CN108026165A - 用于抗体碎片的改进的复性方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供雷珠单抗的复性方法,其中将重质链和/或轻质链的雷珠单抗的增溶溶液用复性缓冲液在合适的条件下处理,包括pH,温度和培养期,并且该pH和温度变化以合适的间隔进行的,来获得高品质和量的复性的蛋白质。
Description
发明领域
本发明涉及生产抗体碎片例如雷珠单抗的方法。更具体地,本发明提供从细菌细胞中所形成的包涵体来回收复性的雷珠单抗的方法。
发明背景
抗体碎片小于常规的抗体,并且通常缺乏糖基化,其允许它们在原核表达系统中生产(Kurucz I等人,Mol Immunol.199532(17-18):1443-52.)。虽然这些较小抗体碎片的基因结构是容易制造的,但是复性碎片的表达变得更困难,这归因于非本来结构。但是,它们可以容易地作为包涵体(IB)在细菌细胞中制造,限定它可以成功复性。但是,IB形成和不溶性蛋白质的复性已经是完全利用大肠杆菌细胞质表达技术的主要障碍(TsutomuArakawa等人,抗体2014,3:232-241)。
雷珠单抗(Lucentis)是一种设计用于眼内的重组体人类化IgG1k同型体单克隆抗体碎片。雷珠单抗结合到和抑制了人类血管内皮生长因子A(VEGF-A)的生物活性。雷珠单抗的分子量是大约48千道尔顿,因为它缺乏Fc区域,并且仅仅由Fab组成,所以可以通过细菌表达系统,优选在大肠杆菌中表达它。Fab碎片对应于该抗体分子的两个相同的臂,其包含完全的轻质链(LC)和与之配对的重质链(HC)的VH和CH1阈。当Fab的LC和HC阈是在细菌系统中,在相同的宿主或者不同的宿主中过表达时,它们形成了称作包涵体的不溶性聚集体。
包涵体主要包含不溶性形式的无活性错复性蛋白质,并且将它转化成活性天然证实总是具有一定的挑战,并且已经报告了几个方法来回收复性的抗体碎片。(TesturoFujii等人,J.Biochem.2007141:699–707;Jin-Liang Xing等人,World J Gastroenterol200410(14):2029-2033)。但是它们的一些不能以工业规模来成规模的,并且另一些产生了非常低复性的蛋白质。此外,研究还尝试了不同的复性技术(Eliana De Bernardez Clark,Current Opinion in Biotechnology 1998,9:157-163)。
此外,本领域仍然需要提供一种从细菌细胞中形成包涵体中回收高品质和量的复性的蛋白质例如雷珠单抗的方法。所以本发明提供一种从包涵体中回收复性的雷珠单抗的有效方法。
发明内容
在一种实施方案中,本发明提供一种从包涵体中回收复性的雷珠单抗的方法,该方法包含在合适的pH,温度和培养期条件下进行的增溶和复性步骤。
在一种实施方案,本发明提供在包括pH,温度和培养期的合适的条件下,用复性缓冲液处理重质链和/或轻质链雷珠单抗的增溶溶液的方法,其中该pH和温度变化是以合适的间隔进行来获得高品质和量的复性的蛋白质。
在一种实施方案中,本发明提供一种回收复性的雷珠单抗的方法,该方法包含步骤:
a)从细菌宿主细胞中分离轻质链和/或重质链雷珠单抗;
b)将所述的轻质链和/或重质链的雷珠单抗在包含促溶剂和/或还原剂的第一缓冲溶液中,在pH大约9增溶;
