KR101520105B1

KR101520105B1 - 재조합 단백질의 리폴딩

Info

Publication number: KR101520105B1
Application number: KR1020097002959A
Authority: KR
Inventors: 쉘리 피자로; 에일린 산체즈; 찰스 에이치. 쉬멜저
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2006-07-14
Filing date: 2007-07-13
Publication date: 2015-05-21
Also published as: EP2041154B1; NZ573639A; WO2008008975A3; JP2013121362A; BRPI0713252A2; JP2009543882A; US9200030B2; TWI476207B; US20160137690A1; JP6120356B2; IL196004A0; MX2009000278A; BRPI0713252C1; CN101506222B; AU2007272412A1; MY169472A; JP5566104B2; US9994612B2; CA2656835A1; SG162834A1

Abstract

pH가 높은 완충액 중에서 단백질을 리폴딩시키는 단계를 포함하는, 이종성 숙주 세포에서 생산된 리폴딩된 재조합 단백질을 회수하고 정제시키는 방법을 제공한다.

리폴딩된 재조합 단백질, 회수, 정제, 성장 인자, VEGF

Description

재조합 단백질의 리폴딩{REFOLDING OF RECOMBINANT PROTEINS}

관련 출원

본 출원은 2006년 7월 14일 출원된 미국 가출원 시리얼 번호 제60/830,831호 (그의 명세서 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 관한 우선권과, 그에 대한 잇점을 주장한다.

본 발명의 분야

본 발명은 세포 배양물에서 생산된 이종성 재조합 단백질을 수득하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 원핵생물 숙주 세포에서 생산되고 이들 세포내, 전형적으로는 원형질막 주위공간 또는 세포간극에 존재하는, 리폴딩된 재조합 단백질을 회수하고 정제하는 방법을 포함한다. 원핵생물 숙주 세포에서 생산된 재조합 단백질은 또한 가용성 단백질로서, 또는 가용성 및 불용성 단백질의 혼합물로서 발견될 수 있다.

다수의 치료학적으로 관련된 재조합 단백질은 다양한 숙주 유기체에서 생산된다. 대부분의 단백질은 진핵생물 숙주, 예로서, CHO 세포에서 그의 천연 형태로 발현될 수 있다. 동물 세포 배양물은 일반적으로 최대 세포 밀도에 도달하기 위해서는 장기간의 배양 시간이 필요하며, 최종적으로는 원핵생물 세포 배양물보다 더 낮은 세포 밀도에 도달한다 (문헌 [Cleland, J. (1993) ACS Symposium Series 526, Protein Folding: In Vivo and In Vitro, American Chemical Society]). 추가로, 동물 세포 배양물은 종종 원하는 단백질의 회수를 방해할 수 있는 배양 성분을 함유하는 값비싼 배지를 필요로 한다. 세균 숙주 발현 시스템은 재조합 단백질의 제조업 규모의 생산에 대한 대안이자, 비용면에서 효율적인 대안을 제공한다. 재조합 단백질의 일반 세균 발현에 관한 미국 특허는 다수 존재하며, 이는 미국 특허 번호 제4,565,785호; 제4,673,641호; 제4,795,706호; 및 제4,710,473호를 포함한다. 생산 방법의 주된 장점은 원심분리 또는 정밀여과에 의해 세포 성분으로부터 산물을 용이하게 단리시킬 수 있다는 능력이다. 예를 들어, 문헌 ([Kipriyanov and Little, (1999) Molecular Biotechnology, 12:173-201]; 및 [Skerra and Pluckthun, (1988) Science. 240: 1038-1040])을 참조한다.

그러나, 세균 발현 시스템, 예로서, E. 콜라이(E. coli)에는 단백질의 적절한 리폴딩을 촉진시키는 세포 기관이 존재하지 않으며, 일반적으로는 거대 단백질을 배양 배지로 분비하지 못한다. 세균 숙주 세포에서 발현되는 재조합 단백질은 종종 부분적으로 폴딩된 환원된 단백질 및 미스폴딩된 환원된 단백질의 조밀한 매스로 구성된 봉입체로서 발견된다. 예를 들면, 문헌 ([Baneyx, (1999) Current Opin. Biotechnology 10:411-421]; 및 [Villaverde and Carrio, (2003) Biotech. Letts. 25:1385-1395])을 참조한다. 단백질은 또한 봉입체를 형성하지 않은 채로 발현될 수 있다. 예를 들면, 상기 문헌을 참조한다. 전형적으로 봉입체내 재조합 단백질은 일반적으로 불활성이다.

추가로, 리폴딩은 종종 미스폴딩되고, 이황화-연결된 이량체, 삼량체, 및 다량체를 생산한다 (문헌 [Morris et al., (1990) Biochem. J. 268:803-806]; [Toren et al., (1988) Anal. Biochem., 169:287-299]). 이러한 회합 현상은 단백질 리폴딩시에, 특히 단백질이 고농도일 때 매우 공통적이며, 종종 부분적으로 폴딩된 중간체의 소수성 상호작용을 통한 회합을 포함하는 것으로 보인다 ([Cleland and Wang, (1990) Biochemistry 29:11072-11078]).

미스폴딩은 발효시 또는 분리 절차시에 세포에서 일어난다. 원형질막 주위공간 또는 세포간극으로부터 회수된 단백질은 가용화되어야 하며, 가용성 단백질은 천연 상태로 리폴딩되어야 한다. 예를 들면, 문헌 [Rudolph, Renaturation of Recombinant, Disulfide-Bonded Proteins From "Inclusion bodies" in Modern Methods in Protein- and Nucleic Acid Research (Walter de Gruyter New York, 1990) pp. 149-172] 참조한다. 단백질을 올바르고, 생물학적으로 활성인 입체구조로 리폴딩시키는 시험관내 방법은 기능성 단백질을 수득하는데 필수적이다. 봉입체로부터 회수된 단백질을 처리하는 전형적인 하류 공정은 예로서, 우레아와 같은 고농도의 변성제 중에서 봉입체를 용해시킨 후, 변성제를 희석시켜 리폴딩이 일어날 수 있도록 하는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 제4,512,922호; 제4,511,502호; 및 제4,511,503호 참조한다). 예를 들면, 문헌 ([Rudolph and Lilie, (1996) FASEB J. 10:49-56]; [Fischer et al., (1993), Biotechnology and Bioengineering, 41:3-13]; [Misawa & Kumagai, (1999) Biopolymers 51:297-307]; 및 [Clark, (1998) Current Opinion in Biotechnology. 9:157-163]; 및 [Tsumoto et al., (2003) Protein Expression and Purification 28:1-8])도 참조한다. 그러한 회수 방법은 보편적으로 최소한의 수정을 통해 봉입체로부터 생물학적으로 활성인 재조합 단백질을 회수하는데 적용될 수 있는 것으로 간주된다. 이들 방법이 헤파린 결합 단백질 (HBP), 예로서, VEGF에 적용되어 왔다 (문헌 [Siemeister et al. (1996) 상기 동일 문헌]). 이들 방법은 그의 다른 안정화력을 통해 재조합 단백질을 생물학적으로 활성인 입체 형태가 되도록 하기 이전에 무작위적인 이황화 결합을 제거하고자 하는 것이며, 부적절하게 폴딩된 중간체를 제거할 수 없거나, 적절하게 폴딩된 생성물의 동질적인 군집을 제공하지 못할 수 있거나, 적절하게 폴딩된 생성물을 충분한 양으로 제공하지 못할 수 있다.

단일 단백질을 미셀 내에 포위하거나 수지 상에서 분리한 후, 변성제를 제거함으로써 변성된 단백질의 리폴딩을 돕는데 역전 미셀 또는 이온 교환 크로마토그래피가 사용되어 왔다 (문헌 ([Hagen et al., (1990) Biotechnol. Bioeng. 35:966-975]; [Creighton (1985) in Protein Structure Folding and Design (Oxender, D.L. Ed.) pp.249-251, New York: Alan R. Liss, Inc.])). 이들 방법은 단백질 응집을 막고, 적절한 리폴딩을 촉진시키는데 유용하였다. 리폴딩 속도 또는 리폴딩 정도를 변경시키기 위하여 단백질의 천연 구조에 대한 리간드 및 항체를 사용하여 입체 형태-특이 리폴딩을 실시하여 왔다 (문헌 [Cleland and Wang, (1993), in Biotechnology, (Rehm H.-J., and Reed G. Eds.) pp 528-555, New York, VCH]). 예를 들면, 크레아틴 키나제는 천연 구조체에 대한 항체의 존재하에서 리폴딩되었다 (문헌 [Morris et al., (1987) Biochem. J. 248:53-57]). 항체 이외에도 리폴 딩을 증진시키기 위하여 리간드 및 보조인자가 사용되어 왔다. 이들 분자가 천연 단백질의 형성 이후 폴딩 단백질과 상호작용할 수 있는 가능성은 보다 크다. 그러므로, 폴딩 평형 상태는 천연 상태로 "유도"될 수 있다. 예를 들면, 페리시토크롬 c의 리폴딩 속도는 헴 철의 축 위치에 대한 외인성 리간드에 의해 증진되었다 (문헌 [Brems and Stellwagon, (1983) J. Biol. Chem. 258:3655-3661]). 샤페론 단백질 및 폴딩 촉매는 또한 단백질 폴딩을 돕는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Baneyx, (1999) Current Opinion in Biotechnology, 10:411-421; & [Carrio & Villaverde, (2003) FEBS Letters 537:215-221])을 참조한다. 그러나, 이러한 방법이 다량의 단백질 생성물을 생산하는데 있어 항상 효율적이거나, 충분한 것은 아니다.

숙주 세포 배양물로부터 재조합 단백질을 폴딩하고/거나 회수하는 신규하고 보다 효과적인 방법, 예를 들면, 세균 세포 배양물에서 재조합 단백질을 효과적이고 경제적으로 생산하는 방법에 관해 요구되고 있다. 이러한 신규하고 보다 효과적인 방법은 고도로 정제되고 생물학적으로 활성이며 적절하게 리폴딩된 단백질의 회수를 개선시키면서, 일반적으로는 제조업 규모의 단백질 생산에 적용될 수 있다. 하기 개시 내용을 리뷰함으로써 자명하게 되는 바, 본 발명은 이러한 요구와 기타 요구들을 다룬다.

본 발명의 요약

본 발명은 세포 배양물로부터 리폴딩된 재조합 단백질을 회수하고 정제하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 원핵생물 숙주 세포, 예를 들면, 세균 세포로부터 재조합 단백질을 회수하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 재조합 단백질에 광범위하게 적용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 재조합 단백질은 성장 인자, 예를 들면, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)이다. 하나의 실시태양에서, 성장 인자는 VEGF₁₆₅이다.

하나의 실시태양에서, 본 방법은 (a) 원핵생물 세포 배양물로부터 상기 재조합 단백질을 단리시키는 단계; (b) 제1 카오트로픽제를 포함하는, pH 9 초과의 제1 완충 용액 중에서 상기 단백질을 가용화시키는 단계; 및 (c) 재조합 단백질이 리폴딩될 수 있는 시간 동안, 및 그러한 조건하에 공기 또는 산소를 첨가하면서 제2 카오트로픽제, 2개 이상의 환원제를 포함하는, pH > 9이되, pH ≤ 11인 제2 완충 용액 중에서 상기 가용화된 단백질을 리폴딩시키는 단계; 및 (d) 상기 리폴딩된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 제1 완충 용액 및/또는 제2 완충 용액은 추가로 아르기닌을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 제1 완충 용액은 최종 농도 1 M의 우레아, 최종 농도 300 mM의 아르기닌, 최종 농도 10 mM의 CHES, 최종 농도 5 mM의 EDTA, pH 11을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 제1 완충 용액은 최종 농도 1 M의 우레아, 최종 농도 300 mM의 아르기닌, 최종 농도 10 mM의 트리스, 최종 농도 5 mM의 EDTA, pH 11을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 제2 완충 용액은 2개 이상의 환원제, 예를 들면, DTT 및 시스테인을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 제2 완충 용액은 최종 농도 1 M의 우레아, 최종 농도 15 mM의 시스테인, 최종 농도 2 mM의 DTT, 최종 농도 100 mM의 아르기닌, 최종 농도 10 mM의 CHES, 최종 농도 5 mM의 EDTA, pH 10을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 제2 완충 용액은 최종 농도 1 M의 우레아, 최종 농도 15 mM의 시스테인, 최종 농도 0.5-2 mM의 DTT, 최종 농도 100 mM의 아르기닌, 최종 농도 10 mM의 트리스, 최종 농도 5 mM의 EDTA, pH 10을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 본 방법은 (a) 원핵생물 세포 배양물로부터 상기 재조합 단백질을 단리시키는 단계; (b) 공기 또는 산소를 첨가하면서 pH > 9이되, pH ≤ 11인, 콤보 완충 용액 중에서 상기 단백질을 가용화시키고, 리폴딩시키는 단계; 및 (c) 상기 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 콤보 완충 용액은 최종 농도 1 M의 우레아, 최종 농도 15 mM의 시스테인, 최종 농도 2 mM의 DTT, 최종 농도 100 mM의 아르기닌, 최종 농도 10 mM의 CHES, 최종 농도 5 mM의 EDTA, pH 10을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 콤보 완충 용액은 최종 농도 1 M의 우레아, 최종 농도 15 mM의 시스테인, 최종 농도 0.5-2 mM의 DTT, 최종 농도 100 mM의 아르기닌, 최종 농도 10 mM의 트리스, 최종 농도 5 mM의 EDTA, pH 10을 포함한다.

리폴드 반응을 위한 산소 또는 공기는 공기 공급원 또는 산소가 강화된 압축 가스 공급원(gas supply)에 의해 제공받을 수 있다. 하나의 실시태양에서, 0.004분^-1의k_La이 사용되는데, 예를 들면, 이는 선박용 추진기를 포함하는 2.5 L의 베쓸에서 혼합 속도가 200-400 rpm이고, 분사 속도가 0.3 cc/분/L인 것을 나타낸다. 다른 실시태양에서, 리폴딩된 단백질을 생산하는데 k_La = O.O1분^-1 또는 0.1분^-1이 사용된다.

가용화 및/또는 리폴딩은 다양한 온도에서 수행될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 가용화 및/또는 리폴딩을 위한 인큐베이션 온도는 실온이다. 인큐베이션 시간은 회수되고 리폴딩되는 재조합 단백질에 따라 달라질 수 있다. 하나의 실시태양에서, 재조합 단백질은 적어도 1시간, 또는 1 내지 2시간 동안 제1 완충 용액 중에서 인큐베이션시킨다. 하나의 실시태양에서, 가용화된 단백질은 약 3 내지 24시간 동안 제2 완충 용액 중에서 인큐베이션시킨다. 하나의 실시태양에서, 단리된 재조합 단백질은 3 내지 24시간 동안 콤보 완충 용액 중에서 인큐베이션시킨다.

추가로 본 발명은 단독으로 또는 본원에 기술된 바와 같이 재조합 단백질을 회수하는 것과 함께 재조합 단백질을 리폴딩하는 공정 및 방법을 제공한다. 특정 실시태양에서, 정제 방법은 재조합 단백질을 함유하는 용액을 정화시키고, 정화된 용액 중의 상기 리폴딩된 재조합 단백질을 혼합 모드 지지체, 양이온 크로마토그래피 지지체, 제1 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체, 및 임의로, 제2 소수성 크로마토그래피 지지체 또는 이온 교환 지지체와 접촉시키고; 각각의 지지체로부터 리폴딩된 재조합 단백질을 선택적으로 회수하거나 용리시키는 것을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 용액을 정화시키는 것은 세정제(detergent)를 최종 농도 1%로 가하고, pH를 약 8.5-9.5로 조정하고, 1 내지 10시간 동안 25-30℃에서 용액을 인큐베이션시키고, 상기 용액을 원심분리하고, 원심분리 단계로부터 회수한 액체를 여과시키는 것을 포함한다. 하나의 실시태양에서, pH는 약 8.7이다. 또다른 실시태양에서, pH는 약 9.0이다. 회수 단계를 위한 단계들은 임의의 순서대로, 예를 들면, 순차적으로 또는 크로마토그래피 지지체의 순서를 변경시킴으로써 수행될 수 있다는 것에 주시한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 본 발명은 제조업 또는 산업 규모의 세포 배양물로부터 리폴딩된 재조합 단백질을 회수하고 정제하는 것을 제공한다.

