EA020621B1 - Рефолдинг белков с использованием химически контролируемого окислительно-восстановительного состояния - Google Patents
Рефолдинг белков с использованием химически контролируемого окислительно-восстановительного состояния Download PDFInfo
- Publication number
- EA020621B1 EA020621B1 EA201270015A EA201270015A EA020621B1 EA 020621 B1 EA020621 B1 EA 020621B1 EA 201270015 A EA201270015 A EA 201270015A EA 201270015 A EA201270015 A EA 201270015A EA 020621 B1 EA020621 B1 EA 020621B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- protein
- refolding
- thiol
- buffer
- disulfide
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 195
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 195
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 80
- 239000006176 redox buffer Substances 0.000 claims abstract description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 181
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 96
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 43
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 28
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 23
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- -1 thiol disulfide Chemical class 0.000 claims description 21
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 claims description 18
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 17
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 claims description 16
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 16
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 16
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 14
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 14
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 14
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 14
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 12
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical class NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229940124272 protein stabilizer Drugs 0.000 claims description 11
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 10
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 10
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 10
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 9
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 8
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 7
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims description 7
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 7
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000000065 osmolyte Effects 0.000 claims description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 7
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 claims description 6
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims description 6
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 claims description 6
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 claims description 5
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 5
- MGJKQDOBUOMPEZ-UHFFFAOYSA-N N,N'-dimethylurea Chemical class CNC(=O)NC MGJKQDOBUOMPEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 5
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 claims description 5
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 claims description 5
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 claims description 5
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims description 5
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 claims description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- XGEGHDBEHXKFPX-UHFFFAOYSA-N N-methylthiourea Chemical class CNC(N)=O XGEGHDBEHXKFPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XGEGHDBEHXKFPX-NJFSPNSNSA-N methylurea Chemical class [14CH3]NC(N)=O XGEGHDBEHXKFPX-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims description 4
- RYECOJGRJDOGPP-UHFFFAOYSA-N Ethylurea Chemical class CCNC(N)=O RYECOJGRJDOGPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims 2
- 101001120470 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Peptidoglycan-associated lipoprotein Proteins 0.000 claims 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 claims 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 claims 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 30
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 30
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 30
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 27
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 description 17
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 15
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 15
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 13
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 12
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 12
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 12
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 10
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 10
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 4
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 2
- 229960003589 arginine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000011537 solubilization buffer Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001450 Alpha-Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241000204801 Muraenidae Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101000606416 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Acyltransferase PE Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 1
- 241001191185 Sarga Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000003570 air Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-RWMJIURBSA-N alpha-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO HFHDHCJBZVLPGP-RWMJIURBSA-N 0.000 description 1
- 229940043377 alpha-cyclodextrin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- NLEBIOOXCVAHBD-QKMCSOCLSA-N dodecyl beta-D-maltoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NLEBIOOXCVAHBD-QKMCSOCLSA-N 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 239000011241 protective layer Substances 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000001303 quality assessment method Methods 0.000 description 1
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 108020005087 unfolded proteins Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Раскрыт способ рефолдинга белка, экспрессия которого была осуществлена в экспрессионных системах организмов, не относящихся к млекопитающим, и присутствующего в концентрациях 2,0 г/л или выше. Способ включает идентификацию тиол-дисульфидного соотношения и окислительно-восстановительной силы буфера для достижения условий, при которых достижим эффективный фолдинг при концентрациях 2,0 г/л или выше, и может быть применен в диапазоне объемов, включая коммерческий масштаб.
Description
Данное изобретение относится в целом к рефолдингу белков при высоких концентрациях и более конкретно к рефолдингу белков при их концентрации в объемах 2,0 г/л и выше.
Уровень техники
Экспрессия рекомбинантных белков может производиться во множестве экспрессионных систем, включая клетки организмов, не являющихся млекопитающими, таких как бактерии и дрожжи. Трудность, связанная с экспрессией рекомбинантных белков в прокариотических клетках, таких как бактерии, - это осаждение продуцированных белков в виде внутриклеточных осадков с ограниченной растворимостью, в типичном случае относящихся к тельцам включения. Тельца включения формируются в результате неспособности бактериальной клетки-хозяина правильно сворачивать рекомбинантные белки при высоких уровнях экспрессии, вследствие чего белки становятся нерастворимыми. Это особенно справедливо в отношении прокариотической экспрессии больших, сложных или имеющих эукариотическое происхождение белковых последовательностей. Образование неправильно свернутых рекомбинантных белков в известной степени ограничивает коммерческое использование бактериальной ферментации для производства крупных, сложных рекомбинантных белков при высоком уровне эффективности.
