CN106163569A

CN106163569A - 活化的神经降压素分子及其用途

Info

Publication number: CN106163569A
Application number: CN201580011319.7A
Authority: CN
Inventors: 纪尧姆·雅科托; 帕斯卡利娜·勒科尔谢; 迈克尔·克雷斯特查提斯基
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Vect Horus
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Vect Horus
Priority date: 2014-01-20
Filing date: 2015-01-19
Publication date: 2016-11-23
Anticipated expiration: 2035-01-19
Also published as: EP3096795A1; US9821072B2; ES2805536T3; EP3096795B1; EP2896402A1; CA2937032A1; US20160354480A1; WO2015107182A1; JP6562948B2; CA2937032C; CN106163569B; JP2017506258A

Abstract

本发明涉及活化的神经降压素、包含它的药物组合物及其用途。本发明的化合物和组合物可用于例如降低体温、减弱或停止癫痫发作、降低兴奋性毒性、促进神经保护、降低神经炎症和异常轴突出芽或减轻疼痛。

Description

活化的神经降压素分子及其用途

技术领域

本发明涉及包含偶联到激活物基团的神经降压素或其类似物的新的化合物(也被称为“活化的神经降压素”)、包含所述化合物的药物组合物及其用途。本发明的化合物和组合物可用于在需要的哺乳动物中降低体温(例如诱导受控的药理学正常体温或低体温)，特别是诱导神经保护。它们可以被特别用于减轻与例如缺血、创伤或癫痫发作相关的中枢神经系统(CNS)损伤以及治疗疼痛。本发明的化合物和组合物也可用于治疗惊厥、过高体温或能够从神经降压素的生物活性获益的任何病症。

背景技术

体温降低(低体温)是针对在各种不同情况例如与中风、心脏骤停或新生儿缺血相关的脑缺血、癫痫发作、严重创伤性脑和脊髓损伤或心脏手术中发生的损伤的强力神经保护方法。在具有升高的体温的病理情形(例如颅内高压(ICH)、缺血性或出血性中风、创伤性脑损伤(TBI)、脓毒症或伴有发热的任何病毒、细菌或寄生虫感染)中，将过高体温降低到正常体温也是有正当理由的。

用于降低体温的物理方法已在本领域中使用，其包括外部方法例如冷却材料或处理(例如冷却毯、冰浴等)或内部方法(例如冷却探头、冷流体的输注等)或两者。然而，这些物理方法难以实施，昂贵，可能使作用和/或瞬时效应的开始延迟，并且可能引起不想要的副作用，例如使得必须施用附加治疗包括麻痹或镇静剂的颤抖。

已经提出了药理学方法，其本质上使用神经降压素或其类似物。神经降压素(NT)是一种直链十三肽，其氨基酸序列为pyroGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH。在哺乳动物中，内源NT主要在CNS中表达，在那里它起到神经递质和与多巴胺能系统相互作用的神经调节剂的作用。NT也在外周组织中表达，主要是在胃肠道中，在那里它在肠动力中发挥作用。此外，已暗示NT系统的失调与许多神经精神病学疾病以及几种癌症的病理生理学相关。当直接给药到脑或脊髓中时，NT发挥强力的μ不依赖性镇痛效果并降低体温。尽管NT的临床使用可以提供治疗许多病理生理病症的有趣且创新的手段，但它受到在系统性给药后在血浆中非常快速的蛋白水解切割的阻碍。此外，它的不良的血脑屏障(BBB)透过性阻碍了它的治疗潜力，除非直接给药到脑或脊髓中。因此，需要药物化学方法，以允许设计能够在系统性给药后引发中枢活性的基于神经降压素的化合物。已经提出了设计神经降压素类似物和/或将神经降压素或其类似物偶联到递送剂例如抗体(WO2011/127580)或转运肽(WO2010/063122)。

然而，在本领域中对基于神经降压素的药理学药剂存在着需求，所述药剂具有改进的效能和安全性情况，包括起效快速以及在不同病理生理病症包括体温过高、兴奋性中毒过程、神经炎症、惊厥以及疼痛中具有生物活性。

发明概述

本发明公开了具有改进的治疗性能的新的神经降压素化合物以及它们在哺乳动物、特别是人类对象中的用途。本发明是基于新分子的设计，所述分子包含共价偶联到(b)激活物基团的(a)NT或其类似物。本发明的“活化的NT”化合物具有提高的BBB透过性和对蛋白水解切割的抗性，并展示出高度改进的生物活性。具体来说，在系统性给药后，本发明的活化的NT化合物在各种不同的治疗性病症中诱导显著的体内治疗效果包括低体温，在癫痫持续状态下诱导抗惊厥效果，以及诱导神经保护性效果和抗神经炎性效果。重要的是，本发明的化合物表现出强的生物活性，起效非常快速，并具有相对短的作用持续时间和非常好的安全性情况。这些性质为需要安全的治疗性干预的急性病症中生物学效应的精细控制和调节提供了非常良好的药效学和安全性先决条件。此外，本发明的化合物在重复给药后保留一定活性，因此可用于重复的或亚慢性治疗。

因此，本发明的目的涉及一种化合物，其包含共价偶联到激活物基团的神经降压素多肽。所述激活物基团包含氨基酸序列M-aa1-R-L-R，其中aa1是脯氨酸或其类似物。与所述NT多肽的偶联可以是直接的，或者可以是间接的，即通过连接物基团。

本发明的另一个目的涉及一种药物组合物，其包含如上所定义的化合物和可药用载体或赋形剂。

本发明的另一个目的是一种制造如上所定义的化合物的方法，所述方法包括将神经降压素多肽共价偶联到如上所定义的激活物基团，优选地通过使用连接物基团的间接共价偶联。

本发明的另一个目的涉及如上所定义的化合物或组合物作为药物的用途。所述化合物或组合物可用于在哺乳动物对象中降低体温(例如诱导低体温或正常体温)、诱导神经保护(例如减轻脑损伤)以及治疗疼痛。

本发明的另一个目的涉及如上所定义的化合物或组合物的用途，其用于治疗具有脑损伤的对象。

本发明的另一方面涉及一种在哺乳动物对象中诱导低体温的方法，所述方法包括向所述对象系统性给药如上所定义的化合物或组合物。

本发明的另一个目的是一种治疗具有脑损伤的对象的方法，所述方法包括向所述对象系统性给药如上所定义的化合物或组合物。

本发明可用于在任何哺乳动物对象例如人类患者中治疗脑损伤(例如保护、防止或减轻其效应)。它特别适合于治疗具有脑缺血、中风、心脏骤停或新生儿缺血、癫痫发作、严重创伤性头部和脊髓损伤、心脏手术、ICH、脓毒症或伴有发热的任何病毒、细菌或寄生虫感染的对象。它也适合于治疗患有对标准的抗惊厥剂有抗性的癫痫发作或对标准的退热药理学药剂有抗性的体温过高的对象，或者与标准的冷却技术组合以更快地引发患者冷却。

附图说明

图1.在以8mg/kg的NT摩尔当量(eq.)剂量静脉内注射(团注(bolus))后，盐水(NaCl 0.9％)、NT或化合物I对Swiss(CD-1)小鼠的直肠体温的影响。

图2.在以0.5至8mg/kg范围内的NT eq.剂量i.v.注射(团注)的Swiss(CD-1)小鼠中，化合物I的低体温剂量响应关系。

图3.化合物I、化合物II和化合物IV在Swiss(CD-1)小鼠中的低体温响应。化合物I、II和IV以0.5mg/kg eq.NT的相同剂量水平i.v.注射(团注)到小鼠中。

图4.在以0.03至10mg/kg范围内的NT eq.剂量i.v.注射(团注)的Swiss(CD-1)小鼠中，化合物II的低体温剂量响应关系。最低有效剂量(MED)为0.35mg/kg eq.NT，并且在10mg/kg eq.NT下观察到最高效果。

图5.使用原位脑灌注，[³H-Tyr3]-NT、[³H-Tyr3]-化合物I和[³H-Tyr3]-化合物XIV在小鼠中的BBB和血视网膜屏障(BRB)运输。

图6.NT、化合物I、化合物IV和化合物XIV的体外血液稳定性。将肽在新鲜收集的Swiss(CD-1)小鼠血液中在37℃下温育，并在指定的时间点使用液相色谱串联质谱术(LC-MS/MS)分析方法定量血浆级分中剩余的完整肽的百分率。

图7.化合物II与本发明的包含NT的较短类似物的活化的神经降压素化合物在Swiss(CD-1)小鼠中的低体温响应的比较。化合物II、化合物V、化合物VI或化合物VII以0.5mg/kg eq.NT的相同剂量水平i.v.注射(团注)到小鼠中。所有偶联物显示出相似的体温降低效力。

图8.化合物II和VIII在Swiss(CD-1)小鼠中的体温降低效果.化合物II或化合物VIII以10mg/kg eq.NT的相同剂量水平i.v.注射(团注)到小鼠中。

图9.在N-端SEQ ID NO：9激活物基团与C-端NT(6-13)或NT(8-13)组成部分之间包含不同连接物的神经降压素偶联物在Swiss(CD-1)小鼠中的低体温响应的比较。不含连接物基团(化合物IX)、包含GGG(化合物X)、Ahx(化合物XII)、PEG2(化合物XIII)或PEG6(化合物XIV)连接物的偶联物以10mg/kg eq.NT的相同剂量水平i.v.注射(团注)到小鼠中。

图10.包含NT(8-13)类似物的串联的SEQ ID NO：9-NT(8-13)或SEQ ID NO：11-NT(8-13)偶联物在Sprague-Dawley大鼠中的低体温响应的比较。在NT(8-13)序列中包含[Tle12](化合物XV)、[Lys8,Tle12](化合物XVI和化合物XX)、[Lys9,Tle12](化合物XVII)、[Trp11,Tle12](化合物XVIII)或[Lys8,Trp11,Tle12](化合物XIX)置换的偶联物以5mg/kgeq.NT的相同剂量水平i.v.注射(团注)到大鼠中。

图11.化合物XIV的重复给药对体温的影响。在4天期间，向Swiss(CD-1)小鼠以4mg/kg eq.NT的剂量每日i.v.注射(团注)给药化合物XIV，并且每天在治疗给药后3小时期间评估低体温响应。化合物XIV在多日中保留了显著且稳定的体温降低效果。

图12.化合物XIV在酵母诱导的体温过高的小鼠模型中的退热效果。在NMRI小鼠中皮下注射酵母悬液引起直肠温度升高+0.8℃(基线2，体温过高小鼠相比于首次用于实验的小鼠)。以所指示的剂量水平i.v.注射(团注)的化合物XIV不仅显示出退热效果，而且在中等和高的剂量水平下诱导强烈且剂量依赖性的低体温。

图13：在癫痫持续状态(SE)下化合物XIV对体温和癫痫发作强度的影响。对小鼠给药促惊厥药物钾盐镁钒(KA)，其在2小时后诱导SE特征性的5级或6级癫痫发作，并通常伴有体温过高。在SE发作后30分钟(SE30)以2或4mg/kg eq.NT的剂量给药的化合物XIV总是引起瞬时的低体温，其持续至少2hrs(图13A)。在SE30+化合物XIV组中，由化合物XIV诱导的低体温伴有癫痫发作的显著减少。一部分动物被i.p.给药高剂量的安定(DZP)，由于它的抗惊厥效果其在癫痫发作模型中被用作阳性对照。当在SE发作后30min给药神经降压素(NT8-13)时，与SE动物相比没有观察到体温或癫痫发作强度的显著变化(图13B)。

