,B编辑，John Wiley&Sons，NewYork(1985))。这些等位基因变体可以在多核苷酸和/或多肽水平改变。或者，可以通过诱变技术或通过直接合成来产生非天然变体。
“标记”是指能够直接或通过与信号产生系统的一个或多个另外的成员相互作用而提供可检测信号的试剂。直接可检测的并且可以用于本发明中的标记包括荧光标记。特定的荧光团包括荧光素、若丹明、BODIPY、花青染料等。
“荧光标记”是指，能够在被另一波长的光激活时发射特定波长的光的任何标记。
“荧光”是指任何可检测的荧光信号特征，包括强度、光谱、波长、胞内分布等。
“检测”荧光是指使用定性或定量方法评价细胞荧光。在本发明的一些实施方案中，以定性方式检测荧光。换言之，荧光标记存在，表明重组融合蛋白得到了表达或没有表达。对于其他情况，可以使用定量方式测定荧光，例如，测量荧光强度、光谱或胞内分布，使得在不同条件下获得的值可以进行统计学比较。还可以使用定性方法来确定水平，如视觉分析和人为对多个样品进行比较，例如，使用荧光显微镜或其他光学检测仪(例如，图像分析系统等)检测样品。荧光的“改变”或“变化”是指，在特定条件下与另一个条件相比，荧光的强度、胞内分布、光谱、波长或其他方面的任何可检测差异。例如，定量地检测“改变”或“变化”，并且差异是统计学上显著的差异。可以用标准仪器，如荧光显微镜、CCD或任何其他荧光检测仪，来检测荧光的任何“改变”或“变化”，并且可以使用自动化系统(如集成系统)来检测，或可以通过人观察者来反映改变的主观检测。
“绿色荧光蛋白”(GFP)是由238个氨基酸组成的蛋白质(26.9kDa)，最初从水母Aequorea victoria/Aequorea aequorea/Aequorea forskalea分离，暴露于蓝光时发出绿色荧光。来自A.victoria的GFP具有在395nm波长的主要激发峰和475nm的次要峰。发射峰在509nm，这在可见光谱的较低绿色部分中。来自海肾(Renilla reniformis)的GFP具有在498nm的单个主要激发峰。由于广泛使用的潜能和研究者的发展需求，已经工程化了GFP的许多不同突变体。第一个主要的改进是1995年由Roger Tsien在Nature中报道的单点突变(S65T)。这种突变显著改善了GFP的光谱特征，导致提高的荧光、光稳定性、以及主要激发峰迁移至488nm而发射峰保持在509nm。将37℃折叠效率(F64L)点突变添加至这个支架产生了增强的GFP(EGFP)。EGFP具有9.13×10-21m2/分子的消光系数(表示为ε)，也称为其光学截面，也作为55,000L/(mol·cm)提出。2006年报道了Superfolder GFP，一系列允许GFP快速折叠和成熟的突变(即使与折叠差的肽融合后)。
“黄色荧光蛋白”(YPG)是绿色荧光蛋白的遗传突变体，源自Aequorea victoria。其激发峰为514nm并且其发射峰为527nm。
如本文中使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数提及物，除非文中明确另外指出。
“病毒”是不能在宿主细胞外生长或繁殖的亚微观传染剂。每个病毒颗粒，或病毒粒，由遗传物质DNA或RNA组成，在称为衣壳的保护性蛋白衣壳内。衣壳形状可以从简单的螺旋体和二十面体(多面体或近球体)形式，至更复杂的具有尾或包膜的结构。病毒感染细胞生命形式并且根据感染的宿主类型，分组为动物、植物和细菌类型。
如本文中使用的术语“跨突触病毒”是指能够通过突触从一个神经元迁移至另一个相连神经元的病毒。这样的跨突触病毒的实例是弹状病毒(rhabodivirus)，例如，狂犬病病毒,和α疱疹病毒，例如，假狂犬病或单纯疱疹病毒。如本文中使用的术语“跨突触病毒”还包括自身具有通过突触从一个神经元迁移至另一个相连神经元的能力的病毒亚单位，和并入这样的亚单位并显示出通过突触从一个神经元迁移至另一个相连神经元的能力的生物载体如修饰的病毒。
跨突触迁移可以是顺行的或逆行的。在逆行迁移的过程中，病毒将从突触后的神经元移动至突触前的神经元。相应地，在顺行迁移过程中，病毒从突触前的神经元移动至突触后的神经元。
同源物是指共享共同的祖先的蛋白。类似物不共享共同的祖先，但具有一些功能(而非结构)相似性，从而使得它们被包括在一个类别中(例如，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶明显不相关——它们在活性位点外的结构完全不同，但它们具有实质上几何学上相同的活性位点，并且因此被认为是趋同进化至类似物的实例)。
存在两个亚类的同源物——直系同源物和旁系同源物。直系同源物是在不同物种中的相同基因(例如，细胞色素'c')。相同生物体中的两个基因不可能是直系同源物。旁系同源物是基因复制的结果(例如，血红蛋白β和δ)。如果两个基因/蛋白质是同源的并且在相同生物体中，则它们是旁系同源物。
如本文中使用的，术语“病症”是指微症、疾病、病、临床病症或病理状况。
如本文中使用的，术语“药物学上可接受的载体”是指，不干扰活性成分的生物活性有效性、是化学惰性的并且对所施用的患者是无毒的载体介质。
如本文中使用的，术语“药物学上可接受的衍生物”是指，对受试者相对无毒的，例如使用本发明的筛选方法鉴定的，药剂的任何同源物、类似物或片段。
术语“治疗剂”是指有助于预防或治疗病症、或病症的并发症的任何分子、化合物或处理。
可以制备配制在相容的药物载体中包含此类药剂的组合物，并包装和加标签用于治疗。
如果复合物是水溶性的，那么可以在合适的缓冲剂中配制，例如，磷酸盐缓冲盐水或其他生理上相容的溶液。
或者，如果所得到的复合物在水性溶剂中具有差的溶解性，则可以用非离子型表面活性剂配制，如Tween或聚乙二醇。因此，可以配制化合物及其生理上可接受的溶剂化物，用于通过吸入或吹入(通过口或鼻)或口服、颊、胃肠外、直肠给药，或在肿瘤的情况中，直接注入实体肿瘤中。
对于口服给药，药物制剂可以是液体形式，例如，溶液、糖浆或悬浮液，或可以作为在使用前用水或其他合适的赋形剂重构的药物产品来呈现。这样的液体制剂可以使用药物学上可接受的添加剂通过常规的方式来制备，所述添加剂为例如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水性载体(例如，杏仁油、油性酯或分馏的植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。药物组合物可以采用例如片剂或胶囊的形式，通过常规方式制备，使用药物学上可接受的赋形剂，如粘合剂(例如，预糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域公知的方法来包衣。
可以合适地配制用于口服的制剂，以实现活性化合物的受控释放。
化合物可以配制用于通过注射的胃肠外给药，例如，通过快速浓注或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型呈现，例如，在安瓿或多剂量容器中，含有添加的防腐剂。
组合物可以采用油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前，用合适的载体(例如，无菌无热原水)构建。
化合物可以配制成局部应用，如霜剂或洗剂。
除了之前所述的制剂，化合物还可以配制成储库(depot)制剂。此类长效制剂可以通过植入(例如，眼内、皮下或肌内)或通过眼内注射来给药。
因此，例如，化合物可以用合适的聚合或疏水性材料(例如，作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂来配制，或配制为难溶性衍生物，例如，作为难溶性盐。脂质体和乳液是用于亲水性药物的递送介质或载体的公知实例。
如果需要，组合物可以在包装或分配器装置中呈现，所述包装或装置可以含有一个或多个含有活性成分的单位剂型。所述包装例如可以包括金属或塑料箔，如发泡包装。所述包装或分配器装置可以附有给药说明。
本发明还提供了用于进行本发明的治疗方案的药盒。这样的药盒在一个或多个容器中包括治疗或预防有效量的药物学上可接受形式的组合物。
药盒的小瓶中的组合物可以是药物学上可接受溶液的形式，例如，组合无菌盐水、葡萄糖溶液或缓冲溶液，或其他药物学上可接受的无菌流体。或者，复合物可以冻干或脱水；在这种情况中，药盒任选进一步在容器中包括药物学上可接受的溶液(例如，盐水、葡萄糖溶液等)，优选无菌的，以将复合物重构以形成用于注射目的的溶液。
在另一个实施方案中，药盒进一步包括针或注射器，优选以无菌形式包装，用于注射复合物，和/或包装的酒精垫。任选包括用于由医生或患者施用组合物的说明书。
视杆光感受器、视杆细胞或视杆是眼睛视网膜中的光感受器细胞，与其他类型的视觉光感受器(视锥细胞)相比，其可以对强度较低的光起作用。视杆集中在视网膜的外边缘并且用于周边视力。平均起来，在人视网膜中存在大约9千万个视杆细胞。视杆细胞比视锥细胞更敏感，几乎完全负责夜视。然而，因为它们只具有一种类型的光敏色素，而非人视锥细胞具有的三种类型，视杆在色觉中具有很小(如果有的话)的作用。