С момента выхода на коммерческие уровни рекомбинантной экспрессии белков в экспрессионных системах организмов, не относящихся к млекопитающим, таких как бактерии, были разработаны различные способы для получения правильно свернутых белков из бактериальных телец включения. Эти способы обычно придерживаются процедуры экспрессии белка, который в типичном случае осаждается в тельцах включения, далее проводится лизинг клеток, сбор телец включения и затем солюбилизация телец включения в солюбилизационном буфере, содержащем денатурант или поверхностно-активное вещество и восстановитель (присутствие последнего необязательно), которые разворачивают белки и разделяют тельца включения на индивидуальные белковые цепи, почти лишенные структуры. Впоследствии белковые цепи промывают с помощью буфера для рефолдинга или разбавляют им, что поддерживает ренатурацию белка в биологически активную форму. Когда остатки цистеина присутствуют в первичной аминокислотной цепи белка, часто необходимо совершить рефолдинг в среде, которая обеспечивает правильное образование дисульфидных связей (например, в окислительно-восстановительной системе).
Типичная концентрация для осуществления рефолдинга сложных молекул, таких как молекулы, включающие две или более дисульфидные связи, составляет менее 2,0 г/л, а более обычно 0,01-0,5 г/л (Кибо1рЬ & ЬШе, (1996) РА8ЕВ 1. 10:49-56). Таким образом, рефолдинг больших масс сложных белков, таких как антитела, пептидные тела или другие гибридные Ре-белки, при производстве в промышленных масштабах ставит значительные ограничения, благодаря крупным объемам, которые требуются для рефолдинга белков при типичных концентрациях продукта, и это обычная проблема, стоящая перед индустрией. Одним из факторов, который ограничивает концентрацию этого типа белков, необходимую для рефолдинга, является некорректное формирование дисульфидных связей, которые могут последовательно увеличивать склонность этих форм белков к агрегации. Благодаря большим объемам материала и крупным размерам емкостей, предполагаемым при работе по производству белков в промышленных масштабах, значительное количество времени и ресурсов может быть сэкономлено путем устранения или упрощения одного или более этапов этого процесса.
Наряду с тем, что рефолдинг белков при более высоких концентрациях был показан и прежде, белки были либо значительно меньше по молекулярной массе, либо представляли собой менее сложные молекулы, содержащие только одну или две дисульфидные связи (см., например, Сте1дЬ1ои, (1974) 1. Мо1. Вю1. 87:563-577).
Кроме того, для рефолдинга таких белков использовали химические механизмы рефолдинга, основанные на применении детергентов (см., например, 81бске1 е! а1., (1997) Еиг. 1. ВюсЬет 248:684-691), или применяли стратегии фолдинга при высоком давлении (81 1оЬи е! а1., (2001) 1. Вю1. СЬет. 276(50):4685663). Более сложные молекулы, такие как антитела, пептидные тела или другие крупные белки, обычно не поддаются рефолдингу под действием детергентов и, как правило, подвергались рефолдингу в хаотропной среде. Эти более сложные молекулы часто имеют больше двух дисульфидных связей, часто количество дисульфидных связей лежит в интервале от 8 до 24, и могут быть многоцепочечными белками, которые образуют гомо- и гетеродимеры.