도 1은 본원에 기술된 바와 같이, rpHPLC 크로마토그래피에 의해 평가된 리폴딩 과정에 대한 시간적 추이 연구의 일례를 도시한 것이다.

도 2는 캅토MMC(CaptoMMC)™ 칼럼 상에 로딩된 세균 균주 W3110에 의해 생산된 VEGF로부터의 크로마토그래프를 도시한다. 칼럼을 25 mM HEPES (pH 9)로 평형화시킨다. 1 M 아르기닌/25 mM HEPES (pH 6-9)를 사용하여 MMC 칼럼으로부터 VEGF를 등용매 용리시킨다.

도 3은 SPHP 칼럼 상에 로딩된 세균 균주 W3110에 의해 생산된 VEGF로부터의 크로마토그래프를 도시한다. 예를 들면, SPHP 칼럼을 50 mM HEPES (pH 7.5)에서 평형화시킨다. 1 칼럼 부피에 대해 50 mM HEPES (pH 7.5) 중 0.0-1.2 M 아세트산나트륨 선형 구배를 사용하여 칼럼을 용리시킨다. 용리액을 280 nm에서 모니터한다. 280 nm (~42 mS/cm에서 OD 최대)에서 최고의 흡광도를 갖는 분획으로부터 단백질을 회수하고, 이 회수된 단백질이 전형적으로 > 90%의 VEGF를 함유하며, 이를 추가 공정을 위해 풀링한다.

도 4는 하이프로필(HiPropyl) 칼럼 상에 로딩된 세균 균주 W3110에 의해 생산된 VEGF로부터의 크로마토그래프를 도시한다.

도 5는 페닐 세파로스 칼럼 상에 로딩된 세균 균주 W3110에 의해 생산된 VEGF로부터의 크로마토그래프를 도시한다.

도 6은 우레아 및 아르기닌이 리폴딩 상태에 미치는 효과를 도시한다.

도 7은 rpHPLC 시간적 추이에 의해 평가된 바, N₂를 리폴딩 시작 후 6시간째 첨가하였을 때, 48시간째까지 리폴드 풀을 안정화시키는데 N₂가 미치는 효과를 도시한다.

도 8은 다양한 공기 분사 속도가 리폴딩 상태에 미치는 효과를 도시한다.

도 9는 리폴딩된 VEGF를 분석하기 위해 양이온 교환 HPLC가 사용된 칼럼 분석법을 도시한다.

도 10은 표시된 바와 같은 이황화 결합을 갖는 VEGF₁₆₅의 아미노산 서열을 도시한다.

상세한 설명

정의

본원에서 사용되는 바, "폴리펩티드"는 일반적으로 약 10개 초과의 아미노산을 갖는, 임의 세포로부터 유래된 펩티드 및 단백질을 지칭한다. "이종성" 폴리펩티드는 사용된 숙주 세포에 대하여 외래의 것인 폴리펩티드, 예로서, E. 콜라이에 의해 생산된 인간 단백질이다. 이종성 폴리펩티드는 원핵성 또는 진핵성의 것일 수 있지만, 진핵성이 바람직하고, 포유동물의 것이 더욱 바람직하며, 인간의 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 이는 재조합적으로 생산된 것이다 (예를 들면, 재조합 폴리펩티드 또는 재조합 단백질).

포유동물 폴리펩티드의 예로는 예를 들면, 성장 인자; 헤파린-결합 성장 인자; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 예를 들면, VEGF-A (이소폼), VEGF-B, VEGF-C 및 VEGF-D; VEGF에 대한 수용체 및 항체, 예로서, rhuFab V2 및 베바시주맙, 라니비주맙; VEGF에 대한 항체; 레닌; 인간 성장 호르몬 (hGH)을 비롯한 성장 호르몬; 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상샘 호르몬; 갑상샘 자극 호르몬; 지질단백질; 1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 트롬보포이에틴; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 성장 호르몬 수용체; 성장 호르몬 방출 단백질 (GHRP); LIV-1 (EP 1263780); TRAIL; 응고 인자 예로서, 인자 ⅧC, 인자 Ⅸ, 조직 인자, 및 폰 빌레브란드 인자; 인자 Ⅷ; 인자 Ⅷ B 도메인; 항-조직 인자; 항-응고 인자, 예로서, 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성 인자, 예로서, 유로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직-형 플라스미노겐 활성 인자 (t-PA) 및 그의 변이체; 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; ErbB2 도메인(들)에 대한 항체, 엔케팔리나제; 혈청 알부민, 예로서, 인간 혈청 알부민; 뮬러리안-억제 물질; 릴랙신 A-쇄; 릴랙신 B-쇄; 프로릴랙신; 마우스 생식샘자극호르몬-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예로서, 베타-락타마제; DNase; 인히빈; 액티빈; 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류마토이드 인자; 향신경 인자, 예로서, 뇌-유래 향신경 인자 (BDNF), 뉴트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예로서, NGF; 카디오트로핀 (심장 비후 인자), 예로서, 카디오트로핀-1 (CT-1); 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF) (A, B, C 또는 D); 섬유아세포 성장 인자, 예로서, aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예로서, TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4, 또는 TGF-5를 비롯한, TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II) 및 그의 수용체, 예로서, IGFBP-1-IGFBP-6; 데스(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예로서, CD-3, CD-4, CD-8, 및 CD-19; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역 독소; 뼈 형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예로서, 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 혈청 알부민, 예로서, 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 소 혈청 알부민 (BSA); 콜로니 자극 인자 (CSFs), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터루킨 (ILs), 예를 들면, IL-I 내지 IL-10; 항-HER-2 항체; Apo2 리간드; 수퍼옥시드 디스뮤타제; 항-CD20; 헤레굴린, 항-IgE, 항-CD 11a, 항-CD 18; 종양 괴사 인자 (TNF) 및 그에 대한 항체, TNF 수용체 및 관련 항체, TNF-수용체-IgG, TNF 수용체 관련 인자 (TRAFs) 및 그의 저해제, T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 항-TGF, 예로서, 항-TGF-베타; 항-액티빈; 항-인히빈; 항-Fas 항체; Apo-2 리간드 저해제; Apo-2 수용체; Apo-3; 아포프토시스 인자; Ced-4; DcR3; 사멸 수용체 및 효현제 항체 (DR4, DR5); 림프독소 (LT); 프로락틴; 프로락틴 수용체; SOB 단백질; WISP (wnt-유도성 분비 단백질); 항-NGF; DNase; 간염 항원; 단순 헤르페스 항원; 렙틴; Toll 단백질, TIE 리간드, CD40 및 항-CD40, 면역어드헤신, 섭틸리신, 간세포 성장 인자 (HGF), 트롬보포이에틴 (TPO); 전립선-특이 암 항원 (PSCA); 바이러스 항원, 예로서, 예를 들면, AIDS 외피의 일부분; 운반 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 항체; 및 상기 나열된 폴리펩티드 중 어느 것의 단편과 같은 분자를 포함한다. 본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 무손상 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 2개 이상의 무손상 항체에 의해 형성되는 다중특이성 항체 (예를 들면, 이중특이성 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 갖는다면 항체 단편까지 포함한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 재조합 폴리펩티드는 성장 인자이다. 하나의 실시태양에서, 재조합 폴리펩티드는 포유동물 폴리펩티드 VEGF이다. 또다른 실시태양에서, 재조합 폴리펩티드는 인간 VEGF (예를 들면, VEGF₁₆₅)이다. 하나의 실시태양에서, 재조합 폴리펩티드는 안지오스타틴은 아니다. 하나의 실시태양에서, 재조합 폴리펩티드는 IGF-1은 아니다.

본원에서 사용되는 바, "혈관 내피 성장 인자," 또는 "VEGF"는 원래 문헌 [Castor, C. W., et al., (1991) Methods in Enzvmol. 198:391-405]에 개시된 아미노산 서열을 갖는 소 뇌하수체 소포 세포로부터 유래된 포유동물의 성장 인자와, 그와 함께, 상응하는 천연 VEGF의 정성적인 생물학적 활성을 갖는 그의 기능성 유도체를 지칭하는데, 이는 문헌 [Houck et al., (1991) Mol Endocrin. 5:1806-1814]에 보고된 바와 같은 인간 VEGF 아미노산 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 문헌 ([Leung et al. (1989) Science. 246:1306], 및 [Robinson & Stringer, (2001) Journal of Cell Science. 144(5):853-865], 미국 특허 번호 제5,332,671호 도 참조한다. 이는 또한 VEGF-A로도 지칭된다. 상기 계열의 다른 구성원은 예를 들면, VEGF-B, VEGF-C, 또는 VEGF-D와 같이 VEGF 끝의 문자 표기법으로 표시된다. VEGF 또는 VEGF-A의 주된 형태는 7개의 분자내 이황화 결합과, 2개의 분자간 이황화 결합을 형성하는 16개의 시스테인 잔기를 갖는 165 아미노산 동종이량체이다. 선택적인 스플라이싱이 121, 145, 165, 189 및 206개의 아미노산으로 구성된 다중 인간 VEGF 폴리펩티드의 형성과 연루되어 있지만, VEGF₁₂₁ 변이체에는 다른 변이체들의 헤파린 결합 도메인이 존재하지 않는다. VEGF의 모든 이소폼은 공통 아미노-말단 도메인을 공유하지만, 분자의 카복실-말단부의 길이는 상이하다. VEGF의 바람직한 활성 형태인 VEGF₁₆₅는 각 단량체 중 아미노산 잔기들 사이, Cys26-Cys68; Cys57-Cys1O4; Cys61-Cys1O2; Cys117-Cys135; Cys120-Cys137; Cys139-Cys158; Cys146-Cys160에서 이황화 결합을 갖는다. 도 10을 참조한다. 또한, 예를 들어, 문헌 [Keck et al., (1997) Archives of Biochemistry and Biophysics 344(1): 103-113]도 참조한다. VEGF₁₆₅ 분자는 2개의 도메인: 아미노-말단 수용체-결합 도메인 (아미노산 1-110 이황화 결합된 동종이량체) 및 카복실-말단 헤파린-결합 도메인 (잔기 111-165)으로 구성된다. 예를 들어, 문헌 [Keyt et al., (1996) J, Biol. Chem. 271(13):7788-7795]을 참조한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 단리되고 정제된 VEGF₁₆₅는 75번 잔기 (Asn)에서 글리코실화되어 있지 않다. 예를 들어, 문헌 [Yang et al., (1998) Journal of Pharm. & Experimental Therapeutics, 284: 103-110]을 참조한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 단리되고 정제된 VEGF₁₆₅는 실질적으로 잔기 Asn10에서 탈아미드화되어 있지 않다(undeamidated). 본 발명의 특정 실시태양에서, 단리되고 정제된 VEGF₁₆₅는 탈아미드화된 (잔기 Asn10에서) 단백질 및 탈아미드화되어 있지 않은 단백질의 혼합물이되, 전형적으로 상기 단백질 대부분은 탈아미드화되어 있지 않은 단백질이다. VEGF₁₆₅는 동종이량체이기 때문에, 하나의 폴리펩티드 쇄 또는 둘 모두에서 탈아미드화가 발생할 수 있다.

본원에서 사용되는 "헤파린-결합 단백질"이라는 용어는 헤파린 (상기 정의된 바와 같음)에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 정의는 성숙한 형태, 프리 형태, 프리-프로 형태, 및 프로 형태의 천연 및 재조합적으로 생산된 헤파린-결합 단백질을 포함한다. 전형적인 헤파린-결합 단백질의 예는 "헤파린 결합 성장 인자"이며, 내피 성장 인자 (EGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 산성 섬유모세포 성장 인자 (aFGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 간세포 성장 인자 (HGF) (산란 인자로도 공지되어 있음) 및 신경 성장 인자 (NGF), IL-8 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"헤파린" (헤파린산으로도 지칭됨)은 글라이코스아미노글리칸으로도 명명되는, 고도로 황산화된, 직쇄 음이온성 뮤코다당류의 이종성 군이다. 다른 것들 또한 존재할 수 있지만, 헤파린내 주요 당은 α-L-이듀론산 2-설페이트, 2-데옥시-2- 설프아미노-α-글루코스 6-설페이트, β-D-글루쿠론산, 2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-글루코스, 및 L-이듀론산이다. 이들 당과 임의로 기타 당은 글리코시드 결합 에 의해 결합하여 크기가 다양한 중합체를 형성한다. 그의 공유 결합된 설페이트기 및 카복실산기의 존재로 인하여 헤파린은 강한 산성을 띤다. 헤파린의 분자량은 공급원과 측정 방법에 따라 약 3,000 내지 약 20,000 달톤으로 다양하다. 천연 헤파린은 수개의 포유동물 종의 다양한 조직, 특히, 간, 및 폐, 및 비만 세포의 구성 성분이다. 헤파린 및 헤파린 염 (헤파린 나트륨)은 상업적으로 이용가능하며, 이는 주로 다양한 임상적 상황하에서 항응고제로서 사용된다.

본원에서 사용되는 바, "적절하게 폴딩된" 또는 "생물학적으로 활성인" VEGF 또는 기타 재조합 단백질 등은 생물학적으로 활성인 입체 형태를 갖는 분자를 지칭한다. 당업자는 미스폴딩되고, 이황화 스크램블된 중간체가 생물학적 활성을 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 그러한 경우, 적절하게 폴딩되거나 생물학적으로 활성인 VEGF 또는 재조합 단백질은 VEGF (상기 기술된 바와 같음) 또는 기타 재조합 단백질의 천연 폴딩 패턴과 일치한다. 예를 들면, 적절하게 폴딩된 VEGF는 상기 언급한 이황화 쌍을 갖지만, 이량체 분자내 2개의 분자간 이황화 결합 이외의 다른 중간체가 세균 세포 배양물에 의해 생산될 수 있다. 적절하게 폴딩된 VEGF의 경우, 2개의 분자간 이황화 결합은 각 단량체의 동일한 잔기, Cys51 및 Cys60 사이에서 발생한다. 예를 들어, WO98/16551 특허를 참조한다. VEGF의 생물학적 활성으로는 예를 들어, 혈관 투과 촉진, 혈관 내피 세포 성장 촉진, VEGF 수용체에 대한 결합, VEGF 수용체를 통한 결합 및 신호 전달 (예를 들어, 문헌 [Keyt et al., (1996) Journal of Biological Chemistry, 271(10):5638-5646]을 참조한다), 혈관신생 유도 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

용어 "정제된" 또는 "순수한 재조합 단백질" 등은 보통 재조합적 생산, 및 특히, 원핵생물 또는 세균 세포 배양물에서 발견되는 것과 같은 것을 수반하는 물질이 존재하지 않는 물질을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 오염성 DNA, 숙주 세포 단백질 또는 그의 계내 환경과 관련된 기타 분자가 존재하지 않는 재조합 단백질을 지칭한다. 본 용어는 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 98% 이상의 순도를 지칭한다.

