JP2006519584A - Cnsにおけるcrh応答性遺伝子 - Google Patents
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Abstract
Description
De Souza EB 1995 Corticotropin−releasing factor receptors:physiology,pharmacology,biochemistry and role in central nervous system and immune disorders.Psychoneuroendocrinology 20:789−819 Holsboer F 2001 Stress,hypercortisolism and corticosteroid receptors in depression:implications for therapy.J Affect Disord 62:77−91 Holsboer,F,Gerken A,Stalla GK,Muller OA 1987 Blunted aldosterone and ACTH release after human CRH administration in depressed patients.Am J Phychiatry 144:229−231 Holsboer F,Gerken A,von Bardeleben U,Grimm W,Beyer H,Muller OA,Stalla GK 1986 Human corticotropin−releasing hormone in depression−correlation with thyrotropin secretion following thyrotropin−releasing hormone.Biol Psychiatry 21:601−611 Nemeroff CB,Owens MJ,Bissette G,Andorn AC,Stanley M 1988 Reduced corticotropin releasing factor binding sites in the frontal cortex of suicide victims.Arch Gen Psychiatry 45:577−579 Raadsheer FC,Hoogendijk WJ,Stam FC,Tilders FJ,Swaab DF 1994 Increased numbers of corticotropin−releasing hormone expressing neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus of depressed patients.Neuroendocrinology 60:436−444 Stenzel−Poore et al.,(1992)Endocrinology 130:3378−3386) Stenzel−Poore et al.,(1994)J.Neurosci.14:2579−2584
CRHシグナリングとこれまで関連付けられていなかった、従って、細胞におけるCRHシグナリング応答を調節する化合物を同定する方法においてもしくは個体におけるCRH誘発性鬱病を同定するための診断方法において有用である多数の遺伝子を提供することは本発明の目的である。
[発明の詳細な記述]
本明細書において用いる場合、「化合物」もしくは「因子」という用語は、単純なもしくは複雑な有機分子、ペプチド、タンパク質もしくはオリゴヌクレオチドのような生物学的もしくは化学的化合物を意味する。「試験化合物」は、本明細書において用いる場合、該化合物がCRHシグナリング活性を調節するかどうかを評価するために本発明の方法において使用する「化合物」もしくは「因子」をさす。
スクリーニング方法
本発明は、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)誘発性鬱病およびストレスを調節する化合物を同定するためのスクリーニング方法に関する。それは、CRH活性化CRH受容体の下流モジュレーターとしての多数の遺伝子の同定に基づく。特に、本発明は細胞におけるCRHシグナリング応答を改変することができる化合物を同定する方法を提供し、該方法は;
a)該細胞を該化合物の有無でCRHと接触させること;
b)該細胞における副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)シグナリングを調節する少なくとも1つのタンパク質の転写レベルでの変化を決定すること;および
c)該タンパク質の転写レベルを該化合物の有無で比較すること;
(ここで、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)シグナリングを調節するタンパク質は、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されている。)
を含んでなる。
a)該細胞を該化合物の有無でCRHと接触させること;ならびに
b)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38および配列番号40よりなる群から選択される核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドの発現レベルを決定すること
を含んでなる。
a)該細胞を該化合物の有無でCRHと接触させること;
b)該細胞における副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)シグナリングを調節する少なくとも1つのタンパク質の量を決定すること;および
c)該タンパク質の量を該化合物の有無で比較すること;