До настоящего открытия эти типы сложных молекул не могли подвергаться рефолдингу при высоких концентрациях, т.е. концентрациях 2,0 г/л и выше, со сколько-нибудь значимой степенью эффективности при малом масштабе и совершенно не подвергались ему в промышленном масштабе. Открытые способы, напротив, могут быть реализованы при высоких концентрациях в малом или большом (т.е. промышленном) масштабе, чтобы получить правильно свернутые сложные белки. Способность обеспечивать рефолдинг белков при высоких концентрациях и в больших масштабах может найти выражение не только в повышенной эффективности самой операции рефолдинга, но также означает экономию времени и себестоимости ввиду устранения нужды в дополнительном оборудовании и персонале. Следовательно, способ рефолдинга белков, присутствующих в высоких концентрациях, может быть претворен в
- 1 020621 повышенную эффективность и экономию затрат в процессе производства белка.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой серии графиков, изображающих влияние тиол-дисульфидного соотношения и окислительно-восстановительной силы буфера на распределение видов продукта;
фиг. 1А изображает влияние силы буфера величиной 5 мМ; фиг. 1В показывает влияние буфера силой 7,5 мМ; фиг. 1С показывает влияние буфера силой 10мМ; фиг. 1Ό показывает влияние буфера силой 12,5 мМ; фиг. 1Е показывает влияние буфера силой 15 мМ и фиг. 1Р показывает влияние буфера силой 20 мМ;
фиг. 2 представляет серию графиков, показывающих влияние степени аэрации на распределение видов при фиксированном тиол-дисульфидном соотношении и буферной силе тиол-дисульфидной системы;
фиг. 3 представляет аналитическое наложение химически контролируемого, неаэробного рефолдинга, осуществляемого при концентрации 6 г/л и оптимизированного путем осуществления описанного способа, в объемах от 1 до 2000 л.
Сущность изобретения
Способ рефолдинга белков, произведенных в экспрессионных системах организмов, не относящихся к млекопитающим, и присутствующих в объеме в концентрации 2,0 г/л или более, включает: (а) контакт белка с буфером для рефолдинга, содержащим окислительно-восстановительный компонент, окончательное тиол-дисульфидное соотношение находится в пределах от 0,001 до 100, и окислительновосстановительная сила буфера составляет 2 мМ или более и содержащим один или более компонентов из списка: (ί) денатурант; (ίί) супрессор агрегации и (ίίί) стабилизатор белка; для формирования смеси для рефолдинга; (Ь) инкубация смеси для рефолдинга и (с) выделение белка из смеси для проведения рефолдинга.
В различных вариантах окислительно-восстановительный компонент имеет окончательное тиолдисульфидное соотношение, большее или равное 0,001, но меньшее или равное 100, например в диапазоне от 0,05 до 50, от 0,1 до 50, от 0,25 до 50, от 0,5 до 50, от 0,75 до 40, от 1,0 до 50 или от 1,5 до 50, от 2 до 50, от 5 до 50, от 10 до 50, от 15 до 50, от 20 до 50, от 30 до 50 или от 40 до 50 и буферную силу тиолдисульфидной системы, равную или превышающую 2 мМ, например большую чем или равную 2,25, 2,5, 2,75, 3, 5, 7,5, 10 или 15 мМ, там, где буферная сила тиол-дисульфидной системы эффективно ограничена максимумом в 100 мМ. Переформулируя в терминах интервалов, сила тиолового буфера для формирования смеси может быть в интервале от 2 до 20 мМ, например между 2,25 и 20 мМ, 2,5 и 20 мМ, 2,75 и 20мМ, 3 и 20 мМ, 5 и 20 мМ, 7,5 и 20 мМ, 10 и 20 мМ или 15 и 20 мМ.
В одном из вариантов буфера для рефолдинга буфер включает мочевину, аргинин-НС1, цистеин и цистамин в Трис-буфере. В другом варианте компоненты присутствуют в буфере для рефолдинга, с учетом пропорций, описанных в примере 3.
В другом варианте буфер для рефолдинга содержит мочевину, аргинин-НС1, глицерин, цистеин и цистамин в Трис-буфере. В другом варианте компоненты присутствуют в буфере для рефолдинга с учетом пропорций, описанных в примере 4.
В некоторых вариантах белок изначально присутствует в объеме в ненативной форме с ограниченной растворимостью, такой как тельца включения. В альтернативном случае белок представлен в объеме в растворимой форме. Белок может быть рекомбинантным или эндогенным. Белок может быть сложным белком, таким как антитело, или многомерным белком. В другом варианте белок представляет собой конъюгат Ре-белка, такой как белок, сплавленный или сцепленный с доменом Рс.
Система экспрессии организмов, не являющихся млекопитающими, может быть бактериальной системой экспрессии или системой экспрессии дрожжей.