"봉입체" 또는 "굴절반사 소체"라는 용어는 관심의 대상이 되는 응집된 폴리펩티드의 조밀한 세포내 매스를 지칭하며, 이는 모든 세포 성분을 비롯한 전체 세포 단백질 상당부로 구성되어 있다. 모든 경우가 그러한 것은 아니지만, 몇몇의 경우, 이러한 폴리펩티드 응집체는 1,000배 낮은 배율에서 위상차 현미경하에 세포의 봉입체(enclosure)내에서 육안으로 볼 수 있는 밝은 스폿으로서 인지될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "미스폴딩된" 단백질은 굴절반사 소체내 함유된, 침전되거나 응집된 폴리펩티드를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "불용성" 또는 "미스폴딩된" VEGF 또는 기타 재조합 단백질은 원핵생물 숙주 세포, 또는 다르게는 관련된 원핵생물 숙주 세포의 원형질막 주위공간 또는 세포간극내 함유된, 침전되거나 응집된 VEGF 또는 재조합 단백질을 지칭하고, 미스매치되거나, 이황화 결합이 형성되지 않은, 생물학적으로 불활성인 입체 형태를 취한다. 불용성 재조합 단백질은 일반적으로는 굴절반사 소체내 함유되어 있지만, 반드시 그러한 것은 아니며, 즉, 위상차 현미경하에 육안으로 볼 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "카오트로픽제"는 수용액 중 적합한 농도에서, 폴리펩티드가 수성 매질중 가용성이 되도록 그의 표면을 변경시켜 폴리펩티드의 공간 구성 또는 입체 형태를 변경시킬 수 있는 화합물을 지칭한다. 상기 변경은 예를 들면, 수화 상태, 용매 환경, 또는 용매-표면 상호작용을 변화시킴으로써 일어날 수 있다. 카오트로픽제의 농도는 그의 강도와 효과에 직접적으로 영향을 미칠 것이다. 강한 변성 카오트로픽 용액은 고농도로 카오트로픽제를 함유하는데, 이는 용액 내에서 단백질 2차 구조를 효과적으로 제거시키면서 상기 용액내 존재하는 폴리펩티드를 효과적으로 언폴딩시킬 것이다. 언폴딩은 상대적으로 광범위하지만 가역성일 것이다. 중간 정도의 변성 카오트로픽 용액은, 폴리펩티드가 취하는 어떠한 왜곡형 입체 형태부터라도 용액 내에서 가용성인 중간체를 거쳐, 내재성 또는 동종성의 생리학적 조건하에 폴리펩티드가 활성 형태로 작동할 때에 그 자체가 나타내는 공간 입체 형태로 폴리펩티드를 부분적으로 폴딩시킬 수 있는 충분한 농도로 카오트로픽제를 용액 내에 함유한다. 카오트로픽제의 예로는 구아니딘 하이드로클로라이드, 우레아, 및 수산화물, 예로서, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 포함한다. 카오트로픽제는 이들 시약의 조합물, 예로서, 수산화물과 우레아 또는 구아니딘 하이드로클로라이드의 혼합물을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "환원제"는 수용액내 적합한 농도로 유리 설프하이드릴기를 유지시켜 분자내- 또는 분자간 이황화 결합이 화학적으로 파괴되도록 하는 화합물을 지칭한다. 적합한 환원제의 대표적인 일례로는 디티오트레이톨 (DTT), 디티오에리트리톨 (DTE), 베타-머캅토에탄올 (BME), 시스테인, 시스테아민, 티오글 리콜레이트, 글루타티온, 및 수소화붕소나트륨을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "완충 용액"은 그의 산-염기 접합체 성분의 작용에 의한 pH 변화에 내성을 띠는 용액을 지칭한다.

본원의 목적을 위한 "세균"은 진정 세균 및 고세균을 포함한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 그램-양성 및 그램-음성 세균을 비롯한 진정 세균이 본원에 기술된 방법 및 공정에 사용된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 그램-음성 세균, 예를 들어, 엔테로박테리아세애(Enterobacteiaceae)가 사용된다. 엔테로박테리아세애에 속하는 세균의 예로는 에스케리키아(Escherichia), 엔테로박터(Enterobacter), 어위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 시겔라(Shigela)를 포함한다. 다른 유형의 적합한 세균으로는 아조토박터(Azotobacter), 슈도모나스(Pseudomonas), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla), 및 파라코쿠스(Paracoccus)를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, E. 콜라이가 사용된다. 적합한 E. 콜라이 숙주로는 E. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325), E. 콜라이 294 (ATCC 31,446), E. 콜라이 B, 및 E. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537)을 포함한다. 이들 예는 제한적이라기 보다는 예시적인 것이며, W3110은 일례이다. 상기-언급한 세균 중 임의의 것의 돌연변이체 세포 또한 사용될 수 있다. 물론, 세균 세포에서 레플리콘의 복제가능성을 고려하여 적합한 세균을 선택하는 것이 필요하다. 예를 들면, E. 콜라이, 세라티아, 또는 살모넬라 종은, 잘-알려져 있는 플라스미드, 예로서, pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410을 사용하여 레플리콘을 공급하고자 할 때 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 적합한 세균 숙주 세포의 일례와 관련하여 추가로 하기를 참조한다.

본원에서 사용되는 바, "세포," "세포주," "균주," 및 "세포 배양물"이라는 표현은 상호교환적으로 사용되고, 그렇게 명시하는 것은 모두 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"라는 단어는 1차 대상 세포와, 전달 횟수와는 상관없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 고의적이거나 부주의적인 돌연변이화에 기인하여 모든 자손의 DNA 함량은 정확하게 동일할 수 없다는 것도 이해하여야 한다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다. 명확하게 명시하고자 하는 경우, 이는 문맥으로부터 명백해질 것이다.

혼합 모드 칼럼은 양이온 교환 성질 뿐만 아니라, 소수성 상호작용, 이 둘 모두를 갖는 수지를 포함하는 칼럼을 지칭한다.

재조합 단백질

재조합 단백질, 예를 들면, 성장 인자, 예로서, 산성 섬유모세포 성장 인자, 염기성 섬유모세포 성장 인자 및 혈관 내피 성장 인자는 세균을 비롯한 다수의 공급원으로부터 회수되고 정제되었다 (문헌 ([Salter D.H. et al., (1996) Labor. Invest. 74(2):546-556] (VEGF); [Siemeister et al., (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 222(2):249-55] (VEGF); [Cao et al., (1996) J. Biol. Chem. 261(6):3154-62] (VEGF); [Yang et al., (1994) Gaoiishu Tongxun. 4:28-31] (VEGF); [Anspach et al., (1995) J. Chromatogr. A 711(1): 129-139] (aFGF 및 bFGF; [Gaulandris (1994) J Cell. Physiol. 161(1): 149-59] (bFGF); [Estape and Rinas (1996) Biotech. Tech. 10(7):481-484] (bFGF); [McDonald et al., (1995) FASEB J. 9(3):A410] (bFGF)). 예를 들면, VEGF의 주된 활성 형태는 165-아미노산 폴리펩티드 2개의 동종이량체이다 (VEGF-165). 이러한 구조에서, 각 서브유니트는 7쌍의 쇄내 이황화 결합과, 2개의 서브유니트의 공유결합에 영향을 주는 추가의 2쌍을 함유한다 (문헌 [Ferrara et al., (1991) J. Cell. Biochem. 47:211-218]). 천연 입체 형태는 헤파린에 용이하게 결합하는 것으로 입증된 강한 염기성 도메인을 포함한다 (문헌 [Ferrara et al (1991), 상기 동일 문헌]). 효과적인 수용체 결합과 생물학적 활성을 위해서는 VEGF의 공유 이량체화가 필요한 반면 (문헌 [Potgens et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:32879-32885]; [Claffey et al., (1995) Biochim. et Biophys. Acta 1246:1-9]), 세균 생성물은 잠재적으로, 미스폴딩되고, 이황화 스크램블된 중간체를 수개 함유한다. 숙주 세포에서 "굴절반사 소체"의 형태로 뿐만 아니라, 가용성 단백질로서 출현하는 단백질을 단리시키고, 정제시키고, 재활성화시키는데 유용한 방법들을 제공한다.

재조합 단백질 단리

불용성의, 미스폴딩된 재조합 단백질은 당업계의 많은 표준 기법들 중 임의의 것에 의해 단백질을 발현시키는 원핵생물 숙주 세포로부터 단리된다. 예를 들면, 대부분의 숙주 단백질을 가용화시키기에는 적합한 이온 강도를 갖지만, 대상 단백질은 실질적으로 불용성인 완충액에 세포를 노출시키거나, 세포를 파괴하여 원형질막 주위공간 또는 세포간극으로부터 봉입체 또는 단백질을 유리시키고, 그를 예를 들면, 원심분리에 의해 회수할 수 있도록 함으로써 불용성 재조합 단백질을 적합한 단리용 완충액에서 단리시킨다. 이러한 기법은 잘 알려져 있고, 예를 들면, 미국 특허 번호 제4,511,503호에 기재되어 있다. 클라이트(Kleid) 등은 균질화시킨 후 원심분리하여 굴절반사 소체를 정제하는 것에 관하여 개시하였다 (문헌 [Kleid et al., (1984) in Developments in Industrial Microbiology, (Society for Industrial Microbiology, Arlington, VA) 25:217-235]). 또한, 예를 들어, 문헌 [Fischer et al., (1993) Biotechnology and Bioengineering 41 :3-13]을 참조한다.

미국 특허 번호 제5,410,026호에는 봉입체로부터 단백질을 회수하는 전형적인 방법이 기재되어 있고, 하기와 같이 요약된다. 원핵생물 세포를 적합한 완충액에 현탁시킨다. 전형적으로, 완충액은 pH 5 내지 9, 또는 약 6 내지 8 사이에서 완충처리하기에 적합한 완충제 및 염으로 구성된다. NaCl을 비롯한 임의의 적합한 염은 완충 용액에서 충분한 이온 강도를 유지시키는데 유용하다. 전형적으로, 약 0.01 내지 2 M, 또는 0.1 내지 0.2 M의 이온 강도가 사용된다. 이러한 완충액에 세포를 현탁시키는 동안, 통상 사용되는 기법, 예를 들면, 기계적인 방법, 예를 들어, 균질기 (맨톤-가울린(Manton-Gaulin) 프레스, 미세 유동화기, 또는 니로-사오비(Niro-Soavi)), 프렌치 프레스, 비드 밀, 또는 초음파 발진기를 사용함으로써, 또는 화학적 또는 효소적 방법에 의해 세포를 파괴시키거나, 용해시킨다.

세포를 파괴시키는 화학적 또는 효소적 방법의 일례로는 세균 벽을 용해시키기 위하여 리소자임을 사용하는 것을 포함하는 스페로플라스트화 (문헌 [H. Neu et al., (1964) Biochem. Biophys. Res. Comm., 17:215]), 및 고장성 용액, 및 저장성 냉수 세척제로 생육성 세포를 처리하여 폴리펩티드를 유리시키는 것을 포함하는 삼투압 충격 (문헌 [H. Neu et al., 1965 J. Biol. Chem. 240(9):3685-3692])을 포함한다. 초음파는 일반적으로 분석 규모 용량의 발효 브로쓰내 함유된 세균을 파괴시키는데 사용된다. 전형적으로 고압 균질화는 대규모로 사용된다.

세포를 파괴시킨 후, 전형적으로 현탁액을 저속으로, 일반적으로, 예를 들어, 500 내지 15,000 x g으로 원심분리시킨다. 본 발명의 하나의 실시태양에서는 표준 원심분리법에서 실질적으로 모든 불용성 단백질을 펠릿화시키기에 충분한 시간 동안 약 12,000 x g를 사용한다. 상기 시간은 간단하게 결정될 수 있고, 이는 원심분리하려는 용량 뿐만 아니라, 원심분리 디자인에 따라 달라질 것이다. 전형적으로 약 10분 내지 0.5시간이 불용성 단백질을 펠릿화시키기에 충분하다. 하나의 실시태양에서, 현탁액은 12,000 x g에서 10분 동안 원심분리된다.

생성된 펠릿은 실질적으로 모든 불용성 단백질 분획을 함유한다. 세포 파괴 공정이 완전하지 못하면, 펠릿은 또한 무손상 세포 또는 파손된 세포 단편을 함유할 수 있다. 소량의, 상기와 동일한 완충 용액에 펠릿을 재현탁시키고, 위상차 현미경을 사용하여 검사함으로써 세포 파괴의 완결성을 분석할 수 있다. 파손된 세포 단편 또는 전체 세포가 존재하는 것은 단편 또는 세포 및 관련된 비-굴절반사 폴리펩티드를 제거하기 위해 추가의 초음파 또는 기타 파괴 수단이 필요하다는 것을 지시한다. 그러한 추가의 파괴 이후, 필요하다면, 현택액을 다시 원심분리하고, 펠릿을 회수하고, 재현탁시키고, 재검사한다. 본 공정은 육안 검사로 펠릿화 된 물질내 파손된 세포 단편이 존재하지 않는 것으로 나타날 때까지, 또는 추가 처리를 통해 생성된 펠릿의 크기가 감소되지 못할 때까지 반복된다.

상기 공정은 불용성 단백질이 세포내에 존재하든, 원형질막 주위공간에 존재하든 간에 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 재조합 단백질을 단리시키기 위해 본원에서 주어진 조건은 원형질막 주위공간 또는 세포간극에 침전된 봉입체에 관한 것이고, 특히, VEGF에 관한 것이다. 그러나, 본 공정 및 방법은 일반적으로 하기 텍스트 전역에 걸쳐 언급되는 바와 같이, 최소한의 수정을 통해 재조합 단백질에 적용될 수 있을 것으로 사료된다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 본 공정 및 방법은 재조합 단백질의 제조 또는 산업적 규모의 생산, 리폴딩, 및 정제에 적용될 수 있다.

하나의 실시태양에서, 실질적으로 재조합 단백질을 가용화시키기에 충분한 제1 완충 용액 중에서 펠릿중의 단리된 재조합 단백질을 인큐베이션시킨다. 원하는 양 또는 실질적으로 모든 재조합 단백질을 가용화시킬 수 있는 농도, 인큐베이션 시간, 및 인큐베이션 온도 조건하에서 상기 인큐베이션을 수행한다.

제1 완충 용액은 완충액의 pH 범위를 적어도 약 9 이상으로 유지시키는데 적합한 완충제를 포함하며, 전형적인 pH 범위는 9-11이다. 하나의 실시태양에서, VEGF에 대한 pH는 11이다. 상기에서 후자의 범위내의 pH를 제공하는데 적합한 완충액의 예로는 트리스 (트리스[하이드록시메틸]아미노메탄), HEPPS (N-[2-하이드로시에틸]피페라진-N'-[3-프로판-설폰산]), CAPSO (3-[사이클로헥실아미노]-2-하이드록시-1-프로판설폰산), AMP (2-아미노-2-메틸-1-프로판올), CAPS (3-[사이클로헥실 아미노]-1-프로판설폰산), CHES (2-[N-사이클로헥실아미노]에탄설폰산), 아르기닌, 리신, 및 붕산나트륨을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본원의 완충액은 약 pH 11의 CHES 및 아르기닌을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본원의 완충액은 약 pH 11의 트리스 및 아르기닌을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본원의 완충액은 pH 11의 CHES를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본원의 완충액은 약 pH 11의 트리스를 포함한다. 특정 실시태양에서, 제1 완충 용액은 카오트로픽제를 포함한다.

본 발명을 실시하는데 적합한 카오트로픽제로는 예를 들면, 우레아 및 구아니딘 또는 티오시안산 염, 예를 들면, 우레아, 구아니딘 하이드로클로라이드, 티오시안산 나트륨 등을 포함한다. 완충액내 존재하여야 하는 카오트로픽제의 양은 용액내 재조합 단백질을 언폴딩하는데 충분한 양이다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 카오트로프는 약 0.5-5몰 사이로 존재한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 카오트로픽제는 약 1 M의 우레아이다.

완충 용액중 단백질의 농도는 광학 밀도에 의해 측정되는 바, 단백질이 실질적으로 가용화되는 것이어야 한다. 정확한 사용량은 예를 들면, 완충액 중 다른 성분들의 농도 및 종류, 특히 단백질 농도, 카오트로픽제, 및 완충액의 pH에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 재조합 단백질의 농도는 1 ml당 0.5-5.5 mg 범위, 또는 1.5-5.0 mg/ml이다. 가용화는 적어도 약 1시간 내지 24시간 동안 전형적으로 약 0-45℃, 또는 약 2-40℃, 또는 약 20-40℃, 또는 약 23-37℃, 또는 약 25-37℃, 또는 약 25℃에서 수행된다. 전형적으로, 온도는 외관상으로 염, 환원제 및 카오트로픽제 수준에 의해 영향을 받지는 않는다. 특정 실시태 양에서, 가용화는 대기압에서 수행된다.

완충 용액에서의 가용화도 측정값은 측정될 수 있고, 이는 예를 들면, 혼탁도 측정에 의해, 환원된 SDS-PAGE 겔 상에서의 원심분리 이후의 상등액과 펠릿 사이의 분획화 분석에 의해, 단백질 분석법에 의해 (예를 들어, 바이오-래드(Bio-Rad) 단백질 분석 키트), 또는 HPLC에 의해 적합하게 수행된다.

임의로, 파괴된 세포를 원심분리시키지 않고, 본원에 기술된 제2 완충 용액 (리폴딩 완충액)에서 예를 들면, 1:4, 1:6, 1:8로 희석시킨다. 재조합 단백질을 가용화시킬 수 있고 리폴딩시킬 수 있는 농도, 인큐베이션 시간, 및 인큐베이션 온도 조건하에서 상기 인큐베이션을 수행한다. 하나의 실시태양에서, 약 30% 이상의 재조합 단백질이 가용화되고 리폴딩된다.

재조합 단백질 리폴딩

폴리펩티드를 가용화시킨 후, 또는 별법으로, 세포를 파괴시킨 후, 일정한 용량 물질 전달 계수 K_la = 0.004 내지 0.1분^-1 (예를 들면, 선박용 추진기를 포함하는 2.5 L의 베쓸의 경우, 공기 분사 속도는 0.3-10 cc/분/L, 0.3-3 cc/분/L, 또는 1 cc/분/L, 또는 25 cc/분/L이며, 혼합 속도는 200-400 rpm이다)을 사용하여 공기 또는 산소를 첨가하면서, 재조합 단백질의 리폴딩을 허용하는 농도로 적어도 하나의 환원제, 및 카오트로픽제를 함유하는 제2 완충 용액에 놓거나, 희석시킨다. 리폴드 반응을 위해 산소 또는 공기는 공기 공급원 또는 산소가 강화된 압축 가스 공급원에 의해 제공받을 수 있다. 기체상으로부터 액상으로의 물질 전달 효율은 교 반, 분사 및 가압에 의해 조정되고, 용량 물질 전달 계수, K_La에 의해 포착한다. 예를 들면, 문헌 ([Blanch, & Clark, Biochemical engineering, Marcel Dekker, New York, 1997]; 및 [Aunins, & Henzler, Aeration in Cell bioreactors, in Biotechnology:A multi-vokume comprehensive treatise, G. Stephanopoulos, Ed., Weinheim, New York, 1993, pp. 219-281])을 참조한다. 하나의 실시태양에서, 0.004분^-1의k_La이 사용되는데, 이는 선박용 추진기를 포함하는 2.5 L의 베쓸에서 혼합 속도가 200-400 rpm이고, 분사 속도가 0.3 cc/분/L인 것을 나타낸다. 다른 실시태양에서, 적절하게 폴딩된 단백질을 생산하는데 k_La = 0.01분^-1 또는 0.1분^-1이 사용된다.

본 발명의 특정 실시태양에서, 제2 완충 용액은 2개 이상의 환원제를 함유한다. 폴리펩티드는 리폴딩 완충액의 사용으로 예를 들면, 적어도 5배, 또는 적어도 약 10배, 또는 약 20배, 또는 약 40배로 희석될 수 있다. 가용성의 언폴딩된 단백질의 제2 인큐베이션 조건은 일반적으로 원하는 양 또는 상당량의 단백질 또는 단백질 전부를 리폴딩시킬 수 있는 조건이 될 것이다. 정확한 조건은 예를 들면, 완충액의 pH, 및 존재하는 카오트로픽제 및 환원제의 종류 및 농도에 따라 달라질 것이다. 인큐베이션 온도는 일반적으로 약 0-40℃이며, 일반적으로는 적어도 약 1시간 내지 약 48시간 동안 인큐베이션시켜 리폴딩을 수행한다. 특정 실시태양에서, 반응은 예를 들면, 적어도 약 3시간 동안, 적어도 약 10시간 동안, 또는 약 3 내지 30시간 사이 동안, 또는 약 3 내지 24시간 사이 동안 약 0-45℃, 또는 약 2-40℃, 또는 약 20-40℃, 또는 약 23-37℃, 또는 약 25-37℃, 또는 약 25℃에서 수행된다. 특정 실시태양에서, 반응은 대기압에서 수행된다.

제2 완충 용액은 완충액의 pH 범위를 약 9 이상 또는 9 초과로 유지시키는데 적합하며, 전형적인 pH 범위가 9-11인 완충제, 카오트로픽제, 및 적어도 하나의 환원제를 포함한다. 특정 실시태양에서, 제2 완충 용액은 2개 이상의 환원제를 포함한다. 하나의 실시태양에서, VEGF에 대한 pH는 pH 10이다. 상기에서 후자의 범위내의 pH를 제공하는데 적합한 완충액의 예로는 트리스 (트리스[하이드록시메틸]아미노메탄), HEPPS (N-[2-하이드로시에틸]피페라진-N'-[3-프로판-설폰산]), CAPSO (3-[사이클로헥실아미노]-2-하이드록시-1-프로판설폰산), AMP (2-아미노-2-메틸-1-프로판올), CAPS (3-[사이클로헥실아미노]-1-프로판설폰산), CHES (2-[N-사이클로헥실아미노]에탄설폰산), 아르기닌, 리신, 및 붕산나트륨을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본원의 제2 완충 용액은 2개 이상의 환원제 및 적어도 하나의 카오트로픽제와 함께 약 pH 10의 CHES 및 아르기닌 (각각의 최종 농도는 10 mM 및 100 mM)을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본원의 제2 완충 용액은 2개 이상의 환원제 및 적어도 하나의 카오트로픽제와 함께 약 pH 10의 트리스 및 아르기닌 (각각의 최종 농도는 10 mM 및 100 mM)을 포함한다.

아르기닌 (또는 또다른 양전하 아미노산), 예를 들면, L-아르기닌/HCl은 제1 완충 용액 및 제2 완충 용액 중에 존재할 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 아르기닌의 농도는 예를 들면, 최종 농도로 약 50-500 mM, 약 75-300 mM, 또는 약 100-300 mM, 또는 약 100 mM 또는 300 mM 등이다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 단백질은 pH 9 초과의, 최종 농도 0.5-3 M의 우레아, 최종 농도 50-500 mM의 아르기닌 및 최종 농도 5 mM의 EDTA를 포함하는 제1 완충 용액에 존재한다. 하나의 실시태양에서, 최종 농도 10 mM의 CHES가 사용된다. 또다른 실시태양에서, 최종 농도 10 mM의 트리스가 사용된다. 하나의 실시태양에서, 제1 완충 용액은 최종 농도 1 M의 우레아, 최종 농도 300 mM의 아르기닌, 최종 농도 10 mM의 CHES, 최종 농도 5 mM의 EDTA, pH 11을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 제1 완충 용액은 최종 농도 1 M의 우레아, 최종 농도 300 mM의 아르기닌, 최종 농도 10 mM의 트리스, 최종 농도 5 mM의 EDTA, pH 11을 포함한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 단백질은 최종 농도 0.5-3 M의 우레아, 최종 농도 50-500 mM의 아르기닌, 최종 농도 0.25-1 mM의 DTT, 최종 농도 5-20 mM의 시스테인, 및 최종 농도 2-10 mM의 EDTA를 포함하며, pH >9이되, pH ≤ 11인 제2 완충 용액 (리폴딩 완충 용액)에 존재한다. 하나의 실시태양에서, 최종 농도 10 mM의 CHES가 사용된다. 또다른 실시태양에서, 최종 농도 10 mM의 트리스가 사용된다. 하나의 실시태양에서, 단백질은 최종 농도 1 M의 우레아, 최종 농도 15 mM의 시스테인, 최종 농도 2 mM의 DTT, 최종 농도 100 mM의 아르기닌, 최종 농도 10 mM의 CHES, 최종 농도 5 mM의 EDTA를 포함하는, pH 9-10의 리폴딩 완충 용액에 존재한다. 또다른 실시태양에서, 단백질은 최종 농도 1 M의 우레아, 최종 농도 15 mM의 시스테인, 최종 농도 0.5-2 mM의 DTT, 최종 농도 100 mM의 아르기닌, 최종 농도 10 mM의 트리스, 최종 농도 5 mM의 EDTA를 포함하는, pH 9-10의 리폴딩 완충 용액에 존재한다.

언급한 바와 같이, 상기 용액은 또한 적어도 하나의 환원제를 함유한다. 적합한 환원제의 예로는 디티오트레이톨 (DTT), β-머캅토에탄올 (BME), 시스테인, DTE 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 완충액내 존재하는 환원제의 양은 주로 환원제 및 카오트로픽제의 종류, 사용되는 완충액의 종류 및 pH, 용액내 혼입되거나, 그에 도입된 산소의 양, 및 완충액내 단백질의 농도에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 환원제는 시스테인의 경우, 농도 범위가 약 0.5 내지 약 20 mM, DTT의 경우, 농도 범위가 0.25-3.0 mM (예를 들면, 0.5-2 mM DTT), 및 BME의 경우, 농도 범위가 약 0.2 mM 미만인 상기 기술된 것으로부터 적합하게 선택된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 2개 이상의 환원제, 예를 들면, 약 0.5-2 mM의 DTT 및 0.5 내지 약 20 mM의 시스테인이 존재한다. DTT 및 BME는 일반적으로 재조합 단백질에 대해 본원에서 제공된 방법과 관련하여 사용될 수 있는 반면, 상기 기술된 바와 같은 DTT 및 약 15 mM의 시스테인의 조합물은 VEGF 회수용으로 사용되는 것의 일례이다. 하나의 실시태양에서, 환원제는 최종 농도 15 mM의 시스테인과 함께 최종 농도 약 2 mM의 DTT이다. 또다른 실시태양에서, 환원제는 최종 농도 15 mM의 시스테인과 함께 최종 농도 약 0.5 mM의 DTT이다.

제2 완충 용액은 재조합 단백질이 리폴딩될 수 있는 농도로 적어도 하나의 카오트로픽제를 함유한다. 일반적으로 카오트로프는 최종 농도 약 0.5 내지 2몰 사이로 존재한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 본원의 카오트로픽제는 최종 농도 약 0.5-2 M, 0.5-2 M, 또는 약 1 M의 우레아이다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 카오트로픽제는 최종 농도 약 0.1-1 M의 구아니딘 하이드로클로라이드이 다.

리폴딩 완충액은 임의로 첨가제, 예로서, 각종 비-이온성 제제, 예로서, 트리톤(TRITON)™ X-100, 노니뎃(NONIDET)™ P-40, 트윈(TWEEN)™ 시리즈 및 BRIJ™ 시리즈를 함유한다. 비-이온성 세정제는 최종 농도 0.01% 내지 1.0% 사이로 존재한다. 일례로, 비-이온성 세정제의 농도는 최종 농도 약 0.025% 내지 0.05% 사이, 또는 약 0.05%이다.

리폴딩 정도는 예를 들면, rpHPLC 크로마토그래피 칼럼, 양이온 교환 HPLC (SP-5PW TSK 겔 칼럼, 토소 바이오사이언스 LLC(Tosoh Bioscience LLC)), 또는 기타의 적절한 헤파린 친화성 칼럼을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 적합하게 측정된다. 양이온 교환 HPLC 분석법 또는 헤파린 결합 HPLC 분석법에 있어서 올바르게 폴딩된 재조합 피크 크기의 증가는 직접적으로 완충액내 존재하는, 폴딩되고 생물학적으로 활성인 재조합 단백질의 양 증가와 상관관계에 있다. rpHPLC 분석법에 의해 측정할 때, 올바르게 폴딩된 재조합 단백질 대 회수한 미스폴딩된 재조합 단백질의 비가 최대가 되도록 인큐베이션이 수행된다.

하나의 실시태양에서, 적절하게 폴딩된 VEGF를 헤파린-결합 분석법을 사용하여 정성 및 정량 평가한다. 희석된 재조합 단백질을 함유하는 샘플을 예를 들면, 헤파린-5PW 칼럼 (7.5 x 75 mm, 일본 도쿄에 소재하는 토소 바이오사이언스 LLC), 또는 다른 적합한 헤파린 친화성 칼럼 상에 로딩한다. 예를 들면, 헤파린-5PW 칼럼은 0.15 M 염화나트륨을 함유하는 pH 7.4의 10 mM 인산나트륨에서 평형화된다. 1 ml/분 또는 2 ml/분의 유속으로 10분에 걸쳐 pH 7.4의 10 mM 인산나트륨 중 0.15-2 M 염화나트륨 선형 구배를 사용하여 용리시킨다. 용리액을 280 nm에서 모니터한다. 하나의 실시태양에서, 단백질은 생물학적으로 활성이며, 적절하게 리폴딩된 VEGF에 상응하는 단일 피크에서 회수된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 적절하게 리폴딩된 VEGF를 측정하는 분석법은 RPHPLC이다. 이황화 결합은 임의로 펩티드 지도에 의해 확인할 수 있다. 2 & 3D 구조/폴딩을 측정하는데 있어서 원편광 이색성 또한 사용될 수 있다.

하나의 실시태양에서, 가용화 및 리폴딩은 단일 단계로 실시된다. 파괴된 세포 펠릿을 수득한 후, 상기 기술된 바와 같은 제2 완충 용액 (이 경우 콤보 완충 용액으로 칭함)에 놓거나, 희석시킨다. 폴리펩티드는 콤보 완충 용액의 사용으로 예를 들면, 적어도 5배, 또는 적어도 약 10배, 또는 약 20배, 또는 약 40배로 희석될 수 있다. 펠릿의 인큐베이션 조건은 일반적으로 공기 또는 산소를 첨가하면서, 원하는 양 또는 상당량의 단백질 또는 단백질 전부를 가용화시키고 리폴딩시킬 수 있는 조건이 될 것이다. 하나의 실시태양에서, 0.004분^-1의k_La이 사용되는데, 이는 선박용 추진기를 포함하는 2.5 L의 베쓸에서 혼합 속도가 200-400 rpm이고, 분사 속도가 0.3 cc/분/L인 것을 나타낸다. 다른 실시태양에서, 적절하게 폴딩된 단백질을 생산하는데 k_La = 0.01분^-1 또는 0.1분^-1이 사용된다. 정확한 조건은 예를 들면, 완충액의 pH, 및 존재하는 카오트로픽제 및 환원제의 종류 및 농도에 따라 달라질 것이다. 인큐베이션 온도는 일반적으로 약 0-40℃이며, 일반적으로는 적어도 약 1시간 내지 약 48시간 동안 인큐베이션시켜 가용화 및 리폴딩을 수행한다. 반응은 예를 들면, 적어도 약 3시간 동안, 적어도 약 10시간 동안, 또는 약 3 내지 48시간 사이 동안, 또는 약 3 내지 30시간 사이 동안 약 0-45℃, 또는 약 2-40℃, 또는 약 20-40℃, 또는 약 23-37℃, 또는 약 25-37℃, 또는 약 25℃에서 수행된다. 특정 실시태양에서, 반응은 대기 온도에서 수행된다.

재조합 단백질의 회수 및 정제

재조합 단백질을 회수하고 정제하는 것은 상기 단백질을 분리시키기 위한 다양한 방법 및 공지 방법, 예를 들면, 염 및 용매 분획화, 콜로이드성 물질을 사용한 흡착, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피, 전기천공 및 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용할 수 있지만, 정화 단계 및 다단계 크로마토그래피 방법의 일례가 기술되어 있다. 정화 단계는 세정제 (예를 들면, 트리톤-X-100)를 최종 농도 1%로 첨가하고, pH를 약 8.5-9.5 (또는 약 8.7 또는 약 9)로 조정하고, 1 내지 10시간 동안 25-30℃에서 용액을 인큐베이션시키고, 상기 용액을 원심분리하고; 원심분리 단계로부터 회수한 액체를 여과시키는 것을 포함한다. 다단계 크로마토그래피 방법은 상기 리폴딩된 재조합 단백질을 혼합 모드 수지, 양이온 크로마토그래피 지지체, 제1 소수성 크로마토그래피 지지체, 및 임의로, 제2 소수성 크로마토그래피 지지체 또는 이온 교환 지지체와 접촉시키고; 각각의 지지체로부터 재조합 단백질을 선택적으로 회수하거나 용리시키는 것을 포함한다. 상기 방법의 단계들은 임의의 순서대로 수행될 수 있다는 것에 주시한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 단계는 순차적으로 실시 된다.

재조합 단백질을 추가로 회수하고 정제하는데 있어서 적합한 제1 단계는 특징으로서 재조합 단백질을 농축시키고 샘플 부피를 감소시키는 것을 제공한다. 예를 들면, 상기 기술된 제2 인큐베이션 단계를 통해 회수된 재조합 단백질의 양은 매우 증가할 수 있고, 동시에 상기 단백질은 리폴딩 완충액 중에서 희석될 수 있다. 적합한 제1 크로마토그래피 지지체는 회수된 재조합 단백질의 부피를 감소시키고, 유리하게는 상기 단백질을 원치않는 오염성 단백질로부터 다소 정제할 수 있다. 적합한 제1 크로마토그래픽 단계는 제2 크로마토그래피 지지체 상에서 직접 용리될 수 있고, 그에 로딩될 수 있는 크로마토그래피 지지체를 포함한다.

예시적인 제1 크로마토그래피 지지체로는 혼합 모드 수지 (예를 들면, GE 헬쓰케어(GE Healthcare)의 캅토MMC™, 또는 팔 코포레이션(Pall Corporation)의 MEP 하이퍼셀(MEP Hypercel)), 수산화인회석 크로마토그래피 지지체, 예를 들면, CHT 세라믹 I형 및 II형 (공식적으로는 마크로프렙(MacroPrep) 세라믹으로 공지됨), 바이오-겔(Bio-Gel) HT, 바이오-겔 HTP(캘리포니아주 허큘레스에 소재하는 바이오래드(BioRad)) 등; 고정된 금속 이온, 예로서, 구리, 니켈 등의 불활성 수지로 구성된 금속 킬레이팅 크로마토그래피 지지체; 뿐만 아니라, 비-유도체화된 실리카겔을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, VEGF를 정제 및 회수하기 위한 제1 크로마토그래피 지지체는 혼합형 이온 교환 크로마토그래피 지지체이다. 제1 크로마토그래피 지지체로부터의 용리는 당업계의 표준 실시 방법에 따라 수행된다. 적합한 용리 조건 및 완충액은 하기 기술되는 바와 같이 용리 된 재조합 단백질을 직접 양이온 크로마토그래피 지지체에 로딩하는 것을 용이하게 할 것이다.

크로마토그래피용의 양이온 지지체를 형성하기 위하여 다양한 음이온 성분들이 매트릭스에 부착될 수 있다. 음이온 성분들로는 카복시메틸, 설프에틸기, 설포프로필기, 포스페이트 및 설포네이트 (S)을 포함한다. 셀룰로스 이온 교환 수지, 예로서, SE52, SE53, SE92, CM32, CM52, CM92, P11, DE23, DE32, DE52, 익스프레스 이온(EXPRESS ION)™ S 및 익스프레스 이온™ C는 영국 켄트주 메이드스톤에 소재하는 와트만 리미티드(Whatman LTD)로부터 이용가능하다. 세파덱스(SEPHADEX)™ 및 세파로스™ 기반 및 가교 결합된 이온 교환체는 또한 제품명 CM 세파덱스™ C-25, CM 세파덱스™ C-50 및 SP 세파덱스™ C-25 SP 세파덱스™ C-50 및 SP-세파로스™ 하이 퍼포먼스(High Performance), SP-세파로스™ 패스트 플로우(Fast Flow), SP-세파로스 XL, CM-세파로스™ 패스트 플로우, 및 CM-세파로스™, CL-6B하에 공지되어 있으며, 이들 모두는 파마시아 AB(Pharmacia AB)로부터 이용가능하다. 본 발명의 실시를 위한 이온 교환체의 예로는, 예를 들면, 캘리포니아주 허큘레스에 소재하는 바이오래드로부터의 제품명 마크로프렙(MACROPREP)™ 예로서, 예를 들면 마크로프렙™ S 지지체, 마크로프렙™ 하이(High) S 지지체 및 마크로프렙™ CM 지지체하의 이온 교환체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

양이온 크로마토그래피 지지체로부터의 용리는 일반적으로 염 농도를 증가시킴으로써 수행된다. 이온 칼럼으로부터의 용리는 염을 첨가하는 것을 포함하기 때문에, 그리고, 상기 언급한 바와 같이, HIC에서 염 농도가 증가하기 때문에, 이온 단계 또는 기타 염 단계 이후에 HIC 단계를 도입하는 것이 임의로 사용된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 적어도 HIC 단계, 예를 들면, 제1 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체 및/또는 제2 소수성 상호작용보다 앞선다.

소수성 칼럼은 예를 들면, 2차, 3차 및/또는 4차 정제 단계에서 재조합 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피는 당업계에 잘 알려져 있고, 이는 "크로마토그래피 지지체"에 부착된 소수성 리간드와 상호작용하는 분자의 소수성 부분의 상호작용에 입각한다. 매트릭스에 커플링된 소수성 리간드는 HIC 크로마토그래피 지지체, HIC 겔, 또는 HIC 칼럼 등으로서 다양하게 지칭된다. 추가로, 단백질과 HIC 칼럼 사이의 상호작용의 강도는 단백질 상의 비극성 대 극성 표면의 비 뿐만 아니라, 비-극성 표면의 분포와도 함수 관계에 있음을 이해한다.

다수의 매트릭스가 HIC 칼럼 제조에 사용될 수 있다. 실리카 및 유기 중합체 수지가 사용될 수 있지만, 가장 광범위하게 사용되는 것은 아가로스이다. 유용한 소수성 리간드로는 약 2 내지 약 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬기, 예로서, 부틸, 프로필, 또는 옥틸, 또는 아릴기, 예로서, 페닐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 겔 및 칼럼용의 통상의 HIC 지지체는 공급처, 예로서, 스웨덴 웁살라에 소재하는 파마시아(Pharmacia)로부터 제품명 부틸-세파로스™, 부틸-SP-세파로스™-패스트 플로우, 페닐-세파로스™ CL-4B, 옥틸 세파로스™ FF 및 페닐 세파로스™ FF하에, 및 공급처, 예로서, 일본 도쿄에 소재하는 토소 코포레이션(Tosoh Corporation)으로부터 제품명 토요펄(TOYOPEARL)™ 부틸 650M (프락토겔(Fractogels) TSK 부틸-650) 또는 TSK-겔 페닐 5PW하에 상업적으로 이용할 수 있다.

리간드 밀도는 단백질의 상호작용 강도 뿐만 아니라, 칼럼 부피에도 영향을 준다는 점에서 중요한 파라미터이다. 상업적으로 이용가능한 페닐 또는 옥틸 페닐 겔의 리간드 밀도는 약 5-40 μmol/ml 겔 상이다. 겔 용량은 당해의 특정 단백질 뿐만 아니라, pH, 온도 및 염 농도와 함수 관계에 있지만, 일반적으로 3-20 mg/ml 겔 범위에 포함되는 것으로 예측될 수 있다.

특정 겔을 선택하는 것은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 단백질의 상호작용 강도 및 HIC 리간드는 알킬 리간드의 쇄 길이에 따라 증가하지만, 대부분의 분리를 위해서는 약 4 내지 약 8개의 탄소를 갖는 리간드가 적합하다. 단백질의 방향족 기와의 pi-pi 상호작용 가능성 때문에 선택성이 상이할 수 있지만, 페닐기는 펜틸기와 거의 동일한 소수성을 갖는다.

단백질이 HIC 칼럼에 흡착되기 위해서는 염 농도가 높은 것이 유리하지만, 실제 농도는 선택된 특정 HIC 리간드와 단백질의 성질에 따라 폭넓은 범위에 걸쳐 달라질 수 있다. 일반적으로 염 농도는 약 1 내지 4 M인 것이 유용하다.

단계식이든 또는 구배 형태이든 간에, 다양한 방식으로, 예로서, a) 염 농도를 변화시키거나, b) 용매의 극성을 변화시키거나, 또는 c) 세정제를 가함으로써 HIC 지지체로부터의 용리를 수행할 수 있다. 염 농도를 감소시킴으로써 흡착된 단백질은 소수성이 증가하는 순서로 용리된다. 극성을 변화시키는 것은 예로서, 에 틸렌 글리콜 또는 이소프로판올과 같은 용매를 첨가함으로써 소수성 상호작용의 강도를 감소시킴에 따라 수행될 수 있다. 세정제는 단백질의 여과기로서 작용을 하며, 주로 막 단백질의 정제와 관련하여 사용되어 왔다.

VEGF를 정제하는 방법의 일례는 하기에 기술되어 있으며, 예를 들면, 실시예 IV 및 V를 참조한다.

재조합 단백질의 발현

요약컨대, 숙주 원핵생물 세포 게놈과 관련하여 자동 복제할 수 있고, 단백질을 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입한다. 본원에 기술된 재조합 단백질의 뉴클레오티드 서열을 포함하여 적절한 발현 벡터를 작제하는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 문헌 ([Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, New York) (2001)]; [Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols John Wiley and Sons (New Jersey) (2002)]; 및 [Baneyx, (1999) Current Opinion in Biotechnology, 10:411-421])을 참조한다. 세균을 비롯한 적절한 적절한 원핵생물 세포 발현 벡터는 예를 들면, 메릴랜드주 로크빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)을 통해 상업적으로 이용가능하다. 원핵생물 세포, 및 특히, 세균 세포 배양물을 대량 배양하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 이들 방법은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.

예를 들면, 원핵생물 숙주 세포를 관심의 대상이 되는 헤파린 결합 단백질을 코딩하는 발현 벡터 또는 클로닝 벡터로 형질감염시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적절하도록 개질된 종래의 영양 배지에서 배양한다. 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 적합하게 임의의 공급원으로부터 유래된 RNA, cDNA, 또는 게놈 DNA이되, 단, 이는 관심의 대상이 되는 폴리펩티드(들)를 코딩한다. 미생물 숙주에서 이종성 폴리펩티드 (그의 변이체 포함)를 발현시키는데 적절한 핵산을 선별하는 방법은 잘 알려져 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 당업계에 공지된 각종 방법에 의해 제조된다. 예를 들면, VEGF를 코딩하는 DNA는 예를 들어, VEGF를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써 단리되고 서열 분석된다.

이종성 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 적합한 프로모터의 조절하에 미생물에서의 발현을 위한 복제가능한 벡터 내로 적합하게 삽입한다. 본 목적을 위해 많은 벡터가 이용될 수 있으며, 적절한 벡터를 선택하는 것은 주로 벡터 내로 삽입시키고자 하는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환시키고자 하는 특정 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 각 벡터는 그와 상용성에 있는 특정 숙주 세포에 따라 다양한 성분들을 함유하게 된다. 특정 유형의 숙주에 따라 벡터 성분은 일반적으로 하기: 단일 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 프로모터, 및 전사 종결 서열중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일반적으로, 숙주 세포와 상용성인 종으로부터 유래된 레플리콘 및 조절 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 미생물 숙주와 관련하여 사용된다. 벡터는 보통 복제 부위 뿐만 아니라, 형질전환된 세포에서 표현형으로 선별될 수 있도록 하는 마킹 서열도 수반한다. 예를 들면, E. 콜라이는 전형적으로 E. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환된다 (예를 들어, 문헌 [Bolivar et al., (1977) Gene, 2: 95]를 참조한다). pBR322는 앰피실린 및 테트라사이클린 내성에 대한 유전자를 함유하는 바, 이로써, 형질전환된 세포를 용이하게 동정할 수 있는 수단을 제공해 준다. pBR322 플라스미드, 또는 기타 세균 플라스미드 또는 파지는 또한 일반적으로 선별가능한 마커 유전자의 발현을 위해 숙주가 사용할 수 있는 프로모터를 함유하거나, 함유하도록 변형된다.

(i) 신호 서열

본 발명의 폴리펩티드는 직접적으로 뿐만 아니라, 이종성 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생산될 수 있는데, 상기 이종성 폴리펩티드는 전형적으로 신호 서열, 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적인 절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드이다. 선택된 이종성 신호 서열은 전형적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱된 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단된) 것이다. 천연 폴리펩티드 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 못하는 원핵생물 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들면, 알칼리성 포스파타제, 페니실린, lpp, 또는 내열성 장독소 II 리더로부터 선택되는 원핵 신호 서열에 의해 치환된다.

(ii) 복제 기점 성분

발현 벡터는 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 상기 벡터를 복제시킬 수 있는 핵산 서열을 함유한다. 그러한 서열은 각종 미생물에 대하여 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그램-음성 세균 예로서, E. 콜라 이에 적합하다.

(iii) 선별 유전자 성분

발현 벡터는 일반적으로, 선별가능한 마커로 명명되기도 하는 선별 유전자를 함유한다. 이러한 유전자는 선택적인 배양 배지에서 배양시킨 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 코딩한다. 선별 유전자를 함유하는 벡터를 이용하여 형질전환되지 않은 숙주 세포는 이러한 배양 배지에서 생존하지 못할 것이다. 이러한 선별가능한 마커는 본 발명에 의해 이용되고 정의되는 바와 같은 유전자 마커와는 별도의 것이다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 유전자 마커(들)의 존재에 의해 유발되는 것 이외의 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양분을 공급하는 단백질을 코딩하며, 예를 들어, 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자가 있다.

선별 계획에 대한 한가지 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용하는 것이다. 이러한 경우, 관심의 대상이 되는 핵산을 이용하여 성공적으로 형질전환시킨 세포는 약물 내성을 부여해 주는 폴리펩티드를 생산하므로, 선별 섭생에서 살아 남는다. 그러한 우성 선택의 예는 약물로서 네오마이신 (문헌 [Southern et al., J. Molec. Appl. Genet., 1: 327 (1982)]), 미코페놀산 (문헌 [Mulligan et al., Science, 209: 1422 (1980)]) 또는 하이그로마이신 (문헌 [Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5: 410-413 (1985))을 사용한다. 상기 3가지 예들은 진핵생물 세포 제어 하에 세균성 유전자를 이용하여 적절한 약물 G418 또는 네오마이신 (제네티신), xgpt (미코페놀산) 또는 하이그로마이신 각각에 대한 내성을 전달한다.

(ⅳ) 프로모터 성분

관심의 대상이 되는 재조합 단백질을 제조하기 위한 발현 벡터는 숙주 유기체에 의해 인식되는 적합한 프로모터를 함유하고, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된다. 원핵생물 숙주와 사용하기에 적합한 프로모터는 베타-락타마제와 락토스 프로모터 시스템 (문헌 ([Chang et al., (1978) Nature, 275: 615]; [Goeddel et al., (1979) Nature, 281: 544])), 아라비노스 프로모터 시스템 (문헌 [Guzman et al., (1992) J. Bacteriol., 174: 7716-7728]), 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (문헌 [Goeddel, (1980) Nucleic Acids Res., 8: 4057(1980)] 및 EP 36,776) 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터 (deBoer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25])를 포함한다. 그러나, 기타 공지된 세균 프로모터가 적합하다. 그들의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있기 때문에, 당업자는 링커 또는 임의의 필요한 제한 부위를 제공하는 어댑터를 사용하여 이들 서열을 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 결찰시킬 수 있을 것이다 (문헌 [Siebenlist et al, (1980) Cell, 20: 269]). 예를 들어, 문헌 ([Sambrook et al., 상기 동일 문헌]; 및 [Ausubel et al., 상기 동일 문헌])을 참조한다.

