JP2022529775A - 硝子体内送達のためのバリアントａａｖキャプシド - Google Patents

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Abstract

バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質、および１つまたは複数のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を有する組換えＡＡＶビリオンを提供する。疾患もしくは障害の処置または予防のためなどの組換えＡＡＶビリオンの使用のための組成物および方法も提供する。本明細書において、治療用遺伝子産物を被験体の網膜に提供する方法であって、被験体に、本明細書に開示の組換えＡＡＶビリオン、または本明細書に開示の医薬組成物を硝子体内注入によって投与するステップを含む、方法も提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８３９，５４８号、および２０１９年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／９２３，９２４号の利益を主張し、そのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルの以下の提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：コンピューター可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：６２７００２００１１４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２０年４月２１日、サイズ：４９ＫＢ）。
遺伝的疾患および障害、ならびに他の疾患および障害を処置および予防する有望なアプローチは、ビリオンなどの遺伝子治療ベクターを用いる治療用遺伝子産物の送達である。遺伝子治療のために適切なビリオンの実例としては、限定されるものではないが、レトロウイルスビリオン、レンチウイルスビリオン、アデノウイルスビリオン、ヘルペスウイルスビリオン、アルファウイルスビリオンおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンが挙げられる。ＡＡＶは、４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡウイルスである。野生型ＡＡＶは、非病原性であり、かつ任意の公知の疾患との病因学的関連を有さないので、ＡＡＶに基づく組換えビリオン（ｒＡＡＶビリオン）は、優れた臨床的安全性に関連する。加えて、ＡＡＶは、高効率の遺伝子送達のための能力、ならびに眼、筋肉、肺および脳を含む多数の組織における持続した導入遺伝子の発現を提供する。
遺伝子治療における使用のためのビリオンの設計に関して残っているある特定の課題は、ウイルス細胞指向性の最適化、特に眼の遺伝子治療に関して、網膜への送達の最適化を含む。したがって、選択された哺乳動物細胞において遺伝子を発現するための最適化されたビリオンについての必要性がある。本発明は、組換えＡＡＶビリオンの所望の細胞および組織への送達のために有利な改変ＡＡＶキャプシドタンパク質を提供することによってこの必要性に対処する。
本明細書において、（ａ）親アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質に比べてアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変配列を含むバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質であって、改変配列が、ＨＫＦＫＳＧＤ（配列番号１）を含み、アミノ酸残基の番号付けが、ＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質に対応する、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質；および（ｂ）治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶビリオンを提供する。
一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質、またはＡＡＶ５およびＡＡＶ２ハイブリッドキャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔキャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１キャプシドタンパク質である。
一部の実施形態では、改変配列は、ＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３）を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号４または配列番号５に記述されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するキャプシド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号６または配列番号７に記述されるキャプシド配列を含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、バリアントＡＡＶ５、またはバリアントＡＡＶ２およびＡＡＶ５ハイブリッドビリオンである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、バリアントＡＡＶ２．５Ｔビリオンである。
一部の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、哺乳動物に硝子体内注入される場合に、網膜の細胞に形質導入することができる。一部の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、哺乳動物に硝子体内注入される場合に、光受容細胞（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、および網膜色素上皮細胞のうちの１つまたは複数に形質導入することができる。一部の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、哺乳動物に硝子体内注入される場合に、網膜色素上皮細胞に形質導入することができる。
一部の実施形態では、治療用遺伝子産物は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはタンパク質である。一部の実施形態では、治療用遺伝子産物は、抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）遺伝子産物である。一部の実施形態では、治療用遺伝子産物は、オプシンである。
一部の実施形態では、治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲと隣接している。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶもしくはヒツジＡＡＶのＩＴＲ、またはそれらのバリアントである。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲまたはＡＡＶ５のＩＴＲである。
一部の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ２．５Ｔと比較して、変化した細胞指向性を有する。
一部の実施形態では、本明細書に開示の組換えＡＡＶビリオンは、それを必要とする被験体の網膜の疾患または障害を処置する方法における使用のためのものであり、方法は、被験体に、組換えＡＡＶビリオンを含む医薬組成物を硝子体内注入によって投与するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書に開示の組換えＡＡＶビリオンは、被験体の網膜の疾患または障害の処置のための医薬の調製における使用のためのものである。一部の実施形態では、疾患または障害は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、滲出型ＡＭＤ、萎縮型ＡＭＤ、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症または糖尿病性網膜浮腫である。
本明細書において、本明細書に開示の組換えＡＡＶビリオンを含む医薬組成物も提供する。
本明細書において、ｒＡＡＶビリオンを産生するための方法であって、（ａ）ｒＡＡＶビリオンが産生される条件下で宿主細胞を培養するステップであって、宿主細胞が、（ｉ）親ＡＡＶキャプシドタンパク質に比べてアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変配列を含むバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、改変配列が、ＨＫＦＫＳＧＤ（配列番号１）を含む、ポリヌクレオチド；（ｉｉ）ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶのＩＴＲと隣接している治療用遺伝子産物をコードする配列を含むポリヌクレオチドカセット；および（ｉｖ）ＡＡＶヘルパー機能を含むステップ；ならびに（ｂ）宿主細胞によって産生されたｒＡＡＶビリオンを回収するステップを含む、方法も提供する。
本明細書において、治療用遺伝子産物を被験体の網膜に提供する方法であって、被験体に、本明細書に開示の組換えＡＡＶビリオン、または本明細書に開示の医薬組成物を硝子体内注入によって投与するステップを含む、方法も提供する。
一部の実施形態では、被験体は、急性黄斑視神経網膜症、ベーチェット病、脈絡膜血管新生、糖尿病性ぶどう膜炎、ヒストプラスマ症、黄斑変性症、浮腫、多病巣性脈絡膜炎、後眼部位もしくは区域に影響を与える眼外傷、眼腫瘍、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ぶどう膜網膜疾患（ｕｖｅｉｔｉｃ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、交感性眼炎、フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群、ぶどう膜拡散（ｕｖｅａｌ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、眼レーザー処置によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態、光線力学的療法によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態、光凝固、放射線網膜症、網膜上膜障害、網膜静脈分枝閉塞症、前部虚血性視神経症、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症、非網膜症糖尿病性網膜機能障害、網膜分離症、網膜色素変性症、緑内障、アッシャー症候群、錐体杆体ジストロフィー、シュタルガルト病、遺伝性黄斑変性症、脈絡網膜変性症、レーバー先天黒内障、先天停止性夜盲、全脈絡膜萎縮、バルデ・ビードル症候群、黄斑部毛細血管拡張症、レーバー遺伝性視神経症、未熟児網膜症、および色覚の障害からなる群より選択される１つもしくは複数の状態を有すると診断されているか、またはそれを有する疑いがある。
本明細書において、それを必要とする被験体の網膜の疾患または障害を処置する方法であって、被験体に、本明細書に開示の組換えＡＡＶビリオン、または本明細書に開示の医薬組成物を硝子体内注入によって投与するステップを含む、方法も提供する。
一部の実施形態では、疾患または障害は、急性黄斑視神経網膜症、ベーチェット病、脈絡膜血管新生、糖尿病性ぶどう膜炎、ヒストプラスマ症、黄斑変性症、浮腫、多病巣性脈絡膜炎、後眼部位もしくは区域に影響を与える眼外傷、眼腫瘍、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ぶどう膜網膜疾患、交感性眼炎、フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群、ぶどう膜拡散、眼レーザー処置によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態、光線力学的療法によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態、光凝固、放射線網膜症、網膜上膜障害、網膜静脈分枝閉塞症、前部虚血性視神経症、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症、非網膜症糖尿病性網膜機能障害、網膜分離症、網膜色素変性症、緑内障、アッシャー症候群、錐体杆体ジストロフィー、シュタルガルト病、遺伝性黄斑変性症、脈絡網膜変性症、レーバー先天黒内障、先天停止性夜盲、全脈絡膜萎縮、バルデ・ビードル症候群、黄斑部毛細血管拡張症、レーバー遺伝性視神経症、未熟児網膜症、または色覚の障害である。
本明細書において、親ＡＡＶキャプシドタンパク質に比べてアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変配列を含むバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質であって、改変配列が、ＨＫＦＫＳＧＤ（配列番号１）を含み、アミノ酸残基の番号付けが、ＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質に対応する、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質も提供する。
一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質、またはＡＡＶ５およびＡＡＶ２ハイブリッドキャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔキャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１キャプシドタンパク質である。
一部の実施形態では、改変ＡＡＶキャプシドタンパク質は、親ＡＡＶキャプシドタンパク質に比べてアミノ酸残基５７０～５７９にＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３）を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号４または配列番号５に記述されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するキャプシド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号６または配列番号７に記述されるキャプシド配列を含む。
本明細書において、本明細書に開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸も提供する。
本明細書において、本明細書に開示の核酸を含む発現ベクターであって、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸配列が、プロモーター配列に作動可能に連結されている、発現ベクターも提供する。一部の実施形態では、発現ベクターは、ｒｅｐタンパク質をコードする核酸をさらに含む。
本明細書において、本明細書に開示の発現ベクターを含む細胞も提供する。一部の実施形態では、細胞は、治療用遺伝子産物をコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、治療用遺伝子産物は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはタンパク質である。一部の実施形態では、治療用遺伝子産物は、抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）遺伝子産物である。一部の実施形態では、治療剤は、オプシンである。
一部の実施形態では、治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲと隣接している。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶもしくはヒツジＡＡＶのＩＴＲ、またはそれらのバリアントである。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲまたはＡＡＶ５のＩＴＲである。
本特許出願および刊行物を含む本明細書に引用されるすべての参考文献は、それらの全体が、参照により組み込まれる。
図１Ａは、網膜および同心試料の穿孔場所の略図を示す。穿孔１は、黄斑（小さな円形の陥凹）を含有し；穿孔２は、傍中心窩を含有し；残りの組織は、血管アーケード（ｂｌｏｏｄ ａｒｃａｄｅ）を含む周辺網膜を含有する。
図１Ｂ～１Ｅは、選択プロセスの異なる段階でのキャプシドバリアントの相対存在量を示す。図１Ｂは、元のライブラリーにおける上位１００のバリアントのパーセンテージを示し；図１Ｃは、第２のスクリーニングラウンドから傍中心窩、黄斑または周辺網膜領域において特定された上位１００のバリアントのパーセンテージを示す。図１Ｄは、傍中心窩が起源のラウンド２のライブラリーから傍中心窩およびＲＰＥ細胞に成功裏に形質導入した上位５０の進化したバリアントのパーセンテージを示す。図１Ｅは、傍中心窩が起源のラウンド２のライブラリーから黄斑＋周辺細胞に成功裏に形質導入した上位５０の進化したバリアントのパーセンテージを示す。
図２は、ＡＡＶ２．５ＴおよびバリアントキャプシドＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１からのヘパリンカラム画分のドットプロットの結果を示す。溶出液Ｅ１～Ｅ１０は、０．１Ｍ（Ｅ１）、０．２Ｍ（Ｅ２）、０．３Ｍ（Ｅ３）、０．４Ｍ（Ｅ４）、０．５Ｍ（Ｅ５）、０．６Ｍ（Ｅ６）、０．７Ｍ（Ｅ７）、０．８Ｍ（Ｅ８）、０．９Ｍ（Ｅ９）および１．０Ｍ（Ｅ１０）の漸増濃度のＮａＣｌを有する。
図３は、２Ｅ＋１０ｖｇ（すなわち、２Ｅ１０ｖｇ）または４Ｅ＋１０ｖｇ（すなわち、４Ｅ１０ｖｇ）のＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンに感染後７日目または１４日目の６ｍｍのブタ網膜外植片におけるＧＦＰ発現のライブイメージングを示す。
図４Ａ～４Ｃは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後１４日目（図４Ａ）、２１日目（図４Ｂ）および２８日目（図４Ｃ）のアフリカミドリザルの網膜のＯＴＣ自己蛍光画像を提供し、中心窩および血管アーケード内のＧＦＰ発現を示す。
図４Ｄ～４Ｅは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後２８日目のアフリカミドリザルの左（図４Ｄ）および右（図４Ｅ）の網膜のハイデルベルグスペクトラリス画像を提供し、中心窩および血管アーケード内のＧＦＰ発現を示す。
図５Ａ～５Ｂは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルのフラットマウントされた網膜の蛍光画像を提供する。
図５Ｃ～５Ｄは、左眼（図５Ｃ）および右眼（図５Ｄ）についてのＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルのフラットマウントされた網膜の蛍光画像を提供する。
図５Ｅは、図５Ｃ～５Ｄに示された眼についての黄斑から毛様体までの距離にわたってプロットされたＧＦＰ強度プロファイルを提供する。網膜領域の場所は、中心窩の中央に対する平均距離から計算した。
図６Ａ～６Ｃは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の中心窩から毛様体までの蛍光画像を提供する。図６Ａは、ＧＦＰ発現を示す。図６Ｂは、核のＤＡＰＩ染色を示す。図６Ｃは、図６Ａおよび図６Ｂの合成画像である。
図７は、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の中心窩において発現したＧＦＰの蛍光画像を提供する。
図８は、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の中心窩において発現したＧＦＰの蛍光画像を提供する。
図９Ａ～９Ｄは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の中心窩の蛍光画像を提供する。図９Ａは、図９Ｂ～９Ｄの合成画像を示す。図９Ｂは、核のＤＡＰＩ染色を示す。図９Ｃは、ＧＦＰ発現を示す。図９Ｄは、杆体光受容細胞のロドプシン抗体標識化を示す。
図１０Ａ～１０Ｄは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の中心窩の蛍光画像を提供する。図１０Ａは、図１０Ｂ～１０Ｄの合成画像を示す。図１０Ｂは、核のＤＡＰＩ染色を示す。図１０Ｃは、ＧＦＰ発現を示す。図１０Ｄは、ミュラー細胞のグルタミン合成酵素抗体標識化を示す。
図１１は、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の網膜において発現したＧＦＰの蛍光画像を提供する。
図１２Ａ～１２Ｃは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の網膜の蛍光画像を提供する。図１２Ａは、図１２Ｂおよび図１２Ｃの合成画像である。図１２Ｂは、核のＤＡＰＩ染色を示す。図１２Ｃは、ＧＦＰ発現を示す。
図１３Ａ～１３Ｄは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の網膜の蛍光画像を提供する。図１３Ａは、図１３Ｂ～１３Ｄの合成画像を示す。図１３Ｂは、核のＤＡＰＩ染色を示す。図１３Ｃは、ＧＦＰ発現を示す。図１３Ｄは、ミュラー細胞のグルタミン合成酵素抗体標識化を示す。
図１４Ａ～１４Ｄは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の網膜の蛍光画像を提供する。図１４Ａは、図１４Ｂ～１４Ｄの合成画像を示す。図１４Ｂは、核のＤＡＰＩ染色を示す。図１４Ｃは、ＧＦＰ発現を示す。図１４Ｄは、ミュラー細胞のグルタミン合成酵素抗体標識化を示す。
図１５Ａ～１５Ｄは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の網膜の蛍光画像を提供する。図１５Ａは、図１５Ｂ～１５Ｄの合成画像を示す。図１５Ｂは、核のＤＡＰＩ染色を示す。図１５Ｃは、ＧＦＰ発現を示す。図１５Ｄは、ミュラー細胞のグルタミン合成酵素抗体標識化を示す。
図１６Ａ～１６Ｅは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の網膜の蛍光画像を提供する。図１６Ａは、図１６Ｂ～１６Ｅの合成画像を示す。図１６Ｂは、核のＤＡＰＩ染色を示す。図１６Ｃは、ＧＦＰ発現を示す。図１６Ｄは、双極細胞のＰＣＫ－アルファ抗体標識化を示す。図１６Ｅは、網膜神経節軸索末端の経路のＴＵＪ－１抗体標識化を示す。
図１７Ａ～１７Ｄは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の網膜の蛍光画像を提供する。図１７Ａは、図１７Ｂ～１７Ｄの合成画像を示す。図１７Ｂは、核のＤＡＰＩ染色を示す。図１７Ｃは、ＧＦＰ発現を示す。図１７Ｄは、双極細胞のＰＣＫ－アルファ抗体標識化を示す。
図１８Ａ～１８Ｅは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の網膜の蛍光画像を提供する。図１８Ａは、図１８Ｂ～１８Ｅの合成画像を示す。図１８Ｂは、核のＤＡＰＩ染色を示す。図１８Ｃは、ＧＦＰ発現を示す。図１８Ｄは、錐体光受容細胞の錐体アレスチン抗体標識化を示す。図１８Ｅは、杆体光受容細胞のロドプシン抗体標識化を示す。
図１９Ａ～１９Ｅは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の網膜の蛍光画像を提供する。図１９Ａは、図１９Ｂ～１９Ｅの合成画像を示す。図１９Ｂは、核のＤＡＰＩ染色を示す。図１９Ｃは、ＧＦＰ発現を示す。図１９Ｄは、錐体光受容細胞の錐体アレスチン抗体標識化を示す。図１９Ｅは、杆体光受容細胞のロドプシン抗体標識化を示す。
図２０Ａ～２０Ｅは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の網膜の蛍光画像を提供する。図２０Ａは、図２０Ｂ～２０Ｅの合成画像を示す。図２０Ｂは、核のＤＡＰＩ染色を示す。図２０Ｃは、ＧＦＰ発現を示す。図２０Ｄは、錐体光受容細胞の錐体アレスチン抗体標識化を示す。図２０Ｅは、杆体光受容細胞のロドプシン抗体標識化を示す。
図２１Ａ～２１Ｅは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の網膜色素上皮（ＲＰＥ）の蛍光画像を提供する。図２１Ａは、図２１Ｂ～２１Ｅの合成画像を示す。図２１Ｂは、核のＤＡＰＩ染色を示す。図２１Ｃは、抗体標識化なしのネイティブＧＦＰ発現を示す。図２１Ｄは、錐体光受容細胞のＲＰＥ６５抗体標識化を示す。図２１Ｅは、６４７ｎｍでのＧＦＰ発現を示す。
図２２Ａ～２２Ｅは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の網膜色素上皮（ＲＰＥ）の蛍光画像を提供する。図２２Ａは、図２２Ｂ～２２Ｅの合成画像を示す。図２２Ｂは、核のＤＡＰＩ染色を示す。図２２Ｃは、抗体標識化なしのネイティブＧＦＰ発現を示す。図２２Ｄは、錐体光受容細胞のＲＰＥ６５抗体標識化を示す。図２２Ｅは、６４７ｎｍでのＧＦＰ発現を示す。
図２３Ａ～２３Ｅは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の網膜色素上皮（ＲＰＥ）の平面蛍光画像を提供する。図２３Ａは、図２３Ｂ～２３Ｅの合成画像を示す。図２３Ｂは、核のＤＡＰＩ染色を示す。図２３Ｃは、抗体標識化なしのネイティブＧＦＰ発現を示す。図２３Ｄは、錐体光受容細胞のＲＰＥ６５抗体標識化を示す。図２３Ｅは、６４７ｎｍでのＧＦＰ発現を示す。
図２４Ａ～２４Ｅは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の網膜色素上皮（ＲＰＥ）の平面蛍光画像を提供する。図２４Ａは、図２４Ｂ～２４Ｅの合成画像を示す。図２４Ｂは、核のＤＡＰＩ染色を示す。図２４Ｃは、抗体標識化なしのネイティブＧＦＰ発現を示す。図２４Ｄは、錐体光受容細胞のＲＰＥ６５抗体標識化を示す。図２４Ｅは、６４７ｎｍでのＧＦＰ発現を示す。
図２５Ａ～２５Ｅは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの眼の網膜色素上皮（ＲＰＥ）の平面蛍光画像を提供する。図２５Ａは、図２５Ｂ～２５Ｅの合成画像を示す。図２５Ｂは、核のＤＡＰＩ染色を示す。図２５Ｃは、抗体標識化なしのネイティブＧＦＰ発現を示す。図２５Ｄは、錐体光受容細胞のＲＰＥ６５抗体標識化を示す。図２５Ｅは、６４７ｎｍでのＧＦＰ発現を示す。
