PT93996B - Processo para a producao de factor de crescimento de celulas endoteliais vasculares e de dna codificador do mesmo - Google Patents

Description

Ests invento está relacionado com um factor de mento de células endoteliais vasculares e com meios e para a sua produção em quantidades terapêuticamente sign vas „ c resci— métodos ificatiTem sido desenvolvida uma. investigação considerável relativamente & morfologia e fisiologia das células secretoras da pituitária anterior e pars tu.ber a 1 is. No entanto, até recentemente, sabia-se pouco acerca da função das células foliculares ou foi icu.lo~estrels.das CFC), uma população morfologicamente bem caracterizada de células granulares. As FC são células estreladas que transferem processos cítoplasmáticos entre células secretoFerrara et al., Methods. Enz íed» Conn, P.M»), Vol» 124, pp» 245-253 CAcademic Press, New York, 1986) descreveu um método pars a. cu.ltu.ra. de populações homogéneas de FC» 0 padrão de crescimento e expressão da formação da cúpula, por FC em cultura e a. sua ultra—estrutura foram elucidados (Ferrara st al

Am

Physiol.a 252: E3Ô4-312 £1987)» Em adição, FC foram das como elementos de transporte de iões, possivelmente envolviuas na rt?yuiàtÇão us u.OHíposxcao iónica e osmoxarxdade do τXuxdo intersticial nas células das cordas- da adeno-hipóíise (Ferrara e Gospodarowitz, Biochem. Siophys» Res. Comm», 157 s1576—1382 (1988). FC- produz ainda, o factor de crescimento de fibroblastos angiogénico mitogénio básico CbFGF) (Ferrara, et al., Proc „ Na 11»Ac ad» Sei», 84 s 5773-5777 £1987) = gene codificador de faFGF, descrito em Abraham et a;

EMPO J» 5 3 2523-2529 (1986) convencional, necessário ao transporte extracelular de proteír de acordo com as vias secretoras convencionais» Walter e Blobs d» Cell. E-iol»2X3557-561 (1981) assim como o gene codificac codifica um peptideo sin

da factor ds crescimento ds fibroblastos acidico (aFGF), descrita em 3aye et al», Science, 253s541 —544 (1986). Assim o factor de crescimento não é apreciavelmente secretado para o meia [Moscatel li. et al», 3» Cell Physil.129:275-277 (1986): Klagsburn et al», Proc. Natl. Acad» Sei. USA» 83:2448-2452 (1986)3 e os tipos de células responsivos são dependentes de bFBF exógeno para uma proliferação óptima em cultura, mesmo que possam ter concentrações intracelulares significativas do mitogénio. Neufeld et al, .Endocrinoloqy, 121:597-602 (1987); Schwsigerer st al», Endocrinoloqy, 12®:796-882 (1987); Schweiger et al», Exp.

Res»r,46: 71—30 (1988)» Foi sugerido que bFb'F poderá ser incorporado na membrana basal e subsequentemente libertado numa forma, solúvel apenas quando a matrix é degradada após a acção de enzimas especificas» Vlodavsky et

Proc« Natl» Acad» Sei

USA, 84s 2282-2286 <19tí7)» Tal mecanismo de libertação sugere um papel para cs factor de crescimento exclusivamente ou na maior parte das vezes em casos que envolvem degradação da. membrana basal ou lise celular, como seja remodelação de orgãos.

zação de feridas- ou neoplasia. Folkman e Klagsbrun, Science, 442-447 (1987).

cicarri· ~5*CS· aFGF são ambos mitogénios potentes para as células endoteliais da córnea, células epiteliais do cristalino, fibroblastos BHK-21, células adrsno-corticóides e queratinócitos, assim como células do endotélio vascular» Sospodarowicz et al =, Endocrine Reviews, Ss 95-114 (1987)s Baird et al«, Recent P roq» Horm»Res»» 425 143-186 (1986)»

Um mitogénio de células do endotélio vascular foi isolado e descrito por Plouet ε SospodarowiczThe Internat.1.ona 1

Symposium on the Development of the Vascular System, Madison, WI» April 23-26, 1989, entitulado Isolatian and Characterization of a New Vascular Cell Mitogens Vasculotropín. Mais recentemente»

Mitogens

um factor de crescimento de células endoteliais que se liga heparina designado factor de crescimento endotelial vascular foi identificado e purificada a partir do meio condicionado por células foliculares ou foiiculo-estreladas de pituitária bovina»

Ferrara e Henzei, Biophys» Res» Comm» 851 (1989)»

Verifica—se a necessidade de um factor de crescimento que ao contrário de aFSF e de faFSF não seja retido dentro da célula mas antes secretado» com resultante acesso directo ás células alvo» Tal factor de crescimento poderá desempenhar um papel mais dinâmico na regulação fisiológica da proliferação de células do endotélio vascular, tanto no crescimento cíclico de vasos ssnquineos que ocorre em orq-Sos cais como o corpt i uceum / -5 ; 231· (194-5)3 como na manutenção tónica do estado diferenciado do endotélio na árvore vascular»

Existe também a necessidade de um factor de crescimento que seja especifico de células do endotélio vascular» ao contrário de aFSF e de bFSF, os quais são activos num largo espectro ds células» Tal especificidade poderá ser terapêuticamente útil em condições em que se pretenda uma acção selectiva sobre as células do endotélio vascular, na ausência de proliferação excessiva de tecido conjuntivo₅ como sejam úlceras diabéticas ou danificações vasculares traumáticas» tíe bem que seja possível isolar e purificar um factor de crescimento de células endoteliais vasculares com os requisitos atrás descritos₅ a partir de fontes naturais para uso subsequente, a concentração reiativamente baixa da proteina em FC e o custo elevado,em termos de esforço e de custos» da recuperação em quantidades comerciais do factor de crescimento purificado a partir de FC trava o seu uso em laroa escala»

Assim, constitui um objectivo >-dq-presente inventa isolar DNA codificador de um factor de crescimento de células do endotélio vascular s produzir quantidades comercialmente úteis da proteína a partir de uma fonte terapeuticamente aceitável.

Um outro objectivo é obter o factor de crescimento de células do endotélio vascular numa forma não acompanhada da glicosilação associada ao correspondente factor de crescimento n at i vo.

Um o b j ec t i vo ad .1 c i on; aminoácidos e outras variantes células endoteliais vasculares ?

de modo adverso a actividade biolóqica da proteína

é preparar	a ssqtfencia	uS
do factor de	C r©5C Í.fFiG?n Í7.C5	de
ϊ não afectem	su bs t an ciaime	nte

έ ainda um outro objectivo produzir um factor de crescimento de células endoteliais vasculares completamente livre de outras proteínas da fonte natural.

Estes e outros objectivos do invento serão aparentes a partir da especificação como um todo.

Os objectivos deste invento são conseguidos através da expressão de um gene codificador de factor de crescimento de células endoteliais vasculares em cultura de células recombinantes,/ um processo que fundamentai mente se caracteriza pela obtenção de ácido nucleico codificador de factor de crescimento, transformação de células hospedeiras com o ácido nucleico codificador do factor de crescimento e cultura das células para expressarem o ácido nucleico codificador do factor ds crescimento na cultura de células hospedeiras.

Numa realização especifica, sste / irt^ento engloba uma sequência, ds ácido isolada compreendendo uma. sequência que codifica, um factor de crescimento de células endoteliais vasculares tendo um peso molecular de aproximadamente 45 000 daltons em condições não redutoras e de aproximadamente 23 000 em redutoras conforme medido por SDS-PA6E.

Num outro aspecto o invento proporciona, uma sequência de DNA isolada compreendendo uma. sequência qus híbrida com a seq u/ên c i a d e DNA : 5^?-CCTATSGCTSAASSCGGCCASAASCCTCACGAASTGGTGAAGTTCATSSACGTGTATCA-3⁵ quando incubada com ela. a. 42 C em formamida. a 20% ₅ 5 x SSC, fosfato de sódio 50 mí-1 pH ó,S, pirofosfato ds sódio a 0₃1₅ solução de Denhardt 5x e 50 pq/ml de DNA de esperma, de salmão e lavada com 2x SSC, 0,1% SDS a 42°C, em que a referida sequência contem pelo menos cerca de dez nucleotidos.

Ainda num outro aspecto, o invento proporciona uma sequência, de DNft isolada compreendendo uma sequência qus hibrida com a sequência, de DNA da. Fig»2 quando incubada, com ela a 42°C em formamida a. 50%, 5xSSC, fosf a. to de sódio 50 mH pH 6,8, pirofosfa— to de sódio a 0,1%, solução de Denhardt 5x e 50 pg de DNA de esperma, de salmão e lavada cora ©,2 x SSC, 0,17. SDS a 42°C, em que a referida, sequência, isolada contem pelo menos cerca de dez n itc 1 eo t £ d eos„ ft sequência de t*NA pode também ser carac ter i zada como compreendendo uma sequência de DNA codificadora de um factor de crescimento de células endoteliais tendo uma sequência de aminoá— eidos suficientemente duplicativa da do factor de crescimento de células endoteliais vasculares para permitir que sla tenha a propriedade biológica de (a) promoção selectiva do crescimento de células endoteliais vasculares mas não de células endoteliais da / ' *-*> Λ \ córnea bovina, células epiteliais do cristaii;rid'..'.células adreno-corticóides, fibroblastos BHK-21 ou queratinócitos ou Cb) reacção imunológica cruzada com um anticorpo induzido contra, pelo menos uia epitopo da correspondente proteína nativa.

Noutras realizações, o invento está relacionado com Cl) sequências de DNA marcado para, fins de sns·:

_L tt

DNA operacionalmente ligadas expressão contendo a sequência um proffloxor

C 2} seq uên c x as d e <35 vectores de ds DNA descrita atrás operacionalmente ligada a sequências de controle reconhecidas por um hospedeiro transformado pelo vector s (4) células hospedeiras transformadas com o vector de expressão atrás descrito» uutros aspectos do invento são dirigidos a novas formas do factor de crescimento de células endoteliais vasculares natural, incluindo o factor que não é acompanhado da glicosilação nativa associada, tendo pelo menos cerca de 807» de homologia com a sequência de aminoácidos da proteína madura mostrada na Fig»2 ou Fig.l© e possuindo uma ou ambas as propriedades biológicas de Ca) promoção selectiva do crescimento de células endoteliais vasculares mas não de células endoteliais da córnea bovina, células epiteliais do cristalino, células adreno-corticóides, fibroblastos BHK—21 ou queratinócitos ou Cb) reacção imunológica cruzada com um anticorpo induzido contra pelo menos um epitopo da correspondente proteína nativa» Tal factor de crescimento de células endoteliais vasculares é geralmente obtido como um produto de expressão em cultura de células recombinantes heteróIogas» 0 factor de crescimento em qualquer forma como um componente de uma cultura de células recombinantes é novo»

Numa outra realização, o invento é dirigido a uma composição farmacêutica útil para a promoção do crescimento de de células do endotélio vascular compreendendo uma. quantidade

terpêuticamente eficaz do factor endoteliais vasco, lares, produzido veículo farmacêuticamente aceitável de crescimento de células por via. recombinante, num

Também è aqui contemplado um método para o tratamento de trauma afectando o endotélio vascular caracterizado pela administração a. um animal ou humano , sofrendo do referido trauma, de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica atrás descrita.

factor de s derivaprodutos e presente invento torna possível produzir um crescimento de células endoteliais vasculares s/ou seu dos por técnicas recombinantes, assim como proporciona métodos relacionados com tal produção,

Pensa método aqui desse ja importante vascular na anexem pio ulceras de traumas tais se que o factor de crescimento preparado pelo rito © útil para o tratamento de estados em que uma acção selectiva sobre as células do endotélio ência de crescimento excessivo de tecido, por diabéticas e danificações vasculares resultantes como feridas subcutâneas,

Dutras utilizações para o factor ds crescimento serão óbvias para os familiarizados com a matéria.

A tigura 1 descreve a sequência dica usada no despiste de bibliotecas de pituitária bovina relativamente a clones crescimento, assim como o empareihamento obtida da sonda oligonuclsoticélulas foliculares de de cDNA do factor de com a sequência de DNA

A Figura 2 descreve a. sequência de nucleotidos- completa e a sequência de aminoácidos deduzida do factor de crescimento de

V células endoteliais vasculares bovino dc* clone p.vegf»6. Us aminoácidos previstos da proteina. estão apresentados por baixo da. sequência de DMA e estão numerados a partir do primeiro resíduo amioacidos com numeros líder ou preproteína.

do extremo N da sequência, proteica. Os negativos referem—se à sequência sinal enquanto que os números positivos se referem à proteína, madura. A localização da sonda oligonucleotidica está indicado por sublinhado„

A Figura 3 descreve a construção do vector de expressão de partida pFQCIS usado para construir o vector de expressão final o

A Fiqura 4 descreve a construção do vector intermédio pCIS2»tíc24D para, o Factor VIII que o sitio Ciai não é afectada por meti lação obstrutora = Também esta apresentada a subclonaqem dos fragmentos da 408 e 416 pb da região cc ^:icadora do Factor

VIli para. a. construção de um plasmídeo de fusão.