Денатурант в буфере для рефолдинга может быть выбран из группы, состоящей из мочевины, солей гуанидина, диметилмочевины, метилмочевины и этилмочевины. Стабилизатор белка в составе буфера для рефолдинга может быть выбран из группы, состоящей из аргинина, пролина, полиэтиленгликоля, неионных поверхностно-активных веществ, ионных поверхностно-активных веществ, многоатомных спиртов, глицерина, сахарозы, сорбита, глюкозы, Трис, натрия сульфата, калия сульфата и осмолитов. Супрессор агрегации может быть выбран из группы, состоящей из аргинина, пролина, полиэтиленгликоля, неионных поверхностно-активных веществ, ионных поверхностно-активных веществ, полигидрированных спиртов, глицерина, сукрозы, сорбита, глюкозы, Трис, натрия сульфата, калия сульфата и осмолитов. Тиол-дисульфидная система может содержать по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из восстановленного глутатиона, окисленного глутатиона, цистеина, цистина, цистеамина, цистемина и β-меркаптоэтанола.
В различных вариантах очистка может включать контакт смеси с аффинной сепарационной матрицей, такой как белок А или белок С. В альтернативном случае аффинная смола может быть представлена сепарационной матрицей смешанного типа или ионообменной сепарационной матрицей. В различных аспектах инкубация может быть произведена при аэробных условиях или при неаэробных условиях.
- 2 020621
Подробное описание изобретения
Соответствующая литература свидетельствует, что при оптимизации различных операций рефолдинга белка, тиол-дисульфидное отношение буфера для рефолдинга целенаправленно изменялось и, как результат, сила тиолового буфера неизвестным образом варьировала в широком диапазоне величин (см., например, ЬШе, 8сй\уаг/ & Кибо1рй (1998) Ситтей Θρίηίοη ίη Вю1есйпо1о§у 9(5):497-501, и Ттап-Мокетап, 8сйаиет & С1агк (1999) Рто1еш Ехртеккюп & Рипйсайоп 16(1): 181-189). В одном из исследований взаимосвязь между тиол-дисульфидным соотношением и буферной силой была изучена для лизоцима, простого одноцепочечного белка, который образует расплавленные глобулы (Эе Вегпагбе/ е1 а1., (1998) Вю1есйпо1. Ргод. 14:47-54). Работа Ое Ветагбе/ описывает концентрацию тиолов в терминах модели, учитывающей только кинетику реакции, идущей по единственному пути. Однако более сложные белки управляются обратимыми термодинамическими равновесиями, описать которые нелегко (см., например, ИатЪу е1 а1., (1995) 1. Мо1. Вю1. 249:463-477). Более сложное поведение ожидается в случае крупных мультицепочечных белков, содержащих много дисульфидных связей, таких как антитела, белковые антитела и другие гибридные Рс-белки. Вплоть до настоящего открытия не были исследованы специфические отношения между буферной силой тиол-дисульфидной системы, химией тиол-дисульфидного соотношения и концентрацией белка касательно сложных белков и в связи с эффективностью синтеза белка. Следовательно, способность к рефолдингу в высококонцентрированном объеме была в значительной степени неэффективной или недостижимой, что создавало критическое затруднение в производстве белка, особенно в промышленном масштабе.
До настоящего открытия специальные контролируемые исследования независимого влияния тиолдисульфидного соотношения и тиол-дисульфидной буферной силы не были раскрыты для сложных белков. Как описано в данном документе, путем контроля тиол-дисульфидной буферной силы вместе с тиолдисульфидным соотношением и концентрацией белка, эффективность операций сворачивания белка может быть оптимизирована и повышена и может быть достигнут рефолдинг белков при их высоких концентрациях, например 2 г/л и более.
Таким образом, в одном аспекте настоящее открытие относится к идентификации и контролю химии окислительно-восстановительного тиол-дисульфидного соотношения, что облегчает рефолдинг белка при высокой концентрации белка, такой как концентрация выше 2 г/л. Способ может быть применен к любому типу белка, включая простые белки и сложные белки (например, белки, включающие в себя от 2 до 23 дисульфидных связей или более 250 аминокислотных остатков или имеющие молекулярную массу свыше 20000 Да), включая белки, которые содержат домен Рс, такие как антитела, пептидные антитела и другие Рс-гибридные белки, и может быть выполнен в лабораторном масштабе (обычно в масштабе миллилитров и литров), в масштабе опытного завода (обычно сотни литров) или в промышленном масштабе (обычно тысячи литров). Примеры сложных молекул, известных как пептидные антитела, и других Рсгибридных белков описаны в патентах США №№ 6660843, 7138370 и 7511012.