c)将所述增溶轻质链和重质链雷珠单抗在第二缓冲液溶液中,在具有高pH和低温度的合适的条件下复性,直到第一培养期,然后将该合适的条件改变到低pH和高温度,直到第二培养期,其中该pH和温度变化是在第一和第二培养期之间进行的,来获得复性的雷珠单抗;
d)回收所述的复性的雷珠单抗。
在一种实施方案中,本发明提供一种回收复性的雷珠单抗的方法,其包含步骤:
a)从细菌宿主细胞中分离轻质链和/或重质链雷珠单抗;
b)将所述的轻质链和/或重质链的雷珠单抗在包含促溶剂和/或还原剂的第一缓冲溶液中,在选自大约8-大约9.5的pH增溶;
c)将所述增溶轻质链和重质链雷珠单抗在包含氧化剂的第二缓冲液溶液中,在具有选自大约pH10-大约pH11的pH,选自至少大约4℃-大约12℃的温度和选自至少大约4小时-大约8小时的培养期的合适的条件下复性;
d)进行步骤(c)的合适的条件的改变,包含选自大约8-大约9的pH,选自至少大约20℃-大约30℃的温度和选自至少大约1小时-大约20小时的培养期,来获得复性的雷珠单抗;和
e)回收所述的复性的雷珠单抗。
在一种实施方案中,本发明提供一种回收复性的雷珠单抗的方法,其包含步骤:
a)从细菌宿主细胞中分离轻质链和/或重质链雷珠单抗;
b)将所述的轻质链和/或重质链的雷珠单抗在包含促溶剂和/或还原剂的第一缓冲溶液中,在选自大约8-大约9.5的pH增溶;
c)将所述增溶轻质链和重质链雷珠单抗在包含氧化剂的第二缓冲液溶液中,在具有选自大约pH10-大约pH11的pH,选自至少大约4℃-大约12℃的温度和选自至少大约4小时-大约8小时的培养期的合适的条件下复性;
d)进行步骤(c)的合适的条件的改变,包含选自大约8-大约9.5的pH,选自至少大约20℃-大约30℃的温度和选自至少大约1小时-大约20小时的培养期,来获得复性的雷珠单抗;和
e)回收所述的复性的雷珠单抗。
在一种实施方案中,本发明提供一种回收复性的雷珠单抗的方法,其包含步骤:
a)从细菌宿主细胞中分离轻质链和/或重质链雷珠单抗;
b)将所述的轻质链和/或重质链的雷珠单抗在包含促溶剂和/或还原剂的第一缓冲溶液中,在pH大约9的增溶;
c)将所述增溶轻质链和重质链雷珠单抗在包含氧化剂的第二缓冲液溶液中,在具有pH大约10,温度至少大约5℃-10℃和培养期至少大约4小时的合适的条件下复性;
d)进行步骤(c)的合适的条件的改变,包含pH大约9,温度至少大约20℃-25℃和培养期至少大约14小时,来获得复性的雷珠单抗;和
e)回收所述的复性的雷珠单抗。
在一种实施方案中,本发明另外提供净化方法,其包括将含有雷珠单抗的溶液澄清化,然后将该澄清溶液中的所述的复性的雷珠单抗与阴离子交换和阳离子交换柱接触,和从每个柱中选择性回收或者洗提复性的雷珠单抗。
附图说明:
图1:增溶和还原的IB的RP-HPLC曲线。
图2:在18h和参考标准物的复性1的RP-HPLC曲线。
图3:复性1和2在不同时间点的RP-HPLC曲线。
图4:复性的RP-HPLC曲线。
图5:复性的RP-HPLC曲线,复性的pH调节到8.7
图6:复性的RP-HPLC曲线,复性的pH调节到9.0
图7:复性的RP-HPLC曲线,复性的pH调节到9.3
图8:复性的RP-HPLC曲线,复性的pH调节到9.0
具体实施方式
定义:
作为本文使用的,“抗体碎片”通常指的是具有大于大约10个氨基酸的蛋白质。抗体碎片表达为进入宿主细胞的异种蛋白质。