(ここで、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)シグナリングを調節するタンパク質は、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されている。)
を含んでなる。
a)配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのタンパク質を発現する細胞を試験化合物と接触させること;および
b)該細胞のCRH応答活性を該化合物の有無で比較すること
を含んでなる細胞におけるCRHシグナリング応答活性を改変する化合物を同定しそして得る方法を提供する。
(a)配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されるタンパク質を発現する宿主細胞を試験する化合物と接触させること;
(b)電気生理学的技術を用いて該細胞の膜電位への試験化合物の影響を測定すること;ならびに
(c)該細胞のCRH応答活性を該化合物の有無で比較すること
を含んでなる。
a)配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されるキナーゼを含んでなる混合物をホスフェート源および適当なキナーゼ基質と接触させること;
b)該混合物を該化合物の有無でインキュベーションすることならびに;該試験化合物のない場合の該基質のリン酸化のレベルと比較して該化合物の存在下での該基質のリン酸化のレベルを測定すること
を含んでなる。
a)配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されるキナーゼを含んでなる細胞をホスフェート源および適当なキナーゼ基質と接触させること;
b)該混合物を該化合物の有無でインキュベーションすることならびに;該細胞のCRH応答活性を該化合物の有無で比較すること
を含んでなる。
a)配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されるホスファターゼおよび適当なリン酸化基質を含んでなる混合物を接触させること;
b)該混合物を該化合物の有無でインキュベーションすることならびに;該試験化合物のない場合の該基質のリン酸化のレベルと比較して該化合物の存在下での該基質のリン酸化のレベルを測定すること
を含んでなる。
a)配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されるホスファターゼを含んでなる細胞を適当なリン酸化基質と接触させること;
b)該混合物を該化合物の有無でインキュベーションすることならびに;
c)該細胞のCRH応答活性を該化合物の有無で比較すること(ここで、該細胞のCRH応答活性は、基質のリン酸化レベルの変化により決定される。)
を含んでなる。
a)配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのタンパク質を発現する細胞を該試験化合物と接触させること;および
b)該化合物の有無で、該細胞におけるcAMP、cGMP、Ca2+もしくはIP3のような二次メッセンジャーのレベルを比較すること
を含んでなる。
CRH誘発性遺伝子発現プロファイルの同定
別の態様として、本発明は、細胞におけるCRHシグナリングのマーカーとしての、より高いレベルのCRHに長期さらされた際にアップもしくはダウンレギュレーションされることが示された単離されそして精製された核酸分子の使用に関し、ここで、該核酸分子は、RNA、DNA、cDNAもしくはゲノムDNAのいずれかである。特に、本発明には:
(a)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30および配列番号31よりなる群から選択されるポリヌクレオチドに対して、該ポリヌクレオチドの全長にわたって、少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、より好ましくは少なくとも90%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも95%の同一性、なおさらに好ましくは少なくとも97〜99%の同一性を有するヌクレオチド配列;
b)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30および配列番号31よりなる群から選択されるポリヌクレオチドに対して、該ポリヌクレオチドの全コーディング領域にわたって、少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、より好ましくは少なくとも90%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも95%の同一性、なおさらに好ましくは少なくとも97〜99%の同一性を有するヌクレオチド配列;
c)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30および配列番号31よりなる群から選択されるポリヌクレオチドヌクレオチド配列
よりなる群から選択されるメンバーを含んでなる単離されそして精製された核酸分子が包含される。
ポリペプチド
さらなる態様として、本発明は、CRHシグナリングを調節する実質的に純粋な形態のポリペプチドに関し、ここで、該ポリペプチドは、本発明の単離されそして精製された核酸分子によりコードされる。好ましい態様として、ポリペプチドは、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41ならびにその機能的アナログよりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
CRH活性を調節するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの組み換え発現
