EA022422B1 - Пептидные производные, их получение и применение - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к пептидным производным (пептидам и псевдопептидам) и их применению в качестве векторов для веществ, представляющих интерес для пользователя. Изобретение также относится к конъюгатам, содержащим пептидное производное по данному изобретению, соединенное с веществом, представляющим интерес для пользователя. Пептиды по данному изобретению можно применять для векторного переноса в форме конъюгатов, как правило, предшественников ("пролекарств") тех веществ, которые представляют фармацевтический или диагностический интерес, например терапевтических, визуализирующих или диагностических агентов или молекулярных зондов через клеточные мембраны, в особенности с целью способствовать их переносу через гематоэнцефалический барьер.

Description

Настоящее изобретение относится к пептидным производным (пептидам и псевдопептидам) и их применению в качестве векторов для веществ, представляющих интерес для пользователя. Настоящее изобретение также относится к конъюгатам, содержащим пептидные производные по данному изобретению, связанные с веществами, представляющими интерес для пользователя. Пептиды по данному изобретению можно использовать, в частности, как средство трансмембранной доставки в клетки (векторизация), как правило, в форме конъюгата с пролекарством, веществ, представляющих фармацевтический или диагностический интерес, как, например, терапевтических агентов, визуализирующих или диагностических агентов, молекулярных проб и зондов, в особенности для содействия переносу таких веществ через гематоэнцефалический барьер.

Уровень техники

Согласно данным международной информационной компании ΙΜδ НеаКй мировой рынок лекарственных средств для лечения патологических состояний центральной нервной системы (головного и спинного мозга) оценивается в 70 млрд долларов (данные за 2007 г.), из которых почти 9 млрд долларов приходится на продукты, связанные с технологиями адресной доставки лечебных агентов Паит 2008, кин РЬагтаВю1есй Верой, Эгад Эейуегу ίη СЫ§ йЬогйен,). Таким образом, в настоящее время неврология является одной из трех крупнейших областей терапевтического воздействия (наряду с лечением сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний). Хотя больных с расстройствами и патологическими изменениями центральной нервной системы во всем мире больше, чем страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями или раком, неврология как рынок потребления лекарственных препаратов развита недостаточно. Это объясняется тем, что 98% потенциальных средств для лечения патологических состояний центральной нервной системы не могут переходить через гематоэнцефалический барьер (Рагбгйде, 2003, Мо1. Шегу., 3, 90-105).

Действительно, мозг защищен от потенциально ядовитых веществ благодаря существованию двух основных физиологических барьерных систем: гематоэнцефалического и гематоликворного барьеров. Первый из них считается основным путем для веществ, содержащихся в плазме крови. Поверхность гематоэнцефалического барьера приблизительно в 5000 раз больше, чем гематоликворного. Суммарная длина кровеносных сосудов, образующих гематоэнцефалический барьер, составляет приблизительно 600 км. На каждый 1 см³ коры головного мозга приходится 1 км кровеносных сосудов. Общая площадь поверхности гематоэнцефалического барьера оценивается в 20 м² (Эе Воег е! а1., 2007, С1иг РйагтасокшеТ, 46(7), 553-576). Таким образом, эндотелий кровеносных сосудов головного мозга, создающий гематоэнцефалический барьер, представляет собой главное препятствие для использования потенциальных лекарств против многих расстройств центральной нервной системы, но также и огромную поверхность для возможного обмена между кровью и нервной тканью.

Как правило, преодолевать гематоэнцефалический барьер, т.е. переходить из крови в мозг, могут только некоторые небольшие липофильные соединения с молекулярной массой приблизительно 450-600 Да (такие вещества составляют лишь 2% потенциальных лечебных агентов), а молекулярные масса и размеры многих соединений, которые могли бы служить лекарствами для центральной нервной системы и проявили себя обнадеживающе в исследованиях ίη уйго и в опытах на животных, намного больше. Большинство таких терапевтически ценных соединений, как пептиды и белки, обычно не поступают из крови в мозг, поскольку для них проницаемость эндотелиальных клеток мозговых капилляров (ВСЕС) оказывается низкой. Эндотелиальные клетки, образующие стенку капилляра, окружены базальной мембраной, отростками астроцитов, перицитами, микроглиальными клетками и нейронами. Тесная связь эндотелиальных клеток капилляров с отростками астроцитов обусловливает развитие и поддержание специфики непроницаемости гематоэнцефалического барьера для большинства веществ, тем самым обеспечивая строгий эффективный контроль за обменом веществами между кровью и мозгом и гомеостаз мозговой ткани. Эндотелиальные клетки мозговых капилляров тесно связаны посредством так называемых плотных контактов - в отличие от эндотелиальных клеток в других органах, имеющих окончатые мембраны. Эти плотные контакты исключают параклеточный транспорт, т.е. проникновение молекул через гематоэнцефалический барьер каким бы то ни было путем, кроме как сквозь клетки эндотелия, невозможно. Гематоэнцефалический барьер выступает в роли главного препятствия, преодоление которого является важнейшей проблемой в разработке новых методов лечения патологических состояний мозга, в частности в использовании химических соединений для лечения расстройств центральной нервной системы (ЫеитееЙ е! а1., 2008, Байсе! №иго1., 7, 84-96).

В настоящее время, по существу, нет эффективных средств лечения основных патологических состояний головного мозга (рака, болезней Альцгеймера и Паркинсона, инсульта и пр.) - это может объясняться, помимо прочего, тем, что разработчики потенциальных лекарств для лечения патологических состояний головного мозга ведут исследования в пределах своих компаний (программы поиска лекарств для головного мозга), но уделяют мало внимания проблемам преодоления гематоэнцефалического барьера и прицельной доставки лечебных агентов в центральной нервной системе, в частности в головном мозге (программы разработки прицельных лекарств для головного мозга) (Рагйпйде, 2003, Мо1. Шегу., 3, 90-105). Препарат для лечения головного мозга должен разрабатываться по определенным правилам, касающимся его структуры, физико-химических, фармакохимических и фармакологических свойств, для

- 1 022422 того, чтобы наилучшим образом реализовать его потенциальные возможности как лекарства для лечения патологических состояний или расстройств центральной нервной системы (Ра_)оиЬекЬ е! а1., 2005, ИеигоКх, 2(4), 541-553). Так, при разработке лекарства для его терапевтической активности (эффективности) существенны избирательность и специфичность (фармакологический профиль) данного вещества в отношении выбранной мишени. Для использования потенциального лечебного агента в качестве лекарства критически важны его биологическая доступность и возможная токсичность (фармацевтический профиль). Иными словами, всякое вещество, претендующее на роль лекарства для лечения патологических состояний и расстройств центральной нервной системы, должно быть способным пересекать гематоэнцефалический барьер, сохранять свою биологическую активность, проявлять приемлемые фармакокинетические свойства, нужным образом поглощаться, распределяться и метаболизироваться в организме, а также выводиться из него, обладая требующимися фармакодинамическими параметрами и низкой токсичностью. В области медицинской химии для лечения центральной нервной системы особую трудность представляет поиск оптимального соотношения гидрофильности/гидрофобности разрабатываемого лекарства.

Таким образом, основная проблема в лечении расстройств и патологических состояний центральной нервной системы состоит в том, что вводимые в организм вещества не проходят через гематоэнцефалический барьер и потому не могут достичь своих мишеней в центральной нервной системе. Эндотелиальные клетки кровеносных сосудов, включая капилляры, в центральной нервной системе, создающие гематоэнцефалический барьер, служат препятствием для веществ, которые в результате не могут перейти из крови в нервную ткань. Как говорилось выше, эти эндотелиальные клетки и окружающие их отростки астроцитов, образуют физический барьер, обусловленный существованием соединений по типу плотных контактов между эндотелиальными клетками, ограничивающих/предотвращающих всякий параклеточный транспорт, т.е. переход из крови в мозг помимо этих клеток. Эти особенности сильно ограничивают проникновение веществ из плазмы крови в межклеточное пространство мозга.

Вообще-то, определенные вещества, способные пересекать гематоэнцефалический барьер, активно выводятся из мозга в кровоток при помощи специальных транспортных белков МИК (от англ. тиМ-йгад гек1к!ап! рго!ешк). Эти системы активного транспорта, как правило, определяют выведение из мозга в кровь веществ с малой молекулярной массой. Типичной такой системой является гликопротеин Р, относящийся к семейству АВС-переносчиков - транспортных белков, связывающих аденозинтрифосфат; однако в гематоэнцефалическом барьере представлены и другие системы активного выведения веществ, например МИК-ассоциированный белок 1 (МКР1). Гликопротеин Р, находящийся в основном на обращенной в просвет капилляра поверхности эндотелиальных клеток, служит ключевым элементом в функицонировании физиологического гематоэнцефалического барьера: он препятствует проникновению в мозг большинства ксенобиотиков, но также и потенциальных лечебных агентов и других веществ, представляющих терапевтический интерес и способных к активности в центральной нервной системе.

Таким образом, в исследованиях, посвященным поискам веществ для лечения, диагностирования или визуализации расстройств и патологических состояний мозга, одним из приоритетных направлений является разработка средств для увеличения эффективности прохождения активных веществ через гематоэнцефалический барьер.

В этой связи те подходы, которые разработчики лекарств для центральной нервной системы сейчас применяют для обеспечения перехода потенциально лечебных агентов через гематоэнцефалический барьер, можно разделить на две стратегически различные группы: фармакологические подходы и физиологические подходы (фиг. 1) (Рагйпйде, 2007, РЬагт. Кек., 24(9), 1733-1744; Ие Воег е! а1., 2007, СЬп. РЬагтасокше!, 46(7), 553-576; Ие Воег е! а1., 2007, Аппи. Кеу. Рйагтаео1. Тох1со1., 47, 327-355; 1опек е! а1., 2007, РЬагт. Кек., 24(9), 1759-1771).

Инвазивные методы.

Инвазивные методы могут включать непосредственное введение активного вещества путем инъекции в желудочки мозга или в мозговую ткань либо путем инфузии в оболочки мозга, а также прорыв гематоэнцефалического барьера (временное нарушение его целостности).

Важнейшей проблемой нейрохирургического подхода, включающего инъекцию препарата в желудочки мозга, помимо высокой стоимости самой нейрохирургической процедуры, является то, что лечебный агент вводится не прямо в паренхиму мозга, а в спинномозговую жидкость. Инфузия в желудочки мозга предполагает установку в них катетера (Аий, 1984, Ехр. Иеиго1., 86, 342-358). Этот высоко инвазивный метод неэффективен для доставки активного вещества в паренхиму головного мозга. В самом деле, величина потока из спинномозговой жидкости в паренхиму мозга в процессе введения лекарства путем инфузии в желудочки определяется необычайно медленной диффузией в паренхиме головного мозга.

Примерно так же в случае инъекции в мозговую ткань диффузия активного вещества в ней очень быстро снижается в направлении от места введения к месту поражения. В мозге концентрация активного вещества снижается на 90% уже через 500 мкм от места введения.

Инфузия в оболочки мозга включает установку в них катетера, соединенного с насосом, обеспечивающим поступление активного вещества с заданной скоростью потока. Поскольку мозг - единственный

- 2 022422 орган, не содержащий лимфатических сосудов, посредством которых в других органах осуществляется перенос внеклеточной жидкости обратно в общую систему циркуляции, распределение активного вещества, введенного путем инфузии в оболочки мозга, происходит очень медленно. Из-за этого концентрация активного вещества в месте повреждения оказывается низкой.

Кроме того, в ходе таких нейрохирургических процедур вследствие использования катетера неизбежен значительный риск инфицирования. Эти условия не являются оптимальными для пациента.

Временное нарушение непроницаемости гематоэнцефалического барьера связано с преходящим открыванием плотных контактов между эндотелиальными клетками мозговых капилляров. Это имеет место в случае применения таких воздействующих на сосуды веществ, как лейкотриены или брадикинины (ВаЬа с1 а1., 1991, 1. СетеЪ. В1ооТ Р1оте Мс1аЬ.. 11, 638-643). Этот подход не менее инвазивный и предполагает доступ через артерии к сонной артерии, для чего пациент должен находиться под наркозом. Основная проблема, возникающая в связи с временным нарушением целостности гематоэнцефалического барьера, помимо дороговизны рентгенохирургических процедур для доступа к сонной артерии, состоит в том, что гематоэнцефалический барьер открывается только на очень короткое время, что ограничивает возможность доставки лечебного агента на протяжении сколько-нибудь продолжительного периода времени. Более того, временный разрыв гематоэнцефалического барьера позволяет белкам плазмы крови, которые могут быть токсичны для клеток мозга, проникать в мозговую ткань, а также способствует проникновению в мозг инфекционных агентов. Таким образом, временный прорыв гематоэнцефалического барьера чреват хроническими патологическими изменениями в нервной системе и связан с высоким риском инфекции (§а1айиббш е1 а1., 1988, Лс1а ИеигораШок, 76, 1-10).

Фармакологические методы векторизации.

Фармакологические подходы к транспортировке веществ включают диффузию через клетки, для чего активное вещество делают более гидрофобным путем добавления в него липидных или липофильных групп (трансклеточная липофильная диффузия, ТЬИ) или же используют липосомы (ΖΙιοιι е1 а1., 1992, 1. Сои1то1. Ке1еа8е, 19, 459-486) и перенос путем ионной адсорбции с помощью положительно заряженных векторных молекул или путем введения катионов в активное вещество (транспорт, опосредованный адсорбцией, АМТ).

Добавление липидных или липофильных групп обеспечивает химическое превращение гидрофильных соединений в более гидрофобные, например по принципу пролекарства, т.е. создания и введения в организм предшественника активного вещества. Однако синтез таких соединений приводит к получению веществ, молекулярные размеры которых превышают оптимальные пороговые величины для пересечения гематоэнцефаличекого барьера, особенно в отношении молекулярной массы, которая становится больше оптимального предельного значения 450 Да (Ра)оике5к е1 а1., 2005, ИеигоКх, 2(4), 541-553).

По той же причине липосомы или даже малые везикулы (мицеллы и др.) или наночастицы (наносферы, нанокапсулы) слишком велики и недостаточно специфичны для пересечения гематоэнцефалического барьера и, следовательно, относительно менее эффективны для переноса через него веществ, представляющих терапевтический интерес (или визуализирующих либо диагностических агентов, или же любых иных веществ, например молекулярных зондов) (Ьеу1п, 1980, 1. МеТ. Сйет., 23, 682-684; Зсйаскей е1 а1., 1989, §е1есйуе Сапсег Тйет., 5, 73-79). Кроме того, такие системы на основе везикул, как правило, обладают существенным токсическим эффектом в мозге. Таким образом, основными проблемами, возникающими в связи с методами липидизации, являются низкая специфичность в отношении прицельной/специфической доставки лечебного агента и в отношении пересечения гематоэнцефалического барьера по сравнению с другими клеточными мембранами, снижение значений площади под кривой зависимости концентрации активного вещества в плазме крови от времени (АИС) и ограниченные, как правило, возможности применения для векторизации небольших молекул.

Что касается транспорта, опосредованного адсорбцией (АМТ), то его использование предполагает ковалентное присоединение положительно заряженных групп или катионизацию непосредственно активного вещества, и основной проблемой является низкая специфичность в отношении прицельной доставки активного вещества и в отношении пересечения гематоэнцефалического барьера по сравнению с другими клеточными мембранами. В самом деле, АМТ основываются на адсорбции положительно заряженных молекул на клетках с отрицательно заряженными мембранами, что свойственно большинству клеток. К недостаткам целенаправленной доставки лечебных агентов с помощью АМТ относятся также низкие значения площади под кривой зависимости концентрации активного вещества в плазме крови от времени, ограниченность применения для векторизации небольших молекул и цитотоксичность.

Физиологические методы векторизации.

Физиологический подход к созданию средств доставки активных веществ в мозг состоит в использовании природных транспортных механизмов гематоэнцефалического барьера. Эти механизмы активного транспорта веществ через гематоэнцефалический барьер включают сопряжение со специфическим рецепторным субстратом, либо имитирование на молекулярном уровне специфического рецепторного субстрата (транспорт, опосредованный векторами, СМТ), либо сопряжение или объединение с лигандом, специфически связывающим данный рецептор (транспорт, опосредованный рецепторами, РМТ).

- 3 022422

Например, такие вещества, как Ь-дигидроксифенилаланин (болезнь Паркинсона), мелфалан (рак мозга), альфа-метилдигидроксифенилаланин (артериальная гипертензия) и игабапентин (эпилепсия) проникают в мозг путем СМТ с помощью переносчиков 1 и 2 крупных нейтральных аминокислот (ЬАТ1 и ЬАТ2) (РагНгНде, 2003, Мо1. 1йегу., 3, 90-105). Эти соединения по химической структуре близки к фенилаланину - одному из естественных субстратов ЬАТ1. Однако основными проблемами, возникающими в связи с методами на основе СМТ, являются их избирательность/специфичность в отношении конъюгатов, имитирующих субстраты эндогенных рецепторов/переносчиков, и, следовательно, их применение для векторизации небольших молекул остается ограниченным.

Для КМТ нужна транспортная система на основе рецептора. Векторизация осуществляется посредством механизмов эндоцитоза путем нацеливания эндогенных рецепторв/переносчиков, присутствующих в мозговых капиллярах. Показательные примеры различных рецепторов в гематоэнцефалическом барьере у человека, участвующих в КМТ, включают рецептор трансферрина (ТГК), рецептор инсулина (ΣΚ), рецепторы липопротеинов низкой плотности, обеспечивающие транспорт холестерина (ЬПЬК) и члены семейства белков, родственных рецепторам липопротеинов низкой плотности (ЬКР), рецептор инсулиноподобного фактора роста (ЮРК), рецептор дифтерийного токсина (ЭТК). фактор роста, подобный эпидермальному фактору роста, связывающему гепарин (НВ-ЕОР), а также рецепторы мусорщики (скавенджер-рецепторы, §САУ-К) включая рецепторы класса В типа I (§К-В1). В ходе КМТ рецепторы на мембране эндотелиальных клеток гематоэнцефалического барьера связывают свой лиганд, что ведет к эндоцитозу комплекса, образованного рецептором/переносчиком и его лигандом, т.е. к формированию у поверхности клеточной мембраны везикулы, которая затем перемещается внутри эндотелиальной клетки на другую сторону, тем самым пересекая гематоэнцефалический барьер. Комплекс лиганд-рецептор может пройти сквозь эндотелиальную клетку (трансцитоз) и, таким образом, преодолеть гематоэнцефалический барьер с тем, чтобы действовать далее в нервной ткани. Этот процесс КМТ не зависит от молекулярных размеров вещества, поглощаемого путем эндоцитоза. Поэтому КМТ служит механизмом, обеспечивающим переход из крови в мозг таких веществ, как инсулин, белки-переносчики железа, холестерин, различные пептидные производные, белки и пр. Например, для присутствующего в гематоэнцефалическом барьере ТГК в качестве лиганда-вектора используется трансферрин ПеГГепех е1 а1., 1984, ЫаШге, 312, 162-163; Рпбеп е! а1., 1983, §аепсе, 259, 373-377; Рпбеп, 1994, Ыеигокигдегу, 35, 294298); при этом активное вещество, подлежащее переносу через гематоэнцефалический барьер, присоединяют к трансферрину (лиганду-вектору). Хотя такой метод векторизации, использующий макромолекулы, позволяет увеличить поток молекул, предназначенных для переноса через гематоэнцефалический барьер, он имеет ряд недостатков. Во-первых, молекулы выбранного для переноса вещества обычно присоединяются к вектору генетическим путем (экспрессия гибридных генов), что ограничивает спектр веществ, которые можно переносить через гематоэнцефалический барьер таким путем, только пептидами и белками. Во-вторых, система присоединения желаемого вещества к вектору довольно сложна; традиционные химические или биохимические методы объединения молекул ни структурно, ни на молекулярном уровне не дают четких макромолекулярных механизмов. Кроме того, возможна конкуренция между полученными конъюгатами и эндогенными лигандами за желаемый рецептор, что может привести либо к подавлению физиологического процесса КМТ, либо к снижению концентрации эндогенных лигандов, требующихся для должного функционирования мозга. Рецепторы КМТ участвуют в сигнальных процессах в мозговых клетках, а конъюгаты в принципе могут помешать этим процессам.

В международной патентной заявке \УО 2010/046588 впервые описаны пептиды и псевдопептиды, связывающие человеческий ЬПЕК и способные переносить через гематоэнцефалический барьер вещества с большими молекулярными размерами и/ или молекулярной массой.

Настоящее изобретение относится к новым пептидам, связывающим человеческий ЬПЕК и приспособленным для транспорта нужных веществ.

Раскрытие изобретения

Настоящим изобретением предлагаются оптимизированные пептиды или псевдопептиды, способные переносить через клеточные мембраны, более конкретно - через гематоэнцефалический барьер, вещества со значительными молекулярными размерами и/или массой. Данное изобретение тем самым позволяет улучшить биологическое распределение и биологическую доступность веществ, представляющих интерес для пользователя, в частности улучшить их прицельную доставку в центральную нервную систему.

В публикации \УО 2010/046588 описаны разработанные авторами пептидные производные, способные связывать человеческий ЬПЕК. Авторы показали, что эти производные могут проходить через гематоэнцефалический барьер. Авторы также показали, что эти производные могут переносить в клетках гематоэнцефалического барьера вещества, представляющие терапевтический или диагностический интерес.

Продолжая свои исследования, авторы преуспели в конструировании и испытании новых пептидов, обладающих свойствами, выгодными для переноса веществ. Эти новые пептиды, способные связывать ЬПЕК, не конкурируя с естественными лигандами и, соответственно, не мешая транспорту эндогенных ЕПЬ, представляют собой новые продукты (векторы), которые особенно ценны для конструирования и

- 4 022422 векторизации диагностических или визуализирующих препаратов или агентов, в особенности предназначенных для проникновения в центральную нервную систему.

Таким образом, одним из объектов настоящего изобретения является пептид или псевдопептид, характеризующиеся следующей общей формулой (I):

где А1 представляет цистеин или его аналог или изостер;

А2 представляет пролин или его аналог или изостер;

А3 представляет глицин или его аналог или изостер.

В предпочтительных воплощениях настоящего изобретения А1 представляет цистеин (Сук) или его аналог, выбираемый из (О)-цистеина, пеницилламина (Реп) и (О)-пеницилламина ((О)-реи); А2 представляет пролин (Рго) или его аналог, выбираемый из пипеколиновой кислоты (Ρίρ) и тиазолидин-4карбоновой кислоты (Τΐιζ); и/или А3 представляет глицин (С1у) или саркозин (8аг).

Предпочтительным объектом настоящего изобретения является пептид или псевдопептид с общей формулой (I')

где А1 представляет цистеин или его аналог, предпочтительно выбираемый из (О)-цистеина, пеницилламина и (О)-пеницилламина; и

А2 представляет пролин или его аналог, предпочтительно выбираемый из пипеколиновой кислоты и тиазолидин-4-карбоновой кислоты.

Другим объектом настоящего изобретения является пептид или псевдопептид с общей формулой (I'')

где А1 представляет цистеин или его аналог, предпочтительно выбираемый из (О)-цистеина, пеницилламина и (О)-пеницилламина; и

А2 представляет пролин или его аналог, предпочтительно выбираемый из пипеколиновой кислоты и тиазолидин-4-карбоновой кислоты.

Аланин (А1а) может быть в конфигурации Ь либо Ό.

Пептиды по данному изобретению предпочтительно обладают способностью с высоким сродством связывать человеческий рецептор ЬОЬ (ЬЬОЬК). Кроме того, они имеют небольшие молекулярные размеры (состоят обычно менее чем из десяти аминокислотных остатков), что дает особые преимущества. Конкретными примерами таких пептидов являются пептиды с аминокислотными последовательностями 8ЕС ГО N0: 1-10.

Другой объект настоящего изобретения относится к применению описанных выше пептидов или псевдопептидов для получения фармацевтической или диагностической композиции, предназначенной для векторизации активного вещества или вещества, представляющего интерес в диагностике, визуализации или терапии.

Другой объект настоящего изобретения относится к применению таких пептидов или псевдопептидов, как описано выше, для увеличения биологической активности или уменьшения токсичности активного вещества или интересующего пользователя вещества, с которым оно соединено.

Другой объект настоящего изобретения относится к применению таких пептидов или псевдопептидов, как описано выше, для векторизации активного вещества или вещества, представляющего интерес в диагностике, визуализации или терапии.

Другой объект настоящего изобретения относится к таким пептидам или псевдопептидам, как описано выше, для применения с целью увеличения биологической активности или уменьшения токсичности активного вещества или интересующего пользователя вещества, с которым оно соединено.

Другой объект настоящего изобретения относится к любому конъюгированному соединению с общей формулой (II)

где V представляет такой пептид или псевдопептид, как описано выше;

Ό представляет активное вещество или вещество, интересное для пользователя; х и у - целые числа от 1 до 5.

Настоящее изобретение также относится к любому конъюгированному соединению с общей формулой (III)

УхЬгОу (III) где V представляет такой пептид или псевдопептид, как описано выше;

Ь представляет спейсер;

Ό представляет активное вещество или вещество, интересное для пользователя; х и у - целые числа от 1 до 5; ζ - целое число от 1 до 10.

Другой объект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно конъюгированное соединение, описанное выше, и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.

- 5 022422

Другой объект настоящего изобретения относится к диагностической композиции, характеризующейся тем, что она содержит агент для медицинской диагностики или визуализации, включающий конъюгированное соединение, описанное выше.

Другой объект настоящего изобретения относится к способу для улучшения перехода вещества через гематоэнцефалический барьер или придания способности к этому переходу, включающий присоединение указанного вещества к пептиду или псевдопептиду, описанному выше.

Другим объектом настоящего изобретения является усовершенствованный способ лечения с помощью лекарства патологического состояния у индивида, причем это усовершенствование состоит в присоединении указанного лекарства к пептиду или псевдопептиду, описанному выше.

Настоящее изобретение применимо к любому млекопитающему, в частности к человеку.

Описание фигур

Фиг. 1. Схема, иллюстрирующая различные способы преодоления гематоэнцефалического барьера естественными или фармакологическими веществами (по работе ЛЬЬоЦ апб Котего, 1996, Мо1. Меб. Тобау, 2(3), 106-113).

Фиг. 2. Сравнительная схема синтеза конъюгата, объединяющего в себе вектор и вещество, представляющее терапевтический интерес, через линкерную структуру (Ь) и тандемом (а).

Фиг. 3:

А - схема плазмиды, используемой для клонирования ЬЬПЬК/шЬПЬК;

В - схематическое изображение гибридного белка, экспрессирующегося в трансфицированных клетках.

Фиг. 4. Вестерн-блот, выполненный с клетками линий СНО, в которых экспрессируется гибридный белок ЬЬПЬК-СРР или СРР (контроль). Полоса 190 кДа, соответствующая размерам гибридного белка ЬЕПЕК-СРР. выявляется с помощью антител против ЬРПРК.

Фиг. 5. Результаты иммуноцитохимического анализа непермеабилизированных клеток СНО, в которых стабильно экспрессируется либо А - только СРР (контроль), либо В - гибридный белок ЬЬПРК-СРР. Ядра клеток окрашивали реактивом Хекста (голубые, А1 и В1). На фото А2 и В2 видна зеленая флуоресценция, обусловленная СРР, а на фото А3 и В3 видна красная флуоресценция, обусловленная окрашиванием внеклеточного домена ЬРПЬК при помощи антител к ЬРПРК; на фото А4 и В4 желтый и оранжевый цвета обусловлены наложением красного и зеленого окрашиваний. Обратите внимание, что мембранный рецептор экспрессируется только в клетках, стабильно трансфицированных ЬЬПЬК-СРР (В3).

Фиг. 6:

А - Клетки линии СНО-ЬРПЬК-СРР, в которых экспрессируется ЬРПЬК-СРР (зеленый), инкубированные с ΌίΙ-ΡΌΡ (красный). Желтый и оранжевый цвета обусловлены наложением красного и зеленого окрашиваний; обратите внимание на интенсивность окрашивания клеток.

В - Клетки линии СНО-ТЖ.-СРР, в которых экспрессируется ЬТ£К-СРР (зеленые), инкубированные с ΌίΙ-ΡΌΡ (красный): нет связывания ΌίΙ-ΡΌΡ и эндоцитоза.

С - Клетки линии СНО-ЬРПЬК-СРР, в которых экспрессируется ЬРПЬК-СРР (зеленый), инкубированные с трансферрином, присоединенным к красителю техасский красный (красный): нет связывания лиганда Т£ и эндоцитоза. Обратите внимание на разницу в интенсивности окрашивания между А, с одной стороны, и В и С - с другой: определяется окрашивание только рецепторов ЬТ£г и ЬЬПЬК, присоединенных к СРР.

Фиг. 7. Общая схема конъюгатов синтезированных пептидов с родамином либо δ-Тад, содержащих С-концевой спейсер.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к пептидным производным, способным связывать человеческий ЬПРК и их применению в области фармацевтических препаратов, в частности к транспорту в клетках гематоэнцефалического барьера веществ, представляющих терапевтический или диагностический интерес.

Человеческий ЬПРК - это трансмембранный белок, образованный 839 аминокислотами и содержащий три области: внеклеточная часть (аминокислотные остатки с 1 по 768), трансмембранная часть (аминокислотные остатки с 768 по 790) и цитоплазматическая часть (аминокислотные остатки 790-839). Внеклеточная часть подразделяется на два участка: участок, связывающий ЬПЬ (аминокислотные остатки 1-322), и участок, расположенный снаружи от участка, связывающего ЬПЬ (аминокислотные остатки 322-768) (см. публикацию №О 2007/014992).

Для нормального функционирования мозга необходимы ЬПР. Природными лигандами ЬПРК являются ЬПР, в частности, такие компоненты частиц ЬПР, как аполипопротеин В (АроВ) и аполипопротеин Е (АроЕ), которые обеспечивают транспорт холестерина, содержащегося в этих частицах, через клеточные мембраны и тем самым через гематоэнцефалический барьер.

Было показано, что ЬПЕК обеспечивает трансцитоз частиц ЬПЬ через гематоэнцефалический барьер (ПеЬоиек е! а1., 1997, 1. Се11 Бю1., 138(4), 877-889) путем КМТ в особых эндосомных везикулах, которые не дают произойти слиянию с лизосомами. Эти липопротеины после пересечения гематоэнцефали- 6 022422 ческого барьера путем трансцитоза затем поглощаются нейронами и/или астроцитами (8репсег с1 а1., 2007, Ргос. №И. Лсаб. 8с1. И8А, 104(18), 7594-7599). Данное свойство использовали для векторизации веществ, представляющих терапевтический интерес, при помощи наночастииц, с которыми были конъюгированы цельные аполипопротеины (компоненты ЬПЬ) (Кгеи1ег е1 а1., 2007, 1. Сои1го1. Ре1еа5е. 118, 5458). Однако в этом исследовании использовались цельные молекулы аполипопротеинов, притом в форме конъюгатов с наночастицами с целью имитировать структуру частиц ЬОЬ.

В международной патентной заявке № \УО 2010/046588 впервые описываются пептиды или псевдопептиды, связывающие человеческий ГОКК и способные переносить через гематоэнцефалический барьер вещества с большими молекулярными размерами и/или массой.

Настоящее изобретение относится к новым пептидам, связывающим человеческий ΓΟΓΚ, оптимизированным для транспорта веществ. Пептидные или псевдопептидные векторы можно довольно легко синтезировать химическим путем, и большинство веществ, представляющих терапевтический интерес или служащих для визуализации или диагностики, могут быть просто и эффективно присоединены к этим пептидным или псевдопептидным векторам путем прямого соединения двух функциональных частей (тандемный синтез) либо в виде пролекарства со спейсером (синтез с использованием линкерной структуры) (см. фиг. 2). Пептиды и псевдопептиды по данному изобретению сконструированы таким образом, чтобы принимать циклическую конфигурацию, благодаря чему они более устойчивы к протеолизу. Кроме того, пептиды и псевдопептиды по данному изобретению связывают ЬПЬК без конкуренции с его естественными лигандами.

Пептиды и псевдопептиды по данному изобретению можно использовать в качестве векторов для веществ, представляющих терапевтический интерес или служащих для диагностики или визуализации, и для любых других веществ, например молекулярных зондов, при лечении, визуализации и/или диагностике неврологических патологических состояний, а также инфекционных или онкологических заболеваний мозга или других тканей.

Пептиды и псевдопептиды, описанные в настоящем изобретении, обладают способностью нацеливаться на клеточные рецепторы/переносчики и определенные типы клеток и/или пересекать клеточные мембраны, а именно те, которые формируют физиологические барьеры в мозгу, более конкретно - гематоэнцефалический и гематоретинальный барьеры.

Пептиды и псевдопептиды, описанные в настоящем изобретении, обладают способностью нацеливаться на клеточные рецепторы/переносчики и определенные типы клеток, а именно на раковые клетки, нервную или ненервную ткань, и/или пересекать клеточные мембраны, а именно те, что образуют физиологические барьеры в центральной нервной системе, более конкретно - гематотуморальный барьер опухолей нервной ткани.

Пептиды и псевдопептиды, описанные в настоящем изобретении, обладают способностью нацеливаться на клеточные рецепторы/переносчики и определенные типы клеток и/или пересекать клеточные мембраны, а именно те, что образуют физиологические барьеры в центральной нервной системе, и это можно использовать для лечения конкретных инфекционных патологических состояний мозга или иных патологических состояний бактериальной, вирусной, паразитарной или грибковой природы.

Пептиды и псевдопептиды, описанные в настоящем изобретении, обладают способностью связываться с мышиным или человеческим ΓΟΓΚ клеточной мембраны и проходить через указанную мембрану с помощью этого рецептора путем трансцитоза.

Пептиды и псевдопептиды, описанные в настоящем изобретении, обладают способностью связываться с ЬПЬК на поверхности клеточных мембран, образующих физиологические барьеры в мозгу у мыши и человека и проходить через указанные барьеры с помощью ГОКК путем КМТ.

Один из объектов настоящего изобретения, таким образом, является пептидом или псевдопептидом, характеризующимся общей формулой (I)

где А1 представляет цистеин или его аналог или его изостер:

А2 представляет пролин или его аналог или его изостер;

А3 представляет глицин или его аналог или его изостер.

Конкретнее, группа А1 представляет остаток аминокислоты, выбираемой из цистеина (Су8, С) в Ό- или Ь-конфигурации или его производного, выбираемого из 2-амино-3-меркаптопропановой кислоты и ее 8-замещенных производных, δ-ацитилцистеина или 2-амино-3-(ацетилтио)пропановой кислоты, селеноцистеина (8ес, И) или 2-амино-3-(селено)пропановой кислоты, цистеинола, 3-меркаптопропановой кислоты (Мра) или пеницилламина (Реп) в Ь- или Ό-конфигурации.

Группа А2 представляет более предпочтительно остаток аминокислоты, выбираемой из пролина (Рго, Р) или пирролидин-2-карбоновой кислоты, гомопролина или 2-(2-пирролидинил)этановой кислоты, 3-гидроксипролина (3Нур), 4-гидроксипролина (4Нур), 3-метилпролина, 3,4-дегидропролина, 3,4-метанопролина, 4-аминопролина, 4-оксопролина, тиопролина или тиазолидин-4-карбоновой кислоты (ΤΗζ), 2-оксотиазолидин-4-карбоновой кислоты, индолин-2-карбоновой кислоты (Ис), пипеколиновой кислоты (Р1р) или пиперидин-2-карбоновой кислоты, нипекотовой кислоты (№р) или пиперидин-3карбоновой кислоты, 4-оксопипеколиновой кислоты, 4-гидроксипипеколиновой кислоты, амино-1- 7 022422 циклогексанкарбоновой кислоты, пролинола.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения группу А2 выбирают из пролина, пипеколиновой кислоты (Ρίρ) или тиазолидин-4-карбоновой кислоты (Τΐιζ).

Группа А3 представляет более предпочтительно остаток аминокислоты, выбираемой из глицина (С1у, С) или 2-аминометановой кислоты, саркозина (Зат) или Ν-метилглицина (МеС1у), Ν-этилглицина (Е(С1у). аллилглицина (а11у1С1у) или 2-аминопент-4-еновой кислоты, 2-циклопентилглицина (Срд), 2-циклогексилглицина (СЬд), 2,2-дипропилглицина (Юрд), 2-(3-индолил)глицина (1ибС1у), 2-инданилглицина (1д1), 2-неопентилглицина (ΝρΐΌ^), 2-октилглицина (ОсЮ1у), 2-пропаргилглицина (Рга) или 2-аминопент-4-иновой кислоты, 2-фенилглицина (РЬд), 2-(4-хлорфенил)глицина, азаглицина (АζС1у), или глицинола, или 2-аминоэтанола. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения группу А3 выбирают из глицина и саркозина.

Среди пептидов и псевдопептидов формулы (I) особенно предпочтительны пептиды, в которых группа А3 является глицином. Таким образом, конкрентный объект настоящего изобретения является пептидом, описываемым формулой (I')

где А1 представляет цистеин или его аналог или его изостер, предпочтительно А1 представляет Сук, (И)-Су5, Реп или (Э)-Реп;

А2 представляет аналог пролина, предпочтительно А2 представляет Р1р или Τΐιζ.

Ниже описаны конкретные примеры пептидов по данному изобретению:

ЗЕф ΙϋΝΟ: 1, (Т))-су£-МеТР1р-Атд-Теи-Агд-О1у-Сув;

ЗЕф ΙϋΝΟ: 2, (О)-реп-МеБР1р-Агд-Ьеи-Агд-О1у-Суз;

ЗЕф Ю ΝΟ: 3, Реп-Ме1-Р1р-Аг§-Ееи-Агд-О1у-Су5;

ЗЕф ГО N0: 4, (О)-су5-МеГ-ТЬг-Агд-Ьеи-Аг§-Сг1у-Су5;

ЗЕф ГО ΝΟ: 5, (Орреп-МеЕТЬг-Агд-Ьеи-Агд-СНу-Суз;

ЗЕф ΙϋΝΟ: 6,Реп-МеБТЬг-Агд-Ьеи-Агд-СЛу-Суз;

ЗЕф ГО N0: 7, (Г))-суз-Ме1-ТЬг-Агд-1>еи-Аг§-5аг-СуБ;

ЗЕф ГО N0: 8, (В)-реп-Ме1-Т1к-Аг§-Ееи-Аг§-Заг-Су8;

ЗЕф ГО N0: 9, Реп-МеСПи-Агд-Ьеи-Агд-Заг-Суз;

ЗЕф ГО N0: 10, (О)'Су5-МеТ-Рго-Аг§-Ьси-Аг§-(О)-а1а-Су8.

Результаты, полученные авторами изобретения, показывают, что пептиды по данному изобретению обладают улучшенным сродством к ЕВШ. Так, по сравнению с пептидом сравнения ЗЕф ГО N0: 17 все испытанные пептиды формулы (I) проявляли улучшенное сродство, как можно видеть из табл. 1 (пример 3). Эти результаты особенно примечательны, так как модификация других аминокислотных остатков в последовательности пептида, например замена остатков аргинина, приводит к значительному падению сродства (см. пептиды сравнения ЗЕф ГО N0: 11-16).

ЗЕф ГО N0:11, (П)-Су8-Ме1-Рго-ЬАг§-Ьеи-Аг§-01у-Суз;

ЗЕф ΙΒΝΟ: 12, (П)-Суз-Мс(-Рго-А§Ь-Теи-Аге-С1у-Су5;

ЗЕф ΙΟΝΟ: 13, (Е>)-Суз-Ме1-Рго-А§р-Ееи-Агд-О1у-Су8;

ЗЕф ГО ΝΦ: 14, (О)-Суз-Ме{-Рго-Сп-Ьси-Аг§-С1у-Суз;

ЗЕф ГО N0:15, (ОЬСуз-Мег-Рго-Агд-Ьеи-Сй-СПу-Суз;

ЗЕф ПЭ N0: 16, (О)*Суз-Ме1-Рго-Аг8-Ееи-Аг^(кО2)-О1у-Су8;

ЗЕф Ш N0: 17, (0)-Су8-Ме1-Рго-Аг§-Ьеи-Аг8-01у-Суз.

Эти результаты также особенно замечательны ввиду малых молекулярных размеров этих пептидов (перечисленные выше пептиды состоят из 8 аминокислотных остатков), что дает дополнительное преимущество для промышленного применения.

Как сказано выше, циклические пептиды или псевдопептиды по данному изобретению могут содержать пептидные, непептидные и/или модифицированные пептидные связи. В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения пептиды или псевдопептиды содержат по меньшей мере одну связь, имитирующую пептидную, которую выбирают предпочтительно из интеркаляции метиленовой (-СН₂-) или фосфатной (-РО₂-) группы, вторичного амина (-ΝΗ-) или кислорода (-О-), альфа-азапептидов, альфа-алкилпептидов, Ν-алкилпептидов, фосфонамидатов, депсипептидов, гидрокисметиленов, гидроксиэтиленов, дигидроксиэтиленов, гидроксиэтиламинов, ретроинвертированных пептидов, метиленокси, кетометилен, эфиров, фосфинатов, фосфинов, фосфонамидов и карбааналогов.

Кроме того, в одном конкретном воплощении настоящего изобретения пептиды или псевдопептиды содержат Ν-концевую и/или С-концевую функциональную группу, соответствующим образом защищенную, например, путем ацилирования, или амидирования, или этерификации.

- 8 022422

Пептиды и псевдопептиды по настоящему изобретению можно синтезировать любым методом, известным специалистам в данной области техники (химический, биологический или генетический синтез и др.). Их можно хранить как таковые либо в комбинации с веществом, представляющим интерес для пользователя, либо любым приемлемым эксципиентом.

Для химического синтеза в промышленном оборудовании используются как природные аминокислоты, так и неприродные, например Ό-энантиомеры и остатки с боковыми цепями, обладающими гидрофобностью и стерическими параметрами, отличными от природных гомологичных соединений (так называемые экзотические, или некодируемые аминокислоты), или же пептиды, в последовательности которых имеются связи, имитирующие пептидную, которые могут включать в особенности интеркаляцию метиленовой (-СН₂-) или фосфатной (-РО₂-) группы, вторичный амин (-ΝΗ-), или кислород (-О-), или Νалкилпептид.

В процессе синтеза можно осуществлять различные химические модификации, например вводить липидное (или фосфолипидное производное) или часть липосомы либо наночастицу на Ν-конец или на С-конец или в боковую цепь, чтобы пептиды или псевдопептиды по данному изобретению приобрели способность включаться в липидные мембраны, например в мембрану липосомы, состоящие из одного или более липидных моно- или бислоев, или же в наночастицы.

Пептиды по настоящему изобретению или их белковые части можно получать исходя из кодирующей их нуклеотидной последовательности. Настоящее изобретение относится также к молекулам нуклеиновых кислот, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие такие пептиды, как описано выше, или состоящие из этих нуклеотидных последовательностей. Более конкретно, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, содержащим по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид с общей формулой (I). Эти нуклеотидные последовательности могут принадлежать ДНК или РНК и могут быть объединены с контрольными последовательностями и/или введены в состав биологических экспрессионных векторов.

Биологический экспрессионный вектор для использования по данному изобретению выбирают в соответствии с тем, в какие клетки-хозяева его будут вводить. Им может быть, например, плазмида, космида, вирус и др. Настоящее изобретение относится, в частности, к этим нуклеиновым кислотам и биологическим экспрессионным векторам, которые можно использовать для получения пептидов по данному изобретению или их белковых частей, в клетках-хозяевах. Эти биологические экспрессионные векторы и пептиды могут быть получены при помощи методов молекулярной биологии и генетической инженерии, известных специалистам в данной области техники.

Другой объект настоящего изобретения относится к применению описанных выше циклических пептидов или псевдопептидов в качестве векторов для переноса/транспорта веществ, имеющих терапевтическое либо диагностическое значение, или визуализирующих агентов, или любых других веществ.

Настоящее изобретение также относится к применению описанных выше циклических пептидов или псевдопептидов для получения лекарств, способных проходить через гематоэнцефалический барьер.

Настоящее изобретение также относится к способу для обеспечения или улучшения перехода веществ через гематоэнцефалический барьер, включающему присоединение вещества, представляющего интерес для пользователя, к пептиду или псевдопептиду по данному изобретению.

Таким образом, настоящее изобретение относится, в частности, к конъюгированным соединениям, имеющим формулу (II)

УхОу (II) где V представляет пептид или псевдопептид по данному изобретению;

И представляет активное вещество или вещество, интересующее пользователя; х и у являются целыми числами от 1 до 5.

В одном конкретном воплощении данного изобретения х и у равны 1, х больше у или у больше х.

Настоящее изобретение относится также к конъюгированным соединениям, имеющим формулу (III)

УхЬгПу (III) где V представляет пептид или псевдопептид по данному изобретению;

Ь представляет спейсер;

И представляет активное вещество или вещество, интересующее пользователя; х и у являются целыми числами от 1 до 5; ζ - целое число от 1 до 10.

В одном конкретном воплощении данного изобретения χ=ζ=γ=1, или χ=ζ>^, или у=ζ>x, или ζ>χ^.

Активное вещество или вещество, интересующее пользователя, может быть любым веществом, имеющим фармацевтическое значение, в особенности терапевтическим, диагностическим или медицинским визуализирующим агентом, или молекулярным зондом. В частности, оно может быть любой химической структурой, представляющей биологический интерес, например соединением с небольшими молекулярными размерами (антибиотиком, противовирусным, противораковым или противовоспалительным агентом, иммуномодулятором и др.), пептидом или полипептидом, белком (ферментом, гормоном, цитокином, аполипопротеином, фактором роста, антигеном, антителом или частью антитела), нуклеиновой кислотой (рибонуклеиновой кислотой или дезоксирибонуклеинововй кислотой, происходящей из

- 9 022422 эукариотического организма, в том числе человека, животного или растения, или из прокариотического организма, или из вируса, или полученной синтетическим путем и др., молекулярные размеры которой варьируют от олигонуклеотида до генома - целого или его фрагментов), вирусным геномом или плазмидой, рибозимом, маркером или меткой. Как правило, веществом, интересующим пользователя, может быть активный ингредиент лекарственного препарата, будь то природное вещество или соединение, получаемое биохимическим, химическим или синтетическим путем. Выражения химическое вещество с небольшими молекулярными размерами и небольшие молекулы здесь обозначают фармацевтически значимые вещества с молекулярной массой не более 1000 Да, обычно от 300 до 700 Да.

Настоящее изобретение также относится к соединениям с формулой (IV) νχΕζ (IV) где V представляет пептид или псевдопептид по данному изобретению;

Ь представляет спейсер; х является целым числом от 1 до 5; ζ - целое число от 1 до 10.

В одном конкретном воплощении данного изобретения χ=ζ=1 или ζ>χ.

В конъюгатах по данному изобретению присоединение V к Ό или V к Ь, с одной стороны, и Ь к Ό, с другой стороны, может осуществляться за счет любых приемлемых связей в зависимости от химической природы, стерических параметров и числа связываемых активных веществ и пептидов или псевдопептидов. Присоединение, таким образом, может осуществляться одной или более из ковалентных, ионных, водородных связей, гидрофобных или ван-дер-ваальсовых взаимодействий, расщепляемых или нерасщепляемых в физиологической среди или внутри клеток. Кроме того, Ό может присоединяться к V (при необходимости посредством Ь) по различным реакционноспособным группам, в особенности к одной или более Ν-концевых и/или С-концевых групп, и/или по одной или более из реакционноспособных групп в боковых цепях остатков природных или неприродных аминокислот, входящих в состав V.

Присоединение может происходить в любом месте пептида или псевдопептида, где находятся изначально или могут быть введены функциональные группы, например -ОН, -§Н, -СО₂Н, -ΝΗ₂, -§О₃Н или -РО₂Н. Таким образом, вещество, имеющее терапевтическое или диагностическое значение либо визуализирующий агент или любое другое вещество, например молекулярный зонд, можно связать (соединить) с пептидным или псевдопептидным вектором ковалентной связью к Ν- или С-концу или к реакционноспособным группам, имеющимся в боковых цепях остатков природных или неприродных аминокислот в последовательности пептида.

Сходным образом присоединение может быть осуществлено в любом месте активного вещества или вещества, представляющего интерес для пользователя (терапевтического, диагностического или визуализирующего агента, любого другого вещества, например, молекулярного зонда), в котором присутствуют от природы или были введены функциональные группы, например -ОН, -§Н, -СО₂Н, -ΝΗ₂, -§О₃Н, -РО₂Н.

Взаимодействие должно быть предпочтительно достаточно сильным, чтобы конъюгат пептида и активного вещества не диссоциировал прежде, чем достигнет места своего действия. Поэтому предпочтительным типом соединения компонентов конъюгата по данному изобретению является ковалентная связь, хотя можно использовать и нековалентное связывание. Вещество, представляющее интерес для пользователя, может быть присоединено к пептиду непосредственно (тандемный синтез) на одном из концов пептида (Ν- или С-конце) либо к боковой цепи одного из аминокислотных остатков, составляющих пептид (Мащшйаг апй ЕааНаап. Мей Ке8 Ксу., ЕриЬ айеай οί ρτίηΐ). Вещество, представляющее интерес для пользователя, может быть присоединено к пептиду не напрямую, а через спейсерную/линкерную структуру к одному из концов пептида или же к боковой цепи одного из аминокислотных остатков, составляющих пептид (фиг. 2). Средства химического ковалентного связывания - со спейсером или без него - включают выбираемые из би- или полифункциональных агентов, содержащих алкильные, арильные или пептидные группы, эфиры, альдегиды или алкилы или арилы кислот, ангидридные, сульфгидрильные или карбоксильные группы, группы, происходящие из цианогенбромида или цианогенхлорида, карбонилдиимидазол, сукцинимидные эфиры или сульфонилгалиды.

В этой связи настоящее изобретение относится также к способу получения описанных выше конъюгатов, характеризующемуся тем, что включает стадию присоединения пептида или псевдопептида V к веществу Ό, при необходимости посредством Ь, предпочтительно химическим, биохимическим или ферментативным путем или путем генетической инженерии.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, характеризующимся тем, что они содержат по меньшей мере один конъюгат из числа описанных выше и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.

Настоящее изобретение относится также к диагностическим композициям, характеризующимся тем, что они содержат диагностический или медицинский визуализирующий агент, состоящий из описанных выше конъюгатов.

Такой конъюгат может использоваться в форме любой фармацевтически приемлемой соли. Выражение фармацевтически приемлемые соли относится (приводимые ниже примеры не ограничивают

- 10 022422 объема изобретения) к солям присоединения фармацевтически приемлемых оснований или кислот, гидратам, эфирам, сольватам, предшественникам, метаболитам или стереоизомерам, указанным векторам или конъюгатам, несущим по меньшей мере одно вещество, представляющее интерес для пользователя.

Выражение фармацевтически приемлемые соли относится к нетоксичным солям, которые обычно можно получить в результате взаимодействия свободного основания с подходящей органической или неорганической кислотой. Эти соли сохраняют биологическую эффективность и свойства свободных оснований. Характерные примеры таких солей включают растворимые в воде и нерастворимые в воде соли: ацетаты, Ν-метилглюкаминаммоний, амсонаты (4,4-диаминостильбен-2,2'-дисульфонаты), бензолсульфонаты, бензонаты, бикарбонаты, бисульфаты, битартраты, бораты, гидробромиды, бромиды, бутираты, камзилаты, карбонаты, гидрохлораты, хлориды, цитраты, клавуланаты, дихлоргидраты, дифосфаты, эдетаты, кальция эдетаты, эдизилаты, эстолаты, эзилаты, фумараты, глуцептаты, глюконаты, глутаматы, гликозиларсанилаты, гексафторфосфаты, гексилрезоорцинаты, гидрабамины, гидроксинафтоаты, йодиды, изотионаты, лактаты, лактобионаты, лаураты, малаты, малеаты, манделаты, мезилаты, метилбромиды, метилнитраты, метилсульфаты, мукаты, напсилаты, нитраты, 3-гидрокси-2-нафтоаты, олеаты, оксалаты, пальмитаты, памоаты (1,1-метилен-бис-2-гидрокси-3-нафтоаты, или эмбоаты), пантотенаты, фосфаты, пикраты, полигалактуронаты, пропионаты, пара-толуолсульфонаты, салицилаты, стеараты, субацетаты, сукцинаты, сульфаты, сульфосалицилаты, зураматы, таннаты, тартраты, теоклаты, тозилаты, триэтииодиды, трифторацетаты и валерианаты.

Композиции по данному изобретению предпочтительно содержат фармацевтически приемлемый вектор или эксципиент. Фармацевтически приемлемый вектор может быть выбран из векторов, обычно используемых для того или иного способа введения в организм. Соответственно предусматриваемому способу введения препараты могут быть в твердой, полутвердой или жидкой форме. В случае твердых композиций в форме таблеток, пилюль, порошков или гранул, которые могут быть включены в желатиновые капсулы, активное вещество объединяют с а) разбавителями, например лактозой, декстрозой, сахарозой, маннитом, сорбитом, целлюлозой и/или глицином; Ь) агентами, улучшающими скольжение, например двуокисью кремния, тальком, стеариновой кислотой, ее магниевой или кальциевой солью и/или полиэтиленгликолем; с) связующими агентами, например силикатом магния или алюминия, крахмальной пастой, желатином, трагакантовой камедью, метилцеллюлозой, карбоксиметилцеллюлозой натрия и/или поливинилпиррорлидоном; й) разрыхляющими (дезинтегрирующими) агентами, например крахмалом, агаром, альгиновой кислотой или ее натриевой солью или шипучими смесями; и/или й) абсорбентами, красителями, ароматизаторами и подсластителями. В качестве эксципиента могут служить маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин-натрий, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза, карбонат магния и аналогиченые агенты фармацевтического качества. Для композиций в полутвердой форме, например суппозиториев, эксципиентом могут служить, например, эмульсия или масляная суспензия или какой-либо полиалкиленгликоль, например полипропиленгликоль. Композиции в жидкой форме, в особенности используемые для инъекций или включаемые в мягкие капсулы, можно получить, например, путем растворения, дисперсии и пр. активного вещества в фармацевтически чистом растворителе, например в воде, физиологическом растворе, водном растворе декстрозы, глицерине, этиловом спирте, масле и аналогичных субстанциях.

Композиции или конъюгаты по данному изобретению можно вводить в организм любым подходящим путем, например (нижеследующие примеры не ограничивают объем изобретения) парентеральным (в форме препаратов, инъецируемых подкожно, внутривенно или внутримышечно); пероральным (в форме таблеток с оболочкой или без нее, желатиновых капсул, порошков, пастилок, супензий или растворов для перорального введения (одна такая форма для введения через рот может быть с немедленным высвобождением активного вещества или пролонгированным, или отсроченным высвобождением); ректальным, например в форме суппозиториев; местно, в частности через кожу, например в форме пластырей, помад или гелей; интраназальным, например в форме аэрозолей и спреев; перлингвальным или интраокулярным.

Фармацевтические композиции по данному изобретению обычно содержат эффективную дозу пептида или псевдопептида или конъюгата. Выражение терапевтически эффективная доза в контексте настоящего документа означает такую дозу, которая обеспечивает лечебный эффект при данном состоянии и схеме введения. Как правило, это средняя доза активного вещества, которая должна быть введена в организм для облегчения некоторых симптомов, связанных с данным заболеванием или патологическим состоянием. Например, при лечении рака мозга или другой ткани, патологического состояния, повреждения или расстройства центральной нервной системы терапевтически эффективной будет такая доза активного вещества, которая ослабляет, предотвращает, задерживает появление, ликвидирует или прекращает одну из причин или один из симптомов данного заболевания или расстройства.

В терапевтически эффективной дозе активное вещество необязательно вылечивает заболевание или расстройство, но имеет такой лечебный эффект, что данное заболевание или состояние предотвращается, начинается позже или медленнее прогрессирует, или ослабляются его симптомы, или сокращается продолжительность заболевания или расстройства, или снижается степень его тяжести, или ускоряется выздоровление.

- 11 022422

Следует учитывать, что терапевтически эффективная доза для данного индивида зависит от различных факторов, включая активность/эффективность активного вещества, время его введения, путь введения, скорость выведения из организма, его метаболизм в организме, взаимодействие с другими лекарствами, тяжесть заболевания или расстройства, цель введения (профилактика или лечение), а также возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и/или питание пациента.

В зависимости от того, с каким веществом соединяют пептиды или псевдопептиды по данному изобретению, конъюгаты и композиции могут применяться для лечения, профилактики, диагностирования или визуализации множества патологических состояний, в особенности поражающих центральную нервную систему, инфекционных или раковых заболеваний.

В этой связи настоящее изобретение относится к применению описанных выше фармацевтических конъюгатов или композиций для лечения или профилактики патологических состояний или расстройств центральной нервной системы, опухолей мозга или иных раковых клеток, патологические состояния мозговой или иных тканей, обусловленные бактериальными, вирусными, паразитарными или грибковыми инфекциями.

Настоящее изобретение также относится к применению описанных выше фармацевтических конъюгатов или композиций для диагностики или визуализации патологических состояний или расстройств центральной нервной системы, опухолей мозга или иных раковых клеток, патологических состояний мозговой или иных тканей, обусловленных бактериальными, вирусными, паразитарными или грибковыми инфекциями.

Настоящее изобретение также относится к применению описанных выше конъюгатов или композиций для лечения, визуализации и/или диагностики опухолей мозга или иных раковых клеток.

Настоящее изобретение относится также к применению описанных выше конъюгатов и композиций для лечения, визуализации и/или диагностики опухолей мозга или раковых клеток других типов. Исследования показали, что при некоторых раковых заболеваниях имеет место гипохолестеринемия. Эта гипохолестеринемия является следствием интенсивного потребления холестерина раковыми клетками. В тех органах, где есть раковая опухоль, опухолевые клетки вызывают повышение уровня экспрессии ЬИЬК (Неттскккоп е! а1., 1989, Ьапсе!, 2(8673), 1178-1180). Существует, таким образом, корреляция между возрастанием уровня экспрессии ЬИЬК в клетках и определенными раковыми заболеваниями. Также недавно было показано, что на поверхности определенных патологически измененных клеток, в том числе раковых, присутствует очень много ЬИЬК. Обычно считается, что на поверхности нормальной клетки находится 1000-3000 ЬИЬК, а у нейронов этих рецепторов лишь немного (РЬак е! а1., 1987, 1. Вю1. СЬет., 262, 14352-14360). Было продемонстрировано, что при глиобластоме имеет место чрезмерная экспрессия ЬИЬК. Так, на поверхности опухолевых мозговых клеток количество ЬИЬК оценивается в 125000 (клетки И-251) - 900000 (клетки БР-767) (Ма1епЬкка е! а1., 2000, Сапсег Кек., 60, 2300-2303; №кап)ат е! а1., 2007, 1п!. 1. РЬагт., 328, 86-94). Следует также отметить, что чрезмерная экспрессия ЬИЬК свойственна многим раковым клеткам, например при раке предстательной железы (СЬеп е! а1., 2001, 1п!. 1. Сапсег, 91, 41-45), раке толстой кишки (№епйот£ е! а1., 1995, 1п!. 1. Сапсег, 61, 461-464), лейкозе (ТаЬЙ1К е! а1., 2002, ВюсЬет. РЬагтасо1., 63, 2169-2180), колоректальном раке (Сагико е! а1., 2001, АпЬсапсег Кек., 21, 429433), раке молочной железы (Οπι/ίππί е! а1., 2002, Супесо1. Опсо1., 85, 493-497), а также печени, поджелудочной железы, яичников, легких, желудка и др.

Настоящее изобретение относится также к применению описанных выше конъюгатов и композиций для лечения, визуализации и/или диагностики патологических изменений мозга или других тканей, обусловленных бактериальной, вирусной, паразитарной или грибковой инфекцией, например (приведенные ниже примеры не ограничивают объем изобретения) СПИДом или менингитом и др. ЬИЬК присутствуют и на клетках печени. Известно, что эндоцитоз вируса гепатита С (НСУ) может осуществляться при участии ЬИЬК. ЬИЬК может служить в качестве рецептора вируса на ранней стадии инфекции НСУ в гепатоцитах человека (МоЬпа е! а1., 2007, 1. Нера!о1., 46(3), 411-419). Таким образом, конъюгаты по данному изобретению можно использовать для специфичного нацеливания на патологически измененные клетки, инфицированные вирусами, например вирусами гепатита В и С, в которых экспрессируется ЬИЬК, и/или через ЬИЬК влиять на вирусную инфекцию в нормальных клетках.

Настоящее изобретение относится также к применению описанных выше конъюгатов и композиций для лечения, визуализации и/или диагностики нейродегенеративных патологических состояний, например (приведенные ниже примеры не ограничивают объем изобретения) болезней Паркинсона, Альцгеймера и Крейтцфельдта-Якоба, инсульта, губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (коровьего бешенства), рассеянного склероза, бокового амиотрофического склероза и др.

Настоящее изобретение относится также к применению описанных выше конъюгатов и композиций для лечения, визуализации и/или диагностики неврологических патологических состояний, например (приведенные ниже примеры не ограничивают объем изобретения) эпилепсии, мигрени, энцефалита, болевого синдрома, обусловленного патологическим состоянием центральной нервной системы, и др.

Настоящее изобретение относится также к применению описанных выше конъюгатов и композиций для лечения, визуализации и/или диагностики психиатрических патологических состояний, например (приведенные ниже примеры не ограничивают объем изобретения) депрессии, аутизма, шизофрении,

- 12 022422 тревожного синдрома и др.

Термины лечение, лечить, лечебное мероприятие и т.п. выражения относятся к получению фармакологического и/или физиологического эффекта, например подавления злокачественного роста, гибель раковых клеток или положительной динамики заболевания или неврологического расстройства. Этот эффект может быть профилактическим или предупреждающим, т.е. полностью или частично предотвращать усугубление болезни или симптомов у больного индивида или ее/его возникновение у здорового, и/или этот эффект может быть терапевтическим, т.е. полностью или частично излечивать заболевание и/или связанные с ним вредные явления. Термин лечение в контексте настоящего документа охватывает любое лечение болезней у млекопитающих, в частности у человека, и включает (а) предотвращение заболевания (например, предотвращение рака) или состояния, которое может возникнуть у индивида с предрасположением к такому расстройству или патологическому состоянию, но еще не диагностировано с определенностью; (Ь) замедление заболевания (например, путем прекращения его прогрессирования) или (с) облегчение состояния больного (например, путем ослабления симптомов, связанных с данным заболеванием). Термин лечение также охватывает любое введение активного вещества с целью повлиять на патологическое состояние больного (вылечить, облегчить, улучшить динамику, снизить степень тяжести или подавить), включая (перечисленное ниже не ограничивает объем изобретения) введение нуждающемуся в том индивиду препарата, состоящего из вектора или конъюгата, описанных в настоящем документе.

Настоящее изобретение относится также к применению пептидов или псевдопептидов по данному изобретению с целью увеличения биологической активности активного вещества или вещества, интересующего пользователя (терапевтического, диагностического или визуализирующего агента или любого другого вещества, например молекулярного зонда), с которым соединен пептид или псевдопептид.

Настоящее изобретение относится также к применению пептидов или псевдопептидов по данному изобретению с целью снижения токсичности активного вещества или вещества, интересующего пользователя (терапевтического, диагностического или визуализирующего агента или любого другого вещества, например молекулярного зонда), с которым соединен пептид или псевдопептид.

Другие аспекты и преимущества данного изобретения станут ясными из рассмотрения приведенных ниже примеров, которые служат только иллюстративной цели и не ограничивают объем настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. Получение линий клеток СНО со стабильной экспрессией человеческого и мышиного ЬПЬК.

Авторы настоящего изобретения идентифицировали предлагаемые здесь пептиды на основании их взаимодействия с человеческим и мышиным рецептором липопротеинов низкой плотности (НЬЭЬК и тЬЭЬК соответственно), который, как известно, участвует в эндоцитозе и трансцитозе (транспорте через клетку, в том числе через гематоэнцефалический барьер) холестерина и на основании их сродства к этим рецепторным белкам. Для этого были получены линии эукариотических клеток (клеток китайского хомячка, СНО) с выраженной стабильной экспрессией НЬЭЬК и тЬЭЬК с высокой скоростью. Эти линии клеток использовали для I) определения связывания пептидов по данному изобретению с НЬЭЬК. экспрессирумым на поверхности клеток, в его нативной конфигурации; II) проверки того, что НЬЭЬР и тЬЭЬК могут обеспечить проникновение выбранных пептидов внутрь клеток путем эндоцитоза.

Получение этих линий клеток описано в заявке АО 2010/046588. Вкратце, в базах данных имеются сведения о последовательностях мРНК, кодирующих НЬЭЬВ и тЬЭЬВ (номера доступа ΝΜ 000527 и ΝΜ 010700 соответственно). Подбирали праймеры, требующиеся для амплификации кДНК путем полимеразной цепной реакции, содержащие на концах сайты рестрикции (в приведенных ниже последовательностях выделены жирным шрифтом), а именно ΗίηάΙΙΙ и 8аИ для человеческого ЬПЬК, ΗίηάΙΙΙ и ΚρηΙ для мышиного ЬПЬК, необходимые для клонирования в экспрессионном векторе ρΕ0ΡΡ-Ν1 (С1оШссП):

ΑΖ,ΏΕΛ

Прямой праймер: АТАТАТААССТТСОАООАСАС АОСАООТСОТОАТ (ЗЕф ГО ΝΟ: 18)

Обратный праймер:ТТААТТСТССАССАСОССАСОТСАТССТССАОАСТ(8Е0 ГОРЮ:

19) тЫ)ЬК

Прямой праймер: АТАТАТААССТТОАСОСААСОСАОААОСТААО (8Еф ГО ΝΟ: 20)

Обратный праймер: ТТААТТССТАССОТТОССАСАТСОТССТССАО (8Ер ΙϋΝΟ: 21)

Из тотальной РНК, выделенной из мозговой ткани (человеческой и мышиной), путем обратной транскрипции получали кДНК для амплификации путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) тех фрагментов ДНК, которые кодируют ЬЕОЬК и тЬЭРК После амплификации продукты ПЦР расщепляли рестриктазами ΗίηάΙΙΙ-8;·ι1Ι и ΗίηάΙΙΙ-ΚρηΙ соответственно и вставляли в экспрессионный вектор

- 13 022422 рЕСРР-ΝΕ обработанный теми же ферментами. Трансфицированный в эукариотические клетки этот вектор обеспечивает экспрессию (под контролем промотора СМУ) ЬОЬР. соединенного с ОРР на С-конце, т.е. на конце внутриклеточного домена (фиг. 3). Трансформировали компетентные клетки Е.соП ЭН5а и получали изолированные колонии и плазмидную ДНК, причем для проверки определяли полные последовательности обеих цепей гибридной ДНК.

Проводили временную трансфекцию различных линий клеток (СНО, СОЗ, Ν2Α и ΗΕΚ 293), чтобы определить на живых или фиксированных клетках уровни экспрессии и мембранную локализацию ЬБИБК и тБИБК. При помощи флуоресцентной микроскопии можно непосредственно, без иммунологического окрашивания видеть этот рецептор на живых клетках благодаря зеленой флуоресценции ΟΡΡ, присоединенного к С-концу рецептора. Стабильные трансфицированные клетки отбирали путем предельного разведения и с помощью гена устойчивости к генетицину (0418), присутствующего в экспрессионном векторе. Зги клеточные линии размножали при постоянном давлении отбора. В приведенном здесь примере экспрессию НБЭБК-СРР ожидаемого размера проверяли путем вестерн-блоттинга клеточных лизатов с антителами против человеческого БЭБК и против 0РР. Белок, соответствующий суммарному размеру 0РР и НБЭБК (190 кДа), выявляли с помощью антител против НБЭБК (фиг. 4) и антител против 0РР в экстрактах, полученных из клеток стабильных линий. Клетки линии СНО со значительной экспрессией 0РР использовали в качестве отрицательного контроля. Антитела против НБЭБК не выявляли соответствующего белка в клетках этой линии 0РР.

Иммуноцитохимический анализ с антителами против НБЭБК на фиксированных (РРА) клетках линии СНО-ОРР (контроль) и клетках линий СНО-НБИБК-ОРР показал, что в трансфицированных клетках хорошо экспрессируется гибридный белок НБЭБК-СРР. Иммуноцитохимический анализ на клетках, не пермеабилизированных тритоном Х100, показал, что внеклеточный домен БЭБК хорошо определяется вне клеток (фиг. 5).

Совпадение локализации НБЭБК и его естественного лиганда БЭБ было продемонстрировано с помощью поглощения флуоресцентного маркера ΌίΙ. Этот естественный флуоресцирующий лиганд (ΟίΙ-БЭБ) быстро переходил внутрь клеток путем эндоцитоза, что можно было видеть путем флуоресцентной микроскопии на фиксированных клетках (фиг. 6А). И напротив - ΟίΙ-БЭБ не включался путем эндоцитоза в клетки контрольной линии СНО-ОРР или в клетки другой контрольной линии с аномально высоким уровнем экспрессии, например, человеческого рецептора трансферрина (НТБК, фиг. 6В), также участвующего в трансцитозе. Кроме того, активность эндоцитоза в клетках линии СНО-БЭБК-СРР специфична в отношении лиганда БИБК, поскольку в клетках этой линии не наблюдался эндоцитоз неспецифичного к этому рецептору лиганда, например трансферрина (ТБ), окрашенного флуорохромом техасский красный (фиг. 6С).

Функциональность рецептора (способность к эндоцитозу) подтверждается экспериментами, в которых проводилась видеозапись в реальном времени с помощью флуоресцентного микроскопа; было показано, что БИБ, естественный лиганд ПБЭБК, окрашенный ΌίΙ, действительно быстро и эффективно транспортируется в клетках, в которых экспрессируется НБИБК-ОРР, по сравнению с клетками, в которых экспрессируется только ОРР, или в клетках, в которых экспрессируется другой рецептор, участвующий в эндоцитозе, например НТБК (отрицательный контроль). Напротив, аналогичные эксперименты, в которых использовали трансферрин, окрашенный техасским красным, который очень эффективно включался путем эндоцитоза в клетки с экспрессией НТБК.-ОРР, подтвердили, что трансферрин не включается путем эндоцитоза в клетки контрольной линии ОРР или в клетки линии ПБЭБК.

Несмотря на высокий уровень экспрессии НБЭБК в клетках линий СНО-ПБЭБК-ОРР, система эндоцитоза не только эффективна, но и сохраняет свою избирательность. Присутствие присоединенного ОРР не влияет ни на мембранные свойства НБЭБК (внеклеточный домен НБЭБК выступает из клетки), ни на функциональность рецептора в процессе эндоцитоза.

Пример 2. Синтез пептидов и соединение их с меткой (биотином, флуоресцеином или З-Тад с ферментативной активностью).

Пептиды получали методом твердофазного синтеза (8РРЗ) на синтезаторе Айуаисей СНетТесН Арех396 (ААРРТес) или на микроволновом синтезаторе ЫЪейу™ (СЕМ) согласно методу РтосЙВи, применяя амидную смолу Ринка АМ (полистерол-1%дивинилбензол), смолу Вонга (полистерол1%дивинилбензол), смолу Барлоса (2-хлортритилхлорид) (полистерол-1%дивинилбензол) или амидную смолу Зибера (полистерол-1%дивинилбензол). Загрузка (или степень замещения) составляла от 0,25 до 1,6 ммоль/г соответственно используемой смоле.

Аминокислоты с Ν-концом, защищенным Ртос (или Вос в некоторых случаях) и/или с боковыми группами, защищенными по ортогональной схеме (особенно лабильные кислотные группы), сшивающие агенты, депротекторы и растворители приобретали в специализированных компаниях и использовали без изменений.

Амидная смола Ринка и смола Вонга позволяют синтезировать аминокислотные последовательности с полностью депротектированными боковыми цепями и С-концом. Таким образом, это твердофазный синтез пептидов с ортогональной двойной защитой функциональных групп (Ртос/БВи).

- 14 022422

Кислотолабильные смолы Барлоса и Зибера (НАЬ) соответственно позволяют освободить концевую (С-конец) кислотную или амидную группу, в то же время сохраняя ортогональную защиту функциональных групп боковых цепей различных аминокислотных остатков синтезируемого пептида, а также защиту концевой (Ν-конец) аминогруппы последней аминокислоты (например, Ν-ацетилирование для стабильности новосинтезированной аминокислотной последовательности). Эти типы смол при синтезе по методу Ртос (Ρτοΐι) позволяют использовать ортогональную систему кислотолабильных защитных групп (Рто1₂: Вос, 1Ви. О1Ви, Тй Мт1, Ас и др.), которые расщепляются только в сильно кислой среде, в то время как незащищенный пептид распадается в очень слабокислой среде. Такой тип расщепления позволяет получить аминокислотную последовательность с полностью защищенными функциональными группами боковых цепей (Рто1₂), имея в виду, в частности, присоединение к пептиду вещества, представляющего терапевтический интерес. Таким образом, это твердофазный пептидный синтез с ортогональной тройной защитой функциональных групп (Барлос или Зибер/РтосЙВи).

Обычно при синтезе пептидов для ортогональной защиты функциональных групп боковых цепей аминокислот (Рто1₂) используются: Ат§(Ы-РЬ£), Агд(Ы-Ртс), Α8η(Ν-Ττί), А8р(О-1Ви), Су8(8-Аст), Су8(8-Мт1), Су8(8-4МеВп), Су8(8-1Ви), Су8(8-ТтоЬ), Су8(8-Тг1), О1и(О-1Ви), ΟΙη(Ν-Ττί), Ηίδ(Ν-Τή), Ьу5(Ы-Вос), Реп(8-Аст), Реп(8-Тй), 8ет(О-1Ви), ТНт(О-1Ви), Тгр(Ы-Вос), Тут(О-1Ви) (Аррйеб Вю8у81ет8, 1998, С1еауаде, Перто1есйоп, апб Но1айоп о£ Рерйбе8 айет Ртос 8уп1Не818. ТесНтса1 Ви11ейп). О1у, 8аг, А1а, Уа1, Ьеи, 11е, Рйе, Ме1, Рго, Р1р и ТН/ не имеют защиты боковых групп, поскольку по их химической структуре этого не требуется.

Аминокислоты соединяются путем активации кислотной группы аминокислоты п+1 с помощью В1ВА/11ВТВ/11ОВ1 или В1РС/НОВ1 в ΌΜΡ.

Защитную группу Ртос (Рто1₁) с присоединенной таким образом аминокислоты снимают с помощью 20%-ного раствора пиперидина в ΌΜΡ.

Последняя присоединяемая к синтезируемому пептиду аминокислота должна быть защищена группой Вос (имея в виду освобождение концевой аминогруппы при завершении синтеза) или ацетилирована (чтобы стабилизировать синтезированный пептид и снизить вероятность вторичных реакций в процессе ковалентного присоединения вещества, представляющего терапевтический интерес, к С-концу пептида, например) или пропионилирована.

В зависимости от конкретного синтезированного пептида дисульфидные мостики создают путем внутримолекулярной циклизации из двух тиоловых групп, принадлежащих двум должным образом защищенным остаткам цистеина (Аст, Тй, 1Ви и др.), в растворе либо на смоле с помощью обычно используемых для такой цели реагентов, известных специалистам в данной области техники: Н₂О/АсОН/(ЫН₄)₂СОз/ОМ8О, Н₂О/АсОН/(ЫН₄)₂СО₃, 1₂/ОМР,1₂/НР1Р/ПСМ, ТРА/ЭМ8О/анизол, 1₂/ЭСМ/МеОН/Н₂О и пр. Для циклизации посредством дисульфидных мостиков Ν-концевой цистеин (Су8) предпочтительно замещают Реп или Мра. Могут быть также получены лантиониновые мостики (путем циклизации посредством дегидроаланина) или дикарба-связи (путем циклизации посредством аллилглицинов); пути их синтеза известны специалистам в данной области техники. Между кислотной группой боковой цепи остатка глутаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты и аминогруппой боковой цепи лизина или Ν-концевой аминогруппой может быть создан лактамный мостик. Аналогично, может быть осуществлена циклизация созданием амидной связи между Ν-концевой аминогруппой и С-концевой кислотной группой (голова/хвост), а также между аминогруппой боковой цепи лизина и С-концевой кислотной группой пептида (Мащтбаг апб 81аНаап, Меб Ре8 Кеу., ЕриЬ айеаб о£ рпп1).

Пептиды, полученные с помощью смол Барлоса или Зибера расщепляются методами, обычно применяемыми специалистами в данной области техники, с использованием 0,5%-ного раствора (об./об.) ТРА в ЭСМ, или с АсОН/ТРЕ/ЭСМ (1/1/3), или с 30%-ным раствором НР1Р в ЭСМ, или с 30%-ным раствором ТРЕ в ЭСМ и др.

Депротекция функциональных групп боковых цепей и расщепление пептидов, полученных с помощью смол Ринка (амидной) или Вонга, осуществляется методами, обычно применяемыми для этой цели специалистами в данной области техники, с использованием ТРА/Н₂О/Т18 либо Т1Р8 (95/2,5/2,5), или ТРА/Н₂О/ЕПТ/Т18 либо Т1Р8 (94/2,5/2,5/1), или ТРА/тиоанизол/Н₂О (94/5/1), или ТРА/Т18/Н₂О/тиоанизол (90/5/3/2), или ТРА/Н₂О/фенол/тиоанизол/ЕЭТ (82,5/5/5/5/2,5) и др.

Биотин, флуоресцеин или 8-Тад (см. ниже пример 4) обычно присоединяют к С-концу пептида, но иногда эти метки присоединяются к Ν-концу, обычными методами синтеза и присоединения, известными специалистам в данной области техники.

Пептиды выделяли и очищали путем высокоэффективной жидкостной хроматографии (НРЬС/ВЭЖХ), используя оборудование Весктап 8у81ет Оо1б 126 с колонкой СНтотоШЬ С18 (4,6x50 мм) или №.1с1ео8б С18 (10x250 мм), например при градиенте ацетонитрила от 0 до 100% в водной фазе (Н₂О + 0,1% ТРА) за 3,5 мин, затем от 100 до 0% за 1,5 мин (скорость потока: от 1 до 5 мл/мин), или же систему \Уа1ег8 1525 с колонкой СНтотоШЬ 8рееб РОЭ РР-18 (4,6x50 мм) (неподвижная фаза) с детектором \Уа1ег8 996 РЭА (190-400 нм), или же систему \Уа1ег8 АШапсе 2690 с колонкой СНтотоШЬ Рейоттапсе РР-18 (3x100 мм) (неподвижная фаза) с детектором \Уа1ег8 996 РЭА (190-400 нм). Опреде- 15 022422 ление проводили при 214 и 254 нм.

Препаративную очистку проводили с помощью хроматографической системы \Уа1егк Ргер ЬС 4000 на колонке ОиагТ-Рак™ (неподвижная фаза) с картриджами ОеИа-Рак™ С18 (25x10 мм) и детектором \Уа1егк 2487 Эна1 ^ауе1енд1Н АЬкогЬапсе ЭеЮсЮг.

Молекулярные массы определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (Е8Т) в режиме регистрации положительных ионов. Спектры получали с помощью квадрупольного массанализатора \Уа1егк Мютотакк ОнаИго Мюто, снабженного системой \Уа1егк АШапсе 2690 НРЬС, обеспечивающей сопряжение жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ЬС-М§).

Условия при ЬС-М§ были следующие: колонка СЬготоШЪ Р1акЬ С18 (4,6x25 мм), скорость потока 3 мл/мин, линейный градиент от 0 до 100% В за 2,5 тш (А: 0,1% Н₂О/НСО₂Н; В: 0,1% АСЫ/НСО₂Н).

Масс-спектры получали с использованием ионизации электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов при скорости потока 100-200 мкл/мин. Данные получали в режиме сканирования от т/ζ 200 до 1700 с интервалами 0,1 с.

Пример 3. Конструирование пептидных векторов.

Пептид с аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО N0: 17/§-Тад, описанный в публикации \УО 2010/046588, использовался, как исходный. С ним были испытаны различные подходы с целью улучшить связывание, синтез и векторизацию. Было синтезировано множество пептидов, отличающихся от 8ЕО ГО N0: 17 делецией, и/или заменой, и/или химической модификацией одного или более аминокислотных остатков.

У синтезированных таким образом пептидов определяли способность связывать ΗΕΩΕΕ.

Для этого культивировали прилипающие и сливающиеся клетки СН0-НЕЭЕР-РЕР на 6-луночных планшетах. Каждый вариант условий делали в трех лунках. Готовили раствор, содержащий 10 мкМ пептида 5>Е0 ГО N0: 17/§-Тад в среде НатР12-1% В8А. К этому раствору прибавляли 10 мкМ испытываемого пептида (конкуренция).

Готовили также ряд контрольных растворов:

(1) Среда НатР12-1% В8А.

(ίί) Среда НатР12-1% В8А + 10 мкМ контрольного пептида СТКЬ-8-Тад (определение неспецифичного связывания любого пептида, содержащего δ-Тад).

(ίίί) Среда НатР12-1% В8А + 10 мкМ пептида 8Е0 ГО N0: 17/8-Тад + 10 мкМ контрольного пептида СТКР (определение неспецифичной конкуренции между испытываемым пептидом и контрольным пептидом СТРЬ).

Применяли метод резонансного переноса энергии флуоресцнции (РКЕТ), как описано в примере 4.

Результаты, полученные для наилучших пептидов, представлены ниже в табл. 1. В ней приведены данные о конкуренции испытываемых пептидов с исходным пептидным вектором 8Е0 ГО N0: 17/8-Тад за связывание с ЬРПЬК. Чем больше величина замены (в процентах) контрольного пептида испытываемым, тем больше сродство последнего к НЕЭЕК. Если эта величина превышает 50%, то сродство данного пептида выше, чем у исходного (8Е0 ГО N0: 17).

Таблица 1

Испытываемые пептиды	Замена контрольного (исходного) пептида, %
8Ε0ΙΏΝΟ: 1	66
5Ε<}ΙΟΝΟ:2	70
3Ε0ΙΏΝΟ: 3	75
8ΕφΙΟΝΟ:4	88
8ΕΟΠ5ΝΟ:5	91
3ΕΟΙϋΝΟ:6	77
8ΕΟΠ)ΝΟ:7	74
δΕΟΙϋΝΟ: 8	84
8ΕΟΠ>ΝΟ:9	80
δΕΟΙϋΝΟ: 10	54
δΕΟΙϋΝΟ: 11	22
8Ε0 Ιϋ ΝΟ: 12	23
δΕΟΙϋΝΟ: 13	8
δΕΟΙϋΝΟ: 14	9
δΕΟΙϋΝΟ: 15	<5
δΕΟΙϋΝΟ: 16	<5
δΕΟΙϋΝΟ: 17	50

Представленные результаты показывают, что пептиды с аминокислотными последовательностями № 1-10 обладают улучшенным сродством к человеческому рецептору НЕЭЕК. Полученные данные особенно интересны, если принять во внимание небольшие молекулярные размеры этих пептидов, а также особенно примечательны и удивительны в сравнении с тем, что у пептидов с аминокислотными последо- 16 022422 вательностями № 11-16 сродство к ЬЬОЬК гораздо хуже.

Таким образом, используя подход химической оптимизации на основе принципов медицинской химии, авторы настоящего изобретения достигли успеха в выяснении взаимосвязи между структурой и активностью (сродством связывания) исходного пептидного вектора (§Е0 ГО N0: 17), в частности установили следующее:

(ί) важность каждого аминоксилотного остатка (А1а-8сап, Э-хсап), т.е. альтернативной замены (один на один) каждого исходного остатка либо на аланин, либо на его неприродный аналог, имеющий конфигурацию Ό;

(ίί) важность Ν- и С-концов (ацетилирование, амидирование и пр.);

(ίίί) важность/преимущества циклизации пептида.

Пептидным производным, используемым в лечебных целях, обычно свойственны следующие недостатки, ограничивающие их применение:

(ί) низкая биологическая доступность при пероральном введении (обычно требуется внутривенное введение);

(ίί) короткое время жизни из-за быстрого расщепления протеолитическими ферментами (в частности, пептидазами и протеазами) пищеварительной системы и плазмы крови;

(ш) быстрое выведение из кровотока в результате деятельности печени и почек;

(ίν) низкая способность проходить через биологические и физиологические мембраны, обусловленная свойственной этим соединениям, как правило, липофильностью;

(ν) большая конформационная подвижность, что может обусловливать отсутствие избирательности, ведущее к взаимодействию с иными рецепторами или мишенями (и в результате низкая специфичность биологического распределения), а значит - к активации нескольких мишеней, побочным и нежелательным эффектам;

(νί) высокая стоимость синтеза и промышленного производства (стоимость производства пептида с молекулярной массой 5 кДа больше, чем органической молекулы массой 500 Да).

Примечательно, что пептиды и псевдопептиды по данному изобретению имеют следующие фармакологические свойства, являющиеся предпосылками для их медицинского применения:

(ί) высокое сродство к ЬЬОЬК;

(ίί) физико-химические свойства: циклизация путем образования дисульфидных мостиков; присутствие до трех неприродных аминокислот; небольшие молекулярные размеры (содержат всего восемь аминокислотных остатков), способствующие специфичности связывания с соответствующим рецептором;

(ш) большая устойчивость к ферментативному расщеплению благодаря циклизации, присутствию неприродных аминокислот, псевдопептидных связей, а также модификации/блокированию Ν- и С-концов;

(ίν) благодаря небольшим молекулярным размерам и массе (около 1 кДа) стоимость синтеза и в перспективе производства в промышленных масштабах оказываются не такими уж высокими.

Пример 4. Связывание и эндоцитоз синтезированных пептидов, обладающих сродством к ЬЬПЬК, в клетках линий СНО-ЬОЬК-ОРР.

К пептидам по данному изобретению, обладающим сродством к ЬЬПЬК-ОРР, присоединяли (к С-концу) различные метки - родамин либо §-Тад, отделенные спейсером, которым обычно служили три остатка глицина (фиг. 7). Метка §-Тад (представляющий собой олигопептид из 15 аминокислотных остатков, являющийся фрагментом рибонуклеазы А из поджелудочной железы крупного рогатого скота) может, с одной стороны, быть выявлена иммуноцитохимическим методом при помощи антител против этого пептида или же методом сортировки клеток с активированной флуоресценцией (РАС§), а с другой стороны, она может восстанавливать ферментативную активность, связываясь с рибонуклеазным §-белком (С-концевым фрагментом полипептидной цепи рибонуклеазы, включающий аминокислотные остатки с 24 по 124), которую можно измерить ш νίίτο при помощи аналитического набора РКЕТХУоткх §-Тад (№\'адеп 70724-3). Активировавшаяся таким образом рибонуклеаза расщепляет свой субстрат (РНК), в результате чего высвобождается скрытый флуоресцентный агент, выявляемый путем РКЕТ и количественно определяемы на 96-луночном планшете при помощи спектрофлуориметра Весктапп. В этих экспериментах с применением РКЕТ использовались клетки СНО (контроль), причем ОРР, присоединенный к С-концу ЬЬПЬК и тЬОЬК и дававший значительный фон при тех длинах волн, которые требовались для РКЕТ, заменяли красным флуоресцентным белком (КРР). Стабильные линии клеток, созданные для экспериментов с применением РКЕТ, были, таким образом, СНО-КРР и СНО-Ы.Ш.К-КТ.

Для РКЕТ клетки дважды промывали 2 мл РВ§ и затем инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°С с 250 мкл раствора пептида. После этого их опять дважды промывали 2 мл РВ§ и еще два раза 1 мл РВ§, снимали в 1 мл РВ§ и центрифугировали в течение 5 мин при 1250 об/мин. Отсасывали супернатант и осевшие клетки лизировали в растворе 80 мкл РВ§ + 0,1% тритона Х100. Определяли испускание флуоресценции в аликвотах (20 мкл) клеточных лизатов после реакции РКЕТ.

- 17 022422

Таким образом, были проведены эксперименты, включающие инкубацию пептидов с различным клетками, в которых экспрессировался НЬПЬК, и они показали, что пептиды по данному изобретению хорошо связываются с клетками СНО-БЭБР-СРР и включаются путем эндоцитоза в клетки тех линий, в которых экспрессируется НЬПЬК, тогда как в случае контрольных пептидов этого не наблюдается. В этих экспериментах предварительная инкубация пептидов, соединенных с 8-Тад, с первичными антителами против 8-Тад и вторичными антителами (антителами против первых антител) показывает, что комплекс из пептида с 8-Тад, первичного и вторичного антител связывается с клетками, в которых экспрессируется НЬПЬК, и поступает внутрь них путем эндоцитоза. Эти результаты свидетельствуют, что предлагаемые данным изобретением циклические пептиды могут связываться с клетками, в которых экспрессируется НЬПЬК, и служить вектором для крупных структур (два антитела), так что эти структуры поступают внутрь клетки путем эндоцитоза.

Пример 5. Токсичность, эндоцитоз и трансцитоз синтезированных пептидов, обладающих сродством к ЙЬПЬК, в эндотелиальных клетках на модели гематоэнцефалического барьера ίη \йго.

Потенциальное токсическое влияние пептидов по данному изобретению на эндотелиальные клетки, связывание указанных пептидов с этими клетками и накопление в них, а также трансцитоз пептидов изучали на модели гематоэнцефалического барьера ίη \йго. Для такой модели требуется совместная культура эндотелиальных клеток из микрососудов мозга и астроцитов; эти клетки были коровьи (ВВМЕС (бычьи эндотелиальные клетки микрососудов мозга) предоставлены фирмой СеШа1 ТесЬпо1од1е8 (Ланс, Франция) или крысиные (ВСЕС (крысиные эндотелиальные клетки сосудов мозга), что делало возможным разработку мышиной модели. Такая модель гематоэнцефалического барьера ίη \йго используется для изучения пассивного перехода или активного транспорта различных веществ, в особенности фармакологических агентов, через ВСЕС, что позволяет судить об их способности достигать ткани центральной нервной системы ίη νί\Ό. Коровья и мышиная модели обладают ультраструктурными свойствами, характерными для эндотелия мозговых сосудов, а именно имеются плотные контакты, отсутствуют поры и каналы, пересекающие эндотелий, проницаемость для гидрофильных веществ низкая, а электрическое сопротивление высокое. Кроме того, эти модели демонстрируют четкую корреляцию между результатами измерений, предпринятых с различными веществами ίη νίΙΐΌ и ίη νί\Ό, в отношении их способности проходить через гематоэнцефалический барьер. На сегодняшний день все полученные данные показывают, что эти модели гематоэнцефалического барьера ίη уйго весьма близко имитируют ситуацию ίη У1уо, воспроизводя некоторые из сложных особенностей окружения клеток, существующих в живом организме, в то же время сохраняя преимущества, связанные с экспериментированием в культуре клеток.

Например, коровья модель гематоэнцефалического барьера ίη \йго предполагает использование совместной культуры ВВМЕС и астроцитов. Перед культивированием клеток вкладыши для планшета (МШюсИ-РС 3,0 мкм; диаметр 30 мм) обрабатывали с верхней стороны коллагеном из крысиных хвостов, чтобы добиться оптимального прилипания ВВМЕС и создать условия, подобные существующим в базальной пластинке эндотелия сосудов. Первичные культуры смешанных астроцитов получали из коры мозга новорожденных крыс (ЭеИоиск е1 а1., 1990, к ЫеигосЬет., 54, 1798-1801). Вкратце выделение состояло в следующем. После удаления оболочек мозговую ткань продавливали через нейлоновое сито с диаметром пор 82 мкм. Выделенные астроциты размещали в лунки микропланшета в концентрации 1,2х10⁵ клеток/1 мл с 2 мл оптимальной культуральной среды (ЭМЕМ), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием. Среду в культуре клеток меняли два раза в неделю. ВВМЕС от СеШа1 ТссНпо1о81С5 культивировали в среде ЭМЕМ, дополненной 10% (об./об.) лошадиной сыворотки и 10% телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием, 2 мМ глутамина, 50 мкг/мл гентамицина и 1 нг/мл основного фактора роста фибробластов (добавляли каждые два дня). Затем ВВМЕС размещали на верхней поверхности фильтров в 2 мл совместной клеточной культуры. Эту среду меняли три раза в неделю. В таких условиях через 7 суток дифференцированные ВВМЕС формировали монослой слившихся клеток.

Для проверки токсичности пептидов по данному изобретению их соединяли с родамином и инкубировали в верхней камере культуральной системы, где они контактировали с эндотелиальными клетками в течение 1, 5 и 24 ч. Собирали культуральную среду из нижней камеры в различные моменты времени и количественно определяли флуоресценцию путем флуориметрического анализа. Результаты представляли как проницаемость поверхности эндотелия (Ре), выраженную в 10^-3 см/мин. Во всех лунках для оценки целостности гематоэнцефалического барьера ίη уйго использовали флуоресцентный краситель люциферовый желтый (ЬУ), небольшие молекулы которого плохо проходят через гематоэнцефалический барьер. Тот же краситель использовали для инкубации с пептидами, чтобы определить отсутствие токсичности пептидов для эндотелиальных клеток, формирующих гематоэнцефалический барьер. Барьер ίη νί1го считался проницаемым, или открытым, если значение Ре для ЬУ превышало 1х10^-3 см/мин. По трансэндотелитальному электрическому сопротивлению (ТЕЕК), которое измеряли омметром и выражали в Ом-см², также можно судить о целостности гематоэнцефалического барьера ίη \йго при прохождении веществ через него. Пороговым считалось значение 500 Ом-см².

- 18 022422

Проведенные эксперименты продемонстрировали отсутствие токсичности пептидов по данному изобретению и пептидов, использовавшихся как контрольные, для эндотелиальных клеток, формирующих гематоэнцефалический барьер, а также отсутствие негативного влияния на его проницаемость.

Прохождение пептидов по данному изобретению, соединенных с родамином, через гематоэнцефалический барьер изучали ίη уйго на коровьей модели, описанной выше. При этом измеряли флуоресценцию в лунках планшета-приемника в различные моменты времени (1, 4, 24 ч). Целостность гематоэнцефалического барьера в различных лунках оценивали путем одновременного измерения количества ЬУ, перешедшего из одного компартмента в другой, в зависимости от времени.

Пример 6. Протоколы химического синтеза конъюгатов, содержащих вектор и вещество, представляющее терапевтический интерес или являющееся потенциальным визуализирующим либо диагностическим агентом, или любое другое вещество, например молекулярный зонд.

Вещество, представляющее терапевтический интерес или являющееся потенциальным визуализирующим либо диагностическим агентом, или любое другое вещество, например молекулярный зонд, может быть отделено (отщеплено/высвобождено/высолено) от вектора после транспорта и пересечения клеточных мембран, в частности гематоэнцефалического барьера, например по принципу пролекарства путем гидролиза или ферментативного расщепления химической связи между вектором и активным веществом.

Ковалентное присоединение пептидного вектора с полностью защищенными реакционноспособными группами боковых цепей (присоединение по С- и Ν-концу) или с частично защищенными (присоединение по реакционноспособной группе боковой цепи) к веществу, представляющему терапевтический интерес, осуществляли двумя путями (фиг. 2):

тандемный синтез (т.е. непосредственное соединение без промежуточной структуры между двумя соединяемыми структурами);

синтез через связующую (линкерную) структуру (Тепъаташ е! а1., 2004, Эгид ЭБсоу. Тойау, 23, 1012-1019).

Тот или иной путь выбирали соответственно конкретным пептидному вектору и веществу, представляющему терапевтический интерес; присоединение осуществляли по С- либо Ν-концу, или же по реакционноспособной группе боковой цепи пептида (Марппйаг анй Енак-ааи, Мей Рек Реу., ЕриЬ айеай о£ ргтТ). В идеале, следуя принципу пролекарства, спейсер выбирают так, чтобы он обеспечивал приемлемое высвобождение активного вещества и улучшал растворимость конъюгата (Мо1ета е! а1., 2001, УесЮй/аион, огдаи-кресШс 5!га!ед1е5. Ιη: МеШойк анй рг1нс1р1е5 ίη тейюикй сНетМгу, уо1. 12). Между двумя соединяемыми структурами (пептид и активное вещество) можно создать различные лабильные химические ковалентные связи, будь то с участием спейсера или без него: амидную, карбаматную, эфирную, тиоэфирную, дисульфидную связь и др. Например, показано (по литературным данным), что дисульфидные связи, относительно устойчивые в плазме крови, могут расщепляться ферментами, например протеин-дисульфидредуктазой, внутри мозговой ткани с восстановлением свободных тиоловых групп (5аПо е! а1., 2003, Лйу. Эгид ПеНу. Реу., 55, 199-215).

Представляют интерес также другие соединения, в которых спейсером является полимер, например полиэтиленгликоль (РЕС). В самом деле, показано (по литературным данным), что благодаря присоединению полиэтиленгликоля у органических веществ, представляющих биологический интерес, возрастает период полужизни в плазме крови (Сгеентеа1й е! а1., 2003, Лйу. Эгид ЭеПу. Реу., 55, 217-250) и уменьшается выведение из организма.

Векторы, конъюгированные с активным веществом или веществом, интересующим пользователя, можно использовать для диагностики, визуализации или лечения патологических состояний, повреждений или расстройств центральной нервной системы, создавая препараты, способные проходить через гематоэнцефалический барьер, проникать в опухоли мозга или других тканей, и пересекать мембраны раковых клеток, и/или патологических состояний, обусловленных инфекцией, создавая препараты, способные проходить через клеточные мембраны и прицельно поражать инфицированные клетки при инфекционных (бактериальных, вирусных, паразитарных или грибковых) патологических изменениях мозга или иных тканей.

Пример 7. Перфузия мозга ίη кйи с использованием векторов в отдельности и векторов, соединенных с веществами, представляющими терапевтический или диагностический интерес или с визуализирующими агентами, или с любыми другими веществами, например молекулярными зондами, и изучение кинетики их транспорта через гематоэнцефалический барьер и накопления в мозге у мышей.

Чтобы продемонстрировать проникновение через гематоэнцефалический барьер применяли метод перфузии мозга ίη кйи (на самцах мышей линии ΘΡ1).

Предварительно пептидные векторы метили тритием (³Н), который, как известно, обеспечивает наибольшую чувствительность при определении радиоактивных соединений, особенно в срезах тканей. Радиоактивно меченые пептиды с высокой удельной радиоактивностью (РА5, до 100 Ки/ммоль) получали путем ацилирования Ν-концевой аминогруппы содержащим тритий реагентом - пропионовым (пропаноевым) ангидридом или Ν-пропионилсукцинимидом (№§). Этот способ включения трития можно применить ко всем пептидам (векторам, или конъюгатам пептидных векторов с терапевтическими аген- 19 022422 тами, содержащими или не содержащими линкерной структуры пептидной или иной органической природы), при условии, что модификация Ν-конца не влияет на сродство пептида к рецептору-мишени (например, ЬОЬК) или биологическую активность терапевтических агентов.

Реакцию тритирования пептидного вектора путем пропионилирования Ν-конца проводили в ΌΜΡ (1 мг пептида в 100-450 мкл - в зависимости от растворимости), добавляя 0,1 экв. третированного ΝΡ3 на 5 мин при комнатной температуре, затем 0,9 экв. холодного ΝΡ3 (не содержащего тритий) на 1 ч, затем еще 1 экв. холодного ΝΡ3 на 5 ч. Реакционную среду оставляли при температуре 4°С на ночь, после чего очищали путем ВЭЖХ (НРЬС). Удельная радиоактивность у каждого из меченых пептидов составляла обычно от 5 до 10 Ки/моль. Суммарная радиоактивность в итоге составляла от 600 до 950 мкКи.

Радиоактивно меченые (например, тритием) пептиды ковалентно присоединяют к радиоактивно меченному (например, радиоактивным углеродом ¹⁴С) активному веществу, как описано, например, в примере 6. Как отмечалось ранее, такое ковалентное соединение осуществляется соответственно структуре и физико-химическим свойствам активного вещества, в частности имеет значение присутствие функциональных химических групп, которые могут быть модифицированы без снижения биологической активности данного вещества. Радиоактивно меченые конъюгаты синтезируют в принципе так же, как это разработано для немеченых конъюгатов, добавляя лишь необходимые для внедрения метки шаги.

Методы, кратко описанные ниже, были разработаны сначала для изучения распределения активных веществ в мозге и, в частности, роли гематоэнцефалического барьера и, более конкретно, рецептора липопротеинов низкой плотности в проникновении этих веществ в мозг. Методы перфузии мозга ίη δίΐιι принадлежат к числу наиболее технически взыскательных и трудных в исполнении на мышах. Зато этот подход (подобно моделям ίη νίΐτο) позволяет полностью контролировать состав искусственного перфузата, чтобы держать клетки и сосуды мозга в нормальных физиологических и анатомических условиях, свойственных подопытному животному, без распыления веществ по всему организму.

Метод перфузии мозга ίη δίίπ, обычно осуществляемый с крысами, был приспособлен применительно к мышам (Падепа18 е1 а1., 2000, I. СетеЬ. Βίοοά. Ρίον Ме1аЬ., 20(2), 381-6) с целью расширить его приложение для оценки кинетических показателей транспорта в области гематоэнцефалического и гематоретинального барьеров; использовались трансгенные и мутантные (по рецепторам, ферментам или переносчикам активных веществ) мыши линии КО. Этот метод предполагает введение катетера в сонную артерию под наркозом (обычно линии ΘΡ1) и наложение лигатуры на определенные ее ветви (наружную, щитовидную, затылочную) для того, чтобы поток жидкости шел через внутреннюю сонную и крылонебную артерии, которые используются для определения поглощения векторов и конъюгатов мозгом. Благодаря катетеру возможно заменить общий кровоток потоком контролируемого перфузата (бикарбонатный буферный раствор, плазма крови или кровь), проходящего через сонную артерию. Вначале для оценки способности векторов и конъюгатов проникать в мозг использовали насыщенный кислородом бикарбонатный буферный раствор Кребса. После катетеризации сонной артерии эндогенный кровоток прекращали путем рассечения желудочков сердца, чтобы избежать смешения буферного раствора с кровью и возрастания кровяного давления. Отслеживали продолжительность перфузии с постоянной скоростью потока. Для изучения транспорта, опосредованного рецепторами (РМТ), перфузию буферным раствором можно продолжать до 20 мин или до 1 ч в присутствии переносчиков кислорода (отмытых эритроцитов).

Проделанные эксперименты позволили определить церебральный коэффициент переноса (К_1П: связь между объемом распределения и временем перфузии мозга) для ряда пептидов по данному изобретению. Продолжительность перфузии в этих экспериментах составляла 5 мин при скорости потока перфузата 2 мл/мин. Таким образом, К_1П пептидных векторов с аминокислотными последовательностями 8ЕО ГО ΝΟ: 2 и §ЕО ГО ΝΟ: 4, радиоактивно меченых с РАЗ 2 Ки/ммоль, составляют 3,3 и 3,0х10^-4 мл/с/г соответственно.

Для сравнения отметим, что для трансферрина (Т£) К_1П составляет 3,0х10^-4 мл/с/г (Иетеи1е е1 а1., 2008, I. №игосЬет., 106(4), 1534-1544), а исходный пептид с аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО ΝΟ: 17 в тех же условиях эксперимента характеризовался К_т=3,2±0,4х 10^-4 мл/с/г.

Эти результаты показывают, что пептидные векторы по данному изобретению благодаря своим небольшим молекулярным размерам и выгодной пространственной конфигурации обладают весьма высоким церебральным коэффициентом переноса, превышающим таковой трансферрина.

Кроме того, такие эксперименты с перфузией мозга ίη δίίπ позволяют определить разницу между веществами, остающимися в мозге в пределах сосудов, и теми, которые пересекают аблюминальную (базальную) мембрану эндотелиоцитов и проникают в паренхиму мозга. Этот метод, называемый постперфузионной капиллярной элиминацией, позволяет определить, действительно ли молекула пересекает эндотелий для проникновения в паренхиму головного мозга. Применение этого подхода позволяет показать, что определенные пептиды (или конъюгаты) накапливаются в паренхиме головного мозга. Таким образом, этот метод (Тпдиего е1 а1., 1990, ΐ №игосЬет., 54(6), 1882-8) используется для того, чтобы отличить ту часть векторов (или конъюгатов), которая проходит через эндотелий и поступает в мозг через внеклеточное пространство или мозговые клетки, и оставшейся частью, ассоциированной с эндотелиаль- 20 022422 ными клетками.

Ключевые стадии экспериментов с перфузией мозга ίη κίΐιι у мышей для испытания векторов и конъюгатов по данному изобретению можно кратко изложить следующим образом:

ί) Определение толерантности (нетоксичности) векторов и конъюгатов в области гематоэнцефалического барьера и сохранения целостности физиологического барьера.

ϊϊ) Изучение кинетики и линейной зависимости мозгового поглощения посредством КМТ при участии ЬИЬК.

ίίί) Изучение зависимости скорости мозгового поглощения от концентрации вектора или конъюгата (Ттах, К_т).

ίν) Изучение механизмов транспорта с помощью субстратов, подавляющих или модулирующих активность ЬИЬК.

ν) Распределение в компартментах мозга: капиллярная элиминация (Тпдиего е! а1., 1990, 1. ИеигосЬет., 54(6), 1882-8).

νί) Определение скорости связывания векторов и конъюгатов с белками плазмы крови (альбумином и др.) и изучение их влияния на мозговое поглощение этих веществ.

νίί) Внутривенное введение и определение зависимости распределения в тканях (мозг и другие органы) от времени.

Claims (18)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Пептид или псевдопептид, характеризующийся тем, что имеет следующую общую формулу (I):

   А1 -Ме1-А2-Аг^-Теи-Агд- АЗ-Суз (I) где А1 представляет цистеин (Сук), его аналог или изостер, выбираемый из (И)-цистеина, пеницилламина (Реп) и (И)-пеницилламина ((И)-Реп);

   А2 представляет пролин (Рго), его аналог или изостер;

   А3 представляет глицин (С1у), его аналог или изостер.
2. 2. Пептид или псевдопептид по п.1, характеризующийся тем, что А2 представляет аналог пролина (Рго), выбираемый из пипеколиновой кислоты (Р1р) и тиазолидин-4-карбоновой кислоты (ТЬ/).
3. 3. Пептид или псевдопептид по любому из пп.1, 2, характеризующийся тем, что А3 представляет глицин (С1у) или саркозин (§аг).
4. 4. Пептид или псевдопептид по п.1, характеризующийся тем, что имеет следующую общую формулу (I'):

   А1-Ме!-А2-Аг£-Ьеи-Аг£-О1у-Су5 (Г) где А1 представляет цистеин (Сук), его аналог или изостер, выбираемый из (И)-Сук, Реп или (И)-Реп;

   А2 представляет Рго, или его аналог, или его изостер, предпочтительно А2 представляет Р1р или

   ТЬ/.
5. 5. Пептид или псевдопептид по любому из пп.1-4, характеризующийся тем, что его выбирают из пептидов с последовательностями 8ЕО ГО ИО: 1-10.
6. 6. Пептид или псевдопептид по любому из предыдущих пунктов, характеризующийся тем, что имеет циклическую конфигурацию.
7. 7. Пептид или псевдопептид по любому из предыдущих пунктов, характеризующийся тем, что он связывает человеческий рецептор липопротеинов низкой плотности (ЬЕИЬК) на поверхности клеточных мембран.
8. 8. Пептид или псевдопептид по любому из предыдущих пунктов, характеризующийся тем, что он содержит одну пептидомиметическую связь, выбираемую предпочтительно из интеркаляции метиленовой (-СН₂-) или фосфатной (-РО₂-) группы, вторичного амина (-ΝΗ-) или кислорода (-О-), альфаазапептидов, альфа-алкилпептидов, Ν-алкилпептидов, фосфонамидатов, депсипептидов, гидроксиметиленов, гидроксиэтиленов, дигидроксиэтиленов, гидроксиэтиламинов, ретроинверсопептидов, метиленоксигруппы, цетометилена, эфиров, фосфинатов, фосфиновых кислот, фосфонамидов и карбагрупп.
9. 9. Пептид или псевдопептид по любому из предыдущих пунктов, характеризующийся тем, что его Ν-концевая функциональная группа защищена путем ацилирования, и/или тем, что его С-концевая функциональная группа защищена путем амидирования или этерификации.
10. 10. Пептид или псевдопептид по любому из предыдущих пунктов для применения с целью векторизации диагностической, визуализирующей или терапевтической молекулы.
11. 11. Конъюгированное соединение следующей формулы (ΙΙΙ):

    νχΕζϋγ (III) где V представляет пептид или псевдопептид по любому из пп.1-8;

    Ь представляет спейсер;

    И представляет диагностическую, визуализирующую или терапевтическую молекулу; х и у являются целыми числами от 1 до 5; ζ представляет собой целое число от 0 до 10.

    - 21 022422
12. 12. Конъюгированное соединение по п.11, характеризующееся тем, что χ=ζ=γ=1; χ=ζ>γ, у=ζ>х или ζ>κ>γ либо ζ=0, х=у=1 или у>х.
13. 13. Конъюгированное соединение по п.11 или 12, характеризующееся тем, что диагностическая, визуализирующая или терапевтическая молекула представляет собой молекулярный зонд, химическое вещество с небольшим молекулярным размером, пептид или полипептид, белок, антиген, антитело или фрагмент антитела, нуклеиновую кислоту или олигонуклеотид, рибозим, маркер или метку.
14. 14. Конъюгированное соединение по любому из пп.11-13, характеризующееся тем, что соединение, с одной стороны, V с Ό или V с Ь, а с другой - Ь с Ό осуществляется одной или более ковалентной, ионной, гидрофобной или ван-дер-ваальсовой связью, расщепляемой или нерасщепляемой в физиологической среде или внутри клеток.
15. 15. Конъюгированное соединение по любому из пп.11-14, характеризующееся тем, что Ό присоединено к V, при необходимости через Ь, на одном из концов пептидной цепи V (Ν- и/или С-конце) и/или по одной или более из реакционноспособных групп боковых цепей природных или неприродных аминокислот, входящих в состав V.
16. 16. Способ получения конъюгированного соединения по любому из пп.11-15, характеризующийся тем, что он включает стадию присоединения пептида или псевдопептида V к веществу Ό, при необходимости через Ь, предпочтительно химическим, биохимическим или ферментативным путем или методами генетической инженерии.
17. 17. Фармацевтическая композиция, характеризующаяся тем, что она содержит по меньшей мере одно конъюгированное соединение по любому из п.11-15 и один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов.
18. 18. Диагностическая композиция, характеризующаяся тем, что в ее состав входит диагностический или медицинский визуализирующий агент, содержащий конъюгированное соединение по любому из пп.11-15.