除非另外限定，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文中所述那些相似或相当的方法和材料可以用于本发明的实施或测试中，但以下将描述合适的方法和材料。在冲突的情况中，以本发明说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和实施例只是举例说明性的，并且不旨在用来限制。
实施例
基因构建体
在目标细胞类型(视杆)中产生了完整基因组高分辨率DNA甲基化图谱，以鉴定候选调节区域。基于细胞类型特异性DNA低甲基化的存在来选择候选增强子。在视锥和视杆中使用体内高通量报告分子测定试验，来筛选由此选择的元件的表达。随后合成视杆特异性序列元件并且克隆在最小启动子序列之前，所述最小启动子序列为：
ATCCTCACATGGTCCTGCTGGAGTTAGTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAGCTATCACATCCACTGTGTTGTTGTGAACTGGAATCCACTATAGGCCA(SEQ ID NO:2)。在这个启动子和优化的Kozak序列(GCCACC)后立即插入ChR2-eGFP编码序列，并且接着是旱獭肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)和SV40多腺苷酸化位点。使用具有3.43E+11至1.75E+12GC/ml范围滴度的AAV血清型2/8，靶向视网膜神经元。
病毒转染和组织制备
对于AAV施用，通过尖的30号针，在接近晶状体的巩膜中刺入麻醉动物的眼睛。通过Hamilton注射器在视网膜下注射2微升AAV颗粒悬浮液。3周后，将分离的视网膜在PBS中的4％PFA中固定30min，接着是4℃的PBS中的洗涤步骤。用PBS中的10％正常驴血清(NDS)、1％BSA、0.5％Triton X-100在室温下处理整个视网膜1h。在室温下，用PBS中的3％NDS、1％BSA、0.5％Triton X-100中的单克隆大鼠抗GFP抗体(Molecular Probes Inc.；1:500)和多克隆兔抗小鼠Cone Arrestin抗体(Millipore：1:200)处理5天。用第二驴抗大鼠AlexaFluor-488 Ab(Molecular Probes Inc.；1:200)、抗兔Alexa Fluor-633和Hoechst处理2hr。将切片洗涤，用ProLong Gold抗褪色试剂(Molecular Probes Inc.)封固在载玻片上，并且使用Zeiss LSM 700 Axio Imager Z2激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss Inc.)拍照。
Figure IDA0001715593480000011

Claims (22)

1.一种表达盒，其包含：
- 分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO: 1的核酸序列，和
- 编码基因的核酸序列，
其中，所述编码基因的核酸序列可操作地连接所述分离的核酸分子，且其中所述分离的核酸分子有效地驱动所述基因在视杆光感受器细胞中表达。
2.权利要求1的表达盒，进一步包含最小启动子。
3.权利要求2的表达盒，其中所述最小启动子包含SEQ ID NO: 2的核酸序列。
4.一种载体，其包含权利要求1-3任一项的表达盒。
5.权利要求4的载体，其中所述载体是病毒载体。
6.权利要求4的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。
7.根据权利要求1-3任一项的表达盒或根据权利要求4-6任一项的载体在制备用于使基因在视杆光感受器细胞中表达的药物中的用途。
8.一种在视杆光感受器细胞中表达基因的体外方法，包括用根据权利要求1-3任一项的表达盒转染分离的细胞，其中，所述分离的细胞是视杆光感受器细胞。
9.一种在视杆光感受器细胞中表达基因的体外方法，包括用根据权利要求1-3任一项的表达盒转染细胞系或细胞群，其中，所述细胞系或细胞群包含视杆光感受器细胞。
10.一种分离的细胞，其包含权利要求1-3任一项的表达盒或权利要求4-6任一项的载体。
11.权利要求10的分离的细胞，其中表达盒或载体稳定地整合至所述分离的细胞的基因组中。