일반적으로 세균 시스템에 사용되는 프로모터는 또한 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 포함 한다. 이 프로모터를 제한 효소 분해에 의해 세균 공급원 DNA로부터 제거하여 원하는 DNA를 함유하는 벡터 내로 삽입시킬 수 있다.

(v) 벡터의 작제 및 분석

상기 나열한 성분들 중 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 작제는 표준 결찰 기법을 이용한다. 단리된 플라스미드 또는 DNA 단편을 절단하고, 재단하고, 원하는 형태로 다시 결찰시켜 필요한 플라스미드를 생성시킨다.

작제된 플라스미드에서 정확한 서열을 확인하는 분석을 위해, 결찰 혼합물을 사용하여 E. 콜라이 K12 균주 294 (ATCC 31,446) 또는 다른 균주를 형질전환시키고, 성공적인 형질전환체를 경우에 따라 앰피실린 또는 테트라사이클린 내성에 의해 선별한다. 형질전환체로부터의 플라스미드를 제조하고, 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 분석하고/거나, 문헌 ([Sanger et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467] 또는 [Messing et al., (1981) Nucleic Acids Res., 9: 309])의 방법에 의해, 또는 문헌 [Maxam et al., (1980) Methods in Enzvmology, 65: 499]의 방법에 의해 서열 분석한다. 또한 문헌 ([Sambrook et al., 상기 동일 문헌]; 및 [Ausubel et al., 상기 동일 문헌])을 참조한다.

관심의 대상이 되는 재조합 단백질을 코딩하는 핵산을 숙주 세포 내로 삽입한다. 전형적으로 이는, 숙주 세포를 상기-기술된 발현 벡터로 형질전환시키고, 다양한 프로모터를 유도하도록 적절하게 개질된 종래의 영양 배지에서 배양한다.

숙주 세포 배양

본 발명을 실시하는데 적합한 원핵생물 세포는 당업계에 잘 알려져 있다. 봉입체 형태로, 또는 원형질막 주위공간 또는 세포간극에서 풍부하게 재조합 단백질을 발현시키는 숙주 세포가 전형적으로 사용된다. 적합한 원핵생물로는 세균, 예를 들어, 진정 세균, 예로서, 그램-음성 또는 그램-양성 유기체, 예를 들면, E. 콜라이, 바실리(Bacilli), 예로서, B. 섭틸리스(B. subtilis), 슈도모나스 종, 예로서, P. 애루지노사(P. aeruginosa), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 또는 세라티아 마케스센스(Serratia marcescens)를 포함한다. E. 콜라이 숙주의 일례는 E. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이다. 기타 균주, 예로서, E. 콜라이 B, E. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 E. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325) 또한 적합하다. 이들 예는 제한적이라기 보다는 예시적인 것이다. 균주 W3110이 전형적인 숙주인데, 이는 균주 W3110이 재조합 DNA 산물 발효를 위해 공통적인 숙주 균주이기 때문이다. 본 발명의 하나의 측면에서, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비하여야 한다. 예를 들면, 균주 W3110은 단백질을 코딩하는 유전자내 유전자 돌연변이를 일으키도록 변형될 수 있고, 그러한 숙주의 일례로는 1995년 4월 25일 발행된 미국 특허 번호 제5,410,026호에 기재되어 있는 E. 콜라이 W3110 균주 1A2, 27A7, 27B4, 및 27C7을 포함한다. 예를 들면, VEGF 생산용 균주는 유전형 tonAΔptr3 phoAΔE15 Δ (argF-lac)169 degP41 ilvg를 갖는, 49B3으로 명시되는 E. 콜라이 균주 W3110이다. 또한, 예를 들어, WO2004/092393의 23페이지부터 24페이지까지의 표를 참조한다.

관심의 대상이 되는 재조합 단백질을 생산하는데 사용되는 원핵생물 세포는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, New York) (2001)]에 의해 일반적으로 기재된 배지를 비롯한, 당업계에 알려져 있고 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 배양한다. 세균에 적합한 배지는 AP5 배지, 영양 브로쓰, 루리아-베르타니(LB) 브로쓰, 나이다르츠(Neidhardt's) 최소 배지, 및 C.R.A.P. 최소 또는 완전 배지와, 필요한 영양분 보충물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시태양에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵생물 세포의 성장을 선택적으로 허용하는, 발현 벡터의 작제에 기초하여 선택되는, 선별제를 함유한다. 예를 들면, 앰피실린이 앰피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위한 배지에 첨가된다. 탄소, 질소 및 무기 인산염 공급원 이외의 임의의 필요한 보충성분 또한 적절한 농도로, 단독으로 또는 복합 질소원과 같은 다른 보충성분 또는 배지와의 혼합물로 도입된다. 임의로 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다.

적합한 배지의 예는 미국 특허 제5,304,472호 및 제5,342,763호에 주어져 있다. C.R.A.P. 인산염-제한 배지는 탈이온수(deionized H₂O)로 872 ml까지의 적량으로 조정되고, 오토클레이브되고; 55℃로 냉각되고 110 ml 1 M MOPS (pH 7.3), 11 ml 50％ 글루코스, 7 ml 1 M MgS0₄로 보충되는, KOH로 pH가 7.3으로 조정된, 3.57 g (NH₄)₂(SO₄), 0.71 g 시트르산나트륨-2H₂0, 1.07 g KCl, 5.36 g 효모 추출물(인증된), 5.36 g 하이케이스SF™-쉐필드(HycaseSF™-Sheffield)로 구성된다. 이어서, 50 ㎍/ml 농도의 카르베니실린이 유도 배양물에 첨가될 수 있다.

원핵생물 숙주 세포는 적합한 온도에서 배양된다. 예를 들어, E. 콜라이 성장을 위한 온도는 예컨대, 약 20℃ 내지 약 39℃, 또는 약 25℃ 내지 약 37℃ 범위이거나, 약 30℃이다.

알칼리성 포스파타제 프로모터가 사용되는 경우, 본 발명의 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 생산하는데 사용되는 E. 콜라이 세포는 알칼리성 포스파타제 프로모터가 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, New York) (2001)]에 개괄적으로 기재된 바와 같이 부분적으로 또는 완전하게 유도될 수 있는 적합한 배지에서 배양된다. 배양 필요성은 무기 인산염의 부재 또는 인산염 기아 수준에서는 결코 일어나지 않는다. 처음에, 배지는 단백질 합성의 유도 수준을 초과하고 또한 세균 성장에 충분한 양으로 무기 인산염을 함유한다. 세포가 성장하고 인산염을 이용함에 따라, 그들은 배지 중의 인산염 수준을 감소시켜, 폴리펩티드의 합성 유도를 유발한다.

프로모터가 유도성 프로모터이면, 유도가 일어나기 위해, 전형적으로 세포를 특정의 광학 밀도, 예를 들어, 고 세포 밀도 방법을 이용하여 약 200의 A₅₅₀이 달성될 때까지 배양하고, 그 시점에서 (예를 들어, 유도제의 첨가에 의해, 배지 성분의 고갈에 의해 등) 유도가 시작되어 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현을 유도한다.

임의의 필요한 보충성분이 또한 당업자에게 알려진 적절한 농도로 포함되고, 단독으로 또는 복합 질소원과 같은 다른 보충성분 또는 배지와의 혼합물로서 도입될 수 있다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5-9의 임의의 pH일 수 있다. E. 콜라이의 경우에는 pH가 약 6.8 내지 약 7.4이거나, 약 7.0이다.

재조합 단백질의 용도

이에 따라 회수된 폴리펩티드는 약제학적으로 허용가능한 담체 중 제제화될 수 있고, 다양한 진단, 치료 또는 그러한 분자에 대해 알려진 다른 용도로 사용된다. 예를 들어, 본원에 기술된 단백질은 예로서, 효소 면역분석법과 같은 면역분석법에 사용될 수 있다.

본원에 기술된 방법을 사용하여 수득된 재조합 단백질의 치료학적 용도 또한 고려된다. 예를 들어, 성장 인자 또는 호르몬, 예컨대, VEGF는 목적에 따라 성장을 증진시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, VEGF는 예를 들어, 급성 상처 (예를 들어, 화상, 수술 상처, 일반 상처 등), 또는 만성 상처 (예를 들어, 당뇨성 궤양, 압력 궤양, 욕창, 정맥 궤양 등)의 상처 치유를 촉진시키는데, 모발 성장을 촉진시키는데, 조직 성장 및 수복 (예를 들어, 뼈, 간 등)을 촉진시키는 것 등에 사용될 수 있다.

재조합 단백질의 치료학적 제제는 동결건조된 제제 또는 수용액 형태로, 원하는 정도의 순도를 갖는 분자, 예를 들어, 폴리펩티드를 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 저장용으로 제조된다 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, Gennaro, A. Ed. (1995)]). 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 용량과 농도에서 수혜자에게 비독성이며, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제 (예로서, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤즈알코늄, 염화벤즈에토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예로서, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저 분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 예로서, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 당질; 예로서, EDTA와 같은 킬레이팅제; 예로서, 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 또는 솔비톨과 같은 당; 예로서, 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 금속 착물 (예컨대, Zn-단백질 착물) 및/또는 예로서, 트윈™, 플루로닉™, 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.

특정 실시태양에서, 생체내 투여를 위해 사용되는 제제는 멸균 상태이다. 이것은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. 재조합 단백질은 동결건조된 형태로 또는 수용액 또는 겔 형태로 저장될 수 있다. 재조합 단백질 제제의 pH는, 예를 들면, 약 4 내지 8 (하나의 실시태양에서, pH 5.0)일 수 있으며, 또한 특정 경우에는 더 높거나 낮은 pH 값이 적절할 수 있다. 특정의 부형제, 담체, 또는 안정화제를 사용함으로써 재조합 단백질의 염이 형성될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

폴리펩티드 투여 경로는 공지 방법, 예를 들면, 국소 투여, 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 눈내, 동맥내, 또는 변병내 경로에 의한 주사 또는 주입, 또는 하기 언급하는 바와 같은 지효성-방출 시스템에 따른다. 폴리펩티드는 연속적으로 주입에 의해 또는 볼루스 주사에 의해 투여될 수 있다.

전형적으로, 상처 치유의 경우 재조합 단백질은 부위-특이적 전달을 위한 것으로 제제화된다. 국소 적용시, 재조합 단백질은 예로서, 담체 및/또는 애쥬번트와 같은 다른 성분과 적합하게 배합된다. 상기 다른 성분들의 성질에 관한 제한은 없지만, 단, 상기 다른 성분들은 약제학적으로 허용가능하여야 하고, 그가 의도하는 투여에 대하여 효과가 있어야 하며, 조성물의 활성 성분의 활성을 유의적으로 분해하지 않아야 한다. 적합한 비히클의 예로는, 정제된 콜라겐을 포함하거나 포함하지 않는, 연고, 크림, 겔, 스프레이, 또는 현탁액을 포함한다. 조성물은 또한 임의로 액상 또는 반-액상 형태로 멸균 드레싱, 경피용 패취, 반창고, 및 붕대내로 주입될 수도 있다.

겔 제제를 수득하기 위하여서는 액상 조성물로 제제화되는 재조합 단백질을 유효량의 수용성 다당류 또는 합성 중합체, 예로서, 폴리에틸렌 글리콜과 혼합하여 국소 적용하기에 적절한 점성을 갖는 겔을 형성한다. 사용될 수 있는 다당류로는 예를 들면, 셀룰로스 유도체, 예로서, 알킬 셀룰로스, 하이드록시알킬 셀룰로스, 및 알킬하이드록시알킬 셀룰로스, 예를 들면, 메틸셀룰로스, 하이드로시에틸 셀룰로스, 카복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 및 하이드록시프로필 셀룰로스를 비롯한 에테르화된 셀룰로스 유도체; 전분 및 분획화된 전분; 아가; 알 긴산 및 알긴산염; 아라비아 검; 풀루란; 아가로스; 카라기닌; 덱스트란; 덱스트린; 프락탄; 이눌린; 만난; 크실란; 아라비난; 키토산; 글리코겐; 글루칸; 및 합성 생체중합체; 뿐만 아니라, 검, 예로서, 크산탄 검; 구아 검; 로커스트 콩 검; 아라비아 검; 트라가칸트 검; 및 카라야 검; 및 그의 유도체 및 혼합물을 포함한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 본원의 겔화제는 예를 들어, 생물 시스템에 불활성이고, 비독성이며, 제조가 간편하고/거나, 너무 유동성이거나(runny) 너무 점성을 띠지 않으며, 그 안에 함유된 재조합 단백질을 불안정화시키지 않는 것이다.

특정 실시태양에서, 다당류는 에테르화된 셀룰로스 유도체이고, 또다른 실시태양에서는, 잘 정의되고, 정제되고, USP에 열거되어 있는 것, 예를 들어, 메틸셀룰로스 및 하이드록시알킬 셀룰로스 유도체, 예로서, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로스이다. 하나의 실시태양에서, 메틸셀룰로스는 다당류이다.

겔화시키는데 유용한 폴리에틸렌 글리콜은 전형적으로, 적절한 점성을 얻기 위해 저 분자량 및 고 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 혼합물이다. 예를 들면, 페이스트를 수득하기 위해서는 분자량이 400-600인 폴리에틸렌 글리콜과 분자량이 1500인 폴리에틸렌 글리콜의 혼합물이 적절한 비율로 혼합될 때 본 목적에 효과적일 것이다.

다당류 및 폴리에틸렌 글리콜에 적용되는 바, "수용성"이라는 용어는 콜로이드성 용액 및 분산액을 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로, 셀룰로스 유도체의 용해도는 에테르기의 치환도에 의해 결정되고, 본원에 유용한 안정화 유도체는 셀 룰로스 쇄내 무수글루코스 단위당 상기 에테르기를 유도체가 수용성이 되도록 하는데 충분한 양으로 가져야 한다. 에테르 치환도는 무수글루코스 단위당 0.35개 이상의 에테르기인 것이 일반적으로 충분하다. 추가로, 셀룰로스 유도체는 알칼리성 금속 염, 예를 들면, Li, Na, K, 또는 Cs 염 형태일 수 있다.

메틸셀룰로스가 겔에 사용될 경우, 예를 들어, 이는 전형적으로 겔의 약 2-5%, 또는 약 3%, 또는 약 4% 또는 약 5%로 포함되고, 재조합 단백질은 겔 1 ml 당 약 300-1000 mg의 양으로 존재하게 된다.

활성 성분은 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에, 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 봉입될 수 있다. 그러한 기법은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition. Osol, A. Ed. (1995)]에 개시되어 있다. 또한, 문헌 ([Johnson et al, Nat. Med.. 2:795-799 (1996)]; [Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993)]; [Hora et al., Bio/Technology. 8:755-758 (1990)]; [Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462]; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 및 미국 특허 번호 제5,654,010호)를 참조한다.

지효성 방출 제제도 제조될 수 있다. 지효성 방출 제제의 적합한 예로는 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이 매트릭스는 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 성형품 형태이다. 지효성 방출 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예로서, 뉴프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어), 폴리-락트-코글리콜산 (PLGA) 중합체, 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일에 걸쳐 분자를 방출시킬 수 있지만, 어떤 하이드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 단백질이 장기간 체내에 남아있는 경우, 단백질은 37 ℃에서 습기에 노출된 결과, 변성 또는 응집되어 생물학적 활성은 감소되고 면역원성은 변할 수 있다. 안정화를 위해 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 전략을 설계할 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-이황화 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진다면, 설프하이드릴 잔기의 변형, 산성 용액에서의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성의 개발에 의해 안정화시킬 수 있다.

지효성 방출 폴리펩티드 조성물은 또한 리포좀에 의해 봉입된 폴리펩티드를 포함한다. 상기 단백질을 함유하는 리포좀은 본래 공지되어 있는 방법: (DE 3,218,121; 문헌 [Epstein et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 3688-3692]; [Hwang et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 40304034]; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본 특허 출원 83-118008; 미국 특허 번호 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324)에 의해 제조된다. 보통 리포좀은 지질 함량이 약 30 mol.% 초과의 콜레스테롤인 소형 (약 200-800 Å)의 단층형의 것인데, 상기의 선택된 비율은 폴리펩티드를 사용하는 가장 효과적인 요법에 맞게 조정된다.