抗体碎片的例子是雷珠单抗,阿昔单抗,Anatamomab,阿西莫单抗,贝妥莫单抗,比西单抗,赛妥珠单抗,Citatuzumab.bogatox,Naptumomab,若非单抗,硫索单抗,Tadocizumab,Telimomab。在优选的实施方案中,所述抗体碎片是雷珠单抗。
作为本文使用的,“血管内皮生长因子”或者“VEGF”指的是哺乳动物生长因子,其最初来源于具有氨基酸序列的牛垂体卵泡细胞,如Castor,C.W.等人,(1991)Methods inEnzymol.198:391-405中所公开的,及其具有相应的天然VEGF的定性生物活性的功能衍生物,包括但不限于人VEGF氨基酸序列,如Houck等人,(1991)Mol.Endocrin.5:1806-1814中所报告的。还参见Leung等人(1989)Science,246:1306,和Robinson&Stringer,(2001)Journal of Cell Science,144(5):853-865,美国专利No.5,332,671。这也称作VEGF-A。
作为本文使用的,“适当复性”或者“生物活性”指的是具有生物活性构造和表现出理想的生物活性的分子。
术语“净化的”或者“纯重组体蛋白质”等指的是材料没有通常伴随着它的物质,如在它的重组体生产和特别是在原核或者细菌细胞培养基中所发现的。因此该术语指的是这样的重组体蛋白质,其没有污染DNA,宿主细胞蛋白质或者在原位环境中与它有关的其他分子。该术语指的是纯度,其是至少大约75%,至少大约80%,至少大约85%,至少大约90%,至少大约95%或者至少大约98%或者更大。
作为本文使用的,术语“错复性”蛋白质指的是沉淀的或者聚集的多肽,其包含在包涵体内。作为本文使用的,“不溶性”或者“错复性”反VEGF抗体例如雷珠单抗或者其他重组体蛋白质指的是沉淀的或者聚集的雷珠单抗或者重组体蛋白质,其包含在原核宿主细胞的周质或者细胞内空间中和假定生物无活性构造,具有错配或者未形成的二硫键。该不溶性重组体蛋白质通常,但不必需包含在包涵体内。
作为本文使用的,“促溶剂”指的是这样的化合物,其处于合适浓度的水溶液中,其能够通过改变其表面来使得多肽可溶于含水介质中,来改变多肽的立体构型或者构造。该改变可以通过例如改变水合态,溶剂环境或者溶剂-表面相互作用来发生。促溶剂的浓度将直接影响它的浓度和效率。强变性促溶溶液包含高浓度的促溶剂,其在溶液中将有效解折叠该溶液中存在的多肽,这有效地消除了蛋白质的次级结构。该解折叠将是相对广泛的,但是可逆的。中度变性促溶溶液包含促溶剂,其在溶液中处于足够的浓度,这允许多肽从任何扭曲的构造部分地折叠,该多肽已经通过在溶液中中级可溶,而假定到所述空间构造中,其中当以它的活性形式在内生或者同源生理条件下运行时它以本身存在。促溶剂的例子包括盐酸胍,尿素,和氢氧化物例如氢氧化钠或者氢氧化钾。促溶剂包括这些试剂的组合,例如氢氧化物与尿素或者盐酸胍的混合物。
作为本文使用的,“还原剂”指的是这样的化合物,其以合适的浓度处于水溶液中,保持游离巯基,以使得分子内或者分子间二硫化物键被化学破坏。合适的还原剂的代表性例子包括二硫代苏糖醇(DTT),二硫代赤藻糖醇(DTE),β-巯基乙醇(BME),半胱氨酸,半胱胺,巯基乙酸盐,谷胱甘肽和硼氢化钠。
作为本文使用的,“缓冲液溶液”指的是这样的溶液,其通过它的酸-碱共轭组分的作用而是耐pH变化的。
作为本文使用的,“第一缓冲溶液”指的是增溶缓冲液,其用于增溶包涵体。