12.权利要求1-3任一项的表达盒、权利要求4-6任一项的载体、或权利要求10或11的分离的细胞，其中基因的产物是光敏分子。
13.权利要求12的表达盒、载体或分离的细胞，其中所述光敏分子是盐细菌视紫红质。
14.权利要求12的表达盒、载体或分离的细胞，其中所述光敏分子是视紫红质通道蛋白。
15.权利要求7的用途或权利要求8或9的方法，其中基因的产物是光敏分子。
16.权利要求15的用途或方法，其中所述光敏分子是盐细菌视紫红质。
17.权利要求15的用途或方法，其中所述光敏分子是视紫红质通道蛋白。
18.一种用于在视杆光感受器细胞中表达基因的药盒，其包括根据权利要求1-3任一项的表达盒。
19.权利要求1-3任一项的表达盒或权利要求4-6任一项的载体，其中，所述视杆光感受器细胞是啮齿类动物视杆光感受器细胞。
20.权利要求1-3任一项的表达盒或权利要求4-6任一项的载体，其中，所述视杆光感受器细胞是人视杆光感受器细胞。
21.权利要求7的用途或权利要求8或9的方法，其中，所述视杆光感受器细胞是啮齿类动物视杆光感受器细胞。
22.权利要求7的用途或权利要求8或9的方法，其中，所述视杆光感受器细胞是人视杆光感受器细胞。
CN201680077464.XA 2015-12-03 2016-12-01 SynP159，用于基因在视杆光感受器中特异性表达的启动子 Active CN108430519B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15197899 2015-12-03
EP15197899.6 2015-12-03
PCT/IB2016/057263 WO2017093931A1 (en) 2015-12-03 2016-12-01 Synp159, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108430519A CN108430519A (zh) 2018-08-21
CN108430519B true CN108430519B (zh) 2022-04-15

Family

ID=54780228

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680077464.XA Active CN108430519B (zh) 2015-12-03 2016-12-01 SynP159，用于基因在视杆光感受器中特异性表达的启动子

Country Status (6)

Country Link
US (2) US10995344B2 (zh)
EP (1) EP3383438B1 (zh)
JP (1) JP7058220B2 (zh)
CN (1) CN108430519B (zh)
ES (1) ES2909444T3 (zh)
WO (1) WO2017093931A1 (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2009237585C1 (en) 2008-04-18 2013-09-26 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Novel therapeutical tools and methods for treating blindness
US10941417B2 (en) 2015-04-30 2021-03-09 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Promoter for the specific expression of genes in Müller cells
CN108350463B (zh) 2015-09-15 2022-06-24 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 通过靶向光受体治疗失明的新型治疗工具和方法
ES2881782T3 (es) 2015-10-14 2021-11-30 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Res Promotor para la expresión específica de genes en células endoteliales retinianas.
US10994026B2 (en) 2015-12-03 2021-05-04 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research SynP160, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors
US10995344B2 (en) 2015-12-03 2021-05-04 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research SYNP159, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors
ES2761328T3 (es) 2015-12-03 2020-05-19 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Res SynP161, un promotor para la expresión específica de genes en fotorreceptores de bastón
CN108472390B (zh) 2015-12-03 2022-04-15 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 SynP162,用于基因在视杆光感受器中特异性表达的启动子
KR20190077471A (ko) 2016-11-02 2019-07-03 프리드리히 미셔 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치 방향 선택적인 망막 신경절 세포에서의 유전자의 특이적 발현을 위한 프로모터, synp198
US11371060B2 (en) 2017-02-08 2022-06-28 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research SYNP88, a promoter for the specific expression of genes in retinal ganglion cells
CR20200210A (es) 2017-11-15 2020-09-23 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Res Promotor especìfico de las cèlulas del epitelio pigmentario retinal en primates
JP2021503934A (ja) 2017-11-30 2021-02-15 フリードリッヒ ミーシェー インスティトゥート フォー バイオメディカル リサーチ 網膜色素上皮中の遺伝子の特異的発現のためのプロモーターＳｙｎＰＩＩＩ
CN112912508A (zh) * 2018-10-25 2021-06-04 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 用于使基因在视网膜神经节细胞中特异性表达的启动子SynP194(ProB15)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013068413A1 (en) * 2011-11-08 2013-05-16 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Rod cell-specific promoter

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
EP1891976A1 (en) 2006-08-23 2008-02-27 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Use of light sensitive genes
AU2009237585C1 (en) 2008-04-18 2013-09-26 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Novel therapeutical tools and methods for treating blindness
EP2888368A1 (en) 2012-08-27 2015-07-01 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Retinal off circuit-specific promoter
EP3104895A1 (en) 2014-02-10 2016-12-21 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Aii retinal amacrine cell-specific promoter
ES2748282T3 (es) 2014-02-11 2020-03-16 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Res Promotor específico de células de Müller
US10941417B2 (en) 2015-04-30 2021-03-09 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Promoter for the specific expression of genes in Müller cells
CN108350463B (zh) 2015-09-15 2022-06-24 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 通过靶向光受体治疗失明的新型治疗工具和方法
ES2881782T3 (es) 2015-10-14 2021-11-30 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Res Promotor para la expresión específica de genes en células endoteliales retinianas.
US10994026B2 (en) 2015-12-03 2021-05-04 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research SynP160, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors
CN108472390B (zh) 2015-12-03 2022-04-15 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 SynP162,用于基因在视杆光感受器中特异性表达的启动子
ES2761328T3 (es) 2015-12-03 2020-05-19 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Res SynP161, un promotor para la expresión específica de genes en fotorreceptores de bastón
US10995344B2 (en) 2015-12-03 2021-05-04 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research SYNP159, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors
ES2872798T3 (es) 2015-12-04 2021-11-02 Univ Sorbonne Promotores y usos de los mismos
US20190209708A1 (en) 2016-05-17 2019-07-11 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Novel therapeutic tools and methods for treating blindness
KR20190077471A (ko) 2016-11-02 2019-07-03 프리드리히 미셔 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치 방향 선택적인 망막 신경절 세포에서의 유전자의 특이적 발현을 위한 프로모터, synp198