Как описано в настоящем документе, взаимоотношения между силой тиолового буфера и окислительно-восстановительным тиол-дисульфидным соотношением изучены и оптимизированы, чтобы обеспечить воспроизводимый способ рефолдинга белков при концентрациях 2 г/л и выше в различных масштабах. Математическая формула была выведена для точного расчета соотношений и сил индивидуальных окислительно-восстановительных парных компонентов и получить матрицы буферного тиолдисульфидного соотношения и буферной тиоловой силы. Однажды установив эту взаимосвязь, стало возможно систематически демонстрировать, что силы тиолового буфера тиол-дисульфидного соотношения взаимодействуют, определяя распределение результирующих соединений, получаемых в реакции рефолдинга.
Буферное тиол-дисульфидное соотношение, однако, является только одним компонентом в определении тиол-дисульфидного соотношения всей системы в общей реакции. Так как остатки цистеина в развернутом белке также участвуют в реакции, буферная сила тиолов должна меняться пропорционально увеличению концентрации белка, чтобы достичь оптимального тиол-дисульфидного соотношения системы. Следовательно, дополнительно к демонстрации того, что буферная сила тиолов взаимодействует с тиол-дисульфидным соотношением, также показано, что эта буферная сила соотносится и с концентрацией белка в реакции в целом. Оптимизация буферной силы тиолов и тиол-дисульфидного соотношения системы может быть приспособлена к особенному белку, такому как сложный белок, чтобы минимизировать ошибочное спаривание цистеина и облегчить рефолдинг при высоких концентрациях.
I. Определения.
Используемое здесь выражение один означает одно или несколько, если специально не указано иное.
Используемый здесь термин экспрессионные системы организмов, не относящихся к млекопитающим означает системы для экспрессии белков в клетках, происходящих из организмов иных, чем млекопитающие, включая, не ограничиваясь, прокариоты, включая бактерии, такие как Е. сой, и дрожжи. Часто экспрессионные системы организмов, не относящихся к млекопитающим, используются для выработки интересующих рекомбинантных белков, тогда как в других случаях белок является эндогенным белком, экспрессия которого осуществляется клеткой организма, не относящегося к млекопитающим.
- 3 020621
Для целей настоящего открытия, безотносительно является ли целевой белок эндогенным или рекомбинантным, если экспрессия белка осуществляется в клетке организмов, не относящихся к млекопитающим, следовательно, эта клетка является экспрессионной системой организмов, не относящихся к млекопитающим. Сходным образом клетка организма, не относящегося к млекопитающим является клеткой, происходящей из организма иного, чем млекопитающие, примеры которых включают бактерии или дрожжи.
Используемый здесь термин денатурант означает любое соединение, имеющее способность удалять некоторые или все вторичные и третичные структуры белка при вступлении с этим белком в контакт. Термин денатурант относится к особым химическим соединениям, которые вызывают денатурацию, равно как и к растворам, содержащим особое вещество, вызывающее денатурацию. Примеры денатурантов, которые могут быть использованы в описываемом способе, включают, не ограничиваясь, мочевину, соли гуанидина, диметилмочевину, метилмочевину и их комбинации.
Используемый здесь термин супрессор агрегации означает любое соединение, имеющее способность разрывать и уменьшать или устранять взаимодействие между двумя или более белками. Примеры супрессоров агрегации могут включать, не ограничиваясь, аминокислоты, такие как аргинин, пролин и глицин; полиолы и сахара, такие как глицерин, сорбит, сахароза и трегалоза; поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат-20, СНАР8, Тритон Х-100 и додецил мальтозид и их комбинации.
Используемый здесь термин стабилизатор белка означает любое соединение, имеющее способность менять состояние равновесия реакции, так что нативное состояние белка улучшается или поддерживается. Примеры стабилизаторов белка могут включать, не ограничиваясь, сахара и многоатомные спирты, такие как глицерин и сорбит; полимеры, такие как полиэтиленгликоль и α-циклодекстрин; соли аминокислот, таких как аргинин, пролин и глицин, осмолиты и отдельные соли Хоффмейстера, такие как Трис, натрия сульфат и калия сульфат и их комбинации.