图14.化合物XIV在通过KA诱导的SE后具有严重兴奋性中毒损伤和神经炎症的小鼠中的神经保护和抗神经炎性效果。使用免疫组织化学标记(图14A)来评估来自于假处理(SHAM)(A、D、G)、SE(B、E、H)和SE+化合物XIV(SE+HT)(C、F、I)动物的海马结构的冠状面中脑损伤的程度。在A、B和C中将神经元用标记神经元特异性核蛋白的抗NeuN抗体标记。箭头指向CA1和CA3锥体细胞层中以及齿状回(DG)的门区(H)中的神经元。神经炎症使用分别监测星形细胞和小神经胶质细胞反应性的抗GFAP抗体(D、E、F)和抗IbaI抗体(G、H、I)来评估。小箭头指向反应性星形细胞和小神经胶质细胞。标尺条＝500μm。SE诱导的神经胶质变性涉及小神经胶质细胞和星形胶质细胞类型。在假处理动物中，在海马中检测到GFAP和Iba1的基线标记(图14A)。在SE动物中，在所有海马层中出现神经胶质细胞的非常强的激活。当在SE发作后30min给药化合物XIV(SE+HT)时，这种炎性响应显著降低。

NeuN和Fluoro-jade C标记被用于定量神经元死亡和化合物XIV的效应(图14B)。在假处理动物中，在海马中没有观察到神经元死亡。在SE动物中，在CA1-3锥体细胞层和DG中观察到主要的神经元死亡。当在SE发作后30min给药化合物XIV或DZP时，在SE动物中观察到的神经变性显著减少，但是当给药NT(8-13)时没有观察到变化(图14B)。

图15：在SE后8周，化合物XIV在海马中减弱苔藓纤维出芽。对门细胞损失做出响应，苔藓纤维这种齿状回颗粒细胞的轴突的异常出芽发生在内分子层(IML)中，并且在动物癫痫发作模型和人类中的癫痫中已被确立。在SE诱导后8周，使用用于锌囊泡转运体3(ZnT3)的免疫组织化学标记来评估化合物XIV对出芽的影响。在假处理动物中，苔藓纤维末梢存在于CA3区的门和透明层中，并且在DG的IML中没有观察到末梢。在SE动物中，在IML内观察到苔藓纤维末梢。与SE动物相比，在SE发作后30min给药化合物XIV(SE+HT，图15A)或DZP的动物中，神经支配IML的末梢的数目相当大地减少，但是当给药NT(8-13)时相对不变(图15A、15B)。

图16.在小鼠中，化合物XIV在扭体试验中的镇痛效果。将化合物XIV以0.5、1和5mg/kg eq.NT的逐渐增加的剂量水平i.v.注射(团注)到小鼠中，30min后腹膜内注射10mL/kg的0.5％乙酸。在乙酸的i.p.注射后5min开始的10min时间段内，测量每只小鼠中发生的腹部伸展的次数(扭动计数/10min)。

发明详述

本发明提供了新的基于神经降压素的化合物、包含所述化合物的药物组合物及其用途，例如用于在需要的对象中诱导体温的受控降低(例如低体温或正常体温)、受控的抗惊厥效果或镇痛。

更具体来说，本发明的目的在于一种包含共价偶联到激活物基团的神经降压素多肽的化合物，所述激活物基团包含氨基酸序列M-aa1-R-L-R，其中aa1是脯氨酸残基或其类似物。

正如在实验部分中说明的，本发明的活化的神经降压素化合物与天然NT相比时表现出高度改进的生物性能，包括提高的BBB透过性和对蛋白水解切割的高抗性两者。所述化合物在低剂量水平下，在系统性给药后表现出强的生物活性，起效非常快，并且具有高的耐受性和安全性侧貌(profile)。具体来说，本发明的化合物i)诱导的中枢体温降低效应比使用天然NT获得的效应高出多达80倍，ii)不引起与低体温相关的颤抖，iii)表现出防止潜在致死性的过度低体温的平台效应，iv)在静脉内注射(团注)后的最低有效剂量(MED)与最高耐受剂量(MTD)之间显示出显著的安全裕量，v)在重复的静脉内给药后保持显著的生物活性，证明了它们适合于需要重复或亚慢性治疗的病症，vi)表现出强的退热活性，vii)有效地减轻或停止运动性癫痫发作，viii)表现出神经保护和抗神经炎性活性，ix)有效地减少癫痫发作后和癫痫中异常的轴突出芽，以及x)诱导显著的镇痛效果，在不同的病理生理状况中表现出意料之外的有益效果和效能。

本发明的化合物本质上包含共价偶联到激活物基团的神经降压素多肽。所述激活物基团可以直接地或间接地、即通过连接物基团共价偶联到所述神经降压素多肽。所述化合物也可以用下式(I)表示：

NT–连接物–AG (I)

其中NT表示具有神经降压素活性的任何多肽；连接物是具有至少两个不同或相同的反应性基团的交联分子或平台；AG是包含上面指定的氨基酸序列的激活物基团。应该理解，为了提供优化的活性，可以调整所述组成部分彼此之间的空间排列、连接策略和锚定点。

神经降压素多肽

术语神经降压素多肽是指具有神经降压素活性的任何多肽，例如神经降压素、神经降压素类似物或神经降压素受体的多肽激动剂。上面提到的术语“类似物”包括野生型神经降压素的保留了神经降压素的一种或几种生物活性例如诱导低体温或镇痛的能力的任何变体或片段。更优选地，神经降压素多肽是指天然的神经降压素或其类似物。在更优选实施方式中，术语神经降压素多肽包括人类神经降压素或其保留了神经降压素的一种或几种生物活性的片段或变体。

人类野生型神经降压素是一种13个氨基酸的肽，其具有下述序列：pELYENKPRRPYIL-OH(SEQ ID NO：1)。

因此，本发明的神经降压素多肽优选地包括包含以下的任何多肽：

(i)SEQ ID NO：1，

(ii)(i)的天然变体，

(iii)(i)或(ii)的片段，或

(iv)(i)-(iii)的任一序列的类似物，优选地包含一个或多个氨基酸置换或修饰，甚至更优选地包含1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基、甚至更优选地1、2、3或4个氨基酸残基的置换或修饰，

所述多肽具有引发神经降压素的一种或几种生物活性例如低体温或镇痛的能力。

当在本文中使用时，序列的片段是指包含所述序列的至少4个、更优选地至少5个连续氨基酸的任何片段。就此而言，符合本发明的优选的神经降压素多肽包括至少包含人类神经降压素的8-13位氨基酸(“NT(8-13)”)或人类神经降压素的6-13位氨基酸(“NT(6-13)”)或人类神经降压素的2-13位氨基酸(“NT(2-13)”)的神经降压素片段。已报道这些至少包含C-端NT(8-13)片段的片段引发神经降压素的大部分生物活性，如果不是所有生物活性的话。相应的氨基酸序列提供如下：

NT(8-13)：RRPYIL(SEQ ID NO：2)

NT(6-13)：KPRRPYIL(SEQ ID NO：3)

NT(2-13)：LYENKPRRPYIL(SEQ ID NO：4)

在特定实施方式中，符合本发明的神经降压素多肽的序列与野生型神经降压素多肽或其片段的序列相比包含1、2、3或4个氨基酸修饰(例如置换或插入或化学修饰)。就此而言，可以单个地或组合地对NT或其片段做出下述氨基酸置换和修饰，以产生在本发明中使用的神经降压素的生物活性类似物：

-N-端乙酰化，以产生例如乙酰基-NT(2-13)或乙酰基-NT(6-13)或乙酰基-NT(8-13)，

-用(D)-Arg、Lys、(D)-Lys、HLys(高赖氨酸)、Dab(二氨基丁酸)、Orn(鸟氨酸)、(D)-Orn或用α-脱氨基-N,N-二甲基高赖氨酸置换Arg8，以产生例如[(D)-Lys8]NT(8-13)、[Lys8]NT(8-13)或[HLys8]NT(8-13)，

-用Lys、(D)-Lys、Orn、(D)-Orn、Dab、(D)-Arg、HLys(高赖氨酸)或用α-脱氨基-N,N-二甲基高赖氨酸置换Arg9，以产生例如[Lys9]NT、[Lys9]NT(8-13)、[(D)-Orn9]NT或[(D)-Orn9]NT(8-13)，

-用Trp、(D)-Trp、neoTrp、(D)-Tyr、Phe、(D)-Phe、Nal(萘基丙氨酸)或(D)-3,1-萘基-丙氨酸置换Tyr11，以产生例如[Trp11]NT(8-13)、[(D)-Tyr11]NT(8-13)、[Trp11]NT、[(D)-Tyr11]NT；

-用Tle(叔丁基-亮氨酸)置换Ile12，以产生例如[Tle12]NT(8-13)、[Tle12]NT；

-Arg8、Arg9、Tyr11和Ile12的组合置换，以产生例如[(D)-Lys8,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[Lys9,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[Lys8,Tle12]NT(8-13)、[Lys9,Tle12]NT(8-13)、[Trp11,Tle12]NT(8-13)、[Lys8,Trp11,Tle12]NT(8-13)或[HLys8,Tle12]NT(8-13)；

-用CH₂NH(psi)还原键修饰8-9、9-10、10-11、11-12或12-13位置处的肽键；和/或

-NT(8-13)二聚体的环化，其中带有或不带有任何上述可能的氨基酸置换或修饰。

在优选实施方式中，所述神经降压素多肽选自人类NT、NT(2-13)、NT(6-13)或NT(8-13)或其具有1至4个氨基酸修饰的类似物。

就此而言，在最优选的实施方式中，所述神经降压素多肽选自[Lys8]NT(8-13)、[Lys9]NT(8-13)、[HLys8]NT(8-13)、[(D)-Lys8]NT(8-13)、[(D)-Orn9]NT(8-13)、[Lys8,Lys9]NT(8-13)、[(D)-Lys8,Lys9]NT(8-13)、[Trp11]NT(8-13)、[neoTrp11]NT(8-13)、[Tle12]NT(8-13)、[Trp11,Tle12]NT(8-13)、[neoTrp11,Tle12]NT(8-13)、[Lys8,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,Trp11]NT(8-13)、[(D)-Lys8,neoTrp11]NT(8-13)、[Lys8,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,neoTrp11,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,Lys9,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,Lys9,neoTrp11,Tle12]NT(8-13)、[Lys9,Tle12]NT(8-13)、[Lys9,Trp11]NT(8-13)、[Lys9,neoTrp11]NT(8-13)、[Lys9,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[Lys9,neoTrp11,Tle12]NT(8-13)、[HLys8,Tle12]NT(8-13)、[HLys8,Trp11]NT(8-13)、[HLys8,neoTrp11]NT(8-13)、[HLys8,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[HLys8,neoTrp11,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Orn9,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Orn9,Trp11]NT(8-13)、[(D)-Orn9,neoTrp11]NT(8-13)、[(D)-Orn9,Trp11,Tle12]NT(8-13)、或[(D)-Orn9,neoTrp11,Tle12]NT(8-13)。

在另一个优选实施方式中，本发明的神经降压素多肽是包含任何上述氨基酸置换的全尺寸NT或NT(2-13)或NT(6-13)多肽。

在最优选的实施方式中，所述神经降压素多肽是NT(8-13)或其保留了神经降压素的一种或几种生物活性的类似物。

适合用于本发明的其他神经降压素多肽或神经降压素置换描述在例如下述文献中：Rivier等，J Med Chem 1977；Tokumura等，Chem Pharm Bull(Tokyo)1990；Labbé-Jullié等，J PharmExp Ther 1994；Tyler等，Brain Res.1998；Podstawka-Proniewicz等，J PhysChem 2011；Kitabgi等，Mol.Pharm.18,11-19(1980)；专利申请US2009/0062212、WO2008/137720、WO 1999/52539、WO2007/070672、WO2010/063122或WO2012/000118。

激活物基团

本发明的活化的神经降压素化合物包含增强它们的活性的激活物基团。一般情况下，所述激活物基团包含结合BBB上的LDL受体(LDLR)的任何肽序列。通过允许NT的LDLR介导的转胞吞作用，本发明人产生了具有令人吃惊的生物活性的活化的化合物。就此而言，在更优选的实施方式中，所述激活物基团包含氨基酸序列M-aa1-R-L-R，其中aa1是脯氨酸残基(“P”)或其类似物。在上式中，M表示甲硫氨酸，R表示精氨酸，L表示亮氨酸。正如在实验部分中所示，这种激活物基团为本发明的活化的神经降压素分子提供了改进的生物活性和药理活性形式。具体来说，这种活化基团的接枝产生了活化的神经降压素分子，其在静脉内给药时与内源NT相比在降低体温方面的效力强出高达80倍。除了这种显著的降低体温效应之外，所述化合物显示出意料之外的退热活性。它们还表现出减少或停止运动癫痫发作的潜力，并通过抑制与兴奋性毒性相关的神经元死亡和神经炎症和通过减少与惊厥和癫痫相关的异常轴突出芽，表现出强力且出人意料的神经保护活性。此外，本发明的活化的神经降压素分子表现出非常良好的药物动力学和药效学侧貌，在系统性给药后的快速起效，在低剂量水平下强的降低体温活性，没有与低体温相关的颤抖的非常良好的安全性侧貌，防止潜在致死的过度体温降低的平台效应，以及MED与MTD之间400倍的安全裕量。最后，所述化合物通过静脉内给药显示出显著的镇痛效果。

因此，本发明涉及一种活化的神经降压素化合物，其中所述化合物包含激活物基团，所述激活物基团包含氨基酸序列M-aa1-R-L-R，其中aa1是脯氨酸残基(“P”)或其类似物。优选地，所述脯氨酸类似物选自Pip和Thz。Pip表示哌啶甲酸，Thz表示噻唑烷-4-甲酸。

根据优选实施方式，所述激活物基团包含下列氨基酸序列之一：

M-P-R-L-R(SEQ ID NO：5)；

M-Pip-R-L-R(SEQ ID NO：6)；或

M-Thz-R-L-R(SEQ ID NO：7)。

在另一个特定实施方式中，所述激活物基团中的氨基酸序列包含另一个L或D构型的N-端半胱氨酸残基(“C”)，即包含氨基酸序列C-M-aa1-R-L-R或c-M-aa1-R-L-R，其中aa1如上所定义。在最优选的实施方式中，所述N-端半胱氨酸残基“C”是D构型的。

在另一个特定实施方式中，所述激活物基团中的氨基酸序列包含包含另外两个C-端残基，即包含序列M-aa1-R-L-R-aa2-aa3，优选为c-M-aa1-R-L-R-aa2-aa3，其中aa1如上所定义，aa2是Gly或其类似物Sar(肌氨酸)，aa3是Cys或其类似物Pen(青霉胺)。

特别和最优选的激活物基团包含下列氨基酸序列之一：

c-M-P-R-L-R-G-C(SEQ ID NO：8)

c-M-Pip-R-L-R-Sar-C(SEQ ID NO：9)

c-M-Thz-R-L-R-G-Pen(SEQ ID NO：10)

c-M-Pip-R-L-R-Sar-Pen(SEQ ID NO：11)

活化的神经降压素的设计

本发明的优选的活化的神经降压素分子包含一个神经降压素多肽和一个激活物基团。然而，在可替选实施方式中，将几个NT分子与一个激活物基团组合，或者反过来，可能是有利的。就此而言，本发明的特定化合物具有结构式(NT)_l–连接物–AG或NT–连接物–(AG)_l，其中l是2至5之间的整数，通常为2或3。

所述激活物基团优选被共价连接到所述神经降压素分子。偶联可以通过本身在本领域中公知的任何反应或过程例如化学、生物化学或酶反应来进行，或者当所述神经降压素多肽和激活物基团只包含天然氨基酸时，通过遗传工程来进行。

偶联可以在所述激活物基团和神经降压素多肽的天然存在或引入有反应性官能团例如-OH、-SH、-CO₂H、-NH₂、-SO₃H、-CN、-N3、-NCS、-马来酰亚胺或琥珀酰亚胺酯或-PO₂H的任何位点处进行。因此，偶联可以在N-端或C-端处和/或在侧链携带的反应性基团处做出。所述激活物基团可以通过共价键直接偶联到所述神经降压素多肽。或者，所述激活物基团也可以利用连接物基团间接地偶联。共价化学偶联优选地包括使用含有烷基、芳基或肽基团的双功能或多功能试剂，通过酯类、醛类或烷基或芳基酸、酮类、酸酐、巯基或羟基、源自于溴化氰或氯化氰的基团、叠氮化物、腈类、马来酰亚胺类、羰基二咪唑、琥珀酰亚胺酯或磺酰卤。优选的化学偶联剂是磺基-EMCS(N-ε-马来酰亚胺己酰基-氧磺酰琥珀酰亚胺酯)，其可以被添加到例如所述神经降压素多肽，并随后用于共价连接所述激活物基团。

适合的连接物的实例包括单、二、三或多氨基酸，包含例如Lys、Glu、Asp、聚Lys、二肽例如Gly-Lys或多氨基酸例如GGG或G₄S。其他连接物包括例如琥珀酸、Ahx(氨基己酸)或PEG(聚乙二醇)分子。

在优选实施方式中，所述神经降压素多肽和激活物基团使用选自PEG分子的连接物来偶联。可以使用任何PEG分子，例如特别是PEG2(12-氨基-4,7,10-三氧杂十二烷酸)、PEG3、PEG4、PEG5或PEG6(21-氨基-4,7,10,13,16,19-六氧杂二十一烷酸)。更优选地，所述连接物包含PEG2或PEG6分子，甚至更优选地PEG6。

在另一个优选实施方式中，所述神经降压素多肽和激活物基团利用肽键直接偶联。

在另一个优选实施方式中，所述神经降压素多肽和激活物基团使用柔性连接物来偶联，所述柔性连接物选自聚G分子，更优选为G氨基酸或GGG三肽或直链氨基己酸。

在另一个优选实施方式中，所述神经降压素多肽和激活物基团使用可切开的二硫键来偶联。

在另一个优选实施方式中，所述神经降压素多肽和激活物基团使用异双功能交联剂、更优选为磺基-EMCS试剂来偶联。

本发明的最优选的活化的神经降压素分子的名单提供在下面的表A中。

表A

生产本发明的活化的神经降压素分子的详细方法公开在实验部分中。就此而言，本发明还涉及一种用于制备活化的神经降压素分子的方法，所述方法包括在如上所定义的神经降压素多肽与激活物基团之间进行共价(直接或间接)偶联的步骤。所述方法可以包括另一个收集或纯化所述活化的神经降压素的步骤，和/或另一个修饰所述活化的神经降压素的任选步骤，和/或另一个用可接受的赋形剂配制所述活化的神经降压素的任选步骤。

在特定实施方式中，首先分开地合成所述神经降压素多肽和激活物基团，然后通过例如化学、酶或生物化学偶联将它们共价连接。正如上文公开的，偶联可以通过所述神经降压素和/或激活物基团中存在和/或插入的各种不同的反应性官能团，并任选地使用适合的连接物来进行。

在另一个特定实施方式中，所述神经降压素多肽和激活物基团被直接合成为单一分子。例如，所述活化的神经降压素分子可以作为独一无二的分子实体在多肽合成仪上合成。或者，所述活化的神经降压素分子可以通过基因融合和在重组宿主细胞中表达来生产。当两种组分都包含天然氨基酸时，这种方法是可行的。

就此而言，本发明还涉及编码本发明的活化的神经降压素的核酸分子，其中所述神经降压素多肽和激活物基团包含天然存在的氨基酸并通过氨基酸键或连接物偶联。

本发明的另一个目的是包含这种核酸分子的克隆或表达载体(例如质粒、噬菌体、病毒、粘粒等)，以及包含这种核酸或载体的重组宿主细胞。

本发明的活化的神经降压素分子可以使用本身在本领域中已知的技术进行修饰，以进一步提高它们的活性或改进药物动力学性质。例如，可以将它们连接到聚合物(PEG、白蛋白)，或通过添加亲脂性取代基或通过添加化学反应性基团进行修饰。也可以将天然存在的氨基酸用肽模拟物或氨基酸类似物替换，和/或可以产生环状多肽。

药物组合物和方法

本发明还涉及包含如上所定义的活化的神经降压素分子和一种或多种可药用赋形剂的药物组合物。

所述活化的神经降压素可以以任何可药用盐的形式使用。例如并且非限制性地，表述“可药用盐”是指可药用碱或酸加成盐、水合物、酯、溶剂化物、前体、代谢物或立体异构体。

表述“可药用盐”优选是指无毒性盐，其通常可以通过将游离碱与适合的有机或无机酸反应来制备。这些盐保留了游离碱的生物有效性和性能。这类盐的代表性实例包括水溶性和水不溶性盐，例如乙酸盐、N-甲基葡糖胺铵盐、安索酸盐(amsonate)(4,4-二氨基二苯乙烯-2,2’-二磺酸盐)、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、氢溴酸盐、溴化物、丁酸盐、樟脑磺酸盐、碳酸盐、盐酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐、二盐酸盐、二磷酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二胺四乙酸钙、乙二磺酸盐、丙酸酯月桂硫酸酯(estolate)、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、羟乙酰基氨苯胂酸盐(glycolylarsanylate)、六氟磷酸盐、己基间苯二酚酸盐、海巴明、羟基萘酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐(isothionate)、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、3-羟基-2-萘甲酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(1,1-亚甲基-双-2-羟基-3-萘甲酸盐或emboate)、泛酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、次乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、磺基水杨酸盐、suramate、单宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐(teoclate)、甲苯磺酸盐、三乙基碘化物、三氟乙酸盐和戊酸盐。

本发明还涉及包含如上所定义的核酸、载体或宿主细胞和一种或多种可药用赋形剂的药物组合物。

有利情况下，本发明的组合物包含的可药用赋形剂可以选自在制药工业中常用的赋形剂，例如稀释剂、固体载体、稳定剂、防腐剂、表面活性剂等。所述组合物可以配制成固体、半固体或液体形式。

液体组合物是优选的。这种液体制剂、特别是可注射制剂，可以通过例如将活化的神经降压素分子溶解或分散在可药用溶剂例如水、生理盐水溶液、含水右旋糖、甘油、乙醇、油及其类似物中来制备。

对于固体组合物例如片剂、丸剂、粉剂或颗粒剂来说，可以将活性物质与下述组分组合：a)稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸及其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；c)粘合剂，例如硅酸镁和硅酸铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐或泡腾混合物；和/或d)吸收剂、染料、调味剂和甜味剂。赋形剂可以是例如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁和药用级类似物。

对于半固体组合物例如栓剂来说，赋形剂可以是例如乳剂或油性悬剂，或者是基于聚亚烷基二醇例如聚丙二醇的。

适合在本发明中使用的其他赋形剂是在WO 2012/090070或US2012/0172454中所描述的化合物。

本发明还涉及药剂盒，其包含含有如上所定义的组合物的容器和药物递送装置或手册。所述药物递送装置优选为注射器。

本发明的组合物可以通过任何适合的途径给药，例如但不限于通过肠胃外、口、直肠、表面或鼻内途径。

肠胃外给药可以通过注射来进行，使用例如腹膜内、皮下、静脉内、眼内或肌肉内注射，任选地使用延长或延迟释放或受控释放。口服给药(或经口)可以使用例如采取包衣或未包衣片剂、明胶胶囊、粉剂、球丸、悬剂或口服溶液形式的制剂来进行(一种这类用于口服给药的形式可以使用立即释放或使用延长、延迟释放或受控释放)。直肠途径可以使用例如采取栓剂形式的制剂。其他途径包括表面途径，特别是通过透皮途径，例如采取贴片、膏(pomade)或凝胶的形式；鼻内途径，例如采取气溶胶和喷剂的形式；经舌途径；眼内或腹膜内途径。

所述药物组合物通常包含有效剂量的本发明的活化的神经降压素。本文中所描述的“治疗有效剂量”是指对于给定病症和给药安排来说提供治疗效果的剂量。它通常是被给药以明显获得负责或有助于改善与疾病或病理状态相关的某些症状的预期生物效果的活性物质的平均剂量。例如，在治疗CNS的病变或障碍中，减轻、阻止、延迟、消除或停止所述疾病或障碍的病因或症状之一的剂量将是治疗有效的。活性物质的“治疗有效剂量”不必定治愈疾病或障碍，但是将为该疾病或障碍提供治疗，以使它的出现被延迟、阻碍或阻止，或者它的症状被弱化，或者它的期限被改变或例如严重性降低，或者患者的恢复被加速。

应该理解，对于具体的个人来说，“治疗有效剂量”取决于各种不同因素，包括活性物质的活性/有效性、它的给药时间、它的给药途径、它的消除速率和它的代谢和在防止或治愈的基础上待治疗的疾病(或障碍)的严重性，以及患者的年龄、体重、总体健康、性别和/或饮食。因此，所述有效剂量可以由专业技术人员调整。然而，一般来说，所述有效剂量(以相对于神经降压素的摩尔当量表示)在0.001至10mg/kg之间，更优选地在0.002至5mg/kg之间。在优选的范围内，所述有效剂量在0.01至2mg/kg之间。这种剂量范围特别适合于肠胃外注射，特别是适合于静脉内注射(团注)。

本发明的分子和组合物可用于在哺乳动物中诱导药理学低体温，并用于治疗可以从低体温获益的任何疾病或病症。

本发明特别适合于治疗与整体、局灶性和新生儿CNS缺血、CNS创伤、心脏手术、疼痛和过高体温相关的CNS障碍。更具体来说，本发明适合于防止或减轻或最小化由心脏骤停、中风、新生儿缺血、癫痫发作、严重创伤性头部和脊髓损伤、心脏手术在对象的CNS中引起的兴奋性毒性神经元损伤和神经炎症，适合于降低与ICH、脓毒症或伴有发热的任何病毒、细菌或寄生虫感染相关的过高体温，并且适合于减轻疼痛。

本发明的一个目的涉及使用如上所定义的化合物或组合物在哺乳动物对象中诱导低体温和/或治疗具有脑损伤的对象。

本发明的另一个目的涉及一种在哺乳动物对象中诱导低体温的方法，所述方法包括向所述对象系统性给药如上所定义的化合物或组合物。

本发明的另一方面涉及一种在哺乳动物对象中降低体温的方法，所述方法包括向所述对象系统性给药如上所定义的化合物或组合物。

本发明的另一个目的是一种在对象中减轻疼痛的方法，所述方法包括向所述对象系统性给药如上所定义的化合物或组合物。

本发明的另一个目的是一种在对象中减轻癫痫发作的方法，所述方法包括向所述对象系统性给药如上所定义的化合物或组合物。

本发明可用于在任何哺乳动物对象例如人类患者中治疗(例如保护、防止或减轻)脑损伤的影响。它特别适用于治疗心脏骤停后、具有中风、新生儿缺血、癫痫发作、严重创伤性头部和脊髓损伤后、心脏手术期间的对象，以降低与ICH、脓毒症或伴有发热的任何病毒、细菌或寄生虫感染相关的过高体温，以减轻疼痛。

术语“治疗”和其他类似的表述是指实现药理和/或生理效果，例如体温的降低和对患者状况的任何间接的有益效果。所述效果可以是预防性或防止性的，以便完全或部分防止疾病或症状在患病个体中的恶化或它在健康对象中的传播，和/或可以是治疗性的，以便完全或部分治疗疾病和/或其相关的有害效应。当在本文件中使用时，术语“治疗”覆盖了哺乳动物中、更特别为人类对象中疾病的任何治疗，并且包括：(a)在对该病理或障碍易感但尚未被阳性诊断的人中能够发生的疾病或病症的防止；(b)疾病的减缓(例如通过终止它的发展)；或(c)疾病的缓解(例如通过减轻与疾病相关的症状)。术语“治疗”还涵盖活性物质的任何给药，以便在个体或患者中照管、治愈、缓解、改善、减轻或抑制病症。

本发明还涉及一种降低对象体温的方法，所述方法包括向需要的对象以足以降低所述对象的体温的量给药如上所定义的化合物或组合物。所述对象可能正患有或可能最近患过例如心脏骤停、中风、新生儿缺血、脑或脊髓损伤、癫痫发作、过高体温，可能正经历心脏手术，并且可能需要神经保护。

在考察了下面的实施例后，本发明的其他方面和优点将变得显而易见，所述实施例在本质上仅仅是说明性的，并且不限制本申请的范围。

实施例

实施例1

通过NT-Lys6合成活化的NT(1-13)-AG药物

在第一步中，将全尺寸的神经降压素pELYENKPRRPYIL-OH(NT)偶联到本发明人开发的各种不同激活物基团(AG)。目的是选择最佳的AG/NT组合。为了合成这些分子，我们利用了神经降压素序列中6位赖氨酸侧链的胺反应性。将商品化磺基-EMCS(N-ε-马来酰亚胺己酰基-氧磺酰琥珀酰亚胺酯)通过它的琥珀酰亚胺酯组成部分偶联到6位赖氨酸上。在纯化后，将官能化的神经降压素(NT-EMCS)偶联到不同的硫醇化AG。

因此，进行了三个步骤以获得最终的所需偶联物：两种官能化组成部分NT-EMCS和硫醇化AG的合成，以及它们的偶联。这些步骤示意显示如下：

分析和纯化方法：

·反应进程和纯度监测在装备有C18Kinetex^TM(5μm，150mm x 4.6mm)的Dionex3000系统上进行。检测在214nm处完成。洗脱系统由H₂O/0.1％TFA(溶液A)和MeCN/0.1％TFA(溶液B)构成。流速为2mL/min，梯度为4min内0-100％B。

·粗产物在装备有C18Luna^TM(5μm，100mm x 21.2mm)的Dionex3000系统上，通过RP-HPLC进行纯化。检测在214nm处完成。洗脱系统由H₂O/0.1％TFA(溶液A)和MeCN/0.1％TFA(溶液B)构成。流速为20mL/min。

1.NT-EMCS合成：

全尺寸NT购自Biochem AG，而磺基-EMCS(N-ε-马来酰亚胺己酰基-氧磺酰琥珀酰亚胺酯)购自Thermo Scientific(Pierce Biotechnology)。

如下所述制备官能化的NT-EMCS：向NT溶液(25mg，15μmol，1eq.，在1.25mL PBS 4XpH＝7.4中)添加磺基-EMCS溶液(9.2mg，15μmol，1eq.，在1mL PBS 4X pH＝7.4中)。允许反应混合物在室温下搅拌。反应的监测通过分析型RP-HPLC进行。在搅拌过夜后，将粗混合物通过制备型RP-HPLC进行纯化，使用30min内21-30％B的梯度。收集纯度超过95％的级分并冷冻干燥，以给出纯的白色粉末(m＝21mg，得率＝75％，纯度>95％)。质量通过MALDI-TOFMS分析来确认：m/z[M+H]⁺，计算值为1865.98，实测值为1865.97。

2.硫醇化的AG的合成

为了将AG偶联到官能化的NT的马来酰亚胺组成部分，在每个候选AG上引入硫醇反应性基团。

肽Pr-cMaa1RLRaa2aa3-G-OH的合成：

肽Pr-cMaa1RLRaa2aa3-G-OH通过固相肽合成(SPPS)方法，在Liberty^TM(CEM)微波合成仪上，使用Fmoc/tBu策略和购自Iris Biotech的Fmoc-Gly-Wang树脂(100-200目，1％DVB，载样量0.7mmol/g)来合成。这种树脂允许合成在其侧链和C-端末端上完全去保护的肽。

选择具有标准的正交侧链保护的N-α-Fmoc保护的氨基酸：Fmoc-Cys(Trt)-OH(采取D或L构型)，Fmoc-Pen(Trt)-OH(采取D或L构型)，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pip-OH，Fmoc-Thz-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Sar-OH。它们以及哌啶、三氟乙酸(TFA)、二异丙基乙胺(DIEA)、乙二硫醇(EDT)、三异丙基甲硅烷(TIS)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-β]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)都购自Iris Biotech。二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)和丙酸酐(Pr₂O)购自Sigma-Aldrich。

在0.25mmol规模的合成中使用aa/DIEA/HBTU:4/4/8当量(相对于树脂来说)并且在0.1mmol规模的合成中使用aa/DIEA/HBTU:5/5/10当量(相对于树脂来说)，通过第n+1个氨基酸的酸官能团的微波活化对氨基酸进行偶联。偶联时间被调整到10min。在aa1引入后，甲硫氨酸和半胱氨酸的掺入需要双倍偶联。由此偶联的新氨基酸的Fmoc基团的去保护，使用DMF中的20％哌啶来进行。使用DCM中的50％丙酸酐或乙酸酐将肽延长期间偶联的最后一个氨基酸丙酰化或乙酰化。N-端封端的目的是使合成的新肽稳定，但是也例如在C-端位置中的共价偶联期间降低二次反应的风险。为了保持N-端化学结构类似于某些放射性标记的肽的结构，所述放射性标记的肽有时使用氚化的丙酰基琥珀酰亚胺酯在N-端氨基酸上标记，选择丙酰基而不是乙酰基组成部分。然后使用由TFA/TIS/H2O/EDT：94/2/2/2构成的溶液在室温(RT)下对树脂结合的肽进行切割至少2小时。每克树脂使用至少15mL的切割溶液。然后使用冰冷的乙醚将粗品肽沉淀，以3000rpm离心8min，并在H₂O/0.1％TFA中冷冻干燥。获得白色固体并且不用进一步纯化将其用于下一步骤中。

肽Pr-cMaa1RLRaa2aa3-G-OH的环化：

二硫桥通过采取L或D构型的两个被适合地保护的Cys或Pen的两个硫醇官能团的分子内环化来获得。

AcOH、K₃[Fe(CN)₆]和碳酸铵购自Sigma-Aldrich。

将粗品Pr-cMaa1RLRaa2aa3-G-OH肽溶解在AcOH 0.5％中以得到0.5mg/mL的终浓度。向所述肽溶液添加碳酸铵(2N)以达到8-9的接近碱性的pH。然后向反应混合物添加K₃[Fe(CN)₆](0.01N)，直至观察到明亮且持久的黄色。反应的监测通过分析型RP-HPLC进行。通常在不到30min内反应是定量的。将反应混合物在0.45μm膜上过滤并通过制备型RP-HPLC进行纯化。收集纯度高于95％的级分并冷冻干燥，以给出纯的白色粉末(最终纯度>95％)。详细的梯度、得率和质量分析在下面给出。

环化的Pr-cMaa1RLRaa2aa3-G-OH肽上半胱胺的偶联：

2-三苯甲硫基-1-乙胺盐酸盐(Trt-半胱胺)购自Iris Biotech，而其他反应物的购买已在上文描述。

制备Trt-半胱胺(2eq.)、DIEA(4eq.)和含有游离C-端的环化的肽(1eq.)在无水DMF中的溶液(对于肽来说0.05M)。最后向混合物添加PyBop(1.1eq，在无水DMF中0.13M)。几乎立即达到反应完成，因为在2min后的HPLC监测显示起始肽完全消失。在真空下蒸发掉DMF，得到浅黄色油状物。为了除去三苯甲基硫醇保护，加入DCM/TIS/TFA：3/1/1溶液(约0.5mL/mg起始肽)。允许反应混合物在RT下搅拌。反应的监测通过分析型RP-HPLC进行。然后使用惰性气体鼓泡蒸发掉DCM和TFA，并且Et₂O使得粗品肽沉淀。在以3000rpm离心8min后，将粗品肽在H₂O/0.1％TFA中冷冻干燥并通过制备型RP-HPLC进行纯化。收集纯度高于95％的级分并冷冻干燥，给出纯的白色粉末(最终纯度>95％)。详细的梯度、得率和质量分析在下面给出。

3.通过NT-EMCS与硫醇化AG的偶联合成NT(1-13)-AG：

将含有硫醇反应性基团的AG溶解在PBS 1X中(1eq.，0.003M，pH 7.4)并添加到NT-EMCS(1eq)。允许反应混合物在RT下搅拌。通常，超声波有助于NT-EMCS的溶解。反应的监测通过分析型RP-HPLC进行。在反应完成后，将粗产物通过制备型RP-HPLC进行纯化。收集纯度高于95％的级分并冷冻干燥，给出纯的白色粉末(最终纯度>95％)。详细的梯度、得率和质量分析在下面给出。

实施例2

本发明的活化的NT药物的体外结合亲和性

神经降压素的中枢低体温效应通过NTR-1受体的活化来介导。为了引发生物活性例如低体温活性，神经降压素偶联物应该以至少与天然神经降压素、即NT(1-13)相近的亲和性结合NTR-1。

神经降压素偶联物的结合亲和性使用竞争性结合测定法，利用人类和大鼠1型神经降压素受体(hNTR-1、rNTR-1)两者来评估。富含hNTR-1的细胞膜购自Perkin Elmer。大鼠NTR-1通过用大鼠NTSR1质粒构建物(Origene,Rockville,USA)转染HEK 293细胞来获得。

活化的NT药物对hNTR-1的结合亲和性按照制造商的说明书(Perkin Elmer)来进行，并作出了轻微修改。详细来说，使用终浓度为0.5μg/孔的从稳定表达人类NTR-1的CHO细胞制备的膜匀浆物和浓度为3nM的放射性标记配体[³H]-神经降压素(比活性为99.8Ci.mmol^-1；Perkin-Elmer)，测量NTR-1结合。放射性标记配体的特异性结合被确定为K_D值为0.81nM和B_max为34pmol每mg膜蛋白。非特异性结合在5μM神经降压素存在下测定。

对于使用大鼠1型神经降压素受体(rNTR1)的测定法来说，我们使用终浓度为0.75μg/孔的来自于表达rNTR-1的HEK 293细胞的膜匀浆物。放射性标记配体在这些匀浆物上的特异性结合被确定为K_D值为0.93nM和B_max为2.5pmol每mg膜蛋白。

每个测定在96孔板中，在100μL总反应体积中，在结合缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.4，0.1％BSA)中进行。随后将所述测定体系在室温下温育24h。将每个孔的内含物使用MicroBeta FilterMate-96收获器(Perkin-Elmer)通过(Perkin-Elmer，用25μL 0.5％聚乙烯亚胺预先浸渍)快速过滤，然后将每个孔用清洗缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.2)漂洗5次。通过添加25μL MicroScint^TM-O(Perkin)测量每个干燥滤器的放射活性(cpm)，并使用TopCount NXT^TM微孔板闪烁和发光计数器(Perkin-Elmer)定量。特异性结合通常为总结合的90％或更高。使用KaleidaGraph进行剂量响应曲线作图，以确定IC50值。测定进行一式两份。使用Cheng-Prusoff转换从IC50平均值确定Ki值。

ND：未测定

这些结果显示，本发明的活化的分子保留了在纳摩尔或甚至更低的范围内的对NTR-1的非常高的亲和性。事实上，在大多数情况下，AG显著提高不同NT药物对NTR-1的亲和性。这种结果是引人注目和出人意料的，因为更可能预期偶联将负面干扰受体结合。

实施例3

本发明的活化的NT药物的体内评估

通过在Swiss(CD-1)小鼠中监测低体温响应，调查了本发明的活化的NT药物对神经降压素的中枢药理学活性的有益效果(图1)。在以8mg/kg剂量静脉内给药(团注)NT后，小鼠显示出直肠体温的少量但明显的降低，最大效果为注射后15min时距基线-1℃。在24mg/kg剂量下这种效果增加，达到注射后30min时-2.6℃的最大效果。相反，化合物I、即本发明的包含SEQ ID NO：8作为激活物基团的活化的NT药物以8mg/kg的摩尔当量剂量(8mg/kgeq.NT)的静脉内给药诱导快速和更强的体温降低，在注射后15min时显著，并且在注射后30至60min之间达到-3.7℃的最大效果。随后这种药理学低体温逐渐减小，直至在注射后3小时返回到基线温度。在实验期间，在这些小鼠中没有观察到颤抖。

较低剂量水平的化合物I的评估显示出剂量依赖性低体温效应，其中最低有效剂量(MED)为0.5mg/kg eq.NT，ED₅₀为1.21mg/kg eq.NT，在4mg/kg eq.NT下观察到约-4℃的最大效果，在8mg/kg eq.NT下没有更强的效果(图2)。使用较高剂量水平时达到最大效果的时间增加，从较低剂量水平下的注射后15min到较高剂量水平下的注射后30-60min。当与表现出8mg/kg的MED的单独的NT相比时，这种活化的NT药物显示出中枢低体温效应的16倍的增加.

然后试验了本发明的可替选的活化基团(AG)。当在0.5mg/kg eq.NT的相同剂量水平下与化合物I相比时，包含例如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11作为激活物基团的活化的NT药物，即化合物II(NT-SEQ ID NO：9)和化合物IV(NT-SEQ ID NO：11)，在小鼠中诱导了甚至更大的低体温响应，最大效果分别为在注射后30min时的-4.1℃和-3.4℃(图3)。选择化合物II用于进一步研究。

化合物II的剂量响应关系的评估证实了0.1mg/kg eq.NT的MED，其比单独的NT低80倍，并且ED₅₀为1.25mg/kg eq.NT(图4)。在高剂量水平下，化合物II诱导甚至更强的低体温，在10mg/kg eq.NT下在注射后60min时达到-7℃的最大效果。在这种高剂量水平下，小鼠显示出减少的自主活动，其在时间上与低体温效应平行，但是保留了对不同种类刺激的充分响应性。同样地，甚至在表现出30℃左右的体温的小鼠中，也没有观察到颤抖。

实施例4

本发明的活化的NT药物的BBB运输

我们评估了本发明的活化的神经降压素药物的BBB透过性和体外血液稳定性。

本发明的偶联物在BBB和血视网膜屏障(BRB)处的运输动力学，在成年雄性C57Bl/6小鼠中使用原位脑灌注技术来评估。通过将[3H]Tyr3-NT与AG偶联或通过将氚化的AG偶联到NT分子，获得放射性标记的活化的NT化合物。NT通过使用氚气对碘代Tyr3-NT进行催化脱卤来放射性标记，而AG通过将氚化的丙酰基琥珀酰亚胺酯偶联到其N-端进行放射性标记。比放射活性(SRA)通常在50Ci/mmol的范围内。为每次合成准备的放射活性的总量一般在100至1000μCi之间。

原位脑灌注技术能够对人造灌注液的组成进行全面控制，以便将脑的细胞和血管化维持在动物内的正常生理和解剖条件下，而没有破坏系统性分布的因素。原位脑灌注最初在大鼠中开发，并由Dagenais等人改编以适应于小鼠(Dagenais等，2000,J Cereb BloodFlow Metab.,20(2),381-6)。这允许在目标受体、酶或不同类型的内流或外流转运蛋白的转基因和KO突变小鼠中，评估化合物跨过BBB和BRB的运输动力学。

放射性标记的本发明的化合物的原位脑灌注在120s期间，使用2mL/min的灌注液流速来进行。初始运输被表示成转移系数K_in(对血管体积校正过的试验化合物的分布体积与脑灌注时间之间的关系)。放射性标记的蔗糖这种正常情况下不跨过BBB的化合物的共同灌注，也允许评估BBB的物理完整性以及因此试验化合物的急性毒性的不存在。

与文献中发现的数据相一致，NT在脑中显示出非常低的初始运输，K_in值为～0.4x10^-4mL/s/g脑组织。NT在眼中的运输甚至更低(图5，白色条)。重要的是，使用放射性标记的本发明的活化的NT药物获得的结果一致地显示出在脑和眼中明显更高的运输动力学，证实了用本发明的激活物基团活化NT特异性地增强它在这些否则不可透过的器官中的运输。具体来说，化合物XIV在脑中显示出～3.65x 10^-4mL/s/g的K_in值，其与游离NT相比提高9倍，在眼中的K_in值为～32.0x 10^-4mL/s/g(图5，黑灰色条)。此外，化合物I不改变BBB的完整性，因为蔗糖的脑分布体积与对照值相近。

实施例5

本发明的活化的NT药物的体外稳定性

评估本发明的药物的体外血液稳定性(半衰期或t_1/2)并与单独的NT进行比较。简单来说，将每种肽在2μM的标称浓度下，在新鲜收集的Swiss(CD-1)小鼠血液中在37℃下温育最多3小时。在几个时间点使用液相色谱串联质谱术(LC-MS/MS)分析方法定量血浆级分中的被分析物。体外半衰期(t_1/2)从每个动力学曲线(一级反应动力学：C(t)＝C₀.e^-kt)的对数回归估算并由t_1/2＝ln2/k给出。

结果验证了天然NT对血浆降解的非常低的抗性，体外半衰期仅为7min(图6)。这与内源肽和一般而言，仅含有天然氨基酸的小的线性肽的快速酶促蛋白水解相一致(Foltz等，2010,J Nutr.,Jan；140(1):117-8)。形成鲜明对比的是，本发明的所有活化的NT药物在小鼠血液中显示出极大增加的t_1/2，通常超过1小时。

BBB运输动力学、在血液中的体外稳定性和提高的中枢低体温效果，合在一起证实了本发明的活化的NT药物的引人注目和出人意料的有益效果。

实施例6

基于NT(x-13)的活化的神经降压素分子的合成

实施例1-5显示了SEQ ID NO：9在活化全尺寸NT中特别有效。在本实施例和下面的实施例中，试验了SEQ ID NO：9在NT片段的基础上产生强效的活化的神经降压素分子的能力。

在文献中报道了某些截短的神经降压素类似物与全长内源神经肽同样强效，特别是当对应于8-13位氨基酸的最小序列存在时。在此基础上，使用尺寸减小的NT类似物制备了新的活化的NT药物，其目的是产生更强效的药物，同时最小化生产成本，并允许串联偶联在NT的N-端部分上。

偶联物使用与用于包含全尺寸神经降压素的偶联物(参见实施例1)相同的偶联方法来合成，焦点在于三个神经降压素片段：NT(2-13)，其中只有焦谷氨酸丢失；NT(6-13)和Lys-NT(8-13)，其包含最小活性序列并且还至少含有6位赖氨酸，用于偶联到AG。分析和纯化方法如实施例1中所述来进行。

1.NT(x-13)肽合成：

截短的神经降压素类似物通过固相肽合成(SPPS)方法，在Liberty^TM(CEM)微波合成仪上，使用Fmoc/tBu策略来合成。氨基酸偶联从人工预装载的Fmoc-Leu-Wang树脂(100-200目，1％DVB)进行。这种树脂允许合成在其侧链和C-端末端上完全去保护的肽。

Wang树脂(载量0.2mmol/g)购自Iris Biotech。其他原材料已经在前面描述。

为了树脂预装载，向树脂添加Fmoc-Leu-OH/HOBt/DIC(6eq./6eq./6eq.)在DMF中的溶液(相对于aa来说0.055M)。然后添加DMAP(1eq.)。在过夜机械搅拌后，洗涤所述树脂并评估它的载量。通常载量在0.1至0.16mmol/g之间。

肽延长按照已经描述过的来进行。使用DCM中的50％乙酸酐将肽的N-端乙酰化，以模拟在内源肽中存在的肽键并提高代谢稳定性。使用与前述相同的程序切下树脂结合的肽，并通过RP-HPLC进行纯化。收集纯度高于95％的级分并冷冻干燥，以提供纯的白色粉末(最终纯度>95％)。详细的梯度、得率和质量分析在下面给出。

ND：未测定

2.NT(x-13)-EMCS合成

NT(x-13)官能化使用与实施例1中描述的用于全尺寸NT的相同的程序来进行。肽被产生为纯的白色粉末，纯度为至少95％。详细的梯度、得率和质量分析在下面给出。

3.硫醇化的SEQ ID NO：9的合成：

硫醇化的SEQ ID NO：9如实施例1中所述来合成。

4.偶联物NT(x-13)-SEQ ID NO：9的合成：

NT(x-13)-EMCS与SEQ ID NO：9的偶联程序与实施例1中详细描述的用于NT(1-13)-AG合成的程序相同。偶联物被产生为纯的白色粉末，纯度为至少95％。详细的梯度、得率和质量分析在下面给出。

实施例7

本发明的活化的NT(x-13)药物的低体温响应

活化的药物的低体温响应通过将每种偶联物以0.5mg/kg eq.NT的相同剂量水平在Swiss(CD-1)小鼠中静脉内注射(团注)来评估。

所有截短的基于NT的药物在小鼠中诱导类似程度的低体温，体温的最大降低为注射后30min时的约-2.5℃(图7)。这些结果显示，在本发明的活化的药物的情形中，最短的C-端NT(8-13)片段足以引发强效生物活性。

实施例8

使用二硫桥合成活化的NT药物偶联物

在实施例1和4中描述的本发明的活化的NT药物偶联物，使用EMCS连接物和NT序列中天然存在或引入的赖氨酸残基来合成。在评估新的连接策略的尝试中，将NT(8-13)和SEQID NO：9通过二硫桥偶联。这种可切开的连接物在系统循环中表现出良好的稳定性，同时它可以在某些细胞内区室、特别是BBB的内皮细胞中的细胞内区室的还原环境中切开，潜在地引起完整活性的NT(8-13)在脑实质中的释放。此外，改变连接物产生具有不同的和潜在有益的PK、处置和代谢性质的新药物。

二硫桥从天然存在或引入到待偶联的两个组成部分上的两个硫醇基团制成。在本发明的情形中，所述待偶联的两个组成部分不存在游离的半胱氨酸，因此将两个硫醇官能团化学引入到AG和NT上。为此目的，将受到硫醇活化的Npys保护的半胱氨酸残基引入到NT(8-13)的N-端处。Npys衍生的Cys对游离硫醇具有特异性反应性，因此有利于异二硫桥的形成。硫醇化的SEQ ID NO：9通过以与用于偶联到NT-EMCS的相同的方式用半胱胺进行C-端官能化来产生。两个组成部分被独立地产生，然后在最后一步中彼此偶联。偶联步骤示意显示如下：

分析和纯化方法如实施例1中所述。

1.肽C(Npys)-NT(8-13)的合成

Boc-Cys(Npys)-OH和DIC(二异丙基碳二亚胺)购自Iris Biotech。

H-NT(8-13)如实施例6中所述来制备，区别在于N-端不封端。将Boc-Cys(Npys)-OH(5eq.)和DIC(5eq.)在无水DMF中的溶液(0.33M)在RT下预先活化10min，然后添加到树脂。在过夜机械搅拌后，将树脂用DMF和DCM清洗，使用与前面实施例中描述的相同的程序对树脂结合的肽进行切开并处理。使用30min内17-26％B的梯度纯化粗品肽，产生纯的浅黄色粉末(m＝25.9mg，得率＝24％，纯度>95％)。质量通过MALDI-TOF MS分析来验证：m/z[M+H]⁺，计算值为1074.49，实测值为1074.47。由于在分析期间Npys保护在MALDI-TOF中被切下，因此也观察到没有所述基团的产物：[M-Npys+H+H]⁺，计算值为920.51，实测值为920.475。

2.硫醇化的SEQ ID NO：9的合成

硫醇化的SEQ ID NO：9如实施例1中所公开的来产生。

3.活化的NT偶联物NT(8-13)-SS-SEQ ID NO：9(化合物VIII)的合成

将C(Npys)-NT(8-13)(1.3eq.)在惰性气氛下溶解在脱气的10％乙酸溶液中(0.02M)。将硫醇化的SEQ ID NO：9(1eq.)在惰性气氛下溶解在脱气的10％乙酸溶液中(0.015M)并立即添加到所述C(Npys)-NT(8-13)溶液。允许反应混合物在惰性气氛下在RT下搅拌。反应的监测通过分析型RP-HPLC来进行。在搅拌48小时后，再次向反应混合物添加C(Npys)-NT(8-13)(0.45eq.)。在反应完成后，通过制备型RP-HPLC，使用30min内17-27％B的梯度进行粗品混合物的纯化。获得纯的白色粉末(m＝7.8mg，得率＝52％，纯度>95％)。质量通过MALDI-TOF MS分析来验证：m/z[M+H]⁺，计算值为2050.00，实测值为2051.08。

实施例9

活化的药物偶联物NT(8-13)-SS-SEQ ID NO：9的低体温响应

NT(8-13)-SS-SEQ ID NO：9(化合物VIII)的低体温响应通过以10mg/kg eq.NT的剂量水平在Swiss(CD-1)小鼠中静脉内注射(团注)来评估，并与使用半胱胺-EMCS连接物获得的药物、即化合物II的响应进行比较。

化合物VIII在小鼠中诱导强烈低体温，其程度类似于化合物II。两种化合物在注射后45min和1hr时分别诱导-5.8℃和-6.7℃的最大体温降低(图8)。因此，NT(8-13)的使用二硫化物连接物的偶联似乎是足以活化NT并在同时推测可能允许NT在还原环境例如脑毛细血管内皮细胞中释放的策略。

实施例10

串联的AG-NT活化药物的合成

在前面实施例中公开的活化的NT药物通过NT和AG组成部分的独立制备和官能化以及它们随后的偶联来合成。在本实施例中，使用串联合成和SPPA相容性间隔物生产了新的一系列活化的NT药物。或者，利用肽键将NT和AG组成部分直接偶联。这些药物的合成可以使用仅仅两个步骤串联进行：支持物上的肽延长和AG二硫键形成。使用这种策略，制备了基于最优选的NT(8-13)片段及其类似物的活化的NT药物，总体得率高达35％。此外，串联合成允许使用许多连接物作为AG组成部分与NT多肽之间的间隔物。重要的是，NT多肽被引入到偶联物的C-端处，因为游离的羧基端对于结合到NT受体来说是必需的。这些共同的连接物中包括基于氨基酸的连接物例如三聚甘氨酸。氨基己酸也被选中。这种非天然氨基酸是常见的疏水连接物，被用于增加肽与另一个组成部分之间的距离。最后，还评估了两种PEG间隔物，以使偶联物更加亲水并因此水溶性和生物耐受性更高。试验了两种PEG分子以评估AG与NT多肽之间的距离对其生物活性的影响。引入到药物偶联物中的所有连接物/间隔物为所述药物提供了柔性，这对于靶-受体通过NT多肽的最适识别来说是重要的。分析和纯化方法如实施例1中所述来进行。

1.SEQ ID NO：9-NT(8-13)、SEQ ID NO：9-GGG-NT(6-13)、SEQ ID NO：9-Ahx-NT(6- 13)和SEQ ID NO：9-Ahx-NT(8-13)的合成

化合物IX(SEQ ID NO：9-NT(8-13))、化合物X(SEQ ID NO：9-GGG-NT(6-13))、化合物XI(SEQ ID NO：9-Ahx-NT(6-13))和化合物XII(SEQ ID NO：9-Ahx-NT(8-13))通过固相肽合成(SPPS)方法，在Liberty^TM(CEM)微波合成仪上，使用Fmoc/tBu策略和如上所述手动预先装载的Fmoc-Leu-Wang树脂(100-200目，1％DVB，载量0.09mmol/g)来合成。

Fmoc-Ahx-OH购自Iris Biotech。其他原材料已在上文描述。

肽延长、切割和处理使用与前面实施例中所描述的相同的程序来进行。对于D-Cys、Met和NT-Arg9氨基酸来说，进行双重偶联。使用DCM中的50％丙酸酐将肽的N-端丙酰化。粗品肽SEQ ID NO：9-GGG-NT(6-13)通过制备型RP-HPLC进行纯化，使用30min中15-25％B的梯度。不含间隔物(只有肽键)或包含Ahx间隔物的粗品肽不需进一步纯化直接用于下一个环化步骤中。

二硫桥使用与实施例1中详细描述的相同的方案，通过来自于AG中包含的两个半胱氨酸(1和8位)的分子内环化来获得。纯的药物作为白色粉末获得(最终纯度>95％)。详细的梯度、得率和质量分析在下面给出。

2.SEQ ID NO：9-PEG2-NT(8-13)和SEQ ID NO：9-PEG6-NT(8-13)的合成

化合物XIII(SEQ ID NO：9-PEG2-NT(8-13))和化合物XIV(SEQ ID NO：9-PEG6-NT(8-13))通过固相肽合成(SPPS)方法，在Liberty^TM(CEM)微波合成仪上合成，区别在于人工引入PEG间隔物。使用Fmoc/tBu策略和如上所述手动预先装载的Fmoc-Leu-Wang树脂(100-200目，1％DVB，载量0.09mmol/g)。

Fmoc-12-氨基-4,7,10-三氧杂十二烷酸(Fmoc-PEG2-OH)和Fmoc--21-氨基-4,7,10,13,16,19-六氧杂二十一烷酸(Fmoc-PEG6-OH)购自PoluPeptide Laboratories。其他原材料已在上文描述。

在PEG引入之前及其手动引入之后，如前所述使用微波Liberty^TM合成仪进行肽延长。对于D-Cys、Met和NT-Arg9氨基酸来说，进行双重偶联。对于手动偶联来说，将PEG氨基酸(2eq.)用无水DMF中的COMU(2eq.)和DIEA(4eq.)(相对于PEG来说0.2M)预先活化5min。然后将活化的PEG添加到树脂并允许混合物在RT下机械搅拌过夜。使用DCM中的50％丙酸酐将肽的N-端丙酰化。在照常切割和处理后，将粗品肽不需进一步纯化直接用于下一个环化步骤中。

二硫桥使用与实施例1中所述的相同的方案，通过来自于AG中1和8位中包含的两个半胱氨酸的分子内环化来获得。纯的偶联物作为白色粉末获得(最终纯度>95％)。详细的梯度、得率和质量分析在下面给出。

3.SEQ ID NO：9-[Tle12]NT(8-13)、SEQ ID NO：9-[Lys8,Tle12]NT(8-13)、SEQ ID NO：9-[Lys9,Tle12]NT(8-13)、SEQ ID NO：9-[Trp11,Tle12]NT(8-13)、SEQ ID NO：9- [Lys8,Trp11,Tle12]NT(8-13)和SEQ ID NO：11-[Lys8,Tle12]NT(8-13)的合成

化合物XV(SEQ ID NO：9-[Tle12]NT(8-13))、化合物XVI(SEQ ID NO：9-[Lys8,Tle12]NT(8-13))、化合物XVII(SEQ ID NO：9-[Lys9,Tle12]NT(8-13))、化合物XVIII(SEQID NO：9-[Trp11,Tle12]NT(8-13))、化合物XIX(SEQ ID NO：9-[Lys8,Trp11,Tle12]NT(8-13))和化合物XX(SEQ ID NO：11-[Lys8,Tle12]NT(8-13))如对化合物IX(SEQ ID NO：9-NT(8-13))所述，通过固相肽合成(SPPS)方法，在Liberty^TM(CEM)微波合成仪上，使用Fmoc/tBu策略和如上所述手动预先装载的Fmoc-Leu-Wang树脂(100-200目，1％DVB，载量0.09mmol/g)来合成。

Fmoc-Lys-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Tle-OH购自Iris Biotech。其他原材料已在上文描述。

肽延长、切割和处理使用与前面实施例中所述相同的程序来进行。对于D-Cys、Met和NT-Arg9氨基酸来说，进行双重偶联。使用DCM中的50％丙酸酐将肽的N-端丙酰化。在照常切割和处理后，将粗品肽不需进一步纯化直接用于下一个环化步骤中。

实施例11

串联AG-NT活化药物的低体温响应

为了确定使用串联合成程序获得的活化的NT药物的低体温效果，将每种药物以及化合物II以10mg/kg eq.NT的剂量静脉内注射(团注)到Swiss(CD-1)小鼠中，并在注射后3小时内监测直肠体温。

试验的所有药物在小鼠中诱导强力且相似的低体温响应，具有可比的最大体温降低和动力学，在注射后60min时达到约-6/-7℃(图9)。

在这个剂量水平下，化合物XIV表现出最好的耐受性侧貌，同时表现出强的低体温效果，在注射后60min时达到-6.7℃。化合物XIV的ED₅₀为1.53mg/kg eq.NT，这与为化合物I和化合物II所测量到的相近。当与化合物I相比时，化合物XIV在脑和眼中显示出增加的K_in，分别达到3.65x 10^-4mL/s/g和3.30x 10^-4mL/s/g(图5，黑色条)，以及更高的血液稳定性，估算半衰期为96min(图6)。当以20mg/kg eq.NT在小鼠中注射时，化合物XIV仍然良好地耐受，没有另外的安全性顾虑。在这个剂量水平下没有观察到体温的进一步降低，表明药理学低体温响应在10mg/kg eq.NT下饱和。最高耐受剂量(MTD)为40mg/kg eq.NT，LD₅₀(致死剂量，50％)没有达到(>40mg/kg eq.NT)。考虑到MED约为0.1mg/kg eq.NT，这种药效学/毒性侧貌构成了出色的安全性先决条件，因为i)它防止了由加重的药理学低体温造成的潜在致死的过高剂量，并且ii)使用静脉内(团注)给药模式，被表示成MED与MTD之间的倍率增加的治疗窗约为400，在引发最大低体温响应的剂量水平与诱导轻度/非致死毒性的剂量水平之间具有4倍的安全保证。

实施例12

包含置换的NT的串联活化药物的低体温响应

为了确定使用串联合成程序获得的含有置换版本的NT(8-13)的活化的NT药物的低体温效果，将每种药物以及无置换的化合物IX以5mg/kg eq.NT静脉内注射(团注)到Sprague-Dawley大鼠中，并在注射后3小时内监测直肠体温。

当与无置换的化合物IX相比时，在NT(8-13)序列中包含稳定化置换的所有药物在大鼠中诱导更高的低体温响应(图10)。在5mg/kg eq.NT下的最大体温降低，对于化合物IX来说是注射后30min时-1.2℃，对于化合物XV、XVI、XVII和XX来说是注射后60至90min时-2℃左右，对于化合物XVIII和XIX来说是注射后90min时-2.8℃左右。

实施例13

本发明的活化的NT药物的重复给药

为了确定小鼠在重复给药本发明的活化的NT后的低体温响应性，将Swiss(CD-1)小鼠通过以4mg/kg eq.NT的剂量每天静脉内(团注)给药化合物XIV共四天进行激惹。每天在注射后3小时内监测直肠体温。

在第1天，小鼠通常在注射后45min时显示出-5.5℃的最大体温降低(图11)。尽管第2天低体温响应略微降低，但随后(从第2天到第4天)所述效应保持显著且稳定，在注射后30min时平均体温降低为-3℃。

与在重复给药3天后没有显示出效果的稳定的NT类似物(Boules等，2003,BrainRes.,987(1):39-48)相反，这些结果证实本发明的活化的NT药物表现出独一无二的药效学性质和有限的耐受性，允许以有效且安全的剂量水平重复地或亚慢性给药。

实施例14

本发明的活化的NT药物的退热效果

除了在静脉内注射到首次用于实验的小鼠中时引发强烈的低体温效果之外，我们在具有酵母诱导的过高体温的小鼠中评估了本发明的活化的NT药物的退热效果。简单来说，首先在试验前14小时使用直肠探头测量雄性NMRI小鼠的直肠温度(基线1，间隔至少5min的两次独立测量值)。然后将小鼠皮下注射酵母悬液(512mg/kg)以诱导体温过高响应，或注射0.9％盐水中的羟丙基甲基纤维素(HPMC)。14小时后，再次测量小鼠的直肠温度(基线2，间隔至少5min的两次独立测量值)，以便评估酵母或HPMC注射对基线温度的影响。然后将小鼠随机分组，用活化的神经降压素分子(化合物XIV)或对照(0.9％盐水)i.v.注射，并在15、30、45、60、120和180分钟后再次测量直肠温度。

用酵母悬液注射并接受盐水的对照小鼠显示出典型的0.6-1℃的过高体温。本发明的活化的NT分子的退热效果根据它逆转所述诱导的过高体温的能力进行排序。结果显示，化合物XIV自2mg/kg eq.NT起在小鼠中明显逆转过高体温并且起效快，在注射后15min时与同一动物的基线2相比或与用盐水处理的时间匹配的动物相比最大效果为-2.2℃(图12)。化合物XIV的退热效果显示出剂量响应关系，并且在6mg/kg eq.NT的剂量水平下可能进一步降低体温至4.7℃。这个引人注目的结果显示，由本发明的活化的NT分子诱导的受控的正常体温或甚至适度的治疗性低体温，可以在伴有过高体温的急性病症例如局灶性脑缺血、严重创伤性脑损伤、ICH、病毒、细菌或寄生虫感染和其中局部炎性反应可能诱导过高体温的任何急性病症中用于神经保护。

实施例15

活化的NT药物在癫痫和兴奋性毒性神经元死亡的小鼠模型中的抗惊厥、神经保护和抗神经炎性效果

在本实施例中，我们评估了本发明的活化的NT药物在与惊厥和癫痫发作相关的兴奋性毒性后促进神经保护的潜力。远超过任何其他细胞，神经元对氧和葡萄糖剥夺这种诱导神经元的主要兴奋性神经递质谷氨酸的大量释放的情形特别敏感。由神经元释放的过量谷氨酸进而诱导过度的神经元活性，其引起快速神经元死亡和有害的神经炎症。这个兴奋性毒性过程对于所有形式的脑缺血即心脏骤停后(全脑缺血)、中风后(局灶性缺血)和新生儿缺血来说是常见的。在癫痫发作期间和癫痫中以及脑和脊髓创伤后，也发生兴奋性毒性。在所有情况下，在神经系统的神经元对兴奋性毒性特别敏感的区域例如海马中观察到的快速神经元死亡，引起不可逆的神经元损伤，具有通常严重的障碍或死亡。癫痫发作也可能伴有异常轴突出芽，特别是在癫痫发作后几周内海马的苔藓纤维的异常轴突出芽。

在本发明的情形中，兴奋性毒性由皮下(s.c.)注射卡英酸(KA)引起，这是一种促惊厥剂，已知诱导癫痫持续状态(SE)并伴有可以在KA给药后3至7天观察到的海马中的兴奋性毒性、神经炎症和严重神经元损伤，并伴有可以在KA给药后7-8周时观察到的齿状回苔藓纤维的异常轴突出芽。我们试验了化合物XIV对i)癫痫活性(复发性癫痫发作的持久性)，ii)神经变性、神经炎症和引起的脑组织损伤以及iii)齿状回苔藓纤维的异常轴突出芽的影响。

对FVB/N成年雄性小鼠注射单剂KA(40-45mg/kg s.c.)，以产生具有作为SE的标志的自发性复发性癫痫发作的小鼠。小鼠的阴性对照组被给药0.9％盐水代替KA，并且没有其他处理(“假处理”，n＝5)。SE发作后30分钟，小鼠接受剂量为4mg/kg eq.NT的化合物XIV(治疗组“SE+HT”，n＝5)或0.9％盐水(“SE”组，n＝5)的静脉内(尾静脉)团注或15mg/kg的高剂量的强力抗惊厥和抗癫痫药物安定(DZP)(阳性对照组“SE+DZP”)。在KA注射前及其后6小时内每15min，使用直肠探头监测体温。在此期间，评估小鼠的运动性癫痫发作的出现和严重性。一周后，将动物处死，用于冠状面上神经元细胞死亡的组织学评估，在该兴奋性毒性模型中，所述海马结构是脑中显示出组织损伤的主要结构。另一组进行相同处理的动物在8周后处死，用于齿状回苔藓纤维的异常轴突出芽的组织学评估。

1)活化的NT药物对癫痫持续状态中的体温和发作强度的影响：化合物XIV具有抗惊厥性能

KA(40-45mg/kg；s.c.)的给药引起特征性的顺序性行为变化。紧接注射之后，所述动物不能移动(阶段1)。在KA注射后30分钟内，观察到伴有点头、前肢阵挛和转圈行为的自动症(阶段2-3。然后，大多数动物进展到间歇性(阶段4)然后是连续性(阶段5)起立并伴有前肢阵挛和跌倒行为。一些小鼠表现出严重的全面性强直阵挛性癫痫(阶段6)。只有至少达到Racine 5级癫痫发作的动物被包含在本研究中。在KA注射后2小时左右发生的SE，以5-6级癫痫发作为特征并通常伴有过高体温(图13A)。在SE发作后30min(SE30)给药的化合物XIV总是引起暂时的低体温(图13A)，其持续至少2hrs。与SE动物相比，为SE30+化合物XIV动物分别记录到-2.5℃和-3.6℃的平均体温(BT)降低(F＝52.34；***P<0.001)。这种低体温伴有SE30+化合物XIV组中与SE组相比癫痫发作的明显减少(F＝823.96；***P<0.001；图13B)。在剩余的实验期间，SE30+化合物XIV动物表现出平均2级或更低的癫痫发作。一部分动物被i.p.给药高剂量安定(DZP)。与SE30+化合物XIV动物的情况相同，DZP治疗的动物在剩余的实验期间快速显示出1-2级癫痫发作，并且在这些动物中也观察到低体温(F＝823.96；***P<0.001；图13A、B)。与SE动物相比，当在SE发作后30min给药神经降压素NT(8-13)时，没有观察到BT或癫痫发作强度的显著变化。因此，在SE动物中以4mg/kg eq.NT的剂量给药化合物XIV(SE+HT组)诱导了运动性癫痫发作的明显减少或甚至抑制，证实了所述药物的强力抗惊厥效果。这种效果与～2.5小时期间-3至-6℃的体温降低相关。

2)在癫痫持续状态后活化的NT药物在海马中促进神经保护

使用分别标记神经元特异性核蛋白和神经元死亡的抗NeuN抗体和Fluoro-jadeC，我们观察到与假处理动物(图14A-图A)相比，对照SE动物(图14A-图B)的海马中CA1和CA3锥体细胞以及一些齿状门神经元的广泛损失。当在SE发作后30min给药化合物XIV或DZP时，在SE动物中观察到的神经变性显著降低(图14A、B)，但是当给药NT(8-13)时没有观察到变化。对SE30+化合物XIV动物获得的结果与在SE30+NT(8-13)组中观察到的结果有显著差异，但是与在SE30+DZP小鼠中观察到的结果没有差异。

3)在癫痫持续状态后，NT-活化的药物在海马中减弱神经胶质细胞介导的炎性反应。

SE诱导的神经胶质增生涉及小神经胶质细胞和星形胶质细胞类型。我们使用GFAP和Iba1免疫标记来估算化合物XIV对神经炎症的影响。在假处理动物中，检测HF中GFAP和Iba1的基线标记(图14A，图D)。在SE动物中，在所有海马层中出现神经胶质细胞的非常强的激活(图14，图E、H)。当在SE发作后30min给药化合物XIV或DZP时，这种炎性反应被显著降低(图14，图F、I)，但是当给药NT(8-13)时没有观察到变化。对SE30+化合物XIV动物获得的结果与在SE30+NT(8-13)组中观察到的结果有显著差异，但是与在SE30+DZP小鼠中观察到的结果没有差异。

4)在癫痫持续状态后，NT-活化的药物在海马中减少苔藓纤维出芽

苔藓纤维这种齿状回颗粒细胞的轴突的出芽，在KA处理的小鼠和总的来说癫痫中已被确立。已提出，这种异常出芽在对门细胞损失做出响应时在内分子层(IML)中出现。为了进一步调查化合物XIV的神经保护效果，我们评估了SE后8周时苔藓纤维出芽的程度。苔藓纤维末梢高度富含锌离子，我们使用用于锌囊泡转运体3(ZnT3)的免疫组织化学标记来检测苔藓纤维出芽，如图15中所示。在所有假处理动物中，苔藓纤维末梢存在于CA3区的门和透明层中，并且在DG的IML中没有观察到末梢(图15A-图A、B，图15B)。在SE动物中，不仅与假处理小鼠中相同在门和CA3区中，而且在IML内观察到苔藓纤维末梢(图15A-图C、D，图15B)。与SE动物相比，在SE发作后30min给药化合物XIV(图15A-图E、F，图15B)或DZP的动物中神经支配IML的末梢的数目明显减少，但是当给药NT(8-13)时没有显著变化(图15B)。

所有这些结果清楚地证实，本发明的活化的NT分子不仅代表了防止由兴奋性毒性神经元死亡和神经炎症引起的脑组织损伤的有吸引力的方法，而且具有抑制运动性癫痫发作的潜力，其据推测是通过经低体温来降低神经元活性。

实施例16

串联的活化的NT药物的镇痛效果

为了评估活化的NT药物的镇痛潜力，在小鼠中的实验性疼痛模型中试验了化合物XIV。使用扭体试验作为急性内脏痛的模型来评估化合物XIV在静脉内给药后的效果。考虑到在接受化合物XIV的小鼠中达到最大体温降低的时间在注射后45min左右，我们假设在这种疼痛模型中具有类似的药效学动力学。小鼠首先接受剂量水平逐渐增加的化合物XIV的静脉内注射(团注)，在30min后接着进行0.7％乙酸的腹膜内注射(10mL/kg)。在对照小鼠中，乙酸的腹膜内注射早在注射后2-3分钟产生特征性和可定量的腹部伸展(身体的延长和前肢的伸长)，并在注射后5至15min之间达到峰值。因此将该时间窗用于在给药盐水或0.5、1或5mg/kg eq.NT的化合物XIV的小鼠中评估腹部伸展的次数(在10min观察期内的扭动计数)。

化合物XIV在该模型中产生显著且剂量依赖性的镇痛效果，在0.5mg/kg eq.NT下没有效果，在1和5mg/kg eq.NT下扭动计数分别减少50％和64％(图16)。

Claims

1.一种化合物，其包含共价偶联到激活物基团的神经降压素多肽，所述激活物基团包含氨基酸序列M-aa1-R-L-R，其中aa1是脯氨酸或其类似物。

2.权利要求1的化合物，其中所述神经降压素多肽包含(i)SEQ ID NO：1；或(ii)(i)的天然变体；或(iii)(i)或(ii)的片段；或(iv)(i)至(iii)的任何序列的类似物，所述多肽具有神经降压素的生物活性。

3.权利要求2的化合物，其中所述神经降压素多肽包含SEQ ID NO：2或其类似物并具有神经降压素的生物活性。

4.权利要求1至3任一项的化合物，其中所述神经降压素多肽选自NT、NT(2-13)、NT(6-13)和NT(8-13)。

5.权利要求1至4任一项的化合物，其中所述神经降压素多肽包含1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基、甚至更优选地1、2、3或4个氨基酸残基的置换或修饰。

6.权利要求1至5任一项的化合物，其中所述神经降压素多肽选自[Lys8]NT(8-13)、[Lys9]NT(8-13)、[(D)-Lys8]NT(8-13)、[(D)-Orn9]NT(8-13)、[Lys8-Lys9]NT(8-13)、[(D)-Lys8-Lys9]NT(8-13)、[Trp11]NT(8-13)、[neoTrp11]NT(8-13)、[Tle12]NT(8-13)、[Trp11,Tle12]NT(8-13)、[neoTrp11,Tle12]NT(8-13)、[Lys8,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,Trp11]NT(8-13)、[(D)-Lys8,neoTrp11]NT(8-13)、[Lys8,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,neoTrp11,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,Lys9,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Lys8,Lys9,neoTrp11,Tle12]NT(8-13)、[Lys9,Tle12]NT(8-13)、[Lys9,Trp11]NT(8-13)、[Lys9,neoTrp11]NT(8-13)、[Lys9,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[Lys9,neoTrp11,Tle12]NT(8-13)、[HLys8,Tle12]NT(8-13)、[HLys8,Trp11]NT(8-13)、[HLys8,neoTrp11]NT(8-13)、[HLys8,Trp11,Tle12]NT(8-13)、[HLys8,neoTrp11,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Orn9,Tle12]NT(8-13)、[(D)-Orn9,Trp11]NT(8-13)、[(D)-Orn9,neoTrp11]NT(8-13)、[(D)-Orn9,Trp11,Tle12]NT(8-13)或[(D)-Orn9,neoTrp11,Tle12]NT(8-13)。

7.前述权利要求任一项的化合物，其中所述激活物基团包含SEQ ID NO：5-11中的任一者，优选为SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11。

8.前述权利要求任一项的化合物，其中所述激活物基团和神经降压素多肽通过连接物基团偶联。

9.权利要求6的化合物，其中所述连接物基团包含聚乙二醇、聚甘氨酸、Ahx间隔物基团或肽键。

10.前述权利要求任一项的化合物，其包含任选地通过连接物基团与包含SEQ ID NO：5-11任一者的激活物基团偶联的包含SEQ ID NO：2或其类似物的神经降压素多肽。

11.权利要求1至10任一项的化合物，其包含利用肽键与包含SEQ ID NO：5-11任一者的激活物基团偶联的包含SEQ ID NO：2或其类似物的神经降压素多肽。

12.一种化合物，其选自表A中列出的化合物I至XX。

13.一种药物组合物，其包含前述权利要求任一项中所定义的化合物和可药用载体或赋形剂。

14.一种制造权利要求1至12任一项中所定义的化合物的方法，所述方法包括将神经降压素多肽共价偶联到权利要求1至9任一项中所定义的激活物基团。

15.权利要求1至13任一项中所定义的化合物或组合物，其用于在哺乳动物对象中降低体温。

16.权利要求1至13任一项中所定义的化合物或组合物，其用于在心脏骤停后或具有中风、新生儿缺血、心脏手术、创伤性头部或脊髓损伤、癫痫发作、疼痛或过高体温的哺乳动物对象中诱导低体温。

17.权利要求1至13任一项中所定义的化合物或组合物，其用于在哺乳动物对象中保护、防止或减轻脑损伤。

18.权利要求1至13任一项中所定义的化合物或组合物，其用于在哺乳动物对象中减轻惊厥。

19.权利要求1至13任一项中所定义的化合物或组合物，其用于在哺乳动物对象中减轻疼痛。