作为本文使用的,“第二缓冲溶液”指的是复性缓冲液,其用于从不溶性错复性蛋白质中回收理想的复性的蛋白质确认。
本发明提供一种从细菌宿主细胞中回收和净化复性的重组体蛋白质的方法。本发明的方法可宽泛地应用于抗体碎片如Fab,ScFv,其包括但不限于雷珠单抗,阿昔单抗,Anatamomab,阿西莫单抗,贝妥莫单抗,比西单抗,赛妥珠单抗,Citatuzumab.bogatox,Naptumomab,若非单抗,硫索单抗,Tadocizumab,Telimomab。在优选的实施方案中,该抗体碎片是雷珠单抗。
本发明提供一种从细胞内或者周质空间细菌宿主细胞中形成的不溶性蛋白质中回收复性的蛋白质的方法。在一种实施方案中,包涵体是根据本领域已知的方法来从原核细胞中分离的。该分离的包涵体主要包含错复性不溶性蛋白质和杂质。在某些实施方案中,该方法和程序可应用于制造或者工业规模生产,复性和净化重组体蛋白质。
在一种实施方案中,分离处于粒料中的包含处于重质链和/或轻质链的雷珠单抗的IB,然后在第一缓冲溶液充分培养,来基本上增溶该IB。这种培养在合适的浓度,培养时间和培养温度条件下进行,其将允许增溶期望量的或者基本上全部的IB。在这样的实施方案中,还原是用合适的还原剂进行大约30分钟-45分钟,其后过滤该还原的溶液,和进一步用于复性。
在实施方案中,该第一缓冲液包含Tris-Cl,尿素。在某些实施方案中,该Tris-Cl的存在浓度选自10mM-60mM,优选50mM。在某些实施方案中,尿素的存在浓度选自6M-8M,优选8M。在实施方案中,第一缓冲液溶液的pH选自8.5-10,优选9。
在一种实施方案中,该促溶剂选自盐酸胍,尿素,和氢氧化物例如氢氧化钠或者氢氧化钾。
在实施方案中,该还原剂选自二硫代苏糖醇(DTT),二硫代赤藻糖醇(DTE),β-巯基乙醇(BME),半胱氨酸,半胱胺,巯基乙酸盐,谷胱甘肽和硼氢化钠。
在一种实施方案中,增溶重质和/或轻质链雷珠单抗进一步用第二缓冲液溶液或者复性缓冲液处理来进行复性。第二缓冲液溶液包含具有高pH和低温度的合适条件,直到第一培养期,然后保持具有低pH和高温的合适条件,直到第二培养期,其中该pH和温度变化是在第一和第二培养期之间进行的。
在一种实施方案中,该增溶重质和/或轻质链的雷珠单抗溶液是用第二缓冲溶液在具有pH选自大约pH10-大约pH11,温度选自至少大约4℃-大约12℃和培养时间选自至少大约4小时-大约8小时的合适条件下处理的,然后进行pH和温度变化到pH选自大约8-大约9,温度选自至少大约20℃-大约30℃和培养时间选自至少大约14小时-大约20小时。在这样的实施方案中,pH改变意味着将pH从pH10-11改变到pH8-9。在某些实施方案中,pH改变意味着将pH从pH10-11改变到pH8-9.5。温度变化意味着温度变化是4℃-12℃到20℃-30℃。
在某些实施方案中,该第一培养期选自大约1小时-大约25小时。在优选的实施方案中,该第一培养期选自大约4小时-大约15小时。在优选的实施方案中,该第一培养期是大约4小时。
在某些实施方案中,该第二培养期选自大约1小时-大约25小时。在优选的实施方案中,该第一培养期选自大约12小时-大约25小时。在优选的实施方案在,该第一培养期是大约14小时。
在实施方案中,该第二缓冲液包含Tris,精氨酸和山梨糖醇。在某些实施方案中,该Tris的存在浓度选自10mM-60mM,优选50mM。在某些实施方案中,精氨酸的存在浓度选自0.1M-1M,优选0.6mM。在某些实施方案中,山梨糖醇的存在浓度选自1%-8%,优选5%。
在某些实施方案中,该第二缓冲液包含选自1mM-10mM的氧化剂浓度。在一种实施方案中氧化剂浓度是3mM。在某些实施方案中氧化剂选自胱氨酸,氧化的谷胱甘肽(GSSG),硫酸铜,脱氢抗坏血酸,硫代硫酸钠。在一种实施方案中该氧化剂是胱氨酸。
在一种实施方案中,本发明提供一种回收复性的雷珠单抗的方法,该方法包含步骤:
a)从细菌宿主细胞中分离轻质链和/或重质链雷珠单抗;
b)将所述的轻质链和/或重质链的雷珠单抗在包含促溶剂和/或还原剂的第一缓冲溶液中,在pH大约9增溶;
c)将所述增溶轻质链和重质链雷珠单抗在第二缓冲液溶液中,在具有高pH和低温度的合适的条件下复性,直到第一培养期,然后将该合适的条件改变到低pH和高温度,直到第二培养期,其中该pH和温度变化是在第一和第二培养期之间进行的,来获得复性的雷珠单抗;
d)回收所述的复性的雷珠单抗。
在一种实施方案中,本发明提供一种回收复性的雷珠单抗的方法,其包含步骤:
a)从细菌宿主细胞中分离轻质链和/或重质链雷珠单抗;
b)将所述的轻质链和/或重质链的雷珠单抗在包含促溶剂和/或还原剂的第一缓冲溶液中,在选自大约8-大约9.5的pH增溶;
c)将所述增溶轻质链和重质链雷珠单抗在包含氧化剂的第二缓冲液溶液中,在具有选自大约pH10-大约pH11的pH,选自至少大约4℃-大约12℃的温度和选自至少大约4小时-大约8小时的培养期的合适的条件下复性;
d)进行步骤(c)的合适的条件的改变,包含选自大约8-大约9的pH,选自至少大约20℃-大约30℃的温度和选自至少大约1小时-大约20小时的培养期,来获得复性的雷珠单抗;和
e)回收所述的复性的雷珠单抗。
在一种实施方案中,本发明提供一种回收复性的雷珠单抗的方法,其包含步骤:
a)从细菌宿主细胞中分离轻质链和/或重质链雷珠单抗;
b)将所述的轻质链和/或重质链的雷珠单抗在包含促溶剂和/或还原剂的第一缓冲溶液中,在选自大约8-大约9.5的pH增溶;
c)将所述增溶轻质链和重质链雷珠单抗在包含氧化剂的第二缓冲液溶液中,在具有选自大约pH10-大约pH11的pH,选自至少大约4℃-大约12℃的温度和选自至少大约4小时-大约25小时的培养期的合适的条件下复性;
d)进行步骤(c)的合适的条件的改变,包含选自大约8-大约9.5的pH,选自至少大约20℃-大约30℃的温度和选自至少大约1小时-大约25小时的培养期,来获得复性的雷珠单抗;和
e)回收所述的复性的雷珠单抗。
在一种实施方案中,本发明提供一种回收复性的雷珠单抗的方法,其包含步骤:
a)从细菌宿主细胞中分离轻质链和/或重质链雷珠单抗;
b)将所述的轻质链和/或重质链的雷珠单抗在包含促溶剂和/或还原剂的第一缓冲溶液中,在选自大约8-大约9.5的pH增溶;
c)将所述增溶轻质链和重质链雷珠单抗在包含氧化剂的第二缓冲液溶液中,在具有pH选自大约pH10-大约pH11,温度选自至少大约4℃-大约12℃和培养时间选自至少大约4小时-大约8小时的合适的条件下复性;
d)进行步骤(c)的合适的条件的改变,包含包含pH选自大约8-大约9.5,温度选自至少大约20℃-大约30℃和培养时间选自至少大约1小时-大约20小时,来获得复性的雷珠单抗;和
e)回收所述的复性的雷珠单抗。
在一种实施方案中,本发明提供一种回收复性的雷珠单抗的方法,其包含步骤:
a)从细菌宿主细胞中分离轻质链和/或重质链雷珠单抗;
b)将所述的轻质链和/或重质链的雷珠单抗在包含促溶剂和/或还原剂的第一缓冲溶液中,在pH大约9的增溶;
c)将所述增溶轻质链和重质链雷珠单抗在包含氧化剂的第二缓冲液溶液中,在具有pH大约10,温度至少大约5℃-10℃和培养期至少大约4小时的合适的条件下复性;
d)进行步骤(c)的合适的条件的改变,包含pH大约9,温度至少大约20℃-25℃和培养期至少大约14小时,来获得复性的雷珠单抗;和
e)回收所述的复性的雷珠单抗。
在实施方案中,该复性的雷珠单抗是通过使用合适的色谱法来净化的。在优选的实施方案中,将该复性的雷珠单抗过滤,然后进行阴离子交换柱和阳离子交换柱。
在一种实施方案中,该复性的雷珠单抗的净化方法包含一种或多种杂质,其中该方法包含:
(a)第一阴离子交换色谱法;
(b)第二阴离子交换色谱法;和
(c)阳离子交换色谱法;
(d)任选地过滤可以在步骤(a)或者步骤(c)之前进行。
在一种实施方案中,该复性的雷珠单抗的净化方法包含一种或多种杂质,其中该方法包含:
(a)将包含复性的雷珠单抗和一种或多种杂质的组合物装入第一阴离子交换色谱法柱上,其是用pH大约8-大约10的平衡缓冲液平衡的,并且用pH大约7-大约9的洗提缓冲液洗提该柱,来获得第一洗提溶液;
(b)将获自步骤(a)的第一洗提溶液装入第二阴离子交换色谱法柱上,其是用pH大约8-大约10的平衡缓冲液平衡的,并且用pH大约7-大约10的洗提缓冲液洗提该柱,来获得第二洗提溶液;和
(c)将获自步骤(b)的第二洗提溶液装入阳离子交换色谱法柱上,其是用pH大约4-大约6.5的平衡缓冲液平衡的,并且使用盐梯度来洗提该结合的雷珠单抗。
在一种实施方案中,该复性的雷珠单抗的净化方法包含一种或多种杂质,其中该方法包含:
(a)将包含雷珠单抗和一种或多种杂质的组合物装入第一阴离子交换色谱法柱上,其是用pH大约8.5-大约9.5的平衡缓冲液平衡的,并且用pH大约7.5-大约8.5的洗提缓冲液洗提该柱,来获得第一洗提溶液;
(b)将获自步骤(a)的第一洗提溶液装入第二阴离子交换色谱法柱上,其是用pH大约8.5-大约9.5的平衡缓冲液平衡的,并且用pH大约7.5-大约8.5的洗提缓冲液洗提该柱,来获得第二洗提溶液;和
(c)将获自步骤(b)的第二洗提溶液装入阳离子交换色谱法柱上,其是用pH大约4.5-大约6.0的平衡缓冲液平衡的,并且使用pH大约4.5-大约6.0的洗提缓冲液洗提该柱,来获得所关注的净化的抗体;
(d)任选的过滤可以在步骤(a)或者步骤(c)之前进行。
本发明可以通过下面的实施例来说明,本领域技术人员将清楚地理解在实施方案和实施例中许多改变是可能的,而不脱离其教导。
实施例1
将在发酵,收获和IB分离之后获得的36g包涵体(IB)在包含8M尿素,50mM Tris和处于pH9的大约720mL第一缓冲液中增溶,并且使用4mM DTT进行45分钟还原。该增溶和还原的IB然后用0.8+0.2μm过滤器过滤。
增溶IB的曲线是通过RP-HPLC检查的,如图1所示。重质链和轻质链峰可以在该曲线中观察到。
然后在1h内以恒定流速将大约360ml增溶和还原的IB溶液加入到包含0.6M精氨酸,5%山梨糖醇和50mM Tris和处于pH10和温度5-10℃的大约8640mL复性缓冲液。在这个pH的复性进行了4h,然后用酸将该复性溶液的pH调节到9。在pH调整后还升温到20-25℃。复性持续了另外14小时。该RP-HPLC曲线显示在图2和图3中,其称作复性1。在该曲线中可以观察到复性的Fab峰。
实施例2
将在发酵,收获和IB分离之后获得的21.5g包涵体(IB)在包含8M尿素,50mM Tris和处于pH9的大约430mL第一缓冲液中增溶,并且使用4mM DTT进行45分钟还原。该增溶和还原的IB然后用0.8+0.2μm过滤器过滤。
使用了大约400ml增溶和还原的IB,并且将它在1h内以恒定流速加入到包含0.6M精氨酸,5%山梨糖醇,50mM Tris和处于pH9和温度5-10℃的大约9.5L复性缓冲液。该复性进行了大约45h。这个复性称作复性2。在24小时获得的复性的蛋白质的纯度是8.1%和在24小时获得的复性的蛋白质的产率是3.1%。该RP-HPLC曲线显示在图2和3中,并且称作复性2。因此,从RP-HPLC结果可以观察到与45h的复性2相比,复性1在18h内产生了更高的复性。
实施例3
将在发酵,收获和IB清洗之后获得的100g包涵体在1500ml的增溶缓冲液(8M尿素,50mM Tris pH9)中增溶,并且使用4mM DTT进行45分钟还原。该增溶和还原的IB然后过滤。
然后在5-10℃在1h内以恒定流速将800ml增溶和还原的IB加入到~19L的复性缓冲液(0.6M精氨酸,5%山梨糖醇,50mM Tris,pH10)。该复性在这个条件持续大约4-5h。其后从该19L复性溶液中除去三个等分部分(每个2L),并且用6N HCl将每个等分部分的pH分别调节到8.7,9.0和9.3,和复性在这个条件在温度21-25℃持续高到21-28小时。图5-图7显示了在不同的pH的复性的RP-HPLC曲线。该曲线显示在所研究的pH范围内的复性产生了几乎类似的复性。
实施例4
将在发酵,收获和IB清洗之后获得的大约1.6Kg包涵体在~32L的增溶缓冲液(8M尿素,50mM Tris pH9)中增溶,并且使用DTT进行还原。该增溶和还原的IB然后过滤。
在5-10℃将增溶的和还原的IB在1h内以恒定流速加入到大约800L复性缓冲液中(0.6M精氨酸,5%山梨糖醇,50mM Tris,pH10.1)。该复性在这个条件持续了大约4-5h,并且将该复性的pH用6N HCl调节到9.1。复性温度增加到21-25℃和复性持续高到21-22h。该复性的RP-HPLC曲线显示在图4中。复性的蛋白质的纯度和产率分别是47.3%和13.6%。
实施例5
将在发酵,收获和IB清洗之后获得的45g包涵体在900ml增溶的缓冲液(8M尿素,50mM Tris pH9)中增溶,并且使用4mM DTT进行45分钟还原。该增溶和还原的IB然后过滤。
在5-10℃将400ml增溶的和还原的IB在1h内以恒定流速加入到大约9.5L复性缓冲液(0.6M精氨酸,5%山梨糖醇,50mM Tris),该复性缓冲液的pH是大约10.5-10.6。该复性在这个条件持续了大约4-5h,并且将该复性溶液的pH用6N HCl调节到9。复性温度增加到21-25℃和复性持续高到21-22h。该复性的RP-HPLC曲线显示在图8中。
Claims (22)
1.一种回收复性的雷珠单抗的方法,该方法包含步骤:
a)从细菌宿主细胞中分离轻质链和/或重质链雷珠单抗;
b)将所述的轻质链和/或重质链的雷珠单抗在包含促溶剂和/或还原剂的第一缓冲溶液中,在合适的pH增溶;
c)将增溶轻质链和/或重质链雷珠单抗在第二缓冲液溶液中,在具有pH和温度的合适的条件下复性,直到第一培养期,然后将该第一培养期的pH和温度改变到低pH和高温,直到第二培养期,其中该pH和温度变化是在第一和第二培养期之间进行的,来获得复性的雷珠单抗;和
d)回收所述的复性的雷珠单抗。
2.权利要求1所要求的方法,其中步骤(c)的第二缓冲液溶液的pH在第一培养期过程中保持在大约10-大约11。
3.权利要求2所要求的方法,其中步骤(c)的第二缓冲液溶液的pH在第一培养期过程中保持在10。
4.权利要求1所要求的方法,其中步骤(c)的第二缓冲液溶液的温度在第一培养期过程中保持在大约4℃-大约12℃。
5.权利要求4所要求的方法,其中步骤(c)的第二缓冲液溶液的温度保持在大约5℃-大约10℃。
6.权利要求1所要求的方法,其中该第一培养期是大约1-大约25小时。
7.权利要求6所要求的方法,其中该第一培养期是4小时。
8.权利要求1所要求的方法,其中步骤(c)的第二缓冲液溶液的pH在第二培养期过程中保持在大约8-大约9。
9.权利要求8所要求的方法,其中步骤(c)的第二缓冲液溶液的pH保持在9。
10.权利要求1所要求的方法,其中步骤(c)的第二缓冲液溶液在温度在第二培养期过程中保持在大约20℃-大约30℃。
11.权利要求10所要求的方法,其中步骤(c)的第二缓冲液溶液的温度保持在大约20℃-大约25℃。
12.权利要求1所要求的方法,其中该第二培养期是大约1-大约25小时。
13.权利要求12所要求的方法,其中该第二培养期是14小时。
14.权利要求1所要求的方法,其中该第二缓冲液选自Tris、精氨酸、山梨糖醇、胱氨酸、氧化的谷胱甘肽(GSSG)、硫酸铜、脱氢抗坏血酸和硫代硫酸钠。
15.权利要求1所要求的方法,其中该第二缓冲液选自Tris、精氨酸、山梨糖醇和胱氨酸。
16.权利要求1所要求的方法,其中步骤(b)中的第一缓冲液溶液选自Tris-Cl和尿素。
17.权利要求16所要求的方法,其中步骤(b)的第一缓冲液溶液的pH保持在大约8.5-大约10。
18.权利要求17所要求的方法,其中步骤(b)的第一缓冲液溶液的pH保持在9。
19.权利要求1所要求的方法,其中该促溶剂选自盐酸胍、尿素和氢氧化钠或者氢氧化钾。
20.权利要求1所要求的方法,其中该还原剂选自二硫代苏糖醇(DTT)、二硫代赤藻糖醇(DTE)、β-巯基乙醇(BME)、半胱氨酸、半胱胺、巯基乙酸盐、谷胱甘肽和硼氢化钠。
21.前述任一项权利要求所要求的回收复性的雷珠单抗的方法,其包含步骤:
a)从细菌宿主细胞中分离轻质链和/或重质链雷珠单抗;
b)将所述的轻质链和/或重质链的雷珠单抗在包含促溶剂和/或还原剂的第一缓冲溶液中,在pH大约9增溶;
c)将所述的增溶轻质链和重质链雷珠单抗在第二缓冲液溶液中,在具有pH大约10,温度至少大约5℃-10℃的合适的条件下复性至少大约4小时的第一培养期;
d)将步骤(c)的合适的条件在大约14小时的第二培养期进行改变,包含pH大约9,温度至少大约20℃-25℃,来获得复性的雷珠单抗;和
e)回收所述的复性的雷珠单抗。
22.权利要求1所要求的方法,其中该回收的复性的雷珠单抗是使用选自过滤和阴离子或者阳离子色谱法的至少一种净化方法来进一步净化的。
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