別の態様として、本発明のポリヌクレオチドは、適当なプロモーターおよび他の適切な転写調節要素を含有する発現ベクターへの分子クローニングにより組み換え的に発現し、そしてCRHシグナリングを調節するタンパク質を製造するために原核もしくは真核宿主細胞に導入することができる。そのような操作の技術は、Maniatis,T.et al.,上記に十分に記述されており、そして当該技術分野において周知である。
トランスジェニック非ヒト動物
本発明はまた、生殖細胞、胚細胞、幹細胞もしくは卵またはそれら由来の細胞への本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターの導入を含んでなる、トランスジェニック非ヒト動物、好ましくはトランスジェニックマウスの製造の方法にも関する。非ヒト動物は、本明細書に記述する本発明のスクリーニング方法に従って用いることができ、そして非トランスジェニックの健康な動物であることができ、またはリン酸摂取もしくは再吸収障害、好ましくはCRHシグナリングを調節するタンパク質における少なくとも1つの突然変異に起因する障害を有することができる。そのようなトランスジェニック動物は、例えば、上記のポリペプチドの突然変異体型と関連して薬剤の薬理学的研究によく適している。トランスジェニック胚の製造およびそれらのスクリーニングは、例えば、A.L.Joyner Ed.,Gene Targeting,A Practical Approach(1993),Oxford University Pressにより記述されているように行うことができる。胚の胚膜のDNAは、例えば、適切なプローブでのサザンブロットを用いて分析することができる;上記参照。
(a)CRHシグナリングを調節することができるタンパク質をコードする内在性遺伝子(1つもしくは複数)の破壊;
(b)本発明のポリヌクレオチドを含んでなる転写産物に対する少なくとも(1つの)アンチセンスRNAおよび/もしくはリボザイムの発現;
(c)本発明のポリヌクレオチドのセンスおよび/もしくは非翻訳mRNAの発現;
(d)本発明の抗体の発現;
(e)本発明の調節配列の機能性もしくは非機能性コピーの導入;または
(f)本発明の組み換えDNA分子もしくはベクターの導入
の少なくとも1つをもたらす外来DNAの安定なもしくは一時的な存在のために野生型動物と比較してCRH代謝の欠損を示すことができる。
診断アッセイ
本発明はさらに、診断試薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。機能障害と関連する配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38および配列番号40のポリヌクレオチドを特徴とする遺伝子の突然変異型の検出は、該遺伝子の不十分な発現、過剰発現または改変された空間的もしくは時間的発現に起因する疾患もしくは疾患へのかかりやすさの診断を加えるかもしくは特定することができる診断手段を提供する。該遺伝子に突然変異を保有する個体は、様々な技術によりDNAレベルで検出することができる。
(a)本発明のポリヌクレオチドにおける突然変異の有無を決定すること;および
(b)該突然変異の有無に基づいて病的症状もしくは病的症状へのかかりやすさを診断すること
を含んでなるCRH活性の障害に関連する被験体における病的症状もしくは病的症状へのかかりやすさを診断する方法を提供することが理解される。診断のための核酸は、血液、尿、唾液、組織生検もしくは検視解剖材料のような、被験体の細胞から得ることができる。ゲノムDNAを検出に直接用いることができ、または分析の前にPCRもしくは他の増幅技術を用いることにより酵素的に増幅することができる。RNAもしくはcDNAもまた、同様に用いることができる。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較した増幅産物のサイズの変化により検出することができる。点突然変異は、本発明の標識したヌクレオチド配列に増幅DNAをハイブリダイズすることにより同定することができる。好ましくは、マッチする配列をミスマッチ二本鎖からRNアーゼ消化によりもしくは融点の違いにより区別することができる。DNA配列の違いはまた、変性剤の有無で、キャピラリー電気泳動カラムもしくはゲルにおけるDNAフラグメントの電気泳動移動度の改変により、またはダイレクトDNAシーケンスにより検出することもできる(例えば、Myers et al.,Science(1985)230:1242)。特定の位置での配列変化はまた、特定の制限エンドヌクレアーゼ、RNアーゼおよびS1保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイもしくは化学切断方法により示すこともできる(Cotton et al.,Proc Natl Acad Sci USA(1985)85:4397−4401を参照)。別の態様として、例えば遺伝子突然変異の効率のよいスクリーニングを行うためにCRH活性を調節することができるタンパク質をコードするヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントを含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。アレイ技術方法は周知であり、一般的適用性を有し、そして遺伝子発現、遺伝子連鎖および遺伝子変異性を包含する分子遺伝学における様々な問題に取り組むために用いることができる(例えば:M.Chee et al.,Science,Vol 274,pp610−613(1996))を参照)。
(a)生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドもしくはその誘導体の存在もしくはその発現の量を決定すること;および
(b)ポリペプチドもしくはその誘導体の存在もしくはその発現の量に基づいて病的症状もしくは病的症状へのかかりやすさを診断すること