A Figura 5 descreve a construção do plasmídeo intermédia pUC.8d28 contendo a região de fusão de uma variante do Factor VIlí num vector pUC =

A Figura 6 descreve a construção do vector de expressão intermédio codificador de uma proteína variante do Factor VIII pCIS2«8c28D»

A Figura 7 descreve a construção do vector de expressão pRK5 no qual foi inserido o DNA codificador do factor de crescimento de células endoteliais vasculares»

- ? Η

Α Figura 8 descreve a construção do vector de expressão pRKS.vegf.ó usado para transformar células hospedeiras de mamífera para produzir o factor de crescimento»

A Figura 9 descreve os efeitos do factor ds crescimento de células endoteliais vasculares sobre o crescimento de diferentes tipos celulares» CEC, células do endotélio da córnea? BAC, células adeno-cortieóides bovinas;KTC₅ queratinócitos? LEC, células epiteliais do cristalino? BHK—21» células de rim de cabaia b-ábé₅ clone 21? ACC» células do endotélio capilar do córtex adrenal? BBC, células endoteliais capilares do cérebro bovino? HUVE células endoteliais da veia umbilical humanas FBAE células endoteliais de aorta bovina fetal? ABAE células endoteliais de aorta bovina adulta» As células foram semeadas no respectivo meio de crescimento, incubadas com uma concentração máxima do factor de crescimento e contadas após 4 ou ‘5 dias

U5 resultados estão expressos em percentagem da testemunha adequada

A Figura 10 descreve a sequência de nucleotídeos completa e a sequência de aminoácidos deduzida do factor de crescimento de células endoteliais vasculares humano aqui a partir do clone p»vegf»2í« Os aminoácidos previstos da proteína estão apresentados por baixo da sequência de DMA e estão numerados a partir do primeiro residuo extremo N da sequência proteica» Os aminoácidos cora números negativos referem—se à presumível sequência sinal líder ou preproteína, enquanto os números, positivos se referem à proteína madura»

A Figura 11 descreve a construção do vector de expressão p»vegf»21 usado para transformar células hospedeiras de mamífera para produzir o factor de crescimento»

fii Figura 12 descreve ursa comparação entre as sequências de .aminoácidos de VEGF bovino íb) s de VEBF humano Ch), os aminoácidos dentro de rectângulos indicam regiões homologas.

Conforme aqui é usado/⁵ factor de crescimento de células endoteliais vasculares ou VEGF refere-se a um factor de crescimento mamífero derivado originalmente de células foliculares de pituitária bovina tendo a sequência de aminoácidos da Fig.. 2, juntamente com seus análogos ou variantes tendo a actividade biológica do correspondente VEGF nativo, incluindo a sequência de aminoácidos humana da Fig»10» A actividade biológica do VEGF nativo é partilhada por análogo seu ou variante que seja capas de promover o crescimento selectivo de células endoteliais vasculares mas não de células endoteliais de córnea bovina, células epitsliais do cristalino células adreno-corticóides, fibroblastos BHK—21 ou querafinócitos, ou que possui um ep.it.opo imune que dá reacção imunológics cruzada com um anticorpo induzido contra pelo menos um epitopo do correspondente VEGF nativo»

Análogos ou variantes são definidos como moléculas em que s sequência de aminoácidos, glicosilação, ou outra caracterí stica do VEGF nativo foi modificada covalentemente ou não covalentemente» Assim as variantes podem ou não ter um peso molecular de aproximadamente 45 kD (conforme determinado por SDS-PAGE realizada na ausência de um agente redutor, e.g» β-mercaptoetanol ou ditiotreitol>« Por exemplo, VEGF não glicosilado tendo a sequência, nativa madura terá um peso molecular inferior em SDS-PAGE não redutora» As variantes da sequência de aminoácidos incluem não só alelos da sequência aa.

mas também mutações dela predeterminadas» Geralmente as variáveis dat sequência de aminoácidos têm uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 8©X de homologia e mais tipicamente pelo menos homoloqia. relativamente â do VEGF nativo da

1? -

Fig,2, incluindo variantes con? pelo menos 95% de homologia, como seja a sequência humana mostrada na Fig, 10« Daqui em diante- o termo VEGF significará a sequência nativa ou uma forma variante a menos que de outro modo seja indicado»

Assim₃ no -âmbito do presente invento está incluído um VEGF tendo a sequência de aminoácidos de VEF6 bovino como descrito na Fig.2_s proteinas VEGF análogas de outras espécies tais como VEGF humano, equino, porcino, ovino, canino, murino -e felino e similares, e variantes destas sequências de aminoácidos biológicamente activas destas moléculas de VEGF, incluindo alelos e derivados covalentes gerados in vitro de proteinas VEGF que apresentem actividade biológica»

A expressão “trauma afectando o endotélio vascular refere-se a trauma, como seja danificações, dos vasos sanguíneos ou coração, incluindo a rede vascular dos orgãos, a que um animal ou humano, de preferência um mamífero e mais preferencialmente um humano foi sujeito» Exemplos de tais traumas incluem feridas, incisões e úlceras, preferencíalmente úlceras diabéticas e feridas ou lacerações- dos vasos sanguíneos ou coração. Os traumas incluem condições provocadas por causas- internas assim como as impostas por um agente extrínseco, por exemplo um patogénio, que pode ser melhorado através da promoção do crescimento ds células do endotélio vascular»

Derivados e variantes da sequência ds aminoácidos de VEGF são úteis pela sua actividade biológica pois está relacionada com a actividade terapêutica»tal como aqui foi descrito algures, assim como pela sua capacidade de ligação a anticorpos anti-VEGF» Os derivados e variantes possuindo esta última característica são úteis na purificação de anticorpos- ou marcadas, coisa reagentes em imunoensaios para VEGF quando tendo estes '** X

Λ retido ou não a sua actividade biológica

derivadas e variantes terapêutica =

Dentro do Smbito deste invento estão incluídas modificações- covalentes de uma molécula de VEGF» Fragmentos variantes de VESF tendo até cerca de í®ô resíduos podem ser convenientemente preparados por síntese in vitro. Tais modificações podem ser introduzidas na molécul, :ravês da reaccão aminoácidos específicos da proteína purificada ou bruta com um agente da derivatização orgânico que seja capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas ou resíduos terminais» Os derivados covalentes resultantes são úteis sm programas dirigidos para a identificação de resíduos importantes para a actividade biológica»

Normalmente os resíduos cisteinilo são reagidos com α-haloacetatos Ce correspondentes aminas)„ tais como ácido cloroacético ou cloroacetamida₅ para dar derivados carboximetilados ou carboxiamidometilados» Qs resíduos cisteinilo também são derivatizados por reacção com bromotrifluoroacetona, ácido ct-broroo-β- C 5-imidozoí 1) propiónico ₅ c 1 oroacet.i 1 fosfato IM-alqui 1 maleiffiidas, 3-nitro~2-piridildissulfeto, 2-piridildissulfeto de meti lo, ρ-cloromercuribenzoatoj 2-cIoromercuri-4-nitroíenol ou cloro-7-nitrobenzo~2-oxa~í,3-diazole.

Os resíduos histidilo são derivatizados por reacção com diet.ilpirocarbona.to a pH 5_s5—7_?® devido a este agente ser relati— vamente especifico para a cadeia lateral histidilo. Brometo de parabromofenacilo também é útil§ a reacção é de preferência realizada em caceai lato de sódio a ρΗ 6_S·®.

Ds resíduos- lisinilo e terminais amina são reagidos com anidridos succinicos ou outros anidridos de ácidos carboxílicos»

A derivatização com estes agentes tem o efeito reverter a carga dos residuos lisinilo. Outros reagentes- adequados para a deriva— tização de resíduos contendo «-amina incluem imido-esteres tais como picolinimidato de metilog fosfato de piridoxalj piridoxalg—

cloroboro-hidreto , ác ido isoureiag 2,4-pentanodionagnases com qlioxilato.

;rin i trobensenossuI fónico 5 O-meti1e reacção catalisada por transami—

Ds resíduos arqinilo são modificados por reacção com um ou vários reagentes convencionais, entre eles femlglxoxal,

2,3-butanediona, i,2-cicIo-hexanediona e ninidrina. A derivatiza— ção dos residuos arginina requere que a reacção seja efectuada em condições alcalinas devido ao seu elevs-do oK do orupo funcional a guanxdxna. Ainda estes reagentes podem reagir com os grupos de lisina assim como com o grupo epsilon-amina da arginina.

fi modificação especifica de residuos tirosilo per se tem sido extensivamente estudada,, com particular interesse em introdução de marcas espectrais em -residuos tirosilo por reacção com compostos aromáticos de diazónioou tetranitrometano. Mais vulgarmente, são usados N-acetxlimidazol e tetranitrometano para formar espécies D~acetxItirosilo e derivados 3-nitro, respectivamente. Os residuos tirosilo são iodinados usando _ou para preparar proteínas marcadas para usar em radioimunoensaio, sendo adequado o método da cloramina T descrito acima.

Ds grupos laterais carboxilo (aspartilo ou qlutamilo) são selectivamente modificados por reacção com carbodiimidas (R⁹-M-C-N-R⁵) tais como i-ciclo—hexiI-3-C2—morfolinil—C4-stil)carbodí imida ou í -eti 1 -3- í 4-azonia-ⁱ-4 „ 4-dimeti 1 pen ti 1) carbodi imida. Ainda os residuos aspartilo e glutamilo são convertidos em asparaqinilo e glutamilo por reacção com iões amónio.

A derivatização com agentes bifuncionais é útil para a. ligação cruzada de VESF a uma matrix ou superfície de suporte insolúvel em água para usar no método de purificação de anticorpos anti-VESF» Os agentes de ligação cruzada norm-almente usados incluem, e»q» , 1,1— bisCdiazoacetil)-2—feniletano =. glutaraldeido, ésteres de N-hidroxi-succinímida, por exemplo» ésteres com ácido azitío-salicilico, imidoesteres homobiíuncionais» incluindo ésteres de di-succinimidilo tais como 3,3—ditiobisCsuccinimidilpropionato e maleimidas bifuncionais tais como bis-N-malrimido-1,8-Dctsno. Os agentes de derivatízação tais como metil-3-CCp-azidofenil)dítio3propioimídato dão intermediários fotosctivâveis que sao capazes de Tormar ligações cruzaoas na presença de luz» Como alternativa são empregues em imobilização matrizes reactivas insolúveis em água tais como açucares activados com brometo de cianogénio e os substratos reactivos descritos nas Pat» U.S. Nos» , 9o 9 5 28 / 5 o 5 69 í , © í 6 5 4, j. 9o 51 .zb ji 4, z4 ζ , 64.z 5 4 = 22¾ , O-z / » e

5 330 3 440» □s- resíduos glutaminilo e asparaginilo são frequentemente desamidados para dar os correspondentes resíduos glutamilo e aspartilo» Como alternativa, estes resíduos são desamidados em condições ligeíramente ácidas» Ambas as formas destes resíduos estão dentro do Smbito deste invento.·.

Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxilo ds resíduos serilo ou treonilo, metil-ação dos grupos <2—amina das cadeias laterais de lisina.. arginina e histidina CT»E» Crsighton, Proteinas Structure and Molecular Propsrtjgs, W»H» Freeman & Co», San Francisco, pp. 79-86 C19833), acetilação d-a amina N-terminal e nalguns casos, amidação do grupo carboxilo C-terminal» fts variantes da sequência de aminoácidos de VEGF podem

também ser preparadas por mutações no DNA» Tais variantes incluem incluem por exemplo delecçõss, inserções ou substituições de resíduas dentro da sequência de aminoácidos mostrada na Figura 2« Pode também ser feita qualquer combinação de delecção» inserção e substituição para chegar à construção final, desde que a construção final possua a actividade pretendida. Obviamente as mutações que serão feitas no DMA codificador da variante não devem colocar a sequência fora da grelha de leitura e de preferência não criarão regiões complementares que possam produzir estruturas secundárias de mRNA íver EP 75„444A>»

A nível genético, estas variantes são normalmente preparadas- por mutagénese dirigida de nucleotidos no DMA codificador de VEGF, produzindo assim DMA codificador da variante e depois expressando o DNA em cultura ds células recombinantes,. As variantes apresentam tipicamente a mesma actividade biológica, qualitativa do análogo natural.

£>«=? oem que o sitj da introdução de uma 'variação da sequência de aminoácidos seja predeterminado, a mutação per se não necessita de ser predeterminada. Por exemplo, para optimizar a eficácia da mutação num dado sítio, pode—se fazer mutagénese ao acaso no codão ou região alvo e as variantes de itor íx pressas despistadas quanto à combinação óptima da actividade pretendida» São bem conhecidas as técnicas para fazer mutações por substituição em sítios predeterminados no DNA tendo uma sequência bem conhecida, por exemplo por mutagénese especifica de sitio»

A preparação aqui foi dito ê de pre fica de sitio do DNA variante da proteína de variantes de VtGF de acordo com o que erência conseguida por mutagénese especi~ que codifica uma versão variante ou não anteriormente preparada» A mutagénese /

especifica de sitia permite a produção de variantes de VEbF através da utilização de sequências olíqonucleotidicas especificas que codificam a sequência de DNA da mutação pretendida , assim como um número suficiente de nucleotídeos adjacentes, para proporcionar uma sequência iniciadora de tamanha ε complexidade de sequência suficientes para formar um duplex estável em ambos os lados da junção da delecção a ser atravessada» Tipicamente é preferido um iniciador de aproximadamente 2@ a 25 nucleotídeos de comprimento, com cerca de a 10 resíduos de ambos os lados da junção a ser alterada» Em geral, a técnica de muta.genèse especifica de sitio é bem conhecida, conforme exemplificado pelas

Conforme será apreciado, a técnica de especifica de sitio tipicamente emprega um vector existe na forma de cadeia simples e ds cadeia dupl típicos úteis na mutagénese dirigida incluem vectores fago hli-3, por exemplo, como descrito por Messing et. Cleveland Symposium on Macrornolecules and Recombinant mutagénese f ãg i c o q u e i Vec to restais como o a 1 = , Third DNA, Editor

A» Walton, Elsevier, Amsterdam (1981)= Estes fagos facilmente podem ser adquiridos comercialmente e a sua utilização é geralmente bem conhecida dos familiarizados com a área. Como alternativa, podem ser empregues vectores plasmídeo que contêm uma origem de replicação de fagos de cadeia simples (Vieira et» al=, M.eth = Enzymo 1 = 155s 3 118873 para se obter DNA de cadeia simples.