Используемый здесь термин Рс и Рс регион используются взаимозаменяемо и означают фрагмент антитела, которое заключает в себе человеческие или нечеловеческие (например, мурены) СН2 и СН3 иммуноглобулиновые домены или которые заключают в себе две соприкасающихся области, которые по меньшей мере на 90% идентичны человеческим или нечеловеческим СН2 и СН3 иммуноглобулиновым доменам. Участки Рс могут, но не обязаны, иметь способность взаимодействовать с Рс рецептором. См., например, публикацию Накешаии & Сарга, Иммуноглобулины: структура и функции в издании под ред. ^Нйаш Е. Раи1, Фундаментальная иммунология, Второе издание, 209, 210-218 (1989), включенной в настоящую заявку путем ссылки в полном объеме.
Используемые здесь термины белок и полипептид используются взаимозаменяемо и означают любую цепь по меньшей мере из пяти природным или неприродным способом сочетающихся аминокислот, соединенных пептидными связями.
Используемые здесь термины разделить и очистить используются взаимозаменяемо и означают сократить на 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% или более количество гетерогенных элементов, например, биологических макромолекул, таких как белки или ДНК, которые могут быть представлены в образце, содержащем целевой белок. Присутствие гетерогенных белков может быть проанализировано любым подходящим способом, включая высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), гель-электрофорез и окрашивание и/или иммуноферментный анализ. Присутствие ДНК и других нуклеиновых кислот может быть проанализировано любым подходящим способом, включая гель-электрофорез и окрашивание и/или тесты, использующие реакцию полимеразной цепи.
Используемый здесь термин сложная молекула означает любой белок, который а) имеет молекулярную массу более 20000 или заключает в себе более 250 аминокислотных остатков и б) содержит 2 или более дисульфидные связи в своей нативной форме. Сложная молекула может, но не обязательно, образовывать мультимеры. Примеры сложных молекул включают, не ограничиваясь, антитела, пептидные антитела и другие химерические молекулы, содержащие Рс-домен и другие крупные белки. Примеры сложных молекул, известных как пептидные антитела, и других гибридных Рс-молекул описаны в патентах США №№ 6660843, 7138370 и 7511012.
Используемый здесь термин пептидное антитело относится к полипептидам, состоящим из одного или более биоактивных пептидов, соединенных вместе, необязательно посредством линкеров, с доменом Рс. См. патенты США №№ 6660843, 7138370 и 7511012, где приведены примеры пептидных антител.
Используемый здесь термин рефолдинг означает процесс возвращения вторичной и третичной структуры белку, вторичная или третичная структуры которого были частично или полностью утрачены, будь то ίη νίίτο или ίη νίνο, т.е. в результате условий экспрессии или преднамеренной денатурации и/или редукции. Следовательно, белок после рефолдинга представляет собой белок, у которого до некоторой степени или полностью восстановлена его нативная вторичная и третичная структура.
Используемый здесь, термин буферное тиол-дисульфидное соотношение определяется взаимоотношением восстановленных и окисленных редокс-соединений, используемых в буфере для рефолдинга, как показано в уравнении 1.
- 4 020621
Уравнение 1.
Определение буферного тиол-дисульфидного соотношения (ТДС) [восстановитель]3 _ [цистеин]2 [окислитель] [цистамин]
Используемый здесь термин буферная сила тиолов, сила тиол-дисульфидного буфера и сила тиол-дисульфидной системы используются взаимозаменяемо и определены в уравнении 2, т.е. как полная моноэквивалентная концентрация тиола, где полная концентрация представляет сумму концентрации восстановленных и удвоенной концентрации окисленных соединений.
Уравнение 2.
Определение буферной силы тиол-дисульфидной системы/буферной силы (БС) тиолов Сила тиол-дисульфидной системы=2[окислитель]+[восстановитель]=2[цистамин]+[цистеин]
Взаимоотношение между тиол-дисульфидным соотношением и силой буферной тиолдисульфидной системы описаны в уравнениях 3 и 4.
Уравнение 3.
Расчет восстановленных окислительно-восстановительных соединений в отношении к определенной окислительно-восