CN103119052A

CN103119052A - 肽衍生物、其制备和用途

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Publication number: CN103119052A
Application number: CN2011800300142A
Authority: CN
Inventors: 帕特里克·维列诃; 马里恩·戴维; 伊夫·莫利诺; 米歇尔·克瑞斯塔提斯凯
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de la Mediterranee Aix Marseille II; Vect Horus
Current assignee: Aix Marseille Universite; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Vect Horus
Priority date: 2010-04-21
Filing date: 2011-04-18
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2031-04-18
Also published as: JP2013525336A; TR201905058T4; JP6073779B2; DK2547692T5; BR112012027043A2; WO2011131896A3; AU2011244107A1; EP2547692A2; EA201201446A1; BR112012027043B1; HUE042850T2; EA022422B1; WO2011131896A2; DK2908837T3; CA2796174A1; ES2719727T3; DK2547692T3; CA2796174C; ES2637265T3; US20130108548A1

Abstract

本发明涉及肽衍生物(肽和类肽)及其作为用于关注分子的载体的用途。本发明还涉及含有结合至关注分子的本发明的肽衍生物的轭合物。本发明的肽可以用于通常以轭合物的形式矢量化越过细胞膜的药物或诊断关注的分子的前药例如治疗分子、成像剂或诊断剂、或分子探针，并且显著地促进它们越过血脑屏障(barrière hémato-encéphalique,BHE)的传输。

Description

肽衍生物、其制备和用途

本发明涉及肽衍生物(肽和类肽)及其作为用于关注（感兴趣的）分子的载体的用途。本发明还涉及含有结合至关注分子的本发明的肽衍生物的轭合物。本发明的肽尤其可用于以通常前药轭合物的形式矢量化（载体化，vectorize）越过细胞膜的药物或诊断关注的分子例如治疗分子、成像剂或诊断剂、或分子探针，并且尤其用于促进它们越过血脑屏障(barrière hémato-encéphalique,BHE)的运输。

发明背景

根据IMS Health，对于用于治疗中枢神经系统（SNC，cerveau et moelleépinière,脑和脊髓）病状的药物的全球市场在2007年为约700亿美元，其中这个量的几乎90亿美元代表源于药物递送技术的产品(Jain,2008,JainPharmaBiotech Report,Drug Delivery in CNS disorders)。因此，当今神经病学是三个最大治疗领域之一，连同心血管病学和肿瘤学。尽管全世界患有SNC病症和病状的人数大于患有心血管疾病或癌症的人数，但是神经病学保持落后的市场。这通过以下事实解释：98%的用于治疗SNC病状的潜在药物不会越过血脑屏障或BHE(Pardridge,2003,Mol.Interv.,3,90-105)。

事实上，通过两种基本生理学屏障系统BHE和血-脑脊液屏障(barrièresang-liquide céphalo-rachidien,BS-LCR)的存在，脑被保护以免于潜在的性物质。BHE被视为用于摄取血浆配体的主要途径。其表面积比BS-LCR的表面积大约5000倍。BHE的构成血管的总长度为约600km。每cm³的大脑皮质含有相当于1km的血管。BHE的总表面积估计在20m²(De Boer et al.,2007,Clin.Pharmacokinet.,46(7),553-576)。因此，构成BHE的大脑内皮代表针对许多SNC病症的潜在药物使用的主要障碍，而且代表血液和神经组织之间的潜在交换的大表面。

通常，仅少数较小的约450-600道尔顿的亲脂性分子可以通过BHE（仅2%的药物候选物），也就是说，从血液传到大脑。表现出前景而导致用于治疗SNC病症的体外研究和动物研究的许多药物候选物的分子量和尺寸显著更大。因此，大多数分子如治疗肽或蛋白通常从血液至大脑的通过/运输被排除，因为脑毛细血管内皮细胞（BCECs）对于这种类型的药物候选物的低跨细胞渗透性。血管中器官化的BCECs被基膜、星形胶质细胞突触小结、周细胞和神经元细胞包围。内皮细胞与星形胶质细胞突触小结的紧密缔合负责形成和维持对大多数分子的BHE渗透性能，由此确保血液和大脑之间的分子交换的严格和有效控制，以便维持脑内稳态。相比于其他器官的内皮细胞（其是具有膜孔的），BCECs被紧密连接部密切结合。这些紧密连接部由此防止越过BHE的任何细胞旁运输。

BHE被视为在开发用于治疗大脑病状的新型疗法，并且尤其是对于用于治疗SNC病症的分子的使用中要克服的主要障碍(Neuwelt et al.,2008,LancetNeurol.,7,84-96)。

可以解释为什么当前对于主要脑病状（脑癌，帕金森病和阿尔茨海默病，脑血管事故(accidents vasculaires cérébraux,AVC)等）没有可用的有效治疗的原因之一是，用于治疗脑病状的药物候选物的开发者实施内部研究程序（脑药物开发程序），同时在通过BHE的问题中以及SNC，并且尤其是大脑（脑药物靶向程序）的优先靶向方面投入很少的努力(Pardridge,2003,Mol.Interv.,3,90-105)。药物候选物必须依照某些结构的、物理化学的、药物化学的和药理学的规则以便具有成为用于治疗SNC病状或病症的药物的最佳机会(Pajouhesh et al.,2005,NeuroRx,2(4),541-553)。因此，在药物候选物的开发中，分子对其靶标的选择性和特异性（药理学分布）对于其治疗活性（有效性）而言是必需的。分子的生物利用度和潜在毒性（药物分布）对于其作为药物的未来是关键的。换句话说，可能成为用于治疗SNC病状或病症的药物的任何分子必须跨越过BHE，保持其生物学活性，并且展现出药动学(PK)、吸收、分布、代谢和消除（ADME）以及药效学(PD)的合适性质，具有低毒性（Tox）。事实上，对于SNC治疗剂这个领域中的药物化学家来说很难找到处于开发的分子的亲水性/亲脂性平衡。

因此，治疗SNC病症和病状中的主要问题在于这样的事实，即给药的分子不穿过BHE并因此不能到达它们在SNC中的靶标或多个靶标。构成BHE的SNC的血管和毛细血管的内皮细胞是不能从血液传到神经组织的分子的障碍。实际上，如上提及的，这些内皮细胞和包围它们的星形胶质细胞突触小结构成尤其是与内皮细胞之间的紧密连接部存在相关的物理屏障（其限制/阻止通过细胞旁途径的任何通过/运输），以及生理屏障，因为这些细胞具有限制通过跨细胞途径的任何通过/运输的有效流出系统。这些性质因此强大地限制物质从血浆朝向脑细胞外空间的通过。

实际上，能够越过BHE的某些分子通过多药抗性(MDR)运输蛋白主动地从大脑朝向血液系统排出。这些活性流出运输(AET)系统通常控制小分子从脑朝向血液系统的主动流出。在BHE处的模型AET系统是ATP结合盒(ABC)转运蛋白，即P-糖蛋白(P-gp)；然而，其他AET系统存在于BHE，如MDR-相关蛋白1(MRP1)。P-gp，其主要位于脑毛细血管内皮细胞的腔表面上，是阻止大多数外源物以及药物候选物和能够在SNC中是活性的治疗关注的其他分子进入脑的BHE的生理屏障的功能中的基本元件。

因此在发现用于治疗、诊断或成像脑病症或病状的分子中的研究的优先考虑的事情之一是找到用于增大活性物质通过BHE的有效性的手段。

在这方面，对于越过BHE的分子的矢量化的策略，其由药物候选物的开发者当前研究和使用以能够使治疗关注的分子到达SNC，可以分成两种主要策略：药理学方法和生理学方法（图1）(Pardridge,2007,Pharm.Res.,24(9),1733-1744;De Boer et al.,2007,Clin.Pharmacokinet.,46(7),553-576;De Boer etal.,2007,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,47,327-355;Jones et al.,2007,Pharm.Res.,24(9),1759-1771)。

侵入性方法

侵入性方法可以通过在大脑中的直接心室内注射、脑内注射或鞘内灌注活性物质，或者通过BHE的破坏（BHE完整性的暂时破裂）实施。

除了与神经外科程序相关的费用外，通过脑室内注射的神经外科方法的主要问题在于，药物不被直接递送到脑薄壁组织中而是在脑脊髓液中。心室内灌注涉及将导管置于心室中(Aird,1984,Exp.Neurol.,86,342-358)。这种高度侵入性技术对于活性物质在脑薄壁组织中国的运输不是有效的。实际上，在通过心室内灌注的药物递送期间，从脑脊髓液至脑薄壁组织的流量受其对流的异常慢的灌注（传输）控制，因为脑不具有脑实质内流量。

对于脑内注射类似地，活性物质在脑中的扩散从注射部位至病变部位非常快速地降低。实际上，活性物质的脑中浓度在距其注射部位500μm距离处下降90%。

鞘内灌注涉及将导管置于脑中。这种导管连接于以预定流速递送活性物质的泵。由于脑是不具有淋巴系统（通常用于将细胞外流体运输回到全身循环）的唯一器官的事实，所以活性物质通过鞘内灌注在脑中的分布极低。这降低了活性物质在病变部位处的浓度。

此外，感染的风险在这样的神经外科程序中非常大，尤其是在导管存在下。在这些状况下，患者舒适不是最佳的。

BHE的不渗透性的暂时破裂与脑毛细血管内皮细胞的紧密连接部的短暂打开相关。这是对于作用于血管的物质如白三系类或缓激肽类的情形(Baba etal.,1991,J.Cereb.Blood Flow Metab.,11,638-643)。这种策略同样的侵入性的并且需要在镇静对象/患者中对颈动脉的动脉访问。除了与用于访问颈动脉的放射性程序相关的费用外，由BHE的完整性的暂时破裂遇到的主要问题是，BHE仅在短时间保持打开，因此限制在延长时间期内递送药物的可能性。此外，BHE的暂时破裂允许血浆蛋白进入脑（而这些蛋白对于脑可能是有毒的）并且也可以促进感染剂的进入。这种类型的BHE破裂因此可以导致慢性神经病理破坏并且与高感染风险相关(Salahuddin et al.,1988,Acta Neuropathol.,76,1-10)。

矢量化的药理学方法

用于运输分子的药理学策略包括通过在活性物质上添加脂质或亲脂性基团而制成更大疏水性的分子的跨细胞扩散(跨细胞亲脂性扩散，TLD)或使用脂质体(Zhou et al.,1992,J.Control.Release,19,459-486)，以及通过经由带正电荷的载体分子的离子性吸附或者通过活性分子的阳离子化的运输（吸附性介导运输或AMT）。

脂质或亲脂性基团的加入使亲水性分子能够化学转化成更大疏水性分子，尤其是通过前药方法。然而，这样的化合物的合成导致产生超过越过BHE的最佳运输阈值的分子，尤其是关于变得大于450道尔顿的最佳限的分子量(Pajouhesh et al.,2005,NeuroRx,2(4),541-553)。由于相同原因，脂质体或甚至更小囊泡（胶团等）或纳米粒子（纳米球，纳米胶囊）通常太大，对于BHE不是足够特异性的，并因此对于越过BHE的治疗关注的运输分子(或成像剂或诊断剂，或者任何其他分子如分子探针)是相对较不有效的(Levin,1980,J.Med.Chem.,23,682-684;Schackert et al.,1989,Selective Cancer Ther.,5,73-79)。此外，这种类型的囊泡系统在大脑中通常具有不可忽视的毒性作用。因此，由脂质化技术遇到的主要问题是，相比于其他细胞膜，它们对于特异性地靶向和越过BHE的低特异性，在药物曲线下方的面积(ASC)的血浆值下降，以及它们对于小分子的矢量化的通常受限的用途。

在AMT方法(经由药物的共价键接或直接阳离子化加入阳离子基团)中，主要遇到的问题是用于特异性地靶向和越过BHE的低特异性（相比于其他细胞膜）。实际上，AMT基于吸附在细胞膜带负电荷的细胞上的阳离子分子，这是对于大多数细胞的情形。药物ASC的血浆值降低、它们对于小分子矢量化的通常受限用途以及它们的细胞毒性是使AMT矢量化方法不利的额外因素。

用于矢量化的生理学方法

基于用于矢量化的生理学方法的策略在于开发BHE的各种天然运输机制。分子主动运输越过BHE的这些机制经由与特异性受体底物的偶联或通过用特异性受体底物的分子模拟（载体介导的运输或CMT）、或者经由与特异性地靶向受体的偶联或融合（受体介导的运输或RMT）进行工作。

作为一个实例，分子如L-DOPA(帕金森病)、美法仑（melphalan）(脑癌)、α-甲基-DOPA(动脉高血压)和加巴喷丁（gabapentin）(癫痫)经由大的中性氨基酸转运蛋白1和2（LAT1和LAT2）通过CMT进入脑中(Pardridge,2003,Mol.Interv.,3,90-105)。这些分子具有与苯丙氨酸（LAT1的天然底物之一）接近的结构。然而，由CMT方法遇到的主要问题是它们对于密切模仿/模拟内源性受体/转运蛋白的底物的轭合物的宽选择性/特异性，以及相应地它们受限的用于矢量化小分子的用途。

RMT访问受体依赖性运输系统。矢量化通过靶向脑毛细血管中存在的内源性受体/转运蛋白而经由胞吞作用机制进行。RMT中涉及的各种人BHE受体的显著实例包括：转铁蛋白受体(TfR)，胰岛素受体(IR)，低密度脂蛋白(LDL)受体，其能够进行胆固醇传输，包括LDL受体(LDLR)以及低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)家族的成员，或胰岛素样生长因子受体(IGFR)，白喉毒素受体(DTR)或肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)，以及清除剂受体(SCAV-Rs)，包括清除剂B类I型(SR-BI)。在RMT中，BHE内皮细胞的膜上的受体结合它们的配体，其导致产生在囊泡中的由受体/转运蛋白和其配体构成的复合物的胞吞作用，该复合物在细胞表面上形成，然后穿透BHE内皮细胞。该配体/受体复合物可以穿过内皮细胞（转胞吞作用），并因此相应地可以越过BHE而在神经组织中起作用。这个RMT过程不依赖于通过胞吞作用吞没的分子的大小。因此，RMT是能够将分子如胰岛素、铁转运蛋白、胆固醇、各种肽衍生物和蛋白等从血液运输到脑的机制。例如，转铁蛋白用作在BHE上存在的TfR的配体载体(Jefferies et al.,1984,Nature,312,162-163;Friden et al.,1983,Science,259,373-377;Friden,1994,Neurosurgery,35,294-298)，并且要运输的分子（活性物质）与转铁蛋白（配体载体）偶联。尽管使用大分子的这种矢量化测量能够增大关注的轭合物分子通过BHE，但是它具有若干缺点。首先，分子通常通过基因表达方法（融合）偶联于载体，由此将要运输的分子的数量仅局限于多肽或蛋白。其次，用于分子与载体偶联的系统相当复杂；传统的化学或生物化学偶联从结构和分子角度看不会生成良好定义的大分子系统。此外，轭合物和内源性配体对于受体的潜在竞争可能导致RMT的生理学过程的抑制或者导致用于脑正确发挥作用所需的内源性配体的浓度降低。RMT受体涉及大脑中的细胞信号转导过程并且轭合物可能潜在地干扰这些过程。

国际专利申请WO2010/046588第一次描述了结合人LDLR并且能够越过BHE运载可以是大重量和/或体积的物质的肽或假肽。

本申请涉及结合人LDLR，优化用于分子运输的新型肽。

发明内容

本发明提供能够越过细胞膜，并且更具体地越过BHE传输可以为大重量和/或体积的优化肽或类肽。因此本发明使得有可能改善关注分子的生物分布或生物利用度，并且尤其是改善它们对SNC的访问（靶向）。

在申请WO2010/046588中，本发明的发明人已开发了能够结合人LDLR的肽衍生物。本发明的发明人已证实，这些衍生物能够越过BHE。本发明的发明人还证实，这些衍生物能够在BHE细胞中运输治疗或诊断关注分子。

继续他们的研究，本发明的发明人成功设计和测试了对于分子运输表现出有利性质的新型肽。这些新型肽，能够在没有与天然配体竞争下结合LDLR，并因此不干扰内源性LDL的运输，代表对于设计和矢量化诊断或成像药物或药剂特别有利，尤其是到达SNC的新型产品。

因此本发明的一个目的是一种肽或类肽，其特征在于，其具有以下通式(I)：

A1-Met-A2-Arg-Leu-Arg-A3-Cys (I)

其中A1表示半胱氨酸或其类似物或其电子等排体，A2表示脯氨酸或其类似物或其等排体，并且A3表示甘氨酸或其类似物或其电子等排体。

根据优选的实施方式，A1表示半胱氨酸(Cys)或其选自(D)-半胱氨酸、青霉胺(Pen)和(D)-青霉胺((D)-pen)的类似物；A2表示脯氨酸(Pro)或其选自哌啶酸(Pip)和噻唑烷-4-甲酸(Thz)的类似物；和/或A3表示甘氨酸(Gly)或肌氨酸(Sar)。

本发明的一个优选目的是以下通式(I′)的肽或类肽：

A1-Met-A2-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys (I′)

其中A1表示半胱氨酸或其优选地选自(D)-cys、Pen和(D)-pen的类似物；并且A2表示脯氨酸或其优选地选自Pip和Thz的类似物。

本发明的另一个特定目的是以下通式(I″)的肽或类肽：

A1-Met-A2-Arg-Leu-Arg-Ala-Cys (I″)

其中A1表示半胱氨酸或其优选地选自(D)-cys、Pen和(D)-Pen的类似物；并且A2表示脯氨酸或其优选地选自Pip和Thz的类似物。丙氨酸(Ala)可以是L或D构型。

本发明的肽有利地具有以高亲和力结合人LDL受体(hLDLR)的能力。此外，它们小，典型地少于10个氨基酸，这是特别有利的。这样的肽的特定实例是序列SEQ ID NO：1至10的肽。

本发明的另一个目的涉及诸如以上定义的肽或类肽的用途，用于制备药物或诊断组合物以矢量化活性物质或诊断、成像或治疗关注物质。

本发明的另一个目的涉及诸如以上定义的肽或类肽的用途，用于增大其偶联的活性物质或关注物质的生物学活性或用于降低它们的毒性。

本发明的另一个目的涉及诸如以上定义的肽或类肽，用于矢量化活性物质或诊断、成像或治疗关注物质。

本发明的另一个目的涉及诸如以上定义的肽或类肽，用于增大其偶联的活性物质或关注物质的生物学活性或降低它们的毒性。

本发明的另一个目的涉及下式(II)的任何轭合化合物：

VxDy(II)

其中V表示诸如以上定义的肽或类肽，D表示活性物质或关注物质，并且x和y是1至5的整数。

本发明还涉及下式(III)的任何轭合化合物：

VxLzDy(III)

其中V表示诸如以上定义的肽或类肽，L表示间隔物，D表示活性物质或关注物质，x和y是1至5的整数并且z是1至10的整数。

本发明的另一个目的涉及一种药物组合物，其含有至少一种诸如以上定义的轭合化合物和一种或多种药用赋形剂。

本发明的另一个目的涉及一种诊断组合物，其特征在于，它含有由诸如以上定义的轭合化合物构成的医疗诊断或成像剂。

本发明的另一个目的涉及一种用于改善或实现分子越过BHE的通过的方法，包括所述分子与诸如以上定义的肽或类肽的偶联。

本发明的另一个目的是一种用药物治疗对象的病状的改进方法，所述改进在于所述药物与诸如以上定义的肽或类肽偶联。

本发明可以用于任何哺乳动物，尤其是任何人类。

附图说明

图1

示出了天然或药理学分子通过BHE的的各种模式的图示，其从Abbottand Romero,1996,Mol.Med.Today,2(3),106-113改编。

图2

治疗关注轭合物的载体/分子的直接连接合成和经由连接物的合成的图示。

图3

A–用于克隆hLDLR mLDLR的质粒的图示。

B–表示通过转染细胞表达的融合蛋白的图示。

图4

在构成性地表达hLDLR-GFP或GFP(对照)融合蛋白的CHO细胞系上实施的蛋白质印迹。对应于hLDLR-GFP融合蛋白的大小的190kDa带用抗-hLDLR抗体进行检测。

图5

在非可渗透化的CHO细胞上的免疫细胞化学，该CHO下拨稳定地表达A–单独的GFP(对照)或B–hLDLR-GFP构建。细胞核用Hoechst(蓝色，A1和B1)染色。GFP荧光以绿色(A2和B2)可见，通过抗-hLDLR抗体的hLDLR的细胞外结构域的染色的GFP荧光以红色（A3和B3）可见，并且红色和绿色染色的叠加以黄色/橙色(A4和B4)可见。注意到仅有用hLDLR-GFP构建体稳定地转染的细胞表达膜受体(B3)。

图6

A–表达hLDLR-GFP（绿色）的CHO-hLDLR-GFP细胞系的细胞用DiI-LDL（红色）孵育，红色和绿色染色的叠加以黄色/橙色可见：注意到细胞的强染色。

B–表达hTfR-GFP（绿色）的CHO-TfR-GFP细胞系的细胞用DiI-LDL（红色）孵育：没有DiI-LDL结合和胞吞作用。

C–表达hLDLR-GFP（绿色）的CHO-hLDLR-GFP细胞系的细胞用偶联至德克萨斯红（红色）的转铁蛋白孵育：没有Tf配体结合和胞吞作用。

注意到一方面在A，和另一方面B和C之间的染色的强度差异，其中仅有与GFP融合的hTfr和hLDLR受体的染色被检测到。

图7

合成肽与罗丹明或S-Tag轭合的通用方案，具有C-末端(C-term)间隔物。

具体实施方式

本发明涉及能够结合人LDLR的肽衍生物及其在医药品领域的用途，尤其是在BHE细胞中运输治疗或诊断关注的分子。

人LDLR是839个氨基酸的跨膜蛋白，其包含三个区域：细胞区域(1-768)，跨膜区域(768-790)和胞质区(790-839)。细胞外区域被分成两个子区域：LDL结合的区域(1-322)和LDL结合区域外部的区域(322-768)(参见WO2007/014992)。

脑对于LDL具有极大需要以正确地发挥功能。LDLR的天然配体是LDL并且更具体地是LDL粒子的载脂蛋白B(ApoB)和载脂蛋白E(ApoE)组分，其由此能够运输这些粒子中含有的胆固醇越过细胞膜并且更特别地越过BHE。

因此已经证实，LDLR能够经由RMT过程，在阻止与溶酶体融合的特异性内体囊泡中，实现LDL粒子越过BHE的转胞吞作用(Dehouck et al.,1997,J.Cell Biol.,138(4),877-889)。已经通过转胞吞作用越过BHE的这些脂蛋白，随后被神经元和/或星形胶质细胞吸收(Spencer et al.,2007,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,104(18),7594-7599)。这种性质被用来通过其上轭合了完整载脂蛋白（LDL组分）的纳米粒子而矢量化治疗关注的分子(Kreuter et al.,2007,J.Control.Release,118,54-58)。然而，在这个研究中，使用了完整载脂蛋白，并且以偶联于纳米粒子的形式以模拟LDL粒子结构。

国际专利申请No WO2010/046588第一次描述了结合人LDLR并且能够越过BHE运送可以是大重量和/或体积的物质的肽或类肽。

本申请涉及结合人LDLR的新型肽，优化用于分子的运输。肽或类肽载体可以容易地化学合成，并且大多数治疗关注分子或成像剂或诊断剂，两个实体经由间隔物（经由连接物的合成）或者通过直接偶联（直接连接的合成）通过前药策略可以简单地且有效地与肽或类肽载体偶联（图2）。本发明的肽和类肽被设计成采用环状构型，由此更大地抵抗蛋白水解。此外，本发明的肽和类肽在与天然配体没有竞争下结合LDLR。

本发明的肽或类肽可以用作在神经病状、以及脑或其他组织的传染性或癌性病状的治疗、成像和/或诊断中的用于治疗关注的分子、或用于成像或诊断剂、或用于任何其他分子如分子探针的载体。

本发明中描述的肽或类肽具有靶向细胞受体/转运蛋白和特定细胞型和/或越过细胞膜，尤其是脑的生理学屏障的那些膜并且更特别地是BHE或血视网膜屏障（BRB）的能力。

本发明中描述的肽或类肽具有靶向细胞受体/转运蛋白和特定细胞型，尤其是癌细胞、神经或非神经组织和/或越过细胞膜，尤其是SNC的生理学屏障的那些细胞膜，并且更特别地是神经组织肿瘤的血肿瘤屏障（BTB）的能力。

本发明中描述的肽或类肽具有靶向细胞受体/转运蛋白和特定细胞型和/或越过细胞膜，尤其是SNC的生理学屏障的那些膜，以更特别地治疗细菌、寄生物或真菌性质的传染性脑病状或其他病状的能力。

本发明中描述的肽或类肽具有结合至细胞膜的鼠或人LDLR并且通过转胞吞作用经由这种受体越过前述膜的能力。

本发明中描述的肽或类肽具有在鼠和人脑的生理屏障的细胞膜表面处结合至LDLR以及通过RMT经由LDLR越过前述生理屏障的能力。

因此，本发明的一个目的涉及肽或类肽，其特征在于，它们具有以下通式(I)：

A1-Met-A2-Arg-Leu-Arg-A3-Cys (I)

其中：

-A1表示半胱氨酸或其类似物或其电子等排体，

-A2表示脯氨酸或其类似物或其电子等排体，并且

-A3表示甘氨酸或其类似物或其电子等排体，

更特别地，基团A1表示残基，该残基选自D或L构型的半胱氨酸(Cys,C)、或其选自2-氨基-3-巯基丙酸和其S-取代衍生物、S-乙酰基半胱氨酸或2-氨基-3-(乙酰硫基)丙酸、硒基半胱氨酸(Sec,U)或2-氨基-3-(硒基)丙酸、半胱氨醇、3-巯基丙酸(Mpa)或青霉胺(Pen)（为L或D构型）的衍生物。

基团A2更优先地表示选自以下的残基：脯氨酸(Pro,P)或吡咯烷-2-甲酸、高脯氨酸或2-(2-吡咯烷基)乙酸、3-羟基脯氨酸(3Hyp)、4-羟基脯氨酸(4Hyp)、3-甲基脯氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、3,4-甲醇基脯氨酸、4-氨基脯氨酸、4-氧代脯氨酸、硫代脯氨酸或噻唑烷-4-甲酸(Thz)、2-氧代噻唑烷-4-甲酸、二氢吲哚-2-甲酸(Idc)、哌啶酸(Pip)或哌啶-2-甲酸、哌啶酸(Nip)或哌啶-3-甲酸、4-氧代哌可酸、4-羟基哌可酸、氨基-1-环己烷甲酸、脯氨醇。

在一个优选实施方式中，基团A2选自脯氨酸、哌啶酸(Pip)或噻唑烷-4-甲酸(Thz)。

基团A3更优先地表示选自以下的残基：甘氨酸(Gly,G)或2-氨基乙酸、肌氨酸(Sar)或N-甲基甘氨酸(MeGly)、N-乙基甘氨酸(EtGly)、烯丙基甘氨酸(allylGly)或2-氨基戊-4-烯酸、2-环戊基甘氨酸(Cpg)、2-环己基甘氨酸(Chg)、2,2-二丙基甘氨酸(Dpg)、2-(3-吲哚基)甘氨酸(IndGly)、2-茚满基甘氨酸(Igl)、2-新戊基甘氨酸(NptGly)、2-辛基甘氨酸(OctGly)、2-炔丙基甘氨酸(Pra)或2-氨基戊-4-炔酸、2-苯基甘氨酸(Phg)、2-(4-氯苯基)甘氨酸、氮杂甘氨酸(AzGly)、或甘氨醇或2-氨基乙醇。

在一个优选实施方式中，基团A3选自甘氨酸和肌氨酸。

在式(I)的肽或类肽中，特别优选的是其中基团A3的甘氨酸的肽。因此，本发明的一个特定目的涉及下式(I′)的肽：

A1-Met-A2-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys (I′)

其中A1表示半胱氨酸或其类似物或其电子等排体，优选地A1表示Cys、(D)-cys、Pen或(D)-Pen；并且A2表示脯氨酸类似物，优选地A2表示Pip或Thz。

根据本发明的肽的特定实例描述如下：

SEQ ID NO:1,(D)-cys-Met-Pip-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO:2,(D)-pen-Met-Pip-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO:3,Pen-Met-Pip-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO:4,(D)-cys-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO:5,(D)-pen-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO:6,Pen-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO:7,(D)-cys-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Sar-Cys;

SEQ ID NO:8,(D)-pen-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Sar-Cys;

SEQ ID NO:9,Pen-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Sar-Cys;

SEQ ID NO:10,(D)-cys-Met-Pro-Arg-Leu-Arg-(D)-ala-Cys。

由申请人获得的结果证实，本发明的肽对于LDLR具有改善的亲和力。因此，相比于对照肽SEQ ID NO:17，测试的所有式(I)的肽表现出改善的亲和力，如在表1（实施例III）中看到的。这些结果作为序列中的其他残基的修饰都是更显著的，例如精氨酸残基的替代，导致亲和力的显著下降（参见对照肽SEQ ID NO:11-16）。

SEQ ID NO:11,(D)-Cys-Met-Pro-hArg-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO:12,(D)-Cys-Met-Pro-Agb-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO:13,(D)-Cys-Met-Pro-Agp-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO:14,(D)-Cys-Met-Pro-Cit-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO:15,(D)-Cys-Met-Pro-Arg-Leu-Cit-Gly-Cys;

SEQ ID NO:16,(D)-Cys-Met-Pro-Arg-Leu-Arg(NO2)-Gly-Cys;

SEQ ID NO:17,(D)-Cys-Met-Pro-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys。

考虑到肽的小尺寸（上述肽含有8个氨基酸），这些结果也是特别显著的，其构成它们工业用途中的另外优点。

如上指出的，本发明的环状肽或类肽可以包含肽、非肽和/或修饰肽键。在一个优选实施方式中，所述肽或类肽包含至少一个拟肽键，优选地选自插入的亚甲基(-CH₂-)或磷酸根(-PO₂-)基团、仲胺(-NH-)或氧(-O-)、α-氮杂肽、α-烷基肽、N-烷基肽、氨基膦、缩酚酸肽、羟基亚甲基、羟基亚乙基、二羟基亚乙基、羟基乙胺、逆反肽、亚甲基氧基、乙酰亚甲基、酯类、亚膦酸酯、次膦酸、膦酰胺和卡巴类似物。

此外，在一个特别实施方式中，本发明的肽或类肽包含例如分别通过酰基化、或酰胺化或酯化保护的N-term和/或C-term官能团。

本发明的肽或类肽可以通过本领域技术人员已知的任何技术（化学、生物学或遗传学合成等）合成。它们可以原样保存或者在关注物质或任何可接受的赋形剂存在下进行配制。

对于化学合成，使用商业设备，其可以整合天然以及非天然氨基酸如D对映体和带有侧链的残基（具有不同于它们的天然同源物的疏水性和空间障碍）（所谓的外源的，即非编码的氨基酸），或含有一个或多个可以尤其包括插入的亚甲基(-CH₂-)或磷酸根(-PO₂-)基团、仲胺(-NH-)或氧(-O-)或N-烷基肽的拟肽键的肽序列。

在何处期间，可以引入各种化学修饰，例如在N-term或C-term位置或在侧链上放置脂质(或磷脂)衍生物或脂质体或纳米粒子的组分，以便能够将本发明的肽或类肽整合到脂质膜内，如由一个或多个脂质层或双层构成的脂质体的脂质膜或纳米粒子的脂质膜。

本发明的肽或其蛋白质部分也可以获自编码其的核酸序列。本发明还涉及核酸分子，其包含编码如上定义的肽的核酸序列或由其构成。更特别地，本发明涉及核酸分子，其包含至少一个编码通式(I)的肽的序列。这些核酸序列可以是DNA或RNA并且可以与对照序列合并和/或插入到生物学表达载体中。

使用的生物学表达载体是根据其中它将要转入的宿主进行选择。它可以例如是质粒、粘粒、病毒等。本发明尤其涉及这些核酸和生物学表达载体，其可以用来在宿主细胞中产生本发明的肽，或其蛋白质部分。这些生物学表达载体可以制备并且肽可以通过本领域技术人员熟知的分子生物学和遗传工程技术在宿主中产生或表达。

本发明的另一个目的涉及如以上定义的环状肽或类肽的用途，作为用于治疗关注分子、或成像剂或诊断剂、或任何其他分子的转移/运输。

本发明还涉及如以上定义的环状肽或类肽的用途，用于制备能够越过BHE的。

本发明还涉及一种用于实现或改善分子越过BHE的通过的方法，包括将该分子偶联于本发明的肽或类肽。

因此，本发明尤其涉及如下的式(II)的轭合化合物：

VxDy (II)

其中V表示本发明的肽或类肽，D表示活性物质或关注物质，并且x和y是1至5的整数。在一个特别实施方式中，x和y等于1，x大于y，或y大于x。

本发明还涉及以下的式(III)的轭合化合物：

VxLzDy (III)

其中V表示本发明的肽或类肽，L表示间隔物，D表示活性物质或关注物质，x和y是1至5的整数，并且z是1至10的整数。在一个特定实施方式中，x=z=y=1或x=z>y或y=z>x或z>x>y。

活性物质或关注物质可以是制药关注的任何分子，尤其是治疗、诊断或医疗成像剂，或分子探针。它可以尤其是生物学关注的任何化学实体如小化学分子（抗生素，抗病毒剂，免疫调节剂，抗肿瘤药，抗炎剂等）、肽或多肽、蛋白(酶，激素，细胞因子，载脂蛋白，生长因子，抗原，抗体或抗体部分)、核酸（人、病毒、动物、真核或原核生物、植物或合成起源等的核糖核酸或脱氧核糖核酸，其大小的范围可以为简单寡核苷酸的尺寸至基因组或基因组片段的尺寸）、病毒基因组或质粒、核糖酶、标记物或示踪剂。一般地，“关注物质”可以是任何药物活性成分，无论是化学、生物化学、天然或合成的化合物。表述“小化学分子”是指最大分子量为1000道尔顿，通常为300道尔顿至700道尔顿的最大分子量的制药关注分子。

本发明还涉及下式(IV)的化合物：

VxLz (IV)

其中V表示本发明的肽或类肽，L表示间隔物，x是1至5的整数，并且z是1至10的整数。在一个特别实施方式中，x=z=1或z>x。

在本发明的轭合化合物中，V和D之间、或一方面V和L另一方面L和D之间的偶联可以通过任何可接受的成键方式进行，考虑到相关活性物质和肽或类肽的化学性质、阻碍和数量。因此偶联可以通过在生理学介质或细胞内可裂解或不可裂解的一个或多个共价键、离子键、氢键、疏水或范德华键进行。此外，如果需要经由L，在V的各种反应基团处，并且尤其在一个或多个N-term和/或C-term端处和/或在由V的天然或非天然氨基酸侧链组分带有的一个或多个反应基团处，D可以与V偶联。

偶联可以在其中天然存在或已经引入官能团如-OH、-SH、-CO₂H、-NH₂、-SO₃H或-PO₂H的肽或类肽的任何位点处进行。因此，关注的治疗分子、或诊断（或医疗成像）剂或任何其他分子如分子探针可以在N-term或C-term端处、或者由这个肽序列的天然或非天然氨基酸链带有的反应基团处通过共价键连接（偶联）于肽或类肽载体。

类似地，偶联可以在其中例如天然存在或已经引入官能团如-OH、-SH、-CO₂H、-NH₂、-SO₃H或-PO₂H的官能团的活性物质或关注物质（治疗关注分子、诊断或医疗成像剂、任何其他分子如分子探针）的任何位点处进行。

优选相互作用足够强以使肽在到达其作用位点之前不会从活性物质离解。为此，本发明优选的偶联是共价偶联，然而，但可以使用非共价偶联关注物质可以在这些末端之一（N-term或C-term）处、或在序列的组分氨基酸之一的侧链处直接与肽偶联（直接合成）(Majumdar and Siahaan,Med ResRev.,Epub ahead of print)。关注物质也可以在肽的末端之一处、或在序列的组成氨基酸之一的侧链处，借助于连接物或间隔物间接地进行偶联（图2）。经过间隔物或不经过间隔物的共价化学偶联方式包括选自双或多官能剂的那些，该官能剂含有烷基、芳基或肽基团（通过酯类、醛类或烷基或芳基酸类、酸酐）、巯基或羧基、衍生自溴化氰或氯化氰的基团、羰基二咪唑、琥珀酰亚胺酯类或磺酰卤类。

在这方面，本发明还涉及一种用于制备如上定义的轭合化合物的方法，其特征在于，它包括肽或类肽V和底物D之间的偶联的步骤，如果需要经由L，优选地通过化学、生物化学或酶促路径，或通过遗传工程。

本发明还涉及一种药物组合物，其特征在于，它包含至少一种如上定义的轭合化合物和一种或多种药用赋形剂。

本发明还涉及一种诊断组合物，其特征在于，它包含由如上定义的轭合化合物构成的诊断或医疗成像剂。

所述轭合物可以以任何药用盐形式使用。表述“药用盐”例如并且以非限制性方式是指药用碱或酸加成盐、水合物、酯类、溶剂化物、前体、代谢物或立体异构体，所述载体或轭合物加载有至少一种关注物质。

表述“药用盐”是指无毒盐类，其通常可以通过使游离碱与核实有机或无机酸反应制备。这些盐保持游离碱的生物学效力和性质。这样的盐的代表性实例包括水溶性和水不溶性盐如乙酸盐、N-甲基葡糖胺铵、amsonates(4,4-二氨基芪-2,2’-二磺酸盐)、苯磺酸盐。苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、氢溴酸盐、溴化物、丁酸盐、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氢氯酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克克拉维酸盐、二盐酸盐、二磷酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二胺四乙酸钙、乙二磺酸盐、依托酸盐(estolate)、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、glycolylarsanylate、六氟磷酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明(hydrabamine)、羟基萘甲酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘液酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、3-羟基-2-萘甲酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、(1,1-亚甲基-双-2-羟基-3-萘甲酸盐或emboate)、泛酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、磺基水杨酸盐、suramate、单宁酸盐、酒石酸盐、8-氯茶碱盐、甲苯磺酸盐、三乙碘化物(triethiodide)、三氟乙酸盐和戊酸盐。

本发明的组合物有利地包含药用载体或赋形剂。药用载体可以选自根据各种给药模式典型使用的载体。根据考虑的给药模式，所述化合物可以为固体、半固体或液体形式。对于固体组合物如片剂、丸剂、粉剂或游离的后包含在明胶胶囊中的粒剂，活性物质可以与以下组合物：a)稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如，硅土、滑石、硬脂酸、其镁或钙盐和/或聚乙二醇；c)粘合剂，例如，硅酸镁或硅酸铝，淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、褐藻酸或其钠盐，或泡腾混合物；和/或d)吸附剂、染料、香味剂和甜味剂。赋形剂可以例如是甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁和药物质量的类似物。丢半固体组合物如栓剂，赋形剂可以例如是乳剂或油性混悬剂，或聚亚烷二醇类如聚丙二醇。液体组合物，尤其是注射剂或包含在软胶囊中的那些，可以例如通过将活性物质溶解、分散等在药物纯溶剂例如水、生理盐水溶液、水性右旋糖、甘油、乙醇、油及其类似物。

本发明的组合物或轭合物可以通过任何合适途径给药，并且以非限制性方式，通过胃肠外途径，例如以可以通过皮下、静脉内或肌肉内途径注射的制剂形式；通过经口途径（或口服），例如以包衣或未包衣片剂、明胶胶囊、粉剂、颗粒剂、混悬剂或口服溶液的形式（用于经口给药的一种这样的形式可以是以立即释放或以延长或延迟释放）；通过直肠途径例如以栓剂形式；通过局部途径，尤其通过透皮途径，例如以贴剂、香膏或凝胶剂；通过鼻内途径例如以气溶胶和喷雾形式；通过经舌途径；或通过眼内途径。

所述药物组合典型地包含有效剂量的本发明的肽或类肽或轭合物。如本文描述的“治疗有效量”是指对于给定病症和给药日程获得治疗效果的剂量。其典型地是给药以相当大地改善与疾病或病理状态相关的症状的一部分的活性物质的平均剂量。例如，在治疗脑或其他组织的癌症、SNC的病状、病变或病症中，降低、防止、延迟、消除或终止所述疾病或病症的病因或症状之一的活性物质的剂量将是治疗有效的。

活性物质的“治疗有效剂量”不是必需地治愈疾病或病症，而是提供对于该疾病或病症的治疗以使其出现被延迟、阻止或防止，或其症状被减弱，或其期间被改变，或者例如是不严重，或者患者的恢复被加速。

应理解，对于特定人的“治疗有效剂量”将依赖于各种因素，包括活性物质的活性/效力、其给药时间、其给药途径、其消除速度或其代谢、药物组合/相互作用和基于预防或治愈进行治疗的疾病（或病症）的严重度，以及患者的年龄、体重、总体健康、性别和/或饮食。

取决于偶联的物质，本发明的轭合物和组合物可以用于治疗、预防、诊断或成像各种病状，尤其是影响SNC、传染病或癌症的病状。

在这方面，本发明涉及如上所述的药物轭合物或组合物的用途，用于治疗或预防SNC病状或病症、脑肿瘤或其他癌细胞，以及脑或其他组织的细菌、病毒、寄生虫或真菌传染病。

本发明还涉及如上所述的药物轭合物或组合物的用途，用于诊断或成像SNC病状或病症、脑肿瘤或其他癌细胞，以及脑或其他组织的细菌、病毒、寄生虫或真菌传染病。

本发明还涉及如上所述的药物轭合物或组合物的用途，用于治疗、成像和/或诊断脑肿瘤或其他类型的癌细胞。研究实际上已经表明，患有某些癌症的患者具有低胆固醇血症。这种低胆固醇血症是胆固醇被癌细胞过度利用的结果。后者存活诱导具有肿瘤的器官内的LDLR表达水平增高(Henricksson etal.,1989,Lancet,2(8673),1178-1180)。因此在通过细胞的LDLR表达水平的增高和某些癌症之间存在关联。最近还已表明，LDLR的数量在某些病态细胞如癌细胞的表面上非常高。通常接受的是1000至3000个LDLR存在于非病态细胞的表面。类似地，非病态神经元仅具有很少的LDLR(Pitas et al.,1987,J.Biol.Chem.,262,14352-14360)。在胶质母细胞瘤的情况下，已经表明了LDLR过表达。因此，在脑肿瘤细胞的表面上，已经计数了125,000(对于U-251细胞)至900,000个(对于SF-767细胞)LDLR(Malentiska et al.,2000,Cancer Res.,60,2300-2303;Nikanjam et al.,2007,Int.J.Pharm.,328,86-94)。还应注意，许多肿瘤细胞过表达LDLR，如前列腺癌细胞(Chen et al.,2001,Int.J.Cancer,91,41-45)、结肠癌(Niendorf et al.,1995,Int.J.Cancer,61,461-464)、白血病(Tatidis et al.,2002,Biochem.Pharmacol.,63,2169-2180)、结肠直肠癌(Caruso et al.,2001,Anticancer Res.,21,429-433)、乳腺癌(Graziani et al.,2002,Gynecol.Oncol.,85,493-497)、以及肝、胰腺、卵巢、肺和胃等的癌症的那些。

本发明还涉及如上所述的轭合物或组合物的用途，用于治疗、成像和/或诊断脑或其他组织的细菌、病毒、寄生虫或真菌传染病，例如并且以非限制性方式SIDA或脑膜炎等。LDLR还存在于肝细胞上。现在知晓丙肝病毒(HCV)的胞吞作用可以经由LDLR发生。LDLR可以在人肝细胞被HCV感染的早期用作病毒受体(Molina et al.,2007,J.Hepatol.,46(3),411-419)。本发明的轭合物由此可以用来特异性地靶向病态细胞，其被表达LDLR的病毒如乙肝或丙肝的病毒和/或经由LDLR调节健康细胞的病毒感染过程。

本发明还涉及如上所述的轭合物或组合物的用途，用于治疗、成像和/或诊断神经变性病，例如以非限制性方式的阿尔茨海默病、帕金森病、克雅氏病、脑血管意外(AVC)、牛海绵状脑病、肌萎缩侧索硬化等。

本发明还涉及如上所述的轭合物或组合物的用途，用于治疗、成像和/或诊断神经疾病，例如以非限制性方式的癫痫、偏头痛、脑炎、SNC痛等。

本发明还涉及如上所述的轭合物或组合物的用途，用于治疗、成像和/或诊断神经精神病例如以非限制性方式的抑郁、自闭症、焦虑症、精神分裂症等。

术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”和其他类似表达是指获得药理学和/或生理学效果，例如抑制癌细胞生长、癌细胞死亡或改善疾病或神经病。效果可以是预防性或阻止性的以便完全或部分地防止疾病或这样的疾病的症状在病人中恶化，或其在健康对象中的传播，和/或可以是治疗性的以便完全或部分地治疗治疗疾病和/或其相关有害作用。如在本申请文件中使用的术语“治疗”覆盖哺乳动物，并且更特别地是人中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)在易感疾病或病症但还没有主动诊断的人中可能出现的这种疾病或病症的预防（例如预防癌症），(b)减慢疾病（例如，通过停止其形成），或(c)缓解疾病（例如，通过减少与疾病相关的症状）。这个术语“治疗”还覆盖活性物质的任何给药以便注意、治愈、释放、改善、降低或抑制个体或患者中的疾病，包括但不限于向需要由本申请文件中描述的载体或轭合物构成的药物的人给药。

本发明还涉及本发明的肽或类肽的用途，用于增大其偶联的活性物质或关注物质（关注的治疗分子、诊断或医疗成像剂，或任何其他分子如分子探针）的生物学活性。

本发明还涉及本发明的肽或类肽的用途，用于降低其偶联的活性物质或关注物质（关注的治疗分子、诊断或医疗成像剂，或任何其他分子如分子探针）的毒性。

本发明的其他方面和优点在考虑以下实施例后将变得明显，这些实施例仅是举例说明性的并且其不限制本申请的范围。

实施例

实施例I

稳定表达人和鼠类LDLR的CHO细胞系的构建

本发明的发明人基于它们与人和鼠类低密度脂蛋白受体(hLDLR和mLDLR)的相互作用和对它们的亲和力鉴定了肽，其尤其涉及胆固醇的胞吞作用和转胞吞作用（跨细胞运输，尤其是越过BHE）。表征这些肽的前提是在组成地且以高速率表达hLDLR和mLDLR的稳定细胞系的真核细胞（中华仓鼠卵巢细胞，CHO）中建立。这些细胞系用于：I）结合在细胞表面处表达的hLDLR的肽的表征，以其天然构型；II)验证hLDLR和mLDLR可以通过胞吞作用内化所选的肽。

这些细胞系的构建已描述于申请WO2010/046588。简言之，编码hLDLR和mLDLR的信使RNA序列在数据库中可获得(登录号分别为：NM_000527和NM_010700)。选择对于通过PCR的cDNA扩增所需的引物，在它们的末端（黑体）处包含对于在pEGFP-N1表达载体（Clontech）中进行克隆所需的限制位点(对于人LDLR的HindIII和SalI，以及对于鼠类LDLR的HindIII和KpnI)：

hLDLR

正向引物：ATATATAAGCTTCGAGGACACAGCAGGTCGTGAT(SEQID NO:18)

反向引物：TTAATTGTCGACCACGCCACGTCATCCTCCAGACT(SEQID NO:19)

mLDLR

正向引物：ATATATAAGCTTGACGCAACGCAGAAGCTAAG(SEQ IDNO:20)

反向引物：TTAATTGGTACCGTTGCCACATCGTCCTCCAG(SEQ IDNO:21)

制备自人和鼠脑的总RNA通过逆转录转化成cDNA，用于编码hLDLR和mLDLR的DNA片段的PCR扩增。在扩增后，该PCR产物分别通过HindIII-SalI和HindIII-KpnI限制酶消化，并连接在pEGFP-N1表达载体(Clontech)中，通过相同限制酶消化。在真核细胞中转染后，这种载体在CMV启动子控制下能够表达在它们的C-term端，即在它们的细胞内结构域的末端处与GFP融合的LDLR（图3）。在转化竞争性大肠杆菌DH5a细菌，获得分离的菌落并制备质粒DNA后，构建体的两条链以它们的整体进行测序用于验证。

实施各种细胞系(CHO,COS,N2A和HEK293)中的暂时转染以在活细胞或固定细胞上确定hLDLR和mLDLR的表达水平和膜位置。借助于在受体C-term处融合的GFP发出的绿色荧光，在荧光显微镜下，无需免疫染色，这些受体在活细胞上直接可见。稳定的转染子通过有限稀释和通过由表达载体携带的遗传霉素抗性基因(G418)进行选择。这些细胞系在维持选择性压力的同时进行扩增。在这里叙述的实施例中，预期大小的hLDLR-GFP的表达通过用针对人LDLR和针对GFP的抗体在细胞溶解产物上的蛋白质印迹进行验证。对应于GFP和hLDLR的组合大小(190kDa)的蛋白通过制备自稳定细胞系的细胞提取物中的抗-hLDLR（图4）和抗-GFP抗体识别。组成地表达GFP的CHO细胞系用作阴性对照。抗-hLDLR抗体不检测GFP细胞系中的蛋白。

用在CHO-GFP（对照）和CHO-hLDLR-GFP细胞系的固定(PFA)细胞上的抗-hLDLR抗体的免疫细胞化学表明，hLDLR-GFP融合体在转让细胞中良好表达。在有Triton X100的非可渗透化细胞上的免疫细胞化学实验表明，LDLR的胞外结构域在胞外水平下被良好检测（图5）。

示出了hLDLR和其天然配体LDL的共定位，通过吸附Dil（一种荧光标记物）形成荧光。这种天然荧光配体(DiI-LDL)快速地被内化（胞吞作用），如在固定细胞上的荧光显微镜下可视化的（图6-A）。相反，DiI-LDL不通过对照CHO-GFP细胞系的胞吞作用，或通过例如过表达人转铁蛋白受体（hTfR，图6-B）（涉及转胞吞作用的另一种受体）的另一种对照CHO细胞系被整合。此外，CHO-LDLR-GFP细胞系的胞吞活性对于LDLR配体是特异性的，因为在这种细胞系中没有观察到对其不是特异性的配体例如用红色荧光染料（德克萨斯红，图6-C）染色的转铁蛋白(Tf)的胞吞作用。

受体功能性（胞吞能力）在电视荧光显微镜下通过实时实验确认，表明hLDLR的天然配体LDL（用Dil染色），相比于表达单独GFP的细胞或表达胞吞作用涉及的另一种受体如hTfR（阴性对照）的细胞，在表达hLDLR-GFP的细胞中实际地被快速且非常有效地运输。相反地，用德克萨斯红染色的Tf（其通过表达hTfR-GFP的细胞的胞吞作用非常有效地整合）实施的电视显微镜检查实验确认，转铁蛋白不通过对照GFP细胞系的细胞或hLDLR细胞系的细胞的胞吞作用被整合。

尽管在CHO-hLDLR-GFP细胞系中的高hLDLR表达水平，但胞吞系统不仅是有效的，而且它保持其选择性。GFP融合体的存在在胞吞作用过程中不改变hLDLR（暴露于hLDLR胞外结构域的细胞外部）的膜插入性能，也不改变受体的功能性。

实施例II

肽的合成及与示踪剂分子（生物素，荧光素或具有酶促活性的S-Tag）的偶联。

在聚苯乙烯-1%DVB上的Rink Amide AM树脂、在聚苯乙烯-1%DVB上的Wang，在聚苯乙烯-1%DVB上的Barlos(2-氯三苯甲基氯)或在聚苯乙烯-1%DVB上的Sieber Amide上，使用Fmoc/tBu策略，在AdvancedChemTech Apex396(AAPPTec)合成仪或Liberty^TM(CEM)合成仪上，通过固相肽合成（SPPS）方法合成肽。根据所使用的树脂，加载（或取代）为0.25mmol/g至1.6mmol/g。

通过Fmoc（或对于某些N-term端的Boc）N-保护和/或在它们的侧链处通过正交官能团（尤其是酸易断裂官能团）保护的氨基酸、化学偶联剂和去保护剂以及溶剂购买自专业公司并以其原样使用。

Rink Amide和Wang树脂使得有可能合成在它们的侧链和它们的C-term端上完全去保护的肽序列。这因此是2-维(Fmoc/tBu)正交SPPS。

Barlos和Sieber高敏酸不稳定(HAL)树脂分别能够释放末端(C-term)酸或酰胺官能团同时保持合成肽的各种氨基酸的正交侧保护以及其最后一个氨基酸的胺官能团的末端(N-term)胺保护(例如，用于新合成肽序列的稳定性问题的N-乙酰基化)。这些类型的树脂，经由Fmoc(Prot₁)合成策略，使得有可能利用仅在强酸介质中可裂解的酸不稳定正交侧保护(Prot₂:Boc,tBu,OtBu,Trt,Mmt,Acm等)，而受保护的肽在极弱酸条件中不偶联。这种类型的裂解使得有可能恢复在其侧官能团(Prot₂)上完全保护的肽序列，尤其鉴于将关注的治疗分子与肽偶联。这因此是三维(Barlos or Sieber/Fmoc/tBu)正交SPPS。

在肽合成期间用于各个氨基酸的标准正交侧保护(Prot₂)：Arg(N-Pbf)，Arg(N-Pmc)，Asn(N-Trt)，Asp(O-tBu)，Cys(S-Acm)，Cys(S-Mmt)，Cys(S-4MeBn)，Cys(S-tBu)，Cys(S-Tmob)，Cys(S-Trt)，Glu(O-tBu)，Gln(N-Trt)，His(N-Trt)，Lys(N-Boc)，Pen(S-Acm)，Pen(S-Trt)，Ser(O-tBu)，Thr(O-tBu)，Trp(N-Boc)，Tyr(O-tBu)(Applied Biosystems,1998,Cleavage,Deprotection,andIsolation of peptide after Fmoc Synthesis.Technical Bulletin)。Gly、Sar、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Pip和Thz不具有侧保护，因为它们各自的结构不需要它。

氨基酸利用在DMF中的DIEA/HBTU/HOBt或DIPC/HOBt经由n+1个氨基酸的酸官能团的活化偶联。

由此偶联的新氨基酸的Fmoc(Prot₁)基团的去保护利用在DMF中的20%哌啶进行。

在肽测序期间偶联的最后一个氨基酸将通过Boc官能团（鉴于在合成结束时释放其游离末端胺官能团）或乙酰化（为了稳定化合成的肽而且降低例如在C-term位置中关注的治疗分子的共价偶联期间的二次反应的危险）或丙酰化进行保护。

根据所合成的肽,二硫桥键通过在溶液中或在树脂上从两个适当保护的Cys(Acm,Trt,tBu等)的两个硫醇官能团的分子内环化而获得，其中利用本领域技术人员典型使用的试剂：H₂O/AcOH/,/(NH₄)₂CO₃/DMSO,H₂O/AcOH,/(NH₄)₂CO₃,I₂/DMF,I₂/HFIP/DCM,TFA/DMSO/苯甲醚,I₂/DCM/MeOH/H₂O等。在N-term位置中的Cys可以有利地被Pen或Mpa取代用于经由二硫桥键的环化。羊毛硫氨酸桥（通过经由脱氢丙氨酸的环化）或二甲酰胺(dicarba)(通过经由丙烯基Gly的环化)也可以通过本领域技术人员已知的合成路线获得。内酰胺桥可以在Glu（或Asp）的侧酸官能团和Lys或N-term胺上的侧胺官能团之间形成。类似地，N-term胺官能团和C-term酸官能团（头/尾）之间的环化可以经由酰胺键进行，正如Lys的侧胺官能团和肽的C-term酸官能团之间的环化一样(Majumdar and Siahaan,Med Res Rev.,Epub ahead of print)。

来自Barlos或Sieber树脂的肽通过本领域技术人员典型使用的方法裂解，利用在DCM中的0.5%TFA(v/v)，或利用AcOH/TFE/DCM(1/1/3)，或者利用在DCM中的HFIP(30%)，或利用在DCM中的TFE(30%)等。

侧链的去保护和来自Rink Amide或Wang树脂的肽的裂解通过本领域技术人员典型使用的方法进行：利用TFA/H₂O/TIS或TIPS(95/2.5/2.5)，或利用TFA/H₂O/EDT/TIS或TIPS(94/2.5/2.5/1)，或者利用TFA/茴香硫醚/H₂O(94/5/1)，或利用TFA/TIS/H₂O/茴香硫醚(90/5/3/2)，或利用TFA/H₂O/苯酚/茴香硫醚/EDT(82.5/5/5/5/2.5)等。

生物素、荧光素或S-Tag(参见以下实施例IV)通常在C-term位置引入，这些示踪剂有时是根据本领域技术人员已知的典型合成和偶联方法在N-term位置偶联的偶联体（couple）。

肽通过HPLC分离和纯化，其在具有Chromolith C18(4.6mm x50mm)或Nucleosil C18(10mm x250mm)柱的Beckman System Gold126设备上，利用例如在水相(H₂O+0.1%TFA)中的0%至100%乙腈梯度（3.5min），然后100%至0%（1.5min）(流速：1ml/min至5ml/min)，或在具有ChromolithSpeed ROD RP-18(4.6mm x50mm)柱（固定相）的Waters1525系统，利用通过Waters996PDA检测器(190nm–400nm)进行检测，或在具有Chromolith Performance RP-18(3mm x100mm)柱（固定相）的WatersAlliance2690系统上，利用通过Waters996PDA检测器(190nm–400nm)进行检测。UV检测在214nm和254nm处进行。

制备型纯化利用具有Delta-Pak^TMC18储筒(25mm x10mm)的Guard-Pak^TM柱(固定相)的Waters Prep LC4000系统进行，利用通过Waters2487双波长吸光率检测器进行检测。

分子量利用电喷雾电离(ESI)质谱以正性模式确定。通过利用装配有能够实现LC-MS偶联的Waters Alliance2690HPLC系统的Waters MicromassQuattro Micro(四极分析仪)获得光谱。

使用的LC-MS分析条件如下：

-Chromolith Flash C18柱(4.6mm x25mm)，

-3ml/min流速，

-0%至100%的B的线性梯度，2.5min(A:0.1%H₂O/HCO₂H;B:0.1%ACN/HCO₂H)。

以正性电喷雾模式的质谱以100-200μl/min的流速获得。数据以0.1s间隔从200-1700m/z以扫描模式下获得。

实施例III

肽载体设计。

WO2010/046588中描述的序列SEQ ID NO:17/S-Tag的肽用作参照。

从这种肽，使用各种方法来尝试改善结合、合成和矢量化性能。许多肽由此合成，通过一个或多个氨基酸残基的缺失和/或取代和/或化学修饰而不同于SEQ ID NO:17。

确定由此合成的肽结合hLDLR的能力。

为此，在6-孔板中培养粘附和汇合的CHO-hLDLR-RFP细胞。每种条件使用三个孔的细胞。

含有10μM的肽SEQ ID NO:17/S-Tag的溶液在HamF12-1%BSA培养基中制备。向这种溶液中加入10μM的肽以进行评价（竞争）。

还制备多种对照溶液：

(i)HamF12-1%BSA培养基。

(ii)HamF12-1%BSA培养基+10μM对照肽CTRL-S-Tag(包含S-Tag的任何肽的非特异性结合的评价)。

(iii)HamF12-1%BSA培养基+10μM肽SEQ ID NO:17/S-Tag+10μM对照肽CTRL(关注肽和对照肽CTRL之间的“非特异性”竞争的评价)。

使用的FRET方法是实施例IV中描述的那些方法。

对于最佳肽获得的结果在下表1中提供。该表给出了被本发明的肽替代的参照肽载体(SEQ ID NO:17/S-Tag)的竞争(%)、对于hLDLR的亲和力的结果。替代值越大，肽对hLDLR的亲和力越大。当这个值大于50%时，该肽具有大于参照肽(SEQ ID NO:17)的亲和力。

表1

试验肽	对照肽的置换
		SEQ ID NO:1	66%
SEQ ID NO:2	70%
		SEQ ID NO:3	75%
SEQ ID NO:4	88%
		SEQ ID NO:5	91%
SEQ ID NO:6	77%
		SEQ ID NO:7	74%
SEQ ID NO:8	84%
		SEQ ID NO:9	80%
SEQ ID NO:10	54%
		SEQ ID NO:11	22%
SEQ ID NO:12	23%
		SEQ ID NO:13	8%
SEQ ID NO:14	9%
		SEQ ID NO:15	<5%
SEQ ID NO:16	<5%
		SEQ ID NO:17	50%

提供的结果表明，序列SEQ ID NO：1至10的肽对于人HDL受体具有改善的亲和力。考虑到肽的较小尺寸，这些结果是特别有意义的，并且考虑到对用肽SEQ ID NO:11-16观察到的亲和力的负面效果而是特别显著的和令人惊讶的。

因此，尽管基于药物化学的化学优化方法，本发明的发明人在参照肽载体(SEQ ID NO:17)的结构/活性（亲和力）关系的理解上取得进展，并且尤其是：

(i)各个氨基酸残基(Ala-scan,D-scan)的重要性，即各个原始残基被丙氨酸或被它们的D构型的非天然类似物的可替换替代（一个接一个）；

(ii)N-和C-term端(乙酰化，酰胺化等)的重要性；

(iii)肽的环化的重要性/优点。

通常归属于用于治疗剂的肽衍生物的主要限制为：

(i)它们的低经口生物利用度(它们通过静脉内途径的给药通常是必需的)；

(ii)由于它们通过消化系统和血浆的蛋白水解酶（尤其是肽镁或蛋白酶）的快速分解导致的短半衰期；

(iii)它们通过肝（肝脏清除）和肾（肾清除）而从循环血液快速消除；

(iv)由于它们通常的亲水性导致它们通过生物学或生理学膜的低能力；

(v)它们大的构象柔性，其可能涉及缺乏选择性，导致与不同受体或靶标的相互作用（导致弱的特异性生物分布），其引起若干靶标的激活和导致副作用或不期望作用；

(vi)合成和工业生产的高成本(5kDa肽的生产成本大于500Da有机分子的生产成本)。

以相当显著的方式，本发明的肽或类肽具有以下药理学前提条件：

(i)对于hLDLR的高亲和力；

(ii)促进它们对于这种受体的特异性的生理化学特性（经由二硫桥键的环化；对于一些的多达3个非天然氨基酸；减少至8个氨基酸的尺寸）；

(iii)由于它们的环化、引入非天然氨基酸和对于一些的拟肽键、以及通过修饰/封闭N-term和C-term端而对酶促蛋白水解的更大抗性；

(iv)小尺寸和接近1Da的分子量，使其有可能降低合成和将来工业规模生产的成本。

实施例IV

对CHO-LDLR-GFP细胞系中的hLDLR具有亲和力的合成肽的结合和胞吞作用。

对于hLDLR-GFP具有亲和力的本发明的肽在C-term位置与各种示踪剂分子罗丹明或S-Tag偶联/轭合，通过通常由三个Gly残基构成的间隔物分隔开（图7）。S-Tag(来源于牛胰腺核糖核酸酶A的序列1-15的15该氨基酸肽)一方面可以被用于免疫细胞化学或FACS方法的抗-S-Tag抗体识别，并且在另一方面可以在体外活性试验中利用FRETWorks S-Tag测定试剂盒(Novagen70724-3)，通过与核糖核酸酶S-蛋白(C-term位置，氨基酸21-124)结合而重建酶促活性。由此活化的核糖核酸酶消化RNA底物，释放通过FRET（荧光共振能量转移可视化且在Beckmann荧光分光计中在96-孔板中量化的掩蔽应该剂。对于这些FRET实验，使用对照CHO细胞并且在C-term位置与hLDLR和mLDLR融合的GFP（其在用于FRET的波长处产生强背景噪声）被红色应该蛋白(RFP)替代。产生用于FRET实验的稳定细胞系因此是CHO-RFP和CHO-hLDLR-RFP。

对于FRET方法，细胞用2ml PBS洗涤两次并在37°C用250μl肽溶液孵育1h。它们再次用2ml PBS洗涤两次，然后用1ml PBS洗涤两次，接着在1ml PBS中刮下来并以1250rpm离心5min。然后吸出上清液并将细胞颗粒溶解在80μl PBS+0.1%Triton X100中。20μl的每种细胞溶解产物在FRET反应后通过测量应该发射进行分析。

因此，实施涉及在表达hLDLR的各种细胞上的肽的孵育的实验，证实该肽良好结合于CHO-LDLR-GFP细胞并且它们通过胞吞作用并入以在表达hLDLR的细胞系的细胞中积累，其不是对于对照肽的情形。在这些实验中，与S-Tag轭合的肽用针对S-Tag的一级抗体(一级Ab)、和用针对一级抗体的二级抗体（二级Ab）的初步孵育表明，肽/S-Tag、一级Ab和二级Ab之间的复合物结合至表达hLDLR的细胞并且通过胞吞作用被内化。这些结果表明，这个家族的环状肽可以结合至表达hLDL的细胞并且矢量化大加载（两种抗体），即这些加载通过胞吞作用被内化。

实施例V

对hLDLR具有亲和力的合成肽在体外BHE模型中对内皮细胞的毒性、胞吞作用和转胞吞作用。

肽对内皮细胞的潜在毒性作用、肽在这些细胞中的结合/积累、以及通过肽的转胞吞作用的通过在体外BHE模型上进行评价。对于构建所述模型所需的细胞（来自脑微管和内皮细胞和星形胶质细胞的共培养物）是由CellialTechnologies(Lens,France)销售的牛细胞（牛脑微血管内皮细胞BBMEC）或者以使其有可能形成内部鼠类模型的大鼠细胞（大鼠脑毛细血管内皮细胞，大鼠BCECs）。这种类型的体外BHE模型用来大量分子尤其是药理学试剂被动或主动运输越过BCECs并由此通过外推法评价它们在体内到达SNC组织的能力。所述牛和鼠类模型具有脑内皮，尤其是紧密连接部的超微结构性能特性，没有空隙，没有跨内皮通道，对亲水性分子的低渗透性和高电阻。此外，这些模型已显示在各种分子对它们通过BHE的性能的体内外评价上取得的测量结果之间的一致关联。至今，获得的所有数据表明，这些体外BHE模型通过在线体内存在的细胞环境的一些复杂性、同时保持与细胞培养相关的优点而密切地模仿体内情形。

例如，体外牛BHE模型达到起BBMEC和星形胶质细胞的共培养物。在细胞培养之前，膜插入物(Millicell-PC3.0μm;30mm直径)在上部用大鼠尾部胶原处理以便能够实现BBMEC的最佳粘附和产生基膜的条件。混合的星形胶质细胞的原代培养物从新生大鼠大脑皮质建立(Dehouck et al.,1990,J.Neurochem.,54,1798-1801)。简而言之，在除去脑膜后，使脑组织通过82μm尼龙筛网。星形胶质细胞以1.2x10⁵个细胞/ml的浓度分布在微板孔中，利用补充有10%热灭活胎牛血清的2ml优化培养基(DMEM)。培养基每周改变两次。从Cellial Technologies获得的BBMEC在补充有10%(v/v)马血清和10%热灭活小牛需求、2mm谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素和1ng/ml基本成纤维细胞生长因子（每两天添加）的DMEM培养基存在下生长。然后BBMEC以2ml共培养物分布在过滤器的上表面上。这种BBMEC培养基每周改变三次。在这些条件下，分化的BBMEC在7天后形成汇合细胞的单层。

为了测试它们的毒性，偶联于罗丹明的本发明的肽在与内皮细胞接触1h、5h和24h下在培养系统的上室孵育。下室的培养基在不同时间收集并通过荧光计分析定量荧光。结果表示为内皮表面渗透性(Pe)，单位为10^- ³cm/min。荧光黄(LY)，一种极少越过BHE的小荧光分子，首先用来评价在所分析的所有孔中的体外BHE的完整性，并且其次用于肽共孵育以评价肽对于形成这种BHE的内皮细胞没有毒性。如果LY的Pe值大于1x10^- ³cm/min，则认为该体外屏障是“可渗透的”或“开放的”。用欧姆计测量并以ohm.cm²表示的跨内皮电阻(TEER)还使得有可能测量在越过BHE的试验期间的体外BHE完整性。质量阈值设置在>500ohm.cm²。

进行的实验表明，没有所述肽以及对于所使用的对照肽的毒性，并且对BHE的渗透性没有有害作用。

轭合至罗丹明的本发明的肽通过BHE在上述体外牛BHE模型上被验证。这种分析通过荧光分析法在各个时间（1h，4h，24h）测量接收器孔中积累的荧光量进行。所分析的各个孔中的BHE的完整性通过同时测量作为时间函数从一个室通到另一个室的LY的水平进行。

实施例VI

用于由载体和关注的治疗分子或成像（或诊断）剂或者任何其他分子如分子探针构成的轭合物的化学合成的方案。

关注的治疗分子或成像或诊断剂或任何其他分子如分子探针可以在运输并越过细胞膜，更特别地BHE之后从载体裂解/释放/盐析出来，例如通过载体和活性物质之间的化学键的水解或酶促裂解的前药策略。

在其反应性侧官能团上完全保护（在C-term和N-term处偶联）或部分保护（在侧链的反应性官能团上偶联）的肽载体和关注的治疗分子之间的共价偶联经由两种通用策略进行（图2）：

-直接连接的合成(即，两种实体之间没有中间物的直接偶联)，

-经由连接物的合成(Temsamani et al.,2004,Drug Discov.Today,23,1012-1019)。

根据所选的肽载体和治疗关注的分子，在这种肽载体的C-term、或N-term或侧链反应性官能团上应用各种策略的一种或另一种(Majumdar andSiahaan,Med Res Rev.,Epub ahead of print)。理想地，在前药策略中，所选的间隔物应能够实现活性物质的适当释放和轭合物溶解性的改善(Molema et al.,2001,Vectorization,organ-specific strategies.In:Methods and principles inmedicinal chemistry,vol.12)。各种不稳定共价化学键由此在两个实体（载体和活性物质）之间产生，经由或不经由间隔物：酰胺，氨基甲酸酯，酯类，硫酯，二硫化物等。例如，文献中已经证实，在血浆中相对稳定的二硫键可以通过酶如蛋白-二硫化物还原酶在大脑内室内部裂解以恢复游离硫醇官能团(Saito et al.,2003,Adv.Drug Deliv.Rev.,55,199-215)。

关注的其他化合物是其中间隔物是聚合物如聚乙二醇(PEG)的那些。实际上，文献中已经证实生物学关注的有机分子与PEG的轭合使得有可能增大这种分子的血浆半衰期(Greenwald et al.,2003,Adv.Drug Deliv.Rev.,55,217-250)并降低其清除率。

与火星物质或关注物质轭合的载体可以用于SNC的病理、病变或病症的诊断、成像或治疗，用于制备能够越过BHE的药物；脑肿瘤或另一类型的癌细胞，用于制备恩你哥哥越过癌细胞膜的药物；和/或传染病，用于制备能够越过细胞膜的药物，以及靶向脑或其他组织的细菌、病毒、寄生虫或真菌传染病的感染细胞。

实施例VII

对于单独的载体和与关注的治疗分子或成像（或诊断）剂或任何其他分子如分子探针轭合的载体的原位脑灌注、以及它们越过BHE的运输动力学和它们在小鼠脑中的积累的研究。

使用原位脑灌注技术（在成年雄性OF1小鼠中）来举例说明在脑中越过BHE。

预先，肽载体用氚(³H)（提供对于放射活性化合物的检测，尤其是在组织切片上的最强选择性的一种元素）放射标记。具有高特异性放射活性(RAS，高达100Ci/mmol)的放射活性肽通过氚化的丙酸（或丙酸）酐或氚化的N-丙酰基-琥珀酰亚胺(NPS)的N-term胺官能团的乙酰化策略制备。这种氚化方法可以应用于所有的肽(载体，或直接连接或经由连接物（为肽或有机性质）的治疗肽和肽载体之间的轭合物)，条件是N-term的修饰不影响肽对于所靶向的受体（即LDLR）的亲和力或它们在治疗肽情况下的生物学活性。

通过丙酰化在N-term位置上肽载体的氚化反应在DMF（根据溶解度在100μl至450μl中1mg肽）进行，通过添加0.1当量的氚化NPS在室温下达5min，然后0.9当量的冷NPS(非氚化的)达1h，接着一个新当量的冷NPS达5h。然后反应介质在4°C留置过夜并通过HPLC在第二天纯化。对于各种氚化肽的RAS典型地为5Ci/mmol至10Ci/mmol。通过合成制备的放射活性的总量通常为600μCi至950μCi。

放射标记的肽(例如用³H放射标记的)与例如在实施例VI中描述的放射标记的活性物质（用¹⁴C放射标记的）共价偶联。如之前提及的，这种共价偶联根据活性物质的结构和生理化学性质，尤其是存在可以在没有降低这种物质的生物学活性下被修饰的功能化学基团进行。放射标记的轭合物通过从对于非放射标记的轭合物开发的合成途径外推进行合成。

以下简略概括的技术是之前开发用于研究活性物质在脑中的分布，并且尤其是BHE的作用，并且更特别是LDLR在这些分支在脑中的渗透的作用。原位脑灌注技术处于最大技术需求且最难在小鼠中实施。然而，原位脑灌注（例如在体外模型中）能够实现人工灌注液的组成的总控制以便在正常生理和解剖条件下在动物内维持细胞和脑的血管化，同时不破坏系统分布因子。

通常在大鼠中进行的这种原位脑灌注策略适用于小鼠(Dagenais et al.,2000,J Cereb Blood Flow Metab.,20(2),381-6)以便加宽其应用，用于评价在BHE和血-视网膜屏障处的运输动力学的参数，并且这也在转基因和KO突变小鼠中用于活性物质的受体、酶或转运蛋白。它涉及被麻醉小鼠（通常为OF1）中的颈动脉的导管插入和这种颈动脉的某些分支（外部、甲状腺、枕骨）的连接以便特异性地灌注内部颈动脉和翼突腭动脉，其用量评价载体和轭合物在脑中的摄取。导管使得有可能通过用经过颈动脉的良好控制的灌注液（碳酸氢盐缓冲液，血浆或血液）的灌注代替全身循环。氧化的Krebs碳酸氢盐首先用于评价载体和轭合物在脑中通过的能力。在颈动脉的导管插入之后，内源性血流通过对心脏的心室切片而终止以便避免缓冲液约血液的混合物和血压升高。监测固定流速灌注的持续时间。在氧转运蛋白（洗涤后的红细胞）存在下，缓冲液灌注可以延长直至20min，或直至1h，用于受体介导的转运（RMT）的研究。

进行的实验室的有可能建立本发明的多种肽载体的大脑运输或转移系数（K_in：分布体积和脑灌注时间之间的关系）。对于这些实验的脑灌注的持续时间为5min，其中灌注液流速为2ml/min。因此，用2Ci/mmol的RAS放射标记的SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的肽载体的K_in分别为3.3和3.0x10^-4ml/s/g。

比较地，转铁蛋白(Tf)的K_in为3.0x10^-4ml/s/g(Demeule et al.,2008,J.Neurochem.,106(4),1534-1544)，并且在相同实验条件下对照肽SEQ ID NO:17的K_in为3.2±0.4x10^-4ml/s/g。

因此这些结果表明，本发明的肽载体由于它们的小尺寸和有利的构型而具有非常高的大脑转移系数，大于转铁蛋白的大脑转移系数。

另外，这种类型的原位脑灌注实验还使得有可能在大脑血管室中保留的化合物和已经越过近腔内皮膜而进入脑薄壁组织之间的区别。这种技术，称为灌注后毛细血管消耗，使得有可能测量分子实际上是否越过内皮以便进入脑薄壁组织。这种技术的使用使得有可能表明特异性肽载体（或轭合物）在脑薄壁组织中积累。因此，这种技术(Triguero et al.,1990,J Neurochem.,54(6),1882-8)被使用以在通过内皮传输和经由细胞外空间或脑细胞进入脑的载体（或轭合物）的部分，和与内皮细胞相关的剩余部分之间形成区别。

小鼠中的原位脑灌注研究的关键步骤对于所研究的载体和轭合物可以概括如下：

i)在BHE处的载体和轭合物的耐受性（非毒性）的评价以及这种生理学障碍的完整性的保持。

ii)通过LDLR经由RMT的脑摄取的动力学和线性的研究。

iii)作为载体或轭合物浓度的函数的脑摄取速率的研究（T_max,K_m）。

iv)利用抑制或调解LDLR的底物的运输机制的研究。

v)脑室中的分布：毛细血管消耗(Triguero et al.,1990,J Neurochem.,54(6),1882-8)。

vi)载体和轭合物与血浆蛋白（白蛋白等）的结合速率的评价以及它们对这些分子的脑摄取的影响的研究。

vii)静脉内给药和作为时间的函数的组织分布（脑和其他器官）的评价。

Claims

1.一种肽或类肽，其特征在于，其具有以下通式(I):

A1-Met-A2-Arg-Leu-Arg-A3-Cys (I)

其中A1表示半胱氨酸(Cys)或其类似物或电子等排体，A2表示脯氨酸(Pro)或其类似物或电子等排体，并且A3表示甘氨酸(Gly)或其类似物或电子等排体。

2.根据权利要求1所述的肽或类肽，其特征在于，A1表示Cys或其选自(D)-cys、青霉胺(Pen)和(D)-青霉胺((D)-Pen)的类似物。

3.根据权利要求1或2所述的肽或类肽，其特征在于，A2表示选自哌啶酸(Pip)和噻唑烷-4-甲酸(Thz)的Pro类似物。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽或类肽，其特征在于，A3表示Gly或肌氨酸(Sar)。

5.根据权利要求1所述的肽或类肽，其特征在于，其具有以下通式(I′)：

A1-Met-A2-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys(I′)

其中A1表示半胱氨酸或其类似物或电子等排体，优选地A1表示Cys、(D)-cys、Pen或(D)-Pen；并且A2表示Pro或其类似物或电子等排体，优选地A2表示Pip或Thz。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的肽或类肽，其特征在于，它是选自序列SEQ ID NOs：1至10的肽。

7.根据前述权利要求中任一项所述的肽或类肽，其特征在于，它具有环状构型。

8.根据前述权利要求中任一项所述的肽或类肽，其特征在于，它结合在细胞膜表面上的人低密度脂蛋白受体(hLDLR)。

9.根据前述权利要求中任一项所述的肽或类肽，其特征在于，它含有至少一个拟肽键，优选地选自插入的亚甲基(-CH₂-)或磷酸根(-PO₂-)基团、仲胺(-NH-)或氧(-O-)、氮杂肽、α-烷基肽、N-烷基肽、氨基膦、缩酚酸肽、羟基亚甲基、羟基亚乙基、二羟基亚乙基、羟基乙胺、逆反肽、亚甲基氧基、乙酰亚甲基、酯类、亚膦酸酯、氧化膦、膦酰胺和卡巴类似物。

10.根据前述权利要求中任一项所述的肽或类肽，其特征在于，N-末端(N-term)官能团通过酰基化保护和/或C-末端(C-term)官能团通过酰胺化或酯化保护。

11.根据前述权利要求中任一项所述的肽或类肽，用于矢量化在诊断、成像或治疗中的活性物质或关注物质。

12.根据权利要求1至10中任一项所述的肽或类肽，用于增大其偶联的活性物质或关注物质的生物学活性或降低其毒性。

13.一种下式(III)的轭合物化合物：

VxLzDy(III)

其中V表示根据权利要求1至10中任一项所述的肽或类肽，L表示间隔物，D表示活性物质或关注物质，x和y是1至5的整数并且z是0至10的整数。

14.根据权利要求14所述的轭合化合物，其特征在于，x=z=y=1；x=z>y，y=z>x或z>x>y；或者z等于0并且x和y等于1或y大于x。

15.根据权利要求13或14所述的轭合化合物，其特征在于，所述活性物质或关注物质是治疗关注的分子、诊断或医疗成像剂或分子探针，优选地选自小化学分子、肽或多肽、蛋白、抗原、抗体或抗体的部分、核酸或寡核苷酸、核糖酶、标记物或跟踪剂。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的轭合化合物，其特征在于，一方面V和D之间或V和L之间、另一方面L和D之间的偶联，通过在生理介质中或细胞内可裂解或不可裂解的一个或多个共价键、离子键、氢键、疏水键或范德华键实现。

17.根据权利要求13至16中任一项所述的轭合化合物，其特征在于，如果必要经由L，在V的N-term和/或C-term中的一个或两个处，和/或在一个或多个由V的天然或非天然氨基酸组分的侧链带有的反应性基团处，D与V偶联。

18.一种用于制备根据权利要求13至17中任一项所述的轭合化合物的方法，其特征在于，它包括在肽或类肽V和物质D之间，如果必要，经由L，优选地通过化学、生物化学或酶促途径或者通过遗传工程的偶联步骤。

19.一种药物组合物，其特征在于，它包含至少一种根据权利要求13至18中任一项所述的轭合化合物以及一种或多种药用赋形剂。

20.一种诊断组合物，其特征在于，它包含由根据权利要求13至18中任一项所述的轭合化合物构成的诊断或医疗成像剂。