を含んでなる長期CRH暴露の障害に関連する被験体における病的症状もしくは病的症状へのかかりやすさを診断する方法を提供する。
a)該個体の生物学的サンプルを得ること;および
b)該生物学的サンプルにおける副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)シグナリングを調節する少なくとも1つのタンパク質の量を決定すること;
(ここで、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)シグナリングを調節するタンパク質は、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されている。)
を含んでなる。代わりの態様として、CRH誘発性発現プロファイルを診断する方法は、本発明の少なくとも1つのタンパク質に限定されないが、CRHシグナリングに関与していると同定されるタンパク質、すなわち、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41のアミノ酸配列を有するタンパク質の群の発現レベルの同時評価を必要とする。
(a)本発明のポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38および配列番号40のヌクレオチド配列もしくはそのフラグメント;
(b)(a)のものに相補的なヌクレオチド配列;
(c)本発明のポリペプチド、好ましくは、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41のポリペプチドもしくはそのフラグメント;または
(d)本発明のポリペプチドに対する、好ましくは、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41のポリペプチドに対する抗体ならびに場合により検出のための適当な手段
を含んでなる診断キットに関する。
治療有用性
本発明のさらなる態様は、哺乳類ホストに導入した場合に、本発明のポリペプチドに対して該哺乳類において免疫学的応答を誘導する免疫学的/ワクチン製剤(組成物)に関し、ここで、該組成物は本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを含んでなる。ワクチン製剤はさらに、適当な担体を含んでなることができる。ポリペプチドは胃において分解され得るので、それは好ましくは非経口的に投与される(例えば、皮下、筋肉内、静脈内もしくは皮内注射)。非経口投与に適当な製剤には、酸化防止剤、バッファー、静菌剤および製剤をレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる水性もしくは非水性の滅菌した注射溶液;ならびに沈殿防止剤もしくは増粘剤を含むことができる水性および非水性の滅菌した懸濁剤が包含される。製剤は、単位用量もしくは複数用量容器、例えば、密閉アンプルおよびバイアルにおいて与えることができ、そして使用直前に滅菌した液状担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。ワクチン製剤はまた、水中油滴系および当該技術分野において既知である他の系のような、製剤の免疫原性を高めるためのアジュバント系を含むこともできる。投与量はワクチンの比活性により決まり、そして日常的な実験により容易に決定することができる。
実験方法
動物飼育および処理−オスのトランスジェニックCRF過剰発現C57BL/6Jマウス(CRF−OEもしくはTG)およびそれらの野生型同腹子(WT)は、動物ケアのための全ての国および欧州の必要条件を満たす特別な無菌設備において維持した。マウスは、餌および水を自由に入手できる12時間の明暗サイクル(7:00 ESTに点灯する)を有する温度と湿度が調節された動物コロニーに実験の開始4週前に個々に収容した。処理の前に3ヶ月齢のマウスを各々4匹の野生型および4匹のトランスジェニック動物を含んでなる3群にわたって無作為に選んだ。1つの群には処理を与えず、第二の群には賦形剤注射を5日、1日に2回(10%シクロデキストラン(CD)、pH4)与え、そして第三の群には同じ処方計画に従って10%のCD中10mg/kgのCRH−R1特異的アンタゴニストR121919を与えた。最後の処理の16時間後に動物を脳領域の切除およびその後のRNAの単離のために殺した。
サンプル調製−トランスジェニックおよび野生型動物から肉眼的に以下の脳領域を切除した:下垂体、小脳、側頭領域、海馬、前頭皮質および側座核。脳組織は、Ultra−turrax T25グラインダー(IKA−labortechnik)を用いてトリゾール(Trizol)(Invitrogen Life Technologies)において均質化した。全RNAを製造業者の説明書に従ってトリゾールを用いて抽出した。全RNAをカラム上でDNアーゼI処理とともにRneasyキット(Qiagen)を用いてさらに精製した。
マイクロアレイハイブリダイゼーション−cRNAを下記のように調製した。逆転写は、T7−オリゴ(dT)24プライマーおよびSuperscriptII RT(Invitrogen Life Technologies)を用いて10μgの全RNAで42℃で1時間行った。第二鎖cDNA合成は、エシェリキア・コリDNAポリメラーゼI、DNAリガーゼおよびRNアーゼH(Invitrogen Life Technologies)を用いて16℃で2時間行った。フェーズロックゲル(Eppendorf)を用いたフェノール−クロロホルム抽出の後に、インビトロ転写をビオチン標識リボヌクレオチドでのBioarray高収量RNA転写産物ラベリングキット(Enzo Diagnostics)を用いて37℃で6時間行った。cRNAサンプルをQiagen Rneasyカラム上で精製し、続いて95℃で35分間断片化した。cRNA収量は、50〜100μgの間であった。サンプルをGeneChips(Affymetrix,Santa Clara,CA)上で処理した。各サンプルの品質を調べるために、5μgの標識cRNAをTest2アレイ上で行った。実際の実験は、UniGeneデータベース(Build 74)からの約12,000個の全長マウス遺伝子およびESTクラスターを調べるプローブ組を含有するマウスゲノムU74Av2アレイ上で行った。ハイブリダイゼーションは、15μgのcRNAを用いて連続回転下で45℃で16時間行った。アレイは、アフィメトリックスフルイディクスステーションにおいてストレプトアビジン/フィコエリトリン(SAPE)を用いて染色し、続いて抗ストレプトアビジン抗体および二次SAPE染色で染色した。次に、アレイをHP−レーザースキャナーで走査し、そしてデータをMicroarray Suiteソフトウェア(Affymetrix)で解析した。この段階でスケーリングもしくは正規化を行わなかった。実験の質は、提示コール(present call)率に基づいて評価した(表を参照)。
各アレイ上の生強度は、以下のアルゴリズムを用いて正規化した:
定量的RT−PCR−マイクロアレイデータを、リアルタイムPCR解析を用いて確かめた。第一鎖cDNA合成は、ランダムヘキサマープライマーおよびSuperscriptII RT(Invitrogen Life Technologies)を用いて0.5μgの全RNAで行った。定量的PCRは、Taqman PCRキットを用いてABIPrism 7700サイクラー(Applied Biosystems)で行った。cDNAの連続希釈物を用いてβ−アクチン、CRH受容体1(Crh−R1)、CRH受容体2(Crh−R2)、ニューロテンシン受容体1(Ntsr1)、ニューロテンシン受容体2(Ntsr2)、ニューロテンシン受容体3(Ntsr3)、11β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ1(Hsd11B1)、血清/グルココルチコイド調節キナーゼ(Sgk)および興味のある遺伝子(プライマーの配列は表を参照)の濃度の対数に対する閾値サイクルの標準曲線を作製した。標準曲線から計算される線形回帰直線は、各脳領域で異なる処理群からのRNAサンプルにおける転写産物レベルの決定を可能にした。
結果および説明
中枢神経系への長期CRH投与の影響を研究するために、CRH過剰発現マウスから得られる脳領域における遺伝子発現プロファイルをそれらの野生型同腹子のものと比較した。さらに、これらの発現プロファイルへのCRH−R1アンタゴニスト投与の影響を研究した。本研究において調べる脳領域には、下垂体、側座核、前頭皮質、側頭領域、海馬および小脳が包含される。CRH受容体1(CRH−R1)および2(CRH−R2)の発現を定量的リアルタイムRT−PCR(RTq)を用いて脳領域において測定した。CRH−R1は容易に検出可能であったが、これらの脳領域においてCRH−R2に対して信頼できる測定を得ることができなかった。これらの脳領域におけるCRH受容体の認められた発現レベルは、小脳および前頭皮質における高レベルのCRH−R1ならびに主に末梢受容体であるCRH−R2のより低い発現レベルの以前の報告と一致する(図1を参照)(9)。
Claims (31)
- a)個体の生物学的サンプルを得ること;ならびに
b)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38および配列番号40よりなる群から選択される核酸配列を含んでなる遺伝子の遺伝子転写のレベルを決定すること
を含んでなる個体におけるCRH誘発性遺伝子発現プロファイルを診断する方法。 - 生物学的サンプルが体液もしくは組織サンプルである請求項1に記載の方法。
- 遺伝子転写のレベルが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38および配列番号40からなる核酸配列を有する遺伝子に関して決定される請求項1もしくは2に記載の方法。
- 遺伝子転写のレベルが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38および配列番号40よりなる群から選択される核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドに結合するプローブを用いて評価されている請求項1もしくは2に記載の方法。
- 遺伝子発現のレベルがマイクロアレイ技術を用いて決定される請求項1〜4のいずれか1つに記載の方法。
- a)個体の生物学的サンプルを得ること;および
b)該生物学的サンプルにおける副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)シグナリングを調節する少なくとも1つのタンパク質の量を決定すること;
を含んでなり、
ここで、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)シグナリングを調節するタンパク質は、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択される、
個体におけるCRH誘発性遺伝子発現プロファイルを診断する方法。 - 生物学的サンプルが体液もしくは組織サンプルである請求項6に記載の方法。
- CRHシグナリングを調節するタンパク質の量が、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに結合する抗体を用いて決定されている請求項6もしくは7に記載の方法。
- CRHシグナリングを調節するタンパク質の量が、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする遺伝子の遺伝子転写のレベルを評価することにより決定されている請求項6もしくは7に記載の方法。
- 遺伝子転写のレベルが、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに結合するプローブを用いて評価されている請求項9に記載の方法。
- 遺伝子発現のレベルがマイクロアレイ技術を用いて決定される請求項10に記載の方法。
- 遺伝子転写のレベルが、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41のアミノ酸配列を有するポリペプチドの群をコードするポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて分析される請求項11に記載の方法。
- 遺伝子転写のレベルが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38および配列番号40の核酸配列を有するポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて分析される請求項11に記載の方法。
- a)細胞を化合物の有無でCRHと接触させること;
b)該細胞における副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)シグナリングを調節する少なくとも1つのタンパク質の量を決定すること;および
c)該タンパク質の量を該化合物の有無で比較すること;
(ここで、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)シグナリングを調節するタンパク質は、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されている。)
を含んでなる細胞におけるCRHシグナリング応答を改変することができる化合物を同定する方法。 - 細胞がマウス下垂体コルチコトロフ由来腺腫細胞系AtT−20のような真核細胞である請求項13に記載の方法。
- CRHシグナリングを調節するタンパク質の量が、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに結合する抗体を用いて決定されている請求項13もしくは14に記載の方法。
- CRHシグナリングを調節するタンパク質の量が、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする遺伝子の遺伝子転写のレベルを評価することにより決定されている請求項13もしくは14に記載の方法。
- 遺伝子転写のレベルが、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに結合するプローブを用いて評価されている請求項16に記載の方法。
- 遺伝子発現のレベルがマイクロアレイ技術を用いて分析される請求項16もしくは17に記載の方法。
- 遺伝子転写のレベルが、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41のアミノ酸配列を有するポリペプチドの群をコードするポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて分析される請求項18に記載の方法。
- 遺伝子転写のレベルが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38および配列番号40の核酸配列を有するポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて分析される請求項18に記載の方法。
- a)配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのタンパク質を発現する細胞を試験化合物と接触させること;ならびに
b)該細胞のCRH応答活性を該化合物の有無で比較すること
を含んでなる細胞におけるCRHシグナリング応答活性を改変することができる化合物を同定する方法。 - 細胞が、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのタンパク質を発現することができる宿主細胞である請求項21に記載の方法。
- 宿主細胞が、調節配列を含んでなる少なくとも1つのベクターでトランスフェクションされる請求項22に記載の方法。
- 宿主細胞が、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39および配列番号41よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる少なくとも1つのベクターでトランスフェクションされる請求項22に記載の方法。
- 細胞におけるCRHシグナリングのマーカーとして使用する、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30および配列番号31よりなる群から選択される核酸配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
- 該ポリヌクレオチドがmRNA、DNAもしくはcDNAである請求項21に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 細胞におけるCRHシグナリングのマーカーとして使用する、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30および配列番号31よりなる群から選択される核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項25〜27のいずれか1つに記載の単離されたポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
- ポリヌクレオチドが発現制御配列に操作可能に連結されている請求項28に記載のベクター。
- 請求項28もしくは29に記載のベクターでトランスフェクションした宿主細胞。
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