ES2637265T3 - Derivados peptídicos, su preparación y sus usos como vectores - Google Patents

Abstract

Péptido o seudopéptido, caracterizado por que responde a la siguiente fórmula general (I): A1-Met-A2-Arg-Leu-Arg-A3-Cys (I) en la que A1 indica cisteína (Cys) o uno de sus análogos o isósteros, A2 indica prolina (Pro) o uno de sus análogos o isósteros y A3 indica glicina (Gly) o uno de sus análogos o isósteros, siempre que el residuo A2 sea un análogo de prolina cuando el residuo A1 es una cisteína, y por que es capaz de unirse a un receptor humano de lipoproteínas de baja densidad (hLDLR).

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Derivados peptfdicos, su preparacion y sus usos como vectores

La invencion se refiere a derivados peptidicos (peptidos y seudopeptidos) y a su uso como vectores de moleculas de interes. La invencion tambien se refiere a conjugados que contienen un derivado peptidico de la invencion unido a una molecula de interes. Los peptidos de la invencion se pueden utilizar especialmente para transportar en forma de conjugados, generalmente profarmacos, moleculas de interes farmaceutico o de diagnostico, tales como por ejemplo moleculas terapeuticas, agentes de formacion de imagenes o de diagnostico o sondas moleculares, a traves de las membranas celulares y, en particular, para facilitar su transporte a traves de la barrera hematoencefalica (BHE).

Contexto de la invencion

De acuerdo con IMS Health, el mercado mundial de medicamentos destinados a tratar patologfas del sistema nervioso central (SNC, el cerebro y la medula espinal) era de aproximadamente 70 mil millones de dolares en 2007, de los cuales, la parte de productos derivados de las tecnologfas de administracion de farmacos “drug delivery” se estima en cerca de 9 mil millones de dolares (Jain, 2008, Jain PharmaBiotech Report, Drug Delivery in CNS disorders). Por lo tanto, hasta la fecha, la neurologfa forma parte de las 3 areas terapeuticas mas importantes junto con la cardiovascular y la oncologfa. Incluso si el numero de personas que padecen trastornos y patologfas del SNC en todo el mundo es mayor que el de las personas aquejadas de enfermedades cardiovasculares o cancer, la neurologfa sigue siendo un mercado poco explotado. Esto se explica por el hecho de que 98% de los medicamentos potenciales destinados al tratamiento de patologfas del SNC no cruzan la barrera hematoencefalica o BHE (Pardridge, 2003, Mol. Interv., 3, 90-105).

De hecho, el cerebro esta protegido frente a sustancias potencialmente toxicas por la presencia de dos sistemas principales de barreras fisiologicas: la BHE, y la barrera sangre-lfquido cefalorraqmdea (BS-LCR). La BHE se considera la via principal para la captacion de ligandos plasmaticos. Su superficie es aproximadamente 5000 veces mayor que la de la BS-LCR. La longitud total de los vasos sangumeos constituyentes de la BHE es de aproximadamente 600 km. Cada cm3 de corteza cerebral contiene el equivalente a 1 km de vasos sangumeos. La superficie total de la BHE se estima en 20 m2 (De Boer et al., 2007, Clin. Pharmacokinet., 46 (7), 553-576). Por lo tanto, el endotelio cerebral, que constituye la BHE, representa un obstaculo principal para el uso de medicamentos potenciales contra numerosos trastornos del SNC, pero tambien es una superficie importante de intercambio potencial entre la sangre y el tejido nervioso.

Por regla general, solo pequenas moleculas lipofilas de aproximadamente 450 a 600 Dalton pueden pasar a traves de la BHE (es decir, solo el 2% de los medicamentos candidatos), es decir, para pasar desde la sangre hasta el cerebro. El peso molecular y el tamano de numerosos medicamentos candidatos que muestran resultados prometedores en estudios in vitro y en animales, para el tratamiento de trastornos del SNC, son considerablemente mayores. Por tanto, la mayona de las moleculas tales como los peptidos o las protemas terapeuticas generalmente se excluyen del transito/transporte desde la sangre hasta el cerebro, debido a la baja permeabilidad transcelular de las celulas endoteliales de los capilares del cerebro (brain capillary endothelial cells o BCECs) para este tipo de medicamentos candidatos. Las BCECs organizadas en los vasos estan rodeadas por una lamina basal, pies de astrocitos, pericitos y celulas de microglia y neuronales. La estrecha asociacion de las celulas endoteliales con los pies de los astrocitos es responsable del desarrollo y el mantenimiento de las propiedades impermeables de la BHE para la mayona de las moleculas, asegurando asf un control estricto y eficaz de los intercambios moleculares entre la sangre y el cerebro con el fin de mantener la homeostasis cerebral. Las BCECs estan estrechamente unidas por uniones estrechas, en comparacion con otras celulas endoteliales de otros organos, que estan fenestradas. Por tanto, estas uniones estrechas impiden cualquier transporte paracelular a traves de la BHE.

La BHE se considera el principal obstaculo a franquear en el desarrollo de nuevas terapias para tratar patologfas del cerebro, y especialmente para el uso de moleculas capaces de tratar los trastornos del sNc (Neuwelt et al., 2008, The Lancet Neurol., 7, 84-96).

Una de las razones que pueden explicar por que no esta disponible actualmente ningun tratamiento eficaz para las principales patologfas cerebrales (cancer cerebral, enfermedad de Parkinson y de Alzheimer, accidentes cerebrovasculares (ACV), etc.) es que las personas que desarrollan medicamentos candidatos destinados al tratamiento de patologfas del cerebro, realizan internamente programas de investigacion (brain drug-discovery programs), invirtiendo pocos esfuerzos en la problematica del cruce de la BHE y la orientacion dirigida preferencial del SNC, y especialmente del cerebro (brain drug-targeting programs) (Pardridge 2003, Mol. Interv., 3, 90-105). Un medicamento candidato debe cumplir ciertas reglas estructurales, ffsicoqmmicas, farmacoqmmicas y farmacologicas con el fin de tener todas las posibilidades de convertirse en un medicamento para tratar una patologfa o un trastorno del SNC (Pajouhesh y col., 2005, NeuroRx, 2 (4), 541-553). Por lo tanto, en el desarrollo de un medicamento candidato, la selectividad y la especificidad (perfil farmacologico) de una molecula hacia su diana son esenciales para su actividad terapeutica (eficacia). La biodisponibilidad y la toxicidad potencial (perfil farmaceutico) de una molecula son cruciales para su futuro como medicamento. En otras palabras, cualquier molecula susceptible de convertirse en un medicamento destinado a tratar una patologfa o un trastorno del SNC, por una parte tiene que pasar a traves de la BHE, por otra parte, conservar su actividad biologica y presentar buenas propiedades

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

farmacocineticas (PK) de absorcion, de distribucion, de metabolismo y de excrecion/eliminacion (ADME) y farmacodinamicas (PD), con baja toxicidad (Tox). De hecho, encontrar el equilibrio hidrofilo/lipofilo de la molecula en desarrollo es particularmente diffcil para los qmmicos medicos en esta area terapeutica del sNc.

El principal problema en el tratamiento de trastornos y patologfas del SNC reside por tanto en el hecho de que las moleculas administradas no atraviesan la BHE y por lo tanto no pueden llegar a su(s) diana(s) en el SNC. Las celulas endoteliales de los vasos y los capilares del SNC que constituyen la BHE son un obstaculo para las moleculas que no pueden pasar desde la sangre al tejido nervioso. De hecho, como se ha mencionado anteriormente, estas celulas endoteliales y los pies de los astrocitos que las rodean constituyen una barrera ffsica ligada en particular a la presencia de uniones estrechas entre las celulas endoteliales que limitan/impiden cualquier cruce/transporte por la via paracelular, y tambien una barrera fisiologica, ya que estas celulas disponen de sistemas de flujo de salida eficientes que restringen cualquier cruce/transporte por la via transcelular. Por tanto, estas propiedades limitan fuertemente el paso de sustancias desde el plasma sangumeo hacia el espacio extracelular cerebral.

En efecto, ciertas moleculas que son capaces de atravesar la BHE, son expulsadas activamente desde el cerebro hacia el sistema sangumeo por protemas transportadoras multidrug resistant (MDR). Estos sistemas de flujo de salida por transporte activo (active efflux transport, AET) controlan generalmente el flujo de salida activo de moleculas pequenas desde el cerebro hacia el sistema sangumeo. El sistema de AET modelo a nivel de la BHE es el transportador ATP Binding Cassette (ABC), es decir, la glicoprotema P (P-glicoprotema, P-gp); sin embargo otros sistemas de AET estan presentes a nivel de la BHE, tal como la MDR-associated protein 1 (MRP1). La P-gp, que se localiza principalmente en la superficie luminal de las celulas endoteliales de los capilares cerebrales, es un elemento esencial en la funcion de barrera fisiologica de la BHE que evita la entrada en el cerebro de la mayona de los xenobioticos, pero tambien los medicamentos candidatos y otras moleculas de interes terapeutico que pueden estar activas en el SNC.

Una de las prioridades de la investigacion en el descubrimiento de moleculas destinadas a tratar, diagnosticar o formar imagenes de trastornos o patologfas cerebrales es, por lo tanto, encontrar medios que permitan aumentar la eficacia del paso de sustancias activas a traves de la BHE.

En este sentido, las estrategias de transporte (vectorizacion) de moleculas a traves de la BHE, actualmente estudiadas y utilizadas por personas que desarrollan medicamentos candidatos, con el fin de permitir que una molecula de interes terapeutico llegue al SNC, se pueden dividir segun dos estrategias principales: los enfoques farmacologicos y los enfoques fisiologicos (Figura 1), (Pardridge, 2007, Pharm. Res., 24 (9), 1733-1744; De Boer et al., 2007, Clin. Pharmacokinet., 46(7), 553-576; De Boer et al., 2007, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 47, 327-355; Jones et al., 2007, Pharm. Res., 24 (9), 1759-1771).

Enfoques invasivos

Los enfoques invasivos pueden ser implementados por inyeccion intraventricular cerebral directa de la sustancia activa, inyeccion intracerebral o infusion intratecal o por perturbacion de la BHE (ruptura temporal de la integridad de la BHE).

El principal problema de los enfoques de neurocirugfa mediante inyeccion intraventricular, aparte de los costes relacionados con el acto neuroquirurgico, es que el medicamento no se administra directamente a nivel de parenquima cerebral, sino en el lfquido cefalorraqrndeo. La infusion intraventricular implica la colocacion de un cateter en los ventnculos (Aird, 1984, Exp. Neurol., 86, 342-358). Esta tecnica muy invasiva no es eficaz para el transporte de sustancias activas en el parenquima cerebral. De hecho, el volumen del flujo desde el lfquido cefalorraqrndeo hasta el parenquima cerebral durante el suministro de un medicamento por infusion intraventricular, se rige por una difusion anormalmente lenta de su conveccion (de su transporte) ya que el cerebro no tiene un caudal volumetrico intraparenquimatoso.

Del mismo modo, para la inyeccion intracerebral, la difusion de una sustancia activa en el cerebro disminuye muy rapidamente desde el sitio de la inyeccion hasta el sitio de la lesion. De hecho, la concentracion cerebral de una sustancia activa disminuye en un 90% a una distancia de 500 pm desde su sitio de inyeccion.

La infusion intratecal implica la colocacion de un cateter en el cerebro. Este cateter esta conectado a una bomba que libera la sustancia activa con un flujo predefinido. Debido a que el cerebro es el unico organo que no tiene sistema linfatico, que normalmente sirve para devolver los fluidos extracelulares a la circulacion general, la distribucion de una sustancia activa mediante infusion intratecal en el cerebro es muy lenta. Esto disminuye la concentracion de la sustancia activa en el sitio de la lesion.

Por otra parte, los riesgos de infeccion son importantes durante tales actos neuroquirurgicos, incluso por la presencia del cateter. En estas condiciones, la comodidad del paciente no es optima.

La interrupcion temporal de la impermeabilidad de la BHE se asocia con una apertura transitoria de las uniones estrechas de las celulas endoteliales de los capilares cerebrales.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Este es el caso de sustancias vasoactivas tales como los leucotrienos o bradiquininas (Baba et al., 1991, J. Cereb. Blood Flow Metab., 11, 638-643). Esta estrategia tambien es invasiva y requiere un acceso arterial a nivel de la arteria carotida en sujetos/pacientes sedados. El principal problema encontrado por la ruptura temporal de la integridad de la BHE, ademas de los gastos relacionados con el acto del radiologo para acceder a la carotida, es que la BHE solo permanece abierta durante un corto penodo de tiempo, lo que limita de hecho la posibilidad de administrar de forma cronica un medicamento. Ademas, la ruptura temporal de la BHE permite que protemas plasmaticas entren en el cerebro (aunque esas protemas pueden ser toxicas para el cerebro) y tambien puede facilitar la entrada de agentes infecciosos. Este tipo de ruptura de la BHE puede conducir por ello a trastornos neuropatologicos cronicos y se asocia con riesgos importantes de infeccion (Salahuddin et al., 1988, Acta Neuropathol., 76, 1-10).

Enfoques farmacologicos de transporte

Las estrategias farmacologicas para el transporte de moleculas incluyen la difusion transcelular de moleculas que se han vuelto mas hidrofobas mediante la adicion de grupos lipfdicos o lipofilos sobre la sustancia activa (Transcellular Lipophilic Diffusion o TLD) o el uso de liposomas (Zhou et al., 1992, J. Control. Release, 19, 459-486), y el transporte mediante adsorcion ionica a traves de moleculas vectores cargadas positivamente o por cationizacion de la molecula activa (Adsorptive-Mediated Transport o AMT).

La adicion de un grupo lipfdico o lipofilo permite la conversion qmmica de moleculas hidrofilas en moleculas mas hidrofobas, en particular, a traves de enfoques de profarmacos. Sin embargo, la smtesis de tales compuestos conduce a moleculas que superan el umbral de transporte optimo para atravesar la BHE, especialmente en lo que respecta al peso molecular que se vuelve superior al lfmite optimo de 450 Dalton (Pajouhesh y col., 2005, NeuroRx, 2 (4), 541-553). Por esta misma razon, los liposomas o incluso las vesmulas pequenas (micelas, etc.) o nanopartmulas (nanoesferas, nanocapsulas) tienen generalmente un tamano demasiado grande, no son lo suficientemente espedficas para la BHE, y por lo tanto son relativamente ineficaces para el transporte de moleculas de interes terapeutico (o agentes de formacion de imagenes o de diagnostico, o cualquier otra molecula como una sonda molecular) a traves de la BHE (Levin, 1980, J. Med. Chem., 23, 682-684; Schackert et al., 1989, Selective Cancer Ther., 5, 73-79). Por otra parte, este tipo de sistema vesicular presenta generalmente unos efectos toxicos no despreciables a nivel cerebral. Por lo tanto, los principales problemas que afrontan las tecnologfas de lipidizacion son su baja especificidad para dirigirse a una diana y atravesar espedficamente la BHE, en comparacion con otras membranas celulares, la disminucion de los valores plasmaticos del area bajo la curva del farmaco (ABC) y su uso generalmente limitado al transporte de moleculas pequenas.

En los enfoques de AMT (adicion de un grupo cationico a traves de un acoplamiento covalente o cationizacion directa del farmaco), el principal problema encontrado es la baja especificidad para dirigir a una diana y atravesar espedficamente la BHE en comparacion con otras membranas celulares. De hecho, la AMT se basa en moleculas cationicas que se adsorben sobre celulas en las que la membrana esta cargada negativamente, que es el caso de la mayona de las celulas. La disminucion de los valores plasmaticos de la ABC del farmaco, su uso generalmente limitado al transporte de moleculas pequenas y su citotoxicidad, son otros tantos factores que penalizan el enfoque de transporte a traves de AMT.

Enfoques fisiologicos de transporte

Las estrategias basadas en enfoques fisiologicos de transporte consisten en explotar los diferentes mecanismos de transporte natural a nivel de la BHE. Estos mecanismos de transporte activo de moleculas a traves de la BHE se realizan bien a traves de un acoplamiento a un sustrato espedfico de un receptor o por mimetismo molecular con el sustrato espedfico de un receptor (Carrier-Mediated Transport o CMT), o a traves de un acoplamiento o fusion con un ligando que se dirige espedficamente a un receptor (Receptor-Mediated Transport o RMT).

A tftulo de ejemplo, moleculas tales como la L-DOPA (enfermedad de Parkinson), melfalan (cancer cerebral), a- metil-DOPA (hipertension arterial) y gabapentina (epilepsia) pasan al cerebro por CMT a traves de los large neutral aminoacid transporters 1 y 2 (LATl y LAT2), (Pardridge, 2003, Mol. Interv., 3, 90-105). Estas moleculas tienen estructuras qmmicas cercanas a la fenilalanina, uno de los sustratos naturales de LAT1/2. Sin embargo, los principales problemas encontrados por los enfoques CMT son su gran selectividad/especificidad hacia conjugados que imitan/mimetizan estrechamente al sustrato del receptor/transportador endogeno y, por lo tanto, su uso queda limitado al transporte de moleculas pequenas.

El RMT utiliza un sistema de transporte dependiente de receptor. El transporte se realiza a traves de mecanismos de endocitosis dirigiendo a receptores/transportadores endogenos presentes a nivel de los capilares cerebrales. Entre los diferentes receptores humanos de la BHE implicados en el RMT, se incluyen especialmente: el receptor de la transferrina (TfR), el receptor de la insulina (IR), los receptores de las lipoprotefnas de baja densidad (LDL) que permiten el transporte de colesterol, entre los cuales el receptor de las LDL (LDLR) y los miembros de la familia de protemas relacionadas con el receptor de lipoprotefnas de baja densidad (LRP), o tambien el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina (IGFR), el receptor de la toxina difterica (DTR) o el factor de crecimiento similar al factor de crecimiento epidermico que se une a heparina (HB-EGF), asf como los receptores de barrido (SCAV-Rs), entre los cuales el receptor de barrido de clase B tipo I (SR-BI). En el RMT, los receptores en la membrana de una

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

celula endotelial de la BHE se unen a su ligando, lo que provoca la endocitosis del complejo constituido por el receptor/transportador y su ligando en una vesmula que se forma en la superficie de la celula y luego penetra en la celula endotelial de la BHE. El complejo ligando/receptor puede pasar a traves de la celula endotelial (transcitosis), y por lo tanto atravesar la BHE para actuar en el tejido nervioso. Este proceso de RMT no depende del tamano de lo que se endocita. Por lo tanto, el RMT es un mecanismo que permite el transporte desde la sangre hasta el cerebro de moleculas tales como la insulina, protemas transportadoras de hierro, colesterol, diversos derivados peptfdicos y protemas, etc. Por ejemplo, la transferrina se utiliza como vector, ligando de TfR presentes sobre la BHE (Jefferies et al., 1984, Nature, 312, 162-163; Friden et al., 1983, Science, 259, 373-377; Friden, 1994, Neurosurgery, 35, 294298), y la molecula que se va a transportar (sustancia activa) se acopla a la transferrina (vector ligando). Aunque esta estrategia de transporte con ayuda de una macromolecula permite aumentar el paso de las moleculas de interes conjugadas a traves de la BHE, tiene algunas desventajas. En primer lugar, el acoplamiento de la molecula con el vector se realiza normalmente por metodos de expresion genetica (fusion), lo que limita la cantidad de moleculas que se van a transportar a unicamente polipeptidos o protemas. Ademas, el sistema de acoplamiento de la molecula con el vector es bastante complejo, un acoplamiento qmmico o bioqmmico tradicional no permite obtener sistemas macromoleculares bien definidos desde un punto de vista estructural y molecular. Ademas, la competencia potencial entre los conjugados y los ligandos endogenos por el receptor diana, puede conducir ya sea a una inhibicion del proceso fisiologico de RMT o a una disminucion de la concentracion de ligandos endogenos, necesaria para el buen funcionamiento del cerebro. Los receptores RMT estan involucrados en procesos de senalizacion celular a nivel cerebral y los conjugados podnan interferir potencialmente con esos procesos.

El documento de solicitud de patente internacional n° WO2010/046588 describe por primera vez peptidos o seudopeptidos que se unen al LDLR humano y son capaces de transportar a traves de la BHE sustancias que pueden tener una masa y/o un volumen importante(s).

La presente solicitud se refiere a nuevos peptidos que se unen a LDLR humano, optimizados para el transporte de moleculas.

Compendio de la invencion

La presente invencion proporciona peptidos o seudopeptidos optimizados, capaces de transportar a traves de las membranas celulares, y mas espedficamente la BHE, sustancias que pueden tener una masa y/o un volumen importante(s). La invencion permite de este modo mejorar la biodistribucion o la biodisponibilidad de moleculas de interes, en particular para mejorar su acceso (orientacion) al SNC.

En el documento de solicitud WO2010/046588, los inventores han desarrollado derivados de peptidos capaces de unirse al LDLR humano. Los inventores han mostrado que esos derivados eran capaces de cruzar la BHE. Los inventores tambien han mostrado que esos derivados permitfan transportar, en las celulas de la BHE, moleculas de interes terapeutico o de diagnostico.

Continuando sus investigaciones, los inventores fueron capaces de disenar y someter a ensayo nuevos peptidos que presentan propiedades ventajosas para el transporte de moleculas. Estos nuevos peptidos capaces de unirse al LDLR sin competir con el ligando natural y, por lo tanto, sin una interferencia con el transporte de la LDL endogena, representan nuevos productos (vectores) particularmente ventajosos para el diseno y el transporte de medicamentos o agentes de diagnostico o de formacion de imagenes, especialmente para llegar al SNC.

Un objeto de la invencion reside por lo tanto en un peptido o seudopeptido, caracterizado por que responde a la siguiente formula general (I):

A1-Met-A2-Arg-Leu-Arg-A3-Cys (I)

en la que A1 indica cistema o uno de sus analogos o isosteros, A2 indica prolina o uno de sus analogos o isosteros y A3 indica glicina o uno de sus analogos o isosteros. Con la condicion de que el residuo A2 sea un analogo de prolina cuando el residuo A1 es cistema, y que sea capaz de unirse a un receptor humano de lipoprotemas de baja densidad (hLDLR). Segun realizaciones preferidas, A1 indica cistema (Cys) o uno de sus analogos seleccionado entre (D)-cistema, penicilamina (Pen) y (D)-penicilamina ((D)-pen); A2 indica prolina (Pro) o uno de sus analogos seleccionado entre acido pipecolico (Pip) y acido tiazolidin-4-carboxflico (Thz); y/o A3 indica glicina (Gly) o sarcosina (Sar).

Un objeto preferido de la invencion reside en un peptido o seudopeptido con la siguiente formula general (I'): A1-Met-A2-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys (I')

en la que A1 indica cistema o uno de sus analogos, seleccionado preferiblemente entre (D)-cys, Pen y (D)-pen; y A2 indica prolina o uno de sus analogos seleccionado preferiblemente entre Pip y Thz.

Otro objeto particular de la invencion reside en un peptido o seudopeptido con la siguiente formula general (I"): A1-Met-A2-Arg-Leu-Arg-Ala-Cys (I")

5

10

15

20

25

30

35

40

45

en la que A1 indica cistema o uno de sus analogos seleccionado preferiblemente entre (D)-cys, Pen y (D)-pen; y A2 indica prolina o uno de sus analogos seleccionado preferiblemente entre Pip y Thz. La alanina (Ala) puede tener la configuracion L o D.

Los peptidos de la invencion presentan ventajosamente la capacidad de unirse al receptor humano de LDL (hLDLR), con una afinidad elevada. Por otra parte, tambien tienen un tamano reducido, tfpicamente inferior a 10 aminoacidos, lo que es particularmente ventajoso. Ejemplos particulares de tales peptidos incluyen en particular los peptidos de las secuencias SEQ ID NOs: 1 a 10.

Otro objeto de la invencion se refiere al uso de un peptido o seudopeptido tal como se ha definido anteriormente,

para la preparacion de una composicion farmaceutica o de diagnostico para transportar una sustancia activa o de

interes diagnostico, para la formacion de imagenes o en terapia.

Otro objeto de la invencion se refiere al uso de un peptido o seudopeptido tal como se ha definido anteriormente,

para aumentar la actividad biologica o disminuir la toxicidad de una sustancia activa o de interes a la que esta

acoplado.

Otro objeto de la invencion se refiere a un peptido o seudopeptido tal como se ha definido anteriormente, para su uso para transportar una sustancia activa o de interes diagnostico, para la formacion de imagenes o en terapia.

Otro objeto de la invencion se refiere a un peptido o seudopeptido tal como se ha definido anteriormente, para su uso para aumentar la actividad biologica o disminuir la toxicidad de una sustancia activa o de interes a la que esta acoplado.

La invencion tambien tiene por objeto cualquier compuesto conjugado con la siguiente formula (II):

VxDy (II)

en la que V representa un peptido o seudopeptido tal como se ha definido anteriormente, D representa una sustancia activa o de interes y x e y son numeros enteros comprendidos entre 1 y 5.

La invencion tambien se refiere a cualquier compuesto conjugado con la siguiente formula (III):

VxLzDy (III)

en la que V representa un peptido o seudopeptido tal como se ha definido anteriormente, L representa un brazo espaciador, D representa una sustancia activa o de interes, x e y son numeros enteros comprendidos entre 1 y 5, y z es un numero entero comprendido entre 1 y 10.

Otro objeto de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende al menos un compuesto conjugado tal como se ha definido anteriormente y uno o varios excipientes farmaceuticamente aceptables.

Otro objeto de la invencion se refiere a una composicion de diagnostico caracterizada por que comprende un agente de diagnostico o de formacion de imagenes medicas, constituido por un compuesto conjugado tal como se ha definido anteriormente.

Otro objeto de la invencion se refiere a un metodo para mejorar o permitir el paso de una molecula a traves de la BHE, que comprende el acoplamiento de esa molecula a un peptido o seudopeptido tal como se ha definido anteriormente.

Otro objeto de la invencion reside en un metodo mejorado de tratamiento de una patologfa en un sujeto con un medicamento, consistiendo la mejora en acoplar ese medicamento a un peptido o seudopeptido tal como se ha definido anteriormente.

La invencion se puede utilizar en cualquier marnffero, especialmente cualquier ser humano.

Leyendas de las figuras Figura 1

Esquema que ilustra los diferentes modos de paso de moleculas naturales o farmacologicas a traves de la BHE, adaptado de acuerdo con Abbott y Romero, 1996, Mol. Med. Today, 2 (3), 106-113.

Figura 2

Esquema comparativo de la smtesis en tandem y la smtesis a traves de un enlazador de un conjugado vector/molecula de interes terapeutico.

Figura 3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

A - Esquema del plasmido utilizado para clonar los hLDLR y mLDLR.

B - Esquema que representa la protema de fusion expresada por las celulas transfectadas.

Figura 4

Transferencia Western realizada en lmeas celulares CHO que expresan constitutivamente las protemas de fusion hLDLR-GFP o GFP (utilizada como control). Se detecta una banda de 190 kDa correspondiente al tamano de la protema de fusion hLDLR-GFP con el anticuerpo anti-hLDLR.

Figura 5

Inmunocitoqmmica sobre celulas CHO no permeabilizadas, que expresan de manera estable o bien A - solo la GFP (control), o B - la estructura artificial hLDLR-GFP. Los nucleos celulares se marcan con Hoechst (azul, A1 y B1). La fluorescencia de la GFP es visible en verde (A2 y B2), la del marcado del dominio extracelular de hLDLR por el anticuerpo anti-hLDLR es visible en rojo (A3 y B3) y la superposicion de los marcados rojos y verdes es visible en amarillo/naranja (A4 y B4). Se debe tener en cuenta que solo las celulas transfectadas de manera estable con la estructura artificial hLDLR-GFP expresan el receptor en la membrana (B3).

Figura 6

A - Celulas de la lmea CHO-hLDLR-GFP que expresan hLDLR-GFP (verde) incubadas con Dil-LDL (rojo), la superposicion de los marcados rojos y verdes es visible en amarillo/naranja, se debe tener en cuenta el fuerte marcado de las celulas.

B - Celulas de una lmea CHO-TfR-GFP que expresan hTfR-GFP (verde) incubadas con Dil-LDL (rojo): ausencia de union y de endocitosis de Dil-LDL.

C - Celulas de la lmea CHO-hLDLR-GFP que expresan hLDLR-GFP (verde) incubadas con transferrina acoplada a Texas Red (rojo): ausencia de union y de endocitosis del ligando Tf.

Se debe tener en cuenta la diferencia de la intensidad del marcado entre A, por una parte, B y C por otra parte, en donde solo se detecta el marcado de los receptores hTfR y hLDLR fusionados a GFP.

Figura 7

Esquema general de los peptidos sintetizados conjugados con rodamina o con el marcador S-Tag, con un brazo espaciador en el extremo C-terminal (C-term).

Descripcion detallada de la invencion

La invencion se refiere a derivados peptfdicos capaces de unirse al LDLR humano y a su uso en el campo farmaceutico, en particular para el transporte, a las celulas de la BHE, de moleculas de interes terapeutico o diagnostico.

El LDLR humano es una protema transmembranal de 839 aminoacidos que comprende tres regiones: la region extracelular (1-768), la region transmembranal (768-790) y la region citoplasmica (790-839). La region extracelular se divide en dos subregiones: la que se une a LDL (1-322) y la que esta en el exterior de la zona de union a LDL (322-768) (vease el documento WO2007/014992).

El cerebro tiene una necesidad importante de LDL para su buen funcionamiento. Los ligandos naturales de LDLR son LDL y, mas particularmente, la apolipoprotema B (ApoB) y la apolipoprotema E (ApoE), constitutivas de las partmulas de LDL que permiten asf el transporte de colesterol contenido en esas partmulas a traves de las membranas celulares y en particular de la BHE.

De este modo se ha demostrado que el LDLR permitfa la transcitosis de partmulas de LDL a traves de la BHE (Dehouck et al., 1997, J. Cell Biol., 138 (4), 877-889), a traves de un proceso de RMT, en vesmulas endosomicas particulares que impiden la fusion con el lisosoma. Estas lipoprotemas, una vez que han pasado la BHE por transcitosis, son recogidas entonces por las neuronas y/o los astrocitos (Spencer et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104 (18), 7594-7599). Esta propiedad se ha utilizado para transportar moleculas de interes terapeutico mediante nanopartmulas sobre las que se conjugan apolipoprotemas enteras (constitutivas de la LDL) (Kreuter et al., 2007, J. Control Release, 118, 54-58). En este estudio, sin embargo, se utilizo una apolipoprotema entera, y en forma acoplada a una nanopartmula con el fin de imitar la estructura de la partmula LDL.

El documento de solicitud de patente internacional n° WO2010/046588 describe por primera vez peptidos o seudopeptidos que se unen al LDLR humano y son capaces de transportar a traves de la BHE sustancias que pueden tener una masa y/o un volumen importantes.

La presente solicitud se refiere a nuevos peptidos que se unen al LDLR humano, optimizados para el transporte de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

moleculas. Los peptidos o seudopeptidos vectores se pueden sintetizar facilmente por v^a qmmica, y la mayoiia de las moleculas de interes terapeutico, o los agentes de formacion de imagenes o de diagnostico, se pueden acoplar al peptido o seudopeptido vector de forma simple y eficaz a traves de una estrategia de profarmaco mediante un brazo espaciador (smtesis a traves de enlazador) o por acoplamiento directo (smtesis en tandem) entre las dos entidades (Figura 2). Los peptidos y seudopeptidos de la invencion estan disenados para adoptar una configuracion dclica, y por lo tanto mas resistente a la proteolisis. Por otra parte, los peptidos y seudopeptidos de la invencion se unen al LDLR sin competencia con el ligando natural.

Los peptidos o seudopeptidos de la invencion se pueden usar como vectores de moleculas de interes terapeutico, o agentes de formacion de imagenes o de diagnostico, o cualquier otra molecula como una sonda molecular, en el tratamiento, la formacion de imagenes y/o el diagnostico de patologfas neurologicas, asf como patologfas infecciosas o cancerosas cerebrales o no.

Los peptidos o seudopeptidos descritos en la presente invencion tienen la capacidad de dirigirse a

receptores/transportadores celulares, a tipos celulares particulares y/o de atravesar las membranas celulares en

particular las de las barreras fisiologicas del cerebro y mas particularmente la BHE o la barrera sangre-retina (BSR).

Los peptidos o seudopeptidos descritos en la presente invencion tienen la capacidad de dirigirse a

receptores/transportadores celulares, a tipos celulares particulares, en particular celulas cancerosas, tejido nervioso o no, y/o de atravesar las membranas celulares en particular las de las barreras fisiologicas del SNC y mas particularmente la barrera hemato-tumoral (BHT) a nivel detumores del tejido nervioso.

Los peptidos o seudopeptidos descritos en la presente invencion tienen la capacidad de dirigirse a

receptores/transportadores celulares, a tipos celulares particulares y/o de atravesar las membranas celulares, especialmente las de las barreras fisiologicas del SNC para tratar en particular patologfas infecciosas cerebrales u otras, de tipo bacterianas, vmcas, parasitarias o fungicas.

Los peptidos o seudopeptidos descritos en la presente invencion poseen la capacidad de fijarse sobre un LDLR murino o humano de la membrana celular y de atravesar dicha membrana gracias a este receptor por transcitosis.

Los peptidos o seudopeptidos descritos en la presente invencion poseen la capacidad de fijarse sobre el LDLR en la superficie de las membranas celulares de barreras fisiologicas del cerebro de tipo murino y humano y de atravesar dicha barrera fisiologica gracias a LDLR por RMT.

Un objeto de la invencion se refiere por tanto a peptidos o seudopeptidos caracterizados por que responden a la siguiente formula general (I):

A1-Met-A2-Arg-Leu-Arg-A3-Cys (I)

en la que:

- A1 indica cistema o uno de sus analogos o isosteros,

- A2 indica prolina o uno de sus analogos o isosteros, y

- A3 indica glicina o uno de sus analogos o isosteros.

Mas particularmente, el grupo A1 indica un residuo seleccionado entre cistema (Cys, C), de configuracion D o L, o un derivado de la misma seleccionado entre acido 2-amino-3-mercaptopropanoico y sus derivados sustituidos en S, S-acetilcistema o acido 2-amino-3-(acetiltio)propanoico, selenocistema (Sec, U) o acido 2-amino-3-

(seleno)propanoico, cisteinol, acido 3-mercaptopropanoico (Mpa) o penicilamina (Pen), de configuracion D o L.

En una realizacion preferida, el grupo A1 se selecciona entre cistema o penicilamina, de configuracion L o D

El grupo A2 indica mas preferiblemente un residuo seleccionado entre prolina (Pro, P) o acido pirrolidin-2- carboxflico, homoprolina o acido 2-(2-pirrolidinil)etanoico, 3-hidroxiprolina (3Hyp), 4-hidroxiprolina (4Hyp), 3- metilprolina, 3,4-deshidroprolina, 3,4-metanoprolina, 4-aminoprolina, 4-oxoprolina, tioprolina o acido tiazolidin-4- carboxflico (Thz), acido 2-oxotiazolidin-4-carboxflico, acido indolin-2-carboxflico (Idc), acido pipecolico (Pip) o acido pieperidin-2-carboxflico, acido nipecotico (Nip) o acido piperidin-3-carboxflico, acido 4-oxopipecolico, acido 4- hidroxipipecolico, acido amino-1-ciclohexano carboxflico, prolinol.

En una realizacion preferida, el grupo A2 se selecciona entre prolina, acido pipecolico (Pip) o acido tiazolidin-4- carboxflico (Thz).

El grupo A3 indica mas preferiblemente un residuo seleccionado entre glicina (Gly, G) o acido 2-aminoetanoico, sarcosina (Sar) o N-metilglicina (MeGly), N-etilglicina (EtGly), alilglicina (alilGly) o acido 2-aminopent-4-anoico, 2- ciclopentilglicina (Cpg), 2-ciclohexilglicina (Chg), 2,2-dipropilglicina (Dpg), 2-(3-indolil)glicina (IndGly), 2-indanilglicina (Igl), 2-neopentilglicina (NptGly), 2-octilglicina (OctGly), 2-propargilglicina (Pra) o acido 2-amino-pent-4-inoico, 2- fenilglicina (Phg), 2-(4-clorofenil)glicina, azaglicina (AzGly) o glicinol o 2-aminoetanol.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

En una realizacion preferida, el grupo A3 se selecciona entre glicina y sarcosina.

Entre los peptidos o seudopeptidos de formula (I), se prefiere mas particularmente los peptidos en los que el grupo A3 es glicina. Por lo tanto, un objeto particular de la invencion se refiere a los siguientes peptidos de formula (I'):

A1-Met-A2-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys ((I')

en la que A1 indica cistema o uno de sus analogos o isosteros, preferiblemente A1 indica Cys, (D)-cys, Pen o (D)- pen; y A2 indica un analogo de prolina, preferiblemente A2 indica Pip o Thz.

A continuacion se describen ejemplos particulares de peptidos de acuerdo con la invencion:

SEQ ID NO: 1, (D)-cys-Met-Pip-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO: 2, (D)-pen-Met-Pip-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO: 3, Pen-Met-Pip-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO: 4, (D)-cys-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO: 5, (D)-pen-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO: 6, Pen-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO: 7, (D)-cys-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Sar-Cys;

SEQ ID NO: 8, (D)-pen-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Sar-Cys;

SEQ ID NO: 9, Pen-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Sar-Cys;

SEQ ID NO: 10, (D)-cys-Met-Pro-Arg-Leu-Arg-(D)-ala-Cys.

Los resultados obtenidos por el solicitante muestran que los peptidos de la invencion tienen una afinidad mejorada hacia el LDLR. Por lo tanto, en comparacion con el peptido de referencia SEQ ID NO: 17, los peptidos sometidos a ensayo de formula (I) presentan todos una afinidad mejorada, como se desprende de la Tabla 1 (EJEMPLO III). Estos resultados son aun mas notables dado que la modificacion de otros residuos en la secuencia, como por ejemplo la sustitucion de los residuos de arginina, da lugar a una cafda sustancial de la afinidad (veanse los peptidos de referencia SEQ ID NO: 11-16).

SEQ ID NO: 11, (D)-Cys-Met-Pro-hArg-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO: 12, (D)-Cys-Met-Pro-Agb-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO: 13, (D)-Cys-Met-Pro-Agp-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO: 14, (D)-Cys-Met-Pro-Cit-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO: 15, (D)-Cys-Met-Pro-Arg-Leu-Cit-Gly-Cys;

SEQ ID NO: 16, (D)-Cys-Met-Pro-Arg-Leu-Arg(NO2)-Gly-Cys;

SEQ ID NO: 17, (D)-Cys-Met-Pro-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys.

Estos resultados son igualmente particularmente notables, teniendo en cuenta el tamano reducido de los peptidos (los peptidos anteriores comprenden 8 aminoacidos), lo que constituye una ventaja suplementaria en su uso industrial.

Como se ha indicado anteriormente, los peptidos o seudopeptidos dclicos de la invencion pueden comprender enlaces peptfdicos, no peptfdicos y/o peptfdicos modificados. En una realizacion preferida, los peptidos o seudopeptidos comprenden al menos un enlace peptidomimetico, seleccionado preferiblemente entre la intercalacion de un grupo metileno (-CH2-) o fosfato (-PO2-), amino secundario (-NH-) u oxfgeno (-O-), alfa- azapeptidos, alfa-alquilpeptidos, N-alquilpeptidos, fosfonamidatos, depsipeptidos, hidroximetilenos, hidroxietilenos, dihidroxietilenos, hidroxietilaminas, retro-inverso, metilenoxi, cetometileno, esteres, fosfinatos, fosfmicos, fosfonamidas, analogos de carba.

Por otra parte, en una realizacion particular, los peptidos o seudopeptidos de la invencion comprenden una funcion de N-term y/o C-term protegida respectivamente, por ejemplo, por una acilacion o por una amidacion o esterificacion.

Los peptidos o seudopeptidos de la invencion se pueden sintetizar mediante cualquier tecnica conocida de por sf por una persona experta en la materia (smtesis qmmica, biologica, genetica, etc.). Se pueden conservar tal cuales, o formulados en presencia de una sustancia de interes o cualquier excipiente aceptable.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

En las smtesis qmmicas, se utilizan aparatos comerciales que permiten incorporar tanto aminoacidos naturales como no naturales, tales como los enantiomeros D y residuos que tienen cadenas laterales con hidrofobicidades e impedimentos estericos diferentes de los de sus homologos naturales (aminoacidos denominados exoticos, es decir no codificados), o una secuencia peptidica que contiene uno o varios enlaces peptidomimeticos que pueden incluir, en particular, la intercalacion de un grupo metileno (-CH2-) o fosfato (-PO2-), amino secundario (-NH-) u ox^geno (-O- ), N-alquilpeptido.

Durante la smtesis, es posible introducir diversas modificaciones qmmicas, por ejemplo, poner en el extremo N-term, C-term o en una cadena lateral, un derivado lipfdico (o fosfolipfdico) o un componente de un liposoma o una nanopartmula, de forma que se pueda incorporar el peptido o seudopeptido de la invencion en el seno de una membrana lipfdica, tal como la de un liposoma constituido por una o varias capas o bicapas lipfdicas, o una nanopartmula.

Tambien se pueden obtener los peptidos de la invencion, o una parte de los mismos de naturaleza proteica a partir de una secuencia de acido nucleico que los codifica. La presente invencion tambien tiene por objeto una molecula de acido nucleico que comprende o que esta constituida por una secuencia de acido nucleico que codifica un peptido tal como se ha definido anteriormente. Mas particularmente, la invencion se refiere a una molecula de acido nucleico que comprende al menos una secuencia que codifica un peptido de formula general (I). Estas secuencias de acidos nucleicos pueden ser de ADN o ARN y estar asociadas con secuencias de control y/o estar insertadas en vectores de expresion biologicos.

El vector de expresion biologico utilizado se selecciona en funcion del hospedador en el que sera transferido. Puede ser por ejemplo un plasmido, cosmido, virus, etc. Estos acidos nucleicos y vectores de expresion biologicos constituyen objetos particulares de la invencion y son utiles para producir los peptidos de la invencion, o parte de los mismos de naturaleza proteica, en un hospedador celular. La preparacion de estos vectores de expresion biologicos asf como la produccion o la expresion en un hospedador de los peptidos, se pueden realizar por tecnicas de biologfa molecular e ingeniena genetica bien conocidas por el experto en la tecnica.

Otro objeto de la invencion reside en el uso de un peptido o seudopeptido dclico, tal como se ha definido anteriormente, como vector para la transferencia/transporte de moleculas de interes terapeutico, o agentes de formacion de imagenes o de diagnostico o cualquier otra molecula.

Otro objeto de la invencion reside en el uso de un peptido o seudopeptido dclico, tal como se ha definido anteriormente, para la preparacion de un medicamento capaz de atravesar la BHE.

Otro objeto de la invencion se refiere a un metodo para permitir o mejorar el paso de una molecula a traves de la BHE, que comprende el acoplamiento de la molecula a un peptido o seudopeptido de la invencion.

Por lo tanto, un objeto particular de la invencion se refiere a un compuesto conjugado con la siguiente formula (II):

VxDy (II)

en la que V representa un peptido o seudopeptido de la invencion, D representa una sustancia activa o de interes, y x e y son numeros enteros comprendidos entre 1 y 5. En una realizacion particular, x e y son iguales a 1, x es superior a y, o y es superior a x.

Otro objeto particular de la invencion se refiere un compuesto conjugado con la siguiente formula (III):

VxLzDy (III)

en la que V representa un peptido o seudopeptido de la invencion, L representa un brazo espaciador, D representa una sustancia activa o de interes, x e y son numeros enteros comprendidos entre 1 y 5, y z es un numero entero comprendido entre 1 y 10. En una realizacion particular, x=y=z=1 o x=z>y o y=z>x o z>x>y.

La sustancia activa o de interes puede ser cualquier molecula de interes farmaceutico, en particular terapeutico, un agente de diagnostico o de formacion de imagenes medicas, o una sonda molecular. Se puede tratar especialmente de cualquier entidad qmmica que tenga un interes biologico tal como una pequena molecula qmmica (antibiotico, agente antiviral, inmunomodulador, anticancengeno, antiinflamatorio, etc.), un peptido o un polipeptido, una protema (enzima, hormona, citocina, apolipoprotema, factor de crecimiento, antfgeno, anticuerpo o una porcion de anticuerpo), un acido nucleico (acido ribonucleico o acido desoxirribonucleico de origen humano, vmco, animal, eucariota o procariota, vegetal, sintetico, etc., que puede tener un tamano variable, que va desde un simple oligonucleotido hasta el genoma o un fragmento del genoma), un genoma vmco o un plasmido, una ribozima, un marcador o trazador. En general, la "sustancia de interes" puede ser cualquier principio activo de medicamento, que se trate de un producto qmmico, bioqmmico, natural o sintetico. La expresion "pequena molecula qmmica" se refiere a una molecula de interes farmaceutico que tiene un peso molecular de 10O0 Dalton como maximo, tfpicamente comprende entre 300 y 700 Dalton.

Otro objeto particular de la invencion se refiere a un compuesto con la siguiente formula (IV):

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

VxLz (IV)

en la que V representa un peptido o seudopeptido de la invencion, L representa un brazo espaciador, x es un numero entero comprendido entre 1 y 5, y z es un numero entero comprendido entre 1 y 10. En una realizacion particular, x=z=1 o z>x.

En los compuestos conjugados de la invencion, el acoplamiento entre V y D o entre V y L por un lado y entre L y D por otro lado, se puede realizar por cualquier medio de union aceptable, teniendo en cuenta la naturaleza qmmica, el impedimento y el numero de sustancia(s) activa(s) y de peptido(s) o seudopeptido(s) asociados. El acoplamiento se puede realizar de este modo a traves de uno o varios enlaces covalentes, ionicos, de hidrogeno, hidrofobos o de Van der Waals, escindibles o no en medio fisiologico o en el interior de las celulas. Ademas, D puede estar acoplado a V, en su caso a traves de L, a nivel de diferentes grupos reactivos, y en particular de un extremo o varios extremos N-term y/o C-term de V, y/o a nivel de uno o varios grupos reactivos transportados por las cadenas laterales de aminoacidos naturales o no, que constituyen V.

El acoplamiento se puede efectuar en cualquier sitio del peptido o seudopeptido, en el que grupos funcionales tales como -OH, -SH, -CO2H, -NH2, -SO3H, -PO2H estan presentes de forma natural o se han introducido. Por lo tanto, una molecula de interes terapeutico, o un agente de diagnostico (o de formacion de imagenes medicas) o cualquier otra molecula como una sonda molecular, se puede unir (acoplar) al peptido o seudopeptido vector de la invencion mediante un enlace covalente, ya sea a nivel de los extremos N-term o C-term, o bien a nivel de los grupos reactivos transportados por las cadenas laterales de los aminoacidos naturales o no, de esta secuencia peptidica.

De manera similar, el acoplamiento se puede efectuar en cualquier sitio de la sustancia activa o de interes (molecula de interes terapeutico, agente de diagnostico o de formacion de imagenes medicas, cualquier otra molecula como una sonda molecular), en donde, por ejemplo, grupos funcionales tales como -OH, -SH, -CO2H, -NH2, -SO3H, -PO2H estan presentes de forma natural o se han introducido.

Se prefiere que la interaccion sea suficientemente fuerte para que el peptido no se disocie de la sustancia activa antes de haber alcanzado su sitio de accion. Por esta razon, el acoplamiento preferido de acuerdo con la invencion es un acoplamiento covalente pero, sin embargo, podna ser un acoplamiento no covalente. La sustancia de interes puede estar acoplada directamente al peptido (smtesis en tandem) o a uno de sus extremos terminales (N-term y C- term), bien a nivel de una cadena lateral de uno de los aminoacidos constituyentes de la secuencia (Majumdar y Siahaan, Med Res Rev., Epub ahead of print). La sustancia de interes tambien se puede acoplar indirectamente a traves de un brazo de union o un brazo espaciador (smtesis a traves de enlazador) o bien con uno de los extremos terminales de los peptidos, bien a nivel de una cadena lateral de uno de los aminoacidos constituyentes de la secuencia (Figura 2). Se puede mencionar como medio de acoplamiento qmmico covalente, haciendo referencia o no a un brazo espaciador, los seleccionados entre agentes bifuncionales o multifuncionales que contienen grupos alquilo, arilo o peptfdico mediante esteres, aldetudos o acidos de alquilo o arilo, grupos antudridos, sulfhidrilos o carboxilos, grupos derivados de bromuro o cloruro de cianogeno, carbonildiimidazol, esteres de succinimida o haluros sulfonicos.

En este sentido, un objeto de la invencion tambien reside en un procedimiento de preparacion de un compuesto conjugado tal como se ha definido anteriormente, caracterizado por que comprende una etapa de acoplamiento entre un peptido o seudopeptido V y una sustancia D, en su caso a traves de L, preferiblemente por via qmmica, bioqmmica, enzimatica o mediante ingeniena genetica.

Otro objeto de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica caracterizada por que comprende al menos un compuesto conjugado tal como se ha definido anteriormente y uno o varios excipientes farmaceuticamente aceptables.

Otro objeto de la invencion se refiere a una composicion de diagnostico caracterizada por que comprende un agente de diagnostico o de formacion de imagenes constituido por un compuesto conjugado tal como se ha definido anteriormente.

El conjugado se puede usar en forma de cualquier sal farmaceuticamente aceptable. Por sales farmaceuticamente aceptables se entiende, por ejemplo y de manera no limitativa, sales de adicion basica o acida farmaceuticamente aceptables, hidratos, esteres, solvatos, precursores, metabolitos o estereoisomeros de dichos vectores o conjugados cargados con al menos una sustancia de interes.

La expresion sales farmaceuticamente aceptables se refiere a sales no toxicas que se pueden preparar generalmente haciendo reaccionar una base libre con un acido organico o inorganico adecuado. Estas sales conservan la eficacia biologica y las propiedades de las bases libres. Como ejemplos representativos de tales sales se pueden citar las sales hidrosolubles e insolubles en agua, tales como acetatos, N-metilglucamina amonio, ansonatos (4,4-diaminoestilbenos-2,2'-disulfonatos), bencenosulfonatos, benzonatos, bicarbonatos, bisulfatos, bitartratos, boratos, bromhidratos, bromuros, buriratos, camsilatos, carbonatos, clorhidratos, cloruros, citratos, clavulariatos, diclorhidratos, difosfatos, edetatos, edetatos de calcio, edisilatos, estolatos, esilatos, fumaratos, gluceptatos, gluconatos, glutamatos, glicolilarsanilatos, hexafluorofosfatos, hexilresorcinatos, hidrabaminas, hidroxinaftoatos, yoduros, isotionatos, lactatos, lactobionatos, lauratos, malatos, maleatos, mandelatos, mesilatos,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

metilbromuros, metilnitratos, metilsulfatos, mucatos, napsilatos, nitratos, 3-hidroxi-2-naftoatos, oleatos, oxalatos, palmitatos, pamoatos (1,1-metilen-bis-2-hidroxi-3-naftoatos o emboatos), pantotenatos, fosfatos, picratos, poligalacturonatos, propionatos, p-toluenosulfonatos, salicilatos, estearatos, subacetatos, succinatos, sulfatos, sulfosalicilatos, suramatos, tanatos, tartratos, teoclatos, tosilatos, trietiodidos, trifluoroacetatos, valeratos.

Las composiciones de la invencion comprenden ventajosamente un vehmulo o excipiente farmaceuticamente aceptable. El vehmulo farmaceuticamente aceptable se puede seleccionar entre los vehmulos utilizados de manera clasica de acuerdo con cada uno de los modos de administracion. Dependiendo del modo de administracion previsto, los compuestos pueden estar en forma solida, semisolida o Kquida. Para las composiciones solidas tales como comprimidos, pfldoras, polvos o granulos en estado libre o incluidos en capsulas, la sustancia activa se puede combinar con: a) diluyentes, por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina; b) lubricantes, por ejemplo, sflice, talco, acido estearico, su sal de magnesio o calcio y/o polietilenglicol; c) aglutinantes, por ejemplo, silicato de magnesio y aluminio, pasta de almidon, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sodica y/o polivinilpirrolidona; d) desintegrantes, por ejemplo, almidon, agar, acido algmico o su sal sodica, o mezclas efervescentes; y/o e) absorbentes, colorantes, aromatizantes y edulcorantes. Los excipientes pueden ser, por ejemplo, manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, y analogos de calidad farmaceutica. Para las composiciones semisolidas, tales como supositorios, el excipiente puede ser, por ejemplo, una emulsion o una suspension oleosa, o a base de polialquilenglicol tal como polipropilenglicol. Las composiciones lfquidas, particularmente inyectables o para incluir en una capsula blanda, se pueden preparar, por ejemplo, disolviendo, dispersando, etc. la sustancia activa en un disolvente farmaceuticamente puro tal como, por ejemplo, agua, suero fisiologico, dextrosa acuosa, glicerol, etanol, aceite y sus analogos.

Las composiciones o conjugados de la invencion se pueden administrar por cualquier via adaptada y, de manera no limitativa, por la via parenteral, como por ejemplo en forma de preparaciones inyectables por via subcutanea, intravenosa o intramuscular; por via oral (o per os), como por ejemplo, en forma de comprimidos recubiertos o no, capsulas, polvos, granulos, suspensiones o soluciones orales (una forma de este tipo para administrar por via oral puede ser o bien liberacion inmediata o bien liberacion sostenida o retardada); - por via rectal, como por ejemplo en forma de supositorios; - por via topica, en particular transdermica, como por ejemplo, en forma de parches, pomadas o geles; - por via intranasal, como por ejemplo en forma de aerosoles y vaporizaciones; - por via perlingual; - por via intraocular.

Las composiciones farmaceuticas comprenden normalmente una dosis eficaz de un peptido o seudopeptido o conjugado de la invencion. Una "dosis terapeuticamente eficaz" tal como se describe en el presente documento, se entiende como la dosis que proporciona un efecto terapeutico para una afeccion y un regimen de administracion dados Esto es tipicamente la dosis media de una sustancia activa que se va a administrar para mejorar sustancialmente alguno de los smtomas asociados con una enfermedad o un estado patologico. Por ejemplo, en el tratamiento de un cancer cerebral o no, una patologfa, una lesion o un trastorno del SNC, la dosis de una sustancia activa que disminuye, previene, retrasa, suprime o detiene una de las causas o uno de los smtomas de la enfermedad o del trastorno, sena terapeuticamente eficaz.

Una "dosis terapeuticamente eficaz" de una sustancia activa no cura necesariamente una enfermedad o un trastorno, pero proporcionara un tratamiento para esa enfermedad o ese trastorno de forma que su aparicion se retrase, impida o evite, o que sus smtomas se mitiguen, o que se modifique su termino o, por ejemplo, sea menos grave o que se acelere la recuperacion del paciente.

Se entiende que la "dosis terapeuticamente eficaz" para una persona en particular dependera de diversos factores, incluyendo la actividad/eficacia de la sustancia activa, la hora de administracion, la via de administracion, la tasa de excrecion y su metabolismo, las asociaciones/interacciones medicamentosas y la gravedad de la enfermedad (o el trastorno) tratada a tftulo preventivo o curativo, asf como la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y/o el regimen alimentario del paciente.

De acuerdo con la sustancia acoplada, los conjugados y composiciones de la invencion se pueden utilizar para el tratamiento, la prevencion, el diagnostico o la formacion de imagenes de numerosas patologfas, en particular de patologfas que afectan al SNC, patologfas infecciosas o canceres.

A este respecto, la invencion se refiere al uso de conjugados o composiciones farmaceuticas, tales como las que se han descrito anteriormente, para el tratamiento o la prevencion de patologfas o trastornos del SNC, tumores cancengenos cerebrales u otras celulas cancerosas, y patologfas infecciosas cerebrales u otras, de tipo bacterianas, vmicas, parasitarias o fungicas.

La invencion tambien se refiere al uso de conjugados o composiciones farmaceuticas, tales como las que se han descrito anteriormente, para el diagnostico o la formacion de imagenes de patologfas o trastornos del SNC, tumores cancengenos cerebrales u otras celulas cancengenas, y patologfas infecciosas cerebrales u otras, de tipo bacterianas, vmcas, parasitarias o fungicas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

La invencion tambien se refiere al uso de un conjugado o una composicion tales como las que se han definido anteriormente, para el tratamiento, la formacion de imagenes y/o el diagnostico de un tumor cancengeno cerebral u otro tipo de celulas cancerosas. Los estudios han mostrado de hecho que los pacientes con ciertos tipos de cancer presentan hipocolesterolemia. Esta hipocolesterolemia es la consecuencia del uso excesivo de colesterol por las celulas cancerosas. Estas ultimas inducen para sobrevivir un aumento del nivel de expresion del LDLR en el seno de organos tumorales (Henricksson et al., 1989, Lancet 2 (8673), 1178-1180). Existe, pues, una correlacion entre el aumento del nivel de expresion del LDLR por las celulas y ciertos tipos de cancer. Tambien se ha demostrado recientemente que el numero de LDLR era muy importante en la superficie de ciertas celulas patologicas como las celulas cancerosas. En general se acepta que 1000 a 3000 LDLR estan presentes en la superficie de una celula no patologica. Del mismo modo, las neuronas no patologicas solo presentan un bajo numero de LDLR (Pitas et al., 1987, J. Biol. Chem., 262, 14352-14360). En el caso de glioblastoma, se ha demostrado una sobreexpresion del LDLR. Por lo tanto, se han contabilizado en la superficie de las celulas cerebrales tumorales desde 125000 (para las celulas U-251) hasta 900000 (para las celulas SF-767) LDLRs (Malentiska et al., 2000, Cancer Res., 60, 2300-2303; Nikanjam et al., 2007, Int. J. Pharm., 328, 86-94). Se debe tener en cuenta tambien que muchas de las celulas tumorales sobreexpresan el LDLR, tales como las del cancer de prostata (Chen et al., 2001, Int. J. Cancer, 91, 4145), cancer de colon (Niendorf et al., 1995, Int. J. Cancer, 61, 461-464), leucemias (Tatidis et al., 2002, Biochem. Pharmacol., 63, 2169-2180), cancer colorrectal (Caruso et al., 2001, Anticancer Res., 21, 429-433), cancer de mama (Graziani et al., 2002, Gynecol. Oncol., 85, 493-497), asf como los canceres de tugado, pancreas, ovarios, pulmon, estomago, etc.

La invencion tambien se refiere al uso de un conjugado o una composicion tales como se han definido anteriormente en este documento para el tratamiento, la formacion de imagenes y/o el diagnostico de patologfas infecciosas cerebrales u otras, de tipo bacterianas, vmcas, parasitarias o fungicas, tales como, y de manera no limitativa, SIDA o incluso meningitis, etc. El LDLR tambien esta presente en las celulas del tugado. Se sabe ahora que la endocitosis del virus de la hepatitis C (VHC) se puede realizar a traves del LDLR. El LDLR podna servir de receptor vmco en un estadio precoz de la infeccion de los hepatocitos humanos con los VHC (Molina et al., 2007, J. Hepatol., 46 (3), 411419). Los conjugados de la invencion se pueden utilizar por tanto para dirigirlos espedficamente a celulas patologicas, infectadas con virus, tales como los de la hepatitis B y C, que expresan el LDLR y/o para modular el proceso de infeccion de las celulas sanas a traves de los virus, via el LDLR.

La invencion tambien se refiere al uso de un conjugado o una composicion tales como se han definido anteriormente para el tratamiento, la formacion de imagenes y/o el diagnostico de patologfas neurodegenerativas tales como de manera no limitativa, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, los accidentes cerebrovasculares (AVC), la encefalitis espongiforme bovina, la esclerosis en placas, la esclerosis lateral amiotrofica, etc.

La invencion tambien se refiere al uso de un conjugado o de una composicion tales como se han definido anteriormente para el tratamiento, la formacion de imagenes y/o el diagnostico de patologfas neurologicas tales como de manera no limitativa, la epilepsia, la migrana, las encefalitis, los dolores del SNC, etc.

La invencion tambien se refiere al uso de un conjugado o de una composicion tales como se han definido anteriormente para el tratamiento, la formacion de imagenes y/o el diagnostico de patologfas neurosiquiatricas tales como de manera no limitativa, la depresion, el autismo, la ansiedad, la esquizofrenia, etc.

Los terminos "tratamiento", "tratar" y otras expresiones similares significan la obtencion de un efecto farmacologico y/o fisiologico, por ejemplo, la inhibicion del crecimiento de las celulas cancerosas, la muerte de las celulas cancerosas o la mejona de una enfermedad o un trastorno neurologico. El efecto puede ser profilactico o preventivo con el fin de impedir total o parcialmente el agravamiento de una enfermedad o de un smtoma de la misma, en una persona enferma, o su propagacion, en sujetos sanos, y/o puede ser terapeutico con el fin de tratar total o parcialmente una enfermedad y/o sus efectos adversos. El termino "tratamiento" tal y como se usa en el presente documento cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mairnfero, y mas especialmente un ser humano, y comprende: (a) la prevencion de una enfermedad (por ejemplo, la prevencion del cancer) o de una afeccion que puede producirse en una persona predispuesta a esa patologfa o trastorno, pero que aun no ha sido diagnosticada como aquejada, (b) la desaceleracion de una enfermedad (por ejemplo, deteniendo su desarrollo) o (c) el alivio de una enfermedad (por ejemplo, reduciendo los smtomas asociados a una enfermedad). Este termino "tratamiento" tambien cubre cualquier administracion de una sustancia activa con el fin de curar, sanar, aliviar, mejorar, disminuir o inhibir una afeccion en un individuo o paciente, y comprende, sin limitacion, la administracion a una persona que requiere un medicamento compuesto de un vector o de un conjugado como se han descrito en este documento.

La presente invencion se refiere ademas al uso de un peptido o seudopeptido de la invencion para aumentar la actividad biologica de una sustancia activa o de interes (molecula de interes terapeutico, agente de diagnostico o de formacion de imagenes medicas, cualquier otra molecula como una sonda molecular) a la que esta acoplado.

La presente invencion tambien se refiere al uso de un peptido o seudopeptido de la invencion, para disminuir la toxicidad de la sustancia activa o de interes (molecula de interes terapeutico, agente de diagnostico o de formacion de imagenes medicas, cualquier otra molecula como una sonda molecular) a la que esta acoplado.

Otros aspectos y ventajas de la presente invencion apareceran con la lectura de los siguientes ejemplos, que solo son de naturaleza ilustrativa, y no limitan el alcance de la presente solicitud.

EJEMPLOS

EJEMPLO I

5 Construccion de lmeas celulares CHO que expresan de forma estable LDLR humanos y murinos.

Los inventores han identificado peptidos basandose en su interaccion y afinidad hacia los receptores humanos y murinos de lipoprotefnas de baja densidad (hLDLR y mLDLR), que participan en particular en la endocitosis y la transcitosis (transporte transcelular, en particular a traves de la BHE) del colesterol. El requisito previo a la caracterizacion de estos peptidos era el establecimiento en celulas eucariotas (celulas ovaricas de hamster chino 10 CHO) de lmeas estables que expresaban constitutivamente y con tasas elevadas hLDLR y mLDLR. Estas lmeas se utilizan: i) para caracterizar peptidos que se fijan al hLDLR expresado en la superficie celular, en su configuracion natural; ii) para verificar que el hLDLR y mLDLR pueden internalizar los peptidos seleccionados por endocitosis.

La construccion de estas lmeas se ha descrito en el documento de solicitud WO2010/046588. Brevemente, las secuencias de ARN mensajero que codifican hLDLR y mLDLR estan disponibles en bases de datos (numeros de 15 acceso: NM_000527 y NM_010700, respectivamente). Los cebadores necesarios para la amplificacion de los ADNc mediante PCR se seleccionaron, comprendiendo en su extremo (en negrita) sitios de restriccion necesarios (HindIII y SalI para el LDLR humano y HindIII y Kpnl para el LDLR murino) para la clonacion en el vector de expresion pEGFP- N1 (Clontech)

hLDLR

20 Cebador Directo: ATATATAAGCTTCGAGGACACAGCAGGTCGTGAT (SEQ ID NO: 18)

Cebador Inverso: TTAATTGTCGACCACGCCACGTCATCCTCCAGACT (SEQ ID NO: 19) mLDLR

Cebador Directo: ATATATAAGCTTGACGCAACGCAGAAGCTAAG (SEQ ID NO: 20)

Cebador Inverso: TTAATTGGTACCGTTGCCACATCGTCCTCCAG (SEQ ID NO: 21)

25 Los ARN totales preparados a partir de cerebros humanos y murinos se transformaron en ADNc mediante transcripcion inversa para la amplificacion con PCR de fragmentos de ADN que codificaban hLDLR y mLDLR. Despues de la amplificacion, los productos de la PCR fueron digeridos con las enzimas de restriccion HindIII-SalI y HindIII-KpnI, respectivamente, y se ligaron en el vector de expresion pEGFP-N1 (Clontech) digerido con las mismas enzimas de restriccion. Despues de la transfeccion en celulas eucariotas, este vector permite la expresion, bajo el 30 control del promotor CMV, de LDLR fusionado a GFP en su extremo C-term, es decir, al final de sus dominios intracelulares (Figura 3). Despues de la transformacion de bacterias competentes E. coli DH5a, la obtencion de colonias aisladas, la preparacion del ADN de los plasmidos, se secuenciaron completamente las estructuras artificiales de las 2 hebras para verificar.

Las transfecciones transitorias en diversas lmeas celulares (CHO, COS, N2A y HEK293) se llevaron a cabo para 35 determinar en celulas vivas o fijadas, los niveles de expresion y la localizacion membranal de hLDLR y mLDLR. El receptor es visible directamente sobre las celulas vivas, con microscopfa de fluorescencia, sin necesidad de inmunotincion, gracias a la fluorescencia verde emitida por GFP fusionada en C-term de estos receptores. Los transfectantes estables se seleccionaron mediante dilucion limitante y gracias al gen de resistencia a la geneticina (G418) transportado por el vector de expresion. Estas lmeas se amplificaron a la vez que se mantema la presion de 40 seleccion. En el ejemplo descrito en esta memoria, la expresion de hLDLR-GFP del tamano esperado se verifico por transferencia Western en lisados celulares con anticuerpos dirigidos contra el LDLR humano y contra la GFP. Una protema correspondiente a los tamanos combinados de GFP y hLDLR (190 kDa) es reconocida por el anticuerpo anti-hLDLR (Figura 4) y anti-GFP en extractos celulares preparados a partir de lmeas estables. Una lmea CHO que expresaba GFP constitutivamente, se utilizo como control negativo. El anticuerpo anti-hLDLR no detecta ninguna 45 protema en la lmea GFP.

La inmunocitoqmmica con el anticuerpo anti-hLDLR sobre celulas fijadas (PFA) de las lmeas CHO-GFP (usada como control) y CHO-hLDLR-GFP muestra que la fusion hLDLR-GFP se expresa bien en las celulas transfectadas. Experimentos de inmunocitoqmmica sobre celulas no permeabilizadas con Triton X100, muestran que el dominio extracelular del LDLR se detecta bien a nivel extracelular (Figura 5).

50 Se muestra una colocalizacion entre el hLDLR y su ligando natural la LDL, que emitfa fluorescencia mediante la adsorcion de DiI, un marcador fluorescente. Este ligando natural fluorescente (DiI-LDL) se internaliza rapidamente (endocitosis) como se observa con un microscopio de fluorescencia sobre celulas fijadas (Figura 6-A). Por el contrario, DiI-LDL no es endocitado por la lmea de control CHO-GFP, o por otra lmea de control de celulas CHO, que sobreexpresa por ejemplo el receptor humano de la transferrina (hTfR, la Figura 6-B), otro receptor implicado en

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

la transcitosis. Ademas, la actividad endodtica de la lmea CHO-LDLR-GFP es espedfica del ligando de LDLR, ya que en esa lmea no se observa endocitosis de ligando que no sea espedfica, a titulo de ejemplo la transferrina (Tf) marcada con un fluorocromo rojo (rojo de Texas, Figura 6-C).

La funcionalidad de los receptores (capacidad de endocitosis) se confirma por experimented en tiempo real, con video-microscopfa de fluorescencia que muestra que la LDL, el ligando natural de hLDLR, marcada con Dil, se transporta efectivamente de forma rapida y muy eficazmente en las celulas que expresan hLDLR-GFP, en comparacion con las celulas que expresan solo GFP o las celulas que expresan otro receptor implicado en la endocitosis, tal como hTfR (controles negativos). Por el contrario, experimentos de video-microscopfa realizados con Tf marcada con rojo de Texas, que es endocitada de manera muy eficaz por las celulas que expresan hTfR-GFP, confirman que la transferrina no es endocitada por las celulas de una lmea de control gFp ni por celulas de una lmea hLDLR.

A pesar de la tasa elevada de expresion de hLDLR en las lmeas CHO-hLDLR-GFP, el sistema de endocitosis no es solo eficaz, sino que ha conservado su selectividad. La presencia de la fusion GFP no ha alterado ni las propiedades de insercion en la membrana de hLDLR, ni la exposicion en el exterior de la celula del dominio extracelular de hLDLR, ni la funcionalidad del receptor en el proceso de endocitosis.

Ejemplo II

Smtesis peptidicas y acoplamientos a una molecula trazadora (biotina, fluoresceina o S-Tag con actividad enzimatica).

Los peptidos se sintetizaron por el metodo de smtesis en fase solida (solid phase peptide synthesis o SPPS) en un sintetizador automatico, modelo Advanced ChemTech Apex396 (AAPPTec), o en un sintetizador automatico bajo un campo de microondas focalizado, modelo Liberty® (EMC), usando una estrategia Fmoc/tBu sobre una resina Rink Amida AM sobre poliestireno-1% de DVB, o una resina Wang sobre poliestireno-1% de DVB, o una resina Barlos (cloruro de 2-clorotritilo) sobre poliestireno-1% de DVB, o una resina Sieber Amida sobre poliestireno-1% de DVB. La carga (o sustitucion) esta comprendida entre 0,25 y 1,6 mmol/g, dependiendo de la resina utilizada.

Los aminoacidos protegidos en N con un Fmoc (o un Boc para ciertos extremos N-term) y/o protegidos con funciones ortogonales (acido-labiles particularmente) a nivel de sus cadenas laterales, los reactivos qmmicos de acoplamiento y desproteccion, y los disolventes se compraron a empresas especializadas y se utilizan tal cuales.

Las resinas Rink Amida y Wang permiten sintetizar las secuencias peptidicas completamente desprotegidas en sus cadenas laterales y sus extremos C-term. Esto se denomina smtesis peptidica SpPS ortogonal en 2 dimensiones (Fmoc/tBu).

Las resinas "hypersensitive acid labile o HAL" de tipo Barlos y Sieber permiten respectivamente la liberacion de la funcion acido o amida terminal (en C-term) a la vez que conservan las protecciones laterales ortogonales de diferentes aminoacidos del peptido sintetizado, asf como la proteccion amino-terminal (N-term) de la funcion amino de su ultimo aminoacido (por ejemplo, acetilacion en N por cuestiones de estabilidad de la secuencia peptidica sintetizada de nuevo). Este tipo de resinas a traves de una estrategia de smtesis Fmoc (en Proti) permite el uso de protecciones laterales ortogonales acido-labiles (Prot2 de tipo Boc, tBu, OtBu, Trt, Mmt, Acm, etc.) escindibles unicamente en medio fuertemente acido, de manera que el desacoplamiento del peptido protegido se realiza en condiciones acidas muy suaves. Este tipo de escision permite recuperar la secuencia peptidica totalmente protegida en sus funciones laterales (Prot2), en particular de cara al acoplamiento de una molecula de interes terapeutico en el peptido. Esto se denomina smtesis peptidica SPPS ortogonal en 3 dimensiones (Barlos o Sieber/Fmoc/tBu).

Las protecciones laterales ortogonales (Prot2) estandar, utilizadas para cada aminoacido a lo largo de la smtesis peptidica son: Arg(N-Pbf), Arg(N-Pmc), Asn(N-Trt), Asp(O-tBu), Cys(S-Acm), Cys(S-Mmt), Cys(S-4MeBn), Cys(S- tBu), Cys(S-Tmob), Cys(S-Trt), Glu(O-tBu), Gln(N-Trt), His(N-Trt), Lys(N-Boc), Pen(S-Acm), Pen(S-Trt), Ser(O-tBu), Thr(O-tBu), Trp(N-Boc), Tyr(O-tBu) (Applied Biosystems, 1998, Cleavage, Deprotection, and Isolation of Peptides after Fmoc Synthesis. Technical Bulletin). Gly, Sar, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Met, Pro, Pip y Thz no tienen protecciones laterales ya que sus estructuras qmmicas respectivas no lo requieren.

Los acoplamientos de aminoacidos se realizan a traves de la activacion de la funcion acido del aminoacido n+1 con ayuda de DlEA/HBTU/HOBt o DIPC/HOBt en DMF.

La desproteccion del grupo Fmoc (Proti) de un nuevo aminoacido acoplado de este modo, se realiza utilizando 20% de piperidina en DMF.

El ultimo aminoacido acoplado a lo largo de la secuencia peptidica estara protegido o bien por una funcion Boc (de cara a liberar su funcion amino terminal libre al final de la smtesis) o bien acetilado (con el fin de estabilizar el neo- peptido sintetizado, pero tambien para reducir el riesgo de reacciones secundarias durante el acoplamiento covalente de la molecula de interes terapeutico en el extremo C-term, por ejemplo), o bien propionilado.

En funcion del peptido sintetizado, los puentes disulfuro se obtienen mediante ciclacion intramolecular a partir de 2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

funciones tiol de 2 Cys protegidas de forma adecuada (Acm, Trt, tBu, etc.), ya sea en solucion o sobre la resina, con ayuda de reactivos usados convencionalmente por el experto en la tecnica: H2O/AcOH/(NH4)2CO3/DMSO, H2O/AcOH/(NH4)2COa, I2/DMF, I2/HFIP/DCM, TFA/DMSO/anisol, h/DCM/MeOH/^O, etc. Una Cys en la posicion N- term se puede reemplazar ventajosamente por Pen o Mpa para la ciclacion a traves de un puente disulfuro. Los puentes de lantioninas (mediante ciclacion a traves de deshidroalanina) o dicarba (mediante ciclacion a traves de alilGly) tambien se pueden obtener por rutas de smtesis conocidas por el experto en la materia. Un puente de lactama se puede crear entre la funcion acido lateral de un residuo Glu (o Asp) y una funcion amino lateral en una Lys o un amino N-term. Del mismo modo, una ciclacion entre la funcion amino N-term y la funcion acido C-term (cabeza/cola) se puede llevar a cabo a traves de un enlace amida, al igual que una ciclacion entre la funcion amino lateral de una Lys y la funcion acido C-term del peptido (Majumdar y Siahaan, Med Res Rev., Epub ahead of print).

La escision de los peptidos de las resinas Barlos o Sieber se realiza por metodos usados convencionalmente por el experto en la tecnica, ya sea con 0,5% de TFA (v/v) en DCM, o con AcOH/TFE/DCM (1/1/3) o bien con HFIP (30%) en DCM, o con TFE (30%) en DCM, etc.

Las desprotecciones de las cadenas laterales y la escision de los peptidos de las resinas Rink Amida o Wang, se llevan a cabo por metodos usados convencionalmente por el experto en la tecnica: ya sea con una mezcla de TFA/H2O/TIS o TIPS (95/2,5/2,5), o bien con TFA/H2O/EDT/TIS o TIPS (94/2,5/2,5/1), o bien con TFA/tioanisol/H2O (94/5/1) o bien con TFA/TIS/H2O/tioanisol (90/5/3/2), o bien con TFA/H2O/fenol/tioanisol/EDT (82,5/5/5/5/2,5), etc.

Las biotinas, fluorescemas o S-Tag (vease el EJEMPLO IV, mas adelante) se introducen generalmente en C-term, estos trazadores a veces se acoplan en N-term, de acuerdo con los procedimientos de smtesis y de acoplamiento clasicos conocidos por el experto en la materia.

Los peptidos se afslan y se purifican por HPLC en un aparato Beckman System Gold 126 con una columna Chromolith C18 (4,6 x 50 mm) o Nucleosil C18 (10 x 250 mm), por ejemplo, con un gradiente de 0 a 100% de acetonitrilo en una fase acuosa (H2O + 0,1% de TFA) en 3,5 min, despues de 100 a 0% durante 1,5 min (caudal: 1 a 5 ml/min), o en un equipo Waters 1525 con una columna (fase estacionaria) Chromolith Speed ROD RP-18 (4,6 x 50 mm) con deteccion por un equipamiento Waters 996 PDA (190 - 400 nm), o en un equipo Waters Alliance 2690 con una columna (fase estacionaria) Chromolith Performance RP-18 (3 x 100 mm) con deteccion por un equipamiento Waters 996 pDa (190 - 400 nm). La deteccion UV se realiza a 214 y 254 nm.

Las purificaciones preparativas se realizan con un equipo Waters Prep LC4000 System con una columna (fase estacionaria) Guard-Pak® cartuchos Delta-Pak® C18 (25 x 10 mm) con deteccion por un equipamiento Waters 2487 Dual 1 Absorbance Detector.

Los pesos moleculares se determinan usando un espectrometro de masas con electropulverizacion de iones (ESI) en modo positivo. Los espectros se obtienen usando un aparato Waters MicromassQuattro Micro (analizador cuadrupolo) equipado con un sistema de HPLC Waters Alliance 2690 que permite el acoplamiento LC-MS.

Las condiciones de los analisis LC-MS utilizados son las siguientes:

- columna C18 Chromolith Flash (4,6 x 25 mm),

- caudal de 3 ml/min,

- gradiente lineal de 0 a 100% de B en 2,5 min (A: H2O/0,1% de HCO2H; B: ACN/0,1% de HCO2H).

La adquisicion de los espectros de masas en modo de electropulverizacion positiva se realiza con un caudal de 100200 pl/min. Los datos se obtienen en modo exploracion desde 200 a 1700 m/z con intervalos de 0,1 s.

EJEMPLO III

Diseno de peptidos vectores.

El peptido de secuencia SEQ ID NO: 17/S-Tag, descrito en el documento de solicitud WO2010/046588, se utilizo como referencia.

A partir de ese peptido, se han realizado diferentes enfoques para tratar de mejorar las propiedades de union, de smtesis y de transporte. De este modo se han sintetizado numerosos peptidos, que difieren de SEQ ID NO: 17 por la delecion y/o sustitucion y/o modificacion qrnmica de uno o varios residuos de aminoacidos.

Se ha determinado la capacidad de los peptidos sintetizados de este modo para unirse a hLDLR.

Para este proposito, celulas CHO-hLDLR-RFP adherentes y confluentes, se cultivaron en placas de 6 pocillos. Se emplearon tres pocillos de celulas por cada afeccion.

Se preparo una solucion que contema 10 pM de peptido SEQ ID NO: 17/S-Tag en medio de cultivo HamF12-1% de BSA. A esta solucion se anadio 10 pM del peptido que se iba a evaluar (competencia).

Tambien se prepararon varias soluciones de control:

(i) Medio HamF12-1% de BSA.

(ii) Medio HamF12-1% BSA + 10 pM de peptido control CTRL-S-Tag (evaluacion de la union no espedfica de cualquier peptido que comprende un S-Tag).

5 (iii) Medio HamF12-1% de BSA + 10 pM de peptido SEQ ID NO: 17/S-Tag + 10 pM de peptido de control CTRL

(evaluacion de la competencia "no espedfica" entre el peptido de interes y el peptido de control CTRL).

Los enfoques de FRET utilizados son los descritos en el EJEMPLO IV.

Los resultados obtenidos para los mejores peptidos se presentan en la Tabla 1 a continuacion. La tabla proporciona los resultados de competencias en % de peptido vector de referencia (SEQ ID NO: 17/S-Tag), con afinidad hacia 10 hLDLR, desplazado por los peptidos de la invencion. Cuanto mas elevado es el valor del desplazamiento, mas afm es el peptido hacia hLDLR. Cuando este valor es superior al 50%, el peptido posee una afinidad superior a la del peptido de referencia (SEQ ID NO: 17).

Tabla 1

Pruebas de peptidos

Desplazamiento del peptido de control

SEQ ID NO: 1

66%

SEQ ID NO: 2

70%

SEQ ID NO: 3

75%

SEQ ID NO: 4

88%

SEQ ID NO: 5

91%

SEQ ID NO: 6

77%

SEQ ID NO: 7

74%

SEQ ID NO: 8

84%

SEQ ID NO: 9

80%

SEQ ID NO: 10

54%

SEQ ID NO: 11

22%

SEQ ID NO: 12

23%

SEQ ID NO: 13

8%

SEQ ID NO: 14

9%

SEQ ID NO: 15

<5%

SEQ ID NO: 16

<5%

SEQ ID NO: 17

50%

Los resultados presentados muestran que los peptidos con las secuencias SEQ ID NOs: 1 a 10 muestran una afinidad mejorada hacia el receptor humano de las HDL. Estos resultados son particularmente interesantes teniendo

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

en cuenta el tamano reducido de los peptidos, y son particularmente notables y sorprendentes, teniendo en cuenta los efectos negativos sobre la afinidad, observados con los peptidos SEQ ID NO: 11-16.

Por lo tanto, basandose en un enfoque de optimizacion qmmica basada en la qmmica medicinal, los inventores han hecho progresos en la comprension de las relaciones estructura/actividad (afinidad) del peptido vector de referencia (SEQ ID NO: 17), y en particular:

(i) la importancia de cada uno de los residuos de aminoacidos (Ala-scan, D-scan), es decir, la sustitucion alternativa (uno por uno) de cada uno de los residuos de origen bien por una alanina, bien por su analogo no natural de configuracion D;

(ii) la importancia de los extremos N- y C-terminales (acetilacion, amidacion, etc.);

(iii) la importancia/interes de la ciclacion del peptido.

Las principales limitaciones atribuidas generalmente a los derivados peptfdicos para fines terapeuticos son:

(i) su baja biodisponibilidad oral (por lo general se requiere su administracion por via intravenosa);

(ii) un tiempo de semivida corto debido a su rapida degradacion por enzimas proteolfticas (tales como proteasas o peptidasas) del aparato digestivo y del plasma sangmneo;

(iii) su eliminacion rapida de la circulacion sangmnea a traves del tngado (aclaramiento hepatico) y los rinones (aclaramiento renal);

(iv) su baja capacidad para pasar a traves de membranas biologicas o fisiologicas debido a su caracter generalmente hidrofilo;

(v) su gran flexibilidad conformacional, que a veces conduce a una falta de selectividad que implica interacciones con diversos receptores o dianas (lo que da como resultado una biodistribucion espedfica baja), lo que tiene como efecto la activacion de varias dianas y da lugar a efectos secundarios o indeseables;

(vi) el costo elevado de la smtesis y la produccion industrial (el coste de produccion de un peptido de peso molecular 5 kDa es mayor que el coste de produccion de una molecula organica de peso molecular 500 Da).

De forma remarcable, los peptidos o seudopeptidos de la invencion presentan los requisitos previos farmacologicos:

(i) una afinidad fuerte hacia el hLDLR;

(ii) caractensticas ffsico-qmmicas (ciclacion a traves de un puente disulfuro; hasta 3 aminoacidos no naturales para algunos de ellos, un tamano reducido a 8 aminoacidos) que favorecen su especificidad para ese receptor;

(iii) una mayor resistencia a la proteolisis enzimatica debido a su ciclacion, la introduccion de aminoacidos no naturales y, para algunos de ellos, un enlace seudopeptfdico, pero tambien mediante la modificacion/bloqueo de los extremos N- y C-term;

(iv) un tamano pequeno y un peso molecular cercano a 1 kDa que permite reducir el costo de la smtesis y la produccion futura a escala industrial.

EJEMPLO IV

Union y endocitosis de los peptidos sintetizados, con afinidad hacia hLDLR en las lineas CHO-LDLR-GFP.

Los peptidos de la invencion que tienen afinidad hacia hLDLR-GFP estan acoplados/conjugados en C-term a diferentes moleculas "trazadoras", o bien rodamina, o S-Tag, separados por un brazo espaciador constituido generalmente por 3 residuos Gly (Figura 7). El S-Tag (peptido de 15 aminoacidos obtenido a partir de la secuencia 1-15 de la ribonucleasa A pancreatica bovina) puede ser reconocido por un lado por un anticuerpo anti-S-Tag para los enfoques de inmunocitoqmmica o FACS, y por otro lado puede reconstituir una actividad enzimatica mediante la union a la protema S ribonucleasa (porcion C-term, aminoacidos 21-124) en las pruebas de actividad in vitro utilizando el kit de ensayo de S-Tag FRETWorks (Novagen 70724-3). La ribonucleasa activada de ese modo digiere un sustrato de ARN liberando un agente fluorescente enmascarado revelado por FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) y se cuantifica en placa de 96 pocillos en un espectrofluonmetro Beckmann. Para estos experimentos de FRET, se emplearon celulas CHO controles y la GFP fusionada en C-term a hLDLR y mLDLR lo que genera un ruido de fondo importante en las longitudes de onda utilizadas, para FRET se ha sustituido por la Red Fluorescent Protein (RFP). Las lrneas estables generadas para los experimentos de FRET son, por tanto, CHO-RFP y CHO-hLDLR-RFP.

Para los enfoques de FRET, las celulas se lavan 2 veces con 2 ml de PBS y despues se incuban durante 1 h a 37°C con 250 |jl de solucion de peptido. Se lavan de nuevo 2 veces con 2 ml de PBS y luego 2 veces con 1 ml de PBS y luego se raspan en 1 ml de PBS y se centrifugan durante 5 min a 1250 rpm. El material sobrenadante se aspira

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

despues y el sedimento celular se lisa en 80 |jl de PBS + 0,1% de Triton X100. Se analizan veinte |jl de cada lisado celular midiendo la emision de fluorescencia despues de la reaccion de FRET.

Por lo tanto, se llevan a cabo experimented de incubacion de los peptidos sobre diferentes celulas que expresan el hLDLR y permiten demostrar que los peptidos se unen bien a las celulas CHO-LDLR-GFP y que son endocitadas por acumularse en las celulas de la lmea que expresa hLDLR, lo que no es el caso de los peptidos de control. En estos experimented, incubaciones previas de los peptidos conjugados con S-Tag, con un anticuerpo primario (Ac primario) dirigido contra el S-Tag, y un anticuerpo secundario (Ac secundario) dirigido contra el anticuerpo primario, muestran que el complejo entre un peptido/S-Tag, un Ac primario y un Ac secundario se une a celulas que expresan el hLDLR y se internaliza por endocitosis. Estos resultados indican que los peptidos ctelicos de esta familia se pueden unir a celulas que expresan hLDL y transportar cargas importantes (2 anticuerpos), es decir, internalizacion mediante endocitosis de esas cargas.

EJEMPLO V

Toxicidad, endocitosis y transcitosis de los peptidos sintetizados, con afinidad hacia el hLDLR, sobre celulas endoteliales en modelos de BHE in vitro.

Los efectos toxicos potenciales de los peptidos sobre celulas endoteliales, la union/acumulacion de los peptidos en estas celulas y el paso mediante transcitosis de los peptidos, se evaluan en modelos de BHE in vitro. Las celulas necesarias para la aplicacion del modelo (cocultivo de celulas endoteliales procedentes de microvasos cerebrales y astrocitos) son celulas bovinas (bovine brain microvascular endothelial cells, BBMECs) distribuidas por la empresa Cellial Technologies (Lens, Francia) o celulas de rata (celulas endoteliales de capilares del cerebro de rata, BCECs de rata) que permitieron el desarrollo interno de un modelo murino. Este tipo de modelos de BHE in vitro se utiliza para evaluar el paso pasivo o el transporte activo de muchas moleculas, en particular agentes farmacologicos, a traves de las BCECs y, por lo tanto, por extrapolacion, su capacidad para alcanzar el tejido nervioso en el SNC in vivo. Los modelos bovinos y murinos tienen propiedades ultraestructurales caractensticas del endotelio cerebral, en particular las uniones estrechas, la ausencia de poros, la ausencia de canales transendoteliales, la baja permeabilidad para moleculas hidrofilas y una resistencia electrica elevada. Ademas, estos modelos han mostrado buenas correlaciones entre los resultados de mediciones efectuadas en diferentes moleculas evaluadas in vitro e in vivo por su propiedad de pasar a traves de la BHE. Hasta la fecha, todos los datos obtenidos revelan que estos modelos de bHe in vitro imitan de cerca la situacion in vivo mediante la reproduccion de algunas de las complejidades del entorno celular que existen in vivo, al tiempo que conservan los beneficios asociados con la experimentacion en cultivo celular.

A tttulo de ejemplo, el modelo bovino de BHE in vitro implica un cocultivo de BBMECs y astrocitos. Antes del cultivo celular, inserted de placa (Millicell-PC 3,0 jM, 30 mm de diametro) se tratan en la parte superior con colageno de cola de rata para permitir una adhesion optima de las BBMECs y crear las condiciones de una lamina basal. Los cultivos primarios de astrocitos mixtos se establecen a partir de corteza cerebral de rata recien nacida (Dehouck et al., 1990, J. Neurochem., 54, 1798-1801). Brevemente, despues de retirar las meninges, el tejido cerebral se pasa a traves de una malla de nailon de 82 jm. Los astrocitos se distribuyen en los pocillos de microplacas a una concentracion de 1,2x105 celulas/ml y 2 ml de medio de cultivo optimo (DMEM) complementado con 10% de suero de ternera fetal inactivado por calentamiento. El medio se cambia dos veces por semana. Las BBMECs obtenidas a partir de Cellial Technologies se cultivan en presencia de medio DMEM complementado con 10% (v/v) de suero de caballo y 10% de suero de ternera inactivado por calentamiento, glutamina 2 mM, 50 jg/ml de gentamicina y 1 ng/ml de factor de crecimiento basico de fibroblastos, anadido cada dos dfas. Las BBMECs se distribuyen entonces sobre el lado superior de los filtros en 2 ml de cocultivo. Este medio de BBMECs se cambia tres veces por semana. En estas condiciones, las BBMECs diferenciadas forman una monocapa de celulas confluentes 7 dfas mas tarde.

Para someter a ensayo su toxicidad, los peptidos de la invencion acoplados a rodamina se incuban en la camara superior del sistema de cultivo, en contacto con las celulas endoteliales durante 1 h, 5 h y 24 h. El medio de cultivo de la camara inferior se recoge en diferentes momentos y la fluorescencia se cuantifica mediante un analisis fluorimetrico. Los resultados se expresan en permeabilidad de la superficie endotelial (o Pe) expresada en 10-3 cm/min. El Lucifer Yellow (LY), una pequena molecula fluorescente que atraviesa poco la BHE, se utiliza por una parte para controlar la integridad de la BHE in vitro, en todos los pocillos analizados, pero por otro lado en incubacion conjunta con los peptidos, con el fin de controlar la ausencia de toxicidad de los peptidos para las celulas endoteliales que forman esta BHE. La barrera in vitro se considera "permeable" o "abierta" si el valor de paso Pe de LY es mayor que 1.10-3 cm/min. La medicion de la Trans Endothelial Electrical Resistence (TEER), medida con un ohmetro y expresada en Ohm.cm2, tambien permite medir la integridad de la BHE in vitro despues de las pruebas de paso a traves de esta BHE. El valor del umbral de calidad se establece en >500 Ohm.cm2.

Los experimentos realizados demuestran una ausencia de toxicidad de los peptidos, asf como para el peptido de control utilizado, y una ausencia de efectos perjudiciales sobre las propiedades de permeabilidad de la BHE.

El paso a traves de la BHE de un peptido de la invencion conjugado con rodamina se verifica en el modelo bovino de BHE in vitro descrito anteriormente. Este analisis se realiza midiendo por fluorimetna la cantidad de fluorescencia acumulada en el pocillo receptor en diferentes momentos (1 h, 4 h, 24 h). La integridad de la BHE en los diferentes

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

pocillos analizados se evalua mediante la medicion simultanea de la tasa de LY que pasa de un compartimento a otro en funcion del tiempo.

EJEMPLO VI

Protocolos para la sintesis quimica de conjugados vector/molecula de interes terapeutico o agente de formacion de imagenes (o de diagnostico) o cualquier otra molecula como una sonda molecular.

En una molecula de interes terapeutico o un agente de formacion de imagenes o de diagnostico o cualquier otra molecula como una sonda molecular, se puede escindir/liberar/recolocar el vector despues del transporte y el paso a traves de las membranas celulares y mas particularmente de la BHE, por ejemplo, a traves de una estrategia profarmaco por hidrolisis o escision enzimatica de un enlace qmmico entre el vector y la sustancia activa.

El acoplamiento covalente entre el peptido vector completamente protegido en sus funciones reactivas laterales (el caso de acoplamientos en C-term y N-term) o parcialmente protegido (el caso de acoplamiento sobre una funcion reactiva de una cadena lateral), y la molecula de interes terapeutico, se realiza a traves de 2 estrategias generales (Figura 2):

- sintesis en tandem (es decir, acoplamiento directo sin intermediario entre las 2 entidades),

- sintesis a traves de un enlazador (Temsamani et al., 2004, Drug Discov. Today, 23, 1012-1019).

En funcion del peptido vector seleccionado y de la molecula de interes terapeutico elegida, se aplica una u otra de las diversas estrategias, ya sea sobre el C-term, ya sea sobre el N-term, ya sea sobre una funcion reactiva de una cadena lateral de ese peptido vector (Majumdar y Siahaan, Med Res Rev., Epub ahead of print). Idealmente, en una estrategia profarmaco, los brazos espaciadores seleccionados deben permitir una buena liberacion de la sustancia activa y la mejora de la solubilidad del conjugado (Molema et al., 2001, Drug targeting, organ-specific strategies. In Methods and principles in medicinal chemistry, vol. 12). Diversos enlaces qmmicos covalentes labiles se pueden generar de este modo entre las 2 entidades (vector y sustancia activa) a traves o no de un brazo espaciador: amidas, carbamatos, esteres, tioester, disulfuro, etc. Por ejemplo, se ha mostrado en la bibliograffa que los enlaces disulfuro, relativamente estables en el plasma, pueden ser escindidos por enzimas tales como la protema-disulfuro reductasa en el interior del compartimento intracraneal para devolver una funcion tiol libre (Saito et al., 2003, Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 199-215).

Otros compuestos interesantes son aquellos en los que el brazo espaciador representa un poffmero tal como polietilenglicol (PEG). De hecho, se ha mostrado en la bibliograffa que la conjugacion de una molecula organica de interes biologico con un posible PEG permiffa aumentar la semivida en plasma de esta molecula (Greenwald et al., 2003, Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 217-250) y disminuir su aclaramiento.

Los conjugados vectores/sustancias activas o de interes se pueden utilizar en diagnostico, formacion de imagenes o terapia de una patologfa, una lesion o un trastorno del SNC para la preparacion de un medicamento capaz de atravesar la BHE, de un tumor canceroso cerebral u otro tipo de celulas cancerosas para la preparacion de un medicamento capaz de atravesar las membranas celulares cancerosas, y/o de patologfas infecciosas para la preparacion de un medicamento capaz de atravesar las membranas celulares y de dirigirse a las celulas infectadas de patologfas infecciosas cerebrales u otras, de tipo bacterianas, vfficas, parasitarias o fungicas.

EJEMPLO VII

Perfusion cerebral in situ para los vectores y los conjugados vector/molecula de interes terapeutico o agente de formacion de imagenes (o de diagnostico) o cualquier otra molecula como una sonda molecular, y estudio de su cinetica de transporte a traves de la BHE, y su acumulacion en el cerebro de raton.

La tecnica de perfusion cerebral in situ (en un raton macho adulto OF1) se utiliza para ilustrar el paso al cerebro a traves de la BHE.

Previamente, los peptidos vectores se marcan radiactivamente con tritio (3H), elemento que ofrece la sensibilidad mas fuerte para la deteccion de compuestos radiactivos, en particular en secciones de tejido. La preparacion de peptidos radiactivos con alta radiactividad espedfica (RAS, que puede llegar hasta 100 Ci/mmol) se lleva a cabo por una estrategia de acilacion de la funcion amino N-term por antffdrido propionico (o propanoico) tritiado o propionil-N- succinimida (NPS) tritiada. Este metodo de tritiacion se puede aplicar a todos los peptidos (vectores, o conjugados entre un peptido terapeutico y un peptido vector en tandem o mediante un enlazador (que puede ser de naturaleza pepffdica u organica)), siempre que la modificacion del N-term no afecte a la afinidad de los peptidos hacia el receptor diana (es decir, LDLR) o a su actividad biologica en el caso de peptidos terapeuticos.

La reaccion de tritiacion del peptido vector en N-term mediante propionilacion se lleva a cabo en DMF (1 mg de peptido en 100 a 450 pl segun la solubilidad) mediante la adicion de 0,1 equivalentes de NPS tritiada durante 5 min a T ambiente, despues 0,9 equivalentes de NPS fffa (no tritiada) durante 1 h, a continuacion, un nuevo equivalente de NPS fffa durante 5 h. El medio de reaccion se deja entonces a 4°C durante la noche y se purifica al dfa siguiente por

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

HPLC. La RAS para cada peptido tritiado esta comprendida tipicamente entre 5 y 10 Ci/mmol. La cantidad total de radiactividad preparada mediante smtesis esta comprendida generalmente entre 600 y 950 pCi.

El acoplamiento covalente de los peptidos radiomarcados (en i) * 3H por ejemplo) con una sustancia activa radiomarcada (en 14C por ejemplo) se lleva a cabo como se ha descrito por ejemplo en el EJEMPLO VI. Como se ha mencionado anteriormente, este acoplamiento covalente se lleva a cabo en funcion de la estructura y las propiedades fisicoqmmicas de la sustancia activa, en particular, la presencia de grupos qmmicos funcionales que se pueden modificar sin disminuir la actividad biologica de esa sustancia. Las smtesis de los conjugados radiomarcados se realizan mediante una extrapolacion a partir de las vfas de smtesis puestas a punto en los conjugados no radiomarcados.

Las tecnicas resumidas brevemente a continuacion se han desarrollado previamente para estudiar la distribucion cerebral de sustancias activas y, en particular, el papel de la BHE y mas especialmente del LDLR en la penetracion de estas moleculas en el cerebro. Las tecnicas de perfusion cerebral in situ estan entre las mas exigentes tecnicamente y las mas diffciles de realizar en el raton. Sin embargo, la perfusion cerebral in situ (como los modelos in vitro) permite un control total de la composicion del material perfundido artificial, con el fin de mantener las celulas y la vascularizacion del cerebro en condiciones fisiologicas y anatomicas normales dentro del animal, sin el factor perturbador de distribucion sistemica.

Esta estrategia de perfusion cerebral in situ llevada a cabo normalmente en la rata, se ha adaptado en el raton (Dagenais et al., 2000, J Cereb Blood Flow Metab., 20 (2), 381-6) para ampliar su aplicacion para evaluar los parametros cineticos de transporte a nivel de la BHE y la barrera sangre-retina, y esto tambien en ratones transgenicos y KO mutantes para los receptores, enzimas o transportadores de sustancias activas. Se trata de una cateterizacion de una carotida en los ratones (tfpicamente OF1) anestesiados, y la ligadura de ciertas ramas de esta carotida (externa, tiroidea, occipital) con el fin de perfundir espedficamente la carotida interna y las arterias pterigopalatinas, que se utilizan para evaluar la captacion cerebral de los vectores y conjugados. El cateter permite sustituir la circulacion general por una infusion con un material perfundido bien controlado (tampon bicarbonato, plasma o sangre) al pasar por la carotida. El tampon bicarbonato de Krebs oxigenado se utiliza primero con el fin de evaluar las capacidades de paso cerebral de los vectores y conjugados. Despues de una cateterizacion de la carotida, el caudal sangumeo endogeno se detiene mediante la seccion de los ventnculos del corazon con el fin de evitar la mezcla del tampon con la sangre y una elevacion de la presion sangumea. La duracion de la infusion con un caudal fijo esta controlada. La perfusion con tampon se puede extender hasta 20 minutos o hasta 1 h en presencia de transportadores de oxfgeno (eritrocitos lavados) para los estudios de Receptor-Mediated Transport (RMT).

Los experimentos realizados han permitido determinar el transporte cerebral, o coeficiente de transferencia (Kin : relacion entre el volumen de distribucion y el tiempo de perfusion cerebral), de varios peptidos vectores de la invencion. El tiempo de perfusion cerebral para estos experimentos es de 5 min con un caudal de perfusion de 2 ml/min. Por lo tanto, el Kin de los peptidos vectores de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, radiomarcados con una RAS de 2 Ci/mmol, es respectivamente de 3,3 y 3,0 x 10"4 ml/s/g.

A tftulo comparativo, la transferrina (Tf) tiene un Kin de 3,0 x 10"4 ml/s/g (Demeule et al., 2008, J. Neurochem., 106 (4), 1534-1544), y el peptido de referencia, SEQ ID NO: 17 presenta, en las mismas condiciones experimentales, un Kin de 3,2 ± 0,4 x 10-4 ml/s/g.

Estos resultados muestran por lo tanto que los peptidos vectores de la invencion, aunque de pequeno tamano y configuracion ventajosa, poseen un coeficiente de transferencia cerebral muy elevado, mayor que el de la transferrina.

Por otra parte, este tipo de experimento de perfusion cerebral in situ tambien permite establecer una distincion entre los compuestos que permanecen en el compartimento vascular cerebral, de aquellos que han cruzado la membrana endotelial abluminal para entrar en el parenquima cerebral. Esta tecnica, denominada agotamiento capilar postperfusion, permite medir si la molecula atraviesa efectivamente el endotelio con el fin de entrar en el parenquima cerebral. El uso de esta tecnica permite demostrar que los peptidos vectores espedficos (o los conjugados) se acumulan en el parenquima cerebral. Por lo tanto, esta tecnica (Triguero et al., 1990, J Neurochem., 54 (6), 1882-8) se utiliza con el fin de hacer una distincion entre la fraccion de vectores (o conjugados), que ha transitado por el endotelio y ha entrado en el cerebro a traves del espacio extracelular o las celulas del cerebro, y la fraccion que permanece asociada a las celulas endoteliales.

Las etapas clave de los estudios de perfusion cerebral in situ en el raton se pueden resumir como sigue para los vectores y conjugados estudiados:

i) Evaluacion de la tolerancia (sin toxicidad) de los vectores y conjugados a nivel de la BHE, conservacion de la

integridad de esta barrera fisiologica.

ii) Estudio de la cinetica y la linealidad de la captacion cerebral a traves de RMT mediante el LDLR.

iii) Estudio de la tasa de captacion cerebral en funcion de la concentracion en vectores o conjugados (Tmax,

Km).

iv) Estudio de los mecanismos de transporte con ayuda de sustratos inhibidores o moduladores del LDLR.

v) Distribucion en los compartimentos del cerebro: agotamiento capilar (Triguero et al., 1990, J Neurochem., 54 (6), 1882-8).

vi) Evaluacion de la tasa de union de vectores y conjugados con protemas plasmaticas (albumina, etc.), estudio

5 de su influencia sobre la captacion cerebral de esas moleculas.

vii) Administracion intravenosa y evaluacion de la distribucion en los tejidos (cerebro y otros organos) en funcion del tiempo.

Claims (19)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Peptido o seudopeptido, caracterizado porque responde a la siguiente formula general (I):

   A1-Met-A2-Arg-Leu-Arg-A3-Cys (I)

   en la que A1 indica cistema (Cys) o uno de sus analogos o isosteros, A2 indica prolina (Pro) o uno de sus analogos o isosteros y A3 indica glicina (Gly) o uno de sus analogos o isosteros, siempre que el residuo A2 sea un analogo de prolina cuando el residuo A1 es una cistema, y por que es capaz de unirse a un receptor humano de lipoprotemas de baja densidad (hLDLR).
2. 2. Peptido o seudopeptido segun la reivindicacion 1, caracterizado por que A1 indica Cys o uno de sus analogos seleccionados entre (D)-cys, penicilamina (Pen) y (D)-penicilamina ((D)-pen).
3. 3. Peptido o seudopeptido segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que A2 indica un analogo de Pro seleccionado entre acido pipecolico (Pip) y acido tiazolidin-4-carboxflico (Thz).
4. 4. Peptido o seudopeptido segun una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que A3 indica Gly o sarcosina (Sar).
5. 5. Peptido o seudopeptido segun la reivindicacion 1, caracterizado por que responde a la formula general (I') siguiente:

   A1-Met-A2-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys (I')

   en la que A1 indica cistema o uno de sus analogos o isosteros, preferiblemente A1 indica Cys, (D)-cys, Pen o (D)- pen; y A2 indica Pro o uno de sus analogos o isosteros, preferiblemente A2 indica Pip o Thz, siempre que el residuo A2 sea un analogo de prolina cuando el residuo A1 es una cistema y por que es capaz de unirse a un receptor humano de lipoprotemas de baja densidad (hLDLR).
6. 6. Peptido o seudopeptido que comprende una secuencia seleccionada entre la secuencia SEQ ID NOs: 1 a 10.
7. 7. Peptido o seudopeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que tiene una configuracion dclica.
8. 8. Peptido o seudopeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que comprende al menos un enlace peptidomimetico, seleccionado preferiblemente entre la intercalacion de un grupo metileno (-CH2-) o fosfato (-PO2-), amino secundario (-NH-) u oxfgeno (-O-), alfa-azapeptidos, alfa-alquilpeptidos, N- alquilpeptidos, fosfonamidatos, depsipeptidos, hidroximetilenos, hidroxietilenos, dihidroxietilenos, hidroxietilaminas, retro-inverso, metilenoxi, cetometileno, esteres, fosfinatos, fosfmicos, fosfonamidas, analogos de carba.
9. 9. Peptido o seudopeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la funcion N-terminal (N-term) esta protegida por una acilacion y/o por que la funcion C-terminal (C-term) esta protegida por una amidacion o una esterificacion.
10. 10. Peptido o seudopeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para su uso para transportar una sustancia activa o de interes en diagnostico, formacion de imagenes o terapia.
11. 11. Peptido o seudopeptido segun la reivindicacion 10, para su uso para transportar dicha sustancia al sistema nervioso central.
12. 12. Peptido o seudopeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso para aumentar la actividad biologica o disminuir la toxicidad de una sustancia activa o de interes a la que esta acoplado.
13. 13. Compuesto conjugado con la formula (III) siguiente:

    VxLzDy (III)

    en la que V representa un peptido o seudopeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, L representa un brazo espaciador, D representa una sustancia activa o de interes, x e y son numeros enteros comprendidos entre 1 y 5, y z es un numero entero comprendido entre 0 y 10
14. 14. Compuesto conjugado segun la reivindicacion 13, caracterizado por que x=y=z=1; x=z>y, y=z>x o z>x> y; o por que z es igual a 0 y x e y son igual a 1 o y es superior a x.
15. 15. Compuesto conjugado segun una de las reivindicaciones 13 a 14, caracterizado por que la sustancia activa o de interes es una molecula de interes terapeutico, un agente de diagnostico o de formacion de imagenes medicas, o una sonda molecular seleccionada preferiblemente entre una pequena molecula qrnmica, un peptido o polipeptido, una protema, un antfgeno, un anticuerpo o una porcion de anticuerpo, un acido nucleico o un oligonucleotido, una ribozima, un marcador o un trazador.
16. 16. Compuesto conjugado segun una de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado por que el acoplamiento entre V y D o entre V y L y por una parte y entre L y D por otra parte, se realiza por uno o varios enlaces covalentes, ionicos, de hidrogeno, hidrofobos o de Van der Waals, escindibles o no en medio fisiologico o en el interior de las celulas.
17. 17. Compuesto conjugado segun una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado por que D esta 5 acoplado a V, en su caso a traves de L, a nivel de uno o varios extremos N-term y/o C-term de V y/o a nivel de uno o

    varios grupos reactivos transportados por las cadenas laterales de aminoacidos naturales o no, constitutivos de V.
18. 18. Procedimiento de preparacion de un compuesto conjugado segun una de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizado por que comprende una etapa de acoplamiento entre un peptido o seudopeptido V y una sustancia D, en su caso a traves de L, preferiblemente por via qmmica, bioqmmica, enzimatica o mediante ingeniena genetica.

    10 19. Composicion farmaceutica caracterizada por que comprende al menos un compuesto conjugado segun una de

    las reivindicaciones 13 a 18 y uno o varios excipientes farmaceuticamente aceptables.
19. 20. Composicion de diagnostico caracterizada por que comprende un agente de diagnostico o de formacion de imagenes medicas constituido por un compuesto conjugado segun una de las reivindicaciones 13 a 18.