JP2020501538A - インターニューロン中の遺伝子の特異的発現のためのプロモーターsynpi - Google Patents
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Abstract
Description
である。
を有するものをさらに含み得る。
である。
本試験において使用されるプロモーターID番号1は、脂肪酸結合タンパク質7(Fabp7)をコードするマウス遺伝子の翻訳開始コドン前の1229bpからなる。ChR2−eGFPコード配列をこのプロモーターおよび最適化コザック配列(GCCACC)直後に挿入し、それにウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)およびSV40ポリアデニル化部位が続いた。それぞれ5.86E+11および4.18E+11GC/mLの力価を有するAAV血清型2/9を使用して、皮質ニューロンを標的化した。
V1へのAAV投与のため、マウスにフェンタニル−メデトミジン−ミダゾラム(フェンタニル0.05mg/kg、メデトミジン0.5mg/kg、ミダゾラム5.0mg/kg)を麻酔した。Coliquifilm(Coliquifilm、Allergan、S01XA20)を眼球に施与して脱水を防止した。30G針を使用して一次視覚野上方に両半球中でいくつかの孔を作製した。1μlのAAVを引張(pulled)ホウケイ酸ガラスピペット(1.5mmの外径、チップ直径100μm)中にロードした。ピペットをそれぞれの孔に通してガイドし、針を注射前に1mm下げた。注射後、麻酔をナロキソン1.2mg/kg、アチパメゾール2.5mg/kg、およびフルマゼニル0.5mg/kgのミックスにより拮抗させた。3週間後、単離された脳をPBS中4%PFA中で一晩固定し、次いでPBS中で4℃において洗浄ステップを行った。ビブラトームを使用して150μm厚の冠状切片を作製した。最初にスライスを30%のスクロース中で凍結保護してから3回の冷凍融解サイクルを行った。次いで、これらをPBS中10%の正常ロバ血清(NDS)、1%のBSA、0.5%のTriton X−100により室温において2時間処理した。PBS中3%のNDS、1%のBSA、0.5%のTriton X−100中のモノクローナルラット抗GFP Ab(Molecular Probes Inc.;1:500)およびポリクローナルウサギ抗RFP(Rockland、600−401−379、1:500)による処理を、室温において2〜3日間実施した。二次ロバ抗ラットAlexa Fluor−488Ab(Molecular Probes Inc.;1:200)および抗ウサギAlexa Fluor−568(Life Technologies、A10042、1:200)による処理を2時間行った。切片を洗浄し、スライドガラス上にProLong Gold褐色防止用試薬(Molecular Probes Inc.)と共に載せ、Zeiss LSM 700 Axio Imager Z2レーザー走査型共焦点顕微鏡(Carl Zeiss Inc.)を使用してイメージングした。
Claims (12)
- 配列番号1の核酸配列を含み、もしくはそれからなり、または配列番号1の前記配列と少なくとも80%の同一性を有する少なくとも1000bpの核酸配列からなる単離核酸分子であって、インターニューロン中の遺伝子の特異的発現を、前記遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合にもたらす単離核酸分子。
- 最小プロモーター、例えば、配列番号2の最小プロモーターをさらに含む、請求項1に記載の単離核酸分子。
- 請求項1または2に記載の単離核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む単離核酸分子。
- 規定の細胞中の遺伝子発現を促進するエレメントとして請求項1または2に記載の単離核酸を含む発現カセットであって、前記単離核酸が、少なくとも、桿体光受容器中で特異的に発現させるべき遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に結合している発現カセット。
- 請求項4に記載の発現カセットを含むベクター。
- ウイルスベクターである、請求項5に記載のベクター。
- インターニューロン中の遺伝子の前記発現のための、請求項1もしくは2に記載の核酸の、請求項4に記載の発現カセットの、または請求項5に記載のベクターの使用。
- 単離細胞、細胞系または細胞集団に請求項4に記載の発現カセットを形質移入するステップを含む、桿体光受容器中で遺伝子を発現させる方法であって、前記細胞がインターニューロンであり、または前記細胞がインターニューロンを含む場合、発現させるべき前記遺伝子を前記単離細胞、前記細胞系または前記細胞集団により特異的に発現させる方法。
- 請求項4に記載の発現カセットまたは請求項5に記載のベクターを含む単離細胞。
- 前記発現カセットまたはベクターが、前記細胞のゲノム中に安定的に組み込まれている、請求項9に記載の細胞。
- 前記遺伝子の産物が、光感受性分子、例えば、ハロロドプシンまたはチャネルロドプシンである、請求項1もしくは2に記載の単離核酸分子、請求項4に記載の発現カセット、請求項5に記載のベクター、請求項7に記載の使用、請求項8に記載の方法または請求項9に記載の細胞。
- 請求項1または2に記載の単離核酸分子を含む、インターニューロン中で遺伝子を発現させるためのキット。
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