치료학적으로 사용되는 재조합 단백질의 유효량은 예를 들면, 치료 목적, 투여 경로, 및 환자의 상태에 따라 달라질 것이다. 따라서, 치료학자는 가장 유익한 치료학적 효과를 얻기 위해 필요에 따라 투여량을 적정하고 투여 경로를 변형시켜야 할 것이다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급한 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 부터 10 mg/kg 이상까지의 범위가 될 수 있다. 전형적으로, 임상의는 원하는 효과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 폴리펩티드를 투여할 것이다. 환자는 또한 임상의의 지침하에 폴리펩티드를 투여할 수 있다. 이러한 요법의 진행 과정은 통상의 분석법에 의해 쉽게 모니터된다.

하기 실시예는 제한적이라기 보다는 예시적인 것으로 제공되는 것이다.

실시예 I: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 발현된 재조합 인간 VEGF의 가용화 및 리폴딩

방법

VEGF ₁₆₅ 발현용 플라스미드 - E. 콜라이 원형질막 주위에서 인간 VEGF₁₆₅을 발현시키기 위해 플라스미드 pVEGF171을 디자인한다 (예를 들어, 문헌 [Leung et al, (1989) Science, 246:1306-1309] 참조한다). VEGF 코딩 서열의 전사는 알칼리성 포스파타제(AP) 프로모터의 엄격한 조절하에 있는 반면 (예를 들어, 문헌 [Kikuchi et al., (1981) Nucleic Acids Research, 9:5671-8]을 참조한다), 번역 개시에 필요한 서열은 샤인-달가노 부위에 의해 제공된다 (예를 들어, 문헌 [(Yanofsky et al., (1981) Nucleic Acids Research, 9:6647- 68]). 이후에 E. 콜라이 원형질막 주위 내로 분비되도록 하기 위해 VEGF 코딩 서열을 세균 내열성 장독소 II(STII) 신호 서열 하류에 융합시킨다 (예를 들어, 문헌 ([Lee et al., (1983) Infect. Immun. 42:264-8]; 및 [Picken et al., (1983) Infect. Immun. 42:269-75])을 참조한다). STII 신호 서열내 코돈 변형은 번역 수준을 조절함으로써 원형질막 주위내 VEGF를 최적 수준으로 축적시킨다 (예를 들어, 문헌 [Simmons and Yansura, (1996) Nature Biotechnoloy, 14:629-34]). 전사 종결 인자에 대한 람다 (예를 들어, 문헌 [Scholtissek and Grosse, (1987) Nucleic Acids Research 15:3185]를 참조한다)는 VEGF 번역 종결 코돈 하류에 위치시킨다. 복제 기점, 및 앰피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자 둘 모두가 플라스미드 pBR322에 의해 제공된다. 예를 들어, 문헌 [Bolivar et al., (1977) Gene 2:95-113]를 참조한다.

세포 균질화 및 굴절반사 소체 제조 - 재조합 단백질을 생산하는 에스케리키아 콜라이 세포로부터 유래된 전체 세포를 8000 psid 초과의 압력하에 미세 유동화 기, 또는 니로-사오비(Niro Soavi)를 사용하여 균질화시킨다. 균질액을 16O mM MgSO₄, 0.0375 황산 덱스트란 및 1% 트리톤 X-100을 사용하여 1:1로 희석시킨 후, 원심분리 (BTUX 원심분리기, 스웨덴에 소재하는 알파 라발(Alfa laval))에 의해 펠릿을 수거한다.

가용화 및 리폴딩 - 펠릿 (예를 들면, 1 g)을 4 부피의 (예를 들면, 4 ml) 가용화 완충액: 최종 농도 1 M의 우레아/300 mM의 아르기닌, 최종 농도 10 mM의 트리스 또는 CHES, 최종 농도 5 mM의 EDTA, pH 11 (4 L/kg 펠릿)에 현탁시킨다. 현탁액을 실온 (15-30℃)에서 1-2시간 동안 잘 혼합시킨다. 리폴딩은 가용화 완충액 1 부피당 3 부피의 완충액 (1:4 v/v)을 첨가함으로써 시작되는데, 상기 첨가를 통해 리폴딩 완충액의 최종 농도는 1 M 우레아, 15 mM 시스테인, 0.5-2 mM DTT, 100 mM 아르기닌, 10 mM 트리스 또는 CHES, 5 mM EDTA, pH 9-10이 된다. 6-24시간 동안 실온에서 공기 또는 산소를 첨가하면서, 혼합물을 일정한 용량 물질 전달 계수 K_la (예를 들면, 2.5 L 베쓸에서 공기 분사하는 경우, k_La = 0.004 내지 0.01분^-1이고, 분사 속도는 0.3-3 cc/분/L이며, 혼합 속도는 200-400 rpm이다)에서 교반한다. 리폴딩 과정에 대한 시간적 추이에 관해 도 1을 참조한다. 임의로, VEGF는 6시간 후 공기 대신 질소를 가함으로써 (예를 들면, 2.5 L 탱크의 경우, 0.3-3 cc/분/L) 리폴드 완충액에서 안정화될 수 있다. 도 7을 참조한다. 폴딩은 SDS-PAGE, 양이온 교환 HPLC 및 rpHPLC 크로마토그래피, 및/또는 헤파린 HPLC에 의해 모니터한다.

경미한 수준의 변성제 및 환원제를 함유하는 pH가 높은 완충액에서 리폴딩하 였을 때에는 VEGF 이량체의 회수율을 유지하는 한편, 공정 부피 (5-배)가 현저히 감소된 것이 관찰되었다. 이러한 방법은 다른 재조합 단백질, 예를 들면, 다른 성장 인자의 리폴딩에 적용될 수 있다고 예측된다.

실시예 II: 단일 단계의, 에스케리키아 콜라이에서 발현된 재조합 인간 VEGF의 가용화 및 리폴딩

가용화 및 리폴딩 : 펠릿을 세포 펠릿 1 kg당 10-39 L 부피의 리폴딩 완충액 (이 경우, "콤보 완충 용액"으로 칭함)에 현탁시키는데, 여기서, 콤보 완충 용액은 최종 농도 1 M의 우레아, 최종 농도 15 mM의 시스테인, 최종 농도 0.5 또는 2 mM의 DTT, 최종 농도 100 mM의 아르기닌, 최종 농도 10 mM의 트리스 또는 CHES, 최종 농도 5 mM의 EDTA, pH 9.5-10.5를 함유한다. 리폴딩 완충 용액 중의 우레아 및 아르기닌 첨가에 대한 효과는 도 6을 참조한다. 도 6은 15시간 동안 실온하에 pH 9.5에서 본 실시예에 기술된 1-단계 펠릿 리폴드 (콤보 완충 용액) 결과를 나타낸다. 변성제 농도는 하기와 같이 다양하게 한 반면: (1) 1 M 우레아 및 100 mM 아르기닌; (2) 1 M 우레아 (및 0 mM 아르기닌); (3) 2 M 우레아 (및 0 mM 아르기닌), 다른 완충액 성분들 모두 (예를 들면, 트리스 또는 CHES, DTT 등)는 동일한 농도로 유지된다. 이들로부터 얻은 VEGF 역가는 양이온 교환 HPLC 분석법에 의해 측정된 것과 같다. 도 6은 아르기닌의 존재 또는 부재하의 rpHPLC 프로파일들이 유사하다는 것을 나타낸다.

가용화 및 리폴딩 인큐베이션은 실온에서 3-24시간 동안 수행하고, 물질 전 달 계수 k_La = 0.004 내지 0.1분^-1 (예를 들면, 선박용 추진기를 포함하는 2.5 L의 베쓸의 경우, 공기 분사 속도는 0.3 내지 10 cc/분/L, 또는 0.3-1 cc/분/L, 또는 1 cc/분/L, 또는 25 cc/분/L이고, 동시에 200-400 rpm으로 혼합한다)으로 공기를 분사한다. 다양한 공기 분사 속도가 리폴딩 상태에 미치는 효과에 관해서 도 8을 참조한다. 예를 들면, VEGF를 함유하는 펠릿을 1:39 (펠릿 kg 대 완충액 L)의 비로 pH 10에서 콤보 완충 용액에 첨가하였다. 3개의 2.5 L 반응 탱크를 준비하고, 각 탱크에 대하여 혼합 속도 및 공기 분사 속도를 달리하여 (a) 0.004, (b) 0.01, (c) 0.1분^-1의 kLa에 도달하도록 하였다. 각 탱크에서 시험된 혼합 속도는 314 rpm인 반면, 공기 분사 범위는 1 cc/L/분 내지 25 cc/L/분이었다. 시간이 경과함에 따라 수율 및 생성물의 질에 대해 반응을 모니터하였다. 도 8에 제시된 rpHPLC 프로파일은 12시간 후 생성된 폴딩된 VEGF의 생성물 질이 유사하다는 것을 나타낸다. 임의로, 인큐베이션은 약 48시간 이하의 시간 동안 실온에서 수행할 수 있다. 임의로, VEGF는 6시간 후 공기 대신 질소를 동일한 분사 속도 및 혼합 속도로 첨가하여 리폴드 완충액에서 안정화시킬 수 있다. 도 7을 참조하는데, 상기 도 7은 공기 존재하에 (예를 들면, 2.5 L 탱크의 경우, kLa = 0.004분^-1 또는 0.3cc/분/L) 2-단계 펠릿 리폴드 (실시예 I에 기술되어 있다)로부터 얻은 결과를 나타내며, 여기서, 6시간째 단량체의 피크는 감소되어 있다 (따라서, 이는 리폴딩 반응이 실질적으로 완전하다는 것을 나타낸다). 48시간 이하의 시간 동안 공기 분사를 N₂ (예를 들면, k_La = 0.004분^-1)로 대체한다. 도 7에서 볼 수 있는 바, 물질은 rpHPLC 결과로 나타낸 바와 같이 안정적인 상태로 남아있다. 폴딩을 SDS-PAGE, 양이온 교환 HPLC 및 rpHPLC 크로마토그래피 칼럼, 및/또는 헤파린 HPLC에 의해 모니터한다.

실시예 III: 재조합 단백질의 비펠릿형 리폴딩

재조합 단백질을 생산하는 에스케리키아 콜라이 전체 세포 브로쓰를 모델 15 M 실험실용 균질기 가울린 15M (소규모) 또는 M3 (대규모) (매사추세츠주 에버렛에 소재하는 가울린 코포레이션(Gaulin Corporation))에서 균질화시키고, 균질액 1 부피당 리폴딩 완충액 중 1:4 (v/v)로 희석하고, 물질 전달 계수 k_La = 0.004 내지 O.1분^-1 (예를 들면, 선박용 추진기를 포함하는 2.5 L의 베쓸의 경우, 공기 분사 속도는 0.3 내지 3 cc/분/L, 또는 0.3-1 cc/분/L, 또는 1 cc/분/L, 또는 3 cc/분/L이고, 동시에 200-400 rpm으로 혼합한다)으로 공기를 분사한다. 리폴딩 완충액은 최종 농도 1 M의 우레아, 최종 농도 15 mM의 시스테인, 최종 농도 2 mM의 DTT, 최종 농도 100 mM의 아르기닌, 최종 농도 10 mM의 트리스 또는 CHES, 최종 농도 5 mM의 EDTA, pH 9-10을 함유한다. 3-24시간 동안 실온에서 리폴드 인큐베이션을 수행한다. 임의로, VEGF는 리폴드 인큐베이션 3시간 후 공기 대신 질소를 첨가하여 리폴드 완충액에서 안정화시킬 수 있다. 폴딩을 양이온 교환 HPLC, rpHPLC 크로마토그래피, 및/또는 헤파린 HPLC에 의해 모니터한다.

실시예 IV: 리폴딩후 재조합 인간 VEGF (rhVEGF)의 정제

정제: 트리톤 X-100을 최종 농도 1%로 첨가하고, pH를 9로 조정한 후, 원심분리 (4℃에서 20분 동안 10,000 x g)하여 리폴드 풀을 정화시킨다. 이어서, pH 9 및 전도도 < 10 mS/cm에서 혼합 모드 수지 (뉴저지주 피츠카타웨이에 소재하는 GE 헬쓰케어의 캅토MMC™) 상에 포획시키기 전에 상등액을 여과한다 (쿠노(Cuno) 심층 필터 + 0.22 또는 0.45 μ 막 필터). 임의로, 리폴드 풀을 평형 로딩 완충액에서 적어도 1:5로 희석한 후, pH 9 및 전도도 < 10 mS/cm에서 혼합 모드 수지 (뉴저지주 피츠카타웨이에 소재하는 GE 헬쓰케어의 캅토MMC™) 상에 포획시키기 전에 여과한다 (쿠노(Cuno) 심층 필터 + 0.22 또는 0.45 μ 막 필터). 상기 샘플을 칼럼상에 로딩하기 전에 패킹된 칼럼을 25 mM HEPES (pH 9)로 평형화시킨다. pH 6-9 (예를 들면, pH 7.5)에서 1 M 아르기닌/25 mM HEPES를 사용하여 MMC 칼럼으로부터 VEGF를 등용매 용리시킨다. 도 2를 참조한다.

캅토MMC™ 풀은 0.1 N 수산화나트륨을 사용하여 pH 7.5로 조정하고, (50 mM HEPES (pH 7.5)로 평형화된) SP-세파로스 HP 칼럼 상에 로딩시키기 전에 20 mS/cm 전도도로 WFI를 사용하여 희석시킨다. 10-20 칼럼 부피 (예를 들면, 15 칼럼 부피)에 대해 50 mM HEPES/0-1.2 M 아세트산나트륨 (pH 7.5)으로 구성된 선형의 염 구배를 사용하여 VEGF를 용리시키고, 분획을 수집한다 (1 칼럼 부피). 280 nm (~42 mS/cm에서 OD 최대)에서 최고의 흡광도를 갖는 분획은 전형적으로 > 90%의 VEGF를 함유하였고, 추가 공정을 위해서 풀링한다. 도 3을 참조한다.

세번째 크로마토그래피 단계는 소수성 수지 (예를 들면, 하이 프로필 (J. T. 베이커(J. T. Baker), 페닐 세파로스 패스트 플로우 (낮은 서브) (뉴저지주 피츠카 타웨이에 소재하는 GE 헬쓰케어의 캅토MMC™))를 포함한다. SP-세파로스 HP 용리 풀은 평형화된 칼럼 (50 mM HEPES, 1.2 M 아세트산나트륨, pH 7.5) 상에 로딩하기 전에 아세트산나트륨 또는 황산나트륨을 사용하여 50 mS/cm의 전도도로 조절한다. 도 4를 참조한다. 50 mM HEPES (pH 7.5)으로 VEGF를 등용매 용리시키고, 상기 풀은 남아있는 숙주 세포 불순물 및 가용성 응집체에 대하여 분석한다. 분획을 수집하고, 본원에 기술된 분석법에 의해 측정된 바, 적절하게 폴딩된 VEGF를 함유한 것을 풀링한다. 임의로, 예를 들면, 제2 소수성 수지 (예를 들면, 페닐 TSK) 또는 이온 교환 수지를 사용하여 추가의 크로마토그래피 단계를 실시한다.

한외여과/투석여과 - 풀링된 VEGF를 실험실적 규모의 TFF 시스템상의 5 kD의 재생 셀룰로스 막 상에서 6 g/L (UFl)의 농도로 한외여과시킬 수 있다. 샘플은 TFF 시스템을 통해 5 mM 숙신산나트륨을 사용하여 7-14 DV (투석 부피)로 10 g/L로 투석여과시킨 다음, 5g/L로 제제화하고 -80℃에 저장한다. 사용된 제제 완충액은 5 mM 숙신산나트륨/275 mM 트레할로스/0.01% 폴리소르베이트 20/pH 5.0이다.

실시예 V: 리폴딩후 재조합 인간 VEGF (rhVEGF)의 정제

정제: 트리톤 X-100을 최종 농도 1%로 첨가하고, pH를 8.5-9.5 (예를 들면, pH 8.7)로 조정한 후, 원심분리하기 전에 1 내지 10시간 동안 25-3O℃에서 유지시켜 리폴드 풀을 정화시킨다. 원심분리기 상에서 처리하여 (4℃에서 20분 동안 10,000 x g) 밀도가 큰 입자를 제거한 후, 회수한 액체 (센트레이트(centrate))를 일련의 심층 필터 및 멸균 가드 (0.22 또는 0.45 μ 막 필터)를 통해 통과시켜 미세 입자를 제거한다. 이어서, pH 8.7 및 전도도 < 10 mS/cm에서 혼합 모드 수지 (뉴저지주 피츠카타웨이에 소재하는 GE 헬쓰케어의 캅토MMC™) 상에서 rhVEGF를 포획한다. 상기 샘플을 칼럼 상에 로딩하기 전에 패킹된 칼럼을 25 mM CHES (pH 8.7)로 평형화시킨다. pH 6-9 (예를 들면, pH 7.5)에서 0.9 M L-아르기닌 HCl/25 mM HEPES를 사용하여 MMC 칼럼으로부터 VEGF를 등용매 용리시킨다.

캅토MMC™ 풀은 0.1 N 수산화나트륨을 사용하여 pH 7.5로 조정하고, (25 mM HEPES (pH 7.5)로 평형화된) SP-세파로스 고성능 칼럼 상에 로딩시키기 전에 20 mS/cm 전도도로 WFI를 사용하여 희석시킨다. 10-20 칼럼 부피 (예를 들면, 15 칼럼 부피)에 대해 50 mM HEPES/0-1.2 M 아세트산나트륨 (pH 7.5)으로 구성된 선형의 염 구배를 사용하여 VEGF를 용리시키고, 분획을 수집한다 (1 칼럼 부피). 280 nm 에서 최고의 흡광도를 갖는 분획(~42 mS/cm에서 OD 최대)은 전형적으로 > 90%의 VEGF를 함유하고, 추가 공정을 위해서 풀링한다. 세번째 크로마토그래피 단계는 소수성 수지 (예를 들면, 하이 프로필 (J. T. 베이커, 페닐 세파로스 패스트 플로우 (낮은 서브) (뉴저지주 피츠카타웨이에 소재하는 GE 헬쓰케어의 캅토MMC™))를 포함한다. SP-세파로스 HP 용리 풀은 평형화된 HIC 칼럼 (25 mM HEPES, 0.75 M 아세트산나트륨, pH 7.5) 상에 직접 로딩한다. 도 5를 참조한다. 50 mM HEPES (pH 7.5)으로 VEGF를 등용매 용리시키고, 상기 풀은 남아있는 숙주 세포 불순물 및 가용성 응집체에 대하여 분석한다. 분획을 수집하고, 본원에 기술된 분석법에 의해 측정된 바, 적절하게 폴딩된 VEGF를 함유한 것을 풀링한다. 임의로, 예를 들면, 제2 소수성 수지 (예를 들면, 페닐 TSK) 또는 이온 교환 수지를 사용하여 추가의 크로마토그래피 단계를 실시하여 숙주 불순물을 추가로 제거한다.

한외여과/투석여과 - 풀링된 VEGF를 상업적 TFF 시스템 (펠리콘(Pellicon) 2 카세트 (매사추세츠주 빌러리카에 소재하는 밀리포어(Millipore)))의 5 kD의 재생 셀룰로스 막 상에서 10 g/L 농도로 한외여과시킨 후, 제제 완충액으로 7-14 DV (투석 부피)로 투석여과시킨다. 최종적으로 조절하여 5 mM 숙신산나트륨/275 mM 트레할로스 탈수화물/0.01% 폴리소르베이트 20/pH 5.0 중 5 g/L VEGF를 함유하는 용액을 수득하는데, 이는 -80℃에서 저장될 수 있다.

실시예 VI: 폴딩 및/또는 정제된 재조합 단백질을 측정하는 분석법

본원에 기술된 방법 및 공정에서, 최종 순도 및/또는 활성은 펩티드 지도화, 이황화 지도화, SDS-PAGE (환원성 및 비-환원성 둘 모두), 원편광 이색성 분광 분석, 리물루스 암베오사이트 용해물 (LAL), 양이온 교환 HPLC, 헤파린 HPLC (예를 들어, 헤파린 HPLC를 사용하여 VEGF 이량체 농도 및 미스폴딩된 종의 수준을 측정할 수 있다), 역상 (rp) HPLC 크로마토그래피 (예를 들어, 전체 VEGF 농도를 측정하기 위해서는 환원된 샘플의 rpHPLC가 사용될 수 있는 반면, 천연 샘플의 rpHPLC로는 리폴딩된 VEGF의 질을 평가할 수 있다), 수용체 결합 (예를 들면, VEGF의 경우, 예를 들어, KDR 수용체 결합-생체분석 R&D, 및/또는 Flt1 수용체 수용체 결합), SEC 분석, 세포 분석법, HUVEC 효능 분석법, VEGF 항체를 사용한 ELISA, 질량 분광 분석 등에 의해 평가될 수 있다.

전체 VEGF 발현을 측정하는 분석법

(1) 환원된 샘플의 rpHPLC - 발현된 VEGF의 정량은 C18 칼럼 (주피터(Jupiter) C18 칼럼 (4.6 x 250 mm, 5 ㎛, 캘리포니아주 토런스에 소재하는 페노 메넥스(Phenomenex) 제공)) 상에서의 역상 HPLC 분석법을 사용하여 측정한다. 칼럼을 0.22% 트리플루오로아세트산에서 평형화시키고, 1 mL/분의 유속으로 30분에 걸쳐 0.2% 트리플루오로아세트산을 함유하는 25% 내지 45% 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 용리시킨다. 용리액은 280 nm에서 모니터한다. 샘플을 처리하고, 주입하기 전에 구아니딘 및 DTT에서 전체적으로 환원시킨다. 환원된 VEGF 단백질을 약 26분간 용리시키고, 피크 면적을 사용하여 공지된 표준 곡선으로부터 샘플내 VEGF의 총량을 계산한다.

리폴딩된 VEGF에 대한 분석법

(1) 양이온 교환 HPLC 분석법 - 적절하게 리폴딩된 VEGF 이량체의 정량은 분석 양이온 교환 칼럼, 예를 들면, SP-5PW 칼럼 (TSK 겔 SP-5PW, 7.5 x 75 mm, 10 ㎛, 일본에 소재하는 토소 바이오사이언스 LLC 제공)을 사용하여 측정한다. 칼럼을 50 mM 인산나트륨 (pH 7.5)에서 평형화시킨다. 1 mL/분의 유속으로 60분에 걸쳐 칼럼을 평형 완충액중 0 내지 2 M 염화나트륨의 선형 구배를 사용하여 용리시킨다. 용리액을 280 nm 또는 214 nm에서 모니터한다. 전형적으로, 대부분의 단백질은 처음 30분때에 용리되었고, VEGF는 약 40분때에 용리된다. 도 9를 참조한다.

(2) rp-HPLC 분석법 - 적절하게 리폴딩된 VEGF 이량체를 조르바스(Zorbax) 300SB-C8 칼럼 (4.6 x 150 mm, 3.5 ㎛, 캘리포니아주 산타클라라에 소재하는 애질런트 테크놀러지스(Agilent Technologies) 제공)을 사용하여 정성 측정한다. 칼럼을 0.1% 트리플루오로아세트산에서 평형화시키고, 1 mL/분의 유속으로 50분에 걸쳐 0.08% 트리플루오로아세트산을 함유하는 0 내지 50% 선형 구배를 사용하여 용리시 킨다. 용리액은 214 nm에서 모니터한다. 전형적으로, VEGF는 약 35분째에 용리되고, 피크 프로파일은 주 피크와 비교하여 리딩 에지 소수성 종의 함량 비율에 대하여 평가한다. 언폴딩된 VEGF 단량체는 2-3분 후에 용리된다.

(3) 헤파린-결합 HPLC 분석법 - 적절하게 리폴딩된 VEGF를 고정된 헤파린을 함유하는 칼럼을 사용하여 정성 및 정량 측정한다. 칼럼 헤파린- 5PW (7.5 x 75 mm, 10 ㎛, TSK 겔 (일본에 소재하는 토소 바이오사이언스 LLC 제공))는 0.15 M 염화나트륨를 함유하는 10 mM 인산나트륨 (pH 7.4)에서 평형화시킨다. 1 mL/분의 유속으로 20분에 걸쳐 칼럼을 평형 완충액중 0.15 M 내지 1.6 M 염화나트륨의 선형 구배를 사용하여 용리시킨다. 몇몇 분석법에서는 16분 동안 용리를 수행한다. 용리액을 280 nm에서 모니터한다. 전형적으로, 대부분의 단백질은 공극 부피로 용리되었고, 3 부류의 VEGF를 동정할 수 있었다. 친화성이 가장 높고, 가장 최후에 용리된 종을 올바르게 폴딩된 VEGF로서 동정하고, 이는 종종 "피크 3 VEGF"로 식별된다.

본원에 기술된 기탁물, 실시예, 및 실시태양은 단지 예시적인 목적을 위한 것이며, 그에 비추어 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이며, 이는 본 출원의 정신 및 범위, 및 첨부된 청구의 범위의 범주 내에 포함될 것으로 이해된다. 본원에서 인용된 모든 간행물, 인용물, 특허, 및 특허 출원은 그의 전문이 본원에서 모든 목적을 위해 참고로 인용된다.

<110> GENENTECH, INC. Pizarro, Shelly Sanchez, Ailen Schmelzer, Charles H. <120> REFOLDING OF RECOMBINANT PROTEINS <130> P2385R1 WO <150> US 60/830,831 <151> 2006-07-14 <160> 1 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val 1 5 10 15 Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu 20 25 30 Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr 35 40 45 Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 50 55 60 Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn 65 70 75 Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His 80 85 90 Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg 95 100 105 Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys 110 115 120 Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys 125 130 135 Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln 140 145 150 Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 155 160 165

Claims

하기를 포함하고:

(a) 원핵생물 세포 배양물로부터 재조합 단백질을 단리시키는 단계;

(b) (i) 최종 농도 1 M의 우레아, 300 mM의 아르기닌, 10 mM의 CHES, 5 mM의 EDTA, 또는 (ii) 최종 농도 1 M의 우레아, 300 mM의 아르기닌, 10 mM의 트리스, 5 mM의 EDTA를 포함하는, pH 9 초과의 제1 완충 용액 중에서 상기 단백질을 가용화시키는 단계;

(c) 재조합 단백질이 리폴딩될 수 있는 시간 동안, 및 그러한 조건하에 공기 또는 산소를 첨가하면서, (i) 최종 농도 1 M의 우레아, 15 mM의 시스테인, 2 mM의 DTT, 100 mM의 아르기닌, 10 mM의 CHES, 5 mM의 EDTA, 또는 (ii) 최종 농도 1 M의 우레아, 15 mM의 시스테인, 0.5-2 mM의 DTT, 100 mM의 아르기닌, 10 mM의 트리스, 5 mM의 EDTA를 포함하는, pH > 9이되, pH ≤ 11인 제2 완충 용액 중에서 상기 가용화된 단백질을 리폴딩시키는 단계; 및

(d) 상기 리폴딩된 재조합 단백질을 회수하는 단계,

재조합 단백질이 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)인,

원핵생물 세포 배양물로부터 리폴딩된 재조합 단백질을 회수하는 방법.
제1항에 있어서, VEGF가 VEGF₁₆₅인 방법.
제1항에 있어서, 재조합 단백질을 적어도 1시간 동안 제1 완충 용액 중에서 인큐베이션시키는 것인 방법.
제3항에 있어서, 인큐베이션을 2-40℃에서 실시하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 가용화된 단백질을 3 내지 24시간 동안 제2 완충 용액 중에서 인큐베이션시키는 것인 방법.
제5항에 있어서, 인큐베이션을 2-40℃에서 실시하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 공기 또는 산소를 k_La = 0.001 내지 0.1분^-1으로 첨가하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 질소를 첨가하여 상기 리폴딩된 재조합 단백질을 안정화시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 회수 단계 (d)가 재조합 단백질을 함유하는 제2 완충 용액을 정화시키고, 상기 리폴딩된 재조합 단백질을 혼합 모드 크로마토그래피 지지체, 양이온 크로마토그래피 지지체, 및 제1 소수성 크로마토그래피 지지체에 순차적으로 접촉시키고, 각각의 지지체로부터 리폴딩된 재조합 단백질을 선택적으로 용리시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 정화 단계가 세정제를 최종 농도 1%로 가하고, pH를 8.5-9.5로 조정하고, 1 내지 10시간 동안 25-30℃에서 용액을 인큐베이션시키고, 용액을 원심분리하고; 원심분리 단계로부터 회수한 액체를 여과시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 리폴딩된 재조합 단백질을 제2 소수성 크로마토그래피 지지체 또는 이온 교환 지지체에 접촉시키고, 지지체로부터 리폴딩된 재조합 단백질을 선택적으로 용리시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
제9항 또는 제11항에 있어서, 상기 제1 및 제2 소수성 크로마토그래피 지지체가 부틸-, 프로필-, 옥틸-, 페닐- 및 아릴-아가로스 수지로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
하기를 포함하고:

(a) 원핵생물 세포 배양물로부터 재조합 단백질을 단리시키는 단계;

(b) 공기 또는 산소를 첨가하면서, (i) 최종 농도 1 M의 우레아, 15 mM의 시스테인, 2 mM의 DTT, 100 mM의 아르기닌, 10 mM의 CHES, 5 mM의 EDTA, 또는 (ii) 최종 농도 1 M의 우레아, 15 mM의 시스테인, 0.5-2 mM의 DTT, 100 mM의 아르기닌, 10 mM의 트리스, 5 mM의 EDTA를 포함하는, pH > 9이되, pH ≤ 11인, 완충 용액 중에서 상기 단백질을 가용화시키고, 리폴딩시키는 단계; 및

(c) 상기 리폴딩된 재조합 단백질을 회수하는 단계,

재조합 단백질이 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)인,

원핵생물 세포 배양물로부터 리폴딩된 재조합 단백질을 회수하는 방법.
제13항에 있어서, 회수 단계가 재조합 단백질을 함유하는 완충 용액을 정화시키고, 상기 리폴딩된 재조합 단백질을 혼합 모드 크로마토그래피 지지체, 양이온 크로마토그래피 지지체, 및 제1 소수성 크로마토그래피 지지체에 순차적으로 접촉시키고, 각각의 지지체로부터 리폴딩된 재조합 단백질을 선택적으로 용리시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 정화 단계가 세정제를 최종 농도 1%로 가하고, pH를 8.5-9.5로 조정하고, 1 내지 10시간 동안 25-30℃에서 용액을 인큐베이션시키고, 용액을 원심분리하고; 원심분리 단계로부터 회수한 액체를 여과시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제13항에 있어서, 재조합 단백질을 3 내지 24시간 동안 완충 용액 중에서 인큐베이션시키는 것인 방법.
제16항에 있어서, 인큐베이션을 2-40℃에서 실시하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 리폴딩된 재조합 단백질을 제2 소수성 크로마토그래피 지지체 또는 이온 교환 지지체에 접촉시키고, 지지체로부터 리폴딩된 재조합 단백질을 선택적으로 용리시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 회수 단계 (d)가 재조합 단백질을 혼합 모드 지지체, 양이온 크로마토그래피 지지체, 제1 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체와 순차적으로 접촉시키는 단계, 및 각각의 지지체로부터 재조합 단백질을 선택적으로 용리시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
제19항에 있어서, 재조합 단백질을 제2 소수성 크로마토그래피 지지체 또는 이온 교환 지지체와 접촉시키고, 지지체로부터 재조합 단백질을 선택적으로 용리시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
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