Em geral, a mutagénese dirigida ds acordo com o que se descreve é efectuada obtendo primeiro um vector de cadeia simplesque inclui na sua. sequências uma sequência de DNA que codifica a

proteína		interesse» Prepara-se um	iniciador ol	igonuc1eot id ico
portador	d a	sequência mutagenizada p	iretendida.	geralmente por
síntese.	por	exemplo pelo método de	Crea. et» al	», Proc = Natl»

í USA)» zo s

Acad= Sei o/8o (1978)

Este iniciador é então icS

emparelhado com o vector de cadeia simples contendo a sequência da proteína, e· submetido a. encimas de polimerização do DNA, tais como fragmento Klenow da polimerase I de E. col i para completar a síntese da. cadeia, portadora da mutação. As-sim, forma-se um heteroduplex em que uma cadeia, codifica a sequência original não mutagenizada e a segunda cadeia é portadora da mutação pretendida. Este vector heteroduplex é então usado para transformar células adequadas tais- como as células- JMÍOí e são seleccionados clones que possuam vectores recombinante·» portadores do arranjo de sequência mutagenizada.

Após selecção de tal clone» região ds mutagenizada pode ser removida e colocada num vector pi o LSi.na adequado para a produção de proteína_? geralmente um vector de expressão do tipo que pode ser adequado» empregue na transformação de um hospedeiro

As delecçSes da sequência de aminoácidos -geralmente variam entre aproximadamente 1 e 3® resíduos., de preferência 1 a 1® resíduos- e tipicamente são contíguas.

As inserções de sequências de -aminoácidos incluem

Tusoes amino — polipéptidos ds e/ou carboxil-tsrminsis desde um resíduo até :amanho essenc iaIments i1 imitado, inserções intra-sequência ds um ou mais resíduos de assam como am i n oãc i d os-»

As x n s-ε rç óes x n c ra-seq u a n c x a madura de VEGF)podem variar resíduos, ds preferência 1 terminal inclui a fusão de (i.e._?inserções dentro da sequência geralmente entre cerca de i e í® a 5. Um exemplo de uma inserção uma sequência sinal, heterõloga. ou homóloga para a célula hospedeira, ao extremo N da molécula de VEÍ3F para facilitar a secreção de VESF madura a partir de hospedei ros recornbi n an tes=

+. re

□ terceiro grupo de variantes sSo aquelas em que pelo menos um resíduo de aminoácido na. molécula, de VEBF_S de preferência. apenas um₉ foi removido e inserido um residuo diferente no seu lugar. Tais substituições sSo de preferência, feitas de acordo com a tabela 1 que se segue, quando se pretende modular finamente as características ds uma. molécula, de VEBF =

Tabela 1

.duo oriqinal	Exemplos de subs'
A1 a C A)	gli? ser
ArgCR)	1 is
Asn C W)	gin ? his
AspCD)	glu
uisCL;	ser
Gin CB)	asn
SluCE)	asp
Sii CB)	âldtj pro
His c H í	asn? gin
IleCI)	leu5vai
Leu CL)	ile?vai
LisCK)	arg? gin? glu
MetCM)	leu? tir? ile
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As alterações substanciais imunológica sSo feitas seleccionando vadarss do que as da Tabela 1, i„e«, na função ou identidade substituições menos conserseleccionando resíduos aue '20

diferem mais significativareente no seu efeito na manutenção (a) da estrutura do esqueleto polipeptidico na área da substituição, por exemplo, como uraa conformação em folha ou helicoidal íb) da carga ou hidrofobicida.de da. molécula, no sitio alvo, ou íc) do volume da cadeia lateral» As substituições que em geral se espera produzam as maiores- alterações na.s propriedades de VEGF serão aquelas em que Ca) glicina e/ou prolina CP) é substituída por um outro aminoácido ou é eliminado ou inserido? Cbíum residuo hxarafiiico, e»g», ssrxio residuo hidrofobo, e.g», vaiilo ou alanilos Cc) um residuo u t r o r e s i d í

1. tlV-3. = (5 a G ;

ou treonilo, é substituído por um isoleucilo, fenila.la.nilo, cisteína é substituído por qualquer outro residuo, Cd) um residuo tendo uma cadeia lateral electropositiva, e.g», lisilo, arginilo ou histidilo é substituído por um residuo tendo uma carga electronegativa, e,g=, fenilalanina, é substituído por um que não tenha tal cadeia lateral.

h maior parte das delecçoes e inserções, a substxtux ções em particular, não se espera, que produzam alterações radicais nas características da molécula de VEGF» Mo entanto quando é difícil prever o efeito exacto da substituição, delecção ou inserção com antecedência.

íamilia:x^adus :om saberão que o efeito será avaliado por ensaios de despiste de rotina» For exemplo tipicamente uma variante é feita por mutaqé— nese especifica de sitio do acido nucleico codificador de VEGF, expressão do ácido nucleico variante em cultura de células recombinantes e, facultstivsmente, purificação purificação a partir da cultura de células, por exemplo por absorção por xmunoatxnida.de numa coluna de anticorpos poiiclonais de coelho anti-VEGF ( para adsorver a variante através da sua ligação a pelo menos um epitopo imune restante)=

Uma vez que VEGF tende a agregar-se em dímeros, está dentro do âmbito do invento proporcionar heterodímeros e homodíBieros em que uma ou mais subunidades sejam variantes. Sempre que .ambas as subunidades sejam variantes, as alterações na sequência de aminoácidos pode ser a mesma ou diferente para cada cadeia subunidade, Os heterodímeros são facilmente produzidos por cotransformação de células hospedeiras com DNA codificador de ambas as subunidades e, se necessário, purificação do heterodímero pretendido ou através da síntese separada das subunidades, dissociação das subunidades ί e,g,, por tratamento com um agente caotrópico como seja ureia, bidrocloreto de guanidina ou similares) , misturando as subunidades dissociadas e depois reassociando as subunidades por diálise para remover o agente caotrópico, purificada é então despistada num ensaio ds despiste adequado para a característica pretendida, Por exemplo, uma alteração no carácter imunológico da molécula de VEGF, como seja a afinidade para um determinado anticorpo, é medida através de um imunoensaio do tipo competitiva, As alterações no aumento ou supressão do crescimento do endotélio vascular pelos mutantes candidatos são medidas pelo ensaio adequado, Modificações de tais propriedades das proteínas, tais como estabilidade redox ou térmica, hidrofobicidade, susceptibilida.de a degradação proteolítica ou a tendência para agregar com veículos ou em multímeros são testadas por métodos bem conhecidos dos familiarizados com a matéria,

A molécula de VfcGt pretendida pode ser preparada por qualquer técnica, incluindo métodos recombinantes, Igualmente, um

DNA isolado é aqui entendido como significando DNA sintetizado quimicamente, cDNA, DNA cromossómico ou extracromossómico com ou sem as regiões deiimitantes 3⁵ e/ou 5’, L>e oreferência a VESF

X

pretendida é aqui feita por síntese em cultura de células recombinantes.

Para tal síntese é necessário obter ácido nucleico que codifique um VEQF, DNA codificador de uma molécula de VEGr pode ser obtido a partir de células foliculares- de pituitária bovina por ía) preparação ds células, (b) fazendo uma biblioteca de cDNA a oartir com DMA marcado an á. 1 i se de hi b r i d ac So codificador de VESF ou de seus fragmentos ( até í@0 ou mais pares de bases de comprimento ) para detectar clones na biblioteca contendo sequências homologas e Cc) análise dos clones por análise com enzimas de restrição e sequenciação do ácido nucleico para identificar clones de tamanho completo» DNA que é capaz de hibridar com DNA codificador de VESF em condições de severidade baixa é útil para identificação de DNA codificador de VESF» As condições de severida ds a11as baixas são definidas abaixo, tíe numa biblioteca de cDNA não estiverem presentes clones ds tamanho completo, então fragmentos adequados podem ser recuperados a partir de vários clones usando a informação da sequência ds ácido nucleico aqui divulgada pela primeira vez e ligados em sítioí oe restrição comuns aos clones para montar um clone ds caiaan no completo codificador de VEGF, Como alternativa, bibliotecas genómicas proporcionarão o DNA pretendido, A sequência do DNA codificador de VEBF humano que foi mais recentemente determinada por despiste de uma linha celular de leucemia humana está apresen t ad a na Fig, í @,

Uma vez identificado e isolado este DNA a partir da biblioteca ele έ ligado a um vector replicável para posterior clonagem ou expressão.

Num exemplo de um sistema de expressão recombinante um gene codificador de VEGF é expresso em células de mamífero por trai is i ormação

U.OÍO UiTi tuf expressão ••-^omfefcèéhdenda DNA codificador de VEGF. capazes de conseguir meio de cultura ou obter uma molécula secretada.

é preferível transformar células hospedeiras tal processamento de modo a obter VEGF no no periplasma da célula hospedeira, i.e., us vectores e métodos aqui descritos são adequados para usar em células hospedeiras de uma larga gama de p r oc a rióticos e euc ar ióticos» organismos

Em geral, certamente, são pr para a clonagem inicial das sequências vectores úteis no invento. Por exemplo, co 1 j. í<12 estirpe íiíi 294 (ATCC N23Í 4446) bianas que podem ser usadas incluem esti eferidos os procariatas de DNA e construção dos é particularmente útil E»_ = Outras estirpes micro— rpes de E. coli tais como

Ε» cali B e E» co 1 i XÍ7/6-ÍATCC N231 537)= Estes exemplos pretendem certamente ser ilustrativos e não limitantes.

Os procariotas podem Podem ser usadas as estirpes at estirpes W-51ÍD (F , lambda , K5772 (ATCC N253 635) e SRÍOÍ, is e outras enterobacteriâceas ou -Serrai.ia isarcesans e várias também ser usados para expressão, rás referidas, assim como E. coli prototrófica, ATCC M2 27 325), bacilos tais como Baci11us subti— tais como Sa1mone11a typhimu ri um espéc ies de pseudomonas .

sequências de controle que são derivadas com a célula hospedeira são usados em li ras. 0 vector ê normalmente portador de assim como de sequências de marcas que s nar selecção fenotípica em células transformadas» coli é tipicamente transformada usando pBR322 derivado de uma estirpe de E» coli (consultar, e de espécies compatíveis gação com estes hospedeium sitio de replicação, ão capazes de proporcioPor exemplo, E.

um plasmídeo q=, Bolívar et ií ϊ

•3-l=_s Gene, 95 L19773 )»ρΒΚ-522 contem genes de -'^insistência à ampicilina e à tetraciclina e proporciona assim meios fáceis de identificação das células transformadas» 0 plasmideo pBR322» ou outro plasmídeo ou fago bacteriano» devem também conter, ou ser modificados de modo a conterem, promotores que podem ser usados pelo organismo microbiano para a expressão das suas próprias proteínas»

Os promotores mais vulgarmente usados na construção ds DNA recombinante incluem os sistemas promotores da β-lactamase (penic.ilinase) e da lactose CChang et al», Nature, 375s 615 E19783s Itakura et al», Science, 198¾ 1056 E19773? Goeddel et al,, Nature, 281s 544 E19793 e um sistema promotor do triptofano (trp) (Goeddel et al», Nucleic Acids Res,

EPU NS U03d ^?6>» Se bem que estes sejam

8s 4057 C19803, Red» os mais vulgarmente descobertos e utiliusados, outros promotores microbianos foram d cados, e os detalhes- respeitantes ás suas sequências de nucleotideos foram publicados, permitindo a um técnico experiente ligá-los funcionaImente a vectores plasmídeos (consultar, e»g», Siebenlist et al», Ce11, 20¾ 269 C19803)»

Além de microorganismos procarióticos, também podem ser usados microorganismos eucarióticos ,tais como células de levedura» Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de padeiro, ê de entre os microorganismos eucarióticos o mais vulgarmenta usado, se bem que uma série de outras estirpes estejam disponíveis» Para a expressão em S-accharomycesé normalmente usado» por exemplo, o plasmídeo Yh‘p7 Cbtinchcomb et al», Nature

E19793?

Kingsman -et al =, Gene, 7; 141 C19/93? Tschemper et al». Gene, 10; 157 E198031» Este plasmídeo já contam o gene trpl que proporciona uma marca selectiva de uma estirpe mutante de levedura sem capacidade para crescer em triptofano, por exemplo, ATCC- NS 44,076 ou. PER4-1 CJones, Senetics, 85s 12 t19773)» A presença da •V lesão trpl como caracteristica do qenoma da célLflà*'ftèspedeira de levedura proporciona então um ambiente eficaz para a detecção de transformação através do crescimento na ausência de triptofano.

Sequências de promotores adequadas em vectores de levedura incluem os promotores da cinase de 3-fosfoglicerato (Hitzeman et al., 3. Biol. Chem., 255 s 2®73 E19803) ou de outras enzimas glicoliticas (Hess et al», J» Adv» Enzyme Req., 7; 149

C19681s Ho11and et al tíiochemistry, 1/s 490® 119/83« tais como enolase, desidrogenase de gliceraldeido-3-fosfato, hexocirsase, piruvato-descarboxilase, f osf of rutocinase, isosierass de glucose-é-fosfato, mutase de 3-fosfoglicerato, piruvato-cinase, tiosefosfsto-isomerase, fosfoglucose-isomerase e glucocinase» Ao construir—se plasmídeos de expressão adequados, as- sequências de terminação associadas a estes genes são também ligadas ao vector de expressão no extremo 3⁵ da sequência que se pretende expressa para proporcionar poliadenilação do mRNA e terminação. Outros promotores, que têm a vantagem adicional da transcrição ser regulada pelas condições de crescimento, são a região promotora da alcool-desidrogenase 2» isocitocrómio C, fosfatase ácida, enzimas de degradação associadas ao metabolismo ao azoto e a desidrogenase de gliceraldeido-3-fosfato atrás referida s enzimas responsáveis pela utilização de maltose ε galactose. é adequado qualquer vector plasmideo contendo sequências de promotor, origem de replicaçSo e terminação compatíveis com levedura»

Além ds mícroorganismos, podem também ser usados como hospedeiros culturas ds células derivadas de organismos multice— lulares. Em principio, pode-se trabalhar com qualquer cultura celular, derivada de vertebrado ou invertebrado. No entanto o interesse tem sido maior para células de vertebrados e a propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) tornou-se nos últimos anos um processo de rotina CTis-sue Culture» editares Kruss e Patterson <19/3)3» São celulares hospedeiras úteis as células s_>

Acadsmic de tais

Press, linhas

HeLa, linhas celulares ds ovário ds linhas celulares W13B, BHK, COS-7, expressão para tais células incluem uma origem de replicação um promotor expresso, juntamente com quaisquer s soma, sítios de «splicing» de RNA,

Λ exemplos VERO e

hamster chi	nês	(CHO) e	as
293 e KDCK»	Os	vectores	de
normaImenta	< se	necessár	-;i.o)

situado antes do pene a ser ítios de ligação ao ribossítios de poliadenilação e sequências de terminação da transcrição qus sejam necessárias

Para usar em células de mamífero, as- funçSes de controle nos vectores de expressão são muitas vezes proporcionadas por material virai» Por exemplo promotores normalmente usados sao derivados de polioma, Adenovírus 2 e mais frequentemente Virus Simio 40 (SV405« Os promotores precoce e tardio do SV40 são particularmente úteis porque ambos são obtidos facilmente a partir do vírus como um fragmento que contem também a origem de replicação virai de SV4@ CFiers et al», Nature, 273g 113 <1978)3» Podem também ser usados fragmentos maiores ou menores do SV40 desde que esteja incluída a sequência de aproximadamente 250 ph que vai desde o sitio HindiII até ao sitio BqlIsituado na origem de replicação virai» Ainda, é também possivel, e muitas vezes desejável, utilizar sequências de promotor ou de controle- normalmente associadas â sequência de gene pretendida, desde qus tais sequências ds controle sejam .compatíveis com os sistemas de cé Iu1as hospedei ras»

Uma origem de replicação pode ser proporcionada pel construção do vector para incluir uma origem exógena, como pod ser derivada do SV40 ou de outra fonte virai <e=q», Polioma buShO, VoV, Ur*V ? ou pode ser propoi* cionada p<exo mecanxsmo d replicação da célula hospedeira, Se o vector for integrado n genoma da célula hospedeira esta última pode ser suficiente

As culturas uelulcíres produitíffl quantidades satis

5T-a cc-

rxas de proteína? no entanto, afinações usando uma sequência codificadora secundária servem para aumentar ainda mais os níveis de produção. Uma sequência codificadora secundária compreende di-hidrofolato-redutase íDHFR) que ê afectada por um parâmetro controlado extemamente, como seja o metotrexato CMTX), permitindo assim o controle da expressão através do controle da concentração de metotrexato»

Ao seleccionar-se uma célula hospedeira preferida para transfecção pelos vectores do invento que compreendem sequências de DMA codificadoras de VEBF e da proteína DH-FR, é adequado seleccionar—se o hospedeiro de acordo com o tipo de proteína DHFR empregue» Se se empregar proteina DHFR selvagem, é preferível seleccionsr uma célula hospedeira que seja deficiente em DHFR, permitindo assim a utilização da sequência codificadora ds DHFR como marca de transfecção com êxito em meio selectivo sem hipo— xantina, glicina, e timidína» Neste caso uma célula hospedeira adequada é a. linha celular de ovário de hamster chinês (CHO)deficiente sm actividade DHFR, preparada e propagada como descrito por Urlaub e Chasin, Pr oc» Natl» Acad» Sei» (USA) 77; 4216 C198©)»

Por outro lado.

usar como sequência de controle proteina DHFR cora afinidade de ligação baixa para o MTX, não é necessário usar células deficientes em DHFR» Devido -à DHFR rautante ser resistente ao metotrexato, pode-se usar meio contendo MTX como meio de selecção desde que as próprias células sejam sensíveis ao metotrexato» A maior parte- das células eucarióticas que sso capazes de absorver MíX parecem ser s-ensíveis ao metotre— xato» Uma destas linhas celulares úteis é a linha CHD, CHO—Kí CATCC NS CCL 61)»

-χ λ ..Α construção de vectores adequados contendo as sequências codificadora s de controle pretendidas empregam técnicas de ligação convencionais» Os plasmideos ou fragmentos de DNA isolados são clivados, modificados e rsligados na forma pretendida para preparar os plasmideos necessários»

Ca;

de extremos csrses, a preparação pode

-O, ser tratada durante 15 minutos a 15 C com í® unidades de Poiimsrase I (Klenow), extraída com fenol-clorofórmio e precipitada com etanol,,

A separação por tamanhos dos fragmentos clivados pode ser efectuada usando um gel de 6 por cento de poliacrilamida descrito por Boeddel et al., Nuc1eic Acids Res», Ss 4057 (1980)»

Para análise de confirmação de sequências correctas nos plasmideos construídos, as misturas de ligação são tipicamente usads para transformar E_= outras estirpes adequadas de E» coli e os transformantes com êxito seleccionados quanto à resistência à ampicilina ou tetraciclina conforme adequado» Os plasmideos dos transformantes são preparados e analisados por mapeam-ento de restrição e/ou sequenciação de DNA pelo método de Messing et al», Nucleic Acids Res»,

9: 309 (19QÍ) ou pelo método ds Maxam et al», Methods of

Enzymoloqy» 65: 499 (1980)»

Após introdução do DNA na célula hospedeira de mamífera e selecção em meio para transfectantés estáveis, a amplificação de sequências codificadoras da proteína DHFR é efectuada por crescimento das culturas de células hospedeiras na presença de concentrações ds mstotrexato ds aproximadamente 2u 000- 500 000 nM, o qual é um inibidor competitivo da actividade de DHFR» A gama ds concentrações eficazes é aitamente dependente da natureza

do gene DHFK e das características do hospedeiro«Certamente, de um modo geral os limites superior e inferior não podem ser fixados. Também podem ser usadas concentrações adequadas de outros análogos do ácido f61ico ou de outros compostos gue inibem DHFR. No entanto, o próprio metotrexato é adequado, facilmente adquirido e eficaz.

Outras técnicas que podem ser empregues estão descritas numa secção imediatamente antes dos exemplos.

As moléculas de VEGF aqui descritas têm uma série de utilizações terapêuticas associadas ao endotélio vascular. Tais utilizações incluem o tratamento de trauma da rede vascular face à promoção rápida, demonstrada pelo VEGF de. proliferação das células endoteliais vasculares que rodeiam o trauma» Exemplos de tais traumas que podem ser tratados incluem, mas não estão limitados a ÍncisSes cirúrgicas, particularmente as que envolvem o coração, feridas, incluindo lacerações, incisões e penetrações de vasos sanguíneos e úlceras- de superfície envolvendo o endoté— lio vascular tais como diabéticas, hemofílicas e outras úlceras de varicoses» Outros estados fisiológicos que poderão ser melhorados com base no carácter mitogénico selectivo de VEGF são também aqui incluídas»

Para as indicações traumáticas referidas atrás, a molécula de VEGF será formulada a doseada de acordo com uma boa prática clinica tendo em conta a doença específica a ser tratada, o estado particular do doente, o local da libertação do VEGF, o método de administração e outros factores conhecidos dos especialistas» Assim, neste caso, a «quantidade terapêuticamente eficaz» do VEGF é uma quantidade que é eficaz na prevenção, melhoria, alívio ou cura, do estado tratado, em particular a quantidade que

Variantes da derivados que deêm rs induzidos contra VESF como padrões ou .quando marcados sequência de aminoácidos de VEBF e seus oção imunológica cruzada com anticorpos nativo são uteis em imunoensaios de VEBF como reagentes competitivos»

VEB misturando VESF e x c i p i en tes ou materiais não

F á preparado para armazenamento ou administração tendo o grau de pureza pretendido com veículos, estabilizadores fisiolõgicamente aceitáveis» Tais são tóxicos para os recipientes nas dosagens e sncentrações empregues» Se o VEBF for mulado num tampão como solúvel em água, pode ser seja de fosfato ou de outro sal de idos orgânicos de preferência a um ρΗ de aproximadamente 7 a 8» uma variante de VESF for apenas parcialmente solúvel em água, a pode ser preparada como uma mxcroemulsão atr-avé mulação com um tensioactivo não iónico uronics ou PEB, e»g», iween 8®, numa quantidade de da sua como seja Tween< i^! » Sí4/.“O , U--J?

entes baixo

Facu 11at.ivamente podem tais como antioxidantes, á* peso molecular (menos de

e.g», poliarginina ou tripeptídeos? proteínas, sériea, gelatina ou imunoglobulinas? polímeros ser adicionados outros ingrediido ascórbico? polipeptídeos de aproximadamente dez resíduos).

tais como albumina hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona? aminoácidos, taiglutãmico ácido aspârtico ou arginina? mono; dos e outros açúcares incluindo celulose como glicina, ácido sacáridos, dissacári*· ou seus derivados, glucose, manose ou dextrina EDTA e alcoóis de açúcares tagentes ds que-latação tais s como manitol ou sorbitol» como ser usado para administração terapêutica deve

A esterilidade ê facilmente conseguida por filtração através de membranas filtrantes estéreis Ce»g», membranas ds ô,2 micron). 0 VESF normalmente será guardado na forma liofilizada ou como uma solução aquosa se for altamente estável à

VtGs- a ser esterilizado.

desnaturação térmica e ox. tipicamente será entre 6 e ser usados valores de pH entendido que a utilização estabilizadores refsridos idativa. D pH das preparações de VESF 3, se bem que em certos casos possam mais elevados ou mais baixos» Será de alquns dos excipientes, veículos ou resultará na formação da sais- de VEBF»

Se o VESF for para ser usado parenteralmente, as composições terapêuticas contendo o VESF serão geralmente colocadas num recipiente tendo um acesso estéril, por exemplo um saco de solução intravenosa ou frasco tendo uma tampa que pode ser atravessada por uma -agulha hipodérmica.

Beralmente sempre que a doença o permita, deve-se formular e dossar o VESF para libertação localizada. Isto é conveniente no caso de feridas e úlceras. Podem ser preparadas formulações de libertação controlada e incluem a formação de microcapsulares e sistemas implantáveis» Para a pa. r t í c u 1 a® preparação de composições de VESF de libertação controlada, o VESF é· de preferência incorporado numa matriz ou microcápsula biodegradável. Um material adequado para este fim é um poli lacteto, se bem que possam ser usados outros polímeros ds poli—(ácidos s-bitiroxicarboxilicos), tais como ácido poli-D-C~)-3-hidroxibutirico (EP 133 98SA)„ Outros polímeros biodegradáveis incluem poliClactonas), poli facetais), poliíortoésteres) ou poliíortocar—

bonatos)» A	co	nsideração inicial aqui	dfcrVS	ser que
veículo» ou	os	seus produtos de degrada	ção,	não seja fr
o tecido e n	ão	agrave mais o estado»	1 sto	pode ser ti

tatío por χ^ν yy .,rotina -em modelos animais oom a perturbação a tratar, ou se se dispuser de tais modelos, eai animais normais» n’áu

Para exemplos de composições ds libertação controlada.

ΊNO £> «. 23,88/,699, EP íoS,27/, Patente Canadiana NS 1176565, U» Sidman et al» , «Biopolymers» 22s-547 C 198-33 e R» Langer et al», «Chem» Tech.-,» '12;98 CÍ9823»

Quando aplicado topicamente, ê adequado combinar o VEGF com outros ingredientes, tais como veículos e/ou adjuvantes» Não existe limites, acerca da natureza desses outros ingredientes, excepto serem farstaceuticastente aceitáveis e eficazes para a administração pretendida e não poderem degradar a actividade dos ingredientes activos da composição» Exemplos tais veículos adequados incluem pomadas, cremes, géis ou suspensões com ou sem colagénio purificado» A composição também pode ser impregnada em esparadrapos, emplastros e pensos, de prBTerencxa na Torma liquida ou semi-liquida»

Para obtenção de uma formulação de gel, o VEGF formulada numa composição liquida pode ser misturado com uma quantidade eficaz de um polissacárido ou polímero sintético solúvel em água,como seja poletilenoglicol para formar um gel com a viscosidade adequada a ser administrado topicamente» 0 polissacárido que pode ser usado inclui, por exemplo, derivados de celulose eterificados, incluindo alquilceluloses, hidroxialquilceluloses e alqui1-hidroxialquiIceiuloses, por exemp1o, meti Ice1u1ose, h i d r oxietilcel u 1 ose, c a r bo x i me t i 1 c e 1 u 1 os-e, hidro x i ρ r ο ρ i 1 me t i 1 c e~ lulose e hidroxipropilcelulose? amido e amido fracionado? agar?

ácido -alginico e alginatos, goma arábica? pululano? agarose? carragenano, dextranos? dextrinas? frutanos? inulina? mananos?

quitosnos? qlicoqénios? qlucanos? e x i1anos ? arabinanos ?

xanbiopolimeros sintéticosj assim como gomas,por exmplo goma tano; goma de guarj goma de alfarroba^ goma arábica^ goma, tragacantõí e goma karaya§ e seus derivados· e misturas» □ agente de gel if icação aqui preferido é um que seja, inerte para, os sistemas bilógicos, não tóxico, simples de preparar e não muito fluido ou viscoso e que não destabilise o VEGF nele inserido» metilcelulose e derivao mais preferido é i

De preferência o polissacárido é um derivado da celulose eterificado, mais preferencialmenie um que esteja bem definido , purificado e referenciado na USP, e.g», dos de hiriroxipropilmetilcelulose» Aqui me t i1cε1 u ]. ose» polietilenoglicol utilizado na gelificação é tipicamente uma mistura de polietilenoq1ioóis ds baixo e alto peso molecuxar para s-s oomer a vxscosioacie adequada» dor exemplo, uma. mistura de um polietilenoglicol de peso molecular 400-600 com um de peso molecular 1 500 será eficaz para este fim quando misturado na proporção correcta para se obter uma pasta»

Lí termo «solúvel em -água» aplicado a políssacáridos e polietilenog1icóis pretende incluir soluções coloidais e dispersões» Em geral, a solubilidade dos derivados de celulose é determinada pelo grau de substituição dos grupos éter e os derivadas estabi1ízantes úteis neste caso deverão ter uma quantidade suficiente de tais grupos éter por unidade de anidroglucose na cadeia de celulose para tornar os derivados solúveis em ãgua» É geralmente suficiente» um grau ds substituição de éter de pelo menos 0,35 grupos éter por unidade de anidrocelulose» Em adição os derivados ds celulose podem estar na forma de sais de metais alcalinos, por exemplo, os sais de Li,

X

Ss se empregar metilcelulose no gel, de preferência ele constituirá cerca de 2-5%, mais preferencialmente cerca de 3%, do gel e α VEGF estará presente numa quantidade de aproximadamente

300—1000 y.g por ml de gel.

A dosagem a ser empregue está dependente dos factores descritos atrás. Como proposição geral, o VESF é formulado e libertado para o sítio ou tecido alvo numa dosagem capaz ds estabelecer no tecida um nivel de VEGF superior a aproximadamente 0,1 ng/cc atê uma dose máxima que seja eficaz mas não tóxica. Esta concentração intratecido deverá, ser mantida se possível por infusão continua, libertação sustida, aplicação tópica ou injecção em frequências determinadas empiricamente.

Está, dentro do âmbito do presente invento combinar a terapia VESF com outras terapias novas ou convencionais (e.g., factores de crescimento tais como aFGF, brSF, PDSF§, IGF, NGF, esteróides anabólicos, EGF ou TSF—=a) para austentsr a actividade de qualquer um dos factores de crescimento, incluindo VESF, para promover a proliferação e regeneração celular. Não é necessário que tais drogas de cotratamento sejam incluídas per se nas composições deste invento, se bem qu« sempre que tais drogas sejam proteicas, damente administradas do mesmo modo e VESF usado sózinho. A proporção molar factores de crescimento secundários é ti preferidas quantidades aproximadamente equimola?

isto seja	conveniente
Tais misturas	são adequa-
para o mesmo	fim que o
útil de VESF	para tais
picamente 1s ®,	1-10, sendo

Para simplificar os exemplos e reivindicações, certos métodos que ocorrem frequentemente serão referidos por frases ) encurtadas.

«Transfseção» refere-se à. internaiizaçSo de um vector de expressão por uma célula hospedeira quer sejam ou não expressas de facto as seouências codificadoras. São conhecidos numerosos métodos de transfecção,por exemplo com CaPQ, slectropor ção. As transfecções com êxito são geralmente reconhecida quando qualquer indicação da operação deste vector ocorre dentro da céIu1a hosoedeira„ «Transformação» significa introdução de DNA num organismo ds tal forma que o DNA ê replicável, quer como elemento extracrranossómico quer como oarte integrante do cromossoma.

usando técnicas convencionais adequadas a tais células, 0 tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio, como descrito por Cohen, S,N» Proc» Natl, Acad, Sei, CUSA), 69s 2íl® (1972) e Mandei et al hãs 154 (19/01, s geralmente usada para procariotas ou outras células que contenham barreiras celulares significativas» Para as células de mamífero que não possuem tais paredes celulares, é preferido o método da precipitação com fosfato de cálcio de Graham van oer

Eí

A» ..Víroloqy 55; 456—457 (1978), Os -aspectos gerais das transtor mações de sistemas hospedeiros de células de mamífero foi descrito por Αχεί na Pat» U.S» NS 4,399,216 publicada, em 16 de Agosto de 1.983» As transformações de leveduras são tipicamente efectuadas segundo o método de Van Soligen, P», et al iac946 Í19//1 e Hsiao,C.Ls t al», Proc, Natl, Acad» SCI. CUSA) 76; 3829 C1979 5» No entanto, podem também ser usados outros métodospara a introdução de DNA nas células como seja por injecção nuclear ou por fusão de protoplastos»

Conforme aqui é usada, a expressão «híbrida em condições restrictas» para descrever certas sequências- de DNA incluídas no Smbito deste inventa refere-se a hibridação em condições

ds força iónica baixa s temperatura elevada para a lavagem, por exemplo 0.15 M NaClZcitrato de sódio ®,®15MZ®,1% WaDodSO» a 5®°C, ou. como alternativa a presença de agentes desnaturantes tais coma formamida, por exemplo formamida a 5®“Á ívol/vol) com albumina sérica bovina a ®,1X/Ficol1 a ®,l%Zpolivinilpirrolidona a ®,12/tampão fosfato de sódio 5® mM a pH 6,5 com 75® mM NaCl, citrato de sódio 75 mM, a 42^UC para hibridação» «Híbrida com restrição baixa» refere-se à hibridação a 42°C em formamida a sódio 50mM pH 6,8,pj óó jL· ®,1X, solução de Denhardt bx ε 5® pgZml de DNA de esperma de salmão e lavaqem com 2x SSC, ®,12 SDS a 42°C = «Mutagénese dirigida» & uma técnica bem estabelecida, efectuada usando um oligonucleotídeo iniciador sintético complementar ds um DNA fágico de cadeia simples a ser mutagenizada exceptuando um desemparelbamento limitado,representando a mutação pretendida, Rssumidamente, o oligonucleotídeo sintético é usado como iniciador para dirigir a. síntese de uma cadeia complementar do fago e o DNA de cadeia dupla resultante é usado para transformar uma bactéria hospedeira que suporta a replicação do fago. As culturas das bactérias transformadas são semeadas em agar de topo, permitindo a formação de placas a partir de células isoladas portadoras do fago. Teoricamente 5®% das novas placas conterão o fago tendo como cadeia simples a forma mutagenizada, 5@X terão a sequência original» As placas serão hibridadas com iniciador sintético fosforilado a uma temperatura que permite a hibridação de emparelhamentos sxactos, mas à qual os desempareIhamentos com a cadeia original são suficientes para evitar a hibridação» As placas que híbridam com a sonda são então seleccionadas e cultivadas e o DNA recuperado» «Operacionalmente ligado» refere—se a justaposição de tal forma que pode ser desempenhada a função normal dos

. OA ' componentes» Assim, uraa sequência codificadora «operacionalmente ligada»para controlar sequências refere-se a uma configuração em que a sequência codificadora pode ser expressa sob o controle destas sequências ε em que as sequências de DMA a serem ligadas são contíguas e no caso ds um líder ds secreção, contíguas e na mesma grelha ds leitura» Por exemplo» o DNA de uma pré-sequência ou líder de secreção está operacionalmente ligado a DNA codificador de um polipeptídeo se for expresso como pré-proteína que participa na secreção do polipetideo?um promotor ou potenciador está operacionalmente ligado a uma sequência codificadora se afectar a tradução da sequência? ou um sitio de ligação ao ribossoma está operacionalmente ligado a uma sequência codificadora se estiver posicionado de modo a facilitar a sua tradução» A ligação è conseguida através ds ligação em sítios de restrição usam-se ad ap tado res técnicas convencioadequados» Se não existirem tais sítios, oligonucleotidicos sintéticos de acordo com nais» «Sequências de controle» refere-se a sequências de DNA necessárias à expressão de uma sequência codificadora operacionalmente ligada num organismo hospedeiro particular» As sequências de controle que são adequadas para procariotas, incluem por exempla um promotor, facultativamente uma sequência de operador, um sitio de ligação ao ribossoma e possivelmente outras sequêncicáS cA^.nda mal conhecxdas» Gaoe se que as céxulas eucariocxcas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e potenciadores» «Sistema de expressão» refere—se a sequências de ΕΦ4Α contendo uma sequência codificadora pretendida e sequências cis controle ligadas operacionalmente, de modo que os hospedeiros transformados com estas sequências sao capazes de produzir as proteínas codificadas» Para efectuar a transfarmação, o sistema vector?no entanto o DnA de expressão oode ser incluído num

relevante pede então ser também integrado no cromossoma hospedeiro .

Conforme aqui ê usado, «célula», «linha celular» ε «cultura de células» são empregues com o mesmo significado e todas estas designações incluem a progénie» Assim «transforman— tes» ou «células transformadas» inclui a célula individual primária e culturas- derivadas dela independentemente do número de passagens» Deve—se também entender que toda a progénie pode não ser precisamente idêntica no gue respeita ao seu DNA devido a mutações deliberadas ou inadvertidas» έ incluída a progénie tendo as mesmas características funcionais seleccionadas- para a célula originalmente transformada» Quando se pretenderam designa4 cz 4- i j «Plasmídeos» são designados por um ρ minúsculo precedido e/ou seguido de letras maiusculas- e/ou algarismos» Os plasmídeas de partida aqui usados podem ser adquiridos comercialmente, estão publicamente disponíveis sem restrições ou podem ser construídos a partir de tais plasmídeos segundo processos publicados» Ainda, são conhecidos outros plasmídeos equivalentes que são óbvios para os familiarizados cora a área» «Digestão» de DNA refere-se à clivagem catalítica, do DNA com uma enzima que actua apenas em certos locais do DNA» Tais enzimas são designadas enzimas de restrição e os sítios para os quais são especificas são designados sítios de restrição» As várias enzimas de restrição aqui usadas podem ser adquiridas comercialmente e usam-se as condições de reacção, cofactores e outros requisitos estabelecidos pelo fornecedor das enzimas» As enzimas de restrição normalmente são designadas por abreviaturas compostas por uma letra maiúscula seguia de outras letras representando o microorganismo a partir do qual a enzima de restrição foi originalmente obtida e depois um número designando a enzima particular» Em geral, usa—se cerca de ipq de plasmídeo ou fragmento ds DNA com cerca de 1-2 unidades de enzima em aproximadamente 2® p.l de solução tampão» Os- tampões- e quantidades de substrato adequados para as enzimas de restrição particulares são

especificadas pelo fabricante» Normalmente usa-se incubação a -5/°C mas pode variar de acordo com ss instruções do ϊ ornecedor jpois da incubação a proteina é removida por sxtrao :lorofórmio e o ácido nucleico digerido ê recuperado da fracção aquosa por precipitação com etanol» A digestão com uma enzima de restrição raras vezes ê seguida ds hidrólise com fosfatase alcalina bacteriana dos fosfatos terminais 5⁵ para evitar que dois extremos ds restrição clivados de um fragmento ds DNA «circularizem»ou formem uma ansa fechada que impediria a inserção de um outro fragmento de DNA no sitio ds restrição» A menos que de outra forma seja estabelecido, a digestão dos plasmideos não © seguida ds desfosforilação terminal 5* » Os processos e reagentes para a desfosforilação são os convencionais CT» Maniatis et al»» 1982, Molecular Cloninqs A Laboratory Napu-al (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, pp» 133-134)» «Recuperação» ou «isolamento» ds um dado fragmento de DNA de uma digestão de restrição significa separação dos produtos tíe digestão num gel ds poliacrilamida ou agarose por electroforese, identificação do fragmento com interesse por comparação da sua mobilidade com a de fragmentos de DNA marcadores de peso molecular conhecido, remoção da secção de gel contendo o fragmento pretendido e separação do gel e do DNA» Normalmentesete processo é conhecido» Por sxsmplo, ver R» Lawss et a 1., Nucleic Acids Res»» 9sól03-óll4 (1981) e D» Gosddel et al»» Nucleic Acids _β o« j3. ( j. q/θθ y

Research

,> Λ Λ «Análise Southern»é um método pelo qual a presença de sequências de DNA numa digestão ou numa composição contendo DNA ê confirmada pela hibridação co um oligonucleotídeo ou fragmento de DNA conhecido marcado. Para fins do presente invento, a menos quede outro modo seja especificado, a análise Southern deverá significar separação dos produtos de digestão em agarose a 1 por cento, desnaturação e transferência para nitroceiulose pelo método de E» Southern, J, Mol, Εύοΐ, 98s503—517 (1975) e hibrida— ção como descrito por T, Maniatis et a I , Ce 11,1 b s 68 / — / 01 (19/13), «Ligação® refere—se ao processo de formação de ligações fosfodiéster entre dois fragmentos de DNA de cadeia dupla CT„ Maniatis et al., , 1982, suor a, p, Í46) , A menos que de outro modo seja especificado, a ligação pode ser conseguida usando tampões e condicõss conhecidos com 10 unidades de DNA—ligase de T4 ί«1igase»)por ®,5pg ds quantidades aproximadamente equimolares dos fragmentos de DNA a serem liqados, «Preparação» de DNA a partir ds transformantes significa isolamento de DNA ds plasmídeo a partir de cultura microbiana, A menos que de outro modo seja especificado, pode ser usado o método alcalino/SDS de Maniatis et al·, 1982, supra, p.90.

«01igonucleotídeos» são polidesoxinuc1eotídeos curtos de cadeia simples ou dupla, os quais são sintetizados quimicamente por métodos conhecidos (como seja por química de fosfatriésteres, fosfetos ou fosforamidetos, usando técnicas de fase sólida tais como as descritas na Pub, Pat, EP N2 266,032 publicada em 4 de Maio,1988, ou via intermediários H—fosfonatos de desoxinucleo— sideo como descrito por Froshlsr et al,, Nucl, Acids Res,., 14 s 5399—5407 E19863), Eles são em seguida purificados em géis de poli acri1am ida

Os exemplos que se seguem destinam-se a ilustrar a melhor maneira conhecida ds realizar o invento, mas o invento não deve ser pensado como limitado por eles»

EXEMPLO I

-'urificacão de VE-5F Nativo

Culturas primárias de FC de pituitária bovina foram obtidas e estabelecidas como anteriormente descrito» Ferrara et al., Meth. Ensym», supra; Ferrara et al», Am» u » Physiol», supra»

Quando atinqiram a confluência i í_Jí~cáxti Fl yt^—i. ( cá placas de cultura de tecidos em larga escala (Applied Sei», San Francisco, CA) na presença, de meio de Eagle, modificação de com baixo teor de glucose, suplementado com ÍOX,

Du1becco (DMEM), de soro fetal bovino, glutasmina 2 mM e antibióticos» Pouco depois foram ex tsnsivamente os componentes do soro» As células lavadas com PBs para remover foram então incubadas em meio mais sem soro consistindo em DMEM _£>

transferrina íl© g/ml), insulina (5 pg/ml), selénio CIO Μ), glutamína 2 mM e antibióticos» Após três ou quatro dias, o meio foi colhida e substituido por meio fresco sem soro» Q meio colhido foi centrifugada (1000 xg, 15 min» a 4^0 eguardado a -70°C» 0 meio condicionado foi então colhido de três em três ou de quatro em quatro dias até durante seis semanas» Encontrou—se que o meio condicionado por FC estimula a velocidade de proliferação de células do endotélio vascular em densidade baixa»

Lotes ds quatro a seis litros de meio condicionado ÍCM) foram sujeitos a precipitação com sulfato de amónio» 0 sulfato de e>

amónio (500 g/1) foi adicionado com agitação constante até osal estar completamente dissolvido» Após 8-12 horas na câmara fria, o material fo.i centrifugado (20 000 xg, 45 min» a 4“^:C)„ 0 sobrenadante foi rejeitado e o sedimento foi ressuspenso sm 16? mM Trxs/Ui, pH /, z» 50 mn NaCl e oxalxsaoo a 4^—L- contrai o mesmo tampão durante 8—12 horas» O volume final foi de 50—ó® vezesmenos do que o original» » ρ λ * 1 ·. '

Ο CM concentrado foi aplicado numa coluna H-S CShing et al», Science·, 523 s 1296-1299 C 1984)3 <10 ml) pré-equi1ibrada com i0 mM Tris/Cl, pH 7,2 , 50 mM WaCl = A coluna foi então lavada com o mesmo tampão até a absorvância a 280 nm ser neglig-ivel e depois eluida passo por passo com 10 mM Tris/Cl, pH 7 = 2 contendo 0,15 , 0,9 e3 M NaCl. 0 fluxo foi de í»5 ml/min. Colheram-se fracçSes de

1,5 ml ε amostras destas foram diluídas com gelatina a 2% em PBS, foram testadas quanto à actividade mitogénica em células endote— liais. Aproximadamente 90% da actividade biológica foi eluida na presença de 0,9 M NaCl» A bioactividade nâo foi afectada pelo aquecimento das fracçSes a 65°Cdurante 5 min» e decresceu 25-30% após exposição a ácido trifluoroacético CTFA) (pH 2)durante duas horas» A cromatofocagem usando uma coluna Mono P indicou que o p.i. do factor da crescimento é de aproximadamente 8,5»

As fracçSes H—5 mais bioactivas (conjunto de fracçSes 0,9 M NaCl) foram diluídas quatro vezes com 0,1 % TFA em água e aplicadas numa coluna de HPLC vydac C4 (10 x 250 mm) pré-equilibrada em 0,1% TFA/20% acetonitrilo» A coluna foi eluida com um gradiente linear de acetonitrilo (2Ô%-45% em 115 min») a um fluxo de '2 ml/min. A absorvância foi controlada a 510 nm» FracçSes de 2 ml foram diluídas em gelatina a 0,2% em PBS para ensaio em células endoteliais» A bioactividade foi eluida como um único pico na presença de aproximadamente 297= de acetonitrilo» Um gel SDS-PASE corada com prata CMorrissey, Anal. Biochem»117:307-310 (1981)3 das fracçSes mais activas revelou a presença de três ou quatro bandas»

Reuniram—se as fracçSes mais bioactivas, diluíram—se duas vezes em 0,17 TFA em água e aplicaram—se numa segunda coluna de HPLC Vydac C4 (4,ó x 250 mm) pré—equilibrada com 0,1% TFA/20%

2—propanol» A coluna foi eluida com um gradiente linear de

2—propano 1 (20—45% sm 11-5 min· fluxo foi de 0,6 ml/min

Amostras das 'fracçSes foram diluidas para fracçSes foram secas num Speed Maturo, 227 os bioensaíQS. As « nn g—, í“. Λ .r— —vac para suo-rHbc análise est r u fu. r a 1.

restanres CLasmmli,

080—680 (IV /0) x

Obteve-se um único pico de bioactividade correspondendo a um pico distinto no perfil de absorção.

As fracçSes do pico do segunda passo de fase reversa apresentaram uma única banda, em SDS-PASE corado com prata, com um peso molecular aparente de aproximadamente 23 ©00 em condições não redutoras. A intensidade de coloração da banda estava altamente correlacionada com a actividade mitogénica ao longo do perfil de bioactividade. Devido a experiências anteriores, usando um filtro molecular com uma coluna TSK B 30©0 SW. terem sugerido um peso molecular na gama de 4©-43 000_? foi considerada a possibilidade de o factor nas condições nativas ser um dímero. Isto foi fortemente sugerido pelo facto de o material purificado ter um peso molecular aparente de aproximadamente 45 000 num

SDS-ΡΑΘΕ em condições não redutoras.

Obtiveram—se células endoteliais derivadas do córtex adrenal ou dos capilares do cérebro de bovino e mantiveram-se como descrito por Ferrara et al.. En d oc r i η o 1 oq ysupra. Células endoteliais de aorta de bovino adulto ou fetal, células endoteliais da veia umbilical humana, células endoteliais da córnee. bovina, células epiteliais do cristalino, fibroblastos BHK-21 e queratinócitos humanos foram cultivados e mantidos como descrito por Schweigerer et al., Exp. Eye Res.,,

Clin. Inv., 51s 46ê

Endotelial Cel1, Nossel e Vogel, Ed., pp New York, 1972>5 D’Amore et al=, Proc 78s3Ô68-3072 CÍ9Q1)5 Neufeld et al=, ¢1986)5 Pheel e Ham, In Vitro, 16? 526-538 (1985). Para os bioensaios as células foram semeadas na presença do respectivo supras Faffe et al. , ú.

of the ί1V72)s Fo 1 k man em Patholoqy

79-9-i CAcademic Press,

WSIi •ieq, hcaa. bei

USA, fe* L. . , X O n .x9q> — C’0.

fracções às células era quantidades de 5p.l/ml» Após 4 ou 5 dias ascélulas foram descoladas pela adição de tripsina e contadas nu.® c on tadα r Cou 1 te r»

Como se mostra na Figura 5, observou-se uma actividade apreciável apenas nos tipos celulares derivados de endotélio vascular, como sejam as células endoteliais de aor de bovino bovino sí células endoteliais da veia umbilical humana» Pelo contrário» as células do córtex adrenal, as células epiteliais do cristalino, as células endoteliais da cárnea os fibroblastos BHK-21 e queratinócitos não mostraram qualquer resposta mitogénic a s i qn i f i c a t i va»

Aproximadamente 20 pmoles de proteína das- fracções mais bioactivas obtidas a partir do segundo passo C4foram aplicados directamente num sequenciador de proteínas de fase gasosa modelo 470A {Applied Biosystems)» Ciclos de degradação de Edman foram efectuados por uma coluna de HPLC montada em serie e os derivados de aminoácidos foram identificados no cromatograma de HPLC» Henzel et al», 3. Chromatoqraph»» 404 s 41—52 C19S7)»

A micro-sequenciação em fase gasosa demonstrou, sem ambiguidade uma única sequência ds aminoácidos N—terminal» Os primeiros 39 resíduos são?

A1a—P ro-Met-A1a—GIu—Gli —G1i—61n—Lis—Pro—His—61u—Va1—vai—Li s—t en— Met-Asp-Va 1 -Tir-Gln-Arg-Ser-Fen-Cis-Arg-Pro-11 e-Gl u--Tre--L.eu.-Va 1 Asp-Ile-Fen-GIn-Glu-Ti:—Pro» Esta sequência foi determinada por várias corridas da sequência N-terminal da molécula Intacta» Uma pesquisa por computador revelou que tal sequência não apresenta * <

homologia significativa com qualquer cida.

A curva de dose-respos purificado revelou 5®% do efeito células endoteliais derivadas de a para o factor de crescimento máximo sobre a proliferação de córtex adrenal a 100-Í50 pg/ml e um efeito máximo a 1-1,2 ng/ml. Estes valores derivaram da sequenciação de proteína s estão de acordo com os obtidos por comparação das intensidades relativas das bandas com padrões em SDS-PAGE corado com prata»

A Tabela 1 su.mar os passos para a purificação da actividade promotora do crescimento e o correspondente rendimento em bioactividade» ^Δ7

nado

Passo Purifi	u3 . C &Ç '£.&	Proteína C pg >	Estimulação MátX A ϊ*Π<£ Cng/ml)	Purificação	Rendimento C %}
CMS	-	190 000	Z.	1	100
AS $		Í75 000	2 500	1	92
HS$		A Vt‘'V	250	10	68
R-P 1		25	SZT	500	6
R P 2	❖ ·Λ· ·τ· φ 3 1?	<5.	1,2	2 000	4

CM é meio condicionado? As é precipitado de sulfato de- amónio?

H3	é hepar i n a --se f ar ose ?	R~P	1 é	o passo	1 de HPLJ
sa ?	e R-P 2 ã o passo 2	de	HPLC	cdíH Γ	reversa»
SA	concentração de prot	sins	foi	d & t s(”ín A π	ada com

WA concentração ds proteína foi det intensidades relativas das bandas com rminada por comparação das padrões em SDS—PAGE corado com prata» ^:B^:A concentração foi determinada por sequênciaçâo»

EXEMPLO II

-χ

X

Isolamento de cDNA de VEGF

Extraiu—se RNA total EUlIrich et al«, Science. 196:· 1313-1317 (1977)3 a partir de células foliculares de pituitária bovina Eobtido como descrito por Ferrara et al., Meth. En ζ vmo1« supra e Ferrara et al», Am. 3. Physiol,, supra! e a fracção de ol igo C d'T) -ce1408-1412 Chem«,253 s ffsRlMA polidenilado foi isolada por cromatograf ia em lulose. Aviv et al», Proc» Natl» Ac-ad = (1972). 0 cDNA foi preparado Ewickens- et al. , J. Biol.

2483-2495 (19/8)3 por iniciação com ^{ou um} hexamero ao acaso dN.« 0 cDNA de cadeia dupla foi sintetizado usando um kit da Amersham ε o cDNA resultante foi subclonado em X-gtlO clivado com EcoRi como descrito EHuynh st al», em «DNA Cloning Techniques, A Praticai Approach»,Glover ed. (IRL, Oxford, 1985)3, excepto ter-se usado adaptadores EcoRi assimétricos [Morris st al., Gene, 7s 355—362 (1979)3 evitando assim a necessidade de tratamento com meti1ase de EcoRi,

Os fagos recombinantesforam semeados em E. coli C600 Hfí EHuynh et al., supra! e transferidos para filtros de nitroce— Science, Í96s 180-182 (1977). Estas com uma sonda oligonucleotidica sintética marcada com ‘-'P ETaylor et al „, Biochim» Biophys. ficta, 442¾ 324—33G (1976) tendo a sequências

5^s —CCTATGG sGAAGGCGUCCAGAAbCCTCACGftAGTGGTSAAGTTCATGGACGTGTATCA-3’ a 42°C em formamida a 20%, % x SSC, fosfato de sódio 50mM pH 6,8, pirofosfato de sódio a 0,1%, solução de Denhardt 5 x e 5o pg/ml lulose» Benton et al», réplicas foram hibridadas de DNA de esperma de salmão e lavado am S·

1% SDS a 42°C.

A Fig„1 mostra uma comparação entre esta sonda e a sequência de DNA de facto obtida, com os asteriscos indicando nucleotídeoí homólogos.

. ’ · Λ Ο 7 Foi identificado um clone positivo, designada >»vegf«ó»

Este clone marcado com foi usado como sonda no despiste de de uma biblioteca de cDNft de placenta humana iniciada com oligo-dT e observados clones positivos» Quando pituitária humana foi despistada com foram detectados clones positivos» uma biblioteca de cDNA ds mesmo clone marcatío não

A seqência de nucleotideos completa do clone 'S»vegf»6 foi determinada pelo método de terminação de cadeias· didesoxioli— gonucleotidicas CSangsr te al», Froc» Nafcl. Acad»___Sei» USA,

5463--54Ó7 (1977)3 após subclonagem no vector pR!<5» Na Fig = 2 apresentada a sequência obtida juntamente com a sequência de inserida, incluindo a seouência sinal» © 3· tá DNA

-xpressão do Sene Codificador de VESF em Células de Mamífera

D vector de expressão final, pRKS»vegf»ó, foi construído como se mostra na Fig »2, a partir de íi-»vegf»6 e pRK5» construção de pRK5 e de pRK5»vegf.ó está descrita abaixo detalha damente»

A»Construção de pRK5

A.í» Construção de pFSCIS

A construção inicial de três partes do plasmídeo de partida pFBCISestá descrita abaixo e mostrada na Fiqura 3» í> A marta de resistência à ampicilina e a origem de replicação do vector final foi derivada do plasmídeo de partida pUC13pML, uma variante do plasmídeo pML CLusky, M» e Botchen, M»,

Nature, 293; 79 C19813)» pUC13pML foi construído por transferência do políadaptador de pUCÍ3 (Vieira, 3. e Mssssinq» (Vieira j»»sene.

s259 (1982)para os sitios EcoRI e HindIII de pML. Um segundo plasmídeo de partida pUCS-CMV foi a fonte do potenciador, promotor e sequência dadora de «splicing» ds CMV. pUCS-CMV foi construído por inserção de aproximadamente 80® nucleotídeos do potenciador, promotor e sequência dadora de s «splicing» para os sítios de extremos cersss PstI e Sphl de p4JC8» Vieira , J» e Messing, op» cit. Adaptadores sintéticos BamHI-HindXII (adquiridos comercialmente á New England Biolabsí foram ligados ao extremo coesivo BamHI criando um sitio HindiII, Após esta ligação fez—se uma diqsstão HindiII—Hindi. Esta digestão deu um fragmento de aproximadamente 8©® pb que continha o potenciador, promotor e sítio dador ds «splicing» de CMV» Após isolamento em gel, este fragmenta de 8©© pb foi ligado a um pedaço ds 2 9®© pb do pUC13pML. 0 fragmento necessário à construção de pFBCIS foi obtido por digestão do plasmídeo intermediário atrás referido com Sa1I e HindiII« Este pedaço de 3 123 pb continha a marca de resistência à ampicilina, a origem ds replicação ds pUCi3pML e as sequências de controle de CíTV, incluindo o potenciador, promotor e sitio dador de «solicinq».

2) O intrão sequênc ii icei tado ι região variável de Ig iui construído usando um uliqómero· sinteti· co como se mostra na região central quimicamente um 99-mero e um 3©-met segue para o sítio aceitador de ^J (Bothwell st al», Nature» 29©s o a

ig» 4»	Sintetisaram
do a	sequência que
íng» e	intrão de	IgS

Na ture

65-67 C19813)s — Si —

5⁹ ABTABCAA6CT7BACBTBTBBCABBCTTBA, 31 SATCTSGCCATACACTTSAGTBACAATGA.. 60 CATCCACTTTBCCTTTCTCTCCACAGGT»,»

GTCCACTCCCAG 3^?

A DNft-polimerase t τ ragmen to &1 enosí;

íreencneu pedaço sintético e criou um fragmento de cadeia dupla» Wartell,

R»M» s W»S« Rsznikoff, Gene

30/ <ívS0)« Isto foi seguido de uma dupla digestão com PstI e HindiII» foi clonado em pUC13 (Vieira e Messing,

Este adaptador sintético op» cit«> nos sitios PstI e HindiII» Os clones contendo o oligonucleotídeo sintético, marcado pUCIg.10, foi digerido com PstI. Um sítio ClaX foi adicionado a este fragmento usando um adaptador PstI—Ciai» Após digestão com HindίII isolou-se em gel um fragmento rfíS .18 )b contendo parte do intrão de Ig ε o aceitador de «splicing» da região variável ds Ig»

3) A terceira parte do esquema de construção substituiu o extremo 3^{3 * 5} do antigénio de superficie da hepatite com o sítio de poliadenilação a o sítio de terminação da transcrição da região precoce de SV40» Um vector» pUC»SV40, contendo as sequências do SV40 foi inserido em pUC8 no sítio BamHI descrito por Vieira e Hessing, op» cit„ pUC«SV40 foi então digerido com com EcoRI e Hpal» A partir desta digestão isolou—se então em gel um fragmento de 143 pb contendo a sequência de poliadenilação de SV40. Mais dois fragmentas foram isolados em gel após digestão de pSVE»8clD» (F‘at, Europeia Pub» N91ó0,457>. Ef fragmento de 4,8 kb gerado por digestão com EcoRI e Ciai contem a unidade de transcrição SV40—DHFR, a origem de replicação de pMl e amarca de resistência à ampicilina» 0 fragmento de 7,5 kb produzida após

iiqestão com com Ciai e Hpal contem o cDNA dó Factor VIII com um sítio poli A de 8V4© seguido da unidade de transcrição bV4© DHFR.

A ligação final de três partes para dar pFSCIS usou: a) o fragmento SalI-HindIII ds 3123 ph contendo a origem de replicação₉ a marca qs resxsbencxs à ampxcxixna e o potencisdor, promotor e sítio dador de «splicing» de CMV; e c) um fragmento Clal-SalI de 961í pb contendo o cDNA do Factor VIII, o sitio de poliadenilação do SV4© e a unidade- de transcrição SV4© DHFR» .Construção de pCIS2«8c28u pCIbZ»8c2tíD compreende uma subunidade de 9©kd do Factor VIII ligada a uma subunidade de 73kddo Factor νϊΐI, 0 9©kd compreende os aminoácidos 1 a 74© e os aminoácidos da 169© a 2332 da subunidade 73kd = Esta construção foi preparada por uma ligação ds três partes dos seguintes fragmentos: a) o fragmento Clal-5stl de 1267 pb de pFSCIS (isolado a partir de uma estirpe obstruída e tratada com BAP) ; b) o fragmento SstII-PstI de- 216 pb de pFSCIS, e c) um pequeno oXigonucleotídeo sintético Pstl-Clal fosforilado (ver Fig, alterado)„ que tox onde um asterisco indica o nucleotideo

A Figura 4 também mostra a subclonagem dos fragmentos BamHI-HindIII de 4©8 pb e BamHI-PstI de 416 pb do pSVEFVIII (Pat.. Europeia Publ» N2 16©,457)contendo as regiões 3’ e 5’ do DNA de Factor VIII a serem fundidos para fazer pCIS2»8c28D«

A Figura 5 mostra a ligação de três partes usada para construir a região de fusão de pClS2»8c2BD= Dois fragmentos diferentes, A s B_f, foram clonados no mesmo vector pUCllS BamHI-PstI BAP» 0 fragmento A foi o fragmento BamHI-HindIII de 408 pb de pUC4©SBH e o fragmenta B foi um a1igonucleotídeo HindiI I-PstI..

Na Figura 6 está apresentado o oiigonucíaotideo ds cadeia dupla, Se bem que na Figura 5 esteja apresentada a sequência de DNA completa dos sítios de restrição terminais, o oligonucleotídea em questão não inclui as bases sublinhadas nos sítios de restrição. Este oligonucleotídeo foi usado sem fosforilação para evitar a sua. polimerização durante a ligação»

Após ligação dos fragmentos A e E< ao vector como se mostra na Figura 5, as sequências de junção esperadas foram confirmadas por sequenciação ds DNA das regiões englobadas pelos n uc1eo tídeos» p'_-1,. í l?í construído ligação de quatro partes» 0 e

plasmideo resultante, como se mostra na Figura 6 com uma plasmideo de fusão da Figura 5 foi cortado com BamHI e PSTI isolado o fragmento de 443 pb» Os três fragmentos restantes da ligação de quatro partes forams ίΪ Ciai-BamHI ds 1944 pb do pSVEFVIII íPat» Europeia Pub» N3Í6®»457>, 2) um fragmento BamHI-Xbal de 2202 pb do pSVEFVIII,, o qual foi ainda paro ial men te digerida com PstI e isolado o fragmento PstI-XhaX de 1786 pb e 3) o fragmento Xbal-Clal BAP de 5828 pb do pC182»8c24D da Figura 5» A sequência de DNA traduzida da variante resultante na região de junção BKacta da fusão do pCIS2„8c24D foi determinada e corresponde ã sequência mostrada na Figura 5»

-onstrucao bs pRK5

A construção de pR.K5 está descrita na Fiq» /» U plasmi— deo ds partida para a construção de pRKS foi pCIS2.8c28D= Os números das bases nos parágrafos 1 a 6 referem-se a pCIS2«8c28D com a base 1 um do primeiro T do sítio EcoRI precedendo o promotor de CMV» 0 promotor precoce e intrão de citomeqalovírus e a origem e sequência sinal polià foram colocados em plasmídeos separ ados»

1= 0 promotor precoce do citomegalovirus foi clonado como um fragmento EcoRI do pCIS2=8c28D <9999-12®lno sítio EcoRI do pliCllS descrito atrás» Repicaram-se doze colónias e testaram-se quanto à orientação em que partir de pUC118 permitiria, a.

o DNA de cadeia simples feito a sequenciação a partir do sítio EcoRI distando 12® 1 do sítio EcoRI em 9999= Este clon.e foi d e s i g n a d o pCM VE / P »

2.. Fez-se DNA de cadeia dupla a partir do pCMVE/P para inserir um promotor SP6 (Gresn, MR etal», Cel1, 52 s 681-694 E19833) por mutagénese dirigida» Um HO-mero sintético que continha as sequências -69 a *5 do promotor SP6 (ver Nucleic Aciris Res»,, 12¾ 7Θ41 E19843, Figurai) foi usado juntamente com fragmentos de 18pb em ambos os extremos do oligómero correspondendo às sequências CMVE/P» A mutagénese foi feita por técnicas convencionais e despistada usando um ΙίΦ-mero marcado com restrição alta e baixa» Seis clones potenciais foram seleccionados e sequenciados» Um clone positivo foi identificado e marcado pCMVE/PSPó» promotor BP6 foi testado e mostrou—se estar activo, por exemplo, através da adição de RNA-polimerase de SP6 e procurando o RNA de tamanho adequado»

Sintetizou—se o adaptador C1aI-No f1-SmaI pa?

englobar o local de Ciai <912/ até ao sítio Smal de pUCiiB em pCMVE/P (passo í) e pCHVE/PSPó <passo

□.ste adaptador foi ligado ao sítio C1aI— 8ma1 du pUCíiS e feito o despiste dos clones correctos» O adaptador foi ssquencíado em ambos e os clones foram marcados pCMVE/PSPó e oCSiVE/PL»

5, pCMVE/Põi-’è-L foi cortado com Smal junção adapta-

dor/pUC 118) e HindiI Cem pUCllS)» Um fragmento Ηρ-al C5573) a HindiII C6136) do pSVQRAA/\RI 11, descrito abaixo, foi inserido sm Smal-Hindi11 do pCMVE/PSPó-L» Esta ligação foi despistada s isolado ia clone que se designou pCI*IVE/PSPó-L-SVORAA/\RI»

a) A origem e o sinal poliA de SV40 foi isolado como um fragmento X mn IC 5475)—Hind1I1(6156) do pCIS2»8c28D e cionado nos sítios HindiII a Smal do piJCllP (descrito em Vieira e Messing, op» cit»)» Este clone foi designado pSVORAA»

b) 0 sítio EcoRI em 5716 foi removido por digestão parcial com EcoRI e preenchimento com Klenow» As colónias obtidas após auto-ligação após preenchimento foram despistadas, isolado o clone correcto e designado pSVQRAA/\R11» 0 sítio EcoRI eliminado foi confirmado por sequenciação e verificou-se estar correcto»

c) Q fragmento Hpal pSVORAA/\R111 foi iso1ado 4 atrás)»

C55/3) a HindIII (6136) do e inserido em pCMVE/PSP—L er pCMVE/PSPi . pa.i foi cortado com

EcoRI em 9999, dotado de extremos cerses e auto—ligado» Um clone sem um sitio EcoRI foi identificado s designado pRK»

7» pRK foi cortado com SmaI ε BamHI» do com Klenow e religado» Fez-se o despiste clone positivo foi idsntifice.dc e designado pRl·

Este foi preenchidas colónias» Um '/\Bam/Sma3» sítio Hpal

:io HindIII do pRKDBam/Smaó um conversor» (Um conversor ί o i u ljí s vs r tido e um pedaço de num

DMA + +' usado para mudar um extremo seria compl outro extremo teria clone positivo foi

-Hpal i.

ε 1igou -EcoRI também incluido^!

Portanto

um ementar de um extermo coesivo Hindi 11 e um sítio de reconhecimento para Hpal.) identificado e designado pRK/\Bam/Sma,ΗII

9» pRK/XBam/Sma —se um adaptador Para cada adaptad se determinou que

CuOlS lAÍ RiSiS estes clones t

Um

II«HIII-Hpal 1 foi cortado com PstI e Motl EcoRI-HindiII e um adaptador HindIIIor foram encontrados clones» Noentanto muitos conversores Hpal tinham sido c on ve r so res iveram de ser dão origem um sítio Pvul I>» cortados com Hpal e auto-li10» U clone 3 RI—HIII eoclone 5 HIII—RIforam cortados com Hpal, diluídos e auto-ligados» Qs positivo dos. □ clone RI—HlIIfoi designado pRK5» foram identificaB» Contrução do pR!<5 „ veg f»6

A Figura 8 descreve a construção de pRK5»veqf»ó« 0 clone X.vegf.ó foi tratado com EcoRI e a inserção EcoRIfoi isolada e ligada ao fragmento vector do pRKoobtido por digestão do pRf<5 com EcoRI e isolamento do fragmento grande» A ligação de duas partes destes fragmentos deu o vector de expressão, pRI<5»vegf»6, o qual foi testado quanto ã orientação correcta da sequência codificadora de VEGF relativamente ao promotor»

C» Expressão do Gene Codificador de VEBF

Células ds rim embrionário humano transformadas com SdenOVxrUS Ela tín Elb ík!93s) fnrs® ηρ·-.ΓΓ> tj3«i rir.;-- Rraham csí- aí 1 foram descritas por Braham et

__ _ (197/)„ Estas células foram transfecta— das com o vector de expressão atrás descrito pRK5»vegf=6 pelo

D.Ms método do fosfato ds cálcio de Sorman, em DNA Cloninq, Blover, ed» (IRC Press, Oxford» 1985), vol »2, pp» Í43-19®» horas, as células foram mudadas para meio sem soro durante

Após mais uma incubação de 4tí horas» Este meio sem soro foi então colhido e o sobrenadante dele testado quanto ã actividade de VEGF»

EXEMPLO III

Ensaio in vitro para a Actividade de VEGF sobrenadante das células transformadas produzidas no Exempla IIC atrás- foi testado para bioactividade de VEGF usando as mesmas linhas celulares usadas no processo de purificação de proteina descrita atrás» Assim frações dos sobrenadantes foram adicionadas em quantidades de 5pl/ml aos vários tipos celulares semeados no respectivo meio de crescimento em placas de multicavidades» Após quatro ou cinco dias, as células foram dissociadas por exposição a tripsina e contadas num contador Coulter» Os sobrenadantes celulares que continham VEGF foram eficazes napromoção da proliferação de células endoteliais de aorta bovina fetal e adulta, células endoteliais dos capilares ds cérebro bovino e células endoteliais da veia umbilical humana, mas não suportaram o crescimento de células do córtex adrenal, células epiteliais do cristalino, células endoteliais da cárnea, fibrablastas BHK—21 s queratinócitos»

Ensaio in vivo para a Actividadt

Ai membrana corioalantóica de galinha (derivada de ovos comerciais) fo^ usdda como sistema in vivo pari propriedades angiogánicas de alantóica foi deslocada cela

ca tio saco de a.r falso coriocoíbo descrito por Hamburger» V», Univ. of Chicago Press, ρρ-.

-A Manual of Experimental Embrioloqy,

Í43-Í45 (1942) e Phillis, R. e Kumar,

S», Int.3. Câncer,, 28 s 82, <19/9)» Na casca de ovo cortou-se uma janela de 2 οβ^λ usando ovos fertilizados com oito dias de idade» 0 VESF purificado a partir da fonte nativa como descrito no Exemplo I foi seco e ressupenso (50 ng) em PBS» Esta suspensão ou solução testemunha de PBS sózinho foi aplicada em quantidades de 10 jj.l contendo 100 pg de esferas de Sephadex S50- Após 72 horasos ovos foram foram examinados e avaliada a resoosta neovascular.

ΐϊίί-Σ» í c~'pt-í2í ca dos vasos sanguíneos na ngiogénica marcada com crescimento radial direção das esferas de Sephadex (85% de embriões positivos.

oi obser soa em ovos )E8F mas não nos ovos testemunhEra de esperar que este efl recombinante, < 10% de embriões positivos, n”5£?) bXhMFLO IV

Despiste da Biblioteca de uma Linha Celular ds Leucemia

Humana *reparou-se uma biblioteca de cDNA como se seque.

indutor 10000 x C1000 vezes í linha celular de leucemia humana HLóO (AiCC NSCUL240) foi cultivada em frascos rolantes» A contagem de células foi de 0,8 xl0° células por ml» As células foram cultivadas em meio RPMI1640 (adquirido comercial mente) e soro fet-al de vitela» Para a indução as células foram centrifugadas e ressuspensas em ml de

RF’MIÍ&40 em frascos rolantes» Adicionou—se um total de 500 μΐ de x), em que indutor 1 x foi miristaa 50 ng/ml, EPS a 100 pg/ml.

to acetato de forbol (PMA)

indometacina a i® M e ciclo-heximida a 10® yg/ml= Após horas de crescimento as células foram sedimentadas» quacro

Extraiu—se RNA total (Caibais et al » ,DNA, 2s 329—335 (1983)) a partir das células e a fração de mRNA poliadenilado foi isolada por cromatografia em oligoCtíD-celulose como descrito atrás» 0 cDNA foi preparado por iniciação ao acaso com hexãmeros dMF, (Okayama e Berg, Molecular and Celular Bioloqy, 2s 161 €3

Cl982) 5 Guhler e Hoffman, Gene„ 25? 263 (1983))» 0 cDNA ds cadeia dupla foi sintetizado usando um kit de cDNA da Invitrogsn e adicionaram-se adaptadores- tendo um extremo cerse, um sítio EcoRI no outro extremo e sítios internos- BstXI e htotl» □ cDNA resultante foi ligada pelos extremos- cerses a X-gtí® cortado com EcoRI»

Os fagos recombinantes foram semeados em E» coli Có®® Hfí s transferidos para filtros de nitrocelulose como descrito atrás-, represaitando uma biblioteca dsl x í®^& clones» Estas réplicas foram hibridadas como o clone X»vsgf»6, representando o DNA de tamanho completo completo de VEBF bovino, marcado com 32P ETaylor et al», supra3em condições restrietas a 42°C em formamida

SSC, fosfato de sódio o® mm pH 6,3-, íá os pxroTosT-ato de sódio, solução de Denhardt 5 x s 5® yg/ml de DNA de esperma de salmão» A mistura de hihridação foi lavada em ®,2 x SSC, 0,17» SUS a 42 C»

Cinco clones que hibridaram foram sequenciados como descrito -atrás, um dos quais foi designado X-»vegf»2í» Na Fiq» í® está apresentada a sequência de nucleotideos completa do clone ,vegT»2i, juntamente com sequência de aminoácidos deduzida.

incluindo a sequência sinal»

Expressão do Bene Codificador de VEGF Humano em Células de Mamífero

vector de expressão final, p„vegf»2i₅ foi construído a partir de >«vegf»21 e pCIS.CXRHN» pCIS»CXRHIM é um derivado ds pRK5 em que uma série diferente de sítios de restrição, C1 a 1, Xhol, EcoRI, Hindi 11 e SMotI foi introduzida na região de poliadaptador do pRK5 usando um DMA sintético da sequência:

3⁵- TAAGAGCTCTTAAGTTCGAACGCCGGCGAGCT-5⁹

Isto foi introduzido clivando primeiro pRK5 com Ciai e HindiII

»21	s/π vez	de X»veg
foi	tratado	com EcoRI
ao	fragment	o vector

isolando o fragmento vector e ligando-o usando T4-ligase com a sequência ds DNA mostrada atrás»

A Fig»11 mostra a construção de p=vegf»2í, que é análoga â de pRK5»vegf.ó usando X=vegf»21 em vez de X»veqf.ó, Nais espacíficamente, o clone À.vegf»;

inserção EcoRI foi isolada e ligada ao pCIS.CXRHN obtido por digestão de pCIS.CXRHN com EcoRI e isolamento do fragmento grande» A ligação de duas partes destes fragmentos deu o vector de expressão, p=vegf»21, o qual foi testada quanto à orientação correcta. da sequência codificadora de VEGF reiativamente ao promotor»

Expressão do Bens Codificador de vEGF Humano

Células 293s foram transfectadas com o vector de expressão atrás descrito p»vegf pi pelo método do fosfato ds cálcio de Gorman, em DNA C1onjnq, D»M = Glover, ed» (IRC Press, Oxford, 1985), vol» 2, pp» 143-19®» Após 24 horas, as células foram mudadas para meio sem soro durante mais 48 horas de incubação» Este meio sem soro foi então colhido e o seu sobrenadante testado quanto à actividade de VEGF

EXEMPLO

Ensaio in vitro para : ividade dg VEGF sobrenadante das células transformadas produzido no

Exemplo IV atrás foi testado quanto à bioactividade de VES? usando o mesmo processo descrito no Exemplo III» Os sobrenadantes celulares que continham VEBF humano foram eficazes na promoção da proliferação de células endoteliais de capilares de córtex adrenal bovino» Isto demonstra que o factor de crescimento não é só um mitogénio de células endoteliais, mas é de facto capaz de desencadear toda a cadeia de acontecimentos que conduzem à formação de novos vasos sanguíneos , o que requere também a degradação enzimática da membrana de revestimento e quimiotaxis»

Resumindo, a identificação da sequência de ácido nucleico codificadora de VESF bovino e humano foi determinada, com VEGF sendo um dímero composto por duas subunidades do mesmo peso molecular aparente (cada uma sendo 23 VEBRF humano e bovino são aproximadamente 95à homólogos tíe nas suas sequências de aminoácidos, incluindo o peptídso sinal, indicando conservação evolutiva da molécula» VEGF humano tem mais um aminoácido, devido à inserção de um residuo gli na posição 8» Ver Fig» 12» Os factores de crescimento humano e bovino na forma pura foram capazes de estimular a proliferação de células endoteliais vasculares em concentrações -entre cerca de 25 pq e cerca de 1-1,2 ng/ml« Estes valores, assumindo um peso molecular de 45 000 corresponde respectivamente a 0,55 pM e 22—26 pM, os quais estão na mesma gama dos obtidos com bFGF» Sospadarowicz st al „ , Endoçrlne Reviews, supra, VEGF parece diferir de um factor de crescimento de células endoteliais recentemente purificado EMiyazono et al» , 3»fcÉzol»Chem» , .262s4098—4115 (1987)3 e clonado tIshikawa íMatur— o38sbo7-5ói

C1989>3 deri vado plaquetas hu«<ar)as ed uCe? /

3S DSiii

qus Pi mesmo peso molecular’, eles diferem ns sua estrutura secundária e potência biológica» PD-ECSF ê constituído por uma única cadeia

-ECSF e VEGF tenham o sequência N-terminal, Ao contrário de VEGF, polipeptidica e também parece ser cerca de 1Θ vezes menos potente na promoção do mento de células endoteliais» Também» PD—EC8F não se cresci1 iga à hsparina-Sepharose s é uma proteina acidica, enquanto que VfcGF se liga a heparina e tem um p»i« básico» implicações sulfatos de e x t r ac e 1 u 1 a r determinação mento que se capacidade da VEGF para se ligar à heparina pode no que respeita à sua função e regulação in vivo ter us heparina são componentes fundamentais da matrix e foi propos’to que desempenham um papel crucial na do contacto entre células alvo e factores de cresciligam à heparina»

A te um paoel manutenção d adeno-hipófi presença de VEGF em FC da pituitária sugere fortemenpara estas células no desenvolvimento, organização e e um estado diferenciado do complexo microvascular da è presentemente desconhecido se VEGF é expresso noutros orgãos além da glandula pituitária» No entanto, considerando o papel fundamental do crescimento das células endoteliais vasculares e da angiogénese numa grande variedade de proliferações normais e patológicas, é provável que s. distribuição de VEGF seja mais alargada»

Uma pesquisa ta de aminoácidos de (21-25%) com a cadeia B pur computador acerca da sequência compleVESF mostrou homoloqias significativas do PDGF humano e com o produto do or-coge— ne sis» Um grau menor de homologia foi mente à cadeia. A de PDg-F» .qs regiões observado também relativaque apresentam homologia

mais significativa estão compreendidas cadeia B de PBGF e entre Gli 7 e Arq 1' que todos os os oito resíduos cisteina e B de PDGF estão conservados em VEBF entre Bli 54 e Arg 175 na © em VEBF» é interessante encontrados nas cadeias A

No entanto, VEBF contem mais oito resíduos cisteina»

Estas homoloqias suqerem uma origem comum a partir de um gene progenitor ancestral para o protooncogene sis e para o gene codificador de VEBF bovino» Se bem que PDGF seja activo numa larga, variedade de tipos celulares originárias do mesênquima e inactivo para células endoteliais, VEBF parece ser uma molécula altamente especializada selectiva para células do endotélio vascular» Isto sugere que a divergência estructural entre o produto do protooncogene sis e VEBF fosse igualmente acompanhada de uma marcada diferença funcional» cDNA para VEBF é precedido de um peptídeo sinal clássico, indicando que VEBF é uma proteina. secretada, ao contrária de outros mifcogénios de células endoteliais tais como aFGF, bFGF e PD-ECGF» Isto sugere fortemente que a presença de VEBF nos meios condicionados por células foliculares representa um processo ds secreção verdadeiro e não o resultado de morte ou lise celulares» Assim, VEBF pode potencialmente desempenhar um papel como mediador solúvel do crescimento de células endoteliais- e angiogénese» VEBF ê codificado em células foliculares por um único RNA mensageiro de 3,7 kb conforme demonstrado por tran— ferências Northern»

Claims (4)

1. REIVINDICAgai lé·,. - Processo para a preparação oe uma sequência isolada de ãcido nucleico compreendendo uma sequência que codifica um factor ds crescimento de células endoteliais vasculares tendo um peso molecular de aproximadamente 45 ©θ© dal tons em condições não redutoras e aproximadamente 23 00® em condições redutoras conforme medido por SDS-PAGE, caracterizado por compreender os passos de rastreio de uma fonte de ãcido nucleico para <

   sequência e identificação e isolamento da sequência a partir aa ronte.
2. 2®. ~ Processo de acordo com a reivindicação 1caracterizado por se preparar uma sequência em que o factor de crescimento é bovino ou humano e a sequência é uma sequência ds DNA»
3. 3.ê= - Processo para a preparação de uma sequência de DNA isolada compreendendo uma sequência que híbrida com s. sequência de DNA5
4. 5 — L.L· i H i LiBC I liHAtáiáíJGGlJdAtíAAstiCdTCAiJoAASl GSTSAAtí i TCA ! SGACSTláT ATOA quando incubada com ela a fosfato de sódio 50 mM pH solução de Denhartí ε 5®pq lavada com 2 x SSC, isolada contem pelo por compreender os

   0_FÍ% SDS menos ce passos

   42°C em formamida a 2®“í·, ó₅S_s pirofosfato de sódio /'ml de DNA de esperma de a 42°C_? em que a referida rca de dez nucleótidos, carde rastreio de uma fonte

   5 x SSC, 0,1%, 5 x salmão e sequência acterizado Lís? ciCiduJ nucleico para a sequência e identificação e isolamento da sequência a partir da fonte» •‘racesso para a preparaç de uma sequência de

   DNA isolada compreendendo uma sequênci cia de DNA da Fig=2 que se segues que hibrida com sequen