図２６Ａ～２６Ｃは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの目の網膜におけるさまざまな領域におけるＧＦＰ陽性双極細胞（図２６Ａ）、錐体細胞（図２６Ｂ）およびＲＰＥ細胞（図２６Ｃ）の平均パーセントを提供する。 図２６Ａ～２６Ｃは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの目の網膜におけるさまざまな領域におけるＧＦＰ陽性双極細胞（図２６Ａ）、錐体細胞（図２６Ｂ）およびＲＰＥ細胞（図２６Ｃ）の平均パーセントを提供する。 図２６Ａ～２６Ｃは、ＧＦＰをコードするＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの硝子体内投与後のアフリカミドリザルの目の網膜におけるさまざまな領域におけるＧＦＰ陽性双極細胞（図２６Ａ）、錐体細胞（図２６Ｂ）およびＲＰＥ細胞（図２６Ｃ）の平均パーセントを提供する。
図２７Ａ～２７Ｂは、ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１およびＡＡＶ２に対する中和抗体（ｎＡＢ）プロファイルを提供する。プールされたヒトＩｇＧ抗体（Ｇａｍｍａｇａｒｄ ＩＶＩＧ）を、ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１－ＣＭＶ－ＧＦＰまたはＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰと組み合わせた。２９３Ｔ細胞に、混合物を形質導入し、ＧＦＰ発現を測定する前に３日間インキュベートした。図２７Ａは、ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１－ＣＭＶ－ＧＦＰに対するＩＶＩＧの中和抗体プロファイルを示す（それぞれの希釈についてＮ＝３）。図２７Ｂは、ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰに対するＩＶＩＧの中和抗体プロファイルを示す（それぞれの希釈についてＮ＝２または３）。
本開示は、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質、および１つまたは複数のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを提供する。一部の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、以下の特徴のうちの１つまたは複数を示す：１）網膜細胞の感染力の増加；２）変化した指向性；３）ヘパリンおよび／またはヘパラン硫酸プロテオグリカンおよび／または内境界膜（ＩＬＭ）への結合の増加；ならびに４）本明細書に開示の改変キャプシドタンパク質の代わりに、そのネイティブ、野生型および／または親キャプシドタンパク質を含む対応するウイルスベクターと比較して、硝子体内投与された場合に、感染する能力および／またはＩＬＭを通過して治療用遺伝子産物を送達する能力の増加。個体において、細胞、例えば網膜細胞における治療用遺伝子産物の発現を促進するため、例えば、疾患もしくは障害の処置または予防のための、本明細書に開示の組成物のいずれかの使用のための医薬組成物および方法も提供する。
Ｉ．定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、当業者によって理解される通常の意味と同じ意味を有する。
本明細書で使用される専門用語は、特定の例のみを記載する目的のためであって、限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他を明確に示さない限り、複数形を同様に含むことを意図する。さらにまた、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語、またはそれらの変形が詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される範囲で、そのような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様の方法で包括的であることを意図する。本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」と同義であり、包括的またはオープンエンドである。
本明細書において「または」への任意の言及は、他に記述されない限り、「および／または」を包含することを意図する。
本明細書において「約」の値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体を対象とする変動を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。
本発明の一部の実施形態では、「個体」または「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されるものではないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。ある特定の実施形態では、個体または被験体は、ヒトである。
本明細書で使用される「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「好転させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）」または「好転させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」という用語および他の文法的に同等の用語は、眼の疾患もしくは障害または眼の疾患もしくは障害の症状を軽減すること、弱めることまたは好転させること、眼の疾患もしくは障害の追加症状を防止すること、症状の根本的な代謝原因を好転させること、眼の疾患もしくは障害を阻害すること、例えば、眼の疾患もしくは障害の発生を抑止すること、眼の疾患もしくは障害を緩和すること、眼の疾患もしくは障害の退行を引き起こすこと、あるいは眼の疾患もしくは障害の症状を停止することを指す。この用語は、治療利益を達成することをさらに含む。「治療利益」という用語は、処置される眼の疾患もしくは障害の根絶または好転を指す。また、治療利益は、眼の疾患または障害に関連する１つもしくは複数の生理学的症状の根絶または好転により達成され、その結果、一部の実施形態では、患者、被験体または個体が依然として眼の疾患または障害に苦しめられているにもかかわらず、改善が、患者、被験体または個体において観察される。
一部の実施形態では、本発明の方法は、予防的利益を提供し、例えば、医薬組成物は、疾患または障害の診断が行われていない場合でさえ、眼の疾患もしくは障害を発生する危険性がある患者、被験体または個体に、あるいは眼の疾患もしくは障害の１つもしくは複数の生理学的症状を報告する患者、被験体または個体に投与される。
「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」、「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」、「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」などの用語は、本明細書で使用される場合、生物学的作用の所望の部位に治療薬または医薬組成物の送達を可能にするために使用される方法を指し得る。これらの方法は、眼への硝子体内注入または網膜下注入を含む。
本明細書で使用される「有効量」、「治療有効量」または「薬学的有効量」という用語は、処置される眼の疾患または障害の１つもしくは複数の症状をある程度緩和する、投与される少なくとも１つの医薬組成物または化合物の十分な量を指し得る。医薬組成物の「有効量」、「治療有効量」または「薬学的有効量」は、単位用量（本明細書の他の箇所でさらに詳細に記載する）で、それを必要とする被験体に投与され得る。
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、担体または希釈剤などの物質を指し得、これは、本明細書に開示の化合物の生物活性または性質を抑止せず、相対的に非毒性である（すなわち、物質が個体に投与されると、これは、望ましくない生物効果を引き起こさず、組成物に含有される組成物の成分のいずれかと有害な方法で相互作用しない）。
「医薬組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、限定されるものではないが、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、賦形剤などの少なくとも１つの薬学的に許容される化学成分と必要に応じて混合される、生物活性化合物を指し得る。
本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶベクター」は、標的細胞または標的組織への形質導入のための、ＡＡＶを起源としないポリヌクレオチド配列（例えば、治療用導入遺伝子（例えば、アフリベルセプト）をコードする核酸配列などのＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド）を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを指す。一般に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、一般には２つのＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接している。ｒＡＡＶベクターという用語は、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補性（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」または「ｒＡＡＶ粒子」または「組換えＡＡＶビリオン」は、少なくとも１つのＡＡＶのキャプシドタンパク質、およびポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターを含むウイルス粒子を指す。粒子が、異種のポリヌクレオチド（例えば、標的細胞または標的組織に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶのゲノム以外のポリヌクレオチド）、を含む場合に、これは、典型的には、「ｒＡＡＶベクター粒子」または「ｒＡＡＶベクター」と称される。
本明細書で使用される「パッケージング」という用語は、ｒＡＡＶ粒子の組み立ておよびキャプシド化をもたらし得る一連の細胞内事象を指し得る。
ＡＡＶの「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製およびキャプシド化タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書において、ＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と称される。
「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換可能に使用される。ポリマーは、直鎖状または分枝状であり得、これは、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語は、自然に、または介入によって修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは標識化成分もしくは毒素とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作または修飾も包含する。この定義内には、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つまたは複数のアナログ、および当技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらのアナログを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含んでいてもよく、非ヌクレオチド成分によって中断されていてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書で使用される場合、二本鎖および一本鎖分子を指し得る。
本明細書で使用される場合、「組換え」は、（１）その天然に存在する環境から除去されている、（２）遺伝子が天然で見出されるポリヌクレオチドのすべてもしくは一部と関連しない、（３）天然で連結されないポリヌクレオチドに動作可能に連結されている、または（４）天然で生じない、生体分子、例えば、遺伝子またはタンパク質を指し得る。「組換え」という用語は、クローニングされたＤＮＡ単離物、化学合成されたポリヌクレオチドアナログ、または異種システムによって生物学的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、ならびにそのような核酸によってコードされるタンパク質および／またはｍＲＮＡを参照して使用することができる。したがって、例えば、微生物によって合成されるタンパク質は、例えば、細胞に存在する組換え遺伝子から合成されたｍＲＮＡから合成される場合、組換えである。
「抗ＶＥＧＦ遺伝子産物」という用語は、内因性ＶＥＧＦおよび／もしくは内因性ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）の活性もしくは機能、またはＶＥＧＦ－ＶＥＧＦＲの相互作用、またはｉｎ ｖｉｖｏ経路を、低減し、それらと相互作用し、それらを妨害し、それらをブロックし、ならびに／あるいはそれらを阻害することができる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、多量体タンパク質、抗体、ヒトモノクローナル抗体、抗体断片、アプタマー、キナーゼ阻害剤、受容体もしくは受容体断片、または核酸分子を含む任意の治療剤を含む。抗ＶＥＧＦ遺伝子産物は、細胞、組織または被験体にｉｎ ｖｉｖｏで送達された場合に、新たな血管の成長もしくは形成、および／または浮腫もしくは腫脹を低減することができる公知の治療用遺伝子産物のいずれか１つ、例えば、ラニビズマブ、ブロルシズマブまたはベバシズマブであり得る。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ遺伝子産物は、天然に存在するか、天然に存在しないか、または合成であり得る。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ遺伝子産物は、抗ＶＥＧＦ活性を付与するようにその後に修飾または変異した、天然に存在する分子に由来することができる。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ遺伝子産物は、融合タンパク質またはキメラタンパク質である。そのようなタンパク質において、機能的ドメインまたはポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでＶＥＧＦを隔絶することができるか、もしくはＶＥＧＦＲデコイとして機能することができる融合タンパク質またはキメラタンパク質を作製するために、部分またはポリペプチドに人工的に融合される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ遺伝子産物は、内因性ＶＥＧＦＲをそのリガンドとの相互作用からブロックする融合タンパク質またはキメラタンパク質である。
本明細書で使用される場合、「ＶＥＧＦ」は、他に必要とされない限り、限定されるものではないが、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＶＥＧＦ－Ｆ、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、またはそれらの任意の組合せ、または任意の機能的断片、またはバリアントを含む、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦファミリーメンバーの任意のアイソフォームを指し得る。本明細書で使用される場合、「ＶＥＧＦ受容体」または「ＶＥＧＦＲ」または「ＶＥＧＦ－Ｒ」は、限定されるものではないが、ＶＥＧＦＲ－１（またはＦｌｔ－１）、ＶＥＧＦＲ－２（またはＦｌｋ－１／ＫＤＲ）およびＶＥＧＦＲ－３（またはＦｌｔ－４）を含む、ＶＥＧＦの受容体のいずれか１つを指すために使用することができる。ＶＥＧＦＲは、受容体の、膜結合型もしくは可溶型、または機能的断片、または切断型であり得る。
本明細書で使用される場合、「ｓＦｌｔ－１タンパク質」は、他に明確に記述されない限り、ｓＦｌｔ－１タンパク質またはポリペプチドがＶＥＧＦおよび／もしくはＶＥＧＦ受容体に結合するような、天然に存在するヒトｓＦＬＴ－１配列と少なくとも９０％またはそれよりも高い相同性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を指す。相同性は、２つの配列の間のアライメントの残基の保存％を指す。天然に存在するヒトｓＦＬＴ－１タンパク質は、限定されるものではないが、機能的断片、挿入、欠失、置換を含む配列、偽断片、偽遺伝子、スプライスバリアント、または人工的に最適化された配列を含む、ｓＦＬＴ－１の任意の適切なバリアントを含み得る。
「動作可能に連結された」または「作動可能に連結された」または「カップリングされた」は、遺伝的エレメントの近位を指し得、ここで、エレメントは、予想される方法でそれらを操作することを可能にする関係性にある。例えば、プロモーターがコード配列の転写開始に役立つ場合、プロモーターは、コード領域に動作可能に連結され得る。この機能的関係が維持される限り、プロモーターおよびコード領域の間に介在残基が存在してもよい。
本明細書で使用される「発現ベクター」は、目的の遺伝子産物をコードし、意図する標的細胞中で遺伝子産物の発現をもたらすために使用される、ポリヌクレオチドを含む、上記で議論したか、または当技術分野において公知の、ベクター、例えば、プラスミド、ミニサークル、ウイルスベクター、リポソームなどを包含する。発現ベクターは、標的における遺伝子産物の発現を容易にするために、コード領域に動作可能に連結された制御エレメントも含み得る。制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ＵＴＲ、ｍｉＲＮＡ標的配列など、および発現のためにそれらが作動可能に連結された１つまたは複数の遺伝子の組合せは、「発現カセット」と称される場合がある。多くのそのような制御エレメントは公知であり、かつ当技術分野において利用可能であるか、または当技術分野において利用可能な成分から容易に構築することができる。
「遺伝子産物」は、特定の遺伝子の発現から生じる分子である。遺伝子産物は、例えば、ポリペプチド、アプタマー、干渉ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどを含む。特定の実施形態では、「遺伝子産物」は、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、または小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む干渉ＲＮＡである。特定の実施形態では、遺伝子産物は、治療用遺伝子産物、例えば、治療用タンパク質である。
「異種」という用語は、それが比較されている実体の残りとは遺伝子型で異なる実体を指し得る。例えば、異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに遺伝子操作技法によって導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドであり得る。そのネイティブコード配列から除去され、天然に見出されない連結でコード配列に動作可能に連結されたプロモーターは、異種プロモーターであり得る。
本明細書に記載の方法、組成物およびキットは、他に指示されない限り、当業者の技能範囲内である、分子生物学（組換え技法を含む）、細胞生物学、生化学、免疫化学および眼科技法の従来技法および記載を用い得る。そのような従来技法は、被験体における網膜または視覚の観察および分析、組換えウイルスのクローニングおよび増殖、医薬組成物の製剤化、ならびに生化学的精製および免疫化学のための方法を含む。適切な技法の具体的な実例は、本明細書における実施例への参照により得ることができる。しかしながら、当然ながら、等価な従来手順を使用することもできる。そのような従来技法および記載は、Green, et al., Eds., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series(Vols. I-IV) (1999)；Weiner, et al., Eds., Genetic Variation: A LaboratoryManual (2007)；Dieffenbach, Dveksler, Eds., PCR Primer: A Laboratory Manual(2003)；Bowtell and Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual (2003)；Mount,Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2004)；Sambrook and Russell,Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2006)；およびSambrookand Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002) (すべてCold SpringHarbor Laboratory Pressから)；Stryer, L., Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman,N.Y. (1995); Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach"IRL Press, London (1984)；Nelson and Cox, Lehninger, Principles of Biochemistry,3rd Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2000)；およびBerg et al., Biochemistry, 5thEd., W.H. Freeman Pub., New York (2002)などの標準実験室マニュアルに見出すことができ、これらのすべては、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される「バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質」は、ＡＡＶキャプシドタンパク質が、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に比べて少なくとも１つのアミノ酸の相違（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含み、ＡＡＶキャプシドタンパク質が、天然に存在するＡＡＶキャプシドタンパク質に存在するアミノ酸配列に対応しない、ＡＡＶキャプシドタンパク質を指す。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる結合と比較して、ヘパリンおよび／またはヘパラン硫酸プロテオグリカンへの増加した結合を与える。ある特定の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、ａ）対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、網膜細胞の増加した感染力；ｂ）対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンの指向性と比較して、変化した細胞指向性；および／またはｃ）対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、ＩＬＭに結合するおよび／またはＩＬＭを通過する増加した能力を与える。
本明細書で使用される「改変配列」は、親ＡＡＶまたは親ＡＡＶキャプシドタンパク質の対応する配列と比較して、１つもしくは複数の置換、挿入および／または欠失を含む配列を指す。
ＡＡＶのための「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）が哺乳動物細胞によって複製およびパッケージされるのを可能にするウイルスを指す。ＡＡＶのための各種のそのようなヘルパーウイルスは、当技術分野において公知であり、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニアなどのポックスウイルスを含む。アデノウイルスは、いくつかの異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳動物、および鳥類起源の多数のアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの保管所から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）を含み、これらもＡＴＣＣなどの保管所から入手可能である。
「ヘルパー機能」は、（本明細書に記載の複製およびパッケージングのための他の要件と併せて）ＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にするヘルパーウイルスゲノムにおいてコードされる機能を指す。本明細書に記載される場合、「ヘルパー機能」は、ヘルパーウイルスを提供すること、または例えば、必要な機能をコードするポリヌクレオチド配列をトランスで産生細胞に提供することを含む、いくつかの方法で提供され得る。例えば、１つまたは複数のアデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドまたは他の発現ベクターは、ｒＡＡＶベクターと一緒に産生細胞にトランスフェクトされる。
「感染性」ビリオンまたはウイルス粒子は、コンピテントに組み立てられたウイルスキャプシドを含み、そのウイルス種が向性である細胞にポリヌクレオチド成分を送達することができるものである。この用語は、ビリオンの任意の複製能力を必ずしも意味しない。感染性ビリオンを計数するためのアッセイは、本開示の他の箇所および当技術分野において記載される。ウイルスの感染力は、感染性ビリオンの全ビリオンに対する比として表すことができる。感染性ビリオンの全ビリオンに対する比を決定する方法は、当技術分野において公知である。例えば、Grainger et al. (2005) Mol. Ther. 11:S337 (describing a TCID50infectious titer assay)；およびZolotukhin et al. (1999) Gene Ther. 6:973を参照されたい。
ＩＩ．バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質
本明細書において、バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質を提供する。一部の実施形態では、本明細書に開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、親ＡＡＶキャプシドタンパク質に比べてアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変配列を含み、改変配列は、ＨＫＦＫＳＧＤ（配列番号１）を含み、アミノ酸残基の番号付けは、ＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質に対応する。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、親ＡＡＶキャプシドタンパク質に比べてアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変配列を含み、改変配列は、Ｘ１Ｘ２ＨＫＦＫＳＧＤＸ３（配列番号２）を含み、アミノ酸残基の番号付けは、ＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質に対応し、Ｘ１～３は、独立して任意のアミノ酸であり得る。一部の実施形態では、Ｘ１～３のそれぞれは、独立して、Ａ、Ｌ、Ｇ、ＳおよびＴから選択される。一部の実施形態では、Ｘ１～３のそれぞれは、独立して、Ａ、Ｌ、Ｇ、ＳおよびＴから選択される。一部の実施形態では、Ｘ１はＬである。一部の実施形態では、Ｘ２はＡである。一部の実施形態では、Ｘ３はＡである。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、親ＡＡＶキャプシドタンパク質に比べてアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変配列を含み、改変配列は、ＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３）、配列番号３と少なくとも８０％または少なくとも９０％の相同性を有する配列、配列番号３と少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、あるいは配列番号３内の４もしくはそれよりも多く、５もしくはそれよりも多く、６もしくはそれよりも多く、７もしくはそれよりも多く、８もしくはそれよりも多く、または９またはそれよりも多くの連続したアミノ酸を有する配列を含み、アミノ酸残基の番号付けは、ＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質に対応する。一部の実施形態では、改変配列は、ＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３）を含む。
本明細書において、ＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質に対応するアミノ酸の番号付けを使用して、キャプシドタンパク質（特定のアミノ酸の置換および挿入を含む）のアミノ酸改変に言及するが、これらのアミノ酸改変のいずれかも、例えば、ＡＡＶ５ ＶＰ１の位置に対応する位置で、他の血清型のＡＡＶのキャプシドタンパク質に導入されてもよいことが理解される。ＡＡＶタンパク質配列は、かなりの相同性および類似のアミノ酸番号付けを共有し、当業者は、ＡＡＶ５ ＶＰ１について本明細書に具体的に記載されるものに対応する他のＡＡＶ血清型におけるアミノ酸残基を容易に決定することができる。
一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ８）、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、またはヒツジＡＡＶのキャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３キャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質である。
一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、またはヒツジＡＡＶのキャプシドタンパク質のバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質のバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有するＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質のバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質のバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ハイブリッドキャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質およびＡＡＶ５キャプシドタンパク質のハイブリッドである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔキャプシドタンパク質、またはＡＡＶ２．５Ｔキャプシドタンパク質と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有するそのバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔキャプシドタンパク質、またはＡＡＶ２．５Ｔキャプシドタンパク質と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔキャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３キャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１キャプシドタンパク質、またはＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１キャプシドタンパク質（配列番号５）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有するそのバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１キャプシドタンパク質、またはＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１キャプシドタンパク質（配列番号５）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントである。
一部の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号４または配列番号５に記述されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するキャプシド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号４または配列番号５に記述されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するキャプシド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号６または配列番号７に記述されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の相同性を有するキャプシド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号６または配列番号７に記述されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するキャプシド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号６または配列番号７を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号７を含む。
特定の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、組換えＡＡＶビリオン中に存在する場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、網膜細胞の増加した感染力を与える。特定の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、組換えＡＡＶビリオン中に存在する場合、硝子体内注入によって投与される場合に、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、硝子体内注入によって投与される場合に、網膜細胞の増加した感染力を与える。一部の実施形態では、網膜細胞は、光受容細胞（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ）（例えば、杆体；錐体）、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、ミュラー細胞、アマクリン細胞、双極細胞、および水平細胞のうちの１つまたは複数である。特定の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、組換えＡＡＶビリオン中に存在する場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンの指向性と比較して、組換えＡＡＶビリオンに対する変更された指向性を与える。特定の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、組換えＡＡＶビリオン中に存在する場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンと比較して、硝子体内注入後に、ヘパリンおよび／もしくはヘパラン硫酸への増加した結合、ならびに／または内境界膜（ＩＬＭ）に結合およびそれを通過する増加した能力を与える。
ＩＩＩ．ポリヌクレオチドおよび細胞
本明細書において、本明細書に記載の１つまたは複数のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現ベクターである。一部の実施形態では、発現ベクターは、プロモーター配列、例えば、細胞中でポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーター配列に作動可能に連結された本明細書に記載の改変キャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、細胞は、宿主細胞である。宿主細胞は、改変キャプシドタンパク質を含むビリオンを産生するために使用され得る。例示的な宿主細胞としては、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）、微生物および酵母が挙げられる。一部の実施形態では、細胞は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶもしくはヒツジＡＡＶのｒｅｐタンパク質またはそれらのバリアントをコードするＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、細胞中で安定に維持される。
本明細書において、本明細書に記載の改変キャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞も提供する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現ベクターであり、発現ベクターは、プロモーター配列、例えば、細胞中でポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーター配列に作動可能に連結された本明細書に記載のバリアントキャプシドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、細胞中で安定に維持される。一部の実施形態では、細胞は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、細胞中で安定に維持される。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、ｒｅｐタンパク質、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶもしくはヒツジＡＡＶのｒｅｐタンパク質またはそれらのバリアントをコードする配列をさらに含む。
一部の実施形態では、細胞は、遺伝子産物、例えば、本明細書に記載の治療用遺伝子産物などの治療用遺伝子産物をコードする配列を含むポリヌクレオチドカセットをさらに含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、１つまたは複数のＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接している。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、ＡＡＶのＩＴＲの５’および３’末端において隣接している。一部の実施形態では、１つまたは複数のＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶもしくはヒツジＡＡＶのＩＴＲ、またはそれらのバリアントである。一部の実施形態では、１つまたは複数のＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶまたはヒツジＡＡＶのＩＴＲである。一部の実施形態では、１つまたは複数のＩＴＲは、ヌクレオチドの１つもしくは複数の挿入、欠失および／または置換を含む、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶまたはヒツジＡＡＶのＩＴＲである。
ＩＶ．ビリオンおよびそれを産生する方法
本明細書において、本明細書に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を含む、ビリオン、例えば、組換えＡＡＶビリオンも提供する。
一部の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、遺伝子産物、例えば、治療用遺伝子産物、例えば、本明細書に記載の治療用遺伝子産物をコードする配列を含むポリヌクレオチドカセットをさらに含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、１つまたは複数のＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶもしくはヒツジＡＡＶのＩＴＲ、またはそれらのバリアントと隣接している。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、ＡＡＶのＩＴＲの５’および３’末端において隣接している。一部の実施形態では、１つまたは複数のＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶもしくはヒツジＡＡＶのＩＴＲ、またはそれらのバリアントである。一部の実施形態では、１つまたは複数のＩＴＲは、１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換を含む、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶまたはヒツジＡＡＶのＩＴＲである。一部の実施形態では、１つまたは複数のＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶまたはヒツジＡＡＶのＩＴＲである。
ある特定の実施形態では、遺伝子産物は、被験体の網膜における血管新生、例えば、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を阻害する。多くの細胞因子がＣＮＶ生成の調節において重要な役割を果たすことが見出されており、その中でも、限定されるものではないが、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）および他のサイトカイン、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）が挙げられ得る。一部の実施形態では、遺伝子産物は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦ、ＨＩＦ、ＡｎｇおよびＭＡＰＫのうちの１つまたは複数の阻害剤である。
ある特定の実施形態では、遺伝子産物は、被験体の網膜における血管新生、例えば、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を阻害する。多くの細胞因子がＣＮＶ生成の調節において重要な役割を果たすことが見出されており、その中でも、限定されるものではないが、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）および他のサイトカイン、ならびにマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）が挙げられ得る。一部の実施形態では、遺伝子産物は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦ、ＨＩＦ、ＡｎｇおよびＭＡＰＫのうちの１つまたは複数の阻害剤である。
一部の実施形態では、遺伝子産物は、干渉ＲＮＡ、アプタマーまたはタンパク質である。一部の実施形態では、治療用遺伝子産物は、干渉ＲＮＡ、アプタマーまたはタンパク質である。一部の実施形態では、遺伝子産物（または治療用遺伝子産物）は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはタンパク質である。一部の実施形態では、遺伝子産物（または治療用遺伝子産物）は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、遺伝子産物（または治療用遺伝子産物）は、干渉ＲＮＡである。一部の実施形態では、遺伝子産物（または治療用遺伝子産物）は、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。
一部の実施形態では、遺伝子産物（または治療用遺伝子産物）は、抗ＶＥＧＦ遺伝子産物である。一部の実施形態では、遺伝子産物（または治療用遺伝子産物）は、抗ＶＥＧＦ干渉ＲＮＡである。一部の実施形態では、遺伝子産物（または治療用遺伝子産物）は、抗ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡまたは抗ＶＥＧＦ ｍｉＲＮＡである。
一部の実施形態では、遺伝子産物（または治療用遺伝子産物）は、アプタマーである。例示的な目的のアプタマーとしては、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するアプタマーが挙げられる。例えば、Ng et al. (2006) Nat. Rev. Drug Discovery 5:123；およびLee et al. (2005)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:18902を参照されたい。ＰＤＧＦ特異的アプタマー、例えば、Ｅ１００３０も使用のために適切であり、例えば、Niand Hui (2009) Ophthalmologica 223:401；およびAkiyama et al. (2006) J. CellPhysiol. 207:407を参照されたい。
一部の実施形態では、遺伝子産物（または治療用遺伝子産物）は、タンパク質である。タンパク質は、一般に、網膜細胞の機能、例えば、杆体もしくは錐体光受容細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞または網膜色素上皮細胞の機能を増強するタンパク質である。例示的なタンパク質としては、神経保護ポリペプチド（例えば、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ４、ＮＧＦおよびＮＴＮ）；抗血管新生ポリペプチド（例えば、可溶性血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、ＶＥＧＦ結合抗体、ＶＥＧＦ結合抗体断片（例えば、一本鎖抗ＶＥＧＦ抗体）；エンドスタチン；タムスタチン；アンギオスタチン；可溶性Ｆｌｔタンパク質（Lai et al. (2005) Mol. Ther. 12:659）；可溶性Ｆｌｔタンパク質を含むＦｃ融合タンパク質（例えば、Pechanet al. (2009) Gene Ther. 16:10を参照されたい）；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）；可溶性Ｔｉｅ－２受容体等）；メタロプロテイナーゼ－３（ＴＩＭＰ－３）の組織阻害剤；オプシン、例えば、ロドプシン；抗アポトーシスポリペプチド（例えば、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－Ｘｌ）などが挙げられる。適切なポリペプチドとしては、限定されるものではないが、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；線維芽細胞増殖因子２；ニュールツリン（ＮＴＮ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；神経成長因子（ＮＧＦ）；ニューロトロフィン－４（ＮＴ４）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；上皮成長因子；ロドプシン；アポトーシスのＸ連鎖阻害剤；およびソニックヘッジホッグが挙げられる。
適切なオプシンとしては、例えば、米国特許出願公開第２００７／０２６１１２７号（例えば、ＣｈＲ２；Ｃｈｏｐ２）；米国特許出願公開第２００１／００８６４２１号；米国特許出願公開第２０１０／００１５０９５号；およびDiester et al. (2011) Nat. Neurosci. 14:387に記載の光応答性オプシンが挙げられる。
適切なタンパク質としては、レチノスキシンも挙げられる。適切なポリペプチドとしては、例えば、網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＧＰＲ）相互作用タンパク質－１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ９６ＫＮ７、Ｑ９ＥＰＱ２、およびＱ９ＧＬＭ３を参照されたい）；ペリフェリン－２（Ｐｒｐｈ２）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００３１３；およびTravis et al. (1991) Genomics 10:733を参照されたい）；ペリフェリン；網膜色素上皮特異的タンパク質（ＲＰＥ６５）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ３９６６０；およびMorimuraet al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3088を参照されたい）などが挙げられる。
適切なタンパク質としては、欠陥があるか、または欠損している場合に、全脈絡膜萎縮を引き起こすポリペプチドである、ＣＨＭ（全脈絡膜萎縮（Ｒａｂエスコートタンパク質１））（例えば、Donnelly et al. (1994) Hum. Mol. Genet. 3:1017；およびvan Bokhoven etal. (1994) Hum. Mol. Genet. 3:1041を参照されたい）；ならびに欠陥があるか、または欠損している場合に、レーバー先天黒内障および網膜色素変性症を引き起こすポリペプチドである、Ｃｒｕｍｂｓホモログ１（ＣＲＢ１）（例えば、denHollander et al. (1999) Nat. Genet. 23:217；およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＭ２３３２８を参照されたい）も挙げられる。
適切なタンパク質としては、欠陥があるか、または欠損している場合に、全色盲をもたらすタンパク質も挙げられ、ここで、そのようなポリペプチドとしては、例えば、錐体光受容細胞ｃＧＭＰゲートチャネルサブユニットアルファ（ＣＮＧＡ３）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２８９；およびBooij et al. (2011) Ophthalmology 118:160-167を参照されたい）；錐体光受容細胞ｃＧＭＰゲートカチオンチャネルベータサブユニット（ＣＮＧＢ３）（例えば、Kohlet al.(2005) Eur J Hum Genet. 13(3):302を参照されたい）；グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）；アルファ形質導入活性ポリペプチド２（ＧＮＡＴ２）（ＡＣＨＭ４）；およびＡＣＨＭ５；ならびに欠陥があるか、または欠失している場合に、さまざまな形態の色盲をもたらすポリペプチド（例えば、Ｌ－オプシン、Ｍ－オプシンおよびＳ－オプシン）が挙げられる。Mancusoet al. (2009) Nature 461(7265):784-787を参照されたい。
一部の実施形態では、遺伝子産物（または治療用遺伝子産物）は、抗ＶＥＧＦタンパク質である。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦタンパク質は、ｓＦｌｔ－１タンパク質もしくはその断片、または抗ＶＥＧＦ抗体もしくはその断片である。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦタンパク質は、抗ＶＥＧＦ抗体またはその断片、例えば、アフリベルセプト、ラニビズマブおよびベバシズマブまたはそれらの断片である。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦタンパク質は、ｓＦｌｔ－１タンパク質である。
ＶＥＧＦ受容体のＦＬＴ－１の可溶性切断型、ｓＦＬＴ－１は、ＶＥＧＦの唯一の公知の内因性特異的阻害剤である。天然では、これは、選択的ｍＲＮＡスプライシングによって生成し、膜近位免疫グロブリン様ドメイン、膜貫通領域および細胞内チロシンキナーゼドメインを欠く。構造的に、ＦＬＴ－１およびｓＦＬＴ－１タンパク質は、両方とも複数の機能的ドメインを含み得る。一部のバリアントでは、ＦＬＴおよびｓＦＬＴタンパク質は、通常、６つの連結ドメインを共有し、３つのドメインは、タンパク質の二量体化に関与し、３つのドメインは、ＶＥＧＦなどのリガンドの結合に関与する。ｓＦＬＴ－１は、細胞膜に限定されない。未結合のｓＦＬＴ－１は、細胞外の空間または溶液中で自由に拡散し得る。
