JP2020501538A5

JP2020501538A5 -

Info

Publication number: JP2020501538A5
Application number: JP2019529228A
Authority: JP
Filing date: 2017-11-29
Publication date: 2021-01-14

Description

ウイルス形質移入および組織調製
Ｖ１へのＡＡＶ投与のため、マウスにフェンタニル−メデトミジン−ミダゾラム（フェンタニル０．０５ｍｇ／ｋｇ、メデトミジン０．５ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム５．０ｍｇ／ｋｇ）を麻酔した。Ｃｏｌｉｑｕｉｆｉｌｍ（Ｃｏｌｉｑｕｉｆｉｌｍ、Ａｌｌｅｒｇａｎ、Ｓ０１ＸＡ２０）を眼球に施与して脱水を防止した。３０Ｇ針を使用して一次視覚野上方に両半球中でいくつかの孔を作製した。１μｌのＡＡＶを引張（ｐｕｌｌｅｄ）ホウケイ酸ガラスピペット（１．５ｍｍの外径、チップ直径１００μｍ）中にロードした。ピペットをそれぞれの孔に通してガイドし、針を注射前に１ｍｍ下げた。注射後、麻酔をナロキソン１．２ｍｇ／ｋｇ、アチパメゾール２．５ｍｇ／ｋｇ、およびフルマゼニル０．５ｍｇ／ｋｇのミックスにより拮抗させた。３週間後、単離された脳をＰＢＳ中４％ＰＦＡ中で一晩固定し、次いでＰＢＳ中で４℃において洗浄ステップを行った。ビブラトームを使用して１５０μｍ厚の冠状切片を作製した。最初にスライスを３０％のスクロース中で凍結保護してから３回の冷凍融解サイクルを行った。次いで、これらをＰＢＳ中１０％の正常ロバ血清（ＮＤＳ）、１％のＢＳＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００により室温において２時間処理した。ＰＢＳ中３％のＮＤＳ、１％のＢＳＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００中のモノクローナルラット抗ＧＦＰＡｂ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＩｎｃ．；１：５００）およびポリクローナルウサギ抗ＲＦＰ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、６００−４０１−３７９、１：５００）による処理を、室温において２〜３日間実施した。二次ロバ抗ラットＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８Ａｂ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＩｎｃ．；１：２００）および抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５６８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１００４２、１：２００）による処理を２時間行った。切片を洗浄し、スライドガラス上にＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄ褐色防止用試薬（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＩｎｃ．）と共に載せ、ＺｅｉｓｓＬＳＭ７００ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒＺ２レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓＩｎｃ．）を使用してイメージングした。

以下の態様を包含し得る。
［１］配列番号１の核酸配列を含み、もしくはそれからなり、または配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１０００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子であって、インターニューロン中の遺伝子の特異的発現を、前記遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合にもたらす単離核酸分子。
［２］最小プロモーター、例えば、配列番号２の最小プロモーターをさらに含む、上記［１］に記載の単離核酸分子。
［３］上記［１］または［２］に記載の単離核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む単離核酸分子。
［４］規定の細胞中の遺伝子発現を促進するエレメントとして上記［１］または［２］に記載の単離核酸を含む発現カセットであって、前記単離核酸が、少なくとも、桿体光受容器中で特異的に発現させるべき遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に結合している発現カセット。
［５］上記［４］に記載の発現カセットを含むベクター。
［６］ウイルスベクターである、上記［５］に記載のベクター。
［７］インターニューロン中の遺伝子の前記発現のための、上記［１］もしくは［２］に記載の核酸の、上記［４］に記載の発現カセットの、または上記［５］に記載のベクターの使用。
［８］単離細胞、細胞系または細胞集団に上記［４］に記載の発現カセットを形質移入するステップを含む、桿体光受容器中で遺伝子を発現させる方法であって、前記細胞がインターニューロンであり、または前記細胞がインターニューロンを含む場合、発現させるべき前記遺伝子を前記単離細胞、前記細胞系または前記細胞集団により特異的に発現させる方法。
［９］上記［４］に記載の発現カセットまたは上記［５］に記載のベクターを含む単離細胞。
［１０］前記発現カセットまたはベクターが、前記細胞のゲノム中に安定的に組み込まれている、上記［９］に記載の細胞。
［１１］前記遺伝子の産物が、光感受性分子、例えば、ハロロドプシンまたはチャネルロドプシンである、上記［１］もしくは［２］に記載の単離核酸分子、上記［４］に記載の発現カセット、上記［５］に記載のベクター、上記［７］に記載の使用、上記［８］に記載の方法または上記［９］に記載の細胞。
［１２］上記［１］または［２］に記載の単離核酸分子を含む、インターニューロン中で遺伝子を発現させるためのキット。

Claims

発現カセットであって、
配列番号１の核酸配列を含み、もしくはそれからなり、または配列番号１の前記配列と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１０００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子を含み、
前記単離核酸が、少なくとも、遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に結合している発現カセット。
前記単離核酸分子が配列番号１の核酸配列を含む、請求項１に記載の発現カセット。
最小プロモーターをさらに含む、請求項１または２に記載の発現カセット。
前記最小プロモーターが配列番号２の核酸配列を含む、請求項３に記載の発現カセット。
遺伝子をコードする前記核酸配列がハロロドプシンまたはチャネルロドプシンをコードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の発現カセット。
請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現カセットを含むベクター。
ウイルスベクターである、請求項６に記載のベクター。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項７に記載のベクター。
インターニューロン中の遺伝子の発現のための、単離核酸分子の使用であって、
前記単離核酸分子が、配列番号１の核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１０００ｂｐの核酸配列を含む、使用。
前記単離核酸分子が配列番号１の核酸配列を含む、請求項９に記載の使用。
前記単離核酸分子が最小プロモーターをさらに含む、請求項９または１０に記載の使用。
最小プロモーターが配列番号２の核酸配列を含む、請求項１１に記載の使用。
インターニューロン中で遺伝子を発現させる方法であって、
前記方法が、単離細胞、細胞系または細胞集団に請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現カセットを形質移入することを含み、
前記単離細胞、前記細胞系、または前記細胞集団がインターニューロンを含む場合、前記遺伝子を前記単離細胞、前記細胞系または前記細胞集団により発現させる方法。
請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現カセットまたは請求項６〜８のいずれか１項に記載のベクターを含む単離細胞。
前記発現カセットまたは前記ベクターが、前記細胞のゲノム中に安定的に組み込まれている、請求項１４に記載の細胞。
前記遺伝子の産物が、光感受性分子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項６〜８のいずれか１項に記載のベクター、請求項１３に記載の方法または請求項１４もしくは１５に記載の細胞。
前記光感受性分子が、ハロロドプシンまたはチャネルロドプシンである、請求項１６に記載の発現カセット、ベクター、方法または細胞。