CN108101961A - 一种可以实现脑靶向递药的短肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可以实现脑靶向递药的短肽及其应用，所述短肽的氨基酸序列为：Ile‑Thr‑Pro‑Thr‑Arg‑Lys‑Ser，如SEQ ID NO：1所示。免疫荧光测试结果表示本发明的短肽具有良好的脑靶向递药特性，可以提高现有药物的血脑屏障透过率。

Description

一种可以实现脑靶向递药的短肽及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种短肽，具体涉及一种可以实现脑靶向递药的短肽及其应用。
背景技术
阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease AD）是一种复杂的神经退行性疾病，常见于中老年人，是老年痴呆的主要病因。阿尔茨海默病阶段性发展，并逐渐恶化记忆力、推理、判断和语言能力，以及执行简单任务的能力。目前，阿尔茨海默病正逐步呈现年轻化趋势，对个人家庭和社会都产生了巨大的压力，因此，对阿尔茨海默病的治疗的研究已经变得刻不容缓。
帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见的神经系统变性疾病，平均发病年龄为60岁左右。爬进僧病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著性减少而致病。导致这一病理改变的确切病因目前仍不清楚。
轻度认知障碍（mild cognitive impairment, MCI）是介于正常衰老和痴呆之间的一种中间状态，是一种认知障碍症候群。尽管MCI可呈现各种症状，然而，当失忆是一个主要的症状时，其被称为“遗忘型MCI”，并且常被看做是阿尔茨海默病的前驱期。
此外，还有抑郁症、癫痫、狂躁症、多发梗塞性痴呆、路易体痴呆等病症都属于大脑神经系统疾病。
血脑屏障是在脑和脊髓内的毛细血管与神经组织之间存在的一个调节界面，是药物进入大脑的主要屏障，脑内皮细胞和脉络膜内皮细胞紧密连接是该屏障的结构基础，是脑和外周血循环的主要屏障。血脑屏障对研发上述大脑神经系统疾病的影响有以下几点：（1）98%的小分子药物无法穿过血脑屏障；（2）100%的大分子药物无法穿过血脑屏障；（3）目前为止还没有针对血脑屏障相关药物的重大研究进展。
以阿尔茨海默病的研究为例，在过去的20多年中，淀粉样蛋白假说一直是阿尔茨海默病研究的焦点。阿尔茨海默病治疗除了使用神经保护剂外，大多数药物研发集中于非正常折叠蛋白的清除。然而，多数药物在作用过程中，因无法透过血脑屏障或通过血脑屏障的效率很低，而大大降低了药效。目前，在增加药物透过血脑屏障的研究中，受体介导胞吞转运通过血脑屏障的纳米递释系统是研究的热点。脑毛细血管内皮细胞膜上存在着多种特异性受体，受体介导胞吞转运就是利用这些受体与相应配体或单克隆抗体的特异性结合，使得载药系统（如纳米粒，脂质体等）能够以胞吞的方式介导相应的药物入脑。但是，目前研究较为多的受体（转铁蛋白，胰岛素，单抗OX26等）均存在某些不足：在生理条件下，转铁蛋白受体可能会被内源性转铁蛋白饱和；胰岛素的体内半衰期非常短，高浓度时会导致低血糖；OX26的免疫原性和动物种属选择性较强等等。
噬菌体表面展示技术是近年来新兴的研究手段，是一种能将外源肽段以融合蛋白形式展现于噬菌体表面，同时该外源多肽还可以保持相对独立的空间结构和生物活性的新的基因操作技术。其主要原理是：当外源DNA片段插入丝状噬菌体基因组的衣壳蛋白基因中时，此外源 DNA 片段所编码的氨基酸序列能够与此衣壳蛋白一同以融合蛋白的形式来表达出来，并展示在噬菌体的表面。如果所展示的肽段是随机肽段或是蛋白质，则为噬菌体展示肽库。噬菌体表面展示技术可以结合适当的生物筛选方法，它可以对多肽、蛋白质或核酸等生物分子的某些功能（如结合功能）进行探索和筛选，进而由此来实现体外的快速进化。通过淘选多样性巨大的各种展示库，使许多有特定功能的多肽结构被确定，并据此进行多肽药物和疫苗的研制、蛋白质相互作用位点的确认、描绘抗原决定簇和探讨细胞因子与受体活性中心的作用机制等生物多方向的深入研究。如果能结合噬菌体表面展示技术开发出一种可以实现脑靶向递药的功能基团，将对上述病症的治疗具有很高的研究价值和临床意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种可以实现脑靶向递药的短肽及其应用，该多肽分子量小，具有良好的脑靶向递药特性。本发明的技术方案为：
第一个方面，本发明提供一种可以实现脑靶向递药的短肽，其氨基酸序列为：
Ile-Thr-Pro-Thr-Arg-Lys-Ser（SEQ ID NO：1）。
上述短肽与血脑屏障的亲和力高，特异性强，生物相容性好，因此可以用作大脑神经系统疾病药物的靶向治疗载体。
第二个方面，本发明提供一种包含上述短肽的药物组合物，
故在本发明的第三个方面，提供了上述短肽在制备大脑神经系统疾病产品中的用途。
以及第四个方面，本发明提供一种上述短肽的药物组合物在制备大脑神经系统疾病产品中的用途。
所述的大脑神经系统疾病产品是指生物医药、食品或者试剂技术领域中，用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究大脑神经系统疾病的产品，包括药物、试剂、食品或者保健品中的一种或者多种。
所述的大脑神经系统疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、轻度认知障碍、抑郁症、癫痫、狂躁症、多发梗塞性痴呆、路易体痴呆、肌萎缩侧索硬化中的一种或者多种。
第五个方面，本发明提供一种增加脑靶向递药的方法，包括向有需要的个体施用所述短肽或者包含该短肽的药物组合物。
与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：本发明的可以实现脑靶向递药的短肽，具有良好的靶向递药特性，分子量小，与血脑屏障的亲和力高，特异性强，生物相容性好，可以作为大脑神经系统疾病药物的靶向治疗载体，提高现有药物的血脑屏障透过率，进而增强药物的药效。
附图说明
图1为本发明实施例对提取的大鼠脑组织冰冻切片后进行免疫荧光染色的结果。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
第一个方面，本发明具体实施例中提供了具有下述氨基酸序列的短肽：
Ile-Thr-Pro-Thr-Arg-Lys-Ser，如SEQ ID NO：1所示。
上述短肽与血脑屏障的亲和力高，特异性强，生物相容性好，因此可以用作大脑神经系统疾病药物的靶向治疗载体。
第二个方面，本发明具体实施例中提供了包括具有下述氨基酸序列的短肽的药物组合物：
Ile-Thr-Pro-Thr-Arg-Lys-Ser，如SEQ ID NO：1所示。
故在本发明具体实施例的第三个方面，提供了上述短肽在制备大脑神经系统疾病产品中的用途。
以及第四个方面，本发明具体实施例提供一种上述短肽的药物组合物在制备大脑神经系统疾病产品中的用途。
所述的大脑神经系统疾病产品是指生物医药、食品或者试剂技术领域中，用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究大脑神经系统疾病的产品，包括药物、试剂、食品或者保健品中的一种或者多种。
所述的大脑神经系统疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、轻度认知障碍、抑郁症、癫痫、狂躁症、多发梗塞性痴呆、路易体痴呆、肌萎缩侧索硬化中的一种或者多种。
第五个方面，本发明具体实施例提供一种增加脑靶向递药的方法，包括向有需要的个体施用所述短肽或者包含该短肽的药物组合物。
下面就本发明所用到的有关实验方法，具体阐述如下：
1、本发明的短肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）采用大鼠体内筛选的方法，将纽英伦生物技术有限公司（NEW ENGLAN Biolab）的噬菌体展示随机七肽库（Ph.D-7CTM Phage Display Peptide Library Kit）稀释至1×1012pfu滴度，稀释液为TBST缓冲液，对C57BL/6小鼠进行尾静脉注射，120分钟后，处死小鼠，生理盐水心脏灌流以除去体循环内非特异性的噬菌体；
（2）超净台取出小鼠脑组织，无菌条件下匀浆，加入含1mM苯基磺酰氟（PMSF），20ug/ml蛋白酶抑制剂（Aprotin）和1ug/ml亮抑酶肽（Leupeptin）的TBST，收集上清；取适量所得噬菌体，用处于对数生长期的ER2738大肠杆菌通过滴定法确定噬菌体的滴度，其余的噬菌体扩增后用于下一轮筛选；
（3）将扩增的噬菌体重复步骤（2）二次；
（4）从最后一轮结果中随机挑取出噬菌体单克隆20个，进行测序，获得序号为1～20的多肽氨基酸序列，经测序证实这20个噬菌体展示的多肽包含相同序列，即Ile-Thr-Pro-Thr-Arg-Lys-Ser。并且经过生物信息学分析比对显示，与美国国立生物技术住处中心(NCBI) GeneBank DNA 序列数据库和Swiss-Prot 蛋白数据库中的已知基因和蛋白无同源性。
表1为噬菌体随机七肽库经三轮体内筛选，每一轮的脑内噬菌体回收率，通过从脑内回收噬菌体的量与给入量可以计算得到脑摄取率（%ID/g），表1的结果表明，展示多肽的噬菌体在筛选过程中，进入脑中的效率在逐步增大。
表1
筛选轮数 给入噬菌体的量（pfu） 脑中回收噬菌体的量（pfu） %ID/g
一轮 1.00E+12 1.6E+5 1.6E-7
二轮 1.8E+11 3.6E+5 2.0E-7
三轮 3.5E+10 4.7E+5 1.3E-5
2、免疫荧光试验，试验过程如下：
（1）将大鼠进行分组，分为肽库组，TBST组和脑靶向组，将噬菌体展示随机七肽库和已经筛选得到的展示Ile-Thr-Pro-Thr-Arg-Lys-Ser的噬菌体均稀释至1×1012pfu滴度，稀释液为TBST缓冲液。肽库组对C57BL/6小鼠进行尾静脉注射噬菌体展示随机七肽库，脑靶组对C57BL/6小鼠进行尾静脉注射展示Ile-Thr-Pro-Thr-Arg-Lys-Ser的噬菌体，TBST组对C57BL/6小鼠进行尾静脉注射TBST缓冲溶液。120分钟后，处死小鼠，多聚甲醛溶液心脏灌流固定；
（2）超净台取出小鼠脑组织，加入蔗糖溶液中沉降，进行冰冻切片；
（3）对冰冻切片进行免疫荧光染色，一抗为噬菌体特异性染料，二抗为荧光特异性染料；
（4）利用共聚焦显微镜对免疫荧光染色切片照相。
图1提供了对提取的大鼠脑组织冰冻切片后进行免疫荧光染色的结果。结果显示，首先，脑靶向组与TBST组相比，组织切片上有荧光，说明筛选得到的短肽可以携带噬菌体通过血脑屏障进入大脑，同时脑靶向组与原肽库组相比，在投入量相同的情况下，组织切片上荧光数量和亮度明显增加，说明其入脑量更多，因此，筛选得到的短肽是具有脑靶向递药效果的序列。这证明本发明具体实施例获得了具有脑靶向递药能力的氨基酸序列。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 东北大学
<120> 一种可以实现脑靶向递药的短肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> "人工序列"()
<400> 1
Ile Thr Pro Thr Arg Lys Ser
1 5

Claims (9)

1.一种可以实现脑靶向递药的短肽，其特征在于，其氨基酸序列为：
Ile-Thr-Pro-Thr-Arg-Lys-Ser，如SEQ ID NO：1所示。
2.一种可以实现脑靶向递药的短肽在制备大脑神经系统疾病产品中的用途，其特征在于，所述短肽的氨基酸序列为：Ile-Thr-Pro-Thr-Arg-Lys-Ser，如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求2所述的一种可以实现脑靶向递药的短肽在制备大脑神经系统疾病产品中的用途，其特征在于，所述的大脑神经系统疾病产品是指生物医药、食品或者试剂技术领域中，用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究大脑神经系统疾病的产品，包括药物、试剂、食品或者保健品中的一种或者多种。
4.根据权利要求2或3所述的一种可以实现脑靶向递药的短肽在制备大脑神经系统疾病产品中的用途，其特征在于，所述的大脑神经系统疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、轻度认知障碍、抑郁症、癫痫、狂躁症、多发梗塞性痴呆、路易体痴呆、肌萎缩侧索硬化中的一种或者多种。
5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括可以实现脑靶向递药的短肽，所述短肽的氨基酸序列为：Ile-Thr-Pro-Thr-Arg-Lys-Ser，如SEQ ID NO：1所示。
6.一种药物组合物在制备大脑神经系统疾病产品中的用途，其特征在于，所述药物组合物包括可以实现脑靶向递药的短肽，所述短肽的氨基酸序列为：Ile-Thr-Pro-Thr-Arg-Lys-Ser，如SEQ ID NO：1所示。
7.根据权利要求6所述的一种药物组合物在制备大脑神经系统疾病产品中的用途，其特征在于，所述的大脑神经系统疾病产品是指生物医药、食品或者试剂技术领域中，用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究大脑神经系统疾病的产品，包括药物、试剂、食品或者保健品中的一种或者多种。
8.根据权利要求6或7所述的一种药物组合物在制备大脑神经系统疾病产品中的用途，其特征在于，所述的大脑神经系统疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、轻度认知障碍、抑郁症、癫痫、狂躁症、多发梗塞性痴呆、路易体痴呆、肌萎缩侧索硬化中的一种或者多种。
9.一种增加脑靶向递药的方法，其特征在于，包括向有需要的个体施用具有氨基酸序列为：Ile-Thr-Pro-Thr-Arg-Lys-Ser的短肽或者包含所述短肽的药物组合物。
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