ｓＦＬＴ－１およびＶＥＧＦ受容体の間の相互作用は、特異的であり、１００倍過剰の非標識ＶＥＧＦと競合し得る。一部の場合では、ｓＦＬＴ－１の血管新生抑制活性は、２つの機構：ｉ）高親和性で結合するＶＥＧＦの隔離、およびｉｉ）ＶＥＧＦ受容体のＦＬＴｔ－１およびＦＬＫ－１／ＫＤＲの膜貫通型アイソフォームとの不活性ヘテロ二量体の形成による、ＶＥＧＦの阻害から生じ得る。当技術分野において公知であるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイは、ｓＦＬＴ－１が高親和性でＶＥＧＦと結合すること、およびヒト臍帯静脈内皮細胞のＶＥＧＦ駆動性増殖も阻害し得ることを示す。がんについての動物モデルでは、ｓＦＬＴ－１は、腫瘍成長を阻害する。一部の場合では、ｓＦＬＴ－１は、細胞外空間の過剰のＶＥＧＦがＶＥＧＦ受容体の結合およびその後の活性化を防止し得るので、準化学量論的またはドミナントネガティブの方法で機能し得る。ｓＦＬＴ－１のこれらの性質は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるKendall and Thomas, 1993; Proc Natl Acad Sci. 90: 10705-10709に記載されている。ｓＦＬＴ－１の機能的断片は、全長タンパク質の代わりに使用することができる。より具体的には、ＶＥＧＦ結合ドメイン（ドメイン２）または代替としてｓＦＬＴ－１のドメイン２とｓＦＬＴ１由来のドメイン３、ＫＤＲまたは別のファミリーメンバーは、ＶＥＧＦに結合し、不活性化するために使用することができる。そのような機能的断片は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるWiesmannet al., 1997; Cell, 91: 695-704に記載される。
一部の実施形態では、ｓＦｌｔ－１タンパク質は、米国特許第５，８６１，４８４号および米国特許出願公開第２０１３／０３２３３０２号の配列番号１０９によって開示される配列に記載の天然に存在するタンパク質ｓＦｌｔ－１である。例示的なｓＦｌｔ－１アミノ酸配列を、本明細書において配列番号１３として開示する。これはまた、限定されるものではないが、ｓＦｌｔ－１ドメイン２の配列、または米国特許出願公開第２０１３／０３２３３０２号の配列番号１２１に記述されるもの、および米国特許第７，６３５，４７４号に開示されるＶＥＧＦ結合融合タンパク質などの関連構築物を含む、その機能的断片も挙げられる。例示的なｓＦｌｔ－１機能的断片は、本明細書において配列番号１４として開示する。一部の実施形態では、ｓＦＬＴ－１タンパク質は、配列番号１３または１４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％もしくは１００％相同である。一部の実施形態では、ｓＦＬＴ－１タンパク質は、配列番号１３または１４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％もしくは１００％の配列同一性を有する。抗ＶＥＧＦタンパク質は、米国特許出願公開第２０１３／０３２３３０２号に記載のｓＦＬＴ－１タンパク質、そのバリアントまたは断片のいずれかも含み得る。
一部の実施形態では、ｓＦＬＴ－１タンパク質は、天然に存在するヒトｓＦＬＴ－１タンパク質配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％もしくは１００％相同である。一部の実施形態では、ｓＦＬＴ－１タンパク質は、天然に存在するヒトｓＦＬＴ－１タンパク質配列と最大で約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％もしくは１００％相同である。一部の実施形態では、ｓＦＬＴ－１タンパク質は、天然に存在するヒトｓＦＬＴ－１タンパク質配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％もしくは１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ｓＦＬＴ－１タンパク質は、天然に存在するヒトｓＦＬＴ－１タンパク質配列と最大で約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％もしくは１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ｓＦＬＴ－１タンパク質は、天然に存在するヒトｓＦＬＴ－１タンパク質のコンフォメーションと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％もしくは１００％空間的に相同である。一部の場合では、ｓＦＬＴ－１タンパク質は、天然に存在するヒトｓＦＬＴ－１タンパク質のコンフォメーションと最大で約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％もしくは１００％空間的に相同である。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦタンパク質は、抗ＶＥＧＦ抗体である。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦタンパク質は、ラニビズマブ（商標Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）で市販（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、ラニビズマブの重鎖および軽鎖可変領域の配列について米国特許第７，０６０，２６９号の図１を参照されたい）；ベバシズマブ（商標Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）で市販（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、ベバシズマブの重鎖および軽鎖可変領域の配列について米国特許第６，０５４，２９７号の図１を参照されたい）；アフリベルセプト（商標Ｅｙｌｅａ（登録商標）で市販（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ））；またはブロルシズマブ、米国特許第１０，０３５，８５０号を参照されたい；である。ある特定の実施形態では、ベバシズマブは、以下の重鎖および軽鎖可変ドメインの配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTL（配列番号８）；およびDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV（配列番号９）をそれぞれ含む。ある特定の実施形態では、ラニビズマブは、以下の重鎖および軽鎖可変ドメインの配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTL（配列番号１０）；およびDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV（配列番号１１）をそれぞれ含む。ある特定の実施形態では、アフリベルセプトは、以下のアミノ酸配列：
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１２）を含む。ある特定の実施形態では、アフリベルセプトは、以下のアミノ酸配列：
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEIIHSWLAWYQQKPGKAPKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNVYLASTNGANFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVRQAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGQGTLVTVSS（配列番号１５）を含む。
これらの配列は、当業者によって理解される標準的な技法である遺伝コードを使用して、そのような配列をコードするＤＮＡから発現させることができる。当業者によって理解され得るように、遺伝コードの縮重に起因して、抗ＶＥＧＦタンパク質配列は、いくつかの異なるＤＮＡ配列から容易に発現させることができる。
一部の場合では、遺伝子産物（または治療用遺伝子産物）は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的エンドヌクレアーゼであり、例えば、ここで、エンドヌクレアーゼは、網膜疾患に関連する対立遺伝子をノックアウトする。例えば、野生型の場合に、網膜構造タンパク質であり、および／または正常な網膜機能を提供する遺伝子の欠陥のあるコピーを優性対立遺伝子がコードする場合、部位特異的エンドヌクレアーゼは、欠陥のある対立遺伝子に標的化され、欠陥のある対立遺伝子をノックアウトすることができる。
欠陥のある対立遺伝子をノックアウトすることに加えて、部位特異的ヌクレアーゼは、欠陥のある対立遺伝子によってコードされるタンパク質の機能的コピーをコードするドナーＤＮＡを用いた相同組換えを刺激するために使用することもできる。したがって、例えば、ウイルスベクターを、欠陥のある対立遺伝子をノックアウトする部位特異的エンドヌクレアーゼを送達するために使用することができ、かつ欠陥のある対立遺伝子の機能的コピーを送達するために使用することができ、これにより、欠陥のある対立遺伝子の修復がもたらされ、それによって機能的網膜タンパク質（例えば、機能的レチノスキシン、機能的ＲＰＥ６５、機能的ペリフェリンなど）の産生が提供される。例えば、Li et al. (2011) Nature 475:217を参照されたい。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする異種ヌクレオチド配列、および欠陥のある対立遺伝子の機能的コピーをコードする異種ヌクレオチド配列を含み、ここで、機能的コピーは、機能的網膜タンパク質をコードする。機能的網膜タンパク質としては、例えば、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＧＰＲ）相互作用タンパク質－１、ペリフェリン、ペリフェリン－２などが挙げられる。
使用のために適切な部位特異的エンドヌクレアーゼとしては、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられ、ここで、そのような部位特異的エンドヌクレアーゼは、天然に存在せず、特定の遺伝子を標的にするように改変されている。そのような部位特異的ヌクレアーゼを操作して、ゲノム内の特定の位置を切断することができ、次いで、非相同末端結合は、いくつかのヌクレオチドを挿入または欠失するが、切断を修復することができる。次いで、そのような挿入または欠失（「ＩＮＤＥＬ」とも称される）は、タンパク質を読み枠から外し、遺伝子を効果的にノックアウトする。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。
一部の実施形態では、遺伝子産物をコードする配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、遺伝子産物をコードする配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結されている。他の実施形態では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。一部の例では、遺伝子産物をコードする配列は、組織特異的または細胞型特異的調節エレメントに作動可能に連結されている。例えば、一部の例では、遺伝子産物をコードする配列は、光受容細胞特異的調節エレメント（例えば、光受容細胞特異的プロモーター）、例えば、光受容細胞の作動可能に連結した遺伝子の選択的発現を与える調節エレメントに作動可能に連結されている。適切な光受容細胞特異的調節エレメントとしては、例えば、ロドプシンプロモーター；ロドプシンキナーゼプロモーター（Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076）；ベータホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Nicoudet al. (2007) J. Gene Med. 9:1015）；網膜色素変性症遺伝子プロモーター（Nicoud et al. (2007)、上記）；光受容細胞間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Nicoudet al. (2007)、上記）；ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Yokoyama et al. (1992) Exp Eye Res. 55:225）が挙げられる。
特定の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、例えば、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍の親和性で、ヘパリンおよび／またはヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合することができる。特定の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、例えば、ＡＡＶ５ビリオンと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍の親和性で、ヘパリンおよび／またはヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合することができる。特定の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、例えば、ＡＡＶ２．５Ｔビリオンと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍の親和性で、ヘパリンおよび／またはヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合することができる。
特定の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、例えば、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍の親和性で、内境界膜（ＩＬＭ）に結合することができる。特定の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、例えば、ＡＡＶ５ビリオンと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍の親和性で、内境界膜（ＩＬＭ）に結合することができる。特定の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、例えば、ＡＡＶ２．５Ｔビリオンと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍の親和性で、内境界膜（ＩＬＭ）に結合することができる。
特定の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、網膜細胞の増加した感染力を有する。特定の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、ＩＬＭを通過することができる。特定の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、網膜細胞の増加した感染力を有し、ＩＬＭを通過することができる。特定の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ５ビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、網膜細胞の増加した感染力を有する。特定の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ２．５Ｔビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、網膜細胞の増加した感染力を有する。特定の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、哺乳動物に硝子体内注入される場合に、網膜の細胞に形質導入することができる。特定の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、ＩＬＭを通過することができる。特定の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、硝子体内注入によって投与される場合に、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、硝子体内注入によって投与される場合に、網膜細胞の増加した感染力を有する。特定の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、硝子体内注入によって投与される場合に、ＡＡＶ５ビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、硝子体内注入によって投与される場合に、網膜細胞の増加した感染力を有する。特定の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、硝子体内注入によって投与される場合に、ＡＡＶ２．５Ｔビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、硝子体内注入によって投与される場合に、網膜細胞の増加した感染力を有する。一部の実施形態では、網膜細胞は、光受容細胞（例えば、杆体；錐体）、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、ミュラー細胞、アマクリン細胞、双極細胞、および水平細胞のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、網膜細胞は、ミュラー細胞、錐体細胞、杆体細胞、双極細胞および／またはＲＰＥ細胞である。一部の実施形態では、網膜細胞は、ミュラー細胞である。一部の実施形態では、網膜細胞は、錐体細胞である。一部の実施形態では、網膜細胞は、双極細胞である。一部の実施形態では、網膜細胞は、ＲＰＥ細胞である。
特定の実施形態では、本明細書に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンは、硝子体内注入を介して送達される場合に、遺伝子産物（治療用遺伝子産物など）を網膜に送達することができ、例えば、ここで、得られる発現は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む対応する組換えＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍高い。特定の実施形態では、本明細書に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンは、硝子体内注入を介して送達される場合に、遺伝子産物を網膜に送達することができ、例えば、ここで、得られる発現は、ＡＡＶ５および／またはＡＡＶ２．５Ｔベクターと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍高い。
トランスフェクション、安定細胞系産生、ならびにアデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド（Conway, JE et al., (1997) J. Virology 71(11):8780-8789）およびバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッドを含む感染性ハイブリッドウイルス産生系を含む、組換えＡＡＶビリオンの産生のための多数の方法が当技術分野において公知である。ｒＡＡＶウイルス粒子の産生のためのｒＡＡＶ産生培養は、１）適切な宿主細胞、２）適切なヘルパーウイルス機能、３）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、４）少なくとも１つのＡＡＶのＩＴＲ配列（例えば、特大のｒＡＡＶベクターゲノム）と隣接している核酸（遺伝子産物をコードする配列など）、ならびに５）ｒＡＡＶ産生をサポートする適切な培地および培地成分のすべてを必要とする。一部の実施形態では、適切な宿主細胞は、霊長類宿主細胞である。一部の実施形態では、適切な宿主細胞は、ＨｅＬａ、Ａ５４９、２９３またはＰｅｒｃ．６細胞などのヒト由来細胞系である。
一部の実施形態では、適切なヘルパー機能は、野生型もしくは変異体アデノウイルス（温度感受性アデノウイルスなど）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミド構築物によって提供される。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルスまたはＨＳＶによって提供される。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能は、バキュロウイルスによって提供され、宿主細胞は、昆虫細胞（例えば、Spodoptera frugiperda（Ｓｆ９）細胞）である。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶビリオンは、昆虫細胞において産生された。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶビリオンは、Spodoptera frugiperda（Ｓｆ９）細胞において産生された。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶビリオンは、ヒト由来細胞系において産生された。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶビリオンは、ＨｅＬａ、Ａ５４９、２９３またはＰｅｒｃ．６細胞において産生された。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶビリオンは、ＨＥＫ－２９３細胞において産生された。
一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、任意のＡＡＶ血清型由来であり得る。一般に、拘束力はないが、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、ｒｅｐ遺伝子によってコードされるｒｅｐタンパク質が、ｒＡＡＶゲノムを複製およびパッケージするように機能し得る限り、ｒＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲと同じ血清型のものである。
当技術分野において公知の適切な培地が、ｒＡＡＶベクターの産生のために使用され得る。これらの培地としては、限定されないが、改変イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含むＨｙｃｌｏｎｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨによって作製される培地、特に、組換えＡＡＶベクターの産生における使用のためのカスタム培地調合に関して、そのそれぞれが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５６６，１１８号に記載のものなどのカスタム調合、および米国特許第６，７２３，５５１号に記載のＳｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地が挙げられる。
ｒＡＡＶビリオンを産生するための１つの方法は、トリプルトランスフェクション方法である。簡潔には、ｒｅｐ遺伝子、および本明細書に開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドなどのキャプシド遺伝子を含有するプラスミドを、ヘルパーアデノウイルスプラスミドと一緒に細胞系（例えば、ＨＥＫ－２９３細胞）に（例えば、リン酸カルシウム方法を使用して）トランスフェクトしてもよく、ビリオンを収集し、必要に応じて精製してもよい。そのように、一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ベクターゲノム、本明細書に開示のバリアントキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドなどのＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸の宿主細胞へのトリプルトランスフェクションによって産生し、ここで、宿主細胞への核酸のトランスフェクションは、ｒＡＡＶビリオンを産生することができる宿主細胞を生成する。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、Martin et al., (2013)Human Gene Therapy Methods 24:253-269；米国特許出願公開第２００４／０２２４４１１号；およびLiu, X.L. etal. (1999) Gene Ther. 6:293-299に記載の例示的な産生細胞系方法などの産生細胞系方法によって産生され得る。簡潔には、細胞系（例えば、ＨｅＬａ、２９３、Ａ５４９またはＰｅｒｃ．６細胞系）を、ｒｅｐ遺伝子、本明細書に開示のバリアントキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドなどのキャプシド遺伝子、およびベクターゲノムを含有するプラスミドで安定にトランスフェクトしてもよい。細胞系を、スクリーニングしてｒＡＡＶ産生のためのリードクローンを選択してもよく、これを、次いで、産生バイオリアクターに拡大し、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたはＨＳＶ）を感染させて、ｒＡＡＶ産生を開始させてもよい。その後、ビリオンを回収してもよく、アデノウイルスを、不活性化（例えば、熱により）および／または除去してもよく、ｒＡＡＶビリオンを精製してもよい。このように、一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｒＡＡＶゲノムをコードする核酸、ＡＡＶ ｒｅｐをコードする核酸、本明細書に開示のバリアントキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸のうちの１つまたは複数を含む、産生細胞系によって産生された。
一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子および／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、産生細胞系において安定に維持される。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子および／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、１つまたは複数のプラスミドにおいて細胞系に導入されて、産生細胞系を生成する。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶゲノムは、同じプラスミドで細胞に導入される。他の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐおよびｒＡＡＶゲノムは、２つまたはそれよりも多くの異なるプラスミドで細胞に導入される。一部の実施形態では、プラスミドで安定にトランスフェクトされる細胞系は、複数回の細胞系の継代（例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０回、または５０回を超える細胞系の継代）にわたってプラスミドを維持する。例えば、プラスミドは、細胞複製物として複製されてもよく、またはプラスミドは、細胞ゲノムに組み込まれてもよい。プラスミドが細胞（例えば、ヒト細胞）において自律的に複製するのを可能にする各種の配列が、特定されている（例えば、Krysan, P.J. et al. (1989) Mol. Cell Biol. 9:1026-1033を参照されたい）。一部の実施形態では、プラスミドは、プラスミドを維持する細胞の選択を可能にする選択マーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）を含有していてもよい。哺乳動物細胞において一般に使用される選択マーカーとしては、限定されないが、ブラストサイジン、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、ゼオシン、ピューロマイシン、およびそれらの誘導体が挙げられる。核酸を細胞に導入するための方法は、当技術分野において公知であり、限定されないが、ウイルス形質導入、カチオン性トランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ－デキストランなどのカチオン性ポリマー、またはリポフェクタミンなどのカチオン性脂質を使用する）、リン酸カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、電気穿孔、およびナノ粒子トランスフェクションが挙げられる（より詳細について、例えば、Kim,T.K. and Eberwine, J.H. (2010) Anal. Bioanal. Chem. 397:3173-3178を参照されたい）。
一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子および／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、産生細胞系のゲノムに安定に組み込まれる。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子および／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、１つまたは複数のプラスミドにおいて細胞系に導入されて、産生細胞系を生成する。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶゲノムは、同じプラスミドで細胞に導入される。他の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶゲノムは、２つまたはそれよりも多くの異なるプラスミドで細胞に導入される。一部の実施形態では、プラスミドは、プラスミドを維持する細胞の選択を可能にする選択マーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）を含有していてもよい。各種の宿主細胞系への核酸の安定な組み込みのための方法は公知である。例えば、反復選択（例えば、選択マーカーの使用による）を、選択マーカー（ならびにＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子および／またはｒＡＡＶゲノム）を含有する核酸が組み込まれている細胞について選択するために使用してもよい。他の実施形態では、核酸は、部位特異的な方法で細胞系に組み込まれて、産生細胞系が生成し得る。ＦＬＰ／ＦＲＴ（例えば、O'Gorman, S. et al. (1991) Science 251:1351-1355を参照されたい）、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ（例えば、Sauer,B. and Henderson, N. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5166-5170を参照されたい）、およびｐｈｉ Ｃ３１－ａｔｔ（例えば、Groth,A.C. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:5995-6000を参照されたい）などのいくつかの部位特異的組換え系が、当技術分野において公知である。
一部の実施形態では、産生細胞系は、霊長類細胞系（例えば、ＶｅｒｏまたはＦＲｈＬ－２細胞系などの非ヒト霊長類細胞系）に由来する。一部の実施形態では、細胞系は、ヒト細胞系に由来する。一部の実施形態では、産生細胞系は、ＨｅＬａ、２９３、Ａ５４９またはＰＥＲＣ．６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）細胞に由来する。例えば、産生細胞系を生成するためのＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子および／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸の細胞系への導入ならびに／または安定な維持／組み込みの前に、細胞系は、ＨｅＬａ、２９３、Ａ５４９もしくはＰＥＲＣ．６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）細胞系、またはそれらの誘導体である。
一部の実施形態では、産生細胞系は、懸濁物中での成長に適合する。公知であるように、足場依存性細胞は、典型的には、マイクロキャリアビーズなどの基材なしで懸濁物中において成長することはできない。細胞系を、懸濁物中での成長に適合させることには、例えば、撹拌パドルによる撹拌培養において細胞系を成長させること、集塊を防止するためにカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを欠く培養培地（および必要に応じて消泡剤）を使用すること、シリコン処理化合物でコーティングされた培養容器を使用すること、ならびにそれぞれの継代で培養物（大きな凝集塊中でも容器の側面でもなく）中の細胞を選択することを含み得る。さらなる説明については、例えば、ＡＴＣＣのよくある質問の文書（ｗｗｗ［ｄｏｔ］ａｔｃｃ［ｄｏｔ］ｏｒｇ／Ｇｌｏｂａｌ／ＦＡＱｓ／９／１／Ａｄａｐｔｉｎｇ％２０ａ％２０ｍｏｎｏｌａｙｅｒ％２０ｃｅｌｌ％２０ｌｉｎｅ％２０ｔｏ％２０ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ－４０［ｄｏｔ］ａｓｐｘ）で入手可能）およびそこで引用される参考文献を参照されたい。
一部の態様では、本明細書に開示のｒＡＡＶビリオンを産生するための方法であって、（ａ）ｒＡＡＶビリオンが産生される条件下で宿主細胞を培養するステップであって、宿主細胞が、（ｉ）本明細書に開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶのＩＴＲと隣接している遺伝子産物、例えば、治療用遺伝子産物をコードする配列を含むポリヌクレオチドカセット；および（ｉｖ）ＡＡＶヘルパー機能を含む、ステップ；ならびに（ｂ）宿主細胞によって産生されたｒＡＡＶビリオンを回収するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、前記少なくとも１つのＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶまたはヒツジＡＡＶの血清型ＩＴＲなどからなる群より選択される。一部の実施形態では、方法は、ｒＡＡＶビリオンを精製するステップをさらに含む。
本発明の適切なｒＡＡＶ産生培養培地は、血清または血清由来の組換えタンパク質が０．５％～２０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）のレベルで補充されていてもよい。あるいは、当技術分野において公知であるように、ｒＡＡＶビリオンは、動物由来産物なしの培地とも称され得る血清不含条件において産生されてもよい。当業者は、ｒＡＡＶビリオンの産生をサポートするように設計された市販または特注の培地が、産生培養物においてｒＡＡＶの力価を増加させるために、限定されないが、グルコース、ビタミン、アミノ酸および／または成長因子を含む、当技術分野において公知の１つまたは複数の細胞培養成分も補充されていてもよいことを理解し得る。
ｒＡＡＶ産生培養物は、特定の宿主細胞を用いるのに適切な各種の条件下（広い温度範囲にわたって、さまざまな時間の長さなど）で成長することができる。当技術分野において公知であるように、ｒＡＡＶ産生培養物は、例えば、ローラーボトル、中空繊維フィルター、マイクロキャリア、および充填床もしくは流動床バイオリアクターなどの適切な付着依存性容器において培養することができる、付着依存性培養物を含む。ｒＡＡＶ産生培養物は、例えば、スピナーフラスコ、撹拌漕バイオリアクター、およびＷａｖｅバッグシステムなどの使い捨てシステムを含む各種の方法で培養することができる、ＨｅＬａ、２９３およびＳＦ－９細胞などの懸濁適合宿主細胞も含み得る。
Ｖ．組成物
本明細書において、本明細書に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を含む本明細書に開示の組換えＡＡＶビリオンを含む組成物も提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に開示の組換えＡＡＶビリオン、および１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含む医薬組成物である。
組換えＡＡＶビリオンは、一般に、安全で、非毒性で望ましく、かつ霊長類の使用のために許容される賦形剤を含む、製剤の調製に有用な薬学的に許容される担体、希釈剤および試薬と組み合わせることができる。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合にはガス状であり得る。そのような担体または希釈剤の例としては、限定されるものではないが、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース液、および５％のヒト血清アルブミンが挙げられる。追加の活性化合物を製剤に組み込むこともできる。製剤のために使用される溶液または懸濁物は、注射用水、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌化合物；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化合物；酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液またはリン酸緩衝液などの緩衝液；凝集を防止するためのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０などの洗剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整するための化合物を含むことができる。ｐＨは、塩酸もしくは水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。特定の実施形態では、医薬組成物は、無菌である。眼細胞をｉｎ ｖｉｖｏで接触させる例では、組換えＡＡＶビリオンを、眼への送達のために必要に応じて処理することができる。
医薬組成物は、無菌の注射溶液または分散物の即時調製のための、無菌水溶液または分散物および無菌粉末をさらに含んでいてもよい。静脈内投与のために、適切な担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、静菌性の水、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。一部の例では、組成物は、無菌であり、容易な注射針通過性（syringability）が存在する程度に流動性でなければならない。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、製造および保管の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含有する、例えば、溶媒または分散媒であり得る。適した流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、１つもしくは複数の等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどの多価アルコール、および塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含む。
無菌溶液は、適した溶媒に必要な量で組換えＡＡＶビリオンを、上記に列挙した構成成分の１つまたは組合せで組み込むこと、必要により、その後濾過滅菌を行うことによって、調製することができる。一般に、分散物は、活性化合物を、基本の分散媒および上記に列挙したものからの必要な他の構成成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって、調製される。無菌で注入可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合では、調製の方法は、限定されるものではないが、活性成分の粉末と、事前に滅菌濾過されたその溶液から任意の追加の所望の構成成分とを生じる、真空乾燥および凍結乾燥を含む。
一部の実施形態では、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤などの医薬組成物は、身体からの迅速な排出からウイルスベクターを保護する担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞に標的化されるリポソームを含む）を、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の薬学的に許容される担体として使用することもできる。
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物、眼科用組成物または非経口組成物を製剤化することが有利であり得る。本明細書で使用する投薬単位形態とは、処置される被験体に対する単位投薬量として適切な物理的に別個の単位を指し得、それぞれの単位は、所望の治療効果を生じるように計算された、所定量の活性化合物を含有する。
哺乳動物細胞に効率的に形質導入するのに適切な任意の濃度の組換えＡＡＶビリオンを調製することができる。例えば、組換えＡＡＶビリオンは、１ｍＬあたり約１０８ベクターゲノムまたはそれよりも高い濃度、例えば、１ｍＬあたり約５×１０８ベクターゲノム、１ｍＬあたり約１０９ベクターゲノム、１ｍＬあたり約５×１０９ベクターゲノム、１ｍＬあたり約１０１０ベクターゲノム、１ｍＬあたり約５×１０１０ベクターゲノム、１ｍＬあたり約１０１１ベクターゲノム、１ｍＬあたり約５×１０１１ベクターゲノム、１ｍＬあたり約１０１２ベクターゲノム、１ｍＬあたり約５×１０１２ベクターゲノム、１ｍＬあたり約１０１３ベクターゲノム、１ｍＬあたり約１．５×１０１３ベクターゲノム、１ｍＬあたり約３×１０１３ベクターゲノム、１ｍＬあたり約５×１０１３ベクターゲノム、１ｍＬあたり約７．５×１０１３ベクターゲノム、１ｍＬあたり約９×１０１３ベクターゲノム、１ｍＬあたり約１×１０１４ベクターゲノムもしくは１ｍＬあたり約５×１０１４ベクターゲノム、またはそれよりも高い濃度で製剤化され得る。一部の実施形態では、ウイルス粒子は、１ｍＬあたり約１×１０１５ベクターゲノムを超えない濃度で製剤化され得る。
組換えＡＡＶビリオンは、限定されないが、約１×１０８ベクターゲノムまたはそれよりも高い、例えば、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、もしくは約１×１０１３ベクターゲノムまたはそれよりも高い、あるいはある特定の例では、約１×１０１４ベクターゲノムを含む任意の適切な単位投薬量に製剤化され得る。一部の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、約４×１０１５ベクターゲノムを超えない任意の適切な単位投薬量に製剤化され得る。一部の場合では、単位投薬量は、最大で約５×１０１５ベクターゲノム、例えば、約１×１０１４ベクターゲノムもしくはそれよりも低い、例えば、約１×１０１３、約１×１０１２、約１×１０１１、約１×１０１０、または約１×１０９ベクターゲノムもしくはそれよりも低い、あるいはある特定の例では、約１×１０８ベクターゲノムもしくはそれよりも低い。一部の実施形態では、組換えＡＡＶビリオンは、約１×１０８ベクターゲノム以上の任意の適切な単位投薬量に製剤化され得る。一部の場合では、単位投薬量は、約１×１０１０～約１×１０１１ベクターゲノムである。一部の場合では、単位投薬量は、約１×１０１０～約３×１０１２ベクターゲノムである。一部の場合では、単位投薬量は、約１×１０９～約３×１０１３ベクターゲノムである。一部の場合では、単位投薬量は、約１×１０８～約３×１０１４ベクターゲノムである。
一部の場合では、医薬組成物の単位投薬量は、感染多重度（ＭＯＩ）を使用して測定してもよい。ＭＯＩとは、ウイルスゲノムの核酸が送達され得る細胞に対する比または倍数を意味する。一部の場合では、ＭＯＩは、約１×１０６であり得る。一部の場合では、ＭＯＩは、約１×１０５～約１×１０７であり得る。一部の場合では、ＭＯＩは、約１×１０４～約１×１０８であり得る。一部の場合では、本開示の組換えビリオンは、少なくとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７および１×１０１８のＭＯＩのいずれかである。一部の場合では、本開示の組換えＡＡＶビリオンは、約１×１０８～３×１０１４のＭＯＩである。一部の場合では、本開示の組換えＡＡＶビリオンは、最大で約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７および１×１０１８のＭＯＩのいずれかである。
一部の態様では、医薬組成物の量は、約１×１０８～約１×１０１５の組換えＡＡＶビリオン、約１×１０９～約１×１０１４の組換えＡＡＶビリオン、約１×１０１０～約１×１０１３の組換えＡＡＶビリオン、または約１×１０１１～約３×１０１２の組換えＡＡＶビリオンを含む。
医薬組成物は、投与のための指示と一緒に、容器、パックまたはディスペンサー、例えば、シリンジ、例えば、充填済みシリンジに含まれ得る。
一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される塩を含む。各種の薬学的に許容される塩が当技術分野において公知であり、例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th edition,Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985（およびそのより最近の版）、"Encyclopaediaof Pharmaceutical Technology", 3rd edition, James Swarbrick (Ed.), InformaHealthcare USA (Inc.), NY, USA, 2007、およびJ. Pharm. Sci. 66: 2 (1977)に記載されている。また、適切な塩についての概説について、Handbookof Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use by Stahl and Wermuth(Wiley-VCH, 2002)を参照されたい。
薬学的に許容される塩基付加塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンと形成される。カチオンとして使用される金属は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどを含む。アミンは、Ｎ－Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミンおよびプロカインを含む（例えば、Berge et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharma Sci.,1977, 66, 119を参照されたい）。前記酸性化合物の塩基付加塩は、従来の方法で、遊離酸形態を十分な量の所望の塩基と接触させて、塩を作製することによって調製される。遊離酸形態は、従来の方法で、塩形態を酸と接触させること、および遊離酸を単離することによって再生され得る。遊離酸形態は、極性溶媒中の溶解度などのある特定の物理的性質において、それらのそれぞれの塩形態とはいくらか異なるが、他の点において、塩は、本発明の目的のために、それらのそれぞれの遊離酸と同等である。
医薬組成物は、ヒトなどの霊長類などの哺乳動物への投与のために製剤化することができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、非毒性の不活性な薬学的に許容される水性担体などの水性担体を含む。一部の実施形態では、水性担体のｐＨは、約３～約８である。一部の実施形態では、水性担体のｐＨは、約６～約８である。
一部の実施形態では、本明細書に提供される医薬組成物は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤、例えば、食塩水、リン酸緩衝食塩水、リン酸塩およびアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝液、保存剤および他のタンパク質との混合物中に、治療有効量の本明細書に開示の組換えＡＡＶビリオンを含む。例示的なアミノ酸、ポリマーおよび糖などは、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアレート化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース、フルクトース、デキストロース、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシまたはヒト血清アルブミン、クエン酸塩、酢酸塩、リンゲル液およびハンクス液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リシン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンおよびグリコールである。一部の実施形態では、医薬組成物は、約４℃で少なくとも６か月間安定である。
一部の実施形態では、本明細書に提供される医薬組成物は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、およびGood et al. (1966) Biochemistry 5:467に記載のものなどの当業者に公知の他の緩衝液などの緩衝液を含む。
本明細書において、本明細書に記載の方法における使用のための、本明細書に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を含む本明細書に開示の組換えＡＡＶビリオンを含む組成物も提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に開示の組換えＡＡＶビリオン、および１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含む医薬組成物である。
本明細書において、本明細書に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む組成物も提供する。一部の実施形態では、組成物は、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンを作製する方法などの本明細書に開示の方法における使用のためのものである。
ＶＩ．方法および使用
添付の実施例に開示されるように、本明細書に記載の改変キャプシドタンパク質は、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンに対する増強または変化した細胞指向性を与えることができる。例えば、本明細書に記載のある特定のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、網膜の増加した感染力、もしくは網膜における遺伝子産生物の増加した発現レベル、ＩＬＭへの増加した結合、硝子体内注入後の網膜細胞の増加した感染力、および／または硝子体内注入後の網膜における遺伝子産物の増加した発現に関連する。
本明細書に記載のビリオンによってトランスフェクトされ得る網膜細胞成分の例としては、限定されるものではないが、アストロサイト、ミュラー細胞、ＲＧＣ、ＲＧＣ軸索、光受容細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞およびそれらの組合せを挙げることができる。一部の例では、細胞マーカーを使用して、遺伝子産物をコードする核酸の網膜細胞成分への形質導入を測定する。細胞マーカーとしては、限定されるものではないが、ＧＦＡＰ、ビメンチン、Ｆｏｘ、β－チューブリン、ロドプシン、ＰＫＣａ、パルブアルブミン、カルビンディンおよびそれらの組合せを挙げることができる。下記の表１は、例示的な細胞マーカー、および対応する網膜細胞成分を表す。
Figure 2022529775000002
一部の例では、遺伝子産物を形質導入するためのｒＡＡＶビリオンの能力は、受容体タンパク質の発現によって測定することができる。一部の実施形態では、受容体タンパク質としては、ＧＦＰ、ＹＦＰ、レッドチェリー、β－ガラクトシダーゼおよび当技術分野において公知の他の受容体タンパク質を挙げることができる。
一部の例では、経時的な受容体タンパク質の発現は、さまざまな時点での眼の画像のキャプチャーにより決定することができる。例えば、ＧＦＰの発現は、蛍光の増加に相関され得る。所与の時点での蛍光の量を使用して、遺伝子産物の発現を定量化することができる。
一部の実施形態では、免疫蛍光検査を使用して、本明細書に記載の網膜細胞成分における形質導入された遺伝子の局在化を決定することができる。網膜細胞成分は、本明細書に開示の細胞マーカーに特異的な抗体の使用によって、標識することができる。一部の例では、抗体は、フルオロフォアにカップリングされている。一部の例では、二次抗体を使用して、第１の抗体の結合を検出することができる。形質導入された網膜は、目的の細胞マーカーに対する抗体とのインキュベーションの前に凍結切片化することができ、それにより結合した抗体のイメージングを可能にする。次いで、凍結切片を、抗体を使用して標識して、導入遺伝子の形質導入、目的の細胞マーカーの存在、および２つの間で重複する領域を検出することができる。
したがって、本明細書において、組換えＡＡＶビリオンの指向性を増強または変化させる方法であって、本明細書に開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を組換えＡＡＶビリオンに組み込むステップを含む、方法を提供する。本明細書において、組換えＡＡＶビリオンの指向性を増強または変化させる方法であって、親ＡＡＶキャプシドのアミノ酸残基５７０～５７９をＨＫＦＫＳＧＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列で置換して、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を生成するステップ、およびバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を組換えＡＡＶビリオンに組み込むステップを含み、アミノ酸残基の番号付けが、ＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質に対応する、方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、アミノ酸残基５７０～５７９をＸ１Ｘ２ＨＫＦＫＳＧＤＸ３（配列番号２）を含むアミノ酸配列で置換するステップを含み、Ｘ１～３は、独立して任意のアミノ酸であり得る。一部の実施形態では、Ｘ１～３のそれぞれは、独立して、Ａ、Ｌ、Ｇ、ＳおよびＴから選択される。一部の実施形態では、Ｘ１はＬである。一部の実施形態では、Ｘ２はＡである。一部の実施形態では、Ｘ３はＡである。一部の実施形態では、方法は、アミノ酸残基５７０～５７９を、ＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３）を含むアミノ酸配列、配列番号３と少なくとも８０％または少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列配列、配列番号３と少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは配列番号３内の４もしくはそれよりも多く、５もしくはそれよりも多く、６もしくはそれよりも多く、７もしくはそれよりも多く、８もしくはそれよりも多く、または９またはそれよりも多くの連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列で置換するステップを含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、ＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３）を含む。
一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ１０型（ＡＡＶ１０）、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、またはヒツジＡＡＶのキャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３キャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質である。
一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、またはヒツジＡＡＶのキャプシドタンパク質のバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質のバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有するＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質のバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質のバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ハイブリッドである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５のハイブリッドである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔ、またはＡＡＶ２．５Ｔキャプシドタンパク質と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有するそのバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔ、またはＡＡＶ２．５Ｔキャプシドタンパク質と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３キャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１キャプシドタンパク質、またはＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１キャプシドタンパク質（配列番号５）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有するそのバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１キャプシドタンパク質、またはＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１キャプシドタンパク質（配列番号５）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントである。
本明細書に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を含む本明細書に記載の組換えＡＡＶビリオンは、遺伝子産物の、細胞、例えば、動物の細胞への送達において使用してもよい。例えば、それらは、例えば、遺伝子産物が細胞生存度および／または機能に対して有する効果を決定するために、研究において使用してもよい。別の例として、それらは、例えば、治療用遺伝子産物を細胞または組織に送達することによって、例えば、障害を処置するための医薬において使用してもよい。したがって、一部の実施形態では、本明細書において、細胞において遺伝子産物を発現する方法であって、細胞を、本明細書に開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質および遺伝子産物をコードする配列を含むポリヌクレオチドカセットを含む組換えＡＡＶビリオンを含む組成物と接触させるステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる。一部の実施形態では、接触は、ｉｎ ｖｉｖｏで起こり、すなわち、組成物は、被験体に投与される。特定の実施形態では、組成物は、非経口、例えば、静脈内、経口、または注入によって投与される。ある特定の実施形態では、組成物は、注入によって眼に投与され、例えば、網膜、網膜下または硝子体に投与される。ある特定の実施形態では、組成物は、網膜注入、網膜下注入、または硝子体内注入によって投与される。ある特定の実施形態では、組成物は、硝子体内注入によって投与される。
哺乳動物細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで本明細書に開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンと接触させる特定の実施形態では、細胞は、任意の哺乳動物種、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、スナネズミ、リス）、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、霊長類、ヒト由来であり得る。細胞は、樹立された細胞系、例えば、ＷＥＲＩ細胞、６６１Ｗ細胞由来であってもよく、または細胞は、初代細胞であってもよい。
ある特定の実施形態では、遺伝子産物の発現を促進するために、細胞を、約３０分～約２４時間またはそれよりも長く、例えば、約１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、または２４時間などのいずれか１つにわたって、組換えＡＡＶビリオンと接触させる。細胞は、１回またはそれよりも多くの回数、例えば、１回、２回、３回、または３回よりも多くの回数、組換えＡＡＶビリオンと接触させてもよく、細胞は、それぞれの接触事象の後いくらかの時間、例えば、約１６～２４時間、組換えＡＡＶビリオンとインキュベートさせる。細胞との接触は、任意の培養培地中、細胞の生存を促進する任意の培養条件下で起こり得る。例えば、細胞は、ウシ胎仔血清または熱失活ヤギ血清（約５～１０％）、Ｌ－グルタミン、チオール、特に２－メルカプトエタノール、ならびに抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンが補充された、イスコフ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０などの便利であり任意の適した栄養培地に懸濁させてもよい。培養物は、細胞が応答性である成長因子を含有していてもよい。本明細書に定義する成長因子は、膜貫通受容体に対する特異的効果により、培養物またはインタクト組織のいずれかにおいて、細胞の生存、成長および／または分化を促進することができる分子である。成長因子としては、ポリペプチド、および非ポリペプチド因子が挙げられる。
ある特定の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を含む有効量の組換えＡＡＶビリオンを、細胞中で遺伝子産物の発現を生じさせるために提供する。特定の実施形態では、有効量は、例えば、遺伝子産物の存在またはレベルを検出することによって、細胞の生存度または機能に対する効果を検出することによってなどで、経験的に決定してもよい。ある特定の実施形態では、有効量の組換えＡＡＶビリオンは、親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンなどの参照ウイルスベクターの同じ量よりも、細胞中で遺伝子産物の同等またはより高い発現を促進する。ある特定の実施形態では、発現は、参照ウイルスベクターからの発現に比べて、約２倍またはそれよりも高く、例えば、約３倍、４倍もしくは５倍またはそれよりも高くのいずれか、一部の例では、約１０倍、２０倍もしくは５０倍またはそれよりも高くのいずれか、例えば、１００倍、増強される。ある特定の実施形態では、増強された発現は、特定の細胞型、例えば、本明細書に記載の眼細胞のいずれかにおいて起こる。
細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏで、本明細書に開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質、および遺伝子産物をコードする配列を含むポリヌクレオチドカセットを含む組換えＡＡＶビリオンを含む組成物と接触させる例について、被験体は、任意の哺乳動物、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、スナネズミ）、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシまたは霊長類（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）であってもよい。本開示の方法および組成物は、少なくとも部分的に、細胞の遺伝子治療によって対処され得る任意の状態の処置における使用が見出される。したがって、本開示の組成物および方法は、細胞治療を必要とする個体の処置における使用が見出される。細胞としては、限定されるものではないが、血液、眼、肝臓、腎臓、心臓、筋肉、胃、腸、膵臓および皮膚が挙げられる。
本明細書において、遺伝子産物を網膜に送達する方法であって、本明細書に開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質、および遺伝子産物をコードする配列を含むポリヌクレオチドカセットを含む組換えＡＡＶビリオンを硝子体内注入によって投与するステップを含む、方法も提供する。一部の実施形態では、本明細書において、ＩＬＭを通過して遺伝子産物を送達する方法であって、本明細書に開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質、および遺伝子産物をコードする配列を含むポリヌクレオチドカセットを含む組換えＡＡＶビリオンを硝子体内注入によって投与するステップを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、遺伝子産物を被験体の網膜に提供する方法であって、被験体に、本明細書に記載の組換えＡＡＶビリオンを含む医薬組成物を硝子体内注入によって投与するステップを含み、組換えＡＡＶビリオンが、本明細書に提供または開示のバリアントＡＡＶキャプシド、および遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含む、方法を提供する。
特定の実施形態では、被験体は、急性黄斑視神経網膜症；ベーチェット病；脈絡膜血管新生；糖尿病性ぶどう膜炎；ヒストプラスマ症；急性黄斑変性症、非滲出型加齢性黄斑変性症および滲出型加齢性黄斑変性症などの黄斑変性症；黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫および糖尿病性黄斑浮腫などの浮腫；多病巣性脈絡膜炎；後眼部位もしくは区域に影響を与える眼外傷；眼腫瘍；網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性網膜症（増殖性糖尿病性網膜症を含む）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ぶどう膜網膜疾患などの網膜の障害；交感性眼炎；フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群；ぶどう膜拡散；眼レーザー処置によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態；光線力学的療法によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態；光凝固、放射線網膜症；網膜上膜障害；網膜静脈分枝閉塞症；前部虚血性視神経症；糖尿病性網膜虚血；虚血性網膜症、非網膜症；糖尿病性網膜機能障害；網膜分離症；網膜色素変性症；緑内障；アッシャー症候群、錐体杆体ジストロフィー；シュタルガルト病（黄色斑眼底）；遺伝性黄斑変性症；脈絡網膜変性症；レーバー先天黒内障；先天停止性夜盲；全脈絡膜萎縮；バルデ・ビードル症候群、黄斑部毛細血管拡張症；レーバー遺伝性視神経症；未熟児網膜症；ならびに全色盲、第一色盲、第二色盲および第三色盲を含む色覚の障害からなる群より選択される１つもしくは複数の疾患または障害を有すると診断されているか、またはそれを有する疑いがある。
特定の実施形態では、被験体は、急性黄斑視神経網膜症；ベーチェット病；脈絡膜血管新生；糖尿病性ぶどう膜炎；ヒストプラスマ症；急性黄斑変性症、非滲出型加齢性黄斑変性症および滲出型加齢性黄斑変性症などの黄斑変性症；黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫および糖尿病性黄斑浮腫などの浮腫；多病巣性脈絡膜炎；後眼部位もしくは区域に影響を与える眼外傷；眼腫瘍；網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性網膜症（増殖性糖尿病性網膜症を含む）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ぶどう膜網膜疾患などの網膜の障害；交感性眼炎；フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群；ぶどう膜拡散；眼レーザー処置によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態；光線力学的療法によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態；光凝固、放射線網膜症；網膜上膜障害；網膜静脈分枝閉塞症；前部虚血性視神経症；糖尿病性網膜虚血；虚血性網膜症、非網膜症；糖尿病性網膜機能障害；網膜分離症；網膜色素変性症；緑内障；アッシャー症候群、錐体杆体ジストロフィー；シュタルガルト病（黄色斑眼底）；遺伝性黄斑変性症；脈絡網膜変性症；レーバー先天黒内障；先天停止性夜盲；全脈絡膜萎縮；バルデ・ビードル症候群、黄斑部毛細血管拡張症；レーバー遺伝性視神経症；未熟児網膜症；ならびに全色盲、第一色盲、第二色盲および第三色盲を含む色覚の障害からなる群より選択される１つもしくは複数の疾患または障害を発生する危険性がある。
本明細書において、それを必要とする被験体の網膜の疾患または障害を処置する方法であって、本明細書に開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質、および治療用遺伝子産物をコードする配列を含むポリヌクレオチドカセットを含む組換えＡＡＶビリオンを硝子体内注入によって投与するステップを含む、方法も提供する。本明細書において、それを必要とする被験体の網膜の疾患または障害を予防的に処置する方法であって、本明細書に開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質、および治療用遺伝子産物をコードする配列を含むポリヌクレオチドカセットを含む組換えＡＡＶビリオンを硝子体内注入によって投与するステップを含む、方法も提供する。本明細書において、それを必要とする被験体の網膜の確立もしくは診断された疾患または障害を処置する方法であって、本明細書に開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質、および治療用遺伝子産物をコードする配列を含むポリヌクレオチドカセットを含む組換えＡＡＶビリオンを硝子体内注入によって投与するステップを含む、方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、本明細書に開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質および治療用遺伝子産物をコードする配列を含むポリヌクレオチドカセットを含む組換えＡＡＶビリオンを含む医薬組成物を投与するステップを含む。
一部の実施形態では、疾患または障害は、急性黄斑視神経網膜症；ベーチェット病；脈絡膜血管新生；糖尿病性ぶどう膜炎；ヒストプラスマ症；急性黄斑変性症、非滲出型加齢性黄斑変性症および滲出型加齢性黄斑変性症などの黄斑変性症；黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫および糖尿病性黄斑浮腫などの浮腫；多病巣性脈絡膜炎；後眼部位もしくは区域に影響を与える眼外傷；眼腫瘍；網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性網膜症（増殖性糖尿病性網膜症を含む）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ぶどう膜網膜疾患などの網膜の障害；交感性眼炎；フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群；ぶどう膜拡散；眼レーザー処置によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態；光線力学的療法によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態；光凝固、放射線網膜症；網膜上膜障害；網膜静脈分枝閉塞症；前部虚血性視神経症；糖尿病性網膜虚血；虚血性網膜症、非網膜症；糖尿病性網膜機能障害；網膜分離症；網膜色素変性症；緑内障；アッシャー症候群、錐体杆体ジストロフィー；シュタルガルト病（黄色斑眼底）；遺伝性黄斑変性症；脈絡網膜変性症；レーバー先天黒内障；先天停止性夜盲；全脈絡膜萎縮；バルデ・ビードル症候群、黄斑部毛細血管拡張症；レーバー遺伝性視神経症；未熟児網膜症；ならびに全色盲、第一色盲、第二色盲および第三色盲を含む色覚の障害からなる群より選択される。
特定の実施形態では、被験体は、急性黄斑視神経網膜症；ベーチェット病；脈絡膜血管新生；糖尿病性ぶどう膜炎；ヒストプラスマ症；急性黄斑変性症、非滲出型加齢性黄斑変性症および滲出型加齢性黄斑変性症などの黄斑変性症；黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫および糖尿病性黄斑浮腫などの浮腫；多病巣性脈絡膜炎；後眼部位もしくは区域に影響を与える眼外傷；眼腫瘍；網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性網膜症（増殖性糖尿病性網膜症を含む）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ぶどう膜網膜疾患などの網膜の障害；交感性眼炎；フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群；ぶどう膜拡散；眼レーザー処置によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態；光線力学的療法によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態；光凝固、放射線網膜症；網膜上膜障害；網膜静脈分枝閉塞症；前部虚血性視神経症；糖尿病性網膜虚血；虚血性網膜症、非網膜症；糖尿病性網膜機能障害；網膜分離症；網膜色素変性症；緑内障；アッシャー症候群、錐体杆体ジストロフィー；シュタルガルト病（黄色斑眼底）；遺伝性黄斑変性症；脈絡網膜変性症；レーバー先天黒内障；先天停止性夜盲；全脈絡膜萎縮；バルデ・ビードル症候群、黄斑部毛細血管拡張症；レーバー遺伝性視神経症；未熟児網膜症；ならびに全色盲、第一色盲、第二色盲および第三色盲を含む色覚の障害からなる群より選択される１つもしくは複数の疾患または障害を発生する危険性がある。
ある特定の実施形態では、遺伝子産物は、被験体の網膜における血管新生、例えば、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を阻害する。多くの細胞因子がＣＮＶ生成の調節において重要な役割を果たすことが見出されており、その中でも、限定されるものではないが、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）および他のサイトカイン、ならびにマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）が挙げられ得る。一部の実施形態では、遺伝子産物は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦ、ＨＩＦ、ＡｎｇおよびＭＡＰＫのうちの１つまたは複数の阻害剤である。
一部の実施形態では、遺伝子産物は、本明細書に開示の遺伝子産物または治療用遺伝子産物である。一部の実施形態では、遺伝子産物は、干渉ＲＮＡ、アプタマーまたはタンパク質である。一部の実施形態では、治療用遺伝子産物は、干渉ＲＮＡ、アプタマーまたはタンパク質である。一部の実施形態では、遺伝子産物（または治療用遺伝子産物）は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはタンパク質である。一部の実施形態では、遺伝子産物（または治療用遺伝子産物）は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、遺伝子産物（または治療用遺伝子産物）は、干渉ＲＮＡである。一部の実施形態では、遺伝子産物（または治療用遺伝子産物）は、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。
一部の実施形態では、方法は、例えば、疾患または障害の発生を防止する、疾患または障害の進行を停止する、疾患または障害の進行を逆転させるなどの治療利益をもたらす。一部の実施形態では、方法は、治療利益が達成されていることを検出するステップを含む。
一部の例では、例えば、遺伝子産物のレベルを測定することによって、治療有効性を測定することによってなどで検出される遺伝子産物の発現を、投与後２か月またはそれよりも短く、例えば、投与後約４、３もしくは２週間またはそれよりも短く、例えば、主題組成物の投与後１週間、観察してもよい。遺伝子産物の発現はまた、経時的に持続すると予想される。したがって、一部の例では、例えば、遺伝子産物のレベルを測定することによって、治療有効性を測定することによってなどで検出される遺伝子産物の発現を、主題組成物の投与後約２か月またはそれよりも長く、例えば、約４、６、８もしくは１０か月またはそれよりも長く、一部の例では、約１年またはそれよりも長く、例えば、２、３、４または５年、ある特定の例では、５年よりも長く、観察してもよい。
特定の実施形態では、被験体は、一方の眼、または両方の眼のそれぞれに、約１×１０８ベクターゲノムまたはそれよりも多く、一部の例では、約１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２もしくは１×１０１３ベクターゲノムまたはそれよりも多くのいずれか、ある特定の例では、約１×１０１４ベクターゲノムまたはそれよりも多くが投与される。一部の例では、送達されるベクターゲノムの量は、最大で約１×１０１５ベクターゲノム、例えば、１×１０１４ベクターゲノムまたはそれよりも少ない、例えば、約１×１０１３、１×１０１２、１×１０１１、１×１０１０もしくは１×１０９ベクターゲノムまたはそれよりも少ない、ある特定の例では、１×１０８ベクターゲノム、時々１×１０８ベクターゲノム以上である。一部の例では、送達されるベクターゲノムの量は、約１×１０１０～約１×１０１１ベクターゲノムである。一部の例では、送達されるベクターゲノムの量は、約１×１０１０～約３×１０１２ベクターゲノムである。一部の例では、送達されるベクターゲノムの量は、約１×１０９～約３×１０１３ベクターゲノムである。一部の例では、送達されるベクターゲノムの量は、約１×１０８～約３×１０１４ベクターゲノムである。
一部の場合では、投与される医薬組成物の量は、感染多重度（ＭＯＩ）を使用して測定してもよい。一部の場合では、ＭＯＩは、ベクターまたはウイルスゲノムの核酸が送達され得る細胞に対する比または倍数を指し得る。一部の場合では、ＭＯＩは、約１×１０６であり得る。一部の場合では、ＭＯＩは、約１×１０５～約１×１０７であり得る。一部の場合では、ＭＯＩは、約１×１０４～約１×１０８であり得る。一部の場合では、本開示の組換えＡＡＶビリオンは、少なくとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７または１×１０１８のＭＯＩのいずれかである。一部の場合では、本開示の組換えＡＡＶビリオンは、約１×１０８～約３×１０１４のＭＯＩである。一部の場合では、本開示の組換えＡＡＶビリオンは、最大で約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７または１×１０１８のＭＯＩのいずれかである。
一部の態様では、医薬組成物の量は、約１×１０８～約１×１０１５粒子の組換えＡＡＶビリオン、約１×１０９～約１×１０１４粒子の組換えＡＡＶビリオン、約１×１０１０～約１×１０１３粒子の組換えＡＡＶビリオン、または約１×１０１１～約３×１０１２粒子の組換えＡＡＶビリオンを含む。
一部の実施形態では、２以上の投与（例えば、２、３、４またはそれよりも多くの投与）を、さまざまな間隔の期間にわたって、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年などで、遺伝子発現の所望のレベルを達成するために用いてもよい。
一部の態様では、組換えＡＡＶビリオンは、前記医薬組成物の投与の約７日後、約１４日後、約２１日後、または約３０日後に、ヒト被験体の涙液、血液、唾液または尿試料中で検出されない。一部の態様では、組換えＡＡＶビリオンの存在または非存在は、ｑＰＣＲまたはＥＬＢＡによって検出される。
一部の態様では、被験体の最良矯正視力（ＢＣＶＡ）は、本明細書に記載の処置の方法の後、約１、２、３、４、５またはそれよりも多いラインだけ改善する。
一部の態様では、フルオレセイン血管造影法（ＦＡ）によって評価される血管新生の低減は、投与ステップに続く。
一部の場合では、網膜の厚さは、処置の効果を調べるために測定されてもよい。一部の場合では、ヒト被験体の網膜中心の厚さは、本開示の医薬組成物による処置後約１２か月以内に、約５０ミクロン、約１００ミクロンまたは約２５０ミクロンを超えて増加しない。一部の場合では、ヒト被験体の網膜中心の厚さは、本開示の医薬組成物による処置後、約３か月、約６か月、約９か月または約１２か月以内に、少なくとも約５０ミクロン、約１００ミクロン、約２００ミクロン、約２５０ミクロン、約３００ミクロン、約４００ミクロン、約５００ミクロン、または約６００ミクロン減少する。ヒト被験体の網膜中心の厚さの減少は、本開示の医薬組成物の投与の約１日、３日、７日もしくは１０日で、またはそれ以内に取得されたベースライン測定値に対する１つまたは複数の時点での網膜中心の厚さを比較することによって測定され得る。
前述から、本発明の特定の実施形態は、例示の目的のために本明細書に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな改変を行ってもよいことが理解される。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて、限定されない。
ＶＩＩ．例示的な実施形態
提供される実施形態の中には以下がある。
１．（ａ）親アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質に比べてアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変配列を含むバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質であって、改変配列が、ＨＫＦＫＳＧＤ（配列番号１）を含み、アミノ酸残基の番号付けが、ＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質に対応する、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質；および
（ｂ）治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列
を含む組換えＡＡＶビリオン。
２．親ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質、またはＡＡＶ５およびＡＡＶ２ハイブリッドキャプシドタンパク質である、実施形態１に記載の組換えＡＡＶビリオン。
３．親ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２．５Ｔキャプシドタンパク質である、実施形態１または２に記載の組換えＡＡＶビリオン。
４．親ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１キャプシドタンパク質である、実施形態１から３のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
５．改変配列が、ＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３）を含む、実施形態１から４のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
６．バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号４または配列番号５に記述されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するキャプシド配列を含む、実施形態１から５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
７．バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号６または配列番号７に記述されるキャプシド配列を含む、実施形態１から６のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
８．ｒＡＡＶビリオンが、バリアントＡＡＶ５、またはバリアントＡＡＶ２およびＡＡＶ５ハイブリッドビリオンである、実施形態１から７のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
９．ｒＡＡＶビリオンが、バリアントＡＡＶ２．５Ｔビリオンである、実施形態１から８のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
１０．哺乳動物に硝子体内注入される場合に、網膜の細胞に形質導入することができる、実施形態１から９のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
１１．哺乳動物に硝子体内注入される場合に、光受容細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、および網膜色素上皮細胞のうちの１つまたは複数に形質導入することができる、実施形態１０に記載の組換えＡＡＶビリオン。
１２．哺乳動物に硝子体内注入される場合に、網膜色素上皮細胞に形質導入することができる、実施形態１０または１１に記載の組換えＡＡＶビリオン。
１３．治療用遺伝子産物が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはタンパク質である、実施形態１から１２のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
１４．治療用遺伝子産物が、抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）遺伝子産物である、実施形態１から１３のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
１５．治療用遺伝子産物が、オプシンである、実施形態１から１３のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
１６．治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドが、１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲと隣接している、実施形態１から１５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
１７．１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶもしくはヒツジＡＡＶのＩＴＲ、またはそれらのバリアントである、実施形態１６に記載の組換えＡＡＶビリオン。
１８．１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲが、ＡＡＶ２のＩＴＲまたはＡＡＶ５のＩＴＲである、実施形態１６または１７に記載の組換えＡＡＶビリオン。
１９．ＡＡＶ２．５Ｔと比較して、変化した細胞指向性を有する、実施形態１から１８のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
２０．実施形態１から１９のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオンを含む医薬組成物。
２１．ｒＡＡＶビリオンを産生するための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶビリオンが産生される条件下で宿主細胞を培養するステップであって、宿主細胞が、
（ｉ）親ＡＡＶキャプシドタンパク質に比べてアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変配列を含むバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、改変配列が、ＨＫＦＫＳＧＤ（配列番号１）を含む、ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶのＩＴＲと隣接している治療用遺伝子産物をコードする配列を含むポリヌクレオチドカセット；および
（ｉｖ）ＡＡＶヘルパー機能
を含むステップ；ならびに
（ｂ）宿主細胞によって産生されたｒＡＡＶビリオンを回収するステップ
を含む、方法。
２２．治療用遺伝子産物を被験体の網膜に提供する方法であって、被験体に、実施形態１から１９のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン、または実施形態２０に記載の医薬組成物を硝子体内注入によって投与するステップを含む、方法。
２３．被験体が、急性黄斑視神経網膜症、ベーチェット病、脈絡膜血管新生、糖尿病性ぶどう膜炎、ヒストプラスマ症、黄斑変性症、浮腫、多病巣性脈絡膜炎、後眼部位もしくは区域に影響を与える眼外傷、眼腫瘍、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ぶどう膜網膜疾患、交感性眼炎、フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群、ぶどう膜拡散、眼レーザー処置によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態、光線力学的療法によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態、光凝固、放射線網膜症、網膜上膜障害、網膜静脈分枝閉塞症、前部虚血性視神経症、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症、非網膜症糖尿病性網膜機能障害、網膜分離症、網膜色素変性症、緑内障、アッシャー症候群、錐体杆体ジストロフィー、シュタルガルト病、遺伝性黄斑変性症、脈絡網膜変性症、レーバー先天黒内障、先天停止性夜盲、全脈絡膜萎縮、バルデ・ビードル症候群、黄斑部毛細血管拡張症、レーバー遺伝性視神経症、未熟児網膜症、および色覚の障害からなる群より選択される１つもしくは複数の状態を有すると診断されているか、またはそれを有する疑いがある、実施形態２２に記載の方法。
２４．それを必要とする被験体の網膜の疾患または障害を処置する方法であって、被験体に、実施形態１から１９のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン、または実施形態２０に記載の医薬組成物を硝子体内注入によって投与するステップを含む、方法。
２５．疾患または障害が、急性黄斑視神経網膜症、ベーチェット病、脈絡膜血管新生、糖尿病性ぶどう膜炎、ヒストプラスマ症、黄斑変性症、浮腫、多病巣性脈絡膜炎、後眼部位もしくは区域に影響を与える眼外傷、眼腫瘍、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ぶどう膜網膜疾患、交感性眼炎、フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群、ぶどう膜拡散、眼レーザー処置によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態、光線力学的療法によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態、光凝固、放射線網膜症、網膜上膜障害、網膜静脈分枝閉塞症、前部虚血性視神経症、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症、非網膜症糖尿病性網膜機能障害、網膜分離症、網膜色素変性症、緑内障、アッシャー症候群、錐体杆体ジストロフィー、シュタルガルト病、遺伝性黄斑変性症、脈絡網膜変性症、レーバー先天黒内障、先天停止性夜盲、全脈絡膜萎縮、バルデ・ビードル症候群、黄斑部毛細血管拡張症、レーバー遺伝性視神経症、未熟児網膜症、または色覚の障害である、実施形態２４に記載の方法。
２６．それを必要とする被験体の網膜の疾患または障害を処置する方法における使用のための実施形態１から１９のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオンであって、方法が、被験体に、組換えＡＡＶビリオンを含む医薬組成物を硝子体内注入によって投与するステップを含む、組換えＡＡＶビリオン。
２７．被験体の網膜の疾患または障害の処置のための医薬の調製における使用のための実施形態１から１９のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
２８．疾患または障害が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、滲出型ＡＭＤ、萎縮型ＡＭＤ、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症または糖尿病性網膜浮腫である、実施形態２６または２７に記載の組換えＡＡＶビリオン。
２９．親ＡＡＶキャプシドタンパク質に比べてアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変配列を含むバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質であって、改変配列が、ＨＫＦＫＳＧＤ（配列番号１）を含み、アミノ酸残基の番号付けが、ＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質に対応する、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質。
３０．親ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質、またはＡＡＶ５およびＡＡＶ２ハイブリッドキャプシドタンパク質である、実施形態２９に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質。
３１．親ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２．５Ｔキャプシドタンパク質である、実施形態２９または３０に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質。
３２．親ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１キャプシドタンパク質である、実施形態２９から３１のいずれか一項に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質。
３３．改変ＡＡＶキャプシドタンパク質が、親ＡＡＶキャプシドタンパク質に比べてアミノ酸残基５７０～５７９にＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３）を含む、実施形態２９から３２のいずれか一項に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質。
３４．配列番号４または配列番号５に記述されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するキャプシド配列を含む、実施形態２９から３３のいずれか一項に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質。
３５．配列番号６または配列番号７に記述されるキャプシド配列を含む、実施形態２９から３４のいずれか一項に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質。
３６．実施形態２９から３５のいずれかに記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸。
３７．実施形態３６に記載の核酸を含む発現ベクターであって、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸配列が、プロモーター配列に作動可能に連結されている、発現ベクター。
３８．ｒｅｐタンパク質をコードする核酸をさらに含む、実施形態３７に記載の発現ベクター。
３９．実施形態３７または３８に記載の発現ベクターを含む細胞。
４０．治療用遺伝子産物をコードする核酸をさらに含む、実施形態３９に記載の細胞。
４１．治療用遺伝子産物が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはタンパク質である、実施形態４０に記載の細胞。
４２．治療用遺伝子産物が、抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）遺伝子産物である、実施形態４０または４１に記載の細胞。
４３．治療剤が、オプシンである、実施形態４０または４１に記載の細胞。
４４．治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドが、１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲと隣接している、実施形態４０から４３のいずれか一項に記載の細胞。
４５．１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶもしくはヒツジＡＡＶのＩＴＲ、またはそれらのバリアントである、実施形態４４に記載の細胞。
４６．１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲが、ＡＡＶ２のＩＴＲまたはＡＡＶ５のＩＴＲである、実施形態４４または４５に記載の細胞。
（実施例１：ＡＡＶ２．５Ｔ変異体ライブラリーの構築）
ＡＡＶ２．５Ｔは、その開示がその全体において組み込まれる米国特許第９，４４１，２４４号に記載のＡＡＶ２およびＡＡＶ５由来の領域を含有するハイブリッドキャプシドである。ＡＡＶ２．５Ｔは、網膜下に送達された場合に、網膜に形質導入することができるが、硝子体内に注射された場合では形質導入することができない。ＡＡＶ２．５Ｔの形質導入は、内境界膜（ＩＬＭ）によってブロックされ得、これは、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に富んでいる。
ＡＡＶ２．５Ｔの表面露出ドメインは、ＡＡＶ２．５Ｔのａａ５８２（ＡＡＶ５のａａ５８１）においてＡからＴへの単一の置換を除いてＡＡＶ５のものと同一であり、この変異は、ＡＡＶ５の典型的なシアル酸受容体結合に影響を及ぼすことなく、哺乳動物細胞において感染力を増加させると思われる。ＡＡＶ５およびＡＡＶ２．５Ｔは、無視できる程度のヘパラン硫酸結合を有するが、ＡＡＶ２は、ヘパラン硫酸に対する高い親和性を有する。
ＩＬＭを通過する強化された能力を有する新規ＡＡＶバリアントを開発するため、および硝子体内注入による送達において網膜細胞に形質導入するために、ループ置換および挿入を有するＡＡＶ変異体ライブラリーを、アミノ酸アライメントによって決定されるＡＡＶ２のＨＳＰＧ結合領域に類似する領域においてＡＡＶ２．５Ｔキャプシドから作製した。
２つの変異体ライブラリーを、ランダムな７アミノ酸ループを有するＤＮＡ断片の合成によって作製した。７アミノ酸の位置のそれぞれについて２０の可能なアミノ酸があるので、これらの断片ライブラリーの理論的な多様性は、およそ１×１０９の固有のバリアントであった。これらの変異体ループは、５’末端でアミノ酸ＬＡおよび３’末端でＡと隣接していた。
これらの断片ライブラリーを使用して、ループ挿入ライブラリー（ＬＩＬ）を、受容体結合領域において、ＡＡＶ２．５Ｔキャプシド配列の５７７位に１０アミノ酸ループを挿入することによって作製した。
第２のライブラリーを、キャプシドの表面露出領域における配列を、アミノ酸５７１および５８０（ＶＰ１の最初のアミノ酸からの番号付け）の間のループバリアント配列で置換することによって作製した。このライブラリーを、ループ置換ライブラリー（ＬＳＬ）と称した。
これらのＡＡＶバリアントキャプシドを、プラスミドにクローニングして、（国際公開第２０１７１１２８６８Ａ１号に記載の通り、１：５０の比（プラスミド：ｐｈｉＣ３１）でのｐｈｉＣ３１インテグラーゼによる一過性トランスフェクションによって）個々のウイルスパッケージング細胞ライブラリーを作製した。得られたパッケージング細胞ライブラリーは、そのゲノムによってコードされるキャプシドタンパク質内にパッケージされた変異体Ｃａｐ遺伝子を含有するベクターゲノムで構成される変異体ＡＡＶビリオンを生じ、交差パッケージングは低レベルである。細胞ライブラリーの多様性を確認するために、ｇＤＮＡをそれぞれのライブラリーから単離し、ＮＧＳを行った。多様性は、ＬＩＬにおいておよそ約７２５，０００の固有バリアント、およびＬＳＬにおいて約５５８，０００の固有バリアントであった。
（実施例２：ＡＡＶライブラリーをＮＨＰの眼においてスクリーニングする）
ＩＬＭを通過する変異体ＡＡＶキャプシドの能力を調べるために、バリアントＡＡＶビリオンのライブラリーを、内境界膜（ＩＬＭ）を通る能力、および非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の眼において網膜細胞に感染する能力についてｉｎ ｖｉｖｏでスクリーニングした。
ＬＩＬおよびＬＳＬの変異体ＡＡＶキャプシドライブラリーを、眼あたり６×１０９～９×１０９ｖｇの用量でそれぞれ３頭のアフリカミドリザル（Chlorocebus sabaeus）の眼に硝子体内注入した。注入の４～６週後、動物を屠殺し、それぞれの動物からの網膜組織外植片を単離した。硝子体、および脈絡膜下組織を伴う網膜を単離し、眼球を縁に沿って切断し、眼の前部を廃棄した。次いで、硝子体を、眼杯に付着した網膜を残しながら除去した。眼杯を、ＣＯ２依存性媒体に移した。網膜およびＲＰＥ／脈絡膜を切断して、網膜のフラットマウントを作製した。全フラットマウントを、１０ｍＬのＣＯ２非依存性媒体を含有する１０ｃｍのトランスウェルプレートのポリカーボネートインサート膜上に、光受容細胞層を下向きに置いた。網膜をインサート上に平らに定着させたら、媒体を除去して、網膜を大気に曝した。
組織の上部にＡｄ５溶液を添加し２時間おくことによって、１０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ヒトＡｄ５ウイルス（抗生物質も抗真菌薬も含まないＮｅｕｒｏｂａｓａｌ－Ａ培地に希釈）を網膜に形質導入した。Ａｄ５ウイルスによる同時感染を使用して、網膜組織に存在する変異体ＡＡＶビリオン由来のＣａｐ ＲＮＡの発現を増加させ、それによって、その後の検出のために感染細胞中の変異体キャプシドＲＮＡの量を増加させた。
最初のインキュベーション後、インサートの底部と接触するが組織を覆わないように（約１０ｍｌ）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ－Ａ＋（Ｂ２７補充物、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、１×抗生物質－抗真菌薬）培地をウェルの底部に添加し、組織外植片をＣＯ２とともに３７℃で２日間インキュベートした。インキュベーション後、インサートを、プレートから除去し、きれいな平たい表面上に置き、３つの穿孔を図１Ａに示すように作製した。簡潔には、ＲＰＥ／脈絡膜を有する神経網膜の５ｍｍの穿孔を、黄斑から取得した。次いで、第２の同心穿孔を、１０ｍｍの穿孔を使用して作製して、傍中心窩と呼ばれる血管アーケード内の黄斑の周囲の網膜およびＲＰＥ／脈絡膜の領域を単離した。次いで、残った周辺の網膜およびＲＰＥ／脈絡膜を収集した。
次いで、ＲＮＡを組織穿孔のそれぞれから抽出し、ＲＴ－ＰＣＲによってｃＤＮＡに変換し、続いて１ラウンドのＰＣＲを行った。次いで、得られたＰＣＲ産物をクローニングしてプラスミドに戻し、配列決定して、ＩＬＭを成功裏に通過し、サルの眼における網膜細胞に感染することができた変異体ＡＡＶキャプシドの配列を決定した。
第２および第３ラウンドのスクリーニングのために、個々の網膜の場所（穿孔）のそれぞれから抽出されたＬＩＬおよびＬＳＬバリアントを混合して、それぞれの場所についてのバリアントの１つのライブラリーを作出した。次いで、これらのライブラリーのプールを使用して、細胞およびＡＡＶキャプシドライブラリーを作製し、これを、アフリカミドリザル（ＡＧＭ）の眼に別々に注入し、上記と同じ網膜穿孔戦略を使用して収集した。さらに、一例では、網膜色素上皮を単離し、バリアントをその組織から回収した。
ＮＧＳ分析を使用して、ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１を特定した。ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１は、以下のアミノ酸ループ配列：ＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３）を有するＬＳＬライブラリーが起源のループ置換バリアントである。ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１は、スクリーニングラウンド２における黄斑領域からの４８番目に豊富なバリアントであった。スクリーニングラウンド３において、ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１は、傍中心窩において見出される２番目に豊富なバリアントであり、ＲＰＥ領域において見出される最も豊富なバリアントであった。それぞれのスクリーニングラウンドの上位のバリアントの相対存在量を図１Ｂ～１Ｅに示す。
（実施例３：ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１の産生）
ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１を、ＨＥＫ２９３細胞において、トリプルトランスフェクション方法を使用するさらなる特性評価のために製造した。得られたＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１の力価は、１×１０１３ｖｇ／ｍｌよりも高く、ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１が良好なパッケージング能力を有することを実証した。
（実施例４：ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１のヘパリン結合親和性）
ＨＳＰＧに結合するＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１の能力を、充填済みＧＥヘパリンカラムを使用するヘパリン結合アッセイを行うことによって評価した。ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１のヘパリン結合を、ＡＡＶ２．５Ｔ、および上記に記載のスクリーニングにおいて産生された２つの他のバリアントと比較した。ベクターをカラムにロードし、次いで洗浄し、最後に、ＮａＣｌの漸増濃度（１００ｍＭ～１Ｍ）で溶出させた。ロード、フロースルー、洗浄および溶出の画分を収集し、Ｂ１抗体を使用するドットブロットによって分析した。
図２に示すように、ＡＡＶ２．５Ｔはヘパリンに結合しない。対照的に、ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１は、ヘパリンに結合する能力を有する。
（実施例５：ブタ網膜外植片における発現および指向性）
ｅｘ ｖｉｖｏブタ網膜外植片を、その開示がその全体で組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３０６３６号に記載のトランスウェル上に維持し、ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１キャプシド中に２×１０１０ｖｇまたは４×１０１０ｖｇでパッケージされたＧＦＰレポーター遺伝子で形質導入した。ライブ蛍光画像を、形質導入の１週間後および２週間後にキャプチャーした。図３は、ブタ網膜外植片のライブイメージングを示す。これらの画像は、ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１が、培養中のブタ網膜の少なくとも一部の細胞に効率的に形質導入することができることを示唆する。
（実施例６：非ヒト霊長類の網膜への硝子体内投与後の発現）
ｉｎ ｖｉｖｏ研究を、遍在性プロモーターの制御下のＧＦＰ発現カセットを持つ５×１０１１ｖｇ／眼のＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１を硝子体内注入されたアフリカミドリザル（Chlorocebus sabaeus）において行った。眼における発現を、眼底の蛍光およびハイデルベルグスペクトラリスイメージングによって毎週モニタリングし、図４Ａ～４Ｅに示す。ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１－ＧＦＰの硝子体内送達は、黄斑および血管アーケード内でＧＦＰ発現をもたらした。網膜の血管アーケード領域は、最も厚いＩＬＭを有し、これにより、硝子体内注入された場合に、ほとんどのＡＡＶによって網膜細胞への形質導入がブロックされると思われる。
（実施例７：硝子体内投与後の発現の評価）
ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１の網膜指向性を、ＩＶＴ注入後に非ヒト霊長類において評価した。
アフリカミドリザル（Chlorocebus sabaeus）に、ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１の指向性を評価するために、遍在性プロモーターの制御下のＧＦＰ発現カセットを持つ５×１０１１ｖｇ／眼のＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１を硝子体内（ＩＶＴ）注入した。
サルを、ＩＶＴ注入後３５日目に屠殺し、眼を摘出した。眼を、摘出の際に２４時間４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、次いで、３０％のスクロース／ソレンソンのリン酸緩衝液を用いて終夜凍結保護した。眼を四半部に切開し、ＲＰＥおよび脈絡膜を含む網膜を強膜から取り出した。網膜の四半部を、スライドにフラットマウントし、３０％のスクロース／ソレンソンのリン酸緩衝液の下でカバースリップをかけた。ネイティブＧＦＰの５×タイル状スキャンを、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ．Ｚ１を使用して取得し、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ Ｂｌｕｅソフトウェアを使用して合わせた。ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１－ＧＦＰについて得られたライブ蛍光画像を図５Ａ～５Ｄに示す。
ＧＦＰ強度プロファイルを、図５Ｃ～５Ｄに示されるフラットマウントされた網膜の部分の５×スキャンから取得した。測定値を、視神経に最も近い黄斑の端から毛様体まで取得した。合計で２０ｍｍの長さにわたる約２０，０００の測定ポイントを、黄斑から毛様体までの距離にわたってプロットした（図５Ｅ）。
網膜のフラットマウントを、ＯＣＴ封入剤に包埋し、イソペンタン上で凍らせた。凍結切片を、１０μｍの厚さで、中心窩、周辺中央および周辺を通して収集し、スライドを、免疫蛍光標識化（ＩＦＬ）のために染色した。ＲＰＥの平面画像を、フラットマウントされた網膜の切片の脈絡膜からＲＰＥを剥がし、ＲＰＥがスライド上に下向きに置かれるように切片を反転させることによって作製し、次いでこれをＩＦＬのために染色した。ＩＦＬを、３０分間の０．１％のＴｒｉｔｏｎ－ｘ透過処理、続いてソレンソンのリン酸緩衝液中の５％の正常なロバ血清／６％のウシ血清アルブミンで１時間血清タンパク質ブロッキングを行った後に実行した。ＩＦＬを、表２に示す染料および抗体を使用して、４℃で終夜行った。
Figure 2022529775000003
組織切片をイメージングし、得られた画像を図６Ａ～２５Ｅに示す。指向性を実証する細胞型ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ビリオンの概要を表３に示す。
Figure 2022529775000004
ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを、細胞特異的マーカーを用いる共局在化の手動の細胞計数によって定量化した。網膜のさまざまな領域におけるＧＦＰ陽性の双極細胞、錐体細胞およびＲＰＥ細胞の数を、図２６Ａ～２６Ｃにそれぞれ示し、表４にまとめる。ＧＦＰ陽性細胞の数は、網膜中の場所によって変化した。
Figure 2022529775000005
（実施例８：中和抗体プロファイルの決定）
中和抗体（ｎＡＢ）プロファイルを、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ウイルスおよびＡＡＶ２．５Ｔウイルスについて決定する。簡潔には、プールしたヒトＩｇＧ抗体（ＧａｍｍａｇｕａｒｄＩＶＩＧ）の連続希釈物を、ＧＦＰを発現するＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ベクターまたはＡＡＶ２．５Ｔベクターと組み合わせ、これを使用して、２９３Ｔ細胞に形質導入する。ＧＦＰ発現を、その後測定し、ＧＦＰ発現の阻害を使用して、ＩＣ５０を計算する。
（実施例９：ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１およびＡＡＶ２の中和抗体プロファイルの比較）
中和抗体（ｎＡＢ）プロファイルを、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ウイルスおよびＡＡＶ２ウイルスについて決定した。簡潔には、プールしたヒトＩｇＧ抗体（ＧａｍｍａｇｕａｒｄＩＶＩＧ）の３倍希釈系列を調製し、ＧＦＰを発現するＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ベクターまたはＡＡＶ２ベクター（それぞれ、ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１－ＣＭＶ－ＧＦＰまたはＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ）と組み合わせた。次いで、混合物を使用して、２９３Ｔ細胞に形質導入した。細胞を３日間インキュベートし、その後、ＧＦＰ発現を測定した。ＧＦＰ発現の阻害を使用して、ＩＣ５０を計算した。ＩＣ５０は、ＧＦＰ発現が５０％低減した、プールされたヒトＩｇＧ抗体試料の希釈度の逆数として報告する（例として、ＩＣ５０が１００とは、１：１００で希釈されたＩＶＩＧが、ＧＦＰ発現を５０％低減したことを示す）。より高いＩＣ５０値は、プールされたヒトＩｇＧ抗体中に存在する抗体によるＡＡＶ形質導入の阻害の増加を示す。
ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１およびＡＡＶ２に対する阻害曲線を図２７Ａ～２７Ｂに示す。ＡＡＶ２は、１０３．８の計算ＩＣ５０を有し、ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１は、９．３の計算ＩＣ５０を有していた。
配列
Figure 2022529775000006
Figure 2022529775000007
Figure 2022529775000008
Figure 2022529775000009

Claims (46)

  1. （ａ）親アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質に比べてアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変配列を含むバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質であって、前記改変配列が、ＨＫＦＫＳＧＤ（配列番号１）を含み、アミノ酸残基の番号付けが、ＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質に対応する、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質；および
    （ｂ）治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列
    を含む、組換えＡＡＶビリオン。
  2. 前記親ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質、またはＡＡＶ５およびＡＡＶ２ハイブリッドキャプシドタンパク質である、請求項１に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  3. 前記親ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２．５Ｔキャプシドタンパク質である、請求項１または２に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  4. 前記親ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１キャプシドタンパク質である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  5. 前記改変配列が、ＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３）を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  6. 前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号４または配列番号５に記述されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するキャプシド配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  7. 前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号６または配列番号７に記述されるキャプシド配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  8. 前記ｒＡＡＶビリオンが、バリアントＡＡＶ５、またはバリアントＡＡＶ２およびＡＡＶ５ハイブリッドビリオンである、請求項１から７のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  9. 前記ｒＡＡＶビリオンが、バリアントＡＡＶ２．５Ｔビリオンである、請求項１から８のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  10. 哺乳動物に硝子体内注入される場合に、網膜の細胞に形質導入することができる、請求項１から９のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  11. 哺乳動物に硝子体内注入される場合に、光受容細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、および網膜色素上皮細胞のうちの１つまたは複数に形質導入することができる、請求項１０に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  12. 哺乳動物に硝子体内注入される場合に、網膜色素上皮細胞に形質導入することができる、請求項１０または１１に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  13. 前記治療用遺伝子産物が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはタンパク質である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  14. 前記治療用遺伝子産物が、抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）遺伝子産物である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  15. 前記治療用遺伝子産物が、オプシンである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  16. 前記治療用遺伝子産物をコードする前記ポリヌクレオチドが、１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲと隣接している、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  17. 前記１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶもしくはヒツジＡＡＶのＩＴＲ、またはそれらのバリアントである、請求項１６に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  18. 前記１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲが、ＡＡＶ２のＩＴＲまたはＡＡＶ５のＩＴＲである、請求項１６または１７に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  19. ＡＡＶ２．５Ｔと比較して、変化した細胞指向性を有する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  20. 請求項１から１９のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオンを含む医薬組成物。
  21. ｒＡＡＶビリオンを産生するための方法であって、
    （ａ）ｒＡＡＶビリオンが産生される条件下で宿主細胞を培養するステップであって、前記宿主細胞が、
    （ｉ）親ＡＡＶキャプシドタンパク質に比べてアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変配列を含むバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記改変配列が、ＨＫＦＫＳＧＤ（配列番号１）を含む、ポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶのＩＴＲと隣接している治療用遺伝子産物をコードする配列を含むポリヌクレオチドカセット；および
    （ｉｖ）ＡＡＶヘルパー機能
    を含むステップ；ならびに
    （ｂ）前記宿主細胞によって産生されたｒＡＡＶビリオンを回収するステップ
    を含む、方法。
  22. 治療用遺伝子産物を被験体の網膜に提供する方法であって、前記被験体に、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン、または請求項２０に記載の医薬組成物を硝子体内注入によって投与するステップを含む、方法。
  23. 前記被験体が、急性黄斑視神経網膜症、ベーチェット病、脈絡膜血管新生、糖尿病性ぶどう膜炎、ヒストプラスマ症、黄斑変性症、浮腫、多病巣性脈絡膜炎、後眼部位もしくは区域に影響を与える眼外傷、眼腫瘍、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ぶどう膜網膜疾患、交感性眼炎、フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群、ぶどう膜拡散、眼レーザー処置によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態、光線力学的療法によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態、光凝固、放射線網膜症、網膜上膜障害、網膜静脈分枝閉塞症、前部虚血性視神経症、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症、非網膜症糖尿病性網膜機能障害、網膜分離症、網膜色素変性症、緑内障、アッシャー症候群、錐体杆体ジストロフィー、シュタルガルト病、遺伝性黄斑変性症、脈絡網膜変性症、レーバー先天黒内障、先天停止性夜盲、全脈絡膜萎縮、バルデ・ビードル症候群、黄斑部毛細血管拡張症、レーバー遺伝性視神経症、未熟児網膜症、および色覚の障害からなる群より選択される１つもしくは複数の状態を有すると診断されているか、またはそれを有する疑いがある、請求項２２に記載の方法。
  24. 網膜の疾患または障害の処置を必要とする被験体の網膜の疾患または障害を処置する方法であって、前記被験体に、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン、または請求項２０に記載の医薬組成物を硝子体内注入によって投与するステップを含む、方法。
  25. 前記疾患または障害が、急性黄斑視神経網膜症、ベーチェット病、脈絡膜血管新生、糖尿病性ぶどう膜炎、ヒストプラスマ症、黄斑変性症、浮腫、多病巣性脈絡膜炎、後眼部位もしくは区域に影響を与える眼外傷、眼腫瘍、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ぶどう膜網膜疾患、交感性眼炎、フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群、ぶどう膜拡散、眼レーザー処置によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態、光線力学的療法によって引き起こされたか、もしくは影響を受けた後眼部の状態、光凝固、放射線網膜症、網膜上膜障害、網膜静脈分枝閉塞症、前部虚血性視神経症、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症、非網膜症糖尿病性網膜機能障害、網膜分離症、網膜色素変性症、緑内障、アッシャー症候群、錐体杆体ジストロフィー、シュタルガルト病、遺伝性黄斑変性症、脈絡網膜変性症、レーバー先天黒内障、先天停止性夜盲、全脈絡膜萎縮、バルデ・ビードル症候群、黄斑部毛細血管拡張症、レーバー遺伝性視神経症、未熟児網膜症、または色覚の障害である、請求項２４に記載の方法。
  26. 網膜の疾患または障害の処置を必要とする被験体の網膜の疾患または障害を処置する方法における使用のための請求項１から１９のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオンであって、前記方法が、前記被験体に、前記組換えＡＡＶビリオンを含む医薬組成物を硝子体内注入によって投与するステップを含む、組換えＡＡＶビリオン。
  27. 被験体の網膜の疾患または障害の処置のための医薬の調製における使用のための請求項１から１９のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  28. 前記疾患または障害が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、滲出型ＡＭＤ、萎縮型ＡＭＤ、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症または糖尿病性網膜浮腫である、請求項２６または２７に記載の組換えＡＡＶビリオン。
  29. 親ＡＡＶキャプシドタンパク質に比べてアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変配列を含むバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質であって、前記改変配列が、ＨＫＦＫＳＧＤ（配列番号１）を含み、アミノ酸残基の番号付けが、ＡＡＶ５ ＶＰ１キャプシドタンパク質に対応する、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質。
  30. 前記親ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質、またはＡＡＶ５およびＡＡＶ２ハイブリッドキャプシドタンパク質である、請求項２９に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質。
  31. 前記親ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２．５Ｔキャプシドタンパク質である、請求項２９または３０に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質。
  32. 前記親ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１キャプシドタンパク質である、請求項２９から３１のいずれか一項に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質。
  33. 改変ＡＡＶキャプシドタンパク質が、前記親ＡＡＶキャプシドタンパク質に比べてアミノ酸残基５７０～５７９にＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３）を含む、請求項２９から３２のいずれか一項に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質。
  34. 配列番号４または配列番号５に記述されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するキャプシド配列を含む、請求項２９から３３のいずれか一項に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質。
  35. 配列番号６または配列番号７に記述されるキャプシド配列を含む、請求項２９から３４のいずれか一項に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質。
  36. 請求項２９から３５のいずれか一項に記載のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸。
  37. 請求項３６に記載の核酸を含む発現ベクターであって、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸配列が、プロモーター配列に作動可能に連結されている、発現ベクター。
  38. ｒｅｐタンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項３７に記載の発現ベクター。
  39. 請求項３７または３８に記載の発現ベクターを含む細胞。
  40. 治療用遺伝子産物をコードする核酸をさらに含む、請求項３９に記載の細胞。
  41. 前記治療用遺伝子産物が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはタンパク質である、請求項４０に記載の細胞。
  42. 前記治療用遺伝子産物が、抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）遺伝子産物である、請求項４０または４１に記載の細胞。
  43. 治療剤が、オプシンである、請求項４０または４１に記載の細胞。
  44. 前記治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドが、１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲと隣接している、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の細胞。
  45. 前記１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶもしくはヒツジＡＡＶのＩＴＲ、またはそれらのバリアントである、請求項４４に記載の細胞。
  46. 前記１つまたは複数のＡＡＶのＩＴＲが、ＡＡＶ２のＩＴＲまたはＡＡＶ５のＩＴＲである、請求項４４または４５に記載の細胞。
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