KR102274999B1 - 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 12종류의 세포 투과성 펩타이드는 in vitro 및 in vivo에서 우수한 세포 투과능 및 물질 전달 효과가 있음이 확인되었는바, 상기 세포 투과성 펩타이드는 생물학적 활성을 갖는 물질을 세포, 조직 등 생체 내로 효과적으로 전달할 수 있어 연구 분야, 다양한 질병의 진단 또는 치료 분야 등에서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도{Novel cell penetrating peptides and use thereof}
본 발명은 생물학적 활성 물질을 세포 내로 전달하기 위한 세포 내 전달 기술에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 세포 투과능이 우수한 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
현재까지 다양한 저분자 화합물, 단백질, 펩타이드, RNA, DNA 등 고분자 물질의 세포 내 전달 및 이의 응용을 위한 연구들이 진행되어 왔으며, 특히 SOD, Catalase, SOCS와 같은 효소(enzyme), dnPI3K, ZAP70 돌연변이와 같은 세포 내 신호전달 단백질의 저해 형태의 단백질, Foxp3, RORgt와 같은 전사인자 단백질 혹은 전사인자의 DNA binding domain 부분과 같이 다양한 단백질 전달을 통해 세포 내 기능을 조절하고자 하는 시도가 되어져 왔다. 또한 사이클로스포린A(cyclosporinA) 와 같은 저분자 화합물 약물을 세포 내 및 조직 내로 전달하여 장기 및 세포 이식 시 발생하는 거부반응을 조절하고자 하는 시도, 건선과 같은 자가면역을 조절하고자 하는 시도가 진행되어 왔다.
그러나 일반적으로 친수성이거나 분자량이 크고 거대한 물질들은 세포막이라는 장벽에 의해 세포 안으로 들어갈 수 없다. 세포막은 펩타이드나 단백질, 핵산과 같은 거대 분자가 세포 내로 들어오지 못하게 막고, 세포막 수용체에 의한 엔도사이토시스(endocytosis)라는 생리적 기작을 통해 세포 내로 들어오더라도 세포의 용해소체 분획(lysosomal compartment)과 융합되어 결국 분해되므로, 상기 거대 분자들을 이용한 질병의 치료 및 예방에 있어서 많은 제약이 따른다. 또한, 항암제의 경우 세포 내로 약물을 전달하기 위해서는 다약제 저항성(multidrug resistance)과 같은 장애물을 극복해야만 한다. 이에 약물 분해를 막기 위해 다양한 거대 분자 및 약물이 함유된 전달체를 엔도사이토시스 과정을 통하지 않고, 직접 세포 내로 전달하는 많은 방법이 제시되었다. 이러한 방법들에는 마이크로 주입(microinjection), 전기천공법(electroporation) 등이 있는데, 이는 세포막에 손상을 줄 가능성이 있다. 또 다른 방법들로 세포투과성 물질을 이용하는 방법 등이 있다. 하지만 이러한 방법을 통하여 세포 내로 약물들을 전달하였다 하더라도 약효를 발휘하기 위해서는 특정한 기관으로 이동되어야 하는 문제가 있다.
따라서 상기와 같은 한계점들을 극복하고 안정성 및 물질 전달 효율을 높일 수 있는 다양한 약물전달체들이 많이 연구 개발되어 왔으며, 대표적으로 리포좀(liposome)과 마이셀(micelle)이 있다. 리포좀은 인공적으로 만든 인지질 전달체로 친유성 및 친수성 약물을 모두 봉입할 수 있으며, 생체적합성 물질이므로 독성이 없고 약물을 외부환경으로부터 보호한다. 하지만 흡수가 지연되고 분포의 제한을 받으며 대사율이 낮아지며, 간이나 비장의 세포에 포획되어 혈액으로부터 신속하게 제거되는 단점이 있다. 마이셀은 약물의 용해도 및 생체이용률을 높여줄 수 있는 특징이 있으나, 물질의 세포 내로의 이동에 관한 효과와 기초 의학적 및 임상적 적용가능성에 대해서는 아직도 많은 연구가 필요하다. 이러한 한계점 때문에, 생체물질을 생체 내로 효과적으로 전달할 수 있고 세포독성이 없으며, 특히 엔도사이토시스를 통하여 들어가지 않는 새로운 제제들이 필요하다.
이러한 측면에서, 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide)가 새로운 대안으로써 주목받아왔다. 세포 투과성 펩타이드는 일종의 신호 펩타이드(Signal Peptide)로서 단백질, DNA, RNA 등과 같은 고분자 물질을 세포 내로 전달하고자 하는 목적으로 사용되는 일종의 특정 아미노산 서열의 조합인 펩타이드이다. 예컨대, HIV 바이러스에서 유래된 TAT 단백질에 존재하는 11개 아미노산 서열이 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)(120 kDa) 단백질의 세포 내 및 조직 내 전달이 가능하다는 것을 보여준 1990년대 이후부터 본격적으로 관련 연구가 진행되었다. 초파리의 단백질에서 유래한 안테나페디아(Antennapedia(Penetratin)), HSV-1 바이러스로부터 유래된 VP22(Elliott, G. et al., Cell, 88:223, 1997), 시미안 바이러스 40 거대 항원 T(Simian Virus 40 large antigen T)로부터 유래한 Pep-1이 대표적인 1세대 세포투과성 펩타이드로 여겨지며 TAT과 함께 많이 사용되어져왔다. 또한, 폴리 아르기닌(poly Arginine), 폴리 라이신(poly Lysine)과 같이 단순히 아르기닌 및 라이신과 같은 양이온성 아미노산이 반복적으로 여러 개 연결된 펩타이드도 세포 투과능이 뛰어난 것으로 보고되었으며, 다양한 물질 전달에 응용되고 있다. 그러나 대부분 이러한 세포투과성 펩타이드는 면역원성, 독성의 가능성을 내포하고 있고, 인간세포에 전달되는 효능이 떨어지는 것으로 여겨진다. 따라서 독성이 유발하지 않고 생체 내에서의 안전성을 가지며 효과적으로 물질을 전달할 수 있는 세포 투과성 펩타이드의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 상기와 같은 한계점을 극복할 수 있는 새로운 세포 투과성 펩타이드를 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 종래의 세포 투과성 펩타이드 보다 투과성이 우수한 신규 펩타이드를 설계 및 합성하고, 상기 펩타이드에서 2번째 및 6번째 위치의 아미노산이 세포 투과성을 결정하는 중요한 아미노산임을 in vitro 및 in vivo에서 실험적으로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 신규의 세포 투과성 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 세포 투과성 펩타이드 및 생물학적 활성 물질을 포함하는, 복합체 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 복합체를 포함하는, 물질 전달용 조성물 및 상기 조성물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 물질 전달방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 [일반식 I]로 표시되는 아미노산으로 이루어진, 세포 투과성 펩타이드를 제공한다.
[일반식 I]
X1-X2-...Xn-1-Xn
상기 일반식 I에서,
n ≥16이고,
X2는 His(H) 및 X6는 Leu(L)이고,
상기 X2 및 X6를 제외한 아미노산은 Gly(G), His(H), Glu(E), Arg(R), Lys(K), Ser(S), Asp(D), Trp(W), Val(V), Thr(T), Ala(A), Asn(N) 및 Tyr(Y)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.
본 발명의 일구현예로, 상기 일반식 I에서 n은 16일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포는 뇌혈관장벽 내피세포(brain endothelial cell), 암세포, 혈액세포(blood cell), 림프구(lymphocyte), 면역세포, 줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 신경줄기세포(neural stem cell; NSC), T 세포, B 세포, 자연살해세포(natural Killer cell; NK cell), 대식세포(macrophage), 미세아교세포(microglia), 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte) 및 근육세포(muscle cell)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포 투과성 펩타이드 및 생물학적 활성 물질을 포함하는, 복합체를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 생물학적 활성 물질은 화합물(chemical compound), 단백질, 당단백질, 펩타이드, 항체(antibody), 효소(enzyme), 핵산분해효소(nuclease), 호르몬, 사이토카인(cytokine), 전사인자(transcription factor), 독소, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 천연물(natural product), 반합성 물질(semi-synthetic drug), 약물(drug), 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 바이러스, 양자점(quantum dots) 및 형광색소(fluorochrome)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 핵산분해효소는 CAS9(CRISPR associated protein 9), CAS12, CAS13, CAS14, CAS variants, Cfp1(CxxC-finger protein-1), ZEN(Zinc-finger nucleases) 및 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 핵산은 DNA, RNA, ASO(Antisense oligonucleotide), 마이크로RNA(microRNA; miRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid) 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 복합체를 포함하는, 물질 전달용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 물질 전달방법을 제공한다.
본 발명에서는 신규한 세포 투과성 펩타이드를 합성하였고, in vitro 및 in vivo에서 이의 우수한 세포 투과능 및 물질 전달 효과를 실험적으로 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 생물학적 활성을 갖는 물질을 세포, 조직 등 생체 내로 효과적으로 전달할 수 있어 연구 분야, 다양한 질병의 진단 또는 치료 분야 등에서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 합성된 12개 펩타이드에 FITC가 연결된 물질을 4uM 농도로 세포에 처리하고 in vitro에서 세포 투과성 여부를 검증한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드에서 2번째 및 6번째 아미노산이 세포 투과성에 미치는 영향을 분석한 결과로서, 도 2a는 표 2와 같이 상기 두 위치의 아미노산에 단일 돌연변이를 유발한 변이체 펩타이드를 이용해 in vitro 세포 투과성 분석을 실시한 결과이고, 도 2b는 표 3과 같이 상기 두 위치의 아미노산을 포함하여 이중 돌연변이를 유발한 변이체 펩타이드를 이용해 in vitro 세포 투과성 분석을 실시한 결과이다.
도 3은 본 발명의 세포 투과성 펩타이드 중에서 대표적으로 서열번호 1 펩타이드에 GFP 단백질을 결합시켜 펩타이드 융합체를 제조한 후 마우스의 대뇌피질 및 해마 조직으로의 투과능 및 물질 전달 효과를 분석한 in vivo 결과로서, 도 3a 및 도 3b는 각각 형광 이미지 및 이의 정량 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 transpep-1-FITC 및 angiopep-2-FITC를 이용한 유세포분석법을 통해 해당 기술분야에 공지된 세포 투과성 펩타이드인 angiopep-2와 본 발명에 따른 transpap-1의 세포 투과성을 비교분석한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 transpap-1와 angiopep-2의 BBB 투과도를 비교분석하기 위해 transpep-1-FITC 및 angiopep-2-FITC를 이용하여 이광자 현미경을 통해 in vivo BBB 투과도를 분석한 결과로, 도 5a 내지 도 5e는 각각 마우스에 각 펩타이드를 정맥투여한 후 5분, 10분, 30분, 60분 및 90분째의 3D 실시간 이미징 결과이며, 도 5f는 상기 이미징 결과를 정량화하여 나타낸 것이다.
본 발명은 연구 분야, 다양한 질병의 진단 또는 치료 분야 등에서 유용하게 활용될 수 있는 세포 투과성 펩타이드에 관한 것으로서, 한정되지 않은 수의 디자인으로 확장 가능한 기본 플랫폼 펩타이드 구조에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기와 같은 [일반식 I]로 나타내어지는 아미노산으로 이루어진 세포 투과성 펩타이드를 제공한다.
[일반식 I]
X1-X2-...Xn-1-Xn
상기 일반식 I에서,
n ≥16이고,
X2는 His(H) 및 X6는 Leu(L)이고,
상기 X2 및 X6를 제외한 아미노산은 Gly(G), His(H), Glu(E), Arg(R), Lys(K), Ser(S), Asp(D), Trp(W), Val(V), Thr(T), Ala(A), Asn(N) 및 Tyr(Y)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.
본 발명에서, “세포 투과성”이란, 펩타이드가 세포(막)를 투과하여 세포 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 의미한다.
본 발명에서, “펩타이드(peptide)”란 아미노산의 중합체로서, 보통 소수의 아미노산이 연결된 형태를 펩타이드라 하며, 많은 아미노산이 연결되면 단백질이라 부른다. 이러한 펩타이드 및 단백질 구조에서 아미노산 간의 연결은 아마이드(amide) 결합 또는 펩타이드 결합으로 이루어져 있다. 펩타이드 결합이란 카르복실기(-COOH)와 아미노기(-NH2) 사이에 물(H2O)이 빠져나가고 -CO-NH- 형태를 이루는 결합이다.
본 발명에 있어서, 상기 [일반식 I]로 나타내어지는 세포 투과성 펩타이드는 N-말단으로부터 2번째 위치의 아미노산은 His(H) 및 6번째 위치의 아미노산은 Leu(L)가 위치하면서 1 내지 16개의 연속되는 아미노산 서열을 포함하되, 그의 C-말단에는 상기 세포 투과성 펩타이드로서의 효과를 증대시킬 수 있는 다양한 아미노산을 추가로 부가할 수도 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는, 이로 제한되는 것은 아니나, 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 이때, 상기 세포 투과성 펩타이드는 상기 서열번호 1 내지 12로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드가 투과 가능한 세포의 종류로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 뇌혈관장벽 내피세포(brain endothelial cell), 암세포, 혈액세포(blood cell), 림프구(lymphocyte), 면역세포, 줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 신경줄기세포(neural stem cell; NSC), T 세포, B 세포, 자연살해세포(natural Killer cell; NK cell), 대식세포(macrophage), 미세아교세포(microglia), 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte) 및 근육세포(muscle cell)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법 혹은 제조 방법을 통하여 각 펩타이드의 순도가 90% 이상이 되도록 제작할 수 있으며, 예컨대 직접 합성하거나 펩타이드 제조회사에 제조를 의뢰한 후 구입하여 사용할 수 있다. 상기 펩타이드는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법 혹은 제조 방법을 통하여 D-form 이나 L-form, 서열 중 일부만 D-form이나 L-form으로 구성된 펩타이드, 또는 이들의 라세미체 형태로 모두 제작하여 사용될 수 있다. 또한, 펩타이드의 안정성을 높이기 위해 그 외의 당업계에 공지된 통상적인 변형이 가능하다. 본 발명에서는 바람직하게 고체상 펩타이드 합성(Solid state peptide synthesis) 방법을 이용하여 펩타이드를 합성하였으나, 전술한 바와 같이 펩타이드 합성 방법 및 조건이 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은, 종래 알려진 인공의 세포 투과성 펩타이드 또는 인체 유래 세포 투과성 도메인에 대한 서열 및 구조 분석에 대한 이전 선행 연구를 기반으로 다양한 서열 및 길이를 갖는 세포 투과성 펩타이드들을 설계 및 합성하였다. 그 결과, 우수한 세포 투과능 및 물질 전달 효과를 나타낸 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드를 발굴하였으며, 이를 “transpep-1”으로 명명하였다.
또한, 상기 transpep-1 펩타이드의 3차원 구조에 근거하여 서열번호 1의 아미노산 서열에서 2번째 및 6번째 위치의 아미노산이 세포 투과성에 중요한 영향을 미칠 것이라 예상하였다.
이러한 가설을 바탕으로, 본 발명자들은 2번째 및/또는 6번째 위치의 아미노산을 치환시키거나 나머지 위치의 아미노산을 치환시킨 다양한 펩타이드를 합성하여 세포 투과능을 비교함으로써, 상기 가설을 입증하였다.
보다 구체적으로, 본 발명에서는 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 플랫폼 펩타이드 구조에 상응하는 12개 세포 투과성 펩타이드를 합성한 후, 이의 세포 투과성을 in vitro에서 검증한 결과, 본 발명에 따른 플랫폼 펩타이드 구조를 만족하는 12개의 세포 투과성 펩타이드 모두 우수한 세포 투과성을 나타냄을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, N-말단으로부터 2번째 및/또는 6번째 위치의 아미노산을 치환시킨 단일 또는 이중 돌연변이 펩타이드를 합성한 후 in vitro 세포 투과성 분석을 실시하였다. 그 결과, 2번째 및 6번째 위치의 아미노산은 단독으로 치환되거나 모두 치환되는 경우 펩타이드의 세포 투과성을 현저히 감소시키는 것을 확인하였는바, 상기 두 위치의 아미노산이 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드의 기능에 중요함을 구체적으로 입증하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 12개 펩타이드의 세포 투과성 및 물질 전달 효과를 in vivo에서 검증하기 위하여, 대표적으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 전달 물질(cargo)로써 형광 단백질인 GFP를 결합시켜 세포 투과성 펩타이드-GFP를 제조하였다(실시예 4 참조). 나아가 마우스에 각각 음성대조군인 GFP 및 세포 투과성 펩타이드-GFP를 꼬리정맥으로 주입하고 24시간 후 상기 마우스에서 뇌를 적출하여 대뇌피질 및 해마 조직 절편을 제작하였다, 상기 절편을 이용해 IHC를 수행하여 형광 이미지 및 이의 정량 결과를 분석한 결과, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드가 in vivo에서도 우수한 세포 투과성이 있으며, 전달체로써 효과적으로 물질을 세포 내로 전달 가능함을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 해당 기술분야에서 공지된 세포 투과성 펩타이드와 본 발명에 따른 펩타이드의 세포 투과능을 비교하고자 하였다. 이를 위해, 공지된 세포 투과성 펩타이드인 angiopep-2를 이용해 angiopep-2-FITC를 제조하고, 상기에서 제조한 transpep-1-FITC를 이용해 각각 in vitro 세포 투과도 분석 및 in vivo BBB 투과도 분석실험을 실시하였다. 그 결과, angiopep-2와 비교하여 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드가 현저히 높은 세포 투과성을 가지며 우수한 생체 내 안정성 및 전달 효율을 갖는 것을 알 수 있었다(실시예 6 참조).
상기 실시예의 결과로부터, 본 발명에 따른 펩타이드는 상기 펩타이드와 결합한 임의의 물질을 세포 내로 유입시킬 수 있는 전달체로서 활용 가능함을 알 수 있다.
이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 세포 투과성 펩타이드 및 생물학적 활성 물질을 포함하는 복합체를 제공한다.
본 발명에서 상기 복합체는 펩타이드와 물질이 단순히 혼합(mixing)된 것, 펩타이드와 물질이 혼합되어 형성된 것, 또는 이들이 화학결합에 의해 연결되거나 컨쥬게이션되어 생성된 것을 모두 포함한다. 또한, 복합체는 물리적 결합, 화학적 결합, 공유 결합, 비공유 결합, 자기조립화로 연결되거나, 매개체를 이용하여 통합된 또는 융합된 형태로 연결될 수 있다.
또한, 상기 복합체는 상기 펩타이드와 생물학적 활성 물질이 서로 융합(fusion)된 상태로 발현되어 이룬 복합체가 될 수 있다. 예를 들어, 하나의 벡터 내에 상기 펩타이드와 생물학적 활성 물질을 발현하는 유전자를 삽입한 후, 상기 벡터로 생물을 형질전환시켜 벡터에 삽입된 유전자를 발현하도록 하면, 상기 펩타이드와 생물학적 활성 물질이 융합 단백질(fusion protein)로서 발현될 수 있다. 융합 단백질로 발현될 때, 상기 펩타이드와 생물학적 활성 물질 간에 임의의 링커가 포함되도록 할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 복합체에서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 생물학적 활성 물질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위해서, 단일 또는 복수개가 결합된 형태를 모두 포함할 수 있으며, 전달하고자 하는 생물학적 활성물질에 따라 세포 투과성 펩타이드의 결합 개수는 당업자에게 용이하게 선택 또는 조절될 수 있다.
본 발명에서, 세포 투과성 펩타이드에 결합되어 복합체를 형성할 수 있는 생물학적 활성 물질은 바람직하게는 ‘생물학적 또는 약제학적 활성을 갖는 물질’을 의미하며, 이는 세포 내(세포질 또는 핵 내)로 투과되어 생리활성조절에 관여하거나 약리효과를 발현할 수 있는 것 또는 운반되어 작용해야 하는 세포 내, 조직 내, 세포간질, 혈액 등 다양한 생체 내 부위에서도 생물학적 활성을 갖는 물질을 의미한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 화합물(chemical compound), 단백질, 당단백질, 펩타이드 항체(antibody), 효소(enzyme), 핵산분해효소(nuclease), 호르몬, 사이토카인(cytokine), 전사인자(transcription factor), 독소, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 천연물(natural product), 반합성 물질(semi-synthetic drug), 약물(drug), 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 바이러스, 양자점(quantum dots), 및 형광색소(fluorochrome)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 핵산분해효소는 CAS9(CRISPR associated protein 9), CAS12, CAS13, CAS14, CAS variants, Cfp1(CxxC-finger protein-1), ZEN(Zinc-finger nucleases) 및 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산은 DNA, RNA, ASO(Antisense oligonucleotide), 마이크로RNA(microRNA; miRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), (앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 추가적으로 decoy DNA, plasmid, shRNA, 안티센스 RNA, 올리고리보뉴크레오티드, 또는 전달 RNA (transfer RNA) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 약물(drug)은 화합물 약물(chemical drug), 바이오 약물(biodrug), 핵산 약물(nucleic acid drug), 펩타이드 약물(peptide drug), 단백질 약물(protein drug), 천연물 약물(natural product drug), 호르몬(hormone), 조영제(contrast agent) 및 항체(antibody)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 “바이오 약물”은 (오리지널) 생물학적 치료제(biologics) 및 바이오제네릭(biogenerics), 바이오베터(biobetters), 바이오서피어리어(biosuperiors) 등 다양한 바이오 의약품을 의미한다. 상기 바이오 약물은 생물학적 기원으로부터 제조, 분비 또는 반합성된 임의의 약물을 의미하며, 백신, 혈액 제제, 항원, 세포 제제, 유전자 치료제, 줄기세포 등을 모두 포함하며 이에 제한되지는 않는다.
상기 나노입자는 산화철, 금, 탄소나노튜브, 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 물질 전달용 조성물을 제공한다.
상기 물질 전달용 조성물은 생물학적 활성 물질을 생체 조직 또는 혈중으로 전달시키거나 세포 투과를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 조성물은 생체 조직을 구성하는 세포 또는 세포 간 연접을 통하여 전달될 수 있으나 전달 방식에는 제한이 없다.
상기 생체 조직은 하나 이상의 상피조직, 근육조직, 신경조직, 결합조직을 의미하며 각 장기는 하나 이상의 조직으로 이루어질 수 있으므로, 점막, 피부, 뇌, 폐, 간, 신장, 비장, 폐장, 심장, 위장, 대장, 소화관, 방광, 요관, 요도, 난소, 정소, 생식기, 근육, 혈액, 혈관, 림프관, 림프절, 흉선, 췌장, 부신, 갑상선, 부갑상선, 후두, 편도, 기관지, 폐포의 다양한 생체 장기가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 복합체를 특정 세포, 조직 또는 장기로 전달하고자 하는 경우, 상기 생물학적 활성을 갖는 물질은 특정 세포, 조직 또는 장기에서 특이적으로 발현하는 수용체와 선택적으로 결합할 수 있는 리간드의 세포외 부분 단백질, 또는 이들 수용체 또는 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체(mAb) 및 변형된 형태와 결합하여 복합체를 형성할 수 있다. 상기 펩타이드와 생물학적 활성을 갖는 물질의 결합은 뉴클레오티드 수준에서 발현 벡터를 이용한 클로닝 기법에 의한 간접적인 연결에 의하거나 펩타이드와 생물학적 활성을 갖는 물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합에 의한 직접적인 연결에 의할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 복합체를 포함하는 조성물이 약제학적 조성물로 이용되는 경우, 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 정맥내(intravenous), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 척수강내(intrathecal), 뇌실질내(intracerebroventricular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내 전달될 수 있다. 투여량은 대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 물질 전달용 조성물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포 내로의 물질 전달 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 물질 전달기능을 가지는 세포 투과성 펩타이드는 매우 작은 펩타이드이므로 혹시 발생할 수 있는 활성물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 세포 투과성 펩타이드 후보군의 제조
1-1. 세포 투과성 펩타이드 후보군 설계
본 발명자들은 이전 선행 연구에서 종래 여러 세포 투과성 펩타이드에 대한 분석 결과를 기반으로 다양한 서열 및 길이를 갖는 세포 투과성 펩타이드들을 설계 및 합성하고 이의 세포 투과성을 검증하였다. 그 결과 가장 높은 세포 투과성을 나타낸 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드를 발굴하였으며, 이를 transpep-1으로 명명하였다.
나아가 본 발명자들은 추가적으로 세포 투과성 펩타이드를 발굴하기 위하여 상기 transpep-1 서열에서 한 개 또는 2개 아미노산을 치환시킨 11개 펩타이드 변이체를 합성하였다. 이때, 상기 transpep-1 펩타이드의 3차원적 구조를 기반으로 2번째 및 6번째 아미노산이 세포 투과성에 영향을 미칠 것으로 예상되어 상기 두 위치의 아미노산은 변형시키지 않고 나머지 위치의 아미노산들을 변형시켜 세포 투과성 펩타이드 후보군을 합성하였다. 종합적으로, 본 발명에서 합성한 총 12개 펩타이드 및 이의 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
번호 물질명 서열 서열번호
1 transpep-1 GHHERLKSDEWSVTSG 1
2 transpep-2 GHHERLKSAEWSVTSG 2
3 transpep-3 GHHERLKSDAWSVTSG 3
4 transpep-4 GHHERLKSDEWAVTSG 4
5 transpep-5 GHHERLKSAAWSVTSG 5
6 transpep-6 GHHERLKSAEWAVTSG 6
7 transpep-7 GHHERLKSDAWAVTSG 7
8 transpep-8 GHHERLKSEEWSVTSG 8
9 transpep-9 GHHERLKSYEWSVTSG 9
10 transpep-10 GHHERLKSDDWSVTSG 10
11 transpep-11 GHHERLKSDYWSVTSG 11
12 transpep-12 GHHERLKSDEWNVTSG 12
1-2. 펩타이드 후보군의 합성 및 분리정제
본 발명자들은 상기 실시예 1-1에 기재된 각 펩타이드를 합성하기 위하여 고체상 펩타이드 합성(Solid state peptide synthesis, SPPS) 방법을 이용하였다. 상기 방법은 레진의 N-말단에 N-말단이 F-moc로 보호되어 있는 아미노산의 C-말단을 하나씩 결합하는 유기합성법이다. 모든 반응의 용매는 N,N-다이메틸포름아마이드(N,N-dimethylformamide, DMF)를 이용하였으며, 아미노산의 커플링은 2M 농도의 아미노산 용액을 0.5M의 N,N′-다이아이소프로필카보다이이미드(N,N′-Diisopropylcarbodiimide, DIC) 1ml, 1M의 에틸 시아노(하이드록시이미노)아세테이트(Ethyl cyano(hydroxyimino)acetate, Oxyma) 0.5ml와 혼합하여 마이크로웨이브 합성기(Microwave synthesizer)에서 반응시켜 진행하였다. 또한 각 아미노산 서열마다 반응시간, 온도 또는 마이크로웨이브의 전압을 달리하여 아미노산을 제조하였다. 이때, 다음 아미노산을 합성하기 위해서는 이전 아미노산의 F-moc을 제거해야 하기 때문에 이를 위해 80% DMF와 20% 피페리딘(piperidine) 용액을 사용해 F-moc 보호기를 80℃에서 2분 동안 2회 디프로텍팅(deprotecting) 시켰다. 모든 커플링 과정 및 디프로텍팅 과정 사이에는 DMF와 염화메틸렌(dichloromethane, DCM)을 이용해 교대로 3회씩 세척하는 과정을 수행하였다.
상기 방법을 통해 합성된 펩타이드에 대하여, 추후 세포 투과성 여부를 관찰하고 정량화하기 위해 펩타이드의 N-말단에 카르복실기(-COOH)를 포함하는 형광물질을 화학적 결합방법으로 연결할 수 있다. 이때 사용할 수 있는 상기 형광물질로는 FITC(Fluorescein-5-isothiocyanate), 시아닌 3 카르복시산(Cyanine 3 carboxylic acid), 시아닌 5 카르복시산(Cyanine5 carboxylic acid), 시아닌 7 카르복시산(Cyanine 7 carboxylic acid) 등이 있다. 구체적으로, 상기와 같은 형광물질 중 본 실시예에서는 FITC를 합성된 펩타이드에 연결하고자 하였다. 이를 위해, 먼저 고체상의 레진에 합성된 펩타이드의 마지막 아미노산을 합성한 뒤 FITC : DIC : Oxyma : 레진을 2 : 2.5 : 4 : 1 비율로 잘 혼합시킨 후 상기 레진에서의 반응을 상온에서 2시간 동안 진행하되, 교반기(magnetic stirrer)를 이용하였다. 다음으로, 상기 합성과정 중 레진 색이 노란색에서 진한 노랑 또는 주황빛으로 변하면 DMF와 염화메틸렌을 교대로 3회씩 세척하는 과정을 실시하였다. 이어서 고체상 레진으로부터 펩타이드/FITC를 분리하기 위해 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid; TFA) : 트리이소프로필실란(Triisopropylsilane; TIS) : 증류수가 95 : 2.5 : 2.5로 혼합된 클리비지 용액에서 합성이 완료된 레진을 교반기를 이용해 2시간 동안 반응을 진행한 후 석면필터로 레진을 걸러 내었다. 걸러진 용액에서 용액은 질소 기체 하에서 증발시키고 침전물이 생기면 차갑게 보관한 다이에틸 에테르(diethyl ether)로 침전시켰다. 침전된 펩타이드/FITC는 진공상태에서 건조시킨 후 증류수로 녹여 동결건조하였다.
동결건조된 펩타이드는 증류수나 아세토니트릴(Acetonitrile, ACN) 등으로 용해시키고 역상 고성능 액체 크로마토그래피(Reverse phase High-performance liquid chromatography)를 사용하여 분리 및 정제하였다. 이 때 상기 HPLC의 이동상 용매로는 Solvent A(증류수 99.9%, TFA 0.1%)와 Solvent B(증류수 9.9%, 아세토니트릴 90%, TFA 0.1%)를 사용하였다. HPLC 이동상은 Solvent A 90%와 Solvent B 10%로 시작하여 Solvent B를 1%/min gradient로 증가시키며 분리를 진행하였다. 이후 분리된 펩타이드 용액은 동결건조하여 용매를 제거하고 이후 원하는 용매에 녹여 실험을 진행하였다.
실시예 2. in vitro 세포 투과성 분석
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 합성한 총 12개 펩타이드 후보군에 대하여 in vitro에서 세포 투과성 분석을 실시하였다. 구체적으로, 인간 뇌혈관장벽세포인 hCMEC/D3 세포를 96웰 플레이트에 18,000 cells/well로 분주하고, 세포가 플레이트 면적의 80~90%에 도달할 때까지 상피세포 성장 배지인 EGM(endothelial cell growth medium)에서 37℃, CO2 조건으로 밤새 배양하였다. 이어서 상기 실시예 1-2에서 제조한 FITC가 연결된 12개 후보군 펩타이드와 음성대조군인 FITC 단독을 4uM로 상기 배지에 희석하여 각 웰당 100㎕씩 처리할 양을 제조하였다. 이어서 세포를 배양한 플레이트에서 배양액을 흡입(suction)하여 제거하고, 상기 펩타이드를 희석하여 미리 제조한 용액을 처리한 후 2시간 동안 37℃, CO2 조건으로 배양하였다. 다음으로, 각 웰에서 펩타이드를 처리한 용액을 모두 soaking하여 제거하고, EGM 100㎕를 첨가하여 5~6회 tapping한 후, 흡입하여 제거하는 과정을 2회 반복하였다. 이후 Hoechst 33342를 EGM에 1:5000으로 희석하여 각 웰에 100㎕씩 첨가하고, 30분 동안 37℃, CO2 조건으로 배양하였다. 배양 후 Cytation 5장비로 DAPI와 GFP 형광을 이미지 리딩(image reading)한 후, 영상 처리하여 DAPI로 세포핵을 구획화하였다. 이어서 세포핵 주변 20μM의 FITC 값을 측정하고 DAPI로 나누어 Mean-FITC 값을 구하고 FITC 실험군을 음성대조군으로써 보정하여 뇌혈관장벽세포에 대한 투과도를 계산하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 FITC가 연결된 각 펩타이드를 4uM 농도로 처리한 경우에서 FITC 형광을 통해 상기 12개 펩타이드 모두 세포 투과성을 가지는 것을 확인하였다.
실시예 3. 세포 투과성에 중요한 아미노산 위치 검증
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 전술한 바와 같이 상기 transpep-1 세포 투과성 펩타이드에서 2번째(AA2)및 6번째(AA6) 아미노산 잔기가 세포 투과성에 중요한 영향을 미칠 것으로 예상하였는바, 이를 검증하기 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다.
이를 위해, 먼저 상기 transpep-1 펩타이드의 2번째 아미노산인 히스티딘(Histidine; H) 또는 6번째 아미노산인 류신(Leucine; L)을 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 각각 알라닌(Alaninen; A), 또는 아르기닌(Arginine; R)과 발린(Valine; V)으로 각각 치환한 단일 돌연변이 펩타이드를 합성하고, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 세포 투과성 여부를 분석하였다.
번호 물질명 돌연변이
1 #1 AA2 H->A
2 #2 AA6 L->A
3 #3 AA2 H->R
4 #4 AA6 L->V
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 상기 실시예 2에서 세포 투과성을 가지는 것으로 확인된 transpep-1과 비교할 때, 2번째 또는 6번째 아미노산 잔기가 변이된 4개의 변이체 펩타이드의 경우에는 세포 투과성이 현저히 감소한 것을 확인하였다.
나아가 상기 2개 아미노산 잔기의 중요성을 추가적으로 확인하기 위해, 하기 표 3과 같이 상기 2번째 및 6번째 아미노산이 모두 알라닌으로 치환된 펩타이드를 합성하였고, 이에 더하여 상기 실시예 1에서 합성한 세포 투과성이 확인된 표 1의 2, 3, 및 4번 펩타이드에서 2번째 또는 6번째 아미노산을 함께 알라닌으로 치환시켜 이중 돌연변이를 유발한 변이체 펩타이드를 합성하여 상기와 동일한 실험을 진행하였다.
번호 물질명 돌연변이
1 #5 AA2 H->A / AA6 L->A
2 #6 AA2 H->A / AA9 D->A
3 #7 AA2 H->A / AA10 E->A
4 #8 AA2 H->A / AA12 S->A
5 #9 AA6 L->A / AA9 D->A
6 #10 AA6 L->A / AA10 E->A
7 #11 AA6 L->A / AA12 S->A
그 결과, 도 2b에서 볼 수 있는 바와 같이 이중 돌연변이를 유발시킨 7개의 변이체 펩타이드 모두에서 세포 투과성이 현저히 감소된 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 세포 투과성 펩타이드에서 2번째 위치의 히스티딘과 6번째 위치의 류신이 세포 투과성을 결정하는 중요한 잔기임을 알 수 있었다.
실시예 4. 형광 단백질인 GFP가 결합된 세포 투과성 펩타이드의 제조
본 발명자들은 하기 in vivo 세포 투과성 분석에서 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드의 체내 조직으로의 전달을 이미징하고 이의 cargo 전달체로써의 기능을 검증하기 위하여, 형광을 띄는 단백질인 GFP(Green Fluorescence Protein)를 본 발명의 세포 투과성 펩타이드에 결합시켜 세포 투과성 펩타이드-GFP를 제조하고자 하였다. GFP는 대표적인 형광 단백질로 27kDa의 크기를 가지고 395nm와 475nm에서 여기 피크(excitation peak)를 가지며 509nm에서 방출 피크(emission peak)를 가진다.
구체적으로, 세포 투과성 펩타이드-GFP를 제조하기 위하여 GFP의 C-말단에 폴리뉴클레오티드 효소를 이용하여 서열번호 1의 transpep-1 펩타이드 서열을 삽입하고 이를 주형으로 하여 N-말단, C-말단에 결합할 수 있는 프라이머를 디자인하였다. 이를 PCR로 증폭시킨 후 pET28a 발현벡터에 삽입하여 세포투과성 펩타이드-GFP 단백질의 재조합 발현 벡터를 제조하였다. 상기 재조합 발현벡터로 E.Coli BL21(DE3)를 형질전환시킨 후 O.D. 값이 0.5가 될 때까지 E.Coli를 배양한 다음, 1mM의 농도로 IPTG를 첨가하여 세포 투과성 펩타이드-GFP 단백질의 발현을 유도하였다. 이후 SDS-PAGE를 수행하여 상기 단백질의 발현수준을 확인하였으며, 이를 히스-태그(His-tag) 친화 크로마토그래피를 이용하여 단백질을 분리 및 정제하였다.
실시예 5. in vivo 세포 투과성 분석
본 발명자들은 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드에 대하여 in vivo에서 세포 투과성을 검증하고자 하였다.
이를 위해, 상기 12개 펩타이드 중 대표적으로 transpep-1을 이용하여 하기와 같은 실험을 진행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 4에 기재된 방법으로 제조한 세포 투과성 펩타이드-GFP 또는 음성대조군인 GFP를 500uM의 농도로 PBS에 희석하여 100ul의 양을 C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주사(tail vein, i.v. injection)하였다. 24시간 후 졸레틸을 0.625ml/kg의 용량으로 복강주사(i.p. injection)하여 마우스를 마취시킨 후 발가락 꼬집기 검사(toe-pinch test)를 실시하여 완전한 마취상태를 확인하였다. 다음으로, 심방 관류를 통해 생리식염수 30ml을 3ml/min의 속도로 관류하여 체내에서 혈액을 제거하고, 4% 파라포름알데히드 용액(Paraformaldehyde solution) 30ml을 3ml/min의 속도로 관류하여 조직을 고정하였다. 고정된 마우스의 두개골에서 뇌를 적출한 후 4℃의 4% 파라포름알데히드 용액에 24시간 동안 후고정(post-fixation)을 실시하였다. 이후 준비된 조직의 절편 제작 시 세포의 손상을 방지하기 위하여 30% 수크로오스 용액(Sucrose solution)에 뇌 조직을 옮겨 4℃에서 48시간 동안 조직 내 용액을 치환하였다. 뇌 조직에 남아 있는 수크로오스 용액을 제거한 후, 조직을 Optimal cutting temperature compound를 사용해 급속 냉동한 뒤 냉동 박절기(Cryomicrotome)를 이용해 50um의 조직 절편을 제작하였다.
상기 방법으로 제작된 조직 절편을 이용해 GFP 단백질에 대한 면역조직화학염색(Immunohistochemistry, IHC)을 실시하기 위하여, 먼저 4℃에서 100% 메탄올 용액에 조직 절편을 10분간 담궈 두고, PBS로 5분간 세척하는 것을 2회 반복하였다. 세척 후 블락킹 용액(CAS blocking solution)으로 조직을 덮고 상온에서 1시간 배양한 후 블락킹 용액을 제거하였다. 다음으로, 항체 반응을 유도하기 위하여 1차 항체인 Rabbit anti-GFP를 1:200으로 PBS에 희석한 뒤 준비된 조직을 덮어 4℃에서 24시간 동안 배양하고, PBS로 5분간 세척하는 작업을 3회 반복한 후, Goat anti-Rabbit IgG/Alexa488 2차 항체를 1:200으로 PBS에 희석한 뒤 1차 반응이 끝난 조직을 덮어 2시간 동안 상온에서 배양하고 PBS로 5분간 세척하는 작업을 2회 반복하였다.
한편, 세포핵을 염색하기 위해 DAPI 용액을 1:400으로 PBS에 희석한 뒤 조직을 덮고 10분간 상온에서 배양한 다음, PBS로 5분간 세척하는 작업을 2회 반복하였다. 면역조직화학염색 실험을 마친 조직은 이미징을 위하여 마운팅 용액(mounting solution)으로 조직을 봉입하고 커버글라스를 덮은 후 커버글라스의 주위를 손톱 폴리쉬(nail polish)로 밀봉하고 30분간 건조시켰다. 커버글라스에 마운팅된 뇌 조직은 공초점현미경을 이용해 전달된 GFP 및 세포핵을 영상화하였으며, 분석을 위한 조직의 영상 획득 범위는 대뇌피질(Cerebral cortex) 및 해마(Hippocampus)가 포함될 수 있는 범위에서 20 배율의 렌즈를 이용하여 획득하였다. 또한, 공초점현미경을 이용해 획득한 영상은 2.5mm×2.5mm×40um의 범위(Field of view, FOV)에서 0.38um×0.38um×2.99um (width×height×depth)의 해상도로 촬영하였다. 획득한 영상의 정량화는 FOV의 범위에서 영상의 손실이 있는 부분을 잘라내고(cropping), 가우시안 필터(Gaussian filter)를 통해 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio, SNR)를 증가시키는 전처리(Pre-processing) 과정을 거쳤다. 전처리된 영상을 이용해 대뇌피질부 및 해마 영역에서의 GFP를 정량하기 위하여 DAPI로 염색된 세포 핵 부분을 기준으로 피질 영역 및 해마 영역을 나누어 구획화(Parcellation)하여 조직 내 피질, 해마영역의 ATLAS를 제작한 다음 GFP의 형광 세기를 측정하여 면역반응(Immunoreactivity) 정도를 나타내었다.
실험 결과, 도 3a의 이미지 결과에서 볼 수 있는 바와 같이 펩타이드 없이 GFP만 주입한 대조군의 경우에는 대뇌피질 및 해마 조직에서 녹색 형광이 관찰되지 않은 반면에, 세포 투과성 펩타이드-GFP를 주입한 경우에는 대조군과 비교해 대뇌피질 및 해마 조직에서 녹색 형광이 명확히 관찰되는 것을 확인하였다. 도 3b의 정량 결과를 통해서도 세포 투과성 펩타이드-GFP를 주사한 경우 GFP만 주사했을 때 보다 대뇌 피질에서 약 2.2배 (p=0.009), 해마에서 약 1.78배 (p=0.009) 형광이 높게 검출되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드가 in vivo에서도 우수한 세포 투과성이 있음을 확인하였으며, 물질 전달체로써 효과적으로 cargo를 세포 내로 전달 가능함을 알 수 있었다.
실시예 6. 종래 세포 투과성 펩타이드와의 효과 비교
본 발명자들은 본 발명에 따른 12개 세포 투과성 펩타이드에 대하여 해당 기술분야에서 공지되어 있는 세포 투과성 펩타이드와 세포 투과 정도를 비교해보고자 하였다. 이를 위해, 하기와 같이 각각 유세포분석법을 통한 세포 투과능 및 in vivo 뇌혈관장벽(BBB) 투과도 분석 실험을 실시하였으며, 상기 공지된 세포 투과성 펩타이드로는 angiopep-2를 이용하였다. angiopep-2 펩타이드는 19개의 아미노산 서열로 이루어진 것으로, BBB에서 발현되는 수용체인 저밀도지질단백질 수용체 연관 단백질-1(low-density lipoprotein receptor-related protein-1; LRP-1)에 결합하여 세포 내로 유입되는 것으로 알려져 있다.
6-1. 유세포분석법을 통한 세포 투과 효과 비교분석
먼저, 상기 실시예 1-2에서 제조한 transpep-1-FITC 및 angiopep-2-FITC에 대하여 유세포분석기법(Flow cytometry)을 통해 단일 세포 내부의 형광물질의 유입량을 확인하고 이를 정량화하였다. 구체적으로, hCMEC/D3 세포주를 2% BCS(bovine calf serum)가 함유된 EGM 배양액을 이용해 15,000 cells/well로 분주하고 24시간 후 상기 두 펩타이드 각각을 10uM 농도로 세포에 처리한 다음 37℃, CO2 조건에서 2시간 동안 배양하였다. 이후 1X PBS로 세포를 세척하고 1.1% TE(Trypsinase-EDTA)를 넣고 3분 동안 배양하여 세포를 플레이트 바닥에서 떨어뜨린 다음 TE의 3배 정도의 EGM 세포 배양액를 넣고 100rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 다음으로, 상층액은 흡입하여 제거하고 세포를 250㎕ 1x PBS로 재현탁시킨 다음 BD Falcon 12 x 75 mm Tubewith Cell Strainer Cap으로 옮겨 각 펩타이드에 따른 형광물질의 유입량을 유세포분석기로 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 angiopep-2-FITC 펩타이드와 비교할 때, transpep-1 펩타이드를 처리한 경우 형광 강도가 현저히 높은 것으로 나타났다 (p<0.0001). 이를 통해 본 발명에 따른 transpep-1 펩타이드가 angiopep-2 펩타이드 보다 현저히 높은 세포 투과성을 갖는다는 것을 확인하였다.
6-2. in vivo 뇌혈관장벽(BBB) 투과도 비교분석
다음으로, 본 발명에 따른 transpep-1과 angiopep-2의 in vivo BBB 투과도를 비교하기 위하여, 하기와 같은 방법으로 실험을 진행하였다.
구체적으로, 이광자 현미경(two photon microscopy)을 이용하여 생체 내 실시간 이미징(in vivo live imaging)을 시행하기 위하여 살아있는 마우스(C57BL/6)에서 두개 창(cranial window) 설치 수술을 시행하였다. 두개 창을 만들기 전에 마우스를 3% 아이소프란(isoflurane)으로 호흡 마취를 유도한 뒤 온열 패드를 이용하여 마우스의 체온을 36.5-37.5℃로 유지되도록 하였다. 마취를 유도한 후에는 아이소프란의 농도를 1.5%로 조절하여 마취가 유지되도록 하였다. 또한 마취의 유지 정도를 확인하기 위하여 심박 및 SpO2를 실시간으로 확인하였다. 이후 개두술의 위치는 ML, +2.5 mm, AP, -1.5 mm의 두개골 좌표에서 3mm의 지름을 가지도록 치과용 드릴을 이용해 실시하였다. 개두술로 두개골을 제거한 다음 4mm의 지름을 가지는 커버글라스를 이용해 덮고, 싸이노아크릭(cyanoacrylic) 본드를 이용해 접착하였다. 다음으로 이광자 현미경 아래에서 마우스의 머리를 고정할 수 있는 머리틀(head frame)을 커버글라스가 정 중앙으로 올 수 있도록 접착시켰다. 본드를 이용한 커버글라스 및 틀(frame)의 1차 접착 이후, 2차 접착 및 water immersion 렌즈를 사용하여 이미징을 시행할 수 있도록 치과용 레진을 이용하여 커버글라스의 경계부터, 노출된 모든 두개골을 덮어주었다. 수술 이후에는 수술에 의한 염증이 완화될 수 있도록 엔로프락신(enrofloxacin) 및 멜록시캄(meloxicam) 약물을 5 mg/kg 주사하였다.
상기 과정에 따라 두개 창 수술 후, 4-6주 동안 회복 기간을 거친 뒤 이차증류수 및 70% 알코올을 이용해 두개 창 커버글라스를 닦아 부유물들을 제거하여 실험 시 렌즈와 커버슬라스 사이에 순수한 증류수만 존재할 수 있게 세척하였다. 이어서 마우스를 2% 아이소프란으로 마취시킨 다음, 정위 기구(stereotaxic frame)로 옮겨 머리 틀을 고정하고, 1.5% 아이소프란으로 마취 상태를 유지하고 체온은 36.5-37.5℃로 일정하게 유지시켜주었으며, 이후 꼬리정맥에 튜브를 연결하여 고정하였다. Water immersion lens (25X, NA: 0.9)를 사용하기 위해, 세척 작업을 거친 두개 창에 증류수를 채우고, 초점을 맞췄으며, 70kDa의 텍사스 레드가 접합된 덱스트란(Texas red conjugated dextran)을 꼬리정맥 튜브를 통해 1.5ml/kg(body weight, concentration: 5%(w/v))의 용량으로 주입하였다.
이후 혈관구조영상 이미징 (1)을 시행하여 Pial artery, penetrating arteriole, venule, pial vein이 모두 포함될 수 있도록 영상화 범위(FOV)를 설정하여 혈관구조영상 이미징을 시행하였다. 혈관구조영상 (1)은 전술한 바와 같이 Pial vessel을 포함하여 350-400um 정도의 깊이로 영상화하였다. 다음으로 생체 내 실시간 이미징 (2)을 위해 시해상도를 1분이 되도록 영상 변수를 조절하여 354um × 354um의 범위를 512 × 512의 해상도로 이미징하였다. z축의 해상도는 2um로 75장을 획득하여, 즉 150um 두께를 pial vessel을 제외한 50~200um 깊이까지의 범위로 설정하였다. 상기 생체 내 실시간 이미징 (2)을 시행하기 위한 설정 후, 꼬리정맥 튜브를 통해 15mg/kg의 transpep1-FITC 또는 angiopep-2-FITC를 주입한뒤 상기 설정과 동일한 영상 변수를 이용하여 90분 동안 이미징을 진행하였다.
상기 방법을 통해 이광자 현미경으로부터 획득한 혈관구조영상 (1) 및 생체 내 실시간 이미징 영상 (2)들을 3차원 매트릭스(matrix)로 재구성한 다음 혈관구조영상 매트릭스에 생체 내 실시간 이미징 매트릭스들을 정합하였다. 정합방법은 선형 정합(linear registration)을 원칙으로 하며, 영상을 획득할 때의 동적인 아티팩트(movement artifacts)에 따라 강체(rigid body) 및 상사변수(similarity parameter)를 선택적으로 사용하였다. 정합된 실시간 이미징 매트릭스 중, 70kDa-Texas red dextran을 이용해 이진화(binarization)화 한 혈관 내부 영역을 혈관 내 영역이라고 정의하고, 외부 영역을 혈관외 영역이라고 정의하였다.
이진화(Binarization)는 imageJ 및 matlab을 이용하여 시행할 수 있다. imageJ의 경우, CLAHE(local contrast enhanced thresholding)을 사용하고, matlab의 경우 Mexican hat, otsu 및 local contrast를 이용한 알고리즘을 사용하여 시행하였다. 혈관의 내부 및 외부영역을 결정한 다음, 그 좌표를 실시간 이미징 매트릭스의 좌표에 적용하여 혈관 내/ 외부 영역의 transpep1-FITC 또는 angiopep-2-FITC의 변화를 관찰하였다.
또한, 상기 이미징 영상으로 관찰된 결과들을 정량하기 위하여, 측정된 최초의 혈관 내부 영역의 강도(intensity) 평균값을 100%로 설정하고, 최초의 혈관 외부 영역의 강도 평균값을 0%로 설정하였으며, 모든 시계역 상에 존재하는 매트릭스의 복셀값을 정규화하여 백분율을 생체 내 실시간 이미징 매트릭스에 매핑(mapping)하였다. 정규화된 강도값은 하기 수식에 따라 도출하였다. 이때, 하기 수식에서 averaged Intra Intensity0은 최초의 혈관 내부 영역의 강도 평균값이고, averaged extra Intensity0은 최초의 혈관 외부 영역의 강도 평균값을 나타내는 것이다.
Figure 112020042122557-pat00001
실험 결과, 도 5a 내지 도 5f에 나타낸 바와 같이 transpep-1-FITC를 주사한 경우 angiopep-2-FITC를 주사한 경우보다 혈관 내 영역에서 더 오래 높은 수준으로 형광이 관찰됨을 확인하여 더 높은 생체 내 안정성을 가지고 있음을 확인하였다. 또한, transpep-1-FITC를 주사한 경우 angiopep-2-FITC를 주사한 경우보다 혈관 외 영역으로 전달되는 양이 많은 것을 확인하였다. 결론적으로 본 발명에 따른 transpep-1이 angiopep-2 펩타이드 보다 우수한 생체 내 안정성 및 전달 효율을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Claims (11)

  1. 하기의 [일반식 I]로 표시되는 아미노산으로 이루어진, 세포 투과성 펩타이드로서,
    [일반식 I]
    X1-X2-...Xn-1-Xn
    상기 일반식 I에서,
    n ≥16이고,
    X2는 His(H) 및 X6는 Leu(L)이고,
    상기 X2 및 X6를 제외한 아미노산은 Gly(G), His(H), Glu(E), Arg(R), Lys(K), Ser(S), Asp(D), Trp(W), Val(V), Thr(T), Ala(A), Asn(N) 및 Tyr(Y)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고,
    상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 일반식 I에서 n은 16인 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 뇌혈관장벽 내피세포(brain endothelial cell), 암세포, 혈액세포(blood cell), 림프구(lymphocyte), 면역세포, 줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 신경줄기세포(neural stem cell; NSC), T 세포, B 세포, 자연살해세포(natural Killer cell; NK cell), 대식세포(macrophage), 미세아교세포(microglia), 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte) 및 근육세포(muscle cell)로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는, 세포 투과성 펩타이드.
  5. 제1항의 세포 투과성 펩타이드 및 생물학적 활성 물질을 포함하는, 복합체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 생물학적 활성 물질은 화합물(chemical compound), 단백질, 당단백질, 펩타이드, 항체(antibody), 효소(enzyme), 핵산분해효소(nuclease), 호르몬, 사이토카인(cytokine), 전사인자(transcription factor), 독소, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 천연물(natural product), 반합성 물질(semi-synthetic drug), 약물(drug), 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 바이러스, 양자점(quantum dots) 및 형광색소(fluorochrome)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 복합체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 핵산분해효소는 CAS9(CRISPR associated protein 9), CAS12, CAS13, CAS14, CAS variants, Cfp1(CxxC-finger protein-1), ZEN(Zinc-finger nucleases) 및 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 복합체.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 핵산은 DNA, RNA, ASO(Antisense oligonucleotide), 마이크로RNA(microRNA; miRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid) 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 복합체.
  9. 제5항의 복합체를 포함하는, 물질 전달용 조성물.
  10. 제9항의 조성물을 인간을 제외한 포유동물의 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 물질 전달방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 세포는 뇌혈관장벽 내피세포(brain endothelial cell), 암세포, 혈액세포(blood cell), 림프구(lymphocyte), 면역세포, 줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 신경줄기세포(neural stem cell; NSC), T 세포, B 세포, 자연살해세포(natural Killer cell; NK cell), 대식세포(macrophage), 미세아교세포(microglia), 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte) 및 근육세포(muscle cell)로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는, 물질 전달방법.
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