JP2011514160A - Ｃ末端エレメントを有するペプチドおよびタンパク質に関する方法および組成物 - Google Patents

Ｃ末端エレメントを有するペプチドおよびタンパク質に関する方法および組成物 Download PDF

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Abstract

目的の細胞への分子のターゲティングおよび内在化ならびに目的の組織の分子による透過に有用な組成物および方法を開示する。前記組織および方法は、細胞によって選択的に内在化されるか、組織を透過するか、その両方であるペプチド配列に基づく。開示の内在化および組織透過は、治療薬および検出薬の目的の細胞および組織への送達に有用である。一実施形態において、ＣｅｎｄＲエレメントならびにＣｅｎｄＲエレメントを含むタンパク質およびペプチドを開示する。ＣｅｎｄＲエレメントを含むタンパク質またはペプチドに共有結合したか、非共有的に会合したカーゴ組成物を含むＣｅｎｄＲ結合体も開示する。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２００８年２月２１日に出願された、米国仮出願第６１／０３０，４０９号の利益を主張する。２００８年２月２１日に出願された、出願第６１／０３０，４０９号は、その全体が参考として本明細書に援用される。
連邦政府によって資金援助された研究に関する声明
本発明は、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ＮＩＨからの助成金ＣＡ１０４８９８、ＣＡ １１９４１４、ＣＡ １１９３３５、ＣＡ１２４４２７、ＣＡ１１５４１０および３０１９９、ならびにｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｆｅｎｓｅからの助成金ＢＣ ０７６０５０の下、政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、一般に、分子医学分野、より具体的には、細胞および組織透過性ペプチドに関する。
発明の背景
細胞に内在化するペプチドを、一般に、細胞透過性ペプチドという。かかるペプチドに以下の２つの主なクラスが存在する：疎水性およびカチオン性（非特許文献１）。細胞に核酸、タンパク質を導入するために一般的に使用されるカチオン性ペプチドには、プロトタイプ細胞透過性ペプチド（Ｔａｔ）およびペネトラチンが含まれる（非特許文献２；非特許文献３）。ヘルペスウイルスタンパク質（ＶＰ２２）は、細胞の侵入および排出の両方およびこのタンパク質とのペイロードの輸送が可能である（Ｅｌｌｉｏｔｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ，１９９７；Ｂｒｅｗｉｓら、２００３）。送達ビヒクルとしてのこれらのペプチドの主な制限は、これらのペプチドが選択的でなく、全ての細胞に侵入することにある。１つの細胞型または組織により特異的な活性化可能な送達系を使用することができる。
細胞透過性送達ビヒクルは、多数の点で重要である。第１に、内在化はターゲティングを改善することができる。これは、ペプチドおよびそのペイロードの細胞への内在化によりホーミングがより有効になるからである（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、２００３；Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００４；Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒら，１９９５）。第２に、細胞透過性ターゲティングエレメントは細胞質にペイロードを運搬することができる。これは、例えば、核酸ベースの治療薬の送達で重要である。第３に、既存の能力と組み合わせた細胞透過性により、血管外遊出および組織への広がりを増強することができる。
組織透過は、細胞への組成物の送達における重大な制限である。フルオレセイン標識ペプチドの分布と同一のペプチドをコーティングした酸化鉄粒子の分布との比較により、粒子が腫瘍血管に密接したままであるのに対して、蛍光ペプチドは全ての腫瘍領域に到達することが示されている。頻繁に引用される腫瘍血管の「漏出性」は、この問題を実質的に軽減しないようである。さらに、腫瘍脈管構造を「正常化」させる血管新生抑制治療（Ｊａｉｎ，２００５）により、その脈管構造が漏出性でない腫瘍をターゲティングする必要が生じる。したがって、脈管外隙への多様な組成物の通過を改善する新規の方法を見出すことが重要である。血管内皮（血液脳関門が含まれる）を介して移動する多数のタンパク質が公知である。主な例は、トランスフェリン受容体によって血液脳関門を横切って輸送されるトランスフェリンである。この系を使用して、他のペイロードが脳に輸送されている（Ｌｉら、２００２；Ｆｅｎａｒｔ ａｎｄ Ｃｅｃｃｈｅｌｌｉ，２００３）。循環から組織への組成物の移動を媒介することができる内皮トランスサイトーシスのペプチドシグナルが有用である。
したがって、種々の細胞型の選択的ターゲティング、タンパク質およびペプチドの細胞への内在化、ならびにタンパク質およびペプチドによる組織の透過のための新規の治療ストラテジーが必要である。本発明により、種々の細胞型によって選択的ターゲティングおよび選択的内在化ができ、そして／または組織を透過することができるペプチドを提供することによってこの要求が満たされる。関連する利点も得ることができる。
Ｚｏｒｋｏ Ｍ， Ｌａｎｇｅｌ Ｕ． Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ： ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｃａｒｇｏ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．（２００５）５７、５２９〜４５ Ｍｅａｄｅ ＢＲ． Ｄｏｗｄｙ ＳＦ． Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ／ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ．（２００７）５９（２−３）：１３４〜４０ Ｄｅｒｏｓｓｉ Ｄ， Ｃｈａｓｓａｉｎｇ Ｇ， Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ Ａ． Ｔｒｏｊａｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ： ｔｈｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９８）８， ８４〜７
発明の概要
ＣｅｎｄＲエレメントならびにＣｅｎｄＲエレメントを含むタンパク質およびペプチドを開示する。ＣｅｎｄＲエレメントを含むタンパク質またはペプチドに共有結合したか、非共有的に会合したカーゴ組成物を含むＣｅｎｄＲ結合体も開示する。アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含む、選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合したか、非共有的に会合したカーゴ組成物を含むＣｅｎｄＲ結合体も開示する。カーゴ組成物を、ＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合することができる。
活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントならびに活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを含むタンパク質およびペプチドも開示する。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを含むタンパク質またはペプチドに共有結合したか、非共有的に会合したカーゴ組成物を含む活性化可能なＣｅｎｄＲ結合体も開示する。アミノ酸配列が活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを含む、選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合したか、非共有的に会合したカーゴ組成物を含む活性化可能なＣｅｎｄＲ結合体も開示する。カーゴ組成物を、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合することができる。
カーゴ組成物をＣｅｎｄＲエレメントを含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、カーゴ組成物はＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合する工程、を含む方法によって作製されたＣｅｎｄＲ結合体も開示する。カーゴ組成物を選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、アミノ酸配列がＣ末端エレメントを含み、カーゴ組成物はＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合する工程、を含む方法によって作製されたＣｅｎｄＲ結合体も開示する。（ａ）細胞への内在化および／または組織の透過のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、アミノ酸配列がＣ末端エレメントを含む工程、および（ｂ）カーゴ組成物を選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、カーゴ組成物はＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合する工程を含む方法によって作製されたＣｅｎｄＲ結合体も開示する。ＣｅｎｄＲ結合体はタンパク質またはペプチドおよび結合または会合したカーゴ組成物を含むことができる。
ブロッキング基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）をＣｅｎｄＲエレメントに共有結合させる工程であって、ブロッキング基とＣｅｎｄＲエレメントとを結合する結合が切断可能である工程を含む方法によって作製された活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントも開示する。ブロッキング基をアミノ酸配列に共有結合させる工程であって、アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含み、ブロッキング基とＣｅｎｄＲエレメントとを結合する結合が切断可能である工程を含む方法によって作製された活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントも開示する。（ａ）細胞への内在化および／または組織の透過のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含む工程、および（ｂ）ブロッキング基をＣｅｎｄＲエレメントに共有結合させる工程であって、ブロッキング基とＣｅｎｄＲエレメントとを結合する結合が切断可能である工程を含む方法によって作製された活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントも開示する。ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したブロッキング基は、細胞への内在化および／または組織の透過を軽減または防止する。ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したブロッキング基は、ブロッキング基を持たない同一のＣｅｎｄＲエレメントと比較して細胞への内在化および／または組織の透過を軽減または防止することができる。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントは、選択されたアミノ酸配列およびブロッキング基を含むことができる。
タンパク質またはペプチドを、ＣｅｎｄＲエレメントがタンパク質またはペプチド中に存在する場合には細胞に内在化し、そして／または組織を透過することができるが、ＣｅｎｄＲエレメントがタンパク質またはペプチド中に存在しない場合には細胞に内在化し、そして／または組織を透過することができない。タンパク質またはペプチドを、選択されたアミノ酸配列がタンパク質またはペプチド中に存在する場合には細胞に内在化し、そして／または組織を透過することができるが、選択されたアミノ酸がタンパク質またはペプチド中に存在しない場合には細胞に内在化し、そして／または組織を透過することができない。ＣｅｎｄＲエレメントを、カーゴ組成物に会合させずに細胞に内在化し、そして／または組織を透過することができる。選択されたアミノ酸配列を、カーゴ組成物に会合させずに細胞に内在化し、そして／または組織を透過することができる。ＣｅｎｄＲエレメントはタンパク質またはペプチド中の唯一の機能的内在化エレメントであり得るか、ＣｅｎｄＲエレメントはタンパク質またはペプチド中の唯一の機能的組織透過エレメントであり得るか、その両方である。選択されたアミノ酸配列はタンパク質またはペプチド中の唯一の機能的内在化エレメントであり得るか、選択されたアミノ酸配列はタンパク質またはペプチド中の唯一の機能的組織透過エレメントであり得るか、その両方である。ＣｅｎｄＲエレメントはＣｅｎｄＲ結合体中の唯一の機能的内在化エレメントであり得るか、ＣｅｎｄＲエレメントはＣｅｎｄＲ結合体中の唯一の機能的組織透過エレメントであり得るか、その両方である。選択されたアミノ酸配列はＣｅｎｄＲ結合体中の唯一の機能的内在化エレメントであり得るか、選択されたアミノ酸配列はＣｅｎｄＲ結合体中の唯一の機能的組織透過エレメントであり得るか、その両方である。
ＣｅｎｄＲエレメントは活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントであり得る。ＣｅｎｄＲエレメントはプロテアーゼ活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントであり得る。タンパク質またはペプチドは環状（環式）であり得るか、ループを含むことができる。ＣｅｎｄＲエレメントは、タンパク質またはペプチドのＣ末端に存在し得る。ＣｅｎｄＲエレメントは末端カルボキシル基を含むことができる。ブロッキング基を末端カルボキシル基に結合することができる。ブロッキング基と末端カルボキシル基を結合する結合を、目的の細胞付近に存在するプロテアーゼによって切断可能であるように選択することができる。ブロッキング基をＣｅｎｄＲエレメントのＣ末端アミノ酸に結合することができる。ブロッキング基をＣｅｎｄＲエレメントのＣ末端アミノ酸以外のＣｅｎｄＲエレメントのアミノ酸に結合することができる。
カーゴ組成物を選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させることができ、ここで、アミノ酸配列はＣｅｎｄＲエレメントを含むことができる。カーゴ組成物を、例えば、ＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合することができる。カーゴ組成物は、例えば、治療もしくは診断に適用されるナノ粒子、分子、または分子の複合体であり得る。ＣｅｎｄＲエレメントをターゲティングすることができる治療カーゴ組成物には、ナノ粒子、分子、分子の複合体、抗血管新生薬、血管新生促進薬、癌化学療法薬、細胞毒性薬、前細胞生存薬、細胞分裂薬、神経保護薬、免疫調節薬、抗炎症薬、抗関節炎薬、抗ウイルス薬、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ＣｅｎｄＲエレメントをターゲティングすることができる診断カーゴ組成物には、ナノ粒子、分子、分子の複合体、ＭＲＩ造影剤、放射性造影剤、光学的造影剤、分子タグ（ビオチンなど）、フルオロフォア、エピトープタグ（例えば、特定の分子アッセイを使用して検出することができる）、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。カーゴ組成物はホーミング配列を含むことができる。カーゴ組成物は、腫瘍または他の標的組織に選択的にホーミングすることができる。カーゴ組成物は、腫瘍または他の標的組織の脈管構造に選択的にホーミングすることができる。
カーゴ組成物をＣｅｎｄＲエレメントを含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、カーゴ組成物はＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合する工程、を含むＣｅｎｄＲ結合体を形成する方法も開示する。カーゴ組成物を選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含み、カーゴ組成物はＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合する工程を含む、ＣｅｎｄＲを形成する方法も開示する。（ａ）細胞への内在化および／または組織の透過のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含む工程、および（ｂ）カーゴ組成物を選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、カーゴ組成物はＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合する工程を含む、ＣｅｎｄＲ結合体を形成する方法も開示する。ＣｅｎｄＲ結合体はタンパク質またはペプチドおよび結合または会合したカーゴ組成物を含むことができる。
ＣｅｎｄＲ結合体に細胞を曝露する工程であって、ＣｅｎｄＲエレメントがＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したか非共有的に会合したカーゴ組成物を含み、次いで、ＣｅｎｄＲ結合体が細胞に侵入し、それによりカーゴ組成物を細胞に送達させることができる工程を含む、カーゴ組成物を細胞に送達させる方法も開示する。ＣｅｎｄＲ結合体に細胞を曝露する工程であって、ＣｅｎｄＲエレメントがＣｅｎｄＲエレメントを含むタンパク質またはペプチドに共有結合したか非共有的に会合したカーゴ組成物を含み、次いで、ＣｅｎｄＲ結合体が細胞に侵入し、それによりカーゴ組成物を細胞に送達させることができる工程を含む、カーゴ組成物を細胞に送達させる方法も開示する。（ａ）ＣｅｎｄＲエレメントをカーゴ組成物に結合させ、それにより、ＣｅｎｄＲ結合体を形成する工程、および（ｂ）細胞をＣｅｎｄＲ結合体に曝露する工程であって、次いで、ＣｅｎｄＲ結合体が細胞に侵入し、それによりカーゴ組成物を細胞に送達させることができる工程を含む、カーゴ組成物を細胞に送達させる方法も開示する。
（ａ）細胞をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、および（ｂ）ＣｅｎｄＲエレメントが内在化されたかどうかを決定する工程を含む、ＣｅｎｄＲエレメントを内在化することができる細胞を同定する方法も開示する。（ａ）癌細胞をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、および（ｂ）ＣｅｎｄＲエレメントが癌細胞によって内在化されたかどうかを同定する工程であって、内在化されたＣｅｎｄＲエレメントによって癌細胞がＣｅｎｄＲベースの療法の候補であると同定される工程を含む、ＣｅｎｄＲベースの療法の候補としての癌細胞を同定する方法も開示する。細胞はアッセイ中に存在し得る。ＣｅｎｄＲエレメントをタンパク質またはペプチドに結合することができる。ＣｅｎｄＲエレメントは活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントであり得る。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを、細胞への曝露前に活性化することができる。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントは、プロテアーゼ活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントであり得る。タンパク質またはペプチドは環状であり得る。ＣｅｎｄＲエレメントは、タンパク質またはペプチドのＣ末端に存在し得る。
（ａ）組織をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、および（ｂ）ＣｅｎｄＲエレメントが組織を透過したかどうかを決定する工程を含む、ＣｅｎｄＲエレメントによって透過され得る組織を同定する方法も開示する。（ａ）腫瘍由来の細胞をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、および（ｂ）ＣｅｎｄＲエレメントが細胞によって内在化されたかどうかを決定する工程であって、内在化されたＣｅｎｄＲエレメントによって腫瘍がＣｅｎｄＲベースの療法の候補であると同定される工程を含む、ＣｅｎｄＲベースの療法の候補として腫瘍を同定する方法も開示する。（ａ）腫瘍をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、および（ｂ）ＣｅｎｄＲエレメントが腫瘍を透過したかどうかを決定する工程であって、透過したＣｅｎｄＲエレメントによって腫瘍がＣｅｎｄＲベースの療法の候補であると同定される工程、を含むＣｅｎｄＲベースの療法の候補として腫瘍を同定する方法も開示する。腫瘍はアッセイ中に存在し得る。ＣｅｎｄＲエレメントをタンパク質またはペプチドに結合することができる。ＣｅｎｄＲエレメントは活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントであり得る。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを、腫瘍への曝露前に活性化することができる。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントは、プロテアーゼ活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントであり得る。タンパク質またはペプチドは環状であり得る。ＣｅｎｄＲエレメントは、タンパク質またはペプチドのＣ末端に存在し得る。
切断可能な結合を介してブロッキング基がＣｅｎｄＲエレメントに結合している活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成する工程であって、切断可能な結合が目的の細胞付近に存在する酵素によって切断可能である工程を含む、目的の細胞付近に活性化することができる活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを産生する方法も開示する。細胞は被験体中に存在し得る。目的の細胞付近に存在する酵素を同定することができる。目的の細胞付近に存在する酵素を、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成させる前に同定することができる。切断可能な結合を、目的の細胞付近に存在する酵素に基づいて選択することができる。切断可能な結合を、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成させる前に選択することができる。ＣｅｎｄＲエレメントは末端カルボキシル基を含むことができ、ここではブロッキング基を末端カルボキシル基に結合させる。
ブロッキング基をＣｅｎｄＲエレメントに共有結合させる工程であって、ブロッキング基とＣｅｎｄＲエレメントとを結合する結合が切断可能である工程を含む、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成する方法も開示する。ブロッキング基をアミノ酸配列に共有結合させる工程であって、アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含み、ブロッキング基とＣｅｎｄＲエレメントとを結合する結合が切断可能である工程、を含む活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成する方法も開示する。（ａ）細胞への内在化および／または組織の透過のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含む工程、および（ｂ）ブロッキング基をＣｅｎｄＲエレメントに共有結合させる工程であって、ブロッキング基とＣｅｎｄＲエレメントとを結合する結合が切断可能である工程、を含む、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成する方法も開示する。ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したブロッキング基は、細胞への内在化および／または組織の透過を軽減または防止する。ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したブロッキング基は、ブロッキング基を持たない同一のＣｅｎｄＲエレメントと比較して細胞への内在化および／または組織の透過を軽減または防止することができる。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントは、選択されたアミノ酸配列およびブロッキング基を含むことができる。細胞は被験体中に存在し得る。目的の細胞付近に存在する酵素を同定することができる。目的の細胞付近に存在する酵素を、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成させる前に同定することができる。切断可能な結合を、目的の細胞付近に存在する酵素に基づいて選択することができる。切断可能な結合を、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成させる前に選択することができる。ＣｅｎｄＲエレメントは末端カルボキシル基を含むことができ、ここではブロッキング基を末端カルボキシル基に結合させる。カーゴ組成物を、選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させることができる。カーゴ組成物を、ＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合することができる。
細胞への内在化のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、アミノ酸配列がＣ末端エレメントを含む工程、およびカーゴ組成物を選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、選択されたアミノ酸配列はタンパク質またはペプチドのＣ末端に存在し、ＣｅｎｄＲ結合体はタンパク質またはペプチドおよび結合または会合したカーゴ組成物を含む工程、を含むＣｅｎｄＲ結合体を形成する方法を開示する。
（ａ）細胞への内在化のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、アミノ酸配列がＣ末端エレメントを含む工程、（ｂ）カーゴ組成物を選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、選択されたアミノ酸配列はタンパク質またはペプチドのＣ末端に存在し、ＣｅｎｄＲ結合体はタンパク質またはペプチドおよび結合または会合したカーゴ組成物を含む工程、を含むＣｅｎｄＲ結合体を作製する方法を開示する。
（ａ）ＣｅｎｄＲエレメントをカーゴ組成物に結合させ、それにより、ＣｅｎｄＲ結合体を形成する工程、および（ｂ）細胞をＣｅｎｄＲ結合体に曝露する工程であって、次いで、ＣｅｎｄＲ結合体が細胞に侵入し、それによりカーゴ組成物を細胞に送達させることができる工程を含む、カーゴ組成物を細胞に送達させる方法も開示する。
（ａ）ＣｅｎｄＲエレメントをカーゴ組成物に結合させ、それにより、ＣｅｎｄＲ結合体を形成する工程、および（ｂ）組織をＣｅｎｄＲ結合体に曝露する工程であって、次いで、ＣｅｎｄＲ結合体が組織中の細胞に侵入して排出され、それにより、カーゴ組成物を組織に透過させることができる工程を含む、カーゴ組成物を組織に透過させる方法も開示する。
（ａ）活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントをカーゴ組成物に結合させ、それにより、ＣｅｎｄＲ結合体を形成する工程、および（ｂ）細胞をＣｅｎｄＲ結合体に曝露する工程であって、切断剤がＣｅｎｄＲ結合体の活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを活性化し、次いで、ＣｅｎｄＲ結合体が細胞に侵入し、それによりカーゴ組成物を細胞に送達させることができる工程を含む、カーゴ組成物を細胞に送達させる方法をさらに開示する。
（ａ）活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントをカーゴ組成物に結合させ、それにより、ＣｅｎｄＲ結合体を形成する工程、および（ｂ）組織をＣｅｎｄＲ結合体に曝露する工程であって、切断剤がＣｅｎｄＲ結合体の活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを活性化し、次いで、ＣｅｎｄＲ結合体が組織中の細胞に侵入して排出され、それにより、カーゴ組成物を組織に透過させることができる工程を含む、カーゴ組成物を組織に透過させる方法をさらに開示する。
（ａ）ＣｅｎｄＲエレメントに細胞を曝露する工程、および（ｂ）ＣｅｎｄＲエレメントが内在化されたかどうかを決定する工程を含む、ＣｅｎｄＲエレメントを内在化することができる細胞を同定する方法も開示する。細胞は、例えば、アッセイ中に存在し得る。ＣｅｎｄＲエレメントを、カーゴ組成物（例えば、タンパク質またはペプチドなど）に結合させ、それにより、ＣｅｎｄＲ結合体を形成することができる。
（ａ）細胞を活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、（ｂ）活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントが内在化されたかどうかを決定する工程を含む、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを内在化することができる細胞を同定する方法も開示する。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを細胞への曝露前に脱保護することができるが、その必要はない。例えば、これを使用してブロッカーのブロック能力を試験することができる。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントはまた、プロテアーゼ活性化ＣｅｎｄＲエレメントであり得る。
（ａ）癌細胞をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、および（ｂ）ＣｅｎｄＲエレメントが癌細胞によって内在化されたかどうかを決定する工程であって、内在化されたＣｅｎｄＲエレメントによって癌細胞がＣｅｎｄＲベースの療法の候補であると同定される工程を含む、ＣｅｎｄＲベースの療法の候補として癌細胞を同定する方法も開示する。細胞は、例えば、アッセイ中に存在し得るか、被験体中に存在し得る。ＣｅｎｄＲエレメントを、カーゴ組成物（例えば、タンパク質またはペプチドなど）に結合させ、それにより、ＣｅｎｄＲ結合体を形成することができる。
（ａ）腫瘍由来の組織をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、および（ｂ）ＣｅｎｄＲエレメントが組織を通過したか、または組織中の細胞によって内在化されたかどうかを決定する工程であって、通過または内在化されたＣｅｎｄＲエレメントによって腫瘍がＣｅｎｄＲベースの療法の候補であると同定される工程を含む、ＣｅｎｄＲベースの療法の候補として腫瘍を同定する方法も開示する。
切断可能な結合を介してブロッキング基がＣｅｎｄＲエレメントに結合している活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成する工程であって、切断可能な結合が目的の細胞付近に存在する酵素によって切断可能である工程を含む、目的の細胞付近に活性化することができる活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを産生する方法も開示する。これは、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成させる前に、目的の細胞付近に存在する酵素を同定する工程をさらに含むことができる。これは、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成させる前に目的の細胞付近に存在する酵素に基づいて切断可能な結合を選択する工程をさらに含むことができる。
（ａ）細胞への内在化のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、アミノ酸配列がＣ末端エレメントを含み、Ｃ末端エレメントが末端カルボキシル基を含む工程、および（ｂ）ブロッキング基を選択されたアミノ酸配列の末端カルボキシル基に共有結合させる工程であって、ブロッキング基と末端カルボキシル基とを結合する結合が切断可能であり、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントが前記選択されたアミノ酸配列およびブロッキング基を含む工程、を含む活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成する方法も開示する。これは、工程（ｂ）の前に、目的の細胞付近に存在するプロテアーゼによって切断可能であるようにブロッキング基と末端カルボキシル基とを結合する結合を選択する工程をさらに含むことができる。
（ａ）細胞への内在化のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、アミノ酸配列がＣ末端エレメントを含み、Ｃ末端エレメントが末端カルボキシル基を含む工程、および（ｂ）ブロッキング基を選択されたアミノ酸配列の末端カルボキシル基に共有結合させる工程であって、ブロッキング基と末端カルボキシル基とを結合する結合が切断可能であり、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントが前記選択されたアミノ酸配列およびブロッキング基を含む工程、を含む方法によって作製された活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントをさらに開示する。該方法は、工程（ｂ）の前に、目的の細胞付近に存在するプロテアーゼによって切断可能であるようにブロッキング基と末端カルボキシル基とを結合する結合を選択する工程をさらに含むことができる。
開示の方法および組成物のさらなる利点を以下の説明に一部記載する。利点は説明から一部理解されるか、開示の方法および組成物の実施によって知ることができるであろう。開示の方法および組成物の利点は、特に添付の特許請求の範囲で指摘した要素および組み合わせによって実現および達成される。上記の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方が例示および説明のみを目的とし、特許請求の範囲に記載の発明を制限しないと理解すべきである。
本明細書中に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、開示の方法および組成物のいくつかの実施形態を例証し、説明と共に開示の方法および組成物の原理の説明に役立つ。
図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは、内在化ペプチドの同定を示す。図１Ａ：Ｔ７ファージディスプレイのために、ペプチドを、主なキャプシドタンパク質ＧＰ１０とのＣ末端融合物として発現した。図１Ｂ：４つの異なるライブラリー（ＣＸ７Ｃ、Ｘ７、ＲＸＸＲＸＸＸ（配列番号１９）、およびＲＸＸＲ（Ａ／Ｐ）ＰＲＸＸＸ（配列番号２０））の３ラウンドのｅｘ ｖｉｖｏ選択をＰＰＣ１細胞に対して行い、７つの連続するグリシン残基（Ｇ７）をディスプレイするコントロールファージの５００〜２５００倍ホーミングするファージプールを得た。図１Ｃ：ライブラリーあたりランダムな２０のファージクローンの配列決定により、Ｃ末端アルギニン残基で終結するペプチドが主に存在することが明らかになり、これは、ファージの細胞との相互作用時に使用した最初のライブラリーの配置および温度と無関係であった。配列は、４℃に対応する区分についての表の左上から右下の配列番号５２〜６１、１３２、７２〜７５、１３３、７６、１３４、７７〜７８、１３５〜１４４、および６２〜７１に対応する。配列は、３７℃＋酸洗浄に対応する区分についての表の左上から右下の配列番号８２〜９１、１０２〜１１１、１４５〜１５４、および９２〜１０１に対応する。 図２Ａおよび２Ｂは、Ｃ末端アルギニンをディスプレイするＴ７ファージがＰＰＣ１細胞に結合してＰＰＣ１細胞に内在化することを示す。図２Ａ：Ｔ７ファージの前立腺癌細胞への結合は、ファージ粒子上のＣ末端アルギニンのディスプレイに依存する。ＰＰＣ１細胞を、Ｇ７（上のグラフ）またはＲＰＡＲＰＡＲペプチド（配列番号２）（下のグラフ）の誘導体をディスプレイするＴ７バクテリオファージと４℃でインキュベートし、結合したファージをプラークアッセイによって定量した。結合を、非結合Ｇ７コントロールファージに対する倍率で示す。図２Ｂ：Ｃ末端アルギニンをディスプレイするファージを培養したＰＰＣ１細胞に内在化させる（矢印、核内在化；アローヘッド、細胞質内在化）。一連のＴ７ファージクローンを、コラーゲンコーティングしたカバーガラス上で成長させたＰＰＣ１細胞と３７℃でインキュベートし、抗Ｔ７抗体で染色し、共焦点顕微鏡法によって画像化した。 図２Ａおよび２Ｂは、Ｃ末端アルギニンをディスプレイするＴ７ファージがＰＰＣ１細胞に結合してＰＰＣ１細胞に内在化することを示す。図２Ａ：Ｔ７ファージの前立腺癌細胞への結合は、ファージ粒子上のＣ末端アルギニンのディスプレイに依存する。ＰＰＣ１細胞を、Ｇ７（上のグラフ）またはＲＰＡＲＰＡＲペプチド（配列番号２）（下のグラフ）の誘導体をディスプレイするＴ７バクテリオファージと４℃でインキュベートし、結合したファージをプラークアッセイによって定量した。結合を、非結合Ｇ７コントロールファージに対する倍率で示す。図２Ｂ：Ｃ末端アルギニンをディスプレイするファージを培養したＰＰＣ１細胞に内在化させる（矢印、核内在化；アローヘッド、細胞質内在化）。一連のＴ７ファージクローンを、コラーゲンコーティングしたカバーガラス上で成長させたＰＰＣ１細胞と３７℃でインキュベートし、抗Ｔ７抗体で染色し、共焦点顕微鏡法によって画像化した。 図３は、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）−量子ドットがＰＰＣ１細胞によって内在化されることを示す。コラーゲンコーティングしたカバーガラス上で培養したＰＰＣ１前立腺癌細胞を、ビオチン化ペプチドでコーティングしたストレプトアビジン量子ドットとインキュベートし、その後に固定し、細胞核をＤＡＰＩで対比染色し、共焦点顕微鏡によって画像化した。遊離Ｃ末端を有するＲＰＡＲＰＡＲペプチド（配列番号２）でコーティングしたＱドットが強く内在化されたのに対して（明色ドット）（ａ）、アミドブロックされたＣ末端でコーティングしたＱドットは細胞に結合も内在化もされなかった（ｂ）。挿入図：Ｑドットの略図：本研究で使用した量子ドットは直径が約２０ｎｍであり、粒子あたり５〜１０ペプチドでコーティングすることができる。 図４は、トリプシンがＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号３）ファージのＰＰＣ１細胞への結合を活性化することを示す。５×１０８個のファージ粒子を表示体積の２．５％トリプシンと３７℃で２０分間インキュベートし、その後にファージを１×１０６個のＰＰＣ１細胞と４℃で３時間インキュベートした。結合を、非結合Ｇ７コントロールファージに対する倍率として示す（その内在化は、トリプシン処理によって影響を受けなかった）。 図５は、ｉＲＧＤファージおよびｉＲＧＤペプチドの腫瘍ホーミングおよび内在化を示す。ａ．ｉＲＧＤペプチドは膵腫瘍にホーミングする。約２００μｇのフルオレサミン標識されたｉＲＧＤペプチドを膵管腺癌（ＰＤＡＣ）マウスに尾静脈を介して注射し、４．５時間循環させた。器官を採取し、ＵＶ光下で観察した（上のパネル）。下のパネルは、対応する明視野像を示す。ｂ．ｉＲＧＤファージは、ヒト腫瘍細胞内に広範囲に内在化された。ｉＲＧＤペプチド（メインパネル）またはＣＧ７Ｃコントロールペプチド（右下のウィンドウ）をディスプレイするＴ７ファージを、Ｉ型コラーゲンをコーティングしたカバーガラス上で培養したＰＰＣ１細胞と３７℃で２時間インキュベートし、抗Ｔ７抗体および細胞膜マーカーで染色し、共焦点顕微鏡によって画像化した。ｉＲＧＤファージ（明色ドット）が腫瘍細胞に広範に内在化されるのに対して、コントロールファージが内在化されないことに留意のこと。 図６は、特異的細胞内送達におけるＣｅｎｄＲを示す。特異的受容体（インテグリンなど）への結合によって不顕性ＣｅｎｄＲモチーフを含むホーミングペプチドが標的細胞の表面に導かれ、その後にペプチドを特異的な細胞表面または細胞周囲のプロテアーゼによって切断してＣｅｎｄＲモチーフ（Ｃ末端アルギニン）が曝露され、遍在性ＣｅｎｄＲ受容体に送達され、エンドサイトーシスされる。曝露したＣｅｎｄＲモチーフを有するペプチドはＣｅｎｄＲ受容体と直接相互作用し、内在化される。ＣｅｎｄＲ経路は、治療薬および診断薬の全ての型（ナノ粒子が含まれる）を高度に特異的に細胞内送達させることができる。 図７は、プロテアーゼ活性化侵入および排出シグナルについてのＣｅｎｄＲスクリーニングの略図を示す。（Ａ）タンパク質分解性侵入スクリーニングのために、ＣｅｎｄＲエレメント（ＲＰＡＲＰＡＲ、配列番号２）をランダムヘキサペプチドおよびＣ末端アラニン残基でマスキングする。細胞内で見出されたファージをタンパク質分解的にプロセシングしてＣｅｎｄＲエレメントを曝露させた。（Ｂ）排出シグナルを同定するために、ランダムペプチドが先に存在する曝露されたＣｅｎｄＲエレメントを有するファージライブラリーを構築する。ファージのデフォルト経路は内在化であり、ランダムペプチドが排出シグナルをコードするファージのみが細胞外である。 図８Ａおよび８Ｂは、ｉＲＧＤがＣ末端Ｒ（アルギニン）の代わりにＣ末端Ｋ（リジン）を有するＣｅｎｄＲエレメントを有し、このＣｅｎｄＲエレメントがＣ末端アルギニンを有する他のＣｅｎｄＲのように挙動することを示す。ｉＲＧＤはＣｅｎｄＲエレメントを含む。図８Ａ：ｉＲＧＤファージの短縮バージョンを作製し、ＰＰＣ１ヒト前立腺癌細胞への内在化について試験した。ＣＲＧＤＫＧ（配列番号２１）、ＣＲＧＤＫ（配列番号２２）、ＣＲ（配列番号１６３）を保有するファージは、未変性のｉＲＧＤファージと比較してＰＰＣ１細胞に内在化する能力が高い。配列は、左から右に、配列番号１５５、配列番号４、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３である。図８Ｂ：ＰＰＣ１細胞を、種々の濃度のｉＲＧＤ、ＣＲＧＤＫ（配列番号２２）、ＣＲ（配列番号１６３）、またはＲＰＡＲ（配列番号１６４）を保有するＵＶ不活化ファージを使用するか使用しないでプレインキュベートし、その後に生きたＣＲＧＤＫファージまたはコントロールファージ（ＮＣ５）とさらにインキュベートした。ＣＲＧＤＫ（配列番号２２）ファージ内在化がＲＰＡＲファージによって用量依存性様式で阻害され、これは、ＣＲＧＤＫ（配列番号２２）がＣｅｎｄＲとして作用したことを示すことに留意のこと。 図９は、ｉＲＧＤが腫瘍組織中に拡大することができることを示す。ｉＲＧＤファージ（ａ）およびそのコントロールであるＫＧＤファージ（ｂ）を、自発性の膵管腺癌を保有するトランスジェニックマウスに注射し、１５分間循環させた。次いで、マウスを１％ＢＳＡを含むＰＢＳで灌流し、腫瘍を採取した。腫瘍の凍結切片を、抗Ｔ７ファージ抗体、抗ＣＤ３１抗体、およびＤＡＰＩで染色した。ｉＲＧＤファージが膵腫瘍管を形成する腫瘍細胞によって広範に取り込まれる一方で、ＫＧＤファージがいくつかの血管内に留まって腫瘍管中にシグナルがほとんど認められないことに留意のこと。これは、ｉＲＧＤファージが血管外遊出して腫瘍組織中に広がることができることを示す。図９の両パネル中の染色を鮮やかな色で示す。 図１０Ａおよび１０Ｂは、ファージディスプレイを使用したＣｅｎｄＲペプチドの同定を示す。ペプチドライブラリーのパネル（ＣＸ７Ｃ、Ｘ７、およびＲＸＸＲＸＸＸ（配列番号１９））を、ＰＰＣ−１同所性異種移植腫瘍由来の細胞懸濁液に対するｅｘ ｖｉｖｏ選択のために使用した。（図１０Ａ）３ラウンドの選択後、ファージプールは懸濁液中の腫瘍細胞にコントロールポリグリシンヘプタペプチド（Ｇ７）ファージの５００〜１，３００倍結合した。（図１０Ｂ）３ラウンドのファージ選択後に代表的なペプチド配列を回収した。Ｃ末端アルギニンで終結したペプチドは、配列決定した全ファージインサートの９７％を含んでいた。配列は、４℃に対応する区分についての表の左上から右下の配列番号５２〜８１に対応する。配列は、３７℃＋酸洗浄に対応する区分についての表の左上から右下の配列番号８２〜１１１に対応する。 図１１Ａ〜１１Ｃは、ＣｅｎｄＲ内在化の構造の特徴を示す。図１１Ａ：Ｇ６ＲおよびＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージのＰＰＣ−１細胞との相互作用。細胞をファージと４℃でインキュベートして表面結合（「結合」）を評価するか、３７℃でのインキュベーション後に低ｐＨで洗浄してファージ取り込み（「内在化」）を評価した。ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）機能付与されたｑドットはＲＰＡＲＰＡＲファージの結合および内在化の両方を阻害したのに対して、Ｇ７のｑドットは効果がなかった。Ｇ６Ｒファージは内在化されず、ＰＰＣ−１細胞へのその結合は過剰なＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）のｑドットによってブロックされた。結合を、ポリグリシンヘプタペプチド（Ｇ７）をディスプレイするコントロールファージに対する倍率として示す。図１１Ｂ：４℃でのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）誘導体ファージのＰＰＣ−１細胞への結合。データは、４つの独立した結合実験の代表である。左から右に、配列は配列番号１１２〜１２５に対応するが、それぞれ配列番号２および配列番号３である第１および第９の配列は除外する。スチューデントｔ検定によって統計分析を行った（図１１Ａ）。ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を示す；１つのアスタリスク、ｐ＜０．０５；２つのアスタリスク、ｐ＜０．０１。スケールバー：２０μｍ。図１１Ｃ（パネルｃ〜ｇ）ペプチドディスプレイファージ（鮮やかな色のドット、ｃ〜ｅ）またはペプチドコーティングしたｑドット（鮮やかな色のドット、ｆ、ｇ）と３７℃で２時間インキュベートしたＰＰＣ−１細胞の共焦点顕微鏡法：ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）Ｔ７（ｃ）、Ｇ６Ｒ Ｔ７（ｄ）、ＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号２）Ｔ７（ｅ）、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ｑドット（ｆ）、およびＲＰＡＲＰＡＲ−ＮＨ２（配列番号２）ｑドット（ｇ）。顕微鏡写真中、アローヘッドは表面結合ファージおよびｑドット指し、矢印は内在化粒子を指す。 図１１Ａ〜１１Ｃは、ＣｅｎｄＲ内在化の構造の特徴を示す。図１１Ａ：Ｇ６ＲおよびＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージのＰＰＣ−１細胞との相互作用。細胞をファージと４℃でインキュベートして表面結合（「結合」）を評価するか、３７℃でのインキュベーション後に低ｐＨで洗浄してファージ取り込み（「内在化」）を評価した。ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）機能付与されたｑドットはＲＰＡＲＰＡＲファージの結合および内在化の両方を阻害したのに対して、Ｇ７のｑドットは効果がなかった。Ｇ６Ｒファージは内在化されず、ＰＰＣ−１細胞へのその結合は過剰なＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）のｑドットによってブロックされた。結合を、ポリグリシンヘプタペプチド（Ｇ７）をディスプレイするコントロールファージに対する倍率として示す。図１１Ｂ：４℃でのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）誘導体ファージのＰＰＣ−１細胞への結合。データは、４つの独立した結合実験の代表である。左から右に、配列は配列番号１１２〜１２５に対応するが、それぞれ配列番号２および配列番号３である第１および第９の配列は除外する。スチューデントｔ検定によって統計分析を行った（図１１Ａ）。ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を示す；１つのアスタリスク、ｐ＜０．０５；２つのアスタリスク、ｐ＜０．０１。スケールバー：２０μｍ。図１１Ｃ（パネルｃ〜ｇ）ペプチドディスプレイファージ（鮮やかな色のドット、ｃ〜ｅ）またはペプチドコーティングしたｑドット（鮮やかな色のドット、ｆ、ｇ）と３７℃で２時間インキュベートしたＰＰＣ−１細胞の共焦点顕微鏡法：ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）Ｔ７（ｃ）、Ｇ６Ｒ Ｔ７（ｄ）、ＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号２）Ｔ７（ｅ）、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ｑドット（ｆ）、およびＲＰＡＲＰＡＲ−ＮＨ２（配列番号２）ｑドット（ｇ）。顕微鏡写真中、アローヘッドは表面結合ファージおよびｑドット指し、矢印は内在化粒子を指す。 図１１Ａ〜１１Ｃは、ＣｅｎｄＲ内在化の構造の特徴を示す。図１１Ａ：Ｇ６ＲおよびＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージのＰＰＣ−１細胞との相互作用。細胞をファージと４℃でインキュベートして表面結合（「結合」）を評価するか、３７℃でのインキュベーション後に低ｐＨで洗浄してファージ取り込み（「内在化」）を評価した。ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）機能付与されたｑドットはＲＰＡＲＰＡＲファージの結合および内在化の両方を阻害したのに対して、Ｇ７のｑドットは効果がなかった。Ｇ６Ｒファージは内在化されず、ＰＰＣ−１細胞へのその結合は過剰なＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）のｑドットによってブロックされた。結合を、ポリグリシンヘプタペプチド（Ｇ７）をディスプレイするコントロールファージに対する倍率として示す。図１１Ｂ：４℃でのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）誘導体ファージのＰＰＣ−１細胞への結合。データは、４つの独立した結合実験の代表である。左から右に、配列は配列番号１１２〜１２５に対応するが、それぞれ配列番号２および配列番号３である第１および第９の配列は除外する。スチューデントｔ検定によって統計分析を行った（図１１Ａ）。ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を示す；１つのアスタリスク、ｐ＜０．０５；２つのアスタリスク、ｐ＜０．０１。スケールバー：２０μｍ。図１１Ｃ（パネルｃ〜ｇ）ペプチドディスプレイファージ（鮮やかな色のドット、ｃ〜ｅ）またはペプチドコーティングしたｑドット（鮮やかな色のドット、ｆ、ｇ）と３７℃で２時間インキュベートしたＰＰＣ−１細胞の共焦点顕微鏡法：ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）Ｔ７（ｃ）、Ｇ６Ｒ Ｔ７（ｄ）、ＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号２）Ｔ７（ｅ）、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ｑドット（ｆ）、およびＲＰＡＲＰＡＲ−ＮＨ２（配列番号２）ｑドット（ｇ）。顕微鏡写真中、アローヘッドは表面結合ファージおよびｑドット指し、矢印は内在化粒子を指す。 図１２Ａおよび１２Ａは、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）、ＲＧＥＲＰＰＲ（配列番号２７）、およびＲＶＴＲＰＰＲ（配列番号２８）ペプチドの細胞結合および取り込みを示す。図１２Ａ：共有経路。類似の範囲にて４℃でＰＰＣ−１細胞に結合した３つ全てのタンデムＲＸＸＲ（配列番号２５）ペプチドをディスプレイするファージ。ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）機能付与されたｑドットとの細胞のプレインキュベーションによって結合が阻害された。ヘプタグリシンコントロールペプチド（Ｇ７）でコーティングしたＱドットは、ファージ結合に影響を及ぼさなかった。スチューデントｔ検定によって統計分析を行った（ｃ）。ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を示す；１つのアスタリスクはｐ＜０．０５；２つのアスタリスクはｐ＜０．０１。図１２Ｂ（パネルｂ〜ｉ）：１０９ｐｆｕの以下のファージの存在下で１時間培養したＰＰＣ−１細胞におけるファージ免疫反応性（鮮やかな色のドット）の共焦点免疫蛍光評価：（ｂ）ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）、（ｃ）ＲＧＥＲＰＰＲ（配列番号２７）、（ｄ）ＲＶＴＲＰＰＲ（配列番号２８）、（ｅ）コントロールＧ７、（ｆ）２０μＭの遊離ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドの存在下でのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージ、（ｇ）２００μＭの遊離ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドの存在下でのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージ、（ｈ）２ｍＭの遊離ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドの存在下でのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージ、（ｉ）２００μＭの遊離ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドの存在下でのＲＧＥＲＲＰＲ（配列番号２７）ファージ。卵形長円体は、ＤＡＰＩで対比染色した核を示す。スケールバー：２０μｍ。 図１２Ａおよび１２Ａは、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）、ＲＧＥＲＰＰＲ（配列番号２７）、およびＲＶＴＲＰＰＲ（配列番号２８）ペプチドの細胞結合および取り込みを示す。図１２Ａ：共有経路。類似の範囲にて４℃でＰＰＣ−１細胞に結合した３つ全てのタンデムＲＸＸＲ（配列番号２５）ペプチドをディスプレイするファージ。ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）機能付与されたｑドットとの細胞のプレインキュベーションによって結合が阻害された。ヘプタグリシンコントロールペプチド（Ｇ７）でコーティングしたＱドットは、ファージ結合に影響を及ぼさなかった。スチューデントｔ検定によって統計分析を行った（ｃ）。ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を示す；１つのアスタリスクはｐ＜０．０５；２つのアスタリスクはｐ＜０．０１。図１２Ｂ（パネルｂ〜ｉ）：１０９ｐｆｕの以下のファージの存在下で１時間培養したＰＰＣ−１細胞におけるファージ免疫反応性（鮮やかな色のドット）の共焦点免疫蛍光評価：（ｂ）ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）、（ｃ）ＲＧＥＲＰＰＲ（配列番号２７）、（ｄ）ＲＶＴＲＰＰＲ（配列番号２８）、（ｅ）コントロールＧ７、（ｆ）２０μＭの遊離ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドの存在下でのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージ、（ｇ）２００μＭの遊離ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドの存在下でのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージ、（ｈ）２ｍＭの遊離ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドの存在下でのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージ、（ｉ）２００μＭの遊離ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドの存在下でのＲＧＥＲＲＰＲ（配列番号２７）ファージ。卵形長円体は、ＤＡＰＩで対比染色した核を示す。スケールバー：２０μｍ。 図１３は、ＰＰＣ−１細胞によるＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ｑドットの内在化（明色ドット）を示す：ペプチド修飾の影響。ＰＰＣ−１細胞を以下のペプチドで機能付与されたｑドットと２時間インキュベートした：（ａ）ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）、（ｂ）ＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号３）、（ｃ）ＲＰＡＲＰＡＲ−ＮＨ２（配列番号２）、（ｄ）Ｄ−ｒｐａｒｐａｒ、（ｅ）Ｄ−ｒｐａｒｐａｒａ、および（ｆ）Ｇ７。細胞を核染料ＤＡＰＩで染色し、共焦点顕微鏡を使用して画像化した。スケールバー：５０μｍ。 図１４は、トリプシン切断によってＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号３）ファージのＰＰＣ−１細胞への結合が増強されることを示す。１０９ｐｆｕのＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号３）ファージを３７℃にて表示量のトリプシンで処理し、その後に４℃でファージ結合アッセイを行った。データは、４つの独立した結合実験の代表である。 図１５Ａ〜１５Ｄは、ＣｅｎｄＲファージが多数の細胞型に結合することを示す。図１５Ａ：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける４℃での培養細胞へのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの結合。図１５Ｂ：ｅｘ ｖｉｖｏにおける４℃でのマウス器官の初代細胞懸濁液へのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの結合。図１５Ｃおよび１５Ｄ：２０分間の循環後の静脈内注射したＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの組織分布。図１５Ｃ：滴定によってファージを定量し、組織結合をＧ７ファージに対する倍率として示す。スチューデントｔ検定によって統計分析を行った（ｃ）。ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を示す；２つのアスタリスクはｐ＜０．０１、３つアスタリスクはｐ＜０．００１。図１５Ｄ（パネルｄおよびｅ）：ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）（ｄ）またはＧ７（ｅ）ファージを静脈内注射したマウスの肺切片中のＴ７ファージ（明色）の免疫蛍光局在化。ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）（ｄ中のアローヘッド）を注射したマウスの肺内に広範な免疫応答性が存在するが、Ｇ７では存在しない（血管内で認められる偶然の標識を有する、ｅ中の矢印）。スケールバー：５０μｍ。 図１５Ａ〜１５Ｄは、ＣｅｎｄＲファージが多数の細胞型に結合することを示す。図１５Ａ：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける４℃での培養細胞へのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの結合。図１５Ｂ：ｅｘ ｖｉｖｏにおける４℃でのマウス器官の初代細胞懸濁液へのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの結合。図１５Ｃおよび１５Ｄ：２０分間の循環後の静脈内注射したＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの組織分布。図１５Ｃ：滴定によってファージを定量し、組織結合をＧ７ファージに対する倍率として示す。スチューデントｔ検定によって統計分析を行った（ｃ）。ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を示す；２つのアスタリスクはｐ＜０．０１、３つアスタリスクはｐ＜０．００１。図１５Ｄ（パネルｄおよびｅ）：ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）（ｄ）またはＧ７（ｅ）ファージを静脈内注射したマウスの肺切片中のＴ７ファージ（明色）の免疫蛍光局在化。ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）（ｄ中のアローヘッド）を注射したマウスの肺内に広範な免疫応答性が存在するが、Ｇ７では存在しない（血管内で認められる偶然の標識を有する、ｅ中の矢印）。スケールバー：５０μｍ。 図１５Ａ〜１５Ｄは、ＣｅｎｄＲファージが多数の細胞型に結合することを示す。図１５Ａ：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける４℃での培養細胞へのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの結合。図１５Ｂ：ｅｘ ｖｉｖｏにおける４℃でのマウス器官の初代細胞懸濁液へのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの結合。図１５Ｃおよび１５Ｄ：２０分間の循環後の静脈内注射したＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの組織分布。図１５Ｃ：滴定によってファージを定量し、組織結合をＧ７ファージに対する倍率として示す。スチューデントｔ検定によって統計分析を行った（ｃ）。ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を示す；２つのアスタリスクはｐ＜０．０１、３つアスタリスクはｐ＜０．００１。図１５Ｄ（パネルｄおよびｅ）：ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）（ｄ）またはＧ７（ｅ）ファージを静脈内注射したマウスの肺切片中のＴ７ファージ（明色）の免疫蛍光局在化。ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）（ｄ中のアローヘッド）を注射したマウスの肺内に広範な免疫応答性が存在するが、Ｇ７では存在しない（血管内で認められる偶然の標識を有する、ｅ中の矢印）。スケールバー：５０μｍ。 図１５Ａ〜１５Ｄは、ＣｅｎｄＲファージが多数の細胞型に結合することを示す。図１５Ａ：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける４℃での培養細胞へのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの結合。図１５Ｂ：ｅｘ ｖｉｖｏにおける４℃でのマウス器官の初代細胞懸濁液へのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの結合。図１５Ｃおよび１５Ｄ：２０分間の循環後の静脈内注射したＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの組織分布。図１５Ｃ：滴定によってファージを定量し、組織結合をＧ７ファージに対する倍率として示す。スチューデントｔ検定によって統計分析を行った（ｃ）。ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を示す；２つのアスタリスクはｐ＜０．０１、３つアスタリスクはｐ＜０．００１。図１５Ｄ（パネルｄおよびｅ）：ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）（ｄ）またはＧ７（ｅ）ファージを静脈内注射したマウスの肺切片中のＴ７ファージ（明色）の免疫蛍光局在化。ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）（ｄ中のアローヘッド）を注射したマウスの肺内に広範な免疫応答性が存在するが、Ｇ７では存在しない（血管内で認められる偶然の標識を有する、ｅ中の矢印）。スケールバー：５０μｍ。 図１６Ａおよび１６Ｂは、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージのＰＰＣ−１細胞への結合および内在化の動態を示す。図１６Ａ：４℃で、培養ＰＰＣ−１細胞懸濁液へのファージの結合は２０分でプラトーになる。経時変化研究のために、培養ＰＰＣ−１細胞の細胞懸濁液を、１０９ｐｆｕのファージとインキュベートし、その後にシリコーン油クッション（１．０３ｇ／ｍｌ）上での遠心分離によって非結合ファージから細胞を一段階で分離し、滴定した。図１６Ｂ（パネルｂ、ｃ）：３７℃での肝臓ＰＰＣ−１細胞によるＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）機能付与されたｑドットの内在化。（ｂ）ｑドット添加の１５分後、細胞膜に沿って標識（明色の斑点）が認められる。（ｃ）１時間後、ほとんどのｑドットが内在化される。核を生体内核色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３４２で染色した。ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を示す。スケールバー：２０μｍ。 図１７Ａ、１７Ｂ、および１７Ｃは、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージが通常でない経路を介してＰＰＣ−１細胞によって内在化されることを示す。図１７Ａ：ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージ内在化に及ぼすエンドサイトーシスインヒビターの影響。ファージをＰＰＣ−１細胞と表示のインヒビターの存在下にて３７℃で９０分間インキュベートし、その後に酸で洗浄し、滴定して内在化ファージを定量した。ＡＮＯＶＡによって行った統計分析は、インヒビターが内在化を有意に阻害しなかったことを示した。ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を示す。図１７Ｂ：１０９ｐｆｕのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの存在下で６０分間インキュベートし、Ｔ７ファージおよび細胞内区画マーカーについて二重染色したＰＰＣ−１細胞の共焦点顕微鏡画像（ＬＡＭＰ−１、カベオリン−１、カルネキシン、ＥＥＡ−１）。核をＤＡＰＩで染色した。図１７Ｃ：１０９ｐｆｕのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージおよび１０μｇ／ｍｌのコレラ毒素Ｂサブユニットの存在下で１８０分間インキュベートしたＰＰＣ−１細胞の共焦点顕微鏡画像。ファージをＡｌｅｘａ−５４６標識二次抗体によって検出し、コレラ毒素サブユニットＢをＡｌｅｘａ−４８８色素で標識した。核のすぐ外側に存在する明るいスポット（矢印）によって同時局在化を示す。核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１０μｍ。 図１７Ａ、１７Ｂ、および１７Ｃは、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージが通常でない経路を介してＰＰＣ−１細胞によって内在化されることを示す。図１７Ａ：ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージ内在化に及ぼすエンドサイトーシスインヒビターの影響。ファージをＰＰＣ−１細胞と表示のインヒビターの存在下にて３７℃で９０分間インキュベートし、その後に酸で洗浄し、滴定して内在化ファージを定量した。ＡＮＯＶＡによって行った統計分析は、インヒビターが内在化を有意に阻害しなかったことを示した。ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を示す。図１７Ｂ：１０９ｐｆｕのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの存在下で６０分間インキュベートし、Ｔ７ファージおよび細胞内区画マーカーについて二重染色したＰＰＣ−１細胞の共焦点顕微鏡画像（ＬＡＭＰ−１、カベオリン−１、カルネキシン、ＥＥＡ−１）。核をＤＡＰＩで染色した。図１７Ｃ：１０９ｐｆｕのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージおよび１０μｇ／ｍｌのコレラ毒素Ｂサブユニットの存在下で１８０分間インキュベートしたＰＰＣ−１細胞の共焦点顕微鏡画像。ファージをＡｌｅｘａ−５４６標識二次抗体によって検出し、コレラ毒素サブユニットＢをＡｌｅｘａ−４８８色素で標識した。核のすぐ外側に存在する明るいスポット（矢印）によって同時局在化を示す。核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１０μｍ。 図１７Ａ、１７Ｂ、および１７Ｃは、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージが通常でない経路を介してＰＰＣ−１細胞によって内在化されることを示す。図１７Ａ：ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージ内在化に及ぼすエンドサイトーシスインヒビターの影響。ファージをＰＰＣ−１細胞と表示のインヒビターの存在下にて３７℃で９０分間インキュベートし、その後に酸で洗浄し、滴定して内在化ファージを定量した。ＡＮＯＶＡによって行った統計分析は、インヒビターが内在化を有意に阻害しなかったことを示した。ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を示す。図１７Ｂ：１０９ｐｆｕのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの存在下で６０分間インキュベートし、Ｔ７ファージおよび細胞内区画マーカーについて二重染色したＰＰＣ−１細胞の共焦点顕微鏡画像（ＬＡＭＰ−１、カベオリン−１、カルネキシン、ＥＥＡ−１）。核をＤＡＰＩで染色した。図１７Ｃ：１０９ｐｆｕのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージおよび１０μｇ／ｍｌのコレラ毒素Ｂサブユニットの存在下で１８０分間インキュベートしたＰＰＣ−１細胞の共焦点顕微鏡画像。ファージをＡｌｅｘａ−５４６標識二次抗体によって検出し、コレラ毒素サブユニットＢをＡｌｅｘａ−４８８色素で標識した。核のすぐ外側に存在する明るいスポット（矢印）によって同時局在化を示す。核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１０μｍ。 図１８Ａ〜１８Ｃは、ＮＲＰ−１のＣｅｎｄＲ受容体としての同定および確証を示す。図１８Ａ：ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドと相互作用するタンパク質のアフィニティクロマトグラフィ。ＰＰＣ−１腫瘍組織を２００ｍＭグルコピラノシド緩衝液で抽出し、抽出物をＲＰＡＲＰＡＲコーティングした（配列番号２）ビーズとインキュベートし、その後に徹底的に洗浄し、２ｍＭ遊離ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドで溶離した。溶離液の画分３から開始される１３０ｋＤａバンドの出現は、質量分析によってＮＲＰ−１と同定されたことに留意のこと。上のパネル−銀染色したゲル、下のパネル−抗ＮＲＰ−１抗体での免疫ブロット。図１８Ｂ：野生型ＮＲＰ−１（ＮＲＰ−１）、三重変異体ＮＳ３４６Ａ−Ｅ３４８Ａ−Ｔ３４９Ａ ＮＲＰ−１（変異体ＮＲＰ−１）、または親ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Ｖｅｃｔｏｒ）で一過性にトランスフェクトしたＭ２１黒色腫細胞、およびトランスフェクトしていないＭ２１細胞へのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの結合。図１８Ｃ：（ｃ、ｄ）、ファージと３７℃で４０分間（ｃ）および３時間（ｄ）インキュベートしたＰＰＣ−１細胞におけるＮＲＰ−１およびＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）Ｔ７ファージの共焦点免疫蛍光画像。ファージおよびＮＲＰ−１は広範に同時局在化されるが、重複中で進行性に減少し（ｃおよびｄ中のアローヘッド）、ファージのみについて陽性の構造が出現するようである（矢印、ｄ）。（ｅ）ＮＲＰ−１で一過性にトランスフェクトしたＭ２１細胞におけるＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージおよびＮＲＰ−１の免疫染色および共焦点顕微鏡画像。ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージを、フィブロネクチンコーティングしたカバーガラス上にて培養した細胞と３７℃で３時間インキュベートした。ＮＲＰ−１発現細胞のみがファージに結合して内在化するのに対して（矢印）、陰性細胞（視覚化されず）はそうでなかった。（ｆ）ＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号３）ファージは、ＮＲＰ−１陽性Ｍ２１細胞中に内在化されない。ＡＮＯＶＡを使用して統計分析を行った（ｂ）；ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を示す。スケールバー：１０μｍ。 図１９Ａおよび１９Ｂは、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）および既知のＮＲＰ−１リガンドペプチドをディスプレイするファージのＰＰＣ−１細胞への結合を示す。図１９Ａ：既知のＮＲＰ−１リガンドにより、ファージがＰＰＣ−１細胞に結合される。ＮＲＰ−１のｂ１サブユニットと相互作用することが公知のペプチドリガンドをディスプレイするファージ（ａ中の表）はＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）と類似の範囲で細胞に結合するのに対して、Ｃ末端アラニンを付加したＶＥＧＦ−Ｃ７（ＶＥＧＦ−Ｃ７−Ａ）は不活性である。表中で上から下に、配列は、配列番号１２６〜１３０に対応する。図１９Ｂ（パネルｂ〜ｇ）：１０９ｐｆｕの表示のファージの存在下で１時間培養したＰＰＣ−１細胞におけるファージ免疫反応性の共焦点免疫蛍光評価。矢印、内在化ファージ；アローヘッド、細胞膜会合ファージ。核をＤＡＰＩで染色した。挿入図：０．５ｍＭの遊離ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチド（ファージ添加の１０分前に細胞に添加）によるファージ結合の競合。スケールバー：２０μｍ。 図１９Ａおよび１９Ｂは、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）および既知のＮＲＰ−１リガンドペプチドをディスプレイするファージのＰＰＣ−１細胞への結合を示す。図１９Ａ：既知のＮＲＰ−１リガンドにより、ファージがＰＰＣ−１細胞に結合される。ＮＲＰ−１のｂ１サブユニットと相互作用することが公知のペプチドリガンドをディスプレイするファージ（ａ中の表）はＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）と類似の範囲で細胞に結合するのに対して、Ｃ末端アラニンを付加したＶＥＧＦ−Ｃ７（ＶＥＧＦ−Ｃ７−Ａ）は不活性である。表中で上から下に、配列は、配列番号１２６〜１３０に対応する。図１９Ｂ（パネルｂ〜ｇ）：１０９ｐｆｕの表示のファージの存在下で１時間培養したＰＰＣ−１細胞におけるファージ免疫反応性の共焦点免疫蛍光評価。矢印、内在化ファージ；アローヘッド、細胞膜会合ファージ。核をＤＡＰＩで染色した。挿入図：０．５ｍＭの遊離ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチド（ファージ添加の１０分前に細胞に添加）によるファージ結合の競合。スケールバー：２０μｍ。 図２０Ａ〜２０Ｃは、ウロキナーゼ依存性ＣｅｎｄＲペプチドを示す。図２０Ａ：ｕＰＡ活性可能なＣｅｎｄＲペプチド（ｕＣｅｎｄＲ）のデザイン。ｕＰＡコンセンサス切断部位ＳＧＲＳＡ（配列番号３４のアミノ酸５〜９）（Ｋｅ、Ｓ．Ｈ．ら（１９９７）を、重複ＣｅｎｄＲエレメントと組み合わせた。インタクトなペプチド中で、ＣｅｎｄＲエレメントは、Ｃ末端が曝露していないので不活性である。ｕＰＡによる切断によってＣｅｎｄＲエレメントのＣ末端が曝露し（ｕＣｅｎｄＲ−Ｘ）、細胞への結合および内在化が起こる。図２０Ｂ：ｕＣｅｎｄＲペプチドをディスプレイするファージのＰＰＣ−１細胞への結合および切断後産物に対応するペプチド（ｕＣｅｎｄＲ−Ｘ）のＰＰＣ−１細胞への結合。細胞へのファージの添加前に、ファージを５０ｉｕのｕＰＡ、２５μｇの結晶トリプシン、５０ｉｕのトロンビン、または２５μｇのコラゲナーゼＩ型で処理した。図２０Ｃ（パネルｃ〜ｅ）ｕＰＡ−ＣｅｎｄＲ−ｑドットとインキュベートしたＰＰＣ−１細胞の蛍光顕微鏡法。非処理ｕＣｅｎｄＲのｑドットは内在化されないのに対して（ｃ）、ｕＰＡ処理によってｑドット（ｄ、アローヘッド）の内在化が誘発される。アミロライドは取り込みを阻害した（ｅ）。ＡＮＯＶＡを使用して統計分析を行った（ｂ）；ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を示す；３つのアスタリスクはｐ＜０．００１。スケールバー：２０μｍ。 図２０Ａ〜２０Ｃは、ウロキナーゼ依存性ＣｅｎｄＲペプチドを示す。図２０Ａ：ｕＰＡ活性可能なＣｅｎｄＲペプチド（ｕＣｅｎｄＲ）のデザイン。ｕＰＡコンセンサス切断部位ＳＧＲＳＡ（配列番号３４のアミノ酸５〜９）（Ｋｅ、Ｓ．Ｈ．ら（１９９７）を、重複ＣｅｎｄＲエレメントと組み合わせた。インタクトなペプチド中で、ＣｅｎｄＲエレメントは、Ｃ末端が曝露していないので不活性である。ｕＰＡによる切断によってＣｅｎｄＲエレメントのＣ末端が曝露し（ｕＣｅｎｄＲ−Ｘ）、細胞への結合および内在化が起こる。図２０Ｂ：ｕＣｅｎｄＲペプチドをディスプレイするファージのＰＰＣ−１細胞への結合および切断後産物に対応するペプチド（ｕＣｅｎｄＲ−Ｘ）のＰＰＣ−１細胞への結合。細胞へのファージの添加前に、ファージを５０ｉｕのｕＰＡ、２５μｇの結晶トリプシン、５０ｉｕのトロンビン、または２５μｇのコラゲナーゼＩ型で処理した。図２０Ｃ（パネルｃ〜ｅ）ｕＰＡ−ＣｅｎｄＲ−ｑドットとインキュベートしたＰＰＣ−１細胞の蛍光顕微鏡法。非処理ｕＣｅｎｄＲのｑドットは内在化されないのに対して（ｃ）、ｕＰＡ処理によってｑドット（ｄ、アローヘッド）の内在化が誘発される。アミロライドは取り込みを阻害した（ｅ）。ＡＮＯＶＡを使用して統計分析を行った（ｂ）；ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を示す；３つのアスタリスクはｐ＜０．００１。スケールバー：２０μｍ。 図２０Ａ〜２０Ｃは、ウロキナーゼ依存性ＣｅｎｄＲペプチドを示す。図２０Ａ：ｕＰＡ活性可能なＣｅｎｄＲペプチド（ｕＣｅｎｄＲ）のデザイン。ｕＰＡコンセンサス切断部位ＳＧＲＳＡ（配列番号３４のアミノ酸５〜９）（Ｋｅ、Ｓ．Ｈ．ら（１９９７）を、重複ＣｅｎｄＲエレメントと組み合わせた。インタクトなペプチド中で、ＣｅｎｄＲエレメントは、Ｃ末端が曝露していないので不活性である。ｕＰＡによる切断によってＣｅｎｄＲエレメントのＣ末端が曝露し（ｕＣｅｎｄＲ−Ｘ）、細胞への結合および内在化が起こる。図２０Ｂ：ｕＣｅｎｄＲペプチドをディスプレイするファージのＰＰＣ−１細胞への結合および切断後産物に対応するペプチド（ｕＣｅｎｄＲ−Ｘ）のＰＰＣ−１細胞への結合。細胞へのファージの添加前に、ファージを５０ｉｕのｕＰＡ、２５μｇの結晶トリプシン、５０ｉｕのトロンビン、または２５μｇのコラゲナーゼＩ型で処理した。図２０Ｃ（パネルｃ〜ｅ）ｕＰＡ−ＣｅｎｄＲ−ｑドットとインキュベートしたＰＰＣ−１細胞の蛍光顕微鏡法。非処理ｕＣｅｎｄＲのｑドットは内在化されないのに対して（ｃ）、ｕＰＡ処理によってｑドット（ｄ、アローヘッド）の内在化が誘発される。アミロライドは取り込みを阻害した（ｅ）。ＡＮＯＶＡを使用して統計分析を行った（ｂ）；ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を示す；３つのアスタリスクはｐ＜０．００１。スケールバー：２０μｍ。 図２１はＣｅｎｄＲ内在化経路を示す。タンパク質のＣ末端に配置された場合に活性な同定された内在化モチーフ（ＣｅｎｄＲモチーフ）。Ｃ末端以外の位置にＣｅｎｄＲモチーフを含むペプチド（潜在性ＣｅｎｄＲペプチド）は内在化されないが、ニューロピリン−１へのその結合および内在化をタンパク質分解性切断によって誘発することができる。ＣｅｎｄＲ経路により、生物学的および合成のナノ粒子（バクテリオファージおよびｑドット）が取り込まれる。ＣｅｎｄＲ経路はまた、細胞の他の生物学的因子（ウイルスおよび他の細胞など）との相互作用に関連し得る。
発明の詳細な説明
開示の方法および組成物を、以下の本明細書中に含まれる特定の実施形態の詳細な説明および実施例ならびに図面およびその前後の説明を参照してより容易に理解することができる。
本発明の化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法を開示および説明する前に、他で特定しない限り特定の合成方法または特定の組換えバイオテクノロジー法に制限されないか、他で特定しない限り特定の試薬に制限されず、そのようなものとして、勿論、変動し得ると理解すべきである。本明細書中で使用される用語が特定の実施形態の説明のみを目的とし、制限することを意図しないことも理解すべきである。
Ａ．定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、文脈中で明確に別なふうに示されない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数形が含まれる。したがって、例えば、「薬学的キャリア」という言及には、２つ以上のかかるキャリアの混合物などが含まれる。
範囲を、本明細書中で「約」１つの特定の値から、そして／または「約」別の特定の値までと示すことができる。かかる範囲を示す場合、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、前に「約」を使用することによって値を近似値として示す場合、特定の値が別の実施形態を形成すると理解されるであろう。各範囲の終点が共に他の終点と関連して有意であり、且つ他の終点と無関係に有意であることがさらに理解されるであろう。多数の数値が本明細書中に開示されており、各値は本明細書中で値自体に加えて「約」その特定の値としても開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。当業者によって適切に理解されるように、値をその値「以下」と開示する場合、「その値以上」およびその値の間の可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、値「１０」を開示する場合、「１０以下」および「１０以上」も開示される。本出願を通して、データを多数の異なる形式で提供し、このデータは終点および起点ならびにデータポイントの任意の組み合わせの範囲を示すことも理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント１５を開示する場合、１０および１５を超えるか、１０および１５以上、１０および１５未満、１０および１５以下、および１０および１５、ならびに１０と１５との間が開示されると見なされると理解される。２つの特定の単位の間の各単位も開示されることも理解される。例えば、１０および１５を開示する場合、１１、１２、１３、および１４も開示される。
本明細書中および以下の特許請求の範囲中、多数の用語が参照され、これらは以下の意味を有すると定義するものとする。
「任意選択的な」または「任意選択的に」は、その後に記載される事象または環境が起こっても起こらなくてもよく、この記載にはこの事象または環境が起こる例および起こらない例が含まれることを意味する。
本出願を通して、種々の刊行物を参照する。これらの刊行物の開示全体が、これが属する技術水準をより完全に説明するために本出願に参考として援用される。開示のリファレンスはまた、文中で考察され、参照するのに値するリファレンス中に含まれる材料について本明細書中で参考として個別且つ具体的に援用される。
他で特定しない限り、開示の方法および組成物は特定の合成方法、特定の分析技術、または特定の試薬に制限されず、そのようなものとして変化し得ると理解すべきである。本明細書中で使用した用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とし、制限することを意図しないことも理解すべきである。
Ｂ．概要
組成物の細胞内送達、排出、および組織透過が可能な新規の技術的プラットフォームを本明細書中に開示する。送達は一般的であり得、目的の細胞または組織（腫瘍など）をターゲティングすることができる。組成物（ナノ粒子、薬物、検出可能なマーカー、および他の化合物が含まれる）およびそのペイロードの標的細胞への内在化ならびに標的組織への透過によってターゲティング効率を増大させることができるが、細胞型特異的内在化および組織型特異的透過は以前に達成できなかった。さらに、組成物が脈管外隙を透過する能力は、ｉｎ ｖｉｖｏで組成物のターゲティング効率を制限する主な要因である。ファージおよび遊離ペプチドの細胞への効率の高い内在化をシグナル伝達する決定的な特徴としてＣ末端を有する簡潔なペプチドモチーフが同定された（図９は一例である）。この内在化現象は、「Ｃ末端則」または「ＣｅｎｄＲ」と命名されている。Ｃ末端エレメントを曝露させるタンパク質分解は、内在化シグナルを誘発するスイッチとしての機能を果たすことができる。種々の組成物を、この機構によって内在化することができる。例えば、ホーミングペプチド媒介蓄積は、Ｃ末端エレメントを曝露する細胞型特異的タンパク質分解が起こり、それにより標的誘発性内在化が起こる高度に特異的的ホーミング系が可能な標的部位で起こり得る。ＣｅｎｄＲ経路を、細胞からの目的の組成物の排出および組織へのその拡大のために使用することもできる。Ｃ末端エレメントは血管壁を介して移行することができ（例えば、静脈内注射から腫瘍組織に拡大し得る）、他の障壁（粘膜および血液脳関門など）にも及び得る。本明細書中で使用する場合、「組織透過」および「組織の透過」は、細胞の外層または第一層を超えるか通した、または組織膜を通した、組織内または組織を通した通過をいう。組織を介したかかる通過または透過（血管外遊出および組織透過ともいうことができる）は、細胞内在化および排出機能の両方の機能であり得る。本出願を通して、用語「組織透過」を使用する場合、かかる透過は体内の至る所で見出される他の障壁および膜（血液脳関門など）にも拡大することができると理解される。
公知の細胞透過性ペプチドと異なり、開示の内在化エレメントは位置依存性である−ペプチドのＣ末端以外の位置に存在する場合に不活性である。不顕性ペプチドを、例えば、適切なタンパク質分解酵素によって切断して、例えば、Ｃ末端のアルギニン、リジン、またはリジン−グリシンを曝露することによって活性化することができる。本出願を通して、用語「ＣｅｎｄＲエレメント」または「Ｃ末端エレメント」を使用する場合、この用語を使用して、Ｃ末端アルギニン、Ｃ末端リジン、またはＣ末端リジン−グリシン対（グリシンは最も遠いＣ末端位置に存在する）を説明する。言い換えれば、リジンがＣ末端に存在する場合、リジンのＣ末端側にグリシンを有するＣｅｎｄＲエレメントは、機能的なままであり得る。しかし、リジンがグリシンなしで存在して依然として機能的であり得るように、リジン残基をＣ末端エレメントとして機能的にさせるために末端にグリシンを有する必要はない。しかし、グリシンに隣接するリジンが存在しないでグリシンがＣ末端エレメントとして機能することができないという点で逆は真ではない。最も遠いＣ末端位置に残存する限り、アルギニンはＣ末端エレメントとして機能するためにリジンやグリシンは必要ない。かかるＣｅｎｄＲエレメントを、１型ＣｅｎｄＲエレメントということができる。
用語「ＣｅｎｄＲエレメント」または「Ｃ末端エレメント」を使用して、Ｃ末端ヒスチジンおよび配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４（式中、Ｘ１はＲ、Ｋ、またはＨであり得、Ｘ４はＲ、Ｋ、Ｈ、またはＫＧであり得、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり得る）を有するアミノ酸配列を説明することもできる。かかるＣｅｎｄＲエレメントを、２型ＣｅｎｄＲエレメントということができる。Ｘ２およびＸ３アミノ酸を特定の目的のために選択することができる。例えば、Ｘ２、Ｘ３、または両方を、プロテアーゼ認識配列の全部または一部を形成するために選択することができる。これは、例えば、後のＸ４アミノ酸の切断によって活性化される不顕性または潜在性ＣｅｎｄＲエレメントとしてＣｅｎｄＲエレメントを有するペプチドを特定するか切断可能にするのに有用であろう。かかるアミノ酸の選択例を、表１および４に示す。Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３アミノ酸を、例えば、細胞表面のＮＲＰ−１分子にさらなるタンパク質を動員するために選択することもできる。これを、例えば、ＣｅｎｄＲエレメント（ならびにＣｅｎｄＲエレメントを含む結合体、タンパク質、およびペプチド）の選択性ならびに内在化および／または組織透過効力を調整するために適用することができる。任意選択的に、一定のアミノ酸を、Ｘ２、Ｘ３、または両方のための使用から排除することもできる。例えば、必要に応じて、ＧおよびＤを、それぞれＸ２およびＸ３の同時使用から排除することができる。いくつかの２型ＣｅｎｄＲエレメントを、Ｒ／Ｋ／ＨＸＸＲ／Ｋ／Ｈ（配列番号５０）およびＲ／Ｋ／ＨＸＸＫＧ（配列番号５１）と記載することもできる。
ＣｅｎｄＲエレメントの例には、
が含まれる。
このプロテアーゼ調節可能な内在化系は、細胞型特異的および／または組織型特異的取り込みなどの機能および組織中に組成物を拡大する能力を有する組成物の操作において有用であり得る。さらに、この規則は、複数の生物学的過程（ウイルス感染および食作用が含まれる）に関連し得る。ウイルスが天然に細胞感染のためにＣｅｎｄＲ経路を使用することができるので、ＣｅｎｄＲペプチドおよび／または結合体は、ウイルス感染過程の干渉に有用であり得る。
１つの例では、ＣｅｎｄＲペプチドをナノ医療で使用することができる。ナノ医療の主な目的の１つは、疾患の診断、モニタリング、および治療で複数の機能を果たすことによって単剤を凌ぐデバイスをデザインすることである。多機能性ナノ粒子の医学的使用におけるいくつかの主な問題を解決するための新規のテクノロジーを適用することができる。医学ナノテクノロジーの主な目的は、組織（細胞内部が含まれる）中の疾患をモニタリングすることができるナノデバイスを開発することである。かかるデバイスは、細胞内部をサンプリングした後に所見について折り返し報告するために元に戻るナノ粒子を含むことができる。これには細胞を排出する能力が必要である。それにもかかわらず、分泌のためのシグナル配列を欠く多数の細胞質タンパク質は、細胞から分泌される。この様式で挙動する細胞タンパク質の主要例は塩基性ＦＧＦである（Ｂａｃｋｈａｕｓら、２００４）。ＶＰ２２タンパク質はまた、特殊な様式で細胞を排出する。非ターゲティング細胞の排出シグナルを有する特性を与えられたナノ粒子は、粒子の非特異的毒性を軽減することができる。組織透過性ファージライブラリーを使用して、細胞からのナノ粒子排出を促進する分子シグナルを同定することができる。
１．ＣｅｎｄＲエレメントおよびその使用
細胞への内在化および／または組織の透過のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、アミノ酸配列がＣ末端エレメントを含む工程、およびカーゴ組成物を選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、選択されたアミノ酸配列はタンパク質またはペプチドのＣ末端に存在し、ＣｅｎｄＲ結合体はタンパク質またはペプチドおよび結合または会合したカーゴ組成物を含む工程、を含むＣｅｎｄＲ結合体を形成する方法を開示する。
本明細書中で定義する場合、Ｃ末端エレメントは、アルギニン、リジン、もしくはリジン−グリシン（１型ＣｅｎｄＲエレメントについて）、またはヒスチジンもしくは配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４（式中、Ｘ１はＲ、Ｋ、またはＨであり得、Ｘ４はＲ、Ｋ、Ｈ、またはＫＧであり得、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり得る）を有するアミノ酸配列（２型ＣｅｎｄＲエレメントについて）のいずれかである。
本明細書中で使用する場合、「細胞への内在化のためのアミノ酸配列の選択」は、アミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドの細胞への侵入を得ることを特に意図するアミノ酸配列の選択、同定、デザイン、またはほかの分類をいう。したがって、例えば、アミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドの細胞への侵入を得ること以外およびアミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドの細胞への侵入を得ることを意図しないいくつかの目的または能力のためのアミノ酸配列の選択は、「細胞への内在化のためのアミノ酸配列の選択」を構成しない。いくつかの目的または能力およびアミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドの細胞への侵入を得るためのアミノ酸配列の選択は、「細胞への内在化のためのアミノ酸配列の選択」を構成する。したがって、アミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドの細胞への侵入を少なくとも特に意図するアミノ酸配列の選択が「細胞への内在化のためのアミノ酸配列の選択」を構成するというさらなる目標または目的の存在は変化しない。
本明細書中で使用する場合、「組織の透過のためのアミノ酸配列の選択」は、アミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドの組織への侵入（すなわち、組織透過）を得ることを特に意図するアミノ酸配列の選択、同定、デザイン、またはほかの分類をいう。したがって、例えば、アミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドの組織への侵入を得ること以外およびアミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドの組織への侵入を得ることを意図しないいくつかの目的または能力のためのアミノ酸配列の選択は、「組織の透過のためのアミノ酸配列の選択」を構成しない。いくつかの目的または能力およびアミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドの組織への侵入を得るためのアミノ酸配列の選択は、「組織の透過のためのアミノ酸配列の選択」を構成する。したがって、アミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドの組織への侵入を少なくとも特に意図するアミノ酸配列の選択が「組織の透過のためのアミノ酸配列の選択」を構成するというさらなる目標または目的の存在は変化しない。
本明細書中で使用する場合、「細胞への内在化および／または組織の透過のためのアミノ酸配列の選択」は、アミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドの細胞または組織のいずれかまたはその両方への侵入を得ることを特に意図するアミノ酸配列の選択、同定、デザイン、またはほかの分類をいう。したがって、例えば、アミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドの細胞、組織、またはその両方への侵入を得ること以外およびアミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドの細胞、組織、またはその両方への侵入を得ることを意図しないいくつかの目的または能力のためのアミノ酸配列の選択は、「細胞への内在化および／または組織の透過のためのアミノ酸配列の選択」を構成しない。いくつかの目的または能力およびアミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドの細胞または組織のいずれかまたはその両方への侵入のためのアミノ酸配列の選択は、「細胞への内在化および／または組織の透過のためのアミノ酸配列の選択」を構成する。したがって、アミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドの細胞、組織、またはその両方への侵入を少なくとも特に意図するアミノ酸配列の選択が「細胞への内在化および／または組織の透過のためのアミノ酸配列の選択」を構成するというさらなる目標または目的の存在は変化しない。
本明細書中で使用する場合、何か他のものに「カーゴ組成物を共有結合させるか非共有的に会合させる」は、他の何かに共有結合や非共有的に会合していないカーゴ組成物が他の何かに共有結合したか非共有的に会合した状態になるかまたはなり始める任意の作用をいう。例として、カーゴ組成物の別のカーゴ組成物への共有結合は、他のカーゴ組成物に「カーゴ組成物を共有結合させるか非共有的に会合させる」を構成する。別の例では、存在しない概念として開始され、次いで、組成物の一部として合成される（カーゴ組成物が結合するか会合することが含まれる）カーゴ組成物は、物に「カーゴ組成物を共有結合させるか非共有的に会合させる」を構成する。例えば、目的のアミノ酸配列およびＣ末端エレメントを含むアミノ酸配列の両方を含むペプチドの合成は、Ｃ末端エレメントを含むアミノ酸配列にカーゴ組成物（目的のアミノ酸配列）を共有結合させるか非共有的に会合させることを構成する。しかし、一般に、目的のアミノ酸配列およびＣ末端エレメントを含むアミノ酸配列の両方を天然に含むタンパク質またはペプチドの合成を、Ｃ末端エレメントを含むアミノ酸配列に「カーゴ組成物を共有結合させるか非共有的に会合させる」過程として排除することができる。
本明細書中で使用する場合、「ＣｅｎｄＲエレメント」は、Ｃ末端のアルギニン、リジン、またはリジン−グリシン配列（１型ＣｅｎｄＲエレメントについて）、またはＣ末端ヒスチジンもしくは配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４（式中、Ｘ１はＲ、Ｋ、またはＨであり得、Ｘ４はＲ、Ｋ、Ｈ、またはＫＧであり得、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり得る）を有するＣ末端アミノ酸配列（２型ＣｅｎｄＲエレメントについて）を有するアミノ酸配列をいう。いくつかの２型ＣｅｎｄＲエレメントを、Ｒ／Ｋ／ＨＸＸＲ／Ｋ／Ｈ（配列番号５０）およびＲ／Ｋ／ＨＸＸＫＧ（配列番号５１）と記載することもできる。Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３アミノ酸を、細胞表面のＮＲＰ−１分子にさらなるタンパク質を動員するために選択することもできる。これを、例えば、ＣｅｎｄＲエレメント（ならびにＣｅｎｄＲエレメントを含む結合体、タンパク質、およびペプチド）の選択性ならびに内在化および／または組織透過効力を調整するために適用することができる。ＣｅｎｄＲエレメントは、例えば、Ｃ末端エレメントを有するアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドを含むことができるか、Ｃ末端エレメントを有するアミノ酸配列からなるタンパク質またはペプチドを含むことができるか、Ｃ末端エレメントを有するアミノ酸配列からなり得る。任意選択的に、一定のアミノ酸を、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４形態のＣｅｎｄＲエレメント中のＸ２、Ｘ３、または両方の使用から排除することもできる。例えば、必要に応じて、ＧおよびＤを、それぞれＸ２およびＸ３としての同時使用から排除することができる。
ＣｅｎｄＲエレメントの例には、
が含まれる。
細胞に内在化することができるＣｅｎｄＲエレメントを、内在化ＣｅｎｄＲエレメントということができる。組織を透過することができるＣｅｎｄＲエレメントを、透過性ＣｅｎｄＲエレメントということができる。細胞に内在化し、且つ組織を透過することができるＣｅｎｄＲエレメントを、内在化および透過性ＣｅｎｄＲエレメントということができる。文脈上他の意味を明確に示さない限り、「ＣｅｎｄＲエレメント」という言及は、これらのいずれか、個別、集合的、または任意の組み合わせのいずれかをいう。
本明細書中で使用する場合、「ＣｅｎｄＲ結合体」は、アミノ酸配列がタンパク質またはペプチドのＣ末端に存在する、ＣｅｎｄＲエレメントを含むアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに会合したカーゴ組成物をいう。
本明細書中で使用する場合、「活性化可能なＣｅｎｄＲエレメント」は、分子、部分、ナノ粒子、化合物、または他の組成物がＣｅｎｄＲ結合体の内在化および／または組織透過をブロックすることができ、且つ分子、部分、ナノ粒子、化合物、または他の組成物を除去することができる（例えば、末端カルボキシ基を曝露するため）、ＣｅｎｄＲエレメント（Ｃ末端エレメントの末端カルボキシル基など）に共有結合した分子、部分、ナノ粒子、化合物、または他の組成物を有するＣｅｎｄＲエレメントをいう。例えば、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントは、ペプチドのＣ末端上に存在することができ、ＣｅｎｄＲエレメントの内在化および／または組織透過を防止することができる。ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合した分子、ナノ粒子、分子、化合物、または他の組成物を、「ブロッキング基」ということができる。例えば、ブロッキング基を、Ｃ末端のアルギニンもしくはリジンまたはＣｅｎｄＲエレメントの他のＣ末端アミノ酸の末端カルボキシル基、ＣｅｎｄＲエレメントのＣ末端アミノ酸、またはＣ末端アミノ酸以外のＣｅｎｄＲエレメントのアミノ酸に結合することができる。ＣｅｎｄＲエレメントの内在化および／または組織透過を防止することができる限り、ブロッキング基をＣｅｎｄＲエレメント以外のＣｅｎｄＲ結合体の一部に結合するか会合することもできる。
活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを、細胞への内在化、組織透過、またはその両方からブロックすることができる。一般に、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントは、細胞への内在化および組織の透過からブロックされるであろう。かかる活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを、活性化可能な内在化および透過性ＣｅｎｄＲエレメントということができる。しかし、いくつかの活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを、組織透過のみまたは細胞への内在化のみからブロックすることができる。かかる活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを、活性化可能な内在化ＣｅｎｄＲエレメント（細胞への内在化のみからブロックされるＣｅｎｄＲエレメントについて）または活性化可能な内在化および透過性ＣｅｎｄＲエレメント（組織の透過のみからブロックされるＣｅｎｄＲエレメントについて）ということができる。一般に、活性化可能である内在化ＣｅｎｄＲエレメントは、活性化可能な内在化ＣｅｎｄＲエレメントであろう。同様に、活性化可能である透過性ＣｅｎｄＲエレメントは、一般に、活性化可能な透過性ＣｅｎｄＲエレメントであろう。活性化可能である内在化および透過性ＣｅｎｄＲエレメントは、活性化可能な内在化および透過性ＣｅｎｄＲエレメントであろう。ブロッキング基の除去により、ＣｅｎｄＲエレメントが細胞に内在化するか、組織を透過するか、その両方を行うであろう。
「プロテアーゼ活性化可能なＣｅｎｄＲエレメント」（または「プロテアーゼ活性化ＣｅｎｄＲエレメント」）は、ペプチド結合を介してブロッキング基がＣｅｎｄＲエレメントに結合し、ペプチド結合をプロテアーゼによって切断することができる活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントをいう。プロテアーゼ活性化可能なＣｅｎｄＲエレメント中のこのペプチド結合の切断により、ＣｅｎｄＲエレメントの細胞への内在化および／または組織透過が可能になる。１つの例では、切断可能な結合または不安定な結合を介してブロッキング基をＣｅｎｄＲエレメントに結合することができる。切断可能な結合を、例えば、酵素または化合物によって切断することができる。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメント中の結合の切断または「不安定化」により、ＣｅｎｄＲエレメントの細胞への内在化および／または組織透過が可能になる。かかる切断または「不安定化」を、ＣｅｎｄＲエレメントの活性化ということができる。プロテアーゼ活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントは、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントの一形態である。Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４形態のＣｅｎｄＲエレメントのＸ２およびＸ３アミノ酸を、特定の目的のために選択することができる。例えば、Ｘ２、Ｘ３、または両方を選択して、プロテアーゼ認識配列の全部または一部を形成することができる。これは、例えば、Ｘ４アミノ酸の後の切断によって活性化される不顕性または潜在性ＣｅｎｄＲエレメントとしてＣｅｎｄＲエレメントを有するペプチドを特定または切断可能にするのに有用であろう。かかるアミノ酸の選択例を、表１および４に示す。有用なＣｅｎｄＲエレメントクラスは非ブロックＣｅｎｄＲエレメントおよび活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントからなり得る。このクラスは活性化可能でないブロックされたＣｅｎｄＲエレメントが除外される。
有用なプロテアーゼには、塩基性残基のＣ末端側を切断する酵素（ＣｅｎｄＲエレメントのＣ末端残基が塩基性残基であり得る）およびその切断部位のＣ末端側の配列を認識する酵素（したがって、切断産物のＣ末端配列が自由に選択される）が含まれる。有用なプロテアーゼの例には、例えば、セリンプロテアーゼ（例えば、プラスミンおよびプラスミノゲン（ｐａｓｍｉｎｏｇｅｎ）アクチベーターが含まれる）、プロタンパク質コンバターゼ（例えば、Ｄｕｃｋｅｒｔら、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ １７（１）：１０７−１１２（２００４）を参照のこと）、フューリン、およびカルボキシペプチダーゼが含まれる。セリンプロテアーゼは、癌細胞および腫瘍をターゲティングするＣｅｎｄＲエレメントおよびＣｅｎｄＲ結合体に特に有用である。塩基性残基のＣ末端側を切断する酵素の例には、Ａｒｇ−Ｃプロテアーゼ（アルギニン残基のＣ末端側を切断する；Ｋｅｉｌ，Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９２））、クロストリパイン（アルギニン残基のＣ末端側を切断する；Ｋｅｉｌ，１９９２）、エンテロキナーゼ（配列−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−（配列番号１３１）の後を切断する）、第Ｘａ因子（配列−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−の後を切断する；Ｆｕｊｉｋａｗａら、Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｆａｃｔｏｒ Ｘ（Ｓｔｕａｒｔ ｆａｃｔｏｒ）：ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ Ｘａ ａｌｐｈａ ｔｏ ｆａｃｔｏｒ Ｘａ ｂｅｔａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７２：３３５９−３３６３（１９７５））、Ｌｙｓ−Ｃ（リジン残基のＣ末端側を切断する；Ｋｅｉｌ，１９９２）、トロンビン（アルギニン残基のＣ末端側を切断する；Ｋｅｉｌ，１９９２）、トリプシン（アルギニン残基およびリジン残基のＣ末端側を切断する；Ｋｅｉｌ、１９９２）、セリンプロテアーゼ、プロタンパク質コンバターゼ（ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、ＰＣ４、ＰＣ５、ＰＣ６、ＰＣ７、ＰＣ８、フューリン、Ｐａｃｅ、ＰＡＣＥ４、サイト１プロテアーゼ、Ｓ１Ｐ、ＳＫＩ、ＮＡＲＣ−１、ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ２、ＰＣＳＫ３、ＰＣＳＫ４、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＰＣＳＫ７、ＰＣＳＫ８、およびＰＣＳＫ９など）、プラスミンおよびプラスミノゲンアクチベーターが含まれる。その切断部位のＣ末端側の配列を認識する酵素の例には、Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼ（アスパラギン酸のＮ末端側を切断する；Ｋｅｉｌ，１９９２）およびカルボキシペプチダーゼ（カルボキシペプチダーゼＡなど）（プロリン、リジン、およびアルギニンを除くＣ末端残基を切断する）が含まれる。
プロテアーゼの例は、Ｈｏｏｋ，Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ＲＧ Ｌａｎｄｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ（１９９８）；Ｈｏｏｐｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２１：２６５−２７９（１９９７）；Ｗｅｒｂ，Ｃｅｌｌ ９１：４３９−４４２（１９９７）；Ｗｏｌｆｓｂｅｒｇら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３１：２７５−２７８（１９９５）；Ｍｕｒａｋａｍｉ ａｎｄ Ｅｔｌｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１４６：１２４９−１２５９（１９８７）；Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０７：３１３−３２６（１９９５）；Ｓｍｙｔｈ ａｎｄ Ｔｒａｐａｎｉ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １６：２０２−２０６（１９９５）；Ｔａｌａｎｉａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９６７７−９６８２（１９９７）；およびＴｈｏｒｎｂｅｒｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１７９０７−１７９１１（１９９７）にも記載されている。
以下の酵素は、切断部位の各組成が見出された場合に切断することができる。
例外の原則。上記切断則は、以下の切断部位の組成を有する場合、適用されない（すなわち、切断しない）。
活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントのいくつかの有用な形態は、環状タンパク質またはペプチドであり得るか、これらに存在し得る。ＣｅｎｄＲエレメントは、かかる環状構造中で不顕性であろう。これは、ＣｅｎｄＲエレメントが遊離Ｃ末端にないからであろう。環状タンパク質またはペプチドを、当該分野で公知の種々の方法（システイン結合、共有結合、活性基の反応、およびリンカーなど）で形成することができる。システイン結合は、タンパク質およびペプチドを環状化する有用な方法である。環状化結合がＣｅｎｄＲエレメントのＣ末端に存在する必要はないと理解すべきである。環状化結合をＣｅｎｄＲエレメントのＣ末端から離れて配置することにより、不顕性ＣｅｎｄＲエレメントの環状化結合の選択および切断可能な結合の選択はそれぞれ無関係であり得る。例えば、環状化結合がシステイン結合であり得る一方で、不顕性ＣｅｎｄＲエレメントの切断可能な結合はペプチド結合であり得る（ペプチド結合は、例えば、プロテアーゼ標的の切断部位に存在し得る）。
開示のタンパク質、ペプチド、アミノ酸配列、またはＣｅｎｄＲ結合体中のＣｅｎｄＲエレメントは、一般に、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメント中の切断部位の遊離Ｃ末端またはＮ末端側に存在すべきである。
いくつかの形態では、ＣｅｎｄＲ結合体のペプチドまたはタンパク質を、選択されたアミノ酸配列（ＣｅｎｄＲエレメント）がペプチドまたはタンパク質中に存在する場合に細胞に内在化することができるが、選択されたアミノ酸がペプチドまたはタンパク質中に存在しない場合には内在化することができない。これを使用して、例えば、タンパク質またはペプチドがＣｅｎｄＲエレメントを含むかどうかを検出することができる。ＣｅｎｄＲエレメントを、例えば、それ自体の配列以外のいずれかに会合することなく細胞に内在化することができる。ＣｅｎｄＲエレメントはタンパク質、ペプチド、またはＣｅｎｄＲ結合体中の唯一の機能的内在化エレメントであり得るか、１つまたは複数のさらなる機能的内在化エレメントが存在し得る。いくつかの形態では、ＣｅｎｄＲ結合体を、選択されたアミノ酸配列（ＣｅｎｄＲエレメント）がＣｅｎｄＲ結合体中に存在する場合に細胞に内在化することができるが、選択されたアミノ酸がＣｅｎｄＲ結合体中に存在しない場合に内在化することができない。
同様に、いくつかの形態では、ＣｅｎｄＲ結合体のペプチドまたはタンパク質は、選択されたアミノ酸配列（ＣｅｎｄＲエレメント）がペプチドまたはタンパク質中に存在する場合に組織を透過することができるが、選択されたアミノ酸がペプチドまたはタンパク質中に存在しない場合には透過することができない。これを使用して、例えば、タンパク質またはペプチドがＣｅｎｄＲエレメントを含むかどうかを検出することができる。ＣｅｎｄＲエレメントは、例えば、それ自体の配列以外のいずれかに会合することなく組織を透過することができる。ＣｅｎｄＲエレメントはタンパク質、ペプチド、またはＣｅｎｄＲ結合体中の唯一の機能的組織透過エレメントであり得るか、１つまたは複数のさらなる機能的組織透過エレメントが存在し得る。いくつかの形態では、ＣｅｎｄＲ結合体は、選択されたアミノ酸配列（ＣｅｎｄＲエレメント）がＣｅｎｄＲ結合体中に存在する場合に組織を透過することができるが、選択されたアミノ酸がＣｅｎｄＲ結合体中に存在しない場合に透過することができない。
同様に、いくつかの形態では、ＣｅｎｄＲ結合体のペプチドまたはタンパク質を、選択されたアミノ酸配列（ＣｅｎｄＲエレメント）がペプチドまたはタンパク質中に存在する場合に細胞に内在化し、組織を透過することができるが、選択されたアミノ酸がペプチドまたはタンパク質中に存在しない場合にはこれができない。これを使用して、例えば、タンパク質またはペプチドがＣｅｎｄＲエレメントを含むかどうかを検出することができる。ＣｅｎｄＲエレメントを、例えば、それ自体の配列以外のいずれかに会合することなく細胞に内在化し、組織を透過することができる。ＣｅｎｄＲエレメントはタンパク質、ペプチド、またはＣｅｎｄＲ結合体中の唯一の機能的内在化および組織透過エレメントであり得るか、１つまたは複数のさらなる機能的内在化および／または組織透過エレメントが存在し得る。いくつかの形態では、ＣｅｎｄＲ結合体を、選択されたアミノ酸配列（ＣｅｎｄＲエレメント）がＣｅｎｄＲ結合体中に存在する場合に細胞に内在化し、組織を透過することができるが、選択されたアミノ酸がＣｅｎｄＲ結合体中に存在しない場合にそれができない。
「内在化」は、細胞膜または他の生物学的障壁を介した通過をいう。「透過」は、細胞、組織、または他の生物学的障壁中およびこれを介した通過をいう。透過は、一般に、内在化に関与し、内在化が含まれる。開示のＣｅｎｄＲエレメントは、一般に、内在化（細胞への内在化など）および透過（組織透過など）の両方を促進し、これらを可能にする。内在化または透過という用語は、文脈上他の意味を示さない限り、内在化および透過の両方をいうと理解されるべきである（細胞への内在化および組織透過それぞれの個別または明確な考察および説明など−本段落はその例である）。
「細胞への内在化」は、ＣｅｎｄＲエレメントが細胞膜を透過し、それにより、細胞に内在化することができることを意味する。この内在化は、例えば、所与のＣｅｎｄＲエレメントおよび所与の細胞について１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の効率で起こり得る。
ＣｅｎｄＲ結合体を、例えば、（ａ）細胞への内在化および／または組織透過のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、アミノ酸配列がＣ末端のアルギニンまたはリジン（または別のＣｅｎｄＲエレメント配列）を含む工程、（ｂ）カーゴ組成物を選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、選択されたアミノ酸配列はタンパク質またはペプチドのＣ末端に存在し、ＣｅｎｄＲ結合体はタンパク質またはペプチドおよび結合または会合したカーゴ組成物を含む工程を含む方法によって作製することができる。
（ａ）ＣｅｎｄＲエレメントをカーゴ組成物に結合させ、それにより、ＣｅｎｄＲ結合体を形成する工程、および（ｂ）細胞をＣｅｎｄＲ結合体に曝露する工程であって、次いで、ＣｅｎｄＲ結合体が細胞に侵入し、それによりカーゴ組成物を細胞に送達させることができる工程を含む、カーゴ組成物を細胞に送達させる方法も開示する。
（ａ）ＣｅｎｄＲエレメントをカーゴ組成物に結合させ、それにより、ＣｅｎｄＲ結合体を形成する工程、および（ｂ）組織をＣｅｎｄＲ結合体に曝露する工程であって、次いで、ＣｅｎｄＲ結合体が組織中の細胞に侵入して排出され、それにより、カーゴ組成物を組織に透過させることができる工程を含む、カーゴ組成物を透過させる方法も開示する。組織を介した通過（すなわち、透過）（血管外遊出および組織透過ということもできる）は、細胞内在化および排出機能の両方の機能であり得る。開示のＣｅｎｄＲエレメントおよびＣｅｎｄＲ結合体は、細胞への内在化および細胞からの排出の両方が可能であるので、組織透過が可能である。
（ａ）活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントをカーゴ組成物に結合させ、それにより、ＣｅｎｄＲ結合体を形成する工程、および（ｂ）細胞をＣｅｎｄＲ結合体に曝露する工程であって、切断剤がＣｅｎｄＲ結合体の活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを活性化し、次いで、ＣｅｎｄＲ結合体が細胞に侵入し、それによりカーゴ組成物を細胞に送達させることができる工程を含む、カーゴ組成物を細胞に送達させる方法をさらに開示する。
（ａ）活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントをカーゴ組成物に結合させ、それにより、ＣｅｎｄＲ結合体を形成する工程、および（ｂ）組織をＣｅｎｄＲ結合体に曝露する工程であって、切断剤がＣｅｎｄＲ結合体の活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを活性化し、次いで、ＣｅｎｄＲ結合体が組織中の細胞に侵入して排出され、それにより、カーゴ組成物を組織に透過させることができる工程を含む、カーゴ組成物を透過させる方法をさらに開示する。
（ａ）ＣｅｎｄＲエレメントに細胞を曝露する工程、および（ｂ）ＣｅｎｄＲエレメントが内在化されたかどうかを決定する工程を含む、ＣｅｎｄＲエレメントを内在化することができる細胞を同定する方法も開示する。細胞は、例えば、アッセイ中に存在し得る。ＣｅｎｄＲエレメントをタンパク質またはペプチドに結合させ、それにより、ＣｅｎｄＲ結合体を形成することができる。
（ａ）細胞を活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、（ｂ）活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントが内在化されたかどうかを決定する工程を含む、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを内在化することができる細胞を同定する方法も開示する。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを細胞への曝露前に脱保護することができるが、その必要はない。例えば、これを使用して活性化可能なエレメントのブロック能力を試験することができる。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントはまた、活性化可能なエレメントを切断するプロテアーゼの存在下で活性化されるプロテアーゼ活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントであり得る。
（ａ）癌細胞をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、および（ｂ）ＣｅｎｄＲエレメントが癌細胞によって内在化されたかどうかを同定する工程であって、内在化されたＣｅｎｄＲエレメントによって癌細胞がＣｅｎｄＲベースの療法の候補であると同定される工程を含む、ＣｅｎｄＲベースの療法の候補として癌細胞を同定する方法も開示する。細胞は、例えば、アッセイ中に存在し得るか、被験体中に存在し得る。ＣｅｎｄＲエレメントを、カーゴ組成物（例えば、タンパク質、ペプチド、またはナノ粒子など）に結合させ、それにより、ＣｅｎｄＲ結合体を形成することができる。本明細書中で使用する場合、ＣｅｎｄＲベースの療法は、ＣｅｎｄＲエレメントまたはＣｅｎｄＲ結合体に関与する被験体の治療をいう。
（ａ）腫瘍由来の組織をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、および（ｂ）ＣｅｎｄＲエレメントが組織を通過したか、または組織中の細胞によって内在化されたかどうかを決定する工程であって、通過または内在化されたＣｅｎｄＲエレメントによって腫瘍がＣｅｎｄＲベースの療法の候補であると同定される工程を含む、ＣｅｎｄＲベースの療法の候補として腫瘍を同定する方法も開示する。
切断可能な結合を介してブロッキング基がＣｅｎｄＲエレメントに結合している活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成する工程であって、切断可能な結合が目的の細胞付近に存在する酵素によって切断可能である工程を含む、目的の細胞付近に活性化することができる活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを産生する方法も開示する。これは、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成させる前に、目的の細胞付近に存在する酵素を同定する工程をさらに含むことができる。これは、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成させる前に目的の細胞付近に存在する酵素に基づいて切断可能な結合を選択する工程をさらに含むことができる。
（ａ）細胞への内在化のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含み、ＣｅｎｄＲエレメント（Ｃ末端のアルギニン、リジン、もしくはリジン−グリシン、または別のＣｅｎｄＲエレメント配列など）が末端カルボキシル基を含む工程、および（ｂ）ブロッキング基を選択されたアミノ酸配列の末端カルボキシル基に共有結合させる工程であって、ブロッキング基と末端カルボキシル基とを結合する結合が切断可能であり、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントが選択されたアミノ酸配列およびブロッキング基を含む工程、を含む、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成する方法も開示する。これは、工程（ｂ）の前に、目的の細胞付近に存在するプロテアーゼによって切断可能であるようにブロッキング基と末端カルボキシル基とを結合する結合を選択する工程をさらに含むことができる。
（ａ）細胞への内在化のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含み、ＣｅｎｄＲエレメントが末端カルボキシル基を含む工程、および（ｂ）ブロッキング基を選択されたアミノ酸配列の末端カルボキシル基に共有結合させる工程であって、ブロッキング基と末端カルボキシル基とを結合する結合が切断可能であり、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントが選択されたアミノ酸配列およびブロッキング基を含む工程を含む方法によって作製された活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントをさらに開示する。方法は、工程（ｂ）の前に、目的の細胞／細胞型／細胞／組織付近に存在するプロテアーゼによって切断可能であるようにブロッキング基と末端カルボキシル基とを結合する結合を選択する工程をさらに含むことができる。
ＣｅｎｄＲエレメントならびにＣｅｎｄＲエレメントを含むタンパク質およびペプチドを開示する。ＣｅｎｄＲエレメントを含むタンパク質またはペプチドに共有結合したか非共有的に会合したカーゴ組成物を含むＣｅｎｄＲ結合体も開示する。アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含む、選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合したか非共有的に会合したカーゴ組成物を含むＣｅｎｄＲ結合体も開示する。カーゴ組成物を、ＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合することができる。
活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントならびに活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを含むタンパク質およびペプチドも開示する。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを含むタンパク質またはペプチドに共有結合したか非共有的に会合したカーゴ組成物を含む活性化可能なＣｅｎｄＲ結合体も開示する。アミノ酸配列が活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを含む、選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合したか非共有的に会合したカーゴ組成物を含む活性化可能なＣｅｎｄＲ結合体も開示する。カーゴ組成物を、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合することができる。
カーゴ組成物をＣｅｎｄＲエレメントを含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、カーゴ組成物はＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合する工程、を含む方法によって作製されたＣｅｎｄＲ結合体も開示する。カーゴ組成物を選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、アミノ酸配列がＣ末端エレメントを含み、カーゴ組成物はＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合する工程、を含む方法によって作製されたＣｅｎｄＲ結合体も開示する。（ａ）細胞への内在化および／または組織透過のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、アミノ酸配列がＣ末端エレメントを含む工程および（ｂ）カーゴ組成物を選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、カーゴ組成物はＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合する工程、を含む方法によって作製されたＣｅｎｄＲ結合体も開示する。ＣｅｎｄＲ結合体はタンパク質またはペプチドおよび結合または会合したカーゴ組成物を含むことができる。
ブロッキング基をＣｅｎｄＲエレメントに共有結合させる工程であって、ブロッキング基とＣｅｎｄＲエレメントとを結合する結合が切断可能である工程を含む方法によって作製された活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントも開示する。ブロッキング基をアミノ酸配列に共有結合させる工程であって、アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含み、ブロッキング基とＣｅｎｄＲエレメントとを結合する結合が切断可能である工程を含む方法によって作製された活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントも開示する。（ａ）細胞への内在化および／または組織透過のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含む工程、および（ｂ）ブロッキング基をＣｅｎｄＲエレメントに共有結合させる工程であって、ブロッキング基とＣｅｎｄＲエレメントとを結合する結合が切断可能である工程を含む方法によって作製された活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントも開示する。ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したブロッキング基は、細胞への内在化および／または組織透過を軽減または防止する。ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したブロッキング基は、ブロッキング基を持たない同一のＣｅｎｄＲエレメントと比較して細胞への内在化および／または組織透過を軽減または防止することができる。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントは、選択されたアミノ酸配列およびブロッキング基を含むことができる。
タンパク質またはペプチドを、ＣｅｎｄＲエレメントがタンパク質またはペプチド中に存在する場合には細胞に内在化し、そして／または組織を透過することができるが、ＣｅｎｄＲエレメントがタンパク質またはペプチド中に存在しない場合にはできない。タンパク質またはペプチドを、選択されたアミノ酸配列がタンパク質またはペプチド中に存在する場合には細胞に内在化し、そして／または組織を透過することができるが、選択されたアミノ酸がタンパク質またはペプチド中に存在しない場合にはできない。ＣｅｎｄＲエレメントを、カーゴ組成物に会合させずに細胞に内在化し、そして／または組織を透過することができる。選択されたアミノ酸配列を、カーゴ組成物に会合させずに細胞に内在化し、そして／または組織を透過することができる。ＣｅｎｄＲエレメントはタンパク質またはペプチド中の唯一の機能的内在化エレメントであり得るか、ＣｅｎｄＲエレメントはタンパク質またはペプチド中の唯一の機能的組織透過エレメントであり得るか、その両方である。選択されたアミノ酸配列はタンパク質またはペプチド中の唯一の機能的内在化エレメントであり得るか、選択されたアミノ酸配列はタンパク質またはペプチド中の唯一の機能的組織透過エレメントであり得るか、その両方である。ＣｅｎｄＲエレメントはＣｅｎｄＲ結合体中の唯一の機能的内在化エレメントであり得るか、ＣｅｎｄＲエレメントはＣｅｎｄＲ結合体中の唯一の機能的組織透過エレメントであり得るか、その両方である。選択されたアミノ酸配列はＣｅｎｄＲ結合体中の唯一の機能的内在化エレメントであり得るか、選択されたアミノ酸配列はＣｅｎｄＲ結合体中の唯一の機能的組織透過エレメントであり得るか、その両方である。
ＣｅｎｄＲエレメントは活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントであり得る。ＣｅｎｄＲエレメントはプロテアーゼ活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントであり得る。タンパク質またはペプチドは環状であり得るか、ループを含むことができる。ＣｅｎｄＲエレメントは、タンパク質またはペプチドのＣ末端に存在し得る。ＣｅｎｄＲエレメントは末端カルボキシル基を含むことができる。ブロッキング基を末端カルボキシル基に結合することができる。ブロッキング基と末端カルボキシル基を結合する結合を、目的の細胞付近に存在するプロテアーゼによって切断可能であるように選択することができる。ブロッキング基をＣｅｎｄＲエレメントのＣ末端アミノ酸に結合することができる。ブロッキング基をＣｅｎｄＲエレメントのＣ末端アミノ酸以外のＣｅｎｄＲエレメントのアミノ酸に結合することができる。
カーゴ組成物を選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させることができ、ここで、アミノ酸配列はＣｅｎｄＲエレメントを含むことができる。カーゴ組成物を、ＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合することができる。カーゴ組成物は、例えば、治療もしくは診断に適用されるナノ粒子、分子、または分子の複合体であり得る。ＣｅｎｄＲエレメントをターゲティングすることができる治療カーゴ組成物には、ナノ粒子、分子、分子の複合体、抗血管新生薬、血管新生促進薬、癌化学療法薬、細胞毒性薬、前細胞生存薬、細胞分裂薬、神経保護薬、免疫調節薬、抗炎症薬、抗関節炎薬、抗ウイルス薬、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ＣｅｎｄＲエレメントをターゲティングすることができる診断カーゴ組成物には、ナノ粒子、分子、分子の複合体、ＭＲＩ造影剤、放射性造影剤、光学的造影剤、分子タグ（ビオチンなど）、フルオロフォア、エピトープタグ（例えば、特定の分子アッセイを使用して検出することができる）、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
カーゴ組成物をＣｅｎｄＲエレメントを含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、カーゴ組成物はＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合する工程、を含むＣｅｎｄＲ結合体を形成する方法も開示する。カーゴ組成物を選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含み、カーゴ組成物はＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合する工程を含む、ＣｅｎｄＲ結合体を形成する方法も開示する。（ａ）細胞への内在化および／または組織透過のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含む工程、および（ｂ）カーゴ組成物を選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、カーゴ組成物はＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合する工程を含む、ＣｅｎｄＲ結合体を形成する方法も開示する。ＣｅｎｄＲ結合体はタンパク質またはペプチドおよび結合または会合したカーゴ組成物を含むことができる。
ＣｅｎｄＲ結合体に細胞を曝露する工程であって、ＣｅｎｄＲエレメントがＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したか非共有的に会合したカーゴ組成物を含み、次いで、ＣｅｎｄＲ結合体が細胞に侵入し、それによりカーゴ組成物を細胞に送達させることができる工程を含む、カーゴ組成物を細胞に送達させる方法も開示する。ＣｅｎｄＲ結合体に細胞を曝露する工程であって、ＣｅｎｄＲエレメントがＣｅｎｄＲエレメントを含むタンパク質またはペプチドに共有結合したか非共有的に会合したカーゴ組成物を含み、次いで、ＣｅｎｄＲ結合体が細胞に侵入し、それによりカーゴ組成物を細胞に送達させることができる工程を含む、カーゴ組成物を細胞に送達させる方法も開示する。（ａ）ＣｅｎｄＲエレメントをカーゴ組成物に結合させ、それにより、ＣｅｎｄＲ結合体を形成する工程、および（ｂ）細胞をＣｅｎｄＲ結合体に曝露する工程であって、次いで、ＣｅｎｄＲ結合体が細胞に侵入し、それによりカーゴ組成物を細胞に送達させることができる工程、を含む、カーゴ組成物を細胞に送達させる方法も開示する。
（ａ）細胞をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、および（ｂ）ＣｅｎｄＲエレメントが内在化されたかどうかを決定する工程、を含む、ＣｅｎｄＲエレメントを内在化することができる細胞を同定する方法も開示する。（ａ）癌細胞をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、および（ｂ）ＣｅｎｄＲエレメントが癌細胞によって内在化されたかどうかを決定する工程であって、内在化されたＣｅｎｄＲエレメントによって癌細胞がＣｅｎｄＲベースの療法の候補であると同定される工程を含む、ＣｅｎｄＲベースの療法の候補としての癌細胞を同定する方法も開示する。細胞はアッセイ中に存在し得る。ＣｅｎｄＲエレメントをタンパク質またはペプチドに結合することができる。ＣｅｎｄＲエレメントは活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントであり得る。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを、細胞への曝露前に活性化することができる。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントは、プロテアーゼ活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントであり得る。タンパク質またはペプチドは環状であり得る。ＣｅｎｄＲエレメントは、タンパク質またはペプチドのＣ末端に存在し得る。
（ａ）組織をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、および（ｂ）ＣｅｎｄＲエレメントが組織を透過したかどうかを決定する工程を含む、ＣｅｎｄＲエレメントによって透過され得る組織を同定する方法も開示する。（ａ）腫瘍由来の細胞をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、および（ｂ）ＣｅｎｄＲエレメントが細胞によって内在化されたかどうかを決定する工程であって、内在化されたＣｅｎｄＲエレメントによって腫瘍がＣｅｎｄＲベースの療法の候補であると同定される工程、を含む、ＣｅｎｄＲベースの療法の候補として腫瘍を同定する方法も開示する。（ａ）腫瘍をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、および（ｂ）ＣｅｎｄＲエレメントが腫瘍を透過したかどうかを決定する工程であって、透過したＣｅｎｄＲエレメントによって腫瘍がＣｅｎｄＲベースの療法の候補であると同定される工程、を含むＣｅｎｄＲベースの療法の候補として腫瘍を同定する方法も開示する。腫瘍はアッセイ中に存在し得る。ＣｅｎｄＲエレメントをタンパク質またはペプチドに結合することができる。ＣｅｎｄＲエレメントは活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントであり得る。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを、腫瘍への曝露前に活性化することができる。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントは、プロテアーゼ活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントであり得る。タンパク質またはペプチドは環状であり得る。ＣｅｎｄＲエレメントは、タンパク質またはペプチドのＣ末端に存在し得る。
切断可能な結合を介してブロッキング基がＣｅｎｄＲエレメントに結合している活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成する工程であって、切断可能な結合が目的の細胞付近に存在する酵素によって切断可能である工程を含む、目的の細胞付近に活性化することができる活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを産生する方法も開示する。細胞は被験体中に存在し得る。目的の細胞付近に存在する酵素を同定することができる。目的の細胞付近に存在する酵素を、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成させる前に同定することができる。切断可能な結合を、目的の細胞付近に存在する酵素に基づいて選択することができる。切断可能な結合を、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成させる前に選択することができる。ＣｅｎｄＲエレメントは末端カルボキシル基を含むことができ、ここではブロッキング基を末端カルボキシル基に結合させる。
ブロッキング基をＣｅｎｄＲエレメントに共有結合させる工程であって、ブロッキング基とＣｅｎｄＲエレメントとを結合する結合が切断可能である工程を含む、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成する方法も開示する。ブロッキング基をアミノ酸配列に共有結合させる工程であって、アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含み、ブロッキング基とＣｅｎｄＲエレメントとを結合する結合が切断可能である工程、を含む活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成する方法も開示する。（ａ）細胞への内在化および／または組織透過のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含む工程、および（ｂ）ブロッキング基をＣｅｎｄＲエレメントに共有結合させる工程であって、ブロッキング基とＣｅｎｄＲエレメントとを結合する結合が切断可能である工程、を含む、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成する方法も開示する。ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したブロッキング基は、細胞への内在化および／または組織透過を軽減または防止する。ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したブロッキング基は、ブロッキング基を持たない同一のＣｅｎｄＲエレメントと比較して細胞への内在化および／または組織透過を軽減または防止することができる。活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントは、選択されたアミノ酸配列およびブロッキング基を含むことができる。細胞は被験体中に存在し得る。目的の細胞付近に存在する酵素を同定することができる。目的の細胞付近に存在する酵素を、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成させる前に同定することができる。切断可能な結合を、目的の細胞付近に存在する酵素に基づいて選択することができる。切断可能な結合を、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成させる前に選択することができる。ＣｅｎｄＲエレメントは末端カルボキシル基を含むことができ、ここではブロッキング基を末端カルボキシル基に結合させる。カーゴ組成物を、選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させることができる。カーゴ組成物を、ＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合することができる。
ＣｅｎｄＲエレメントは、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００、または２０００までの残基長であり得る。特定の実施形態では、ＣｅｎｄＲエレメントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または２００残基長であり得る。さらなる実施形態では、ＣｅｎｄＲエレメントは、２〜２００残基長、２〜１００残基長、２〜９０残基長、２〜８０残基長、２〜７０残基長、２〜６０残基長、２〜５０残基長、２〜４０残基長、２〜３０残基長、２〜２０残基長、２〜１５残基長、２〜１０残基長、３〜２００残基長、３〜１００残基長、３〜９０残基長、３〜８０残基長、３〜７０残基長、３〜６０残基長、３〜５０残基長、３〜４０残基長、３〜３０残基長、３〜２０残基長、３〜１５残基長、３〜１０残基長、４〜２００残基長、４〜１００残基長、４〜９０残基長、４〜８０残基長、４〜７０残基長、４〜６０残基長、４〜５０残基長、４〜４０残基長、４〜３０残基長、４〜２０残基長、４〜１５残基長、４〜１０残基長、５〜２００残基長、５〜１００残基長、５〜９０残基長、５〜８０残基長、５〜７０残基長、５〜６０残基長、５〜５０残基長、５〜４０残基長、５〜３０残基長、５〜２０残基長、５〜１５残基長、５〜１０残基長、１０〜２００残基長、１０〜１００残基長、１０〜９０残基長、１０〜８０残基長、１０〜７０残基長、１０〜６０残基長、１０〜５０残基長、１０〜４０残基長、１０〜３０残基長、１０〜２０残基長、２０〜２００残基長、２０〜１００残基長、２０〜９０残基長、２０〜８０残基長、２０〜７０残基長、２０〜６０残基長、２０〜５０残基長、２０〜４０残基長、または２０〜３０残基長であり得る。本明細書中で使用する場合、用語「残基」は、アミノ酸またはアミノ酸アナログをいう。
ＣｅｎｄＲ結合体のタンパク質またはペプチド部分は、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００、または２０００までの残基長であり得る。特定の実施形態では、ＣｅｎｄＲ結合体のタンパク質またはペプチド部分は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または２００残基長であり得る。さらなる実施形態では、ＣｅｎｄＲ結合体のタンパク質またはペプチド部分は、２〜２００残基長、２〜１００残基長、２〜９０残基長、２〜８０残基長、２〜７０残基長、２〜６０残基長、２〜５０残基長、２〜４０残基長、２〜３０残基長、２〜２０残基長、２〜１５残基長、２〜１０残基長、３〜２００残基長、３〜１００残基長、３〜９０残基長、３〜８０残基長、３〜７０残基長、３〜６０残基長、３〜５０残基長、３〜４０残基長、３〜３０残基長、３〜２０残基長、３〜１５残基長、３〜１０残基長、４〜２００残基長、４〜１００残基長、４〜９０残基長、４〜８０残基長、４〜７０残基長、４〜６０残基長、４〜５０残基長、４〜４０残基長、４〜３０残基長、４〜２０残基長、４〜１５残基長、４〜１０残基長、５〜２００残基長、５〜１００残基長、５〜９０残基長、５〜８０残基長、５〜７０残基長、５〜６０残基長、５〜５０残基長、５〜４０残基長、５〜３０残基長、５〜２０残基長、５〜１５残基長、５〜１０残基長、１０〜２００残基長、１０〜１００残基長、１０〜９０残基長、１０〜８０残基長、１０〜７０残基長、１０〜６０残基長、１０〜５０残基長、１０〜４０残基長、１０〜３０残基長、１０〜２０残基長、２０〜２００残基長、２０〜１００残基長、２０〜９０残基長、２０〜８０残基長、２０〜７０残基長、２０〜６０残基長、２０〜５０残基長、２０〜４０残基長、または２０〜３０残基長であり得る。
ＣｅｎｄＲ結合体は、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００、または２０００までの残基長であり得る。特定の実施形態では、ＣｅｎｄＲ結合体は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または２００残基長であり得る。さらなる実施形態では、ＣｅｎｄＲ結合体は、５〜２００残基長、５〜１００残基長、５〜９０残基長、５〜８０残基長、５〜７０残基長、５〜６０残基長、５〜５０残基長、５〜４０残基長、５〜３０残基長、５〜２０残基長、５〜１５残基長、５〜１０残基長、１０〜２００残基長、１０〜１００残基長、１０〜９０残基長、１０〜８０残基長、１０〜７０残基長、１０〜６０残基長、１０〜５０残基長、１０〜４０残基長、１０〜３０残基長、１０〜２０残基長、２０〜２００残基長、２０〜１００残基長、２０〜９０残基長、２０〜８０残基長、２０〜７０残基長、２０〜６０残基長、２０〜５０残基長、２０〜４０残基長、または２０〜３０残基長であり得る。
開示のＣｅｎｄＲ結合体に組み込むことができる多数のアミノ酸およびペプチドアナログが存在すると理解される。例えば、使用することができる多数のＤ型アミノ酸またはアミノ酸が存在する。天然に存在するペプチドの逆の立体異性体が開示されており、ペプチドアナログの立体異性体も開示されている。ｔＲＮＡ分子への最適なアミノ酸の負荷および、例えば、部位特異的方法においてアンバーコドンを使用してペプチド鎖にアナログアミノ酸を挿入する遺伝子構築物の操作によってこれらのアミノ酸をポリペプチド鎖に容易に組み込むことができる（Ｔｈｏｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．７７：４３−７３（１９９１），Ｚｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：３４８−３５４（１９９２）；Ｉｂｂａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｒｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １３：１９７−２１６（１９９５），Ｃａｈｉｌｌら、ＴＩＢＳ，１４（１０）：４００−４０３（１９８９）；Ｂｅｎｎｅｒ，ＴＩＢ Ｔｅｃｈ，１２：１５８−１６３（１９９４）；Ｉｂｂａ ａｎｄ Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：６７８−６８２（１９９４）（少なくともアミノ酸アナログに関連する材料についてその全てが本明細書中で参考として援用される）。
ペプチドに類似しているが、天然のペプチド結合によって連結していない分子を産生することができる。例えば、アミノ酸またはアミノ酸アナログの結合には、ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨＨ２ＳＯ−が含まれ得る（これらおよびその他は以下で見出すことができる：Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ １９８３），Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ ３，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（一般的概説）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（１９８０）ｐｐ．４６３−４６８；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ １４：１７７−１８５（１９７９）（−−ＣＨ２ＮＨ−−，ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−−ＣＨ Ｈ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ ３０７−３１４（１９８２）（−−ＣＨ−−ＣＨ−−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２３：２５３３（１９８２）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｓｚｅｌｋｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｎ，ＥＰ ４５６６５ ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ ２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；およびＨｒｕｂｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１：１８９−１９９（１９８２）（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）（それぞれ、本明細書中で参考として援用される）。特に好ましい非ペプチド結合は−−ＣＨ２ＮＨ−−である。ペプチドアナログが結合原子の間に１つを超える原子を有することができる（ｂ−アラニンおよびｇ−アミノ酪酸など）と理解される。
アミノ酸アナログおよびペプチドアナログは、しばしば、増強されたか望ましい性質（より経済的な産生、より高い化学安定性、増強された薬理学的性質（半減期、吸収、力価、効力など）、変化した特異性（例えば、広域の生物活性）、減少した抗原性、および他の性質など）を有する。
Ｄ型アミノ酸を使用してより安定したペプチドを生成することができる。これは、Ｄ型アミノ酸がペプチダーゼなどによって認識されないからである。コンセンサス配列の１つまたは複数のアミノ酸の同型のＤ型アミノ酸との体系的置換（例えば、Ｌ型リジンの代わりのＤ型リジン）を使用して、より安定なペプチドを生成することができる。システイン残基を使用して、２個以上のペプチドを共に環状化するか付着させることができる。これは、特定の高次構造へのペプチドの拘束に有利であり得る（Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）（本明細書中で参考として援用される））。
ＣｅｎｄＲエレメントに加えて、例えば、個別の機能を有する第２のペプチドに融合したホーミングペプチドを含む多機能性ＣｅｎｄＲ結合体を開示する。かかる多機能性結合体は、全長分子の異なる部分によって付与された少なくとも２つの機能を有し、例えば、選択的ホーミング活性に加えて血管新生抑制活性またはアポトーシス促進活性を示すことができる。
本明細書中で使用する場合、用語「ペプチド」を、ペプチド、タンパク質、およびタンパク質のフラグメントなどを意味するために広く使用する。本明細書中で使用する場合、用語「ペプチド模倣物」は、構造に基づいたペプチド活性を有するペプチド様分子を意味する。かかるペプチド模倣物には、化学修飾されたペプチド、天然に存在しないアミノ酸を含むペプチド様分子、およびペプトイドが含まれ、ペプチド模倣物が由来する活性などの活性を有する。（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｒｏ，Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，ｉｎ “Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ” Ｖｏｌ．１（ｅｄ．Ｍ．Ｅ．Ｗｏｌｆｆ；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９５），ｐａｇｅｓ ８０３−８６１を参照のこと）。
本明細書中で使用する場合、用語「カーゴ組成物」は、ＣｅｎｄＲエレメントと併せて使用することができる物質の任意の組成物をいう。例えば、カーゴ組成物は、分子、結合体、分子の会合物、組成物、混合物であり得る。当業者は、どのようなカーゴがＣｅｎｄＲ結合体に結合するのかを決定することができる。本明細書中に開示のＣｅｎｄＲ結合体は、カーゴ組成物に結合または会合したＣｅｎｄＲエレメントを含むことができる。カーゴ組成物の例には、抗血管新生薬、血管新生促進薬、癌化学療法薬、細胞毒性薬、抗炎症薬、抗関節炎薬、ポリペプチド、核酸分子、小分子、ナノ粒子、微粒子、フルオロフォア、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、インジウム−１１１、テクネチウム−９９、炭素−１１、炭素−１３、またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ＣｅｎｄＲ結合体中のＣｅｎｄＲエレメントに会合したこれらのカーゴ組成物は部分であり得る。本明細書中で使用する場合、用語「部分」を、一般に結合したカーゴ組成物に生物学的に有用な機能を付与する物理的、化学的、または生物学的な材料を意味するために広範に使用する。部分は、任意の天然物質または非天然物質（生体物質（細胞、ファージ、または他のウイルスなど）；有機化学物質（小分子など）；ナノ粒子、放射性核種；核酸分子またはオリゴヌクレオチド；ポリペプチド；またはペプチドが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。例えば、標的に影響を及ぼす部分（治療効果を有する部分など）、標的の検出、視覚化、または画像化を容易にする部分（蛍光分子または放射性核種など）。
開示のＣｅｎｄＲ結合体の成分を、任意の適切な様式で組み合わせ、連結し、そして／または結合することができる。例えば、部分およびホーミング分子を、リンカー部分を使用するか使用しないで直接または間接的に共有結合的または非共有的に会合することができる。
いくつかの実施形態では、ＣｅｎｄＲ結合体は癌化学療法薬を含むことができる。例えば、ＣｅｎｄＲ結合体のカーゴ組成物は癌化学療法薬であり得る。本明細書中で使用する場合、「癌化学療法薬」は、癌細胞の増殖、成長、寿命、または転移を阻害する化学剤である。かかる癌化学療法薬は、タキサン（ドセタキセルなど）；アントラサイクリン（ドキソルビシンなど）；アルキル化剤；ビンカアルカロイド；代謝拮抗物質；白金剤（シスプラチンまたはカルボプラチンなど）；ステロイド（メトトレキサートなど）；抗生物質（アドリアマイシンなど）；イソファミド；または選択的エストロゲン受容体調節因子；抗体（トラスツズマブなど）であり得るが、これらに限定されない。
ＣｅｎｄＲ結合体は、治療薬を含むことができる。例えば、ＣｅｎｄＲ結合体のカーゴ組成物は治療薬であり得る。有用な治療薬は、例えば、本明細書中で使用する場合、細胞死を直接または間接的に促進する任意の分子であり得る細胞毒性薬であり得る。有用な細胞毒性薬には、小分子、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸分子、細胞、およびウイルスが含まれるが、これらに限定されない。非限定的な例として、有用な細胞毒性薬には、細胞傷害性小分子（ドキソルビシン、ドセタキセル、またはトラスツズマブなど）；抗菌ペプチド（以下にさらに記載のものなど）；アポトーシス促進性ポリペプチド（カスパーゼおよび毒素（例えば、カスパーゼ−８）など）；ジフテリア毒素Ａ鎖、シュードモナス外毒素Ａ、コレラ毒素、リガンド融合毒素（ＤＡＢ３８９ＥＧＦなど）、ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ毒素（リシン））；および細胞傷害性細胞（細胞傷害性Ｔ細胞など）が含まれる。例えば、Ｍａｒｔｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：３２１８−３２２４（２０００）；Ｋｒｅｉｔｍａｎ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ，Ｂｌｏｏｄ ９０：２５２−２５９（１９９７）；Ａｌｌａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：２６１５−２６１８（１９９７）；およびＯｓｂｏｒｎｅ ａｎｄ Ｃｏｒｏｎａｄｏ−Ｈｅｉｎｓｏｈｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．２：１７５（１９９６）を参照のこと。当業者は、本明細書中に記載されているか当該分野で公知のこれらおよびさらなる細胞毒性薬が開示の結合体および方法で有用であり得ると理解している。
いくつかの形態では、治療薬は治療ポリペプチドであり得る。本明細書中で使用する場合、治療ポリペプチドは、生物学的に有用な機能を有する任意のポリペプチドであり得る。有用な治療ポリペプチドには、サイトカイン、抗体、細胞傷害性ポリペプチド；アポトーシス促進性ポリペプチド；および血管新生抑制ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。非限定的な例として、有用な治療ポリペプチドは、サイトカイン（腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）；インターフェロン．γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、リンホタクチン（ＬＴＮ）、または樹状細胞ケモカイン１（ＤＣ−ＣＫ１）など）；抗ＨＥＲ２抗体またはそのフラグメント；細胞傷害性ポリペプチド（毒素またはカスパーゼ（例えば、ジフテリア毒素Ａ鎖、シュードモナス外毒素Ａ、コレラ毒素、リガンド融合毒素（ＤＡＢ３８９ＥＧＦなど）、またはリシン）が含まれる）；血管新生抑制ポリペプチド（アンギオスタチン、エンドスタチン、トロンボスポンジン、血小板因子４など）；アナステリン；または本明細書中にさらに記載されているか当該分野で公知の治療ポリペプチドの１つであり得る。生物学的活性を有するこれらおよび他のポリペプチドが「治療ポリペプチド」であり得ると理解される。
開示のＣｅｎｄＲ結合体で有用な治療薬は抗血管新生薬であり得る。本明細書中で使用する場合、用語「抗血管新生薬」は、血管の成長および発達である血管形成を軽減または防止する分子を意味する。結合体を使用して、血管形成に関連する任意の疾患、容態、または障害を治療または診断することができる。例えば、黄斑変性および糖尿病性血管合併症を診断および／または治療することができる。常法によって種々の抗血管新生薬を調製することができる。かかる抗血管新生薬には、小分子；タンパク質（ドミナントネガティブ型血管新生因子、転写因子、および抗体など）；ペプチド；および核酸分子（リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および、例えば、ドミナントネガティブ型血管新生因子および受容体、転写因子、ならびに抗体およびその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｈａｇｅｄｏｒｎ ａｎｄ Ｂｉｋｆａｌｖｉ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３４：８９−１１０（２０００）およびＫｉｒｓｃｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．５０：１４９−１６３（２０００）を参照のこと。
有用な治療薬のいくつかの他の例には、以下が含まれる：ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｏｒｕｅａ）、エチレンイミン、アルカンスルホン酸塩、テトラジン、白金化合物、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、代謝拮抗物質、葉酸アナログ、アントラサイクリン、タキサン、ビンカアルカロイド、トポイソメラーゼインヒビター、およびホルモン剤。例示的な化学療法薬は、以下である：アクチノマイシン−Ｄ、アルケラン、Ａｒａ−Ｃ、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ＢｉＣＮＵ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルボプラチナム、カルムスチン、ＣＣＮＵ、クロラムブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、シスプラチン、クラドリビン、ＣＰＴ−１１、シクロホスファミド、シタラビン、シトシンアラビノシド、サイトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エストラムスチン、エチレンイミン、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、ホテムスチン、ゲムシタビン、ハーセプチン、ヘキサメチルアミン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ノベムビエヒン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、フェネステリン、プリカマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン、リツキシマブ、ステロイド、ストレプトゾシン、ＳＴＩ−５７１、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テトラジン、チオグアニン、チオテパ、トムデックス、トポテカン、トレオスルファン、トリメトレキサート、トロホスファミド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ＶＰ−１６、およびゼローダ。アルキル化剤（チオテパなど）および；スルホン酸アルキル（ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなど）；アジリジン（ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなど）；エチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）、およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）が含まれる）；ニトロ尿素（カンヌスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなど）；抗生物質（アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン（Ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン、クロモイニシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダムビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ぺプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシンなど）；代謝拮抗物質（メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など）；葉酸アナログ（デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、およびトリメトレキサートなど）；プリンアナログ（フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニンなど）；ピリミジンアナログ（アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、および５−ＦＵなど）；アンドロゲン（カルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、ルネピチオスタン、およびテストラクトンなど）；抗副腎薬（アミノグルテチミド、ミトタン、およびトリロスタンなど）；葉酸補充薬（フロリン酸など）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルニチン；エリプチニウムアセタート；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ．ＲＴＭ．；ラゾキサン；シゾフラン（Ｓｉｚｏｆｒｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド（例えば、パクリタキセル（タキソール（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）およびドキセタキセル（タキソテール（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ））；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ（シスプラチンおよびカルボプラチンなど）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；および上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸、または誘導体。腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤（抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、オナプリストン、およびトレミフェン（フェアストン）が含まれる）；および抗アンドロゲン（フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなど）など）；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸、または誘導体も含まれる。
ＣｅｎｄＲ結合体は、検出可能因子も含むことができる。かかる検出可能因子はＣｅｎｄＲ結合体のカーゴ組成物であり得るか、ＣｅｎｄＲ結合体のカーゴ組成物の一部を含むことができるか、分子または部分由来のＣｅｎｄＲ結合体の個別の成分であり得る。種々の検出可能因子は開示の方法で有用である。本明細書中で使用する場合、用語「検出可能因子」は、検出することができる任意の分子をいう。有用な検出可能因子は、ｉｎ ｖｉｖｏで投与し、その後に検出することができる部分を含む。開示の結合体および画像化方法で有用な検出可能因子には、放射性標識および蛍光分子が含まれるが、これらに限定されない。検出可能因子は、例えば、好ましくは非侵襲性および／またはｉｎ ｖｉｖｏでの視覚化技術による直接または間接的な検出を容易にする任意の部分であり得る。例えば、検出可能因子は、任意の公知の画像化技術（例えば、放射線技術が含まれる）によって検出可能であり得る。検出可能因子には、例えば、造影剤（例えば、造影剤がイオン性または非イオン性である場合）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、例えば、検出可能因子は、タンタル化合物および／またはバリウム化合物（例えば、硫酸バリウム）を含む。いくつかの実施形態では、検出可能因子はヨウ素（放射性ヨウ素など）を含む。いくつかの実施形態では、例えば、検出可能因子は、有機ヨウ素酸（ｏｒｇａｎｉｃ ｉｏｄｏ ａｃｉｄ）（ヨードカルボン酸（ｉｏｄｏ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）など）、トリヨードフェノール、ヨードホルム、および／またはテトラヨードエチレンを含む。いくつかの実施形態では、検出可能因子は、非放射性検出可能因子（例えば、非放射性同位体）を含む。例えば、Ｇｄを、一定の実施形態で非放射性検可能出因子として使用することができる。検出可能因子には、放射性同位体、酵素、フルオロフォア、および量子ドット（Ｑｄｏｔ（登録商標））も含まれ得る。例えば、検出部分は、酵素、ビオチン、金属、またはエピトープタグであり得る。他の公知または新規に発見された検出可能マーカーは、提供した結合体との使用を意図する。
開示のＣｅｎｄＲ結合体を、薬学的に許容可能なキャリア中にてｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。「薬学的に許容可能な」は、生物学的またはその他の点で望ましくないわけではない物質を意味する（すなわち、この物質は、いかなる望ましくない生物学的影響や、この物質が含まれる薬学的組成物のいかなる他の成分との有害な様式での相互作用もなく核酸またはベクターと共に被験体に投与することができる）。当業者に周知のように、勿論、有効成分の任意の分解を最小にし、被験体中の任意の有害な副作用を最小にするようにキャリアが選択されるであろう。物質は、（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれた）溶液、懸濁液中に存在し得る。
ＣｅｎｄＲ結合体を、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて治療的に使用することができる。適切なキャリアおよびその処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に記載されている。典型的には、適量の薬学的に許容可能な塩を処方物中で使用して、処方物を等張にする。薬学的に許容可能なキャリアの例には、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは約ｐＨ５〜約ｐＨ８、より好ましくは約ｐＨ７〜約ｐＨ７．５である。さらなるキャリアには、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性調製物が含まれる。このマトリックスは成形品の形態（例えば、フィルム、リポソーム、または微粒子）である。一定のキャリアが、より好ましくは、例えば、投与経路および組成物の投与濃度に依存し得ることが当業者に明らかであろう。
薬学的調製物は、有効成分として、標的タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つのエピトープを含む組成物を含むことができる。この少なくとも１つのエピトープは、血球凝集素のステム領域に結合することができるように抗体を誘発することができる。あるいは、薬学的組成物は、有効成分として、血球凝集素のステム領域の少なくとも１つのエピトープに結合するための抗体の少なくとも１つの免疫学的部分を含む組成物を含むことができる。
調製物を、被験体または生物にそれ自体投与することができるか、適切なキャリアまたは賦形剤と混合した薬学的組成物中に含めることができる。
本明細書中で使用する場合、「薬学的組成物」は、生理学的に適切なキャリアおよび賦形剤などの他の化学成分を有する本明細書中に記載の１つまたは複数の有効成分の調製物をいう。薬学的組成物の目的は、被験体または生物への化合物の投与を容易にすることである。
本明細書中の用語「有効成分」は、生物学的効果を担う調製物をいう。
本明細書中で使用する場合、交換可能に使用することができる句「生理学的に許容可能なキャリア」および「薬学的に許容可能なキャリア」は、被験体または生物に有意に刺激を与えず、投与した化合物の生物学的な活性および性質を抑制しないキャリアまたは希釈剤をいう。これらの句にはアジュバントが含まれる。
本明細書中の用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために薬学的組成物に添加する不活性物質をいう。賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、およびポリエチレングリコールの型が含まれるが、これらに限定されない。
薬物の処方および投与技術を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，最新版（本明細書中で参考として援用される）に見出すことができる。
適切な投与経路には、例えば、経口、直腸、経粘膜（特に、経鼻）、腸、または非経口送達（筋肉内、皮下、および髄内への注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内への注射が含まれる）が含まれ得る。あるいは、調製物を全身よりもむしろ局所に投与することができる。
薬学的組成物を、当該分野で周知の過程によって（例えば、従来の混合、溶解、造粒、ドラジェ作製、水簸、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥過程による）製造することができる。
したがって、開示の方法で用いる薬学的組成物を、有効成分の調製物への加工を容易にし、且つ薬学的に使用することができる賦形剤および助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容可能なキャリアを使用した従来の様式で処方することができる。適切な処方物は、選択した投与経路に依存する。
注射のために、有効成分を、水溶液中、好ましくは、生理学的に適合する緩衝液（ハンクス液、リンゲル液、または生理的塩類緩衝液など）中に処方することができる。経粘膜投与のために、透過すべき障壁に適切な浸透剤を処方物中で使用する。かかる浸透剤は、一般に当該分野で公知である。
経口投与のために、活性化合物を当該分野で周知の薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせることによって化合物を容易に処方することができる。かかるキャリアにより、化合物を患者が経口摂取するための錠剤、丸薬、ドラジェ、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、および懸濁液などに処方することができる。経口用の薬理学的調製物を、固体賦形剤を使用し、任意選択的に得られた混合物を粉砕し、必要に応じて適切な助剤を添加した後に顆粒混合物を加工して錠剤またはドラジェコアを得ることによって作製することができる。適切な賦形剤は、特に、充填剤（糖（ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールが含まれる）；セルロース調製物（例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど）；および／または生理学的に許容可能なポリマー（ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）など）など）である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を添加することができる。
適切なコーティングを有するドラジェコアを提供する。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を任意選択的に含むことができる濃縮糖溶液を使用することができる。活性化合物の用量の異なる組み合わせを識別または特徴づけるための染料または色素を錠剤またはドラジェコーティングに添加することができる。
経口で使用することができる薬学的組成物には、ゼラチンで作製された押し込み式カプセルならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）で作製された密封された軟カプセルが含まれる。押し込み式カプセルは、充填剤（ラクトースなど）、結合剤（デンプンなど）、潤滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および、任意選択的に安定剤との混合物中に有効成分を含むことができる。軟カプセルでは、有効成分を、適切な液体（脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなど）中に溶解または懸濁することができる。さらに、安定剤を添加することができる。経口投与用の全ての処方物は、選択された投与経路に適切な投薬量で存在すべきである。
口内投与のために、組成物は、従来の様式で処方された錠剤またはロゼンジの形態をとることができる。
鼻腔吸入による投与のために、開示の方法で用いる有効成分を、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、または二酸化炭素）を使用して圧縮パックまたは噴霧器からエアゾールスプレーの形態で都合よく送達させることができる。圧縮エアゾールの場合、投薬単位を、定量を送達させるバルブによって決定することができる。化合物と適切な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）との粉末混合物を含む（例えば、ディスペンサーで用いるゼラチンの）カプセルおよびカートリッジを処方することができる。
本明細書中に記載の調製物を、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために処方することができる。注射用処方物は、例えば、任意選択的に防腐剤を添加したアンプルまたは複数回用量の容器中に単位投薬形態で存在することができる。組成物は、油性または水性ビヒクルの懸濁液、溶液、または乳濁液であり得、処方剤（懸濁剤、安定剤、および／または分散剤など）を含むことができる。
非経口投与のための薬学的組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁液を、適切な油または水ベースの注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油（ゴマ油など）または合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチルなど）、トリグリセリド、またはリポソームが含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質（カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなど）を含むことができる。任意選択的に、懸濁液はまた、適切な安定剤または高濃度の溶液を調製するために有効成分の溶解性を増加させる薬剤を含むことができる。
あるいは、有効成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、滅菌した無発熱物質の水ベースの溶液）で構成するための粉末形態であり得る。
例えば、従来の座剤の基剤（カカオバターまたは他のグリセリドなど）を使用して、調製物を直腸組成物（座剤または停留浣腸など）中に処方することもできる。
開示の方法で用いる薬学的組成物には、意図する目的を達成するのに有効な量で有効成分を含む組成物が含まれる。より具体的には、治療有効量は、治療を受ける被験体の疾患を防止するか、緩和するか、症状を改善するか、延命するのに有効な有効成分の量を意味する。
治療有効量の決定は、特に本明細書中に提供した詳細な開示を考慮して、十分に当業者の能力の範囲内である。
開示の方法で使用される任意の調製物のために、治療有効量または治療有効用量を、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイから最初に評価することができる。例えば、動物モデルにおける所望の循環抗体濃度または力価を達成するための用量を処方することができる。かかる情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
本明細書中に記載の有効成分の毒性および治療効率を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイならびに動物研究から得たデータを、ヒトで用いる投薬量範囲の処方で使用することができる。投薬量は、使用される投薬形態および使用される投与経路に応じて変化することができる。正確な処方、投与経路、および投薬量を、患者の容態を考慮して各医師が選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１ ｐ．１．（１９７５）を参照のこと）。
ウイルスの侵入の防止または軽減に十分な抗体の血漿が得られるように（最小有効濃度、ＭＥＣ）、投薬量および投薬間隔を個別に調整することができる。ＭＥＣは各調製物で変化するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータから評価することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投薬量は、それぞれの特徴および投与経路に依存するであろう。結合アッセイを使用して、血漿濃度を決定することができる。
ＭＥＣ値を使用して投薬間隔を決定することもできる。１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、最も好ましくは５０〜９０％の時間でＭＥＣを超える血漿レベルを維持するレジメンを使用して調製物を投与すべきである。
治療すべき容態の重症度および応答性に応じて、数日から数週間まで持続するか、治癒するまでか、病状が軽減するまで一連の治療を使用して、投与は単回投与または複数回投与であり得る。
組成物の投与量は、勿論、治療を受ける被験体、苦痛の重症度、投与様式、担当医の判断などに依存するであろう。
開示の結合体に結合体化することができる脂肪酸（すなわち、脂質）は、リポソームへのペプチドの有効な組み込みが可能な脂肪酸が含まれる。一般に、脂肪酸は極性脂質である。したがって、脂肪酸はリン脂質であり得る。提供した結合体は、天然または合成のリン脂質のいずれかを含むことができる。リン脂質を、飽和または不飽和の一置換または二置換脂肪酸およびその組み合わせを含むリン脂質から選択することができる。これらのリン脂質は、例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルセリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジン酸、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルコリン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルセリン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミテライドイルオレオイルホスファチジン酸、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルコリン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルセリン、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｅｔｈａｎｏａｍｉｎｅ）、ミリストレオイルオレオイルホスファチジルグリセロール、ミリストレオイルオレオイルホスファチジン酸、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルセリン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジン酸、パルミチックリノレオイルホスファチジルコリン、パルミチックリノレオイルホスファチジルセリン、パルミチックリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミチックリノレオイルホスファチジルグリセロール、パルミチックリノレオイルホスファチジン酸であり得る。これらのリン脂質はまた、以下のモノアシル化誘導体であり得る：ホスファチジルコリン（リゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ））、ホスファチジルセリン（リゾホスファチジルセリン）、ホスファチジルエタノールアミン（リゾホスファチジルエタノールアミン）、ホスファチジルグリセロール（リゾホスファチジルグリセロール）、およびホスファチジン酸（リゾホスファチジン酸）。これらのリゾホスファチジル誘導体中のモノアシル鎖は、パルミトイル、オレオイル、パルミトレオイル、リノレオイル、ミリストイル、またはミリストレオイルであり得る。リン脂質は合成でもあり得る。合成リン脂質は、種々の供給者から容易に購入することができる（ＡＶＡＮＴＩ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．）；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）など）。これらの合成化合物は様々であり得、天然に存在するリン脂質中で見出されないその脂肪酸側鎖の異型を有し得る。脂肪酸は、ＰＳまたはＰＣのいずれかまたは両方にＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、またはＣ２０鎖長を有する不飽和脂肪酸側鎖を有することができる。合成リン脂質は、ジオレオイル（１８：１）−ＰＳ；パルミトイル（１６：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＳ、ジミリストイル（１４：０）−ＰＳ；ジパルミトレオイル（１６：１）−ＰＣ、ジパルミトイル（１６：０）−ＰＣ、ジオレオイル（１８：１）−ＰＣ、パルミトイル（１６：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＣ、およびミリストイル（１４：０）−オレオイル（１８：１）−ＰＣを構成要素として有することができる。したがって、例として、提供した結合体は、パルミトイル１６：０を含むことができる。
カーゴ組成物は、微粒子またはナノ粒子（ナノスフェア、ナノシェル、ナノワーム、および発熱ナノシェルなど）であり得る。本明細書中で使用する場合、「ナノシェル」は、１つまたは複数の導電性シェル層に囲まれた個別の誘電性または半導体のコアセクションを有するナノ粒子である。米国特許第６，５３０，９４４号は、金属ナノシェルの作製および使用方法のその教示についてその全体が本明細書中で参考として援用される。ナノシェルを、例えば、近赤外光（約８００〜１３００ｎｍ）などの照射を使用して励起することができる高伝導性金属などの物質でコーティングされた誘電性または不活性の物質（シリコンなど）のコアを使用して形成することができる。励起の際、ナノシェルは発熱する。得られた高熱は、周囲の細胞または組織を死滅させることができる。ナノシェルのシェルおよびコアの直径の合計は、数十ナノメートルから数百ナノメートルまでの範囲である。近赤外光は、組織を透過するその能力が有利である。ナノ粒子コーティングおよびターゲティングされた細胞の選択に応じて他の照射型も使用することができる。例には、Ｘ線、磁場、電場、および超音波が含まれる。粒子を使用して、特に、赤外拡散光子画像化法を使用して画像化を増強することもできる。ターゲティング分子は、抗体またはそのフラグメント、特定の受容体のリガンド、またはターゲティングすべき細胞の表面に特異的に結合する他のタンパク質であり得る。
カーゴ組成物を、例えば、開示のタンパク質、ペプチド、アミノ酸配列、またはＣｅｎｄＲエレメントに共有結合させるか非共有的に会合させることができる。カーゴ組成物を、例えば、開示のタンパク質、ペプチド、アミノ酸配列、またはＣｅｎｄＲエレメントのアミノ末端；開示のタンパク質、ペプチド、アミノ酸配列、またはＣｅｎｄＲエレメントの内部アミノ酸；開示のタンパク質、ペプチド、アミノ酸配列、またはＣｅｎｄＲエレメントのカルボキシ末端；またはＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質、ペプチド、アミノ酸配列；リンカーを介した開示のタンパク質、ペプチド、アミノ酸配列、またはＣｅｎｄＲエレメント；またはその組み合わせに連結することができる。開示のＣｅｎｄＲ結合体は、カーゴ組成物と開示のタンパク質、ペプチド、アミノ酸配列、またはＣｅｎｄＲエレメントとを連結するリンカーをさらに含むことができる。開示のタンパク質、ペプチド、アミノ酸配列、またはＣｅｎｄＲエレメントを、タンパク質、ペプチド、アミノ酸配列、またはＣｅｎｄＲエレメントでナノ粒子、ナノワーム、およびナノシェルなどをコーティングするために使用することができるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのコーティング分子に結合体化することもできる（Ｔｋａｃｈｅｎｋｏら、（２００３）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ、１２５、４７００−４７０１を参照のこと）。
カーゴ組成物を開示のペプチドに架橋するために使用することができるタンパク質架橋剤は当該分野で公知であり、有用性および構造に基づいて定義され、以下が含まれる：ＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベラート）、ＤＳＰ（ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート））、ＤＴＳＳＰ（３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオナート））、ＳＵＬＦＯ ＢＳＯＣＯＥＳ（ビス［２−（スルホスクシンイミド（スルホスクシンイミド）オキシカルボニルオキソ）エチル］スルホン）、ＢＳＯＣＯＥＳ（ビス［２−（スクシンイミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｄｏ）オキシカルボニルオキソ）エチル］スルホン）、ＳＵＬＦＯ ＤＳＴ（ジスルホスクシンイミジルタートラート）、ＤＳＴ（ジスクシンイミジルタートラート）、ＳＵＬＦＯ ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシナート））、ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシナート））、ＤＰＤＰＢ（１，２−ジ［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン）、ＢＳＳＳ（ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート）、ＳＵＬＦＯ ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート）、ＭＢＳ（３−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＵＬＦＯ ＭＢＳ（３−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート）、ＳＵＬＦＯ ＳＩＡＢ（Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート）、ＳＵＬＦＯ ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート）、ＮＨＳ ＬＣ ＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノアート）、ＳＵＬＦＯ ＮＨＳ ＬＣ ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノアート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート）、ＮＨＳ ＢＲＯＭＯＡＣＥＴＡＴＥ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセタート）、ＮＨＳ ＩＯＤＯＡＣＥＴＡＴＥ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセタート）、ＭＰＢＨ（４−（Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジドヒドロクロリド）、ＭＣＣＨ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸ヒドラジドヒドロクロリド）、ＭＢＨ（ｍ−マレイミド安息香酸ヒドラジドヒドロクロリド）、ＳＵＬＦＯ ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミド）、ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド）、ＰＭＰＩ（Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアナート）、ＫＭＵＨ（Ｎ−（κ−マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド）、ＬＣ ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ（６−アミドカプロアート））、ＳＵＬＦＯ ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ（ｂｕｔｒｙｌｏｘｙ））スルホスクシンイミドエステル）、ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミドヘキサノアート））、ＳＵＬＦＯ ＫＭＵＳ（Ｎ−（κ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ（ｂｕｔｙｒｌｏｘｙ））スクシンイミド）、ＤＭＰ（ジメチルピメリミダートヒドロクロリド）、ＤＭＳ（ジメチルスベリミダートヒドロクロリド）、ＭＨＢＨ（ウッズ試薬）（メチル−ｐ−ヒドロキシベンズイミダートヒドロクロリド、９８％）、ＤＭＡ（ジメチルアジピミダートヒドロクロリド）。
ＣｅｎｄＲエレメントを所与の細胞に選択的に送達させ、それによってホーミングＣｅｎｄＲ結合体を形成するためのＣｅｎｄＲエレメントに結合したホーミング分子を開示する。種々のホーミング分子を、開示の組成物、結合体、および方法で使用することができる。かかるホーミング分子には、本明細書中に開示のペプチドが含まれるが、これに限定されない。開示の化合物、組成物、結合体、および方法は、種々の形態の開示のホーミング分子（開示のペプチドおよびペプチド模倣物が含まれる）を含むか使用することができる。都合よく発現するために、本明細書中の多数の場所にペプチドの使用または含有が引用されているであろう。そのような場合に、種々の形態のホーミング分子をペプチドに関して記載の方法と同一または類似の方法で使用するかこれらに含むこともでき、それにより、その使用および含有が特に意図および開示されると見なされると理解される。
本明細書中で使用する場合、用語「ホーミング分子」は、正常組織よりも腫瘍または他の特異的組織にｉｎ ｖｉｖｏで選択的にホーミングする任意の分子を意味する。同様に、用語「ホーミングペプチド」または「ホーミングペプチド模倣物」は、正常組織よりも再生組織、創傷、または腫瘍にｉｎ ｖｉｖｏで選択的にホーミングするペプチドを意味する。再生組織、創傷、または腫瘍にｉｎ ｖｉｖｏで選択的にホーミングするホーミング分子は再生組織、創傷、または腫瘍に優先的にホーミングすることができると理解される。
「選択的にホーミングする」は、ｉｎ ｖｉｖｏでホーミング分子が非標的と比較して標的に優先的に結合することを意味する。例えば、ホーミング分子は、非腫瘍と比較して腫瘍に優先的に結合することができる。例えば、腫瘍細胞への選択的ホーミングは、一般に、非腫瘍細胞のいくつかの組織型と比較して、腫瘍細胞内の少なくとも２倍を超えた局在化によって特徴づけられる。ホーミング分子を、ほとんどまたは全ての非癌性細胞と比較して、５倍、１０倍、２０倍、またはそれを超える癌性細胞への優先的局在化によって特徴づけることができる。したがって、いくつかの場合、ホーミング分子は、腫瘍へのホーミングに加えて、１つまたは複数の正常器官に一部ホーミングすると理解される。選択的ホーミングをターゲティングということもできる。
ホーミング分子認識の文脈における結合および／またはその標的への結合は、例えば、共有結合および／または非共有結合によってホーミング分子がその標的に結合、付着、またはそうでなければカップリングすることができる場合に共有結合または非共有結合の両方をいうことができる。結合は、高親和性または低親和性のいずれでもよく、高親和性が好ましい。有用であり得る結合力の例には、共有結合、双極子相互作用、静電力、水素結合、疎水性相互作用、イオン結合、および／またはファンデルワールス力が含まれるが、これらに限定されない。この結合は、ＣｅｎｄＲエレメントを使用して起こる結合に加えて起こり得る。
「治療」は、疾患、病的状態、または障害を治癒、改善、安定化、または防止することを意図する患者の医学的管理を意味する。この用語には、積極的治療（すなわち、疾患、病的状態、または障害の改善を明確に目指す治療）が含まれ、原因治療（すなわち、関連する疾患、病的状態、または障害の原因の除去を目指す治療）も含まれる。さらに、この用語には、緩和的治療（すなわち、疾患、病的状態、または障害の治癒よりもむしろ症状の緩和のためにデザインされた治療）；予防的治療（すなわち、関連する疾患、病的状態、または障害の発症の最小化または部分的もしくは完全な阻害を目指す治療）；および支持治療（すなわち、関連する疾患、病的状態、または障害の改善を目指す別の特定の療法を補助するために使用される治療）が含まれる。
本明細書中で使用する場合、「被験体」には、動物、植物、細菌、ウイルス、寄生虫、および核酸を有する任意の他の生物または物質が含まれるが、これらに限定されない。被験体は、脊椎動物、より詳細には、哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、ウシ、ネコ、モルモット、またはげっ歯類）、魚類、鳥類、爬虫類、または両生類であり得る。被験体は、無脊椎動物、より詳細には、節足動物（例えば、昆虫および甲殻類）であり得る。この用語は、特定の年齢または性別を示さない。したがって、成体および新生被験体ならびに胎児は、雄または雌のいずれも対象とされることを意図する。患者は、疾患または障害を罹患した被験体をいう。用語「患者」には、ヒトおよび動物被験体が含まれる。子宮内膜癌および子宮内膜癌細胞の文脈では、被験体が子宮内膜癌および／または子宮内膜癌細胞を有するか有し得る被験体であると理解される。
本明細書で主張する化合物、組成物、製品、デバイス、および／または方法がどのようにして作製および評価されるかを当業者に完全に開示および記載するために以下の実施例を示し、この実施例は、純粋に例示を意図し、本開示を制限することを意図しない。数字（例えば、量、温度など）が正確であるように努めたが、いくつかの誤差および偏差が存在するであろう。他で示さない限り、部は重量部であり、温度は摂氏で示すか周囲温度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
Ａ．実施例１：ナノ粒子、薬物、または他の物質の細胞内外への送達
ファージディスプレイを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでの血管ターゲティングのための多数の高選択性ペプチドを単離した。一般に、受容体ターゲティングおよび／または細胞透過性ペプチドの使用によって高分子およびコロイド状ナノ粒子を細胞に送達させる。
１．結果
一連のＴ７バクテリオファージディスプレイされたペプチドライブラリーを使用して、ＰＰＣ１前立腺癌細胞によってファージ粒子を細胞取り込みする配列モチーフを同定した。Ｔ７ファージ粒子は正十二面体のヌクレオカプシドおよびテール繊維から構成され、ディスプレイされたペプチドは、典型的には２００〜４１５ペプチド／ファージの密度の主なコートタンパク質ＧＰ１０とのＣ末端融合物として発現する（図１Ａ）。従来のＴ７ペプチドライブラリー（ランダム環状ＣＸ７Ｃおよび線状Ｘ７；Ｘはランダム残基）をスクリーニングのために使用した。ｉＲＧＤペプチド（ＲＸＸＲＸＸＸおよびＲＸＸＲ（Ａ／Ｐ）ＰＲＸＸＸライブラリー）などの他の分子中で認められているＲＸＸＲモチーフを含むように新規のライブラリーもデザインした。３ラウンドのディスプレイ後、選択されたライブラリーは７−グリシン（Ｇ７）コントロールペプチドをディスプレイするファージの５００〜２，５００倍細胞懸濁液に結合した（図１Ｂ）。３ラウンドの選択後のランダムファージクローンの配列決定により、最初のライブラリーの配置と無関係に全てのライブラリーがＣ末端アルギニン残基をディスプレイするように収束したことが証明された（図１Ｃ）。Ｃ末端アルギニンをディスプレイするファージは、３７℃でのインキュベーションおよび酸洗浄後に細胞中で検出可能であった。これは、細胞へのファージ内在化を示す。各ファージクローンとインキュベートした細胞の免疫染色および共焦点画像化により、ファージ粒子の細胞内局在化が確認された（図２Ｂ）。
ファージ内在化におけるＣ末端アルギニンの役割を理解するために、（１）ＧＧＧＧＧＧＲ（配列番号１）およびＧ７コントロールペプチドの他のバリアント、および（２）１つのロバストな内在化ペプチド（ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２））のバリアントをディスプレイする２組のファージを調製した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＰＣ１細胞（図２Ａ）およびいくつかの他のヒト腫瘍細胞株ならびにｅｘ ｖｉｖｏでの正常なマウス器官から調製した細胞の懸濁液へのこれらのファージの結合を研究した。これらの実験により、Ｃ末端アルギニンが広範な細胞へのファージ結合を誘発するのに十分であることが証明された。ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージは、ＧＧＧＧＧＧＲ（配列番号１）ファージよりも強い結合を示した。普遍的細胞結合と一致して、静脈内注射したＣ末端アルギニンをディスプレイするファージクローンは、最初に遭遇した血管床、心臓、および肺中での富化が認められた。
ｉ．Ｃ末端アルギニンのディスプレイによって合成ナノ粒子が内在化される
次に、合成ナノ粒子へのＣ末端則の適用性を研究した。量子ドット（Ｑドット（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドのコーティングにより、培養ＰＰＣ１細胞によってＱドットの頑強な結合および内在化が誘発された（図３、パネルａ）。ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドのＣ末端のアミドでのブロックにより、Ｑドットの結合および内在化が消滅した（図３、パネルｂ）。これは、粒子内在化が末端アルギニンのグアニド基およびカルボキシル基の両方を使用するという考えに一致する。ＲＰＡＲＰＡＲ−Ｑドット（配列番号２）の内在化はまた、過剰量のＲＰＡＲＰＡＲディスプレイファージ（配列番号２）との細胞のプレインキュベーションによって阻害され、飽和性の受容体媒介過程が示唆された。
本明細書中に記載の実験は、アルギニン残基のＣ末端ディスプレイが細胞へのロバストファージ（およびより一般にはナノ粒子）取り込みを誘発する簡潔なシグナル（ＣｅｎｄＲシグナル）を示すことを証明する。
ｉｉ．プロテアーゼ切断による不顕性内在化組成物の活性化
データは、ＣｅｎｄＲが種々の組成物の取り込みのための簡潔な位置依存性エレメントを定義することを示す。この規則の興味深い意味は、この規則を使用して、タンパク質分解性切断によって内在化ナノ粒子に活性化することができる不顕性組成物（不顕性ナノ粒子など）をデザインすることができることである。多数のセリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼは、Ｃ末端エレメント（リジン、アルギニン、またはリジン−グリシンなど）を曝露し、かかる切断活性化に潜在的に適切である。さらに、細胞外プロテアーゼは、しばしば、細胞型、組織、または疾患に特異的であり得る高度に制御された様式で発現される。これにより、ナノ粒子取り込みのタンパク質分解性活性化をターゲティング可能である。トリプシン（アルギニン残基およびリジン残基のＣ末端側を排他的に切断する広域性セリンプロテアーゼ）を、プロテアーゼスイッチ概念についての概念実証実験のために使用した。ＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号３）ペプチドをディスプレイするファージは、トリプシン処理を行わずにＰＰＣ１細胞とインキュベートした場合に細胞結合をほとんど示さなかったが（Ｇ７ディスプレイファージの２．８倍）、トリプシンとのファージのインキュベーションにより、結合が１００倍を超えて増加した（図４）。
ｉｉｉ．組成物の組織選択的ホーミングおよびＣ末端則
以前に同定された多数の内在化ホーミングペプチドは、内部またはＣ末端にアルギニンを含む（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２ａ；Ｈｏｆｆｍａｎら、２００３；Ｚｈａｎｇら、２００５；Ｊａｒｖｉｎｅｎ ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，２００７）。ＣｅｎｄＲは、これらのホーミングペプチドの細胞内在化に寄与することができる。最近、多数の腫瘍モデルに対して強いｉｎ ｖｉｖｏ選択性を有するホーミングペプチドファミリーが同定された。これらのペプチドのうちの１つであるＣＲＧＤＫＧＰＤＣ（ｉＲＧＤ）（配列番号４）はインテグリン結合ＲＧＤモチーフを含むが、任意の他のＲＧＤペプチド（以前に腫瘍ターゲティングのために使用されたＲＧＤ−４Ｃペプチド（Ａｒａｐら、１９９８）が含まれる）より強く細胞内に内在化されるという点で、ＲＧＤペプチドのうちで珍しい。図５は、ｉＲＧＤペプチドによる強い腫瘍ホーミングの例を示す。
強い内在化の手掛かりは、腫瘍中に発現したプロテアーゼに対してペプチドに感受性を示させるＲＧＤＫ配列（図８に示すように、ＫをＲに置換することができる）のようである。ｉＲＧＤペプチドおよびｉＲＧＤ保有粒子の選択性および強い細胞内在化は、以下の組み合わせの結果として起こり得る：（１）血管形成内皮および腫瘍細胞上のαｖインテグリンとの相互作用（それにより、腫瘍中のペプチド濃度が高くなる）；（２）Ｃ末端のアルギニンまたはリジン（ＲＧＤ配列中のもの）を曝露するための定義されるべき腫瘍由来の細胞外プロテアーゼによる切断；（３）インテグリンによって使用される内在化経路よりも有効な粒子の内在化が得られるＣｅｎｄＲ経路のその後の活性化。これを支持する結果は、ｉＲＧＤペプチドをディスプレイするファージの細胞によるｉＲＧＤファージの内在化がＵＶ不活化ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージとのプレインキュベーションによって減少する（およびコントロールＧ７ファージの影響は受けない）ことを示す。図６は概念を示す。
２．デザインおよび方法
ｉ．細胞表面受容体、細胞内タンパク質、および非タンパク質の同定ならびにＣ末端アルギニンを有するペプチドでコーティングしたナノ粒子のための内在化経路の解明
Ｃ末端則は、種々の組成物の複数の細胞型への結合および内在化を担う。これらの過程を、ＣｅｎｄＲエレメントをディスプレイする非標識粒子との細胞のプレインキュベーションによって阻害することができ、これは、特異的な細胞表面受容体、細胞内タンパク質、および非タンパク質（核酸、脂質、およびグリコサミノグリカンなど）への取り込みの依存と一致している。ＣｅｎｄＲ受容体調節の同定および詳細な理解は、送達経路の合理的適用の重要な必要条件である。ＣｅｎｄＲペプチドの内在化受容体を、同定および特徴づけることができる。受容体／細胞内タンパク質／非タンパク質を、ＣｅｎｄＲペプチドと相互作用する分子のプルダウンによって富化する。ＣｅｎｄＲペプチドと同時精製されるタンパク質を分画し、質量分析に供して推定受容体および他の分子を同定する。
一連の実験を行って真の受容体タンパク質としての候補を確証する。培養細胞中の受容体とのＣｅｎｄＲファージの結合およびＣｅｎｄＲファージの同時局在化について精製された推定受容体を試験することによって相互作用を確認する。機能分析のために、候補ＣｅｎｄＲ−受容体の発現レベルを調整し、ファージおよびＣｅｎｄＲペプチドをコーティングした量子ドットの取り込みと相関させる。
エンドサイトーシス区画のマーカーに対する一連の抗体を使用した同時局在化研究を使用して内在化経路を決定し、次いで、種々の経路のインヒビターに対するＣｅｎｄＲナノ粒子取り込みの感受性を試験する。
受容体の同定および確証。ＣｅｎｄＲ受容体を同定するために、ＰＰＣ１前立腺癌細胞株から調製した抽出物を使用したペプチドプルダウンアッセイを行う。１０×１０６個のＰＰＣ１細胞を、グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ）、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、および哺乳動物細胞用のプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む緩衝液を使用して抽出する。抽出物を、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）およびコントロールペプチド（ブロックされたＣ末端およびＧ７を有するＲＰＡＲＰＡＲ）に結合したアガロースビーズ（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）とインキュベートする。全ペプチドを、本発明者らの研究所に関連するペプチド化学者が合成する。ペプチドをＨＰＬＣによって精製して純度を９５％超にし、その構造を質量分析によって確認する。一晩のインキュベーション後、ビーズを十分に洗浄し、４〜２０％ポリアクリルアミドゲルで分離する。電気泳動後、ゲルを銀染色し、ＲＰＡＲＰＡＲ−プルダウンサンプル中に特異的に存在するタンパク質バンドを切り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果にかける。
種々のプルダウンアッセイも使用することができる。このアッセイは、ジチオ−ビス（スクシンイミジルプロピオナート）（ＤＳＰ、Ｌｏｍａｎｔ’ｓ試薬）を使用した受容体へのペプチドの可逆的架橋のさらなる工程を含む。これは細胞透過性を示すホモ二官能性のチオール切断可能分子であり、ｐＨ範囲が６．５および８．５の水性緩衝液中で相互に第一級アミノ基を連結するようにデザインされている。得られた−Ｓ−Ｓ−架橋を、ゲルローディング緩衝液中でβメルカプトエタノールによって切断する。さらなるアミノ末端システインを有する特定の目的のペプチド組を、ＤＳＰを使用した架橋安定化プルダウンのために調製する。
細胞表面での受容体発現を使用するために手順を修正することができる。バリエーションの１つとして、インタクトな生きた細胞をペプチド−アガロースビーズとプレインキュベートし、過剰なビーズを洗い流し、細胞を可溶化し、ビーズを再度洗浄する。これにより、細胞表面タンパク質への結合が制限される。あるいは、細胞を表面ビオチン化することができ（Ａｌｔｉｎ ａｎｄ Ｐａｇｌｅｒ，１９９５）、ペプチド−アガロースを使用して最初の単離を行い、次いで、ストレプトアビジン−アガロースにてビオチン含有タンパク質をさらに単離し、その後にゲル電気泳動を行うことができる。
ＣｅｎｄＲ単離のクローニングストラテジーも使用することができる。日常的に培養した細胞株（約３０種の異なる細胞株と推定される）を、ＣｅｎｄＲペプチド内在化について試験することができる。非内在化細胞株が認められる場合、これらの細胞を使用してＰＰＣ１細胞のｃＤＮＡライブラリーをトランスフェクトし、ＣｅｎｄＲペプチドでコーティングした量子ドットを内在化する能力を獲得したトランスフェクタントをスクリーニングする。内在化陽性細胞を同定し、ＦＡＣＳによって単離する。ＣｅｎｄＲ陰性細胞株が見出されない場合、かかる株を、細胞内作用するアポトーシス促進性ペプチドでのＰＣＣ１細胞の処理によって生成する。第１の選択はＢＨ３ドメイン由来アポトーシス促進性ペプチドであり、このペプチドは、生存促進性分子Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、およびＡ１の活性を抑制することが公知である（Ｄｈａｒａｐ ａｎｄ Ｍｉｎｋｏ，２００３）。処理に耐性を示す細胞株が得られるまで、生存細胞を選択する。次いで、この細胞株を、ＣｅｎｄＲ−量子ドット内在化の欠損について試験する。欠損がＣｅｎｄＲ工程で存在しない場合、２つの独立して作用するアポトーシス促進性化合物を使用した別の処理を使用する。以前に腫瘍ターゲティングのための使用されていた抗菌ペプチドＤ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２（配列番号５）（例えば、Ａｒａｐら、２００２）を、別のスクリーニングにおける第２の化合物として使用する。
上記方法によって同定された候補受容体を、生物学的且つ細胞ベースのアッセイを使用して確証する。プラスチックウェルに結合した精製された推定受容体タンパク質およびＣｅｎｄＲ（ＲＰＡＲＰＡＲ、配列番号２）およびコントロールペプチド（ＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号３）およびＧ７）をディスプレイするファージの結合を、免疫アッセイ形式で分析する。相互作用が確認される場合、ＣｅｎｄＲファージ取り込みに及ぼす受容体調整の影響を評価する。受容体発現が下方制御された前立腺癌細胞株ＰＰＣ１の亜株を、ｓｉＲＮＡ（ＰＰＣ１／Ｒ−）の構成的発現を駆動するｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ２．０−Ｕ６ベクター（Ａｍｂｉｏｎ）での安定なトランスフェクションの使用によって形成する。真のＣｅｎｄＲ受容体が下方制御される場合、ＣｅｎｄＲファージ内在化の抑制が認められる。ｓｉＲＮＡの影響の特異性のコントロールとして、別のコドン使用頻度を有するｓｉＲＮＡ非感受性発現構築物を生成する。これらの発現ベクターのトランスフェクションによるＰＰＣ１／Ｒ−細胞へのＣｅｎｄＲファージ結合のレスキューにより、ｓｉＲＮＡノックダウンの影響は受容体に特異的であり、他の遺伝子の関与によらないことを確認することができる。いくつかの周知の細胞透過性ペプチドの内在化で同定されたＣｅｎｄＲ受容体の関与も試験して（Ｔａｔ、ペネトラチン、ｐＶｅｃ）、ＣｅｎｄＲ系の普遍性を決定する。
内在化経路の解明。共焦点顕微鏡法を使用して、内在化したＣｅｎｄＲナノ粒子および一連の細胞内区画マーカーの局在化を研究する。ＰＰＣ１細胞を、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドをディスプレイするファージおよび量子ドット（Ｑｄｏｔ（商標）６０５ ＩＴＫ−ＳＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と種々の時間（１０分間〜３時間）インキュベートし、以下のマーカーに対する抗体（エンドソーム（抗ＥＥＡ１ｐＡｂおよび抗Ｍ６ＰＲｐＡｂ；Ａｂｃａｍ）；リソソーム（抗ＬＡＭＰ−１ ｐＡｂ、ｃａｖｅｏｌｉ（抗カベオリン１ｐＡｂ；Ａｂｃａｍ）、およびクラスリン（抗クラスリンｍＡｂ；Ａｂｃａｍ））で細胞を染色する。細胞を、種々の内在化経路のマーカーおよびＴ７バクテリオファージについて二重染色する。非免疫ＩｇＧはコントロールとしての機能を果たす。機能分析のために、ＣｅｎｄＲおよびコントロール粒子の取り込みに及ぼす特異的内在化経路インヒビターの影響を試験する。量子ドットを蛍光顕微鏡法によって検出する。使用インヒビターは以下である：エンドソーム経路の一般的インヒビターとしての低温（４℃）、フィリピン、サイトカラシンＤ、カベオリン媒介性取り込みのためのナイスタチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、クラスリン依存性エンドサイトーシスのためのクロルプロマジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、マクロ飲作用のためのアミロライド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびリソソーム回避のためのクロロキン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。
ｓｉＲＮＡ活性は、細胞質送達の信頼でき且つ関連する基準である。ｓｉＲＮＡをＥＧＦＰのために合成し、ＣｅｎｄＲペプチドＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）に結合させ、ＥＧＦＰおよびＤｓＲｅｄの両方を発現するＰＰＣ１細胞に及ぼすその影響を試験する。コントロールは単純なｓｉＲＮＡである。処理した細胞を、蛍光および免疫ブロッティングによってＥＧＦＰおよびＤｓＲｅｄ発現について試験する。ｓｉＲＮＡを、下記のように構築したナノ粒子の表面に付着させる。
したがって、ＣｅｎｄＲペプチドの細胞取り込みを媒介する受容体を同定する。これらのペプチドによって使用される特定のエンドサイトーシス経路も同定し、細胞質送達が得られるかどうかを見出す。
ｉｉ．ｉｎ ｖｉｖｏでの不顕性組成物の結合／内在化を誘発するためのＣ末端アルギニンのタンパク質分解的曝露の適用
ＣｅｎｄＲエレメントのＣ末端曝露を要求することにより、タンパク質分解性切断によって活性化される不顕性（非内在化）ナノ粒子を構築することが可能となる。ｉｎ ｖｉｔｒｏトリプシン処理は、不顕性ＣｅｎｄＲペプチド（ＲＰＡＲＰＡＲＡ、配列番号３）を強力な内在化誘発ペプチドに変換する。ここに、腫瘍送達における組成物のタンパク質分解的に活性化された内在化の有用性を調査する。
細胞外タンパク質分解機構は、種々の発現パターン、特異性および活性、ならびに受容体、共受容体、およびインヒビターによって調節される各酵素を有する複雑なプロテアーゼ系である。健康な成体では、細胞外タンパク質分解は抑制される。タンパク質分解の増加へのシフトは、組織再造形および血管形成に関連する病的状態（例えば、腫瘍の浸潤および成長、神経変性疾患、血管疾患、および炎症性疾患）において起こる。腫瘍発生とプラスミンおよびプラスミノゲンアクチベーターの細胞外セリンプロテアーゼ系の活性化との間の関係についての多数の研究が確立されている。２つの主なプラスミノゲンアクチベーター（ウロキナーゼ型アクチベーター（ｕＰＡ）および組織型プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ））のうち、ｕＰＡは細胞周囲のタンパク質分解および腫瘍細胞浸潤により重要であると考えられる。ｕＰＡは、タンパク質分解的に不活性な単鎖プロ−ｕＰＡとして細胞から分泌され、細胞周囲空隙中で活性な２鎖ｕＰＡに変換される。腫瘍では、活性なｕＰＡは、浸潤性腫瘍細胞、マクロファージ、および血管形成内皮細胞の表面に存在する。ｕＰＡ活性は、以下の一連の機能的に関連する分子によって正確に調節される：高親和性ＧＰＩ係留細胞表面受容体−ｕＰＡＲ（Ｂｌａｓｉ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，２００２）、共受容体−ＬＤＬ受容体関連タンパク質／α２−マクログロブリン受容体（Ｃｏｎｅｓｅら、１９９５）、セルピンインヒビター−プラスミノゲンアクチベーターインヒビター１〜３型（Ｒｉｊｋｅｎ，１９９５）。この系は、ｕＰＡ活性を隣接した細胞周囲空隙に制限するように作用する。ｕＰＡ活性の腫瘍発生および血管新生との関連、ならびにその強力な基質選択性により、ｕＰＡ活性をｉｎ ｖｉｖｏでのプロテアーゼ活性化ターゲティングの魅力的な候補にしている。実際、細菌毒素のｕＰＡ媒介性活性化は、実験的な腫瘍療法で首尾よく適用されている（Ｌｉｕら、２００１，Ａｂｉ−Ｈａｂｉｂら、２００４）。ｕＰＡはＰ１残基としてアルギニンを好み、マスキングされたＣｅｎｄＲエレメントのＣ末端ディスプレイを触媒するための適切なプロテアーゼであり得る。ＣｅｎｄＲエレメントをディスプレイするＴ７ファージを形成し、その後にコンセンサスｕＰＡ切断部位を形成し、ｕＰＡ発現細胞およびｕＰＡ活性の薬理学的阻害に対する内在化の感受性によってその内在化を研究する。コントロールは、切断の際にＣ末端リジンが曝露されると予想される別のｕＰＡ基質モチーフを有するペプチドをディスプレイするファージを含み、このファージは内在化されるべきではない。２つの他のプロテアーゼ（フューリンおよびトロンビン）（共に塩基性残基のＣ末端側のタンパク質およびペプチドを切断し、潜在的にＣ末端アルギニン残基を曝露する）を同様に内在化を誘導する能力について試験する。一旦、ｕＰＡ−ＣｅｎｄＲファージの内在化がｕＰＡ活性に依存することが証明されると、ｕＰＡ発現異種移植腫瘍を保有するマウスおよび妊娠マウスの胎盤組織（胎盤形態形成は、生理学的ｕＰＡ誘導の周知のモデル過程である）におけるホーミングをｉｎ ｖｉｖｏで研究する。フューリンまたはトロンビンを、ｉｎ ｖｉｖｏ研究のために使用することもできる。
ｉｉｉ．ｕＰＡ感受性ＣｅｎｄＲファージの構築およびｉｎ ｖｉｔｒｏターゲティング研究
Ｃ末端マスキングされた不顕性ＣｅｎｄＲペプチドをディスプレイする一連のファージは、ウロキナーゼ、フューリン、またはトロンビン切断によって曝露されると予想された（表１）。使用されるｕＰＡ感受性モチーフは、ｕＰＡ感受性炭疽毒素バリアントを構築するために首尾よく使用されている（Ｌｉｕら、２００１）。表１中のモチーフ１〜４について、表示のプロテアーゼによる基質ファージの切断によってＣｅｎｄＲエレメントが曝露され、それにより、ファージの結合および内在化が起こると予想される。対照的に、ｕＰＡによるモチーフ５の切断によってＣ末端リジンを曝露することができるが、内在化は誘発されない。基質ファージに加えて、切断後状態を模倣するコントロールファージを構築する（表１、右のカラム）。フューリンは哺乳動物細胞中に遍在しており、トランスゴルジ網、エンドソーム、および細胞膜中には細胞内局在している。実験において、フューリン感受性ファージ（表１中のファージ１）のＣｅｎｄＲ経路は普遍的に活性化され、ファージがポジティブコントロールとしての機能を果たすと予想される。トロンビンは培養細胞中に存在せず、外因性トロンビンの添加を使用して細胞培養物中でのトロンビン切断可能ペプチドを含むファージ（表１中のファージ２）の内在化を誘発する。腫瘍組織では、癌細胞は典型的にはｕＰＡＲを発現するのに対して、間質細胞はプロ−ｕＰＡを産生する。プロ−ｕＰＡおよびｕＰＡＲの両方を産生する細胞株はわずかしか知られていない。一例は、ルイス肺癌細胞株ＬＬ３であり、これは両タンパク質を産生する。ＬＬ３細胞中の基質ファージパネルのｉｎ ｖｉｔｒｏ内在化を研究する。約１０６個のＬＬ３細胞を５×１０８個のファージ粒子と３７℃で２時間同時インキュベートし、その後に１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭで十分に洗浄し、結合したファージをレスキューし、定量する。コントロールとして、特異的ペプチドインヒビターであるウパイン−１（ＣＳＷＲＧＬＥＮＨＲＭＣ（配列番号６）；１００μＭ；Ｈａｎｓｅｎら、２００５）または１ｍＭアミロライドヒドロクロリド（ｕＰＡの特異性の低い競合性インヒビター）との細胞のインキュベーションによってｕＰＡ活性を阻害する。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験は、ＣｅｎｄＲナノ粒子のｕＰＡ媒介性活性化の可能性を証明することができる。
ｉｖ．プロテアーゼ感受性ＣｅｎｄＲファージのｉｎ ｖｉｖｏホーミング
ｕＰＡ感受性ＣｅｎｄＲファージのｉｎ ｖｉｖｏホーミングを、以下の２つの標的を使用して研究する：（１）移植腫瘍（皮下ＬＬ３モデルおよびＰＣ３前立腺癌同所性異種移植モデル）および（２）マウス妊娠中期後胎盤（性交後１０〜１４日）。ＬＬ３およびＰＣ３腫瘍は、高活性化ｕＰＡ系を有することが公知である。胎盤では、ｕＰＡは栄養胚葉細胞および脱落内皮細胞の両方で発現する。胎盤は、ターゲティングを容易にすることができる以下のいくつかの特徴を有する：脈管構造が正常であり、腫瘍において一般的な間質圧の上昇およびＥＰＲの影響が存在しないこと。ナノ粒子（バクテリオファージが含まれる）は、細網内皮系（肝臓）によって血流から迅速にクリアランスされる。タンパク質分解の影響を観察するためにファージの寿命を長くする必要がある場合、肝臓回避変異体Ｔ７ファージを使用する。変異はテール繊維タンパク質に存在し、この変異によってファージが肝臓によって認識不可能になり、その結果、血液半減期が延長される。かかるファージ（Ｓｏｋｏｌｏｆｆら、２００３）を構築し、試験した。ｕＰＡ感受性ＣｅｎｄＲおよびコントロール（Ｇ７）ファージ（１０９〜１０１１ｐｆｕ）をマウスに静脈内注射し、種々の循環期間後（１０分〜２時間）、動物をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で灌流し、組織サンプルを回収する。組織をホモジナイズし、１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭで洗浄し、標的およびコントロール器官（典型的には、脳、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、および骨格筋）中のファージ量を、生きているファージの滴定およびファージＤＮＡコピー数のｑ−ＰＣＲ評価によって評価する。さらに、ウサギポリクローナル抗Ｔ７抗体を使用した免疫ペルオキシダーゼ染色を使用して、ファージの組織分布を決定する。ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞外基質成分、血管およびリンパ管、ならびに腫瘍細胞にホーミングするいくつかのペプチド（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら、２００２ａ；Ｈｏｆｆｍａｎｎら、２００３；Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，２００４；Ｐｉｌｃｈら、２００６）は以前に特徴づけられている。ｕＰＡ感受性ＣｅｎｄＲファージのホーミングを、これらの以前に同定されたホーミングペプチドをディスプレイするファージと定性的および定量的に比較する。
腫瘍は、血液凝固を増加させる傾向があることが知られている。ホーミングペプチド（ＣＲＥＫＡ（配列番号７））でコーティングしたナノ粒子は、腫瘍血管に結合し、腫瘍血管中で血液凝固することが示されている（Ｓｉｍｂｅｒｇら、２００７）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍保有マウス（元のＣＲＥＫＡ（配列番号７）研究で使用）に、ＣｅｎｄＲトロンビン基質ファージ（表１中のファージ２）またはコントロール（Ｇ７）ファージ（１０９〜１０１１ｐｆｕ）を静脈内注射し、上記のｕＰＡ感受性ファージについて記載のようにファージホーミングを研究する。ファージおよびトロンビンの免疫反応性を、レポーター酵素としてペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを使用した二重免疫組織化学を使用して研究する。凝固の増強のために、トロンビン感受性ＣｅｎｄＲファージおよびＣＲＥＫＡファージを結合体化し、その後にホーミングおよび免疫局在化を定量する。
ｖ．ＣｅｎｄＲ経路を介して内在化された新規のプロテアーゼ切断可能細胞型および組織特異的ペプチドのスクリーニング。
ヒトプロテアーゼレパートリー（すなわち、デグラドーム）は、４６０種を超えるプロテアーゼからなる（Ｐｕｅｎｔｅら、２００３）。タンパク質分解活性プロフィールは、組織型および疾患特異的である。全身でアクセス可能な内因性プロテアーゼのｉｎ ｖｉｖｏプロファイリングを、現在の技術を使用して行うことができない。ＣｅｎｄＲエレメントをかかるスクリーニングのために使用することができる。セリンプロテアーゼは公知のプロテアーゼの１／３を構成し、多くの場合、その切断によってＣ末端アルギニン残基が曝露される。多数のシステインプロテアーゼもＰ１残基としてアルギニンを好み、ＣｅｎｄＲスクリーニングの適切な標的であり得る。切断の際にＣ末端アルギニンを曝露することができるいくつかの組織および細胞型特異的プロテアーゼは公知である。ウロキナーゼ／プラスミン系は、発達中の遊走細胞（例えば、栄養胚葉巨細胞、神経堤細胞）および腫瘍浸潤で活性化される（Ｂｌａｓｉ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，２００２）。組織カリクレイン（１５種の密接に関連するキモトリプシン様プロテアーゼファミリー）は、器官および細胞型特異的パターンで発現し、ｈＫ３／前立腺特異的抗原の前立腺特異的発現が最も知られている。基質プロファイリングは、カリクレインｈＫ４、ｈＫ５、ｈＫ６、ｈＫ１０はＰ１残基としてアルギニンを好み、ｈＫ３などの他の重要なカリクレインもこの位置でアルギニンを許容することを示す（Ｄｅｂｅｌｅら、２００６）。トリプシノゲンは膵外分泌部によって生理学的に発現されるが、これらは多数の腫瘍中にも異所性に発現され、マトリックスメタロプロテイナーゼの活性化で役割を果たす（Ｎｙｂｅｒｇら、２００６）。興味深いことに、宿主プロテアーゼによるウイルスコートタンパク質のタンパク質分解性切断は、多数のウイルスの役立つ活性化工程であり、実際、活性化プロテアーゼの発現パターンは頻繁にウイルス組織親和性を決定する（Ｋｌｅｎｋ ａｎｄ Ｇａｒｔｅｎ １９９４）。ウイルスコートタンパク質は一般に塩基性残基で切断される。これは、ウイルス粒子の細胞内送達のためにＣｅｎｄＲ原理を天然に適用する方法を示し得る。Ｃ末端アルギニン残基を直接曝露するエンドプロテアーゼ切断に加えて、カルボキシルペプチダーゼまたはエンドプロテアーゼとカルボキシルペプチダーゼプロセシングとの組み合わせによる多段階トリミングによるＣｅｎｄＲ活性を想定することができる。細胞表面または細胞表面付近で１つを超えるプロテアーゼの同時発現が必要であり、これにより、多数の組織特異的変動が起こり、選択的ターゲティングの可能性を生ずることができる。
新規のｉｎ ｖｉｖｏファージスクリーニングを使用して、ターゲティングにおける組織特異的プロテアーゼ発現の可能性を引き出すことができる。ランダムライブラリー配列内に適切なプロテアーゼ認識エレメントを含むペプチドのタンパク質分解性曝露により、ファージ粒子を細胞内在化することができる（図７）。内在化によってファージが標的に集中し、標的で特異的に切断されるペプチド選択の根拠が得られる。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方のスクリーニングをこの様式で行って、新規の腫瘍特異的ＣｅｎｄＲペプチドを発見する。
かかるペプチドを使用して、種々の腫瘍型におけるプロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせに特異的な内在化組成物を構築することができる。さらに、プロテアーゼベースのターゲティングを、シナフィック（ドッキングベースの）ターゲティングと組み合わせて特異性および有効性を増大させることができ、標的組織で受容体に結合するホーミングペプチドを使用して２つのペプチドでデコレーションしたキメラペプチドまたは組成物（ナノ粒子など）を標的に集中させ、標的部位で、次いで、ＣｅｎｄＲベースのタンパク質分解によってペプチドが切断されて内在化する。組み合わせ効果により、前例のないターゲティング選択性を得ることができる。上記のｉＲＧＤペプチドは、かかる組み合わせ特異性を有するペプチドの一例であり得る。
ｖｉ．ライブラリーの構築
以下の２つのＴ７ファージライブラリー型を構築する。（１）第１のライブラリー組において、単一アルギニン残基の後にランダムペプチドのベイト配列が続く。ランダム配列が環状ペプチドの形成を意図する場合、システイン残基をアルギニンのＮ末端側に挿入し、ランダム部分は構造ＸｎＣを有する。（２）第２のライブラリー組において、既知のホーミングモチーフの後にアルギニン残基およびランダム配列が続く。Ｃ末端残基としてアルギニンを曝露するタンパク質分解プロセシングにより、ファージを内在化させて標的に蓄積させる。デザイン番号２では、既知のホーミングモチーフは、ファージを腫瘍組織中に集中させることを意図する。ホーミングモチーフの選択肢の１つはＲＧＤ−４Ｃペプチドである。このペプチドは９残基内に４個のシステイン残基を含み、強く捻れた構造を形成する（Ａｓｓａ−Ｍｕｎｔら、２００１）。ＲＧＤ−４Ｃは腫瘍血管にホーミングし（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９７；Ａｒａｐら、１９９８）、その構造により、プロテアーゼ切断に比較的耐性を示すことが示されている。それにより、付加したランダム配列が遊離してプロテアーゼ基質および内在化機能が得られる。別の選択肢はＣＬＴ１ペプチド（腫瘍間質中の凝固血漿タンパク質を認識する腫瘍ホーミングペプチド）である（Ｐｉｌｃｈら、２００６）。このペプチドは、アルギニン残基を持たず（配列はＣＧＬＩＩＱＫＮＥＣ（配列番号１８）である）、そしてまたランダム配列によって任意の内在化が得られるはずである。９６ファージクローンのランダムセットのＤＮＡ配列決定を使用して、ライブラリーの質を評価する。
ｖｉｉ．ライブラリースクリーニング
ｉｎ ｖｉｔｒｏファージディスプレイスクリーニングを、培養前立腺癌細胞（ＰＰＣ１、ＰＣ３）および乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５）に対して行う。腫瘍細胞（１０６細胞）を、１０１０ｐｆｕのファージライブラリーと３７℃で２時間インキュベートし、その後に１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭで十分に洗浄して非結合ファージを除去する。ファージをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬＴ５４０３細胞中で増幅させ、ＰＥＧ−８０００沈殿によって精製する。４ラウンドの選択を行う。内在化したファージの可能な不活化に取り組むために、ＰＣＲおよびペプチドをコードするインサートのＴ７ベクターアームへのバッククローニングによって別のファージレスキューを行う。この選択スキームにより、ＣｅｎｄＲ取り込みを活性化することができる細胞外プロテアーゼに感受性を示すペプチドをディスプレイするファージが富化される。異種移植片腫瘍（上記列挙の細胞株由来）を保有するマウスへの１０１０個のファージの静脈内注射および１０分後〜２時間後の組織の回収（プロテアーゼを異なる有効時間でペプチドに作用させるため）によってｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングを行う。ファージをレスキューし、上のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングに記載のように分析する。ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングとｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングとの組み合わせも使用する。
最後の選択ラウンド後、プール由来の９６個のランダムファージクローンを配列決定し、任意のドミナントペプチドモチーフを同定する。Ｃ末端アルギニンをディスプレイする配列（アルギニン残基の後に終止コドンが存在するため）を破棄する。これは、スクリーニングにおけるその選択が既に曝露したＣ末端アルギニンによって生じる可能性があるからであった。図１Ｃに示す結果によれば、これらのファージは、ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング由来の選択された全プールの半分から２／３を示す。Ｃ末端アルギニンを有するファージが腫瘍に到達する前に他の組織に結合するので、おそらくこれはｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングにそれほど由来しないだろう。残りのファージクローンの中から、各ドミナントモチーフを示す３クローンを個別に分析する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、細胞結合、低温に対する結合感受性、およびα２−マクログロブリン（一般的なプロテアーゼインヒビター）、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド（ＡＥＢＳＦ、セリンプロテアーゼインヒビター、Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ペプスタチンＡ（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ）（アスパラギン酸プロテアーゼインヒビター、Ｓｉｇｍａ）、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＦＭＫ（システインプロテアーゼインヒビター、Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、アマスタチン（アミノペプチダーゼインヒビター、Ｓｉｇｍａ）を測定する。これらの試験は、ファージ内在化のプロテアーゼ依存性活性化を証明し、活性化を担うプロテアーゼの型を定義することができる。さらに、選択されたペプチドの結合および内在化におけるＣｅｎｄＲ経路の関与を同定する。以下の２つのアプローチを使用してこれを行う：（１）ＵＶ不活化ＣｅｎｄＲファージによるファージの結合および内在化の競合、および（２）ｓｉＲＮＡテクノロジーを使用して上記で同定されたＣｅｎｄＲ受容体がノックダウンされたＰＰＣ１細胞の使用。
ファージ研究に加えて、蛍光標識した基質ペプチドを、共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）研究のために調製する。接近した２つのフルオロフォアの吸収スペクトルおよび発光スペクトルが重複した場合にＲＥＴクエンチングが起こる。クエンチング量は、分子間の距離およびスペクトルの重複範囲に依存する。ペプチド切断を評価するために、ペプチドの異なる末端を公知のフルオロフォア／クエンチャー対（例えば、ＤＡＢＣＹＬ／ＥＤＡＮＳまたはＡｂｚ／３−ニトロ−Ｔｙｒ）で標識し、ペプチドを細胞とインキュベートし、蛍光強度の変化を測定する。ファージ研究のための上記列挙の一連のプロテアーゼインヒビターを使用して、切断を担うプロテアーゼファミリーを同定する。
ファージクローンを、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍ホーミングについても試験する。腫瘍中および正常組織中のファージの滴定によってホーミング効率を測定する。抗Ｔ７抗体を使用して組織中のファージの存在を分析し、この分析により、組織中のファージが関連する細胞型および細胞に内在化されるかどうかに関する情報が得られる。
これらのスクリーニングにより、新規の腫瘍特異的ＣｅｎｄＲ配列を得ることができる。ホーミングペプチドがＣｅｎｄＲ配列内に包埋されているか、キメラペプチド中でこの配列と協力している混合配列も認められる。かかる組み合わせ機構によって標的組織に結合するペプチドは、組成物の選択的細胞内送達のための特に良好なビヒクルであり得る。プロテアーゼ切断可能基質の同定を使用して、切断を担うプロテアーゼを同定することもできる。これらのプロテアーゼは、疾患の進行に機能的に重要であることを証明することができ、それ自体が重要な新薬開発につながる標的であり得る。
ｖｉｉｉ．ナノ粒子を血管外遊出させる細胞およびペプチドからの組成物の排出を促進するペプチドの単離
種々の組成物の有効な血管外遊出および組織透過は、細胞の内在化および排出機能の両方を使用する。細胞からの組成物の排出は、細胞分泌経路からの強奪に依存し得る。排出のために適用することができる経路は複数存在する可能性があり、これらの経路のうちのいくつかは細胞および組織型に特異的であり得、潜在的に薬物送達にさらなる選択肢を提供することができる。Ｃ末端則を、細胞からの排出を媒介することができるペプチド配列のスクリーニングに適用することができる。この目的を達成するために、ランダムペプチド、その後にＣ末端アルギニンを有するＣｅｎｄＲエレメントをディスプレイするＴ７ライブラリー（ＸＣｅｎｄＲライブラリー）を作製する。Ｃ末端アルギニンはファージを無作為に細胞内在化させる。排出機能を有するペプチドをディスプレイするファージのみが細胞を遊離することができるので、排出機能についてのスクリーニングを作製する。細胞を排出することができるファージを選択できる方法がいくつか存在する。最も簡潔なアプローチは、最初のライブラリー結合および内在化の後に細胞の培養培地中に出現するファージを同定し、洗浄して非結合ファージを除去することである。この系により、１つを超える侵入／排出サイクルが可能なファージを選択することも可能である。このスクリーニングでは、ファージを一方の細胞プールに結合させ、その後にこれらの細胞培養物を選別タグを保有する同一細胞の別のプールと混合する。第２の細胞プールからファージを回収する。このスキームは、侵入―排出サイクルを繰り返すことができ、それにより、組織透過エレメントとして作用するペプチドに選択性を示す。
細胞型特異的細胞排出シグナルの存在の可能性も調査する。２つの異なる細胞株を使用して選択を行うことを除いて、一般的な排出促進タンパク質についての上記スクリーニングの異型を使用する。細胞株Ａに特異的な排出エレメントのスクリーニングでは、ＸＣｅｎｄＲ−ライブラリーとインキュベートし、その後に細胞株Ｂと共培養し、培養物を拡大し、細胞株Ｂから細胞内ファージを回収する。この方法で選択したペプチドは普遍的に内在化するが、既存の細胞株Ａのみを排出することができ、Ｂを排出できない。細胞型特異的排出ペプチドは、ペイロード送達にさらなる選択を与えることができる。例えば、非癌細胞からのカーゴ排出を誘発するペプチドを使用して、血管外遊出、組織透過、および腫瘍細胞の選択的ターゲティングが達成される。
血管外遊出は、ナノ粒子の組織透過の第１工程である。これは、内皮細胞および周皮細胞の透過だけでなく、密な細胞外基質構造（基底膜およびコラーゲンリッチマトリックス）の透過も含む。血管外遊出促進ペプチドモチーフを保有するファージを、ＸＣｅｎｄＲライブラリーを注射したマウスの標的組織から顕微解剖によって単離する。
Ｔ７ファージライブラリー（ＸＣｅｎｄＲライブラリー）を、細胞排出誘発ペプチドの同定のために構築する。ランダムヘプタマーライブラリーによってＣ末端ＣｅｎｄＲペプチド（ＲＰＡＲＰＡＲ、配列番号２）をＮ末端側に隣接させ、このライブラリーをディスプレイするファージを、ＣｅｎｄＲ経路によって内在化させる。他方では、排出機能を有するペプチドをディスプレイするファージは、細胞を遊離することができる。侵入／排出過程が不可逆性プロセシング（例えば、タンパク質分解）を含む限り、侵入／排出サイクルは数回繰り返すことができる。
一般的な排出促進ペプチド配列を同定するための実験ストラテジーを図７のパネルＢに概説する。ライブラリーを５×１０６個のＰＰＣ１前立腺癌細胞と４℃で最初にインキュベートして、ファージを細胞表面に結合させる（４℃でインキュベーションして、ファージ不活化リスクの可能性があるファージの内在化／排出サイクルの反復を回避する）。最初の選択ラウンド中に、ライブラリーの多様性の約２０倍である入力ファージ数（典型的には１０１０プラーク形成単位）を使用する。非結合ファージを除去するための１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭでの十分な洗浄後、細胞を３７℃で種々の時間インキュベートし（細胞死の一因になるのを防止するため、できるだけ短時間維持する）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＴ５４０３細胞の感染によってファージを培養上清からレスキューする。このファージプールは、排出シグナルをディスプレイするファージを含むことができ、スクリーニングの繰り返しによりこのファージを富化することができる。
１つの細胞から排出された後に別の侵入が可能なファージを単離するために、最初のスクリーニング部分を上記のように行うが、結合工程および洗浄工程後に、１０倍過剰のＧＦＰで安定にトランスフェクトしたＰＰＣ１細胞を添加し、その後に３７℃で１時間インキュベートする。十分な洗浄後、ＧＦＰ＋細胞をＦＡＣＳによって単離し、これらの細胞中のファージを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＴ５４０３細胞の感染および／またはＴ７ファージへのＰＣＲベースのバッククローニングによってレスキューする。各選択ラウンド中に、ファージ回収数を、感染ファージの滴定およびファージＤＮＡのｑＰＣＲによって評価する。候補排出モチーフを保有するファージを、ライブラリー選択中の同一のストラテジーを使用して個別に評価する。このアプローチは、１つを超える侵入／排出サイクルが可能なファージを選択し、ナノ粒子の細胞排出が可能なペプチドエレメントを同定することができる。
上記のスクリーニングストラテジーの異型を実施して、可能な細胞型特異的排出シグナルを調査する（図７、パネルＢ）。正常なマウス器官（肝臓、腎臓、前立腺）、臍帯から単離した正常なヒト血管内皮（ＨＵＶＥＣ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、前立腺癌細胞株（ＰＣ３、Ｄｕ１４５；共にＡＴＣＣ）、および乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＡＴＣＣ）から調製した細胞懸濁液の排出シグナルを調査する。細胞型特異的排出ペプチドを同定するために、５×１０６個の標的細胞を多様性が２０倍のＸＣｅｎｄＲライブラリー（典型的には、１０１０プラーク形成単位）と４℃でインキュベートし、その後に１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭで十分に（４回）洗浄して非結合ファージを除去する。次いで、標的細胞を１０倍過剰のＧＦＰ発現ＰＰＣ１細胞（高ＣｅｎｄＲ経路活性を有することが公知である）と３７℃で１時間共培養する。この工程中、ＰＰＣ１細胞は、最初の標的細胞から排出されたファージを内在化する。インキュベーション後、ＰＰＣ１細胞を分類し、酸で洗浄し（表面結合ファージを除去するため）、Ｔ７バクテリオファージの感染および／またはＰＣＲベースのバッククローニングによって細胞内ファージをレスキューする。得られたファージは、標的細胞に侵入／排出されるペプチドをディスプレイするはずであるが、ＰＰＣ１細胞を侵入することのみができ、排出することができない。異なる細胞型の他の組み合わせを、同一の様式で試験する。内皮細胞に侵入および排出することができるが、腫瘍細胞に侵入のみして排出することができないペプチドが腫瘍ターゲティングペプチドとして特に興味深いので、内皮細胞と腫瘍細胞との組み合わせは特に注目されるであろう。
最後に、ＸＣｅｎｄＲライブラリーをｉｎ ｖｉｖｏでスクリーニングして、血管からの血管外遊出を駆動するペプチドを同定する。ＨＵＶＥＣ排出／ＣｅｎｄＲペプチドを有する各ファージの血管外遊出能力を調査する。曝露したＣｅｎｄＲペプチドを有するライブラリーがｉｎ ｖｉｖｏで全ての血管に結合すると予想されるので、最初のスクリーニングを行い、尾静脈注射後にファージが最初に遭遇する標的器官（心臓および肺）を使用してテクノロジーを至適化する。次いで、ファージを左心室に注射して心臓および肺による優先的取り込みを回避する（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，２００４）。ｉｎ ｖｉｖｏ血管外遊出スクリーニングのために、塩化セシウム超遠心分離を使用して精製した高濃度のライブラリーを使用する（高度に精製されたファージによって非精製またはＰＥＧ８０００沈殿させたファージ調製物よりも良好なスクリーニング結果が得られることが見出されている）。２００μｌを超えない総体積の１０１１ｐｆｕ／マウスのライブラリーを注射する（圧力誘導性の血管ストレスおよび損傷を回避するため）。血管外遊出および組織透過させるためにファージを３時間循環させた後、組織を瞬間凍結し、３０μｍの切片にする。組織切片を−２０℃メタノールで１分間固定し、対比染色する。ＰＡＬＭ顕微解剖システム（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して血管構造を除去する。かかる処理がファージ生存に適合すると判断されている。除去した血管を有する組織切片を非イオン性界面活性剤（１％ＮＰ４０を含むＬＢ細菌成長培地）に溶解し、ファージをレスキューする。数ラウンドの選択後、各評価のために候補ファージを選択する。各ファージの血管外遊出を、Ｔａｑｍａｎプローブおよびプライマー組を使用した多重ｑＰＣＲ（ＢｉｏＲａｄ ＩＱ５装置）を使用して評価して、両ファージクローンのＤＮＡコピー数を定量する。ｑＰＣＲのための内部コントロールとして、Ｇ７ファージを監査ファージと同時注射する。標的組織ファージ中の候補血管外遊出ファージの分布も、抗Ｔ７抗体での免疫染色によって研究する。
ファージのライブラリースクリーニング段階および潜在的な血管外遊出ペプチドをディスプレイするファージの同定／確証後、合成ビオチン化ペプチドを調製し、量子ドット（Ｑｄｏｔ（商標）６０５ ＩＴＫ−ＳＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合体化する。肝臓細胞中の量子ドットの内在化／排出を、回転円盤共焦点顕微鏡を使用してリアルタイムで評価する。量子ドットを保有する細胞型特異的排出（およびＣｅｎｄＲ）エレメントを、同一の画像化システムを使用して分析し、異なる蛍光標識を保有する細胞の混合培養物を使用して、細胞型選択性排出を研究する。レンチウイルス発現系を使用して、細胞に迅速に導入することができる一連の蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、Ｖｅｎｕｓ）を発現させて蛍光亜株を生成する。ｉｎ ｖｉｖｏ評価のために、ペプチドコーティングした量子ドットを静脈内注射し、３時間の循環後に器官を回収し、瞬間凍結し、免疫蛍光染色のために処理する。ＴＲＩＴＣフィルターセットを使用して量子ドットを観察し、同一切片を、一連の細胞型特異的マーカー（内皮細胞のためのＣＤ３１、腫瘍細胞のための上皮膜抗原／ＥＭＡ、マクロファージのためのＣＤ１１ｂ、ならびにリンパ内皮細胞のためのポドプラニンおよびＬＹＶＥ−１）およびＡｌｅｘａ４８８色素に結合体化した二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でも染色する。
このストラテジーを、排出することが公知の特殊な細胞排出シグナルを明らかにするためにデザインする。ペプチドディスプレイスクリーニングにより、細胞からの排出を媒介するためにこれらの経路を使用することができるペプチドを明らかにすることができる。これは全く新しいアプローチであり、血管外遊出を引き起こしてある細胞から別の細胞に種々の組成物を移動させるのに極めて有用であるシグナルを明らかにすることができる。
ｉｘ．癌のための実験的療法の考案によるプロテアーゼ誘発Ｃ末端則アプローチの有効性の証明
上に詳述した結果は、ナノ粒子、バクテリオファージ、および量子ドットのうちの２種を送達用のＣ末端則ベースのペプチドの使用によって細胞内部に特異的に送達させることができることを示す。デキストランコーティングおよびペグ化された５０ｎｍ酸化鉄ナノ粒子を足場として使用して多機能性送達ビヒクルを構築する。他のビヒクルは、ｓｉＲＮＡ送達用の類似の足場を使用した（Ｍｅｄａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ホーミングペプチドにより、ターゲティング機能および内在化機能が得られる。ｉＲＧＤペプチドをナノ粒子上のターゲティングエレメントとして使用する。何故なら、このペプチドは、腫瘍血管および腫瘍細胞への特異的ターゲティングと標的細胞へのペイロードの内在化を組み合わせているからである。他の単一またはキメラのホーミングおよびＣｅｎｄＲエレメントペプチドも使用することができる。同様に、血管外遊出および組織への拡大を促進する任意のペプチドを、ナノ粒子に組み込むことができる。
ターゲティングペプチドは、さらに、画像化のための近赤外線フルオロフォアを運搬する。他の画像化法よりも小動物において容易且つ安価であるので、マウスにおいて光学的画像化が好ましい。しかし、酸化鉄コアにより、ヒト患者における最適な方法であるＭＲＩ使用の選択肢が得られる。ペイロードを特定の表面に連結する。ｓｉＲＮＡを使用することができる。このｓｉＲＮＡは、いわゆる「新薬の開発につながらない」標的を調整することが可能であるので、多数の疾患（癌が含まれる）の治療で大きな可能性がある（Ｕｐｒｉｃｈａｒｄ，Ｓ．Ｌ．，２００５；Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎら、２００６）。粒子のエンドソーム回避機能も使用することができる。フルオレセイン標識ｉＲＧＤで処理した細胞由来の核シグナルが見出されている。
量子ドット足場の類似のｓｉＲＮＡ送達ベクターが構築されている（Ｄｅｒｆｕｓら、２００７）。ｉＲＧＤペプチドが腫瘍へのファージおよび蛍光ペプチドの送達ならびにｉＲＧＤおよびＦ３ファージの直接比較において非常に有効であるという事実に基づいて、ｉＲＧＤナノ粒子は、非常に増強されたホーミングおよび内在化活性を示し得る。
別の選択肢は、ｓｉＲＮＡ送達のために他でも使用されているリポソームである（例えば、Ｐｉｒｏｌｌｏら，２００７）。ｓｉＲＮＡ送達のための多数の他の足場デザインが文献に示されている（例えば、Ｌｉ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，２００６；Ｂａｒｔｌｅｔｔら、２００７）。粒子足場は重要ではなく、ホーミング／内在化／血管外遊出エレメントの効率および特異性に基づいて系を構築する。
種々の薬物投与レジメンをｉｎ ｖｉｖｏで調査し、長期にわたる全身腫瘍組織量を特徴づける。長期にわたる粒子のｉｎ ｖｉｖｏ分布を、光学的画像化および組織磁化の測定によって研究する。ｓｉＲＮＡ抑制のための標的は、ｐ３２、ｇＣ１ｑＲ、またはＨＡＢＰとして公知のタンパク質である（Ｇｒｅｂｒｅｈｉｗｅｔら，２００２；Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら，２００４）。このタンパク質は主にミトコンドリアタンパク質であるが、いくつかの環境下で細胞表面にも発現する。ｐ３２は腫瘍ホーミングペプチドの１つの標的である。ホーミングペプチドＬｙＰ−１は、いくつかであるが全部ではない腫瘍中のリンパおよび腫瘍細胞を認識する（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら，２００２ａ；２００４）。腫瘍マクロファージの亜集団も高レベルでｐ３２を発現することが示されている。さらに、ｓｉＲＮＡでのｐ３２発現の抑制によって腫瘍細胞の代謝が解糖にシフトし、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞成長が減少し、腫瘍形成性が損なわれることが示されている。この標的の使用により、腫瘍におけるｐ３２発現の抑制における粒子の有効性を示す。ｐ３２が腎臓および膵臓中にて比較的高レベルで発現されるので（その腫瘍特異性の一部は細胞表面での発現に由来し、これは以前の結果にしたがって腫瘍に制限される）、これらの器官中のｐ３２レベルの測定によってターゲティングの選択性をモニタリングすることもできる。処置研究により、ｐ３２が腫瘍のｓｉＲＮＡ療法で可能性があるかどうかを明らかにすることができる。
ナノ粒子足場。アミノ基官能化デキストランコーティングした超常磁性酸化鉄ナノ粒子（５０ｎｍ ｎａｎｏｍａｇ−Ｄ−ＳＰＩＯ；Ｍｉｃｒｏｍｏｄ Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＧｍｂＨ，Ｒｏｓｔｏｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用する。ナノスフェアよりもむしろ「ナノワーム」（細長い酸化鉄粒子）を使用することができる。ナノワームは、より多くのペイロードを標的に運搬することができる（Ｐａｒｋら、２００８）。ナノワームの合成は、磁性ナノスフェア（ＮＳ）の典型的な調製（デキストランの存在下でのＦｅ（ＩＩ）塩とＦｅ（ＩＩＩ）塩との反応（Ｐａｌｍａｃｃｉ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ，１９９３）を含む）に類似する。ワーム様形態を達成するために、球状粒子の作製よりも鉄塩の濃度をより高くし、より高い分子量のデキストラン（２０ｋＤａ）を使用する。ナノワームは、５〜１０ＩＯコア（５０〜８０ｎｍ）の線状凝集体から構成される、細長いデキストランコーティングされた粒子である。本発明者らは、１〜２ＩＯコア（２５〜３５ｎｍ）を含む球状のデキストランコーティングされた粒子であるナノスフィアも作製することができる。リポソーム（ターゲティングされたリポソームなど）（Ｓｉｍｂｅｒｇら，２００７）を使用することができる。自己集合性ミセルも使用することができる。
ＰＥＧ、ペプチド、およびｓｉＲＮＡのナノ粒子への結合。循環半減期がＮＷおよびＮＳの両方についての表面アミン基の数（ペプチド結合体化のために使用される官能基）および表面電荷に非常に依存することが見出されている（Ｐａｒｋら，２００７）。文献に報告されているように（Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒら，１９９５；Ｍｏｇｈｉｍｉら，２００１）、表面アミン基数が増加し、それによって正味の粒子電荷が増加するにつれ、循環時間は減少する。遊離表面アミンはオプソニン化に関連する一定の血漿タンパク質を誘引することができ、中性付近の表面電荷（ゼータ電位）の維持は、血液半減期を延長するのに重要なようである。アミン化ナノ粒子へのＰＥＧの付着により、循環時間が増加し、これはおそらくオプソニン化に関与する血漿タンパク質の結合の減少に起因する（Ｍｏｇｈｉｍｉら，２００１）。粒子は、細網内皮系回避（ＰＥＧ）、ホーミングおよび内在化（ｉＲＧＤペプチド）、エンドソーム回避（ｐＨ感受性ペプチド（例えば、Ｐｉｒｅｌｌｏら，２００７））、フルオロフォア（Ｃｙ７など）、およびｓｉＲＮＡペイロード（おそらく血管外遊出促進ペプチドも）のための表面修飾を有することができる。１つの粒子におけるこれら全ての機能に適応するために、至適化研究を行ってこれらのエレメントのいずれか１つが占める粒子表面の利用可能な連結部位の比率を決定して、ターゲティング／内在化とペイロード送達との最良の組み合わせを得る。個別よりもむしろタンデムなこれらの化合物の結合の可能性のある利点も調査することができる。一方の極端においては、ホーミング／内在化ペプチドで、エンドソーム排出ペプチド、血管外遊出ペプチド、およびフルオロフォアを全て１つの化合物として合成し、ＰＥＧ部分を介して粒子に結合することができる。他方の極端は、これら全ての個別の結合である。スクランブルペプチドおよびコントロールｓｉＲＮＡを組み込んだ粒子を構築し、コントロールとして使用する。
ｉＲＧＤペプチドおよび他の最近の効率の高いホーミングペプチドは、ペプチド活性に不可欠のジスルフィド結合を有する環状ペプチドである。この問題を解決するための化学が開発されており、選択的側基保護を使用して、遊離スルフヒドリル基を示す余剰システインを有する環状ペプチドを合成する。これらのペプチドは安定であるように短縮されており、ジスルフィド結合の検出可能なスクランブルを持たない。マレイミド官能基を、結合基として使用することもできる。これらの化学的性質を使用して、ｉＲＧＤを粒子に結合する。ジスルフィド結合を使用して、ｓｉＲＮＡペイロードを粒子に結合する。以前の研究で、ジスルフィド架橋剤によってナノ粒子に付着したｓｉＲＮＡは、非還元性チオエーテル結合によって付着した場合よりサイレンシング効率が高いことが示された（Ｄｅｒｆｕｓら、２００７）。これはおそらく、還元細胞内環境下でｓｉＲＮＡが粒子から放出されるからである。
ｘ．ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのナノ粒子の取り込みおよび活性
培養細胞による結合および取り込みを、内在化および細胞内局在を決定するための共焦点顕微鏡法を使用した蛍光顕微鏡法によって研究する。静脈内注射したナノ粒子の循環時間を、種々の時間で回収した血液サンプル中の蛍光の測定およびＳＱＵＩＤ（超伝導量子干渉素子）磁気測定によって決定する。ＳＱＵＩＤは、サンプル中の（総イオン含有量よりもむしろ）磁性ＩＯナノ粒子の総数を直接測定し、測定はＭＲＩ画像化への適用に関連する。ＳＱＵＩＤを使用して、腫瘍および他の組織サンプル中のナノ粒子濃度も決定する。ｓｉＲＮＡの影響を、標的タンパク質および任意の抑制の特異性を確認するためのいくつかの非標的タンパク質の免疫ブロッティングによってモニタリングする。
ｘｉ．腫瘍モデルおよびターゲティングの分析
主な腫瘍モデルは、雌ヌードマウスの乳房脂肪体へのＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト癌細胞の移植によって生成した同所性乳癌異種移植片モデルである。ｉＲＧＤペプチドおよび別のターゲティングエレメントとして利用可能ないくつかの他のホーミングペプチドがこの腫瘍（ＣＲＥＫＡ、ＬｙＰ−１）に有効にホーミングするので、このモデルを選択した。さらに、このモデルは、ペプチドホーミングおよび腫瘍治療研究で広く使用されている（例えば、Ｌａａｋｋｏｎｅｎら，２００４）。
臨床的に関連する濃度（０．７ｍｇ〜２．６ｍｇ Ｆｅ／Ｋｇ体重）から開始して、ｓｉＲＮＡ保有ナノ粒子を、尾静脈を介してマウスに静脈内注射し、１、８、および２４時間後に麻酔下で生きた動物の光学像を取る。ナノ粒子注射から適切な時間の後に回収した器官を画像化し、ＳＱＵＩＤ分析に供してホーミングを定量する。ｓｉＲＮＡの影響を、上記の免疫ブロッティングによって決定する。多機能性ナノ粒子は、腫瘍を選択的にターゲティングし、活性なｓｉＲＮＡを腫瘍に送達させることが証明された。
腫瘍治療研究。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍保有マウス（１６〜２０週齢）をナノ粒子で処置するか、本明細書中に開示の他の適切な組成物を上記で考察した基準にしたがって選択する。マウス（１０マウス／群）に週に一度静脈内注射する。特異的ｓｉＲＮＡおよびコントロールｓｉＲＮＡを有する粒子の用量を決定し、腫瘍および毒性に及ぼすｓｉＲＮＡの影響をモニタリングする。毒性と比較して用量を決定する。ターゲティングしたナノ粒子の有効性および毒性を、投与頻度を週１回から週２〜３回まで増加させるレジメンで研究する。頻度が増加し、注射あたりの用量を低くすると、有効性および毒性の閾値がより有利である可能性がある（Ｋｅｒｂｅｌ ａｎｄ Ｋａｍｅｎ，２００４）。
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍のサイズを、実験終了時の腫瘍塊の寸法の測定および秤量によって容易にモニタリングすることができる。その腫瘍がマウスを顕著に不快にさせるサイズに到達した時にマウスを安楽死させる。研究に関与する研究者と無関係に、動物施設の職員が安楽死を決定する（Ａｒａｐら，２００２）。この取り決めにより、群の比較のための生存データが回収される。上記で考察した光学的（および潜在的にＭＲＩ）画像化法により、腫瘍サイズの測定または終点としての生存使用の代替法が得られる。画像化を使用して、デザインのばらつきを試験する能力を強化し、且つ迅速にすることが可能である。
さらなる有効性の基準として、リンパ管およびマクロファージ（腫瘍細胞に加えて、ｐ３２陽性の標的細胞）を定量する。リンパ管を、ＣＤ１１ｂ染色を用いた抗ＬＹＶＥ−１およびマクロファージを用いて分析する。ｐ３２陽性細胞がこれらの細胞系マーカーを発現することが示されている（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら，２００４；Ｆｏｇａｌ，Ｚｈａｎｇ，ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ／ Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐ３２／ｇＣ１ｑＲ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｓｔｒｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：７２１０−７２１８（２００８））。リンパ中の腫瘍細胞の存在も評価し、リンパに沿った腫瘍の拡大を巨視的および組織学的に評価する。リンパ管数の実質的な減少を検出可能である（Ｌａａｋｋｏｎｅｎら，２００４）。広範な壊死は腫瘍サイズの測定値を歪め得るので、顕微鏡検査によって腫瘍中の壊死を評価することもできる。
本明細書中で得られた情報により、ターゲティングされたナノ粒子テクノロジーを、臨床研究用の化合物を開発できる点に進めることができる。診断薬または治療薬を得る工程は、以下を含む：（１）ホーミングペプチドのヒト受容体に結合する能力を決定し、ヒト受容体分子への結合および薬物動態学的性質のためにペプチドを至適化する工程、（２）治療に適用するためにターゲティングされた組成物を開発する工程。モデル化合物として本明細書中に提案されたｐ３２ ｓｉＲＮＡをヒトの治療のために使用することができ、他のペイロードが運搬されるように調整することもできる。
Ｂ．（実施例２）Ｃ末端則：Ｃ末端アルギニンを曝露するペプチドおよびペプチドコーティングナノ粒子のニューロピリン−１依存性内在化
ペイロードの細胞型選択的内在化は、多数の生物学的過程ならびに薬物および造影剤のターゲティングされた薬物送達に重要である。ナノ粒子の細胞内在化および組織透過をＣ末端曝露したＲ／ＫＸＸＲ／Ｋ（配列番号２３）ペプチドモチーフによって達成することができることが確立されている。この現象を、Ｃ末端則（ＣｅｎｄＲ）と呼ぶ。Ｃ末端以外の位置にＲ／ＫＸＸＲ／Ｋ（配列番号２３）モチーフを含むペプチドは内在化されないが、かかる不顕性ＣｅｎｄＲペプチドの取り込みをタンパク質分解性切断によって誘発することができる。ＣｅｎｄＲペプチドは、ニューロピリン−１と呼ばれる重要な構成要素を含む機構によって細胞に侵入する。ニューロピリン−１は、血管系および神経系のパターン形成でのその役割で知られている多リガンド受容体である。各細胞型または組織に特異的なプロテアーゼ活性化送達系を開発するために、ＣｅｎｄＲテクノロジーを適用することができる。これは、ＣｅｎｄＲ機構に関与する病理学的過程（ウイルスおよび他の微生物の侵入ならびに細胞中のこれらの産物など）を干渉することもできる。
罹患組織、特に腫瘍への診断薬および治療薬の選択的ターゲティングは依然として重要な課題である。一続きのカチオン性アミノ酸は内因性タンパク質を形質導入し、ウイルスの感染および拡大に重要である。かかるタンパク質の例には、ホメオドメイン転写因子（アンテナペディア（Ｊｏｌｉｏｔ，Ａ．，ら １９９１）など）、単純ヘルペスウイルス−１タンパク質ＶＰ２２（Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｇ．ら １９９７）、およびヒト免疫不全ウイルス−１トランスアクチベーターＴＡＴタンパク質（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ら １９８８，Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．ら １９８８）が含まれる。これらのタンパク質由来の短いカチオン性細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、広範な以下のカーゴを内在化する能力を保持している：異種性のペプチドおよびタンパク質、核酸、ならびにナノ粒子（Ｌａｎｇｅｌ，Ｕｅｌｏ，２００７）。しかし、ＣＰＰは選択性を示さず、これらはほぼ全ての細胞型に取り込まれる。この選択性の欠如が、ＣＰＰの臨床的適用を厳しく制限している。シナフィック（ドッキングベースの）送達が可能な組織特異的内在化ペプチドも公知である（Ｌａａｋｋｏｎｅｎ，Ｐ．ら ２００２ｂ，Ｐｏｒｋｋａ，Ｋ．ら ２００２，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｊ．Ａ．ら ２００３，Ｊａｒｖｉｎｅｎ，Ｔ．Ａ．ら ２００７）。全てのＣＰＰについての細胞取り込み機構はあまり理解されていない。
タンパク質分解性スイッチにより、しばしば、生物学的過程におけるタンパク質活性が調整される（Ｅｓｍｏｎ，Ｃ．Ｔ．１９９３，Ｂａｒｒｅｔｔｗら １９９８，Ｓｔｅｒｎｌｉｃｈｔ，Ｍ．Ｄ．ら ２００１）。例には、血液凝固および繊維素溶解、成長因子およびペプチドホルモンの活性化、細胞死−生存の決定、ならびに細胞遊走および接着が含まれる。興味深いことに、細胞へのウイルス侵入および多数の細菌毒素の内在化はタンパク質分解性活性化によって調節され（Ｋｌｅｎｋ，Ｈ．Ｄ．ら １９９４，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｖ．Ｍ．ら，１９９５）、活性化プロテアーゼの発現パターンは、しばしば、標的細胞への侵入における決定要因である。
タンパク質分解性スイッチによって活性化することができる内在化系を本明細書中に記載する。この系は、内在化ペプチドモチーフＲ／Ｋ／ＸＸＲ／Ｋ（配列番号２４）に基づく。このモチーフは、活性であるためにポリペプチド鎖のＣ末端に存在しなければならない（それ故、用語Ｃ末端則またはＣｅｎｄＲ）。内在化受容体を、ニューロピリン−１（ＮＲＰ−１）と同定した。これは、タンパク質またはペプチド配列中に包埋された場合、潜在性Ｒ／Ｋ／ＸＸＲ／Ｋ（配列番号２４）モチーフをプロテアーゼによって曝露し、細胞取り込みを誘発することができることも示す。この所見は、ターゲティングされた薬物送達のために使用することができ、且つウイルス感染などの複数の生物過程で操作可能である細胞透過スイッチを強調する。Ｓｕｇａｈａｒａ，Ｋ．Ｎ．ら（２００８）は、組織特異的ターゲティングエレメントおよび潜在性ＣｅｎｄＲエレメントの両方を含む複合ペプチドを記載している。ターゲティングエレメントは、標的にペプチドを集中させ、ここで組織プロテアーゼがそのＣｅｎｄＲエレメントを曝露し、内在化および組織透過を容易にする。
１．結果
ｉ．Ｃ末端内在化エレメントの同定
ペプチドライブラリーのＣ末端ディスプレイをＴ７ファージの表面に使用して（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｊ．Ａ．ら，２００４）、ＰＰＣ−１ヒト前立腺癌異種移植片腫瘍由来の細胞へのナノ粒子の細胞内在化を誘発するペプチドを同定した。選択のために使用したペプチドライブラリーは、線状Ｘ７ライブラリー、環状ＣＸ７Ｃ、およびいくつかの内在化ホーミングペプチド中にも存在するＲＸＸＲ（配列番号２５）モチーフを含むようにデザインされた拘束ＲＸＸＲＸＸＸ（配列番号１９）ライブラリー（Ｘ、ランダムアミノ酸；Ｃ、システイン；Ｒ、アルギニン、図１０）であった。３ラウンドの選択後、選択されたファージプールは、７−グリシン（Ｇ７）コントロールペプチドをディスプレイするコントロールファージの５００〜１，３００倍ＰＰＣ−１細胞に結合した（図１０Ａ）。ランダムファージ単離物の配列決定により、最初のライブラリーの配置と無関係に、（Ｒ／Ｋ）ＸＸＲ（配列番号２６）状況におけるほとんどの場合、全てのライブラリーがＣ末端アルギニンをディスプレイするように変換されたことが証明された（図１０Ｂ）。Ｔ７ファージは酸性条件に感受性を示し、グリシン緩衝液（ｐＨ ２．５）での細胞の酸洗浄によって細胞外ファージが放出および不活化される。細胞を３７℃でインキュベート後に（Ｒ／Ｋ）ＸＸＲ（配列番号２６）モチーフをディスプレイするファージを回収し、酸性緩衝液で洗浄し、それにより内在化を示した。１つのペプチドは、Ｃ末端のリジン残基も活性ペプチドを産生することができることを示した。
選択されたプール由来の各ファージを使用した結合研究は、Ｃ末端アルギニン（Ｇ６Ｒなど）のみの存在がＰＰＣ−１細胞への弱いファージ結合に十分であった一方で（図１１Ａおよび１１Ｃ、パネルｄ）、頑強な結合および内在化がＲＸＸＲ（配列番号２５）モチーフ（ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）（図１１Ａ、１１Ｂ、および１１Ｃ、パネルｃ）、ＲＧＥＲＰＰＲ（配列番号２７）およびＲＶＴＲＰＰＲ（配列番号２８）（図１２Ａおよび１２Ｂ、パネルｃ、ｄ）など）の存在下で認められることを示した。内在化ＲＸＸＲ（配列番号２５）ペプチドの類似の構造および相互に競合する能力（図１２Ａおよび１２Ｂ、パネルｉ）により、共有の結合機構が示された。ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドを、次の研究でプロトタイプＣｅｎｄＲペプチドとして使用した。
内在化ペプチドの構造上の特徴を評価して、各アルギニン残基のＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージ結合への寄与を定義した。Ｃ末端アルギニン（またはリジン）はファージ結合に重要であり、他の２つの塩基性アミノ酸が用量および位置依存性様式で内在化を増加させることが示された（図１１Ａおよび１１Ｂ）。ファージ粒子と区別可能な様式でＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）機能付与された量子ドット（ｑドット）が結合して内在化されたので、細胞との相互作用は他のファージエレメントに関与しなかった。（図１１Ｃ、パネルｆ、ｇおよび図１３、パネルａ、ｆ）。興味深いことに、Ｄ型アミノ酸（Ｄ−ｒｐａｒｐａｒ）から構成されるペプチドは量子ドットの取り込みを誘発する能力が非常に減少し（図１３、パネルｄ）、これは、キラル結合部位の関与を示した。Ｃ末端ＲＸＸＲ（配列番号２５）エレメントのさらなるＣ末端アミノ酸（ＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号３）など）でのマスキングにより、ＰＰＣ−１細胞へのファージの結合が消失した（図１１Ｂ）。ＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号３）ファージの結合を、トリプシン（塩基性残基の後を切断し、おそらくＣ末端アルギニンを曝露する；図１４）でのペプチドの処理によって修復した。ｑドットの内在化を、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドのＣ末端へのアラニンの付加によって同様に防止した（図１３、パネルｂ）。Ｃ末端カルボキシル基のアミド化によってもｑドット内在化がブロックされた（図１１Ｃ、パネルｃ）。これらの所見は、遊離カルボキシル基を有する末端塩基性アミノ酸の存在下で内在化が起こることを示す。まとめると、ライブラリースクリーニングおよび構造−機能研究により、ＣｅｎｄＲモチーフ（Ｒ／Ｋ）ＸＸ（Ｒ／Ｋ）（配列番号２９）をＰＰＣ−１細胞へのペプチドおよびナノ粒子取り込みの誘発因子と定義する。
ｉｉ．ＣｅｎｄＲ内在化の特徴付け
ＣｅｎｄＲ内在化機構の保存を評価するために、異なる標的細胞（一連の培養ヒト細胞株およびいくつかの正常なマウス器官由来の初代細胞）へのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）およびその誘導体の結合を研究した（図１５）。異なる起源の腫瘍細胞は、ＲＰＡＲＰＡＲ−ファージに結合した（ＰＰＣ−１以外の前立腺癌細胞（ＰＣ−３、Ｄｕ−１４５）、乳癌（４Ｔ１）、および膵癌（ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＰＤＡＣ１．３）、黒色腫細胞（Ｂ１６Ｆ・０）、およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト癌細胞が含まれる）。ＣｅｎｄＲファージ結合はまた、マウス血管内皮細胞（Ｆ２）およびヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と共に認められた。例外はＭ２１黒色腫細胞であり、コントロールファージよりもＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージに結合しなかった。一連の正常マウス器官由来の初代細胞もＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージに結合した（図１５Ｂ）。乱雑な結合と一致して、静脈内注射されたＲＰＡＲＰＡＲファージは最初に遭遇した血管床中に非常に蓄積した（肺および心臓（より低い程度）において）（図１５Ｃ）。肺では、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）についてのファージ免疫反応性が組織の至るところで認められ（図１５Ｄ、パネルｄ）、コントロールファージでは認められなかった（図１５Ｄ、パネルｅ）。これは、ＣｅｎｄＲファージは血管を裏打ちする細胞に結合して内在化するだけでなく、組織の実質も透過することができることを示した。したがって、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドは、種々の細胞型に侵入して組織透過を促進することもできる内在化ペプチドである。
４℃でのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの細胞への結合は迅速であり、２０分後にプラトーに達した（図１６Ａ）。３７℃では、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージおよびｑドットは、細胞添加の１５分後に細胞膜会合を示し、１時間後に核周囲の蓄積を示した（図１６Ｂ、パネルｂ、ｃ）。細胞内蓄積がプロセシング人工産物に起因することを除いて、かかるｑドット内在化は、生きた、非固定の細胞と共に見出された（図１６Ｂ、パネルｂ、ｃ）。
以下の種々のエンドサイトーシス経路の一連のインヒビターも研究した：クラスリン依存性取り込み（クロロプロマジン）、カベオラエンドサイトーシス（ゲニステイン、ナイスタチン）、およびマクロ飲作用（５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロライド、およびウォルトマンニン）。これらのインヒビターはＣｅｎｄＲペプチドの取り込みに影響を及ぼさなかった（図１７Ａ）。同様に、一連の細胞内区画マーカーでの内在化ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの同時染色により、いかなる明確な染色パターンの重複も認められなかった（図１７Ｂ）。興味深いことに、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージ免疫反応性および標識したコレラ毒素サブユニットＢの分布が有意に重複した（図１７Ｃ）。コレラ毒素サブユニットＢのエンドサイトーシス経路が依然として定義されないにもかかわらず、ダイナミンと無関係であり、クラスリン依存性および非依存性機構の両方を含むことが示される（Ｔｏｒｇｅｒｓｅｎ，Ｍ．ら ２００１）。
ｉｉｉ．ＣｅｎｄＲ内在化はＮＲＰ−１に依存する
結合前のＰＰＣ−１細胞のトリプシン処理によってＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージ粒子の結合が減少した（データ示さず）。これは、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）の結合および内在化における細胞表面タンパク質の関与を示す。細胞表面グリコサミノグリカンとの相互作用は、カチオン性ＣＰＰの内在化に関与する（Ｔｙａｇｉ，Ｍ．，ら ２００１，Ｓａｎｄｇｒｅｎ，Ｓ．ら ２００２）。しかし、酵素消化（ヘパリナーゼＩＩＩおよびコンドロイチナーゼＡＢＣ）ならびにヘパリンおよびコンドロイチン硫酸との競合は、ＰＰＣ−１細胞へのＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージ結合に影響を及ぼさなかった（データ示さず）。他の潜在的なＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）相互作用タンパク質を同定するために、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドに対するアフィニティクロマトグラフィによる分画ＰＰＣ−１腫瘍異種移植片抽出物をアガロースビーズ上に固定した。遊離ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドを含む緩衝液での溶離によって１３０ｋＤａタンパク質が放出され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によってＮＲＰ−１と同定された（図１８Ａ）。
いくつかの証拠がＣｅｎｄＲ受容体としてのＮＲＰ−１の役割を支持していた。ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）に結合も内在化もしないＭ２１黒色腫細胞は、微量のＮＲＰ−１を発現した。ＮＲＰ−１の強制的発現によってこれらの細胞がＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージに結合および内在化することができるようになったのに対して（ＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号３）ファージではできない）（図１８Ｃ、パネルｅ、ｆ）、ＮＰＲ−１結合ポケット変異体でトランスフェクトした細胞（Ｖａｎｄｅｒ Ｋｏｏｉ，Ｃ．Ｗ．ら，２００７）はＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）結合を付与しなかった（図１８Ｂ）。最後に、免疫蛍光同時染色は、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージおよびｑドットがＮＲＰ−１と共に細胞表面および細胞内に同時内在化することを示した（図１８Ｃ、パネルｃ〜ｅ）。
ＶＥＧＦ−１６５は、エクソン８（ＣＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号３０））によってコードされるＣ末端Ｃｅｎｄ様配列を使用してＮＲＰ−１に結合する（Ｊｉａ，Ｈ．ら ２００６，Ｓｏｋｅｒ，Ｓ．ら １９９８）。いくつかの他のペプチド（Ａ７Ｒ（ＡＴＷＬＰＰＲ（配列番号３１））（Ｓｔａｒｚｅｃ，Ａ．ら ２００６）、免疫調節ペプチドタフトシン（ＴＫＰＲ（配列番号３２））、およびそのバリアントである増強タフトシン（ＴＫＰＰＲ（配列番号３３））など）（ｖｏｎ Ｗｒｏｎｓｋｉ，Ｍ．Ａ．ら ２００６）は、ＮＲＰ−１の同一部位に結合する（Ｇｅｒｅｔｔｉ、Ｅら ２００８）。ＶＥＧＦ−１６５の７つのＣ末端アミノ酸、増強タフトシン、またはＡ７ＲをディスプレイするＴ７ファージはＰＰＣ−１細胞に結合して取り込まれ、非標識ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドを結合緩衝液に含む場合またはアラニン残基をＶＥＧＦ−Ｃ７のＣ末端に付加する場合に結合および内在化が減少した（図１９）。これらの研究は、重要な構成要素としてＮＲＰ−１を含む経路を介してＣｅｎｄＲペプチドを内在化することを示した。
ｉｖ．タンパク質分解による潜在性ＣｅｎｄＲモチーフの活性化
Ｃ末端則の刺激的な意味は、タンパク質分解的に活性化された内在化ペプチド（ｐｒｏ−ＣｅｎｄＲ）を合理的にデザインできることである。上に示すように、トリプシンでのＲＰＡＲＰＡＲＡ（配列番号３）ファージの処理により、細胞へのファージの結合が１００倍を超えて増加し（図１４）、これは、不顕性ＣｅｎｄＲエレメントのアンマスキングのためにタンパク質分解を使用することができることを示した。ヒトデグラドームは５５０種を超えるプロテアーゼを含み（Ｐｕｅｎｔｅ，Ｘ．Ｓ．ら ２００３）、その多数がＣ末端のアルギニン残基およびリジン残基を曝露し、高度に定義された標的配列という状況で曝露する。かかるプロテアーゼを使用して、標的細胞選択性プロ−ＣｅｎｄＲ活性化を達成することができる。ウロキナーゼ型アクチベーター（ｕＰＡ）は、発達中および病的状態（腫瘍の侵入および転移、血管新生、および炎症など）での組織再構築で重要な細胞周囲のタンパク質分解カスケードで中心的役割を果たす（Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，Ｐ．Ａら ２０００，Ｗａｉｓｍａｎ，２００３）。ｕＰＡ活性と腫瘍との関連、その強い基質特異性、およびＰ１残基としてのアルギニンに対するその優先性により、ｕＰＡをプロ−ＣｅｎｄＲ活性化の魅力的な候補にしている。
ｕＰＡ認識部位（Ｋｅ，Ｓ．Ｈ．ら １９９７）および不顕性ＣｅｎｄＲエレメントを組み込んだペプチドをデザインした（ＲＰＡＲＳＧＲＳＡＧＧＳＶＡ（配列番号３４）、ＣｅｎｄＲ配列に下線、図２０Ａ）。ｕＰＡ切断可能ＣｅｎｄＲ（ｕＰＡ−ＣｅｎｄＲ）ペプチドをディスプレイするファージはコントロールＧ７ファージよりもＰＰＣ−１細胞に結合しなかったが、細胞結合の前のｕＰＡでの前処理によって結合は１００倍を超えて上昇した（図２０Ｂ）。ＲＰＡＲＳＧＲＳＡＧＧＳＶＡ（配列番号３４）でコーティングしたｑドットも、ｕＰＡ感受性様式で内在化された（図２０Ｃ、パネルｃ〜ｅ）。ｕＰＡ−ＣｅｎｄＲファージのトリプシンへの曝露によって結合が非常に増強されるが、コラゲナーゼ−Ｉまたはトロンビンでのファージ処理は影響を及ぼさなかった。トロンビンが塩基性残基の後を切断するにもかかわらず、トロンビンはペプチド中のｕＰＡ基質配列を見かけ上認識しなかったのに対して、トリプシンは切断するのに十分に乱雑であった。これらの研究は、プロテアーゼによって潜在性ＣｅｎｄＲペプチドをアンマスキングし、内在化ペプチドに変換することができることを示した。さらに、制限された発現パターンを有するプロテアーゼを、ＣｅｎｄＲペプチドの内在化機能の標的特異的活性化のために使用することができる。アミロライドは取り込みを阻害した（図２０Ｃ、パネルｅ）。
２．考察
研究により、ＣｅｎｄＲと呼ばれる以前に認識されていなかった細胞内在化経路が明らかとなった（図２１）。ＣｅｎｄＲの顕著な特徴は以下である：（ｉ）Ｒ／ＫＸＸＲ／Ｋ（配列番号２３）認識モチーフ、（ｉｉ）結合および内在化活性のためのモチーフのＣ末端曝露、（ｉｉｉ）結合および内在化におけるＮＲＰ−１の関与、および（ｉｖ）タンパク質分解性プロセシングによる潜在性ＣｅｎｄＲモチーフの活性なＣｅｎｄＲモチーフへの変換。
心臓−ホーミングペプチド群は、曝露したＣｅｎｄＲモチーフ（Ｚｈａｎｇ、Ｌ．ら ２００５）を含むが、ＣｅｎｄＲモチーフはまた潜在性であり得る。細胞透過性を有するいくつかの腫瘍ホーミングペプチドは潜在性ＣｅｎｄＲモチーフを含む（Ｌａａｋｋｏｎｅｎ，Ｐ．，ら ２００２ｂ；Ｐｏｒｋｋａ，Ｋ．ら，２００２；Ｊａｒｖｉｎｅｎ，Ｔ．Ａ．ら ２００７；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ら ２００６）。ＣｅｎｄＲモチーフに加えて、これらのペプチドは、特異的受容体に結合する配列を保有する。（Ｓｕｇａｈａｒａ，Ｋ．Ｎ．ら，２００８）に記載のインテグリン結合ｉＲＧＤペプチドにより、どのようにしてかかるペプチドが作用するのか（特定のホーミングエレメントが標的（腫瘍）のペプチドに集中し、プロテアーゼがＣｅｎｄＲモチーフを曝露し、その後にＮＲＰ−１結合によってペプチド（およびそのペイロード（存在する場合））の細胞取り込みが起こる）が説明される。
多数のカチオン性ＣＰＰは、活性または潜在性ＣｅｎｄＲエレメント（Ｌａｎｇｅｌ，２００７）を含む。ＣｅｎｄＲモチーフを有するＨＩＶ−１ ＴＡＴタンパク質の塩基性ドメインはＶＥＧＦＡ−１６５のＮＲＰ−１への結合を阻害するが（Ｊｉａ，Ｈ．ら ２００１）、カチオン性ＣＰＰの結合および取り込み機構は依然として明らかではない。カチオン性ＣＰＰとＣｅｎｄＲペプチドとの間の最も重要な相違は、Ｄ型アミノ酸から構成されるＣＣＰが活性であるのに対して（Ｐｏｌｙａｋｏｖ，Ｖ．ら ２０００，Ｇａｍｍｏｎ，Ｓ．Ｔ．ら ２００３）、本明細書中の結果はＣｅｎｄＲ取り込みがＬ型ペプチドのみの特異的認識に依存することを示すことである。また、多数のＣＰＰはＣ末端係留カーゴを内在化することができ、これは、コアＣｅｎｄＲの概念と明確に対照的である。ＣｅｎｄＲがカチオン性ＣＰＰの取り込みに関連し得るいくつかの並行経路の１つである可能性がある。
ＣｅｎｄＲ媒介性内在化系の生理学的有意性は十分に理解されていないが、ＣｅｎｄＲエレメントはプロテオームの至るところに存在し、多数のセリンおよびシステインプロテアーゼはこれらを活性化することができる（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａｌａｎら １９９８）。プロタンパク質コンバターゼおよび膜プロテアーゼ（マトリプターゼなど）が特に関連し得る。これは、これらの酵素による切断が種々の内因性タンパク質（ペプチドホルモン、成長因子、接着分子、プロテアーゼ）のＣ末端でＲＸＸＲ（配列番号２３）配列を曝露するからである（Ｔｈｏｍａｓ，Ｇ．，２００２，Ｕｈｌａｎｄ，Ｋ．２００６）。ＮＲＰ−１共受容体機能、受容体活性化、および活性タンパク質の細胞取り込みを可能にすることは、生理学的ＣｅｎｄＲ配列の考え得る機能である。
ウイルスおよび他の微生物は、感染の促進因子として強奪されたＣｅｎｄＲ機構を有するようである。ＣｅｎｄＲエレメントの曝露を伴うウイルスコートタンパク質のタンパク質分解性切断は、多数のウイルス病原体の感染性の繰り返し登場する論題のようである（表２）。
遍在的に発現するプロテアーゼであるフューリンによるウイルス表面タンパク質の切断は、いくつかのウイルスの全身的拡大に対する重要な寄与因子であるのに対して、発現パターンが制限されたプロテアーゼに感受性を示すウイルスの感染性は適切なプロテアーゼを発現する組織に感染が制限され得る。この概念は、インフルエンザウイルスで例示されている（Ｓｔｅｉｎｈａｕｅｒ，Ｄ．Ａ．ら１９９９）。局所的感染性を示す哺乳動物および非病原性トリインフルエンザウイルスの赤血球凝集素は単一のアルギニン残基で切断され、かかる切断は限定された細胞型（気道および消化管の細胞型など）に制限される。対照的に、全身性感染を引き起こす病原性トリインフルエンザウイルスは、フューリンによって活性化されて多塩基ＣｅｎｄＲエレメントを曝露する。病原体およびその産物のＣｅｎｄＲ媒介性内在化および組織透過の阻害によって感染症と戦う新規の方法を得ることができると本明細書中に示す。
ＣｅｎｄＲテクノロジーは、多数の他のバイオテクノロジーに適用することができる（例えば、細胞型特異的ナノ粒子の送達の改善）。予め曝露したＣｅｎｄＲペプチドでコーティングしたナノ粒子は、この粒子が遭遇する第１の血管床に取り込まれるであろう（心臓および肺、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ファージの静脈内注射後）。Ｓｕｇａｈａｒａら，２００８によって示されるように、潜在性ＣｅｎｄＲ配列は、末梢組織へのカーゴの送達で有用であり得る。血漿は、高濃度の一般的（例えば、α−２−マクログロブリン）および酵素特異的（例えば、α−２抗プラスミン、抗トロンビン）プロテアーゼインヒビターを含む。これにより、血中での成熟前ＣｅｎｄＲの活性化から保護されるであろう。活性プロテアーゼは、典型的には、細胞周囲領域付近に限局される。これらのプロテアーゼは、受動的蓄積またはホーミングペプチド媒介性送達によって標的組織に到達したナノ粒子上の潜在性ＣｅｎｄＲペプチドを活性化することができる。潜在性ＣｅｎｄＲ配列をアンマスキングすることができる組織特異的プロテアーゼは、ｉｎ ｖｉｖｏ標的選択性をさらに増強することができる。活性化ＣｅｎｄＲエレメントによって媒介される細胞取り込みにより、プロセシングされたペプチドおよびそのカーゴが標的組織または細胞に蓄積するための機構が得られる。研究由来の別の重要な結論は、ＣｅｎｄＲエレメントが組織中のナノ粒子の拡大を促進することができ、ドッキングベースおよびプロテアーゼ感受性のＣｅｎｄＲターゲティングエレメントの組み合わせによって選択的ＣｅｎｄＲ媒介性の内在化および組織透過を達成することができることである。添付の報告（Ｓｕｇａｈａｒａら ２００８）に記載のｉＲＧＤペプチドおよびおそらくその報告で考察された潜在性ＣｅｎｄＲエレメントを有する他の内在化血管ホーミングペプチドはこのパラダイムを例証している。研究したファージおよび他のナノ粒子の類似性において、種々の感染因子は組織を介したその拡大を容易にするためにＣｅｎｄＲ系を使用することができることも示す。
３．方法
動物手順。全ての動物実験を、Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａによって承認された手順に従ってＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して行った。
ファージディスプレイ。ｉｎ ｖｉｖｏファージディスプレイのために、マウスに１０１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＴ７ファージを静脈内注射し、その後に循環系を灌流し、滴定によって標的器官中の結合ファージを決定した。培養細胞（ｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ）および器官由来細胞懸濁液（ｅｘ ｖｉｖｏディスプレイ）に対する細胞結合研究のために、細胞を１０９ｐｆｕのファージと４℃でインキュベートし、洗浄し、溶解し、滴定によって定量した。３７℃でのインキュベーション後の低ｐＨでの洗浄（グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５）を使用して、内在化ファージ量を評価した。
ｑドットの標識。製造者の説明書にしたがって、ビオチン化ペプチドを使用して６０５ＩＴＫストレプトアビジンｑドット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を機能付与した。
免疫蛍光。培養細胞および組織切片を、４％緩衝化パラホルムアルデヒドまたは冷（−２０℃）メタノールで固定し、その後に適切な一次抗体およびＡｌｅｘａ標識二次抗体とインキュベートし、ＤＡＰＩまたはＨｏｅｃｈｓｔ３４２ＤＮＡ色素で核染色した。
アフィニティクロマトグラフィ。ＰＰＣ−１腫瘍を、２００ｍＭのｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含むＰＢＳに溶解し、その後にＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）コーティングしたＳｕｌｆｏｌｉｎｋ−ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）とインキュベートし、２ｍＭ遊離ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドを含む溶解緩衝液中で溶離した。溶離画分の銀染色ゲルから切り出したゲルフラグメントを、Ｂｕｒｎｈａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ＲｅｓｏｕｒｃｅでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に供した。
マウスおよび組織。全ての動物実験を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａのｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された手順にしたがって行った。腫瘍注射のためおよび屠殺前に、キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によってマウスを麻酔した。ＢＡＬＢ／ｃ胸腺欠損ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、腫瘍異種移植片実験ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏファージディスプレイ実験のために使用した。同所性前立腺腫瘍の異種移植片を、前立腺の腹葉への１０６個のＰＰＣ−１細胞（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ら ２００６）の注射によって生成した。組織学的分析のために、組織を４％パラホルムアルデヒドで固定し、３０％スクロースを含むリン酸緩衝化生理食塩水中で凍結保護し、１０μｍの切片にした。
細胞株。ＰＰＣ−１、ＰＣ−３、Ｄｕ−１４５、４Ｔ１、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＰＤＡＣ１．３、Ｂ１６Ｆ１０、Ｍ２１、およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞株を、１０％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。製造者の説明書にしたがって、ヒト臍帯静脈の内皮細胞を培養した。
ファージディスプレイ。Ｔ７選択ファージディスプレイ系を、製造者の説明書にしたがって（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）ファージライブラリー構築（ライブラリー多様性−１０８）および各ファージクローニングのために使用した。ファージを、ＰＥＧ−８０００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）での沈殿およびその後のＣｓＣｌ２勾配超遠心および透析によって精製した。ディスプレイされたペプチドの配列を、Ｔ７主要コートタンパク質ｇｐ１０のＣ末端のインサート含有領域をコードするＤＮＡから決定した。
バイオパニングおよびファージ結合研究のために（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｊ．Ａ．ら，２００４）、培養細胞をコンフルエントまで成長させ、トリプシンを使用して回収し、Ｍｅｄｉｍａｃｈｉｎｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用してマウス器官を分離した。ファージ結合を測定するために、結合緩衝液（１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ）中の１０６個の細胞を、１０９ｐｆｕ／ｍｌのＴ７ファージと４℃で１時間インキュベートした。細胞を、結合緩衝液で４回洗浄し、１％ＮＰ−４０を含むＬＢ細菌成長培地に溶解し、滴定した。ファージ内在化アッセイは、細胞をファージと３７℃でインキュベートし、酸性緩衝液（５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１Ｍグリシン、１％ＢＳＡ、ｐＨ２．５）を第２の洗浄における結合緩衝液の代わりに使用したこと以外は同一の手順を使用した。
シリコーン油クッション（１．０３ｇ／ｍｌ）上での遠心分離を使用して、経時変化実験中に細胞から非結合ファージを分離した。ファージの結合および内在化のインヒビター（ヘパリン、コンドロイチン、糖衣除去酵素、エンドサイトーシスインヒビター、遊離ペプチド、量子ドット、およびＵＶ不活化ファージ）を、ファージとのインキュベーションの２０分前に細胞に添加した。本研究で使用したエンドサイトーシスインヒビターは以下であった：ナイスタチン（５０μｇ／ｍｌ）、ゲニステイン（１００μｇ／ｍｌ）、クロルプロマジン（５μｇ／ｍｌ）、５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロライド（１００μＭ）、ウォルトマンニン（１０μＭ）。
マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏファージホーミング研究を、尾静脈への１０１０ｐｆｕのＴ７ファージの注射によって行った。１０分〜１時間後、左心室を介してＤＭＥＭでマウスを灌流した。目的の器官を回収し、１％ＮＰ４０中でホモジナイズし、滴定によってファージを定量した。
ペプチド合成およびｑドット標識。マイクロ波支援自動化ペプチド合成機（Ｌｉｂｅｒｔｙ，ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）でのＦｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ化学を使用してペプチドを合成した。０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル−水混合物を使用したＨＰＬＣによってペプチドを純度９０％〜９５％までＨＰＬＣにより精製して、Ｑ−ＴＯＦ質量スペクトル分析によって確証した。
ストレプトアビジンＩＴＫ−６０５量子ドット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、１００倍モル過剰のペプチドとのインキュベーションによってビオチン化ペプチドで機能付与し、その後に透析によって遊離ペプチドを除去した。
アフィニティクロマトグラフィ。同所性ＰＰＣ−１腫瘍を、４００ｍＭ ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、および１錠／５ｍｌの無ＥＤＴＡプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＰＢＳ中でホモジナイズした。４℃での回転プラットフォーム上での６時間の抽出後、溶解物を遠心分離（冷却微量遠心分離機中、１４，０００ｒｐｍで２０分間）によって清澄化し、製造者の説明に従った（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）システインタグ付きＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号２）ペプチドのＳｕｌｆｏｌｉｎｋカップリングゲルへのカップリングによって調製したアフィニティカラムにローディングした。一晩の結合後、２００ｍＭ ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含むがその他は溶解緩衝液と同一のカラム洗浄緩衝液でカラムを洗浄し、その後に２ｍＭ遊離ＲＰＡＲＰＡＲペプチドを含む同一緩衝液で溶離した。
洗浄画分および溶離画分のサンプルを、Ｎｏｖｅｘ ４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して分離し、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｎａｐキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して銀染色し、Ｂｕｒｎｈａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ＦａｃｉｌｉｔｙでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に供した。アフィニティクロマトグラフィサンプルを免疫ブロッティングし、抗体でプローブし、その後に結合を化学発光検出した。
免疫蛍光染色。培養細胞（２×１０５細胞）を、コラーゲンＩコーティングされたカバーガラス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上の６ウェル組織培養プレート中で５％ＣＯ２下にて３７℃で一晩成長させ、１０８ｐｆｕのＴ７ファージとインキュベートした。細胞を４％パラホルムアルデヒドまたは冷（−２０℃）メタノール中で固定し、抗体で染色した。核をＤＡＰＩまたはＨｏｅｃｈｓｔ５４２で染色した。ＣｓＣｌ２遠心分離を使用したさらなるファージ精製工程を含むことを除いて以前に記載のように（Ｌａａｋｋｏｎｅｎ，Ｐ．ら ２００２ｂ）、ポリクローナルウサギ抗Ｔ７抗体をインハウスで生成した。使用した他の一次抗体は、ラット抗マウスＣＤ３１モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ウサギ抗ＮＲＰ−１、マウス抗ヒトＬａｍｐ−１、マウス抗ヒトカベオリン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、マウス抗ＮＲＰ−１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）、マウス抗ヒトＥＥＡ−１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）であった。マウス、ラット、およびウサギ免疫グロブリンに対する二次抗体であるＡｌｅｘａ５９４ヤギ抗体およびＡｌｅｘａ４８８ロバ抗ウサギ抗体を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。細胞および組織切片を共焦点顕微鏡法で試験した（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ５００，Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）。
ＤＮＡ構築物およびトランスフェクション。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中の野生型ＮＲＰ−１ ｃＤＮＡの発現構築物は、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ博士から譲渡された。部位特異的変異誘発を使用して、ＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号４８）（アミノ酸ＳＫＥＴをコードする）のＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＣＴ（配列番号４９）（ＡＫＡＡをコードする）への置換によってＮＲＰ−１のｂ１ドメイン中のＶＥＧＦ−１６５結合部位に３つの変異を生成した（Ｓ３４６Ａ−Ｅ３４８Ａ−３４９Ａ）。
Ｍ２１黒色腫細胞を、製造者の説明書にしたがって（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）リポフェクタミンを使用して、これらの構築物で一過性にトランスフェクションした。
ファージおよびｑドットのプロテアーゼ処理。１０９個のファージ粒子または５０μｌのペプチドコーティングしたｑドットファージを、５０ｉｕのｕＰＡ、２５μｇの結晶トリプシン、５０ｉｕのトロンビン、または２５μｇのコラゲナーゼＩ型（全てＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）で処置した。
統計分析。スチューデントｔ検定および一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によってデータを分析し、その後に適切な事後検定によって分析した（表３）。
本出願全体を通して、種々の刊行物を参照している。これらの刊行物の開示全体が、本発明が属する技術の水準をより完全に説明するために本出願に参考として援用される。
リファレンス
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、文脈中で明らかに別なふうに示されない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数形が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「ａ ｐｅｐｔｉｄｅ」という言及には、かかるペプチドの複数形が含まれ、「ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅ」という言及は、１つまたは複数の当業者に公知のペプチドおよびその等価物などをいう。
「任意選択的な」または「任意選択的に」は、その後に記載される事象、環境、または物質が生じても生じなくてもよく、この記載にはこの事象、環境、または物質が生じるか存在する例および生じないか存在しない例が含まれることを意味する。
範囲を、本明細書中で「約」１つの特定の値から、そして／または「約」別の特定の値までと示すことができる。かかる範囲を示す場合、文脈中で具体的に別なふうに示されない限り、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までの範囲であることも具体的に意図され、開示されると見なされる。同様に、前に「約」を使用することによって値を近似値として示す場合、文脈中で具体的に別なふうに示されない限り、特定の値が別の実施形態を形成し、開示されていると考慮すべき実施形態が特に意図されると理解されるであろう。文脈中で具体的に別なふうに示されない限り、各範囲の終点が他の終点と関連して共に有意であり、且つ他の終点と無関係に有意であることがさらに理解されるであろう。最後に、文脈中で具体的に別なふうに示されない限り、明確に開示された範囲内に含まれる各値の全ておよび値の部分範囲も明確に意図され、且つ開示されると見なすべきであると理解すべきである。特定の場合にこれらの実施形態のいくつかまたは全てが明確に開示されているかどうかに無関係に上記を適用する。
他で定義されない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、開示の方法および組成物が属する技術の当業者が一般的に理解している意味を有する。本明細書中に記載の方法および材料に類似するか等価な任意の方法および材料を本方法および組成物の実施または試験で使用することができるにもかかわらず、特に有用な方法、デバイス、および材料は記載の通りである。本明細書中で引用した刊行物およびこれらの刊行物が引用した材料は、本明細書中で具体的に参考として援用される。本発明が先行発明によるかかる開示に先行する権利を持たないと承認すると解釈されない。いかなる引例も先行技術を構成すると承認されない。引用文献の考察には、著者の主張を記載し、出願人は、引用文献の正確さおよび適切性に異議を申し立てる権利を留保する。多数の刊行物が本明細書中で参照されているが、かかる引用文献はこれらの書類のいずれかが当該分野における共通の一般的知識の一部を形成することを承認しないことが明確に理解されるであろう。
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」およびこの用語の異型（「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」など）は、「〜が含まれるが、これらに限定されない」を意味し、例えば、他の添加物、成分、整数、または工程を排除することを意図しない。
開示の方法および組成物は変化し得るので、記載の特定の方法論、プロトコール、および試薬に制限されないと理解される。本明細書中で使用した用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を制限することを意図せず、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるとも理解すべきである。
当業者は、日常的な実験しか使用せずに、本明細書中に記載の方法および組成物の特定の実施形態の多数の等価物を認識するか、確認することができる。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

Claims (82)

  1. ＣｅｎｄＲ結合体を形成する方法であって、
    （ａ）細胞への内在化、組織透過、またはその両方のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、前記アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含む工程、
    （ｂ）カーゴ組成物を前記選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、前記カーゴ組成物が前記ＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合する工程、を含み、
    ここで、前記ＣｅｎｄＲ結合体が前記タンパク質またはペプチドおよび前記結合または会合したカーゴ組成物を含む、方法。
  2. 前記工程（ｂ）のタンパク質またはペプチドを、前記工程（ａ）の選択されたアミノ酸配列が前記タンパク質またはペプチド中に存在する場合には細胞に内在化することができるが、前記選択されたアミノ酸が前記タンパク質またはペプチド中に存在しない場合には細胞に内在化することができない、請求項１に記載の方法。
  3. 前記工程（ｂ）のタンパク質またはペプチドは、前記工程（ａ）の選択されたアミノ酸配列が前記タンパク質またはペプチド中に存在する場合には組織を透過することができるが、前記選択されたアミノ酸が前記タンパク質またはペプチド中に存在しない場合には透過できない、請求項１に記載の方法。
  4. 前記工程（ｂ）のタンパク質またはペプチドを、前記工程（ａ）の選択されたアミノ酸配列が前記タンパク質またはペプチド中に存在する場合には細胞に内在化して組織を透過することができるが、前記選択されたアミノ酸が前記タンパク質またはペプチド中に存在しない場合には細胞に内在化して組織を透過することができない、請求項１に記載の方法。
  5. 前記工程（ａ）の選択されたアミノ酸配列を、前記工程（ｂ）のカーゴ組成物に会合することなく細胞に内在化することができる、請求項１に記載の方法。
  6. 前記工程（ａ）の選択されたアミノ酸配列が、前記工程（ｂ）のカーゴ組成物に会合することなく組織を透過することができる、請求項１に記載の方法。
  7. 前記工程（ａ）の選択されたアミノ酸配列を、前記工程（ｂ）のカーゴ組成物に会合することなく細胞に内在化して組織を透過することができる、請求項１に記載の方法。
  8. 前記工程（ａ）の選択されたアミノ酸配列が、前記工程（ｂ）のタンパク質またはペプチド中の唯一の機能的内在化エレメントである、請求項１に記載の方法。
  9. 前記工程（ａ）の選択されたアミノ酸配列が、前記ＣｅｎｄＲ結合体中の唯一の機能的内在化エレメントである、請求項１に記載の方法。
  10. 前記ＣｅｎｄＲエレメントが活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントである、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントがプロテアーゼ活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントである、請求項６に記載の方法。
  12. 前記タンパク質またはペプチドが環状である、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記ＣｅｎｄＲエレメントが前記タンパク質またはペプチドのＣ末端に存在する、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記工程（ｂ）のカーゴ組成物が、抗血管新生薬、血管新生促進薬、ナノ粒子、癌化学療法薬、細胞毒性薬、抗炎症薬、または抗関節炎薬である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記工程（ｂ）のカーゴ組成物がホーミング配列を含む、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記カーゴ組成物が腫瘍に選択的にホーミングする、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記カーゴ組成物が腫瘍脈管構造に選択的にホーミングする、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記アミノ酸配列を細胞への内在化のために選択する、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記アミノ酸配列を組織透過のために選択する、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記アミノ酸配列を細胞への内在化および組織透過のために選択する、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
  21. ＣｅｎｄＲ結合体であって、
    （ａ）細胞への内在化、組織透過、またはその両方のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、前記アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含む工程、
    （ｂ）カーゴ組成物を前記選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合させるか非共有的に会合させる工程であって、前記カーゴ組成物が前記ＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合する工程、を含み、
    ここで、前記ＣｅｎｄＲ結合体が前記タンパク質またはペプチドおよび前記結合または会合したカーゴ組成物を含む、方法によって作製された、ＣｅｎｄＲ結合体。
  22. 前記ＣｅｎｄＲエレメントが活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントである、請求項２１に記載のＣｅｎｄＲ結合体。
  23. 前記活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントがプロテアーゼ活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントである、請求項２２に記載のＣｅｎｄＲ結合体。
  24. 前記タンパク質またはペプチドが環状である、請求項２１から２３のいずれか１項に記載のＣｅｎｄＲ結合体。
  25. 前記ＣｅｎｄＲエレメントが前記タンパク質またはペプチドのＣ末端に存在する、請求項２１に記載のＣｅｎｄＲ結合体。
  26. 前記アミノ酸配列を細胞への内在化のために選択する、請求項２１から２５のいずれか１項に記載のＣｅｎｄＲ結合体。
  27. 前記アミノ酸配列を組織透過のために選択する、請求項２１から２５のいずれか１項に記載のＣｅｎｄＲ結合体。
  28. 前記アミノ酸配列を細胞への内在化および組織透過のために選択する、請求項２１から２５のいずれか１項に記載のＣｅｎｄＲ結合体。
  29. 細胞中にカーゴ組成物を送達させる方法であって、
    （ａ）ＣｅｎｄＲエレメントを前記カーゴ組成物に結合させ、それにより、ＣｅｎｄＲ結合体を形成する工程、および
    （ｂ）前記細胞を前記ＣｅｎｄＲ結合体に曝露する工程であって、次いで、前記ＣｅｎｄＲ結合体が前記細胞に侵入し、それにより、前記カーゴ組成物を前記細胞に送達させることができる工程、
    を含む、方法。
  30. 前記ＣｅｎｄＲエレメントが活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントがプロテアーゼ活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記タンパク質またはペプチドが環状である、請求項２９から３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記細胞が前記ＣｅｎｄＲエレメントに曝露された場合に切断剤が前記ＣｅｎｄＲ結合体の前記活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを活性化する、請求項３０から３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記ＣｅｎｄＲエレメントが前記タンパク質またはペプチドのＣ末端に存在する、請求項２９に記載の方法。
  35. ＣｅｎｄＲエレメントを内在化することができる細胞を同定する方法であって、
    （ａ）ＣｅｎｄＲエレメントに細胞を曝露する工程、
    （ｂ）前記ＣｅｎｄＲエレメントが内在化されたかどうかを決定する工程、
    を含む、方法。
  36. 前記細胞がアッセイ中に存在する、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記ＣｅｎｄＲエレメントをタンパク質またはペプチドに結合する、請求項３５または３６に記載の方法。
  38. 前記ＣｅｎｄＲエレメントが活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントである、請求項３５から３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントがプロテアーゼ活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントである、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記タンパク質またはペプチドが環状である、請求項３５から３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを前記細胞への曝露前に活性化する、請求項３５から４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記ＣｅｎｄＲエレメントが前記タンパク質またはペプチドのＣ末端に存在する、請求項３５から３７のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントがプロテアーゼ活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントである、請求項３８から４１のいずれか１項に記載の方法。
  44. ＣｅｎｄＲベースの療法の候補として癌細胞を同定する方法であって、
    （ａ）前記癌細胞をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、
    （ｂ）前記ＣｅｎｄＲエレメントが前記癌細胞によって内在化されるかどうかを決定する工程であって、ここで、内在化されたＣｅｎｄＲエレメントによって前記癌細胞がＣｅｎｄＲベースの療法の候補であると同定される工程、を含む方法。
  45. 前記細胞がアッセイ中に存在する、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記細胞が被験体中に存在する、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記ＣｅｎｄＲエレメントをタンパク質またはペプチドに結合する、請求項４４から４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記ＣｅｎｄＲエレメントが活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントである、請求項４４から４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントがプロテアーゼ活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントである、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記タンパク質またはペプチドが環状である、請求項４８から４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記ＣｅｎｄＲエレメントが前記タンパク質またはペプチドのＣ末端に存在する、請求項４８から４７のいずれか１項に記載の方法。
  52. 目的の細胞付近に活性化することができる活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを産生する方法であって、
    切断可能な結合を介してブロッキング基がＣｅｎｄＲエレメントに結合している活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成する工程を含み、ここで、前記切断可能な結合が前記目的の細胞付近に存在する酵素によって切断可能である、方法。
  53. 前記細胞が被験体中に存在する、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成させる前に前記目的の細胞付近に存在する前記酵素を同定する工程をさらに含む、請求項５２または５３に記載の方法。
  55. 前記活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成させる前に前記目的の細胞付近に存在する前記酵素に基づいて前記切断可能な結合を選択する工程をさらに含む、請求項５２から５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントを形成する方法であって、
    （ａ）細胞への内在化、組織透過、またはその両方のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、前記アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含む工程、
    （ｂ）ブロッキング基を前記ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合させる工程であって、前記ブロッキング基と前記ＣｅｎｄＲエレメントとを結合する結合が切断可能であり、前記ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したブロッキング基が、細胞への内在化、組織透過、またはその両方を軽減または防止する工程、を含み、
    ここで、前記活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントが前記選択されたアミノ酸配列およびブロッキング基を含む、方法。
  57. 前記ＣｅｎｄＲエレメントが末端カルボキシル基を含み、前記ブロッキング基が前記末端カルボキシル基に結合する、請求項５６に記載の方法。
  58. 工程（ｂ）の前に、目的の細胞付近に存在するプロテアーゼによって切断可能であるように前記ブロッキング基と前記末端カルボキシル基とを結合する前記結合を選択する工程をさらに含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記ブロッキング基を前記ＣｅｎｄＲエレメントのＣ末端アミノ酸に結合する、請求項５６に記載の方法。
  60. 前記ブロッキング基を、前記ＣｅｎｄＲエレメントのＣ末端アミノ酸以外の前記ＣｅｎｄＲエレメントのアミノ酸に結合する、請求項５６に記載の方法。
  61. カーゴ組成物を前記選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合するか非共有的に会合し、前記カーゴ組成物を前記ＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合する、請求項５６から６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記アミノ酸配列を細胞への内在化のために選択する、請求項５６から６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記アミノ酸配列を組織透過のために選択する、請求項５６から６１のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記アミノ酸配列を細胞への内在化および組織透過のために選択する、請求項５６から６１のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したブロッキング基が細胞への内在化を軽減または防止する、請求項５６から６２のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したブロッキング基が組織透過を軽減または防止する、請求項５６から６１または６３のいずれか１項に記載の方法。
  67. 前記ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したブロッキング基が細胞への内在化および組織透過を軽減または防止する、請求項５６から６１または６４のいずれか１項に記載の方法。
  68. 活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントであって、
    （ａ）細胞への内在化、組織透過、またはその両方のためにアミノ酸配列を選択する工程であって、前記アミノ酸配列がＣｅｎｄＲエレメントを含む工程、
    （ｂ）ブロッキング基を前記ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合させる工程であって、前記ブロッキング基と前記ＣｅｎｄＲエレメントとを結合する結合が切断可能であり、前記ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したブロッキング基が、細胞への内在化、組織透過、またはその両方を軽減または防止する工程、を含み、
    ここで、前記活性化可能なＣｅｎｄＲエレメントが前記選択されたアミノ酸配列およびブロッキング基を含む、
    方法によって作製された、活性化可能なＣｅｎｄＲエレメント。
  69. 前記ＣｅｎｄＲエレメントが末端カルボキシル基を含み、前記ブロッキング基が前記末端カルボキシル基に結合する、請求項６８に記載のＣｅｎｄＲエレメント。
  70. 前記方法が、工程（ｂ）の前に、目的の細胞付近に存在するプロテアーゼによって切断可能であるように前記ブロッキング基と前記末端カルボキシル基とを結合する前記結合を選択する工程をさらに含む、請求項６９に記載のＣｅｎｄＲエレメント。
  71. 前記ブロッキング基を前記ＣｅｎｄＲエレメントのＣ末端アミノ酸に結合する、請求項６８に記載のＣｅｎｄＲエレメント。
  72. 前記ブロッキング基を、前記ＣｅｎｄＲエレメントのＣ末端アミノ酸以外の前記ＣｅｎｄＲエレメントのアミノ酸に結合する、請求項６８に記載のＣｅｎｄＲエレメント。
  73. カーゴ組成物を前記選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに共有結合するか非共有的に会合し、前記カーゴ組成物を前記ＣｅｎｄＲエレメントのＮ末端側のタンパク質またはペプチドに結合または会合する、請求項６８から７２のいずれか１項に記載のＣｅｎｄＲエレメント。
  74. 前記アミノ酸配列を細胞への内在化のために選択する、請求項６８から７３のいずれか１項に記載のＣｅｎｄＲエレメント。
  75. 前記アミノ酸配列を組織透過のために選択する、請求項６８から７３のいずれか１項に記載のＣｅｎｄＲエレメント。
  76. 前記アミノ酸配列を細胞への内在化および組織透過のために選択する、請求項６８から７３のいずれか１項に記載のＣｅｎｄＲエレメント。
  77. 前記ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したブロッキング基が細胞への内在化を軽減または防止する、請求項６８から７４のいずれか１項に記載のＣｅｎｄＲエレメント。
  78. 前記ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したブロッキング基が組織透過を軽減または防止する、請求項６８から７３または７５のいずれか１項に記載のＣｅｎｄＲエレメント。
  79. 前記ＣｅｎｄＲエレメントに共有結合したブロッキング基が細胞への内在化および組織透過を軽減または防止する、請求項６８から７３または７６のいずれか１項に記載のＣｅｎｄＲエレメント。
  80. ＣｅｎｄＲエレメントによって透過され得る組織を同定する方法であって、
    （ａ）組織をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、および
    （ｂ）前記ＣｅｎｄＲエレメントが前記組織を透過するかどうかを決定する工程、
    を含む方法。
  81. ＣｅｎｄＲベースの療法の候補として腫瘍を同定する方法であって、
    （ａ）前記腫瘍をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、および
    （ｂ）前記ＣｅｎｄＲエレメントが腫瘍を透過するかどうかを決定する工程であって、透過したＣｅｎｄＲエレメントによって前記腫瘍がＣｅｎｄＲベースの療法の候補であると同定される工程、
    を含む方法。
  82. ＣｅｎｄＲベースの療法の候補として腫瘍を同定する方法であって、
    （ａ）前記腫瘍由来の細胞をＣｅｎｄＲエレメントに曝露する工程、および
    （ｂ）前記ＣｅｎｄＲエレメントが前記細胞によって内在化されたかどうかを決定する工程であって、内在化されたＣｅｎｄＲエレメントによって前記腫瘍がＣｅｎｄＲベースの療法の候補であると同定される工程、
    を含む方法。
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