JP2020501538A (ja) 2016-12-01 2020-01-23 フリードリッヒ ミーシェー インスティトゥート フォー バイオメディカル リサーチ インターニューロン中の遺伝子の特異的発現のためのプロモーターｓｙｎｐｉ
CN110072559A (zh) 2016-12-01 2019-07-30 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 用于使基因在中间神经元中特异性表达的启动子SynP107
US11371060B2 (en) 2017-02-08 2022-06-28 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research SYNP88, a promoter for the specific expression of genes in retinal ganglion cells
CR20200210A (es) 2017-11-15 2020-09-23 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Res Promotor especìfico de las cèlulas del epitelio pigmentario retinal en primates
JP2021503934A (ja) 2017-11-30 2021-02-15 フリードリッヒ ミーシェー インスティトゥート フォー バイオメディカル リサーチ 網膜色素上皮中の遺伝子の特異的発現のためのプロモーターＳｙｎＰＩＩＩ
CA3083404A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp61, a primate retinal pigment epithelium cell-specific promoter
US20210388385A1 (en) 2018-10-25 2021-12-16 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp27 (prob12), a promoter for the specific expression of genes in protoplasmic astrocytes
WO2020084541A1 (en) 2018-10-25 2020-04-30 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp151 (proc29), a promoter for the specific expression of genes in retinal ganglion cells
CN112930201A (zh) 2018-10-25 2021-06-08 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 用于视网膜神经节细胞中特异表达基因的启动子SynP78(ProA27)
WO2020084539A1 (en) 2018-10-25 2020-04-30 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp57 (proa14), a promoter for the specific expression of genes in photoreceptors
CN112912508A (zh) 2018-10-25 2021-06-04 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 用于使基因在视网膜神经节细胞中特异性表达的启动子SynP194(ProB15)
EP3870238A1 (en) 2018-10-25 2021-09-01 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Synp17 (prob1), a promoter for the specific expression of genes in retinal ganglion cells
EP3914299A1 (en) 2019-01-24 2021-12-01 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Synp5 (proa9), a promoter for the specific expression of genes in retinal ganglion cells
JP2022517688A (ja) 2019-01-24 2022-03-09 フリードリッヒ ミーシェー インスティトゥート フォー バイオメディカル リサーチ 網膜神経節細胞中の遺伝子の特異的発現のためのプロモーターＳｙｎＰ３５（ＰｒｏＣ８）
WO2020152625A1 (en) 2019-01-24 2020-07-30 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp66 (proa21), a promoter for the specific expression of genes in retinal ganglion cells
WO2020152626A1 (en) 2019-01-24 2020-07-30 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp166 (proa36), a promoter for the specific expression of genes in photoreceptors
US20220154211A1 (en) 2019-02-25 2022-05-19 Novartis Ag Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy
US20220154210A1 (en) 2019-02-25 2022-05-19 Novartis Ag Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013068413A1 (en) * 2011-11-08 2013-05-16 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Rod cell-specific promoter

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AC092498;Deschamps, S等;《GenBank》;20021115;全文 *
rAAV2/5 gene-targeting to rods: dose-dependent efficiency and complications associated with different promoters;WA Beltran等;《Gene therapy》;20101231;第1162-1174页 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3383438B1 (en) 2022-01-05
WO2017093931A1 (en) 2017-06-08
US10995344B2 (en) 2021-05-04
JP7058220B2 (ja) 2022-04-21
US11591618B2 (en) 2023-02-28
US20210230634A1 (en) 2021-07-29
EP3383438A1 (en) 2018-10-10
JP2019500865A (ja) 2019-01-17
US20180355377A1 (en) 2018-12-13
ES2909444T3 (es) 2022-05-06
CN108430519A (zh) 2018-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108472389B (zh) SynP161，用于基因在视杆光感受器中特异性表达的启动子
CN108474001B (zh) SynP160，用于基因在视杆光感受器中特异性表达的启动子
CN108430519B (zh) SynP159，用于基因在视杆光感受器中特异性表达的启动子
CN108472390B (zh) SynP162,用于基因在视杆光感受器中特异性表达的启动子
AU2017354086B2 (en) SynP198, a promoter for the specific expression of genes in direction selective retinal ganglion cells
EP3176177A1 (en) Synp157, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant