CN109136357B - 一种有效诱导血管退化的方法和用途 - Google Patents

一种有效诱导血管退化的方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种有效诱导血管退化的方法和用途，具体地，本发明的(a)cds2抑制剂、(b)VEGF或其促进剂的联用可以有效地(i)促进血管退化；(ii)促进细胞凋亡和/或迁移；和/或(iii)治疗血管过度生长相关疾病。

Description

一种有效诱导血管退化的方法和用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一种有效诱导血管退化的方法和用途。
背景技术
中国肿瘤发病率在过去10年里一直处于高速递增状态，对人民生活和国民经济发展产生相当大的负面影响，更为有效地遏制和治愈肿瘤的临床应用呼之欲出。
眼部的许多疾病在其进程中会出现血管异常生长，包括年龄相关性黄斑变性(AgeRelated Macular Degeneration，AMD)、糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopaphy,DR)、脉络膜新生血管(Choroidal Noevascularigation,CNV)等。其中，AMD可分为干性和湿性两类，各占AMD病人的80％-85％和15％-20％。AMD血管异常生长疾病始于湿性AMD，多表现为视网膜色素上层硫黄色颗粒形成及视网膜萎缩，视力严重受影响。湿性AMD则以CNV为特征，引起黄斑水肿、渗出、纤维化，导致视力丧失。
目前较为成熟的阻断血管生长使得血管发生退化的方法一般是通过靶向VEGF或者VEGF受体实现的，其目的是造成VEGF信号通路无法正常工作从而诱导血管退化。这类药物主要分三类，包括VEGFa特异单克隆抗体和VEGF-Trap、VEGFR抗体以及VEGFR酪氨酸激酶抑制剂，这些药物包括贝伐单抗(Bevacizumab,也称为Avastin)、IMC-1121B(Ramucirumab)、索拉非尼(Sorafenib)和舒尼替尼(sunitinib)等。尽管目前这些VEGFa的靶向药物在临床治疗中应用广泛，但是部分疾病在VEGFa靶向药物治疗过程中会表现出耐药性。
因此，本领域迫切需要开发一种更为有效的阻断血管生长诱导血管退化的方法和药物，以便有助于实现对这些疾病的治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种更为有效的阻断血管生长诱导血管退化的方法和药物，以便有助于实现对这些疾病的治疗。
本发明的第一方面提供了一种组合(或物质组合)的用途，所述组合包括(a)cds2抑制剂、和(b)VEGF或其促进剂，所述组合用于制备一组合物或制剂，所述组合物或制剂用于(i)促进细胞或组织的血管退化；(ii)促进细胞凋亡和/或迁移；和/或(iii)治疗血管过度生长相关疾病。
在另一优选例中，所述cds2抑制剂包括抑制cds2表达或活性的物质。
在另一优选例中，所述cds2抑制剂包括cds2蛋白抑制剂和/或cds2基因抑制剂。
在另一优选例中，所述cds2抑制剂选自下组：小分子化合物、siRNA、反义核酸、crispr试剂、或其组合。
在另一优选例中，所述抑制cds2表达或活性指将cds2基因或蛋白的表达或活性降低≥20％，较佳地，40-100％，更佳地，80-100％。
在另一优选例中，所述VEGF选自下组：VEGFa、VEGFb、VEGFc、VEGFd、PLGF、或其组合。
在另一优选例中，所述各VEGF包括野生型、突变型(或亚型)。
在另一优选例中，所述VEGFa选自下组：VEGFa206、VEGFa189、VEGFa165、VEGFa145、VEGFa121、或其组合。
在另一优选例中，所述cds2蛋白选自下组：
(A)氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示的多肽；
(B)将SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列经过一个或几个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的cds2蛋白衍生物，或其活性片段；
(C)序列与SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列相比，同源性≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％，最佳地≥99％的cds2蛋白衍生物，或其活性片段。
在另一优选例中，所述的cds2基因编码cds2蛋白。
在另一优选例中，所述的cds2基因选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:1所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.:2所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:2所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，且编码SEQ ID NO.:1所示多肽的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述VEGF促进剂为促进VEGF表达的物质。
在另一优选例中，所述VEGF促进剂选自下组：小分子化合物，如DMOG(二甲基草酰甘氨酸)和/或ZK164015。
在另一优选例中，所述cds2蛋白来源于人、非人哺乳动物或非哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。
在另一优选例中，所述非哺乳动物选自下组：斑马鱼、果蝇、爪蟾、或其组合。
在另一优选例中，所述血管过度生长相关疾病选自下组：湿性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、脉络膜新生血管、高度依赖血管生长的肿瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述高度依赖血管生长的肿瘤选自下组：结肠直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、淋巴癌、上皮细胞卵巢癌、前列腺癌、或其组合。
在另一优选例中，所述细胞包括血管内皮细胞。
在另一优选例中，所述组织选自下组：视网膜、肿瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物。
在另一优选例中，所述的药物组合物含有药学上可接受的载体以及(a)cds2抑制剂；(b)VEGF或其促进剂。
在另一优选例中，所述药物组合物为液态、固体、或半固体。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、或注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述组分(a)占所述药物组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。
在另一优选例中，所述组分(b)占所述药物组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。
在另一优选例中，所述组分(a)与组分(b)的重量比为100:1-0.01:1，较佳地，10:1-0.1:1，更佳地，2:1-0.5:1。
在另一优选例中，所述产品组合中，所述组分(a)和组分(b)占所述产品组合总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。
在另一优选例中，所述的组合物还包括额外的抑制血管形成或促进血管退化的组分。
在另一优选例中，所述药物组合物还包括额外的组分，所述额外的组分选自下组：(i)促进血管退化的组分；(ii)促进细胞凋亡和/或迁移的组分；和/或(iii)治疗血管过度生长相关疾病的组分。
在另一优选例中，所述的组合物还包括选自下组的额外的组分：Ki8751、Apatinib、ZM323881、SU5416、Avastin、Ramucirumab、VEGF-Trap、Sorafenib、Sunitinib、或其组合。
在另一优选例中，所述组合物或制剂在(i)促进血管退化；(ii)促进细胞凋亡和/或迁移；和/或(iii)治疗血管过度生长相关疾病的应用中，可单独使用，或联合使用。
在另一优选例中，所述的联合使用包括：与其它(i)促进血管退化；(ii)促进细胞凋亡和/或迁移；和/或(iii)治疗血管过度生长相关疾病的药物联合使用。
在另一优选例中，所述其它(i)促进血管退化；(ii)促进细胞凋亡和/或迁移；和/或(iii)治疗血管过度生长相关疾病的药物选自下组：Ki8751、Apatinib、ZM323881、SU5416、Avastin、Ramucirumab、VEGF-Trap、Sorafenib、Sunitinib、或其组合。
本发明第二方面提供了一种药物组合物，包括：
(i)第一药物组合物，所述第一药物组合物含有(a)第一活性成分，所述第一活性成分为cds2抑制剂，以及药学上可接受的载体；
(ii)第二药物组合物，所述第二药物组合物含有(b)第二活性成分，所述第二活性成分为VEGF或其促进剂，以及药学上可接受的载体；
其中，所述的第一药物组合物和第二药物组合物为不同的药物组合物，或同一药物组合物。
在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述组分(a)占所述药物组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。
在另一优选例中，所述组分(b)占所述药物组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。
在另一优选例中，所述组分(a)与组分(b)的重量比为100:1-0.01:1，较佳地，10:1-0.1:1，更佳地，2:1-0.5:1。
在另一优选例中，所述产品组合中，所述组分(a)和组分(b)占所述产品组合总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。
在另一优选例中，所述药物组合物还包括额外的组分，所述额外的组分选自下组：(i)促进血管退化的组分；(ii)促进细胞凋亡和/或迁移的组分；和/或(iii)治疗血管过度生长相关疾病的组分。
在另一优选例中，所述额外的组分选自下组：Ki8751、Apatinib、ZM323881、SU5416、Avastin、Ramucirumab、VEGF-Trap、Sorafenib、Sunitinib、或其组合。
本发明第三方面提供了一种药盒，包括：
(i)第一容器，以及装于该第一容器中的活性成分(a)cds2抑制剂，或含有活性成分(a)的药物；
(ii)第二容器，以及装于该第二容器中的活性成分(b)VEGF或其促进剂，或含有活性成分(b)的药物；和
(iii)说明书，所述说明书中记载了联合给予活性成分(a)和活性成分(b)从而(i)促进血管退化；(ii)促进细胞凋亡和/或迁移；和/或(iii)治疗血管过度生长相关疾病的说明。
在另一优选例中，所述第一容器与第二容器可以为同一(相同)或不同的容器。
本发明第四方面提供了一种促进血管退化的方法，包括：
在(a)cds2抑制剂、(b)VEGF或其促进剂存在的条件下，培养细胞或组织，从而促进血管退化。
在另一优选例中，所述细胞选自下组：肿瘤细胞、血管内皮细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞选自下组：黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、非小细胞肺癌细胞、肾癌细胞、肝癌细胞、淋巴瘤细胞、上皮细胞卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述方法为非诊断性和非治疗性的。
在另一优选例中，所述方法为治疗性的。
在另一优选例中，所述cds2抑制剂的作用浓度为1％-99％，较佳地，10％-90％，更佳地，30％-70％。
在另一优选例中，所述VEGF或其促进剂的作用浓度为1％-99％，较佳地，10％-90％，更佳地，30％-70％。
在另一优选例中，与对照的细胞或组织相比，加入(a)cds2抑制剂、(b)VEGF或其促进剂的细胞或组织，血管退化的增加幅度≥20％，较佳地，24％-98％，更佳地，48％-85％。
本发明第五方面提供了一种体外促进细胞的凋亡和/或迁移的方法，包括：
在体外适合的培养条件下，将(a)cds2抑制剂、(b)VEGF或其促进剂与细胞接触，从而促进所述细胞的凋亡和/或迁移。
在另一优选例中，所述细胞选自下组：血管内皮细胞、肿瘤细胞。
在另一优选例中，与对照的细胞相比，加入(a)cds2抑制剂、(b)VEGF或其促进剂的细胞，细胞凋亡的增加幅度≥30％，较佳地，40-70％。
在另一优选例中，与对照的细胞相比，加入(a)cds2抑制剂、(b)VEGF或其促进剂的细胞，细胞迁移的增加幅度≥25％，较佳地，30-60％。
在另一优选例中，与对照的细胞相比，加入(a)cds2抑制剂、(b)VEGF或其促进剂的细胞，细胞迁移伴随凋亡的增加幅度≥8％，较佳地，10-30％。
在另一优选例中，所述方法为非诊断性和非治疗性的。
本发明第六方面提供了一种筛选血管过度生长相关疾病的潜在治疗剂的方法，包括：
(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养表达cds2基因的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的cds2基因的表达量E1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中cds2基因的表达量E2；和
(b)对E1和E2进行比较，如果E1显著低于E2，则表示所述测试化合物是血管过度生长相关疾病的潜在治疗剂。
在另一优选例中，在测试组和在对照组中，存在VEGF或其促进剂，并且VEGF或其促进剂的条件是相当的或相同的。
在另一优选例中，所述的VEGF是外源添加的。
在另一优选例中，所述的细胞是表达VEGF的细胞。
在另一优选例中，所述“显著低于”指E1/E2≤1/2，较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。
在另一优选例中，所述细胞选自下组：血管内皮细胞、肿瘤细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤(c)：将步骤(a)中所确定的潜在治疗剂施用于哺乳动物，从而测定其对哺乳动物的血管过度生长相关疾病的影响。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤(d)：将步骤(a)中所确定的潜在治疗剂和VEGF、或其促进剂联用，施用于哺乳动物，从而测定其对哺乳动物的血管过度生长相关疾病的影响。
在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物、灵长目动物，较佳地，包括小鼠、大鼠、兔、猴。
本发明第七方面提供了一种治疗血管过度生长相关疾病的方法，包括步骤：
给需要的对象，施用(a)cds2抑制剂、(b)VEGF或其促进剂，从而促治疗血管过度生长相关疾病。
在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物和灵长目动物，优选小鼠、大鼠、兔、猴。
在另一优选例中，所述cds2抑制剂的施用剂量为0.1-100mg/kg体重，较佳地为1-50mg/kg体重，最佳地为5-20mg/kg体重。
在另一优选例中，所述VEGF或其促进剂的施用剂量为0.1-100mg/kg体重，较佳地为1-50mg/kg体重，最佳地为5-20mg/kg体重。
在另一优选例中，所述cds2抑制剂的施用频率为1-5次/天，较佳地为1天/次。
在另一优选例中，所述VEGF或其促进剂的施用频率为1-5次/天，较佳地为1天/次。
在另一优选例中，所述cds2抑制剂的施用时间为5-100天，较佳地为10-50天，最佳地为14-21天。
在另一优选例中，所述VEGF或其促进剂的施用时间为5-100天，较佳地为10-50天，最佳地为14-21天。
在另一优选例中，所述(a)cds2抑制剂、(b)VEGF或其促进剂同时或先后施用。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了抑制斑马鱼cds2同时受组织VEGFa刺激诱导了血管退化，退化方式为细胞凋亡和/或迁移，随着VEGFa水平升高，现象越显著。其中，1.1-1.5为抑制cds2同时受VEGFa刺激诱导的血管退化结果，1.6-1.8为细胞凋亡和/或迁移现象，1.9和1.10为血管退化现象依赖于VEGFa浓度。其中，
图1.1为实施例1Tg(hsp70l:vegfa-2a-mcherry；fli1a:egfp)胚胎中敲除cds2同时受组织大量VEGFa刺激诱导的血管退化现象；
图1.2为图1.1的统计分析结果；
图1.3为实施例1Tg(hsp70l:vegfa-2a-mcherry；fli1a:egfp)胚胎中敲减cds2同时受组织大量VEGFa刺激诱导的血管退化现象；
图1.4为图1.3的统计分析结果；
图1.5为实施例1Tg(fli1a:egfp)胚胎中敲除cds2同时向循环系统注射人源VEGFa诱导的血管退化现象；
图1.6为实施例1Tg(hsp70l:vegfa-2a-mcherry；fli1a:egfp)背景敲除cds2的胚胎在发生血管退化过程中伴随的细胞凋亡和迁移现象；
图1.7为实施例1血管退化过程中细胞凋亡的TUENL验证结果；
图1.8为实施例1Tg(hsp70l:vegfa-2a-mcherry；fli1a:negfp)背景敲减cds2的胚胎在发生血管退化过程中伴随的细胞凋亡和迁移现象；
图1.9为实施例1随着VEGFa水平的升高，敲除cds2诱导的血管退化现象越显著的结果；
图1.10为实施例1在不同水平VEGFa刺激下发生的血管退化均需要一个响应VEGFa的24小时耐受期，不同于VEGFa的体外相关研究。
图2显示了敲除小鼠血管内皮细胞Cds2在视网膜中VEGFa水平较高的局部组织诱导了血管退化，其中2.1为敲除小鼠模型和敲除效率验证，2.2为视网膜血管退化现象的评价结果。其中，
图2.1为实施例2血管内皮细胞Cds2诱导敲除小鼠(Cdh5-CreERT2 Cds2fl/fl,Cds2ΔEC)的构建模型、基因型鉴定和敲除效率验证；
图2.2为实施例2Cds2ΔEC小鼠视网膜中VEGFa水平较高的血管新生尖端存在较高水平的血管退化现象。
图3显示了敲除小鼠血管内皮细胞Cds2抑制了肿瘤血管生长并且诱导了血管退化，从而显著抑制了肿瘤生长。其中3.1为肿瘤血管及其生长受抑制结果，3.2-3.4为肿瘤组织发生血管退化及肿瘤生长受抑制的结果，3.5为敲除Cds2引起更多VEGFa表达。其中，
图3.1为Cds2ΔEC小鼠诱导敲除血管内皮细胞Cds2后接种TC-1肿瘤细胞，对TC-1肿瘤血管密度评价、肿瘤大小和重量测定及生长曲线统计的结果；
图3.2为实施例3Cds2ΔEC小鼠接种TC-1肿瘤细胞后的肿瘤长时程超声结果，超声造影显示Cds2ΔEC小鼠TC-1肿瘤发生了血管退化现象；
图3.3为实施例3Cds2ΔEC小鼠B16-F0肿瘤的Collagen4/CD31冰冻切片染色，结果显示Cds2ΔEC小鼠B16-F0肿瘤发生了血管退化现象；
图3.4为实施例3Cds2ΔEC小鼠在接种TC-1或B16-F0肿瘤细胞后肿瘤生长受到显著抑制的结果；
图3.5为实施例3Cds2ΔEC小鼠中TC-1或B16-F0肿瘤表达高水平VEGFa。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，(a)cds2抑制剂、(b)VEGF或其促进剂的联用可以有效地(i)促进血管退化；(ii)促进细胞凋亡和/或迁移；和/或(iii)治疗血管过度生长相关疾病。在此基础上，本发明人完成了本发明。
cds2蛋白及其编码核酸
如本文所用，术语“cds2蛋白”、“本发明的cds2蛋白”、“本发明的蛋白”可互换使用，均指二酰基甘油合成酶2。
本发明涉及一种cds2蛋白及其变体，在本发明的一个优选例中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。抑制本发明的蛋白可有效(i)促进血管退化；(ii)促进细胞凋亡和/或迁移；和/或(iii)治疗血管过度生长相关疾病。
本发明还包括与本发明的SEQ ID NO.:1所示序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。
所述“相同或相似功能”主要是指：“(i)促进血管退化；(ii)促进细胞凋亡和/或迁移；和/或(iii)治疗血管过度生长相关疾病”。
本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括具有cds2蛋白活性的cds2蛋白片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然cds2蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。
本发明的突变蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的突变蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的突变蛋白，或(iii)成熟突变蛋白与另一个化合物(比如延长突变蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的突变蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此突变蛋白序列而形成的突变蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此突变蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明中，保守性替换的氨基酸最好根据表I进行氨基酸替换而产生。
表I
Figure BDA0001332720070000101
Figure BDA0001332720070000111
本发明还包括与本发明的天然cds2蛋白具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。在蛋白质变体可以经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明包括天然cds2蛋白类似物与天然cds2蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。
本发明还提供了编码cds2蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
在本发明优选例中，编码人cds2蛋白的DNA序列编码SEQ ID NO.:1所示的cds2蛋白，编码cds2蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
根据本文所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
本发明的蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
cds2抑制剂
如本文所用，术语“cds2蛋白的抑制剂”是指抑制cds2蛋白的表达或活性的物质。
在本发明中，所述cds2抑制剂没有特别限制，只要能够抑制cds2蛋白和/或cds2基因表达或活性的物质均在本发明的保护范围内。
在一优选实施方式中，本发明的cds2抑制剂选自下组：小分子化合物、siRNA、反义核酸、crispr试剂、或其组合。
在一优选实施方式中，通过基因敲除或敲减方法使得机体或部分组织CDS2表达降低或通过其他方法使CDS2蛋白活性降低。
VEGF或其促进剂
如本文所用，术语“VEGF”是指VEGF蛋白或含有VEGF蛋白的物质。
在本发明中，VEGF选自下组：VEGFa、VEGFb、VEGFc、VEGFd、PLGF、或其组合。并且在本发明中，VEGFa选自下组的一种或多种亚型：VEGFa206、VEGFa189、VEGFa165、VEGFa145、VEGFa121。
并且在本发明中，所述各VEGF包括野生型、突变型(或亚型)。VEGF来源于人或非人哺乳动物，只要具有VEGF功能的VEGF类型都在本发明的保护范围内。
其中，可通过下述方法增加组织微环境分泌大量血管内皮生长因子a(vascularendothelial growth factor a,VEGFa)的表达量：组织自身分泌大量VEGFa蛋白或人工过表达VEGFa蛋白、或者人工输送VEGFa蛋白或者VEGFa促进剂。
在本发明中，所述VEGF促进剂(尤其是VEGFa)没有特别限制，只要能够促进VEGF(尤其是VEGFa)的表达或者增强VEGF蛋白活性都在本发明的保护范围内。
在一优选实施方式中，可通过热激方法提高VEGF(尤其是VEGFa)的表达。
在一优选实施方式中，所述VEGF促进剂(尤其是VEGFa促进剂)选自下组：小分子化合物，如DMOG(二甲基草酰甘氨酸)和/或ZK164015。
ZK164015的化学名称为
2-(4-Hydroxyphenyl)-3-methyl-1-[10-(pentylsulfonyl)decyl]-1H-indol-5-ol。
复方药物组合物和药盒
本发明提供了含有活性成分(a)cds2蛋白的抑制剂；(b)VEGF或其促进剂；以及(c)药学上可接受的载体的复方药物组合物。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。本发明的药物组合物优选为注射制剂。此外，本发明药物组合物还可与其他治疗剂一起使用。并且，本发明的药物组合物还可以包括额外的组分，所述额外的组分选自下组：(i)促进血管退化的组分；(ii)促进细胞凋亡和/或迁移的组分；和/或(iii)治疗血管过度生长相关疾病的组分。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明还提供了一种可用于(i)促进血管退化；(ii)促进细胞凋亡和/或迁移；和/或(iii)治疗血管过度生长相关疾病的药盒，该药盒含有：
(i)第一容器，以及装于该第一容器中的活性成分(a)cds2抑制剂，或含有活性成分(a)的药物；
(ii)第二容器，以及装于该第二容器中的活性成分(b)VEGFa或其促进剂，或含有活性成分(b)的药物；和
(iii)说明书，所述说明书中记载了联合给予活性成分(a)和活性成分(b)从而(i)促进血管退化；(ii)促进细胞凋亡和/或迁移；和/或(iii)治疗血管过度生长相关疾病的说明。
在另一优选例中，所述第一容器与第二容器为统一(相同)或不同的容器。
本发明的药物组合物和药盒适用于(i)促进血管退化；(ii)促进细胞凋亡和/或迁移；和/或(iii)治疗血管过度生长相关疾病。
本发明制剂可以每一天服用三次到每十天服用一次，或者以缓释方式每十天服用一次。优选的方式是每天服用一次，因为这样便于病人坚持，从而显著提高病人服药的顺应性。
服用时，极大多数病例一般每天应用的总剂量应低于(或少数病例等于或略大于)各个单药的每天常用剂量，当然，所用的活性成分的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而有所变化。
治疗方法
本发明还提供了用本发明的两种活性成分或相应的药物来(i)促进血管退化；(ii)促进细胞凋亡和/或迁移；和/或(iii)治疗血管过度生长相关疾病的方法，它包括给哺乳动物施用有效量的活性成分(a)cds2蛋白的抑制剂；(b)VEGF或其促进剂，或者施用含有所述活性成分(a)和活性成分(b)的药物组合物。
当本发明两种活性成分被用于上述用途时，可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给药：片剂、丸剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5％悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约0.01-99％，更佳地约为0.1％-90％(重量)的活性成分。
本发明的两种活性成分或药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服、瘤内或局部给药。优选的给药途径包括口服给药、肌内给药或静脉内给药。
从易于给药的立场看，优选的药物组合物是液态组合物，尤其是注射剂。
此外，本发明的两种活性成分或药物还可与其他(i)促进血管退化；(ii)促进细胞凋亡和/或迁移；和/或(iii)治疗血管过度生长相关疾病的组分或药物(如Ki8751、Apatinib、ZM323881、SU5416、Avastin、Ramucirumab、VEGF-Trap、Sorafenib、Sunitinib等)联合使用。
Ki8751，小分子化合物，化学名称为：
1-(2,4-difluorophenyl)-3-[4-(6,7-dimethoxyquinolin-4-yl)oxy-2-fluorophenyl]urea。
Apatinib，小分子化合物，化学名称为：
N-[4-(1-cyanocyclopentyl)phenyl]-2-(pyridin-4-ylmethylamino)pyridine-3-car boxamide。
ZM323881，小分子化合物，化学名称为：
4-fluoro-2-methyl-5-[(7-phenylmethoxyquinazolin-4-yl)amino]phenol。
SU5416，小分子化合物，化学名称为：
(3E)-3-[(3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-yl)methylidene]-1H-indol-2-one。
Avastin，阿瓦斯汀(Bevacizumab)，是重组的人源化单克隆抗体。
Ramucirumab，雷莫芦单抗。
VEGF-Trap，阿柏西普(aflibercept,Zaltrap,Eylea)，一种重组融合蛋白。
Sorafenib，小分子化合物，化学名称为：
4-(4-(3-(4-Chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)ureido)phenoxy)-N-methylpicolin amide。
Sunitinib，小分子化合物，化学名称为：
N-[2-(diethylamino)ethyl]-5-[(Z)-(5-fluoro-2-oxo-1H-indol-3-ylidene)methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide。
促进血管退化的方法
在本发明中，还提供了一种促进血管退化的方法，包括步骤：
在(a)cds2抑制剂、(b)VEGF或其促进剂存在的条件下，培养细胞或组织，从而促进血管退化。
促进细胞的凋亡和/或迁移的方法
在本发明中，还提供了一种促进细胞的凋亡和/或迁移的方法，包括步骤：
在体内或体外适合的条件下，将(a)cds2抑制剂、(b)VEGF或其促进剂与细胞或组织接触，从而促进所述细胞或组织的凋亡和/或迁移。
筛选血管过度生长相关疾病的潜在治疗剂的方法
在本发明中，还提供了一种筛选血管过度生长相关疾病的潜在治疗剂的方法，包括步骤：
(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养表达cds2基因的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的cds2基因的表达量E1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中cds2基因的表达量E2；和
(b)对E1和E2进行比较，如果E1显著低于E2，则表示所述测试化合物是血管过度生长相关疾病的潜在治疗剂。
在另一优选例中，在测试组和在对照组中，存在VEGF或其促进剂，并且VEGF或其促进剂的条件是相当的或相同的。
在另一优选例中，所述的VEGF是外源添加的。
在另一优选例中，所述的细胞是表达VEGF的细胞。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现，(a)cds2抑制剂和(b)VEGF、或其促进剂联用，可显著促进组织或细胞(如视网膜或肿瘤细胞)中的血管退化。
(2)本发明首次发现，(a)cds2抑制剂和(b)VEGF、或其促进剂联用，可显著促进细胞的凋亡和/或迁移。
(3)本发明首次发现，(a)cds2抑制剂和(b)VEGF、或其促进剂联用，可显著治疗血管过度生长相关疾病(如湿性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、脉络膜新生血管、高度依赖血管生长的肿瘤)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例中用到的材料和试剂如无特殊说明，均为市售产品。
实施例1
斑马鱼中敲除或敲减cds2同时受组织大量VEGFa刺激诱导血管退化
(1)敲除或敲减cds2
采用cds2突变杂合子(cds2cas8)鱼系(获自中国科学院上海生命科学研究院)，将cds2cas8配种到热驱动过表达VEGFa和绿色荧光蛋白标记血管的双转基因鱼系Tg(hsp70l:vegfa-2a-mcherry；fli1a:egfp)(Tg(hsp70l:vegfa-2a-mcherry)系获自复旦大学，Tg(fli1a:egfp)获自中国科学院上海生命科学研究院)中，通过测序筛选获得具有Tg(hsp70l:vegfa-2a-mcherry；fli1a:egfp)背景的cds2突变杂合子，该杂合子与cds2cas8配种其子代有1/4为cds2敲除的胚胎(图1，1.1，E和F)。
在Tg(hsp70l:vegfa-2a-mcherry；fli1a:egfp)斑马鱼胚胎发育至1-2细胞期时向卵黄囊注射1纳克(ng)cds2MO即可敲减cds2(图1，1.3，E和F)。
(2)VEGFa刺激
当cds2突变体或注射cds2MO的胚胎发育至28小时(28hpf)，于37℃热激1小时(h)，诱导VEGFa表达，然后在36hpf通过观察标识VEGFa的红色荧光确定VEGFa是否表达(图1，1.1，C,D,G,H和图1，1.3，C,D,G,H)。
当cds2突变体发育至28hpf时，向突变体胚胎的循环系统注射人源VEGFa蛋白(hVEGFa)(购自Sino Biological公司)实现大量VEGFa刺激(图1，1.5)。
(3)敲除或敲减cds2的血管内皮细胞受VEGFa刺激发生退化现象
在斑马鱼胚胎中敲除或敲减cds2，当胚胎发育至28hpf时，于37℃热激1h诱导组织表达VEGFa，然后分别在36hpf和84dpf利用共聚焦显微镜对胚胎躯干处血管进行成像。发现在36hpf，对照组中过表达VEGFa对斑马鱼躯干处节间血管生长(ISV)无显著影响(图1，1.1，A,C和图1，1.3，A,C)，同样，在敲除或敲低cds2组中过表达VEGFa对ISV亦无明显影响(图1，1.1，E,G和图1，1.3，E,G)。在84hpf时，发现在对照组中过表达VEGFa会诱导过多的血管生长，形成一个复杂的血管网络结构(图1，1.1，B,D和图1，1.3，B,D)，在敲除或敲减cds2的胚胎中过表达VEGFa使之前观察到的ISV发生了退化(图1，1.1，F,H；图1，1.3，F,H；图1，1.2和图1，1.4)。
另外，当cds2敲除的斑马鱼胚胎发育至32hpf时，直接向胚胎主静脉注射5纳升(nl)100μg/ml hVEGFa，然后分别在36hpf和84hpf利用共聚焦显微镜对胚胎躯干处血管进行成像，发现hVEGFa刺激可以诱导一个更为复杂的血管网络(图1，1.5，A和B)，然而，在敲除cds2的斑马鱼胚胎中hVEGFa刺激使之前产生的血管发生了退化(图1，1.5，C,D,E和F)。hVEGFa刺激诱导cds2敲除的斑马鱼发生血管退化表明这一诱导血管退化的方法在哺乳动物中是保守的。
(4)血管退化通过细胞凋亡和细胞迁移方式完成
当胚胎发育至52hpf时，在荧光显微镜下观察挑选出cds2敲除并有大量VEGFa刺激的胚胎即cds2mutant+VEGF，然后利用Zeiss LSM 880共聚焦显微镜在52-84hpf对cds2mutant+VEGF胚胎进行长时程成像。通过分析发现部分血管内皮细胞处于不稳定状态然后突然破碎(图1，1.6A)，这指示血管内皮细胞发生了凋亡，还有部分细胞从肌节处迁移至轴血管(图1，1.6B)。此外，在60hpf挑出cds2mutant+VEGF胚胎用4％甲醛溶液4℃过夜固定，然后根据文献已有的方法进行甲醇梯度脱水、复水、封闭、凋亡指示剂TUNEL染色，通过对染色结果成像分析发现破碎的血管内皮细胞带有TUNEL信号，这一结果证实了细胞凋亡的发生(图1，1.7)。
为了进一步证实细胞凋亡和细胞迁移是血管退化的两种方式，将标记血管内皮细胞核的转基因系Tg(fli1a:ngfp)(获自中国科学院上海生命科学研究院)配种到热驱动过表达VEGFa的转基因中获得Tg(hsp70l:vegfa-2a-mcherry；fli1a:ngfp)双转基因系，然后在1-2细胞期向双转基因系胚胎的卵黄囊注射1ng cds2MO敲减cds2，当胚胎发育至28hpf时，于37℃热激1h诱导组织表达VEGFa。然后，在52hpf时通过荧光显微镜观察挑选出cds2敲减并有大量VEGFa刺激的胚胎即cds2MO+VEGF，然后利用Zeiss LSM 880共聚焦显微镜在52-84hpf对cds2MO+VEGF胚胎进行长时程成像。通过分析发现约53％血管内皮细胞发生了细胞凋亡(图1，1.8A)，约35％发生了细胞迁移(图1，1.8B)，12％在细胞迁移过程中伴随有细胞凋亡过程。
(5)随着VEGFa水平升高，血管退化现象越显著
通过控制热激时间(0,5,10,15,20,40,60,80min)逐渐提高VEGFa刺激水平，然后对血管退化现象进行统计，发现随着VEGFa水平的升高，发生血管退化胚胎的比例也逐渐提高(图1，1.9)。另外，在28-84hpf每隔4小时对血管退化现象进行统计，发现不同热激时间引发的血管退化现象均集中在56-76hpf，在28-52hpf存在一个24小时的VEGFa响应时期(图1，1.10)，这一现象不同于以往的体外研究，体外研究中VEGFa的刺激和响应时间非常短，一般在5min-2h，这体现了本发明方法的特异性。
实施例2
在血管内皮细胞Cds2敲除的小鼠视网膜中，VEGFa水平较高的局部组织存在较高水平的血管退化现象
(1)血管内皮细胞Cds2诱导敲除小鼠模型的构建
将Cds2fl/fl小鼠(购自上海南方模式生物科技股份有限公司)配种到Cdh5-CreERT2小鼠(获自上海交通大学)中获得血管内皮细胞Cds2诱导敲除小鼠(Cdh5-CreERT2Cds2fl/fl,Cds2iΔEC，图2,2.1)。
(2)诱导血管内皮细胞Cds2敲除
新生小鼠出生后进行基因型鉴定，筛选出Cds2iΔEC小鼠，在小鼠出生后第3-5天(P3-P5)腹腔注射tamoxifen(他莫昔芬)诱导Cds2敲除，在P6收集小鼠样本通过磁珠分选方法富集血管内皮细胞，然后通过实时定量PCR检测Cds2表达，发现Cds2iΔEC小鼠表现出很高的Cds2敲除效率(图2，2.1)。
(3)小鼠视网膜血管退化的检测
取P6新生小鼠的视网膜，用4％甲醛溶液室温固定2小时，然后根据文献报道的方法进行封闭、Collagen4(胶原蛋白4)和Isolectin B4(植物凝集素B4)免疫荧光共染、清洗和封片，在荧光显微镜下成像，据已有文献报道Collagen4阳性Isolectin B4阴性信号可以指示血管退化现象(图2，2.2)。
(4)血管内皮细胞Cds2敲除的小鼠视网膜中，VEGFa水平较高的局部组织存在较高水平的血管退化现象
在P3-P5对新生小鼠进行tamoxifen腹腔注射，在P6收取新生小鼠视网膜，进行Collagen4和Isolectin B4免疫荧光共染，在荧光显微镜下成像，统计并分析血管退化现象。结果显示，Cds2iΔEC小鼠视网膜相对于对照组呈现较高水平的血管退化现象，已有文献证实在视网膜血管新生尖端存在高水平VEGFa，发现血管退化现象在VEGFa水平较高的视网膜血管尖端更为显著(图2，2.2)，这一实验结果再次证实本发明方法在哺乳动物中是保守的。
实施例3
在血管内皮细胞Cds2敲除的小鼠中接种TC-1或B16-F0肿瘤细胞，Cds2iΔEC小鼠肿瘤中血管发生退化并且肿瘤生长受到抑制
(1)接种肿瘤细胞
预先培养TC-1或B16-F0肿瘤细胞(均获自中国科学院上海生命科学研究院)，所用培养基分别为含10％胎牛血清和1％青链霉素的RPMI-1640或DMEM/HIGH(GibcoTM)，接种前细胞重悬于无血清的RPMI-1640或DMEM中，然后2:1与Matrigel(人工基质胶)混匀，接种体积为150μl，细胞数目分别为3×106和1×106，细胞悬液皮下接种至小鼠背部两侧。
(2)tamoxifen腹腔注射诱导Cds2敲除
接种肿瘤细胞后，机体会响应肿瘤组织VEGFa诱导血管新生为肿瘤提供营养，在接种后第2天向小鼠腹腔注射80mg/kg(小鼠体重)tamoxifen，每天注射一次，连续注射5天诱导Cds2敲除。
(3)肿瘤组织血管退化的检测
小鼠接种TC-1肿瘤细胞后第4-13天每天用游标卡尺进行肿瘤测量并统计其大小，肿瘤体积计算公式为长×宽2/2，在第13天收取肿瘤成像，然后进行4％甲醛固定、蔗糖梯度脱水、OCT包埋、冰冻切片、CD31免疫荧光染色和成像分析，结果显示Cds2iΔEC小鼠与对照组相比肿瘤生长缓慢，血管密度减少，体积减小(图3，3.1)。另外，在小鼠接种TC-1肿瘤细胞后第7-13天每两天进行肿瘤超声造影活体观察肿瘤血管的生长情况，相较于对照组，Cds2iΔEC小鼠肿瘤中血液灌注情况较差，表明Cds2敲除诱导了TC-1肿瘤组织中血管的退化(图3，3.2)。此外，在接种B16-F0肿瘤细胞后第11天收取肿瘤，进行4％甲醛固定、蔗糖梯度脱水、OCT包埋、冰冻切片、Collagen4与CD31免疫荧光共染和成像分析，Collagen4阳性CD31阴性信号可以标记退化的血管，Cds2iΔEC小鼠与对照组相比B16-F0肿瘤中存在较高水平的血管退化现象(图3，3.3)。
(4)肿瘤生长情况的统计
在接种TC-1或B16-F0肿瘤细胞后第7-25天，每两天用游标卡尺进行一次肿瘤测量，肿瘤体积计算公式为长×宽2/2，经统计分析发现Cds2iΔEC小鼠接种的TC-1或B16-F0肿瘤生长受到极显著抑制(图3，3.4)，然而Cds2iΔEC小鼠中生长受限的TC-1和B16-F0肿瘤拥有更高水平的VEGFa(图3，3.5)，这形成了一个恶性循环，即Cds2敲除诱导血管退化，血管密度减少，血管供给不足诱导肿瘤补偿性分泌更多VEGFa，进而诱导更多的血管退化并抑制肿瘤生长。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 一种有效诱导血管退化的方法和用途
<130> P2017-0879
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Thr Glu Leu Arg Gln Arg Val Ala His Glu Pro Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Glu Asp Lys Glu Ser Glu Ser Glu Ala Lys Val Asp Gly Glu Thr Ala
20 25 30
Ser Asp Ser Glu Ser Arg Ala Glu Ser Ala Pro Leu Pro Val Ser Ala
35 40 45
Asp Asp Thr Pro Glu Val Leu Asn Arg Ala Leu Ser Asn Leu Ser Ser
50 55 60
Arg Trp Lys Asn Trp Trp Val Arg Gly Ile Leu Thr Leu Ala Met Ile
65 70 75 80
Ala Phe Phe Phe Ile Ile Ile Tyr Leu Gly Pro Met Val Leu Met Ile
85 90 95
Ile Val Met Cys Val Gln Ile Lys Cys Phe His Glu Ile Ile Thr Ile
100 105 110
Gly Tyr Asn Val Tyr His Ser Tyr Asp Leu Pro Trp Phe Arg Thr Leu
115 120 125
Ser Trp Tyr Phe Leu Leu Cys Val Asn Tyr Phe Phe Tyr Gly Glu Thr
130 135 140
Val Thr Asp Tyr Phe Phe Thr Leu Val Gln Arg Glu Glu Pro Leu Arg
145 150 155 160
Ile Leu Ser Lys Tyr His Arg Phe Ile Ser Phe Thr Leu Tyr Leu Ile
165 170 175
Gly Phe Cys Met Phe Val Leu Ser Leu Val Lys Lys His Tyr Arg Leu
180 185 190
Gln Phe Tyr Met Phe Gly Trp Thr His Val Thr Leu Leu Ile Val Val
195 200 205
Thr Gln Ser His Leu Val Ile His Asn Leu Phe Glu Gly Met Ile Trp
210 215 220
Phe Ile Val Pro Ile Ser Cys Val Ile Cys Asn Asp Ile Met Ala Tyr
225 230 235 240
Met Phe Gly Phe Phe Phe Gly Arg Thr Pro Leu Ile Lys Leu Ser Pro
245 250 255
Lys Lys Thr Trp Glu Gly Phe Ile Gly Gly Phe Phe Ala Thr Val Val
260 265 270
Phe Gly Leu Leu Leu Ser Tyr Val Met Ser Gly Tyr Arg Cys Phe Val
275 280 285
Cys Pro Val Glu Tyr Asn Asn Asp Thr Asn Ser Phe Thr Val Asp Cys
290 295 300
Glu Pro Ser Asp Leu Phe Arg Leu Gln Glu Tyr Asn Ile Pro Gly Val
305 310 315 320
Ile Gln Ser Val Ile Gly Trp Lys Thr Val Arg Met Tyr Pro Phe Gln
325 330 335
Ile His Ser Ile Ala Leu Ser Thr Phe Ala Ser Leu Ile Gly Pro Phe
340 345 350
Gly Gly Phe Phe Ala Ser Gly Phe Lys Arg Ala Phe Lys Ile Lys Asp
355 360 365
Phe Ala Asn Thr Ile Pro Gly His Gly Gly Ile Met Asp Arg Phe Asp
370 375 380
Cys Gln Tyr Leu Met Ala Thr Phe Val Asn Val Tyr Ile Ala Ser Phe
385 390 395 400
Ile Arg Gly Pro Asn Pro Ser Lys Leu Ile Gln Gln Phe Leu Thr Leu
405 410 415
Arg Pro Asp Gln Gln Leu His Ile Phe Asn Thr Leu Arg Ser His Leu
420 425 430
Ile Asp Lys Gly Met Leu Thr Ser Thr Thr Glu Asp Glu
435 440 445
<210> 2
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgacagagc tgaggcagag ggtggcccat gagccggttg cgccacccga ggacaaggag 60
tcagagtcag aagcaaaggt agatggagag actgcatcgg acagtgagag ccgggcagaa 120
tccgcacccc tgccagtctc tgcagatgat accccggagg tcctcaatag ggccctttcc 180
aacttgtctt caagatggaa gaactggtgg gtgagaggca tcctgacttt ggccatgatt 240
gcatttttct tcatcatcat ttacctggga ccaatggttt tgatgataat cgtgatgtgc 300
gttcagatta agtgtttcca tgagataatc actattggct acaacgtcta ccactcatat 360
gatctgccct ggttcaggac gctcagctgg tactttctcc tgtgtgtaaa ctatttcttc 420
tatggtgaga cagtgacgga ttacttcttc accctggtcc agagagaaga gcctttgcgg 480
attctcagta aataccaccg gttcatttcc tttactctct atctaatagg attctgcatg 540
tttgtactga gtctggtcaa gaagcattat cgactgcagt tctacatgtt tggctggacc 600
catgtgacat tgctgattgt tgtaacacag tcacatcttg ttatccacaa cctatttgaa 660
ggaatgatct ggttcattgt ccccatatct tgtgtgatct gtaatgacat catggcctat 720
atgtttggct ttttctttgg tcggacccca ctcatcaagc tgtccccgaa gaagacctgg 780
gaaggcttca ttgggggctt ctttgctact gtggtgtttg gccttctgct gtcctatgtg 840
atgtccgggt acagatgctt tgtctgccct gtggagtaca acaatgacac caacagcttc 900
actgtggact gtgagccctc ggacctgttt cgcctgcagg agtacaacat tcctggggtg 960
atccagtcag tcattggctg gaaaacggtc cggatgtacc ccttccagat tcacagcatc 1020
gctctctcca cctttgcctc gctcattggc ccctttggag gattcttcgc aagtggattc 1080
aaacgagcct ttaaaatcaa agactttgcc aataccattc ctggccatgg aggcatcatg 1140
gatcgctttg actgccagta tctgatggcc acctttgtca atgtatacat cgccagtttt 1200
atcagaggcc ctaacccaag caaactgatt cagcagttcc tgactttacg gccagatcag 1260
cagctccaca tcttcaacac gctgcggtct catctgatcg acaaagggat gctgacatcc 1320
accacagagg acgagtag 1338

Claims (2)

1.一种组合的用途，其特征在于，所述组合由(a) cds2抑制剂和(b) VEGF组成，所述组合用于制备一组合物或制剂，所述组合物或制剂用于(i) 促进血管退化；和/或 (ii) 促进细胞凋亡和迁移，并且所述VEGF为VEGFa，所述细胞为血管内皮细胞。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述血管退化为视网膜的血管退化。
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CDP-diacylglycerol synthetase-controlled phosphoinositide availability limits VEGFAsignaling and vascular morphogenesis;Weijun Pan等;《BLOOD》;20120712;第120卷(第2期);摘要，第496页第3段，第489页第2段 *
血管生成抑制因子在肿瘤防治中的研究进展;沈先荣等;《国外医学药学分册》;19941231;第21卷(第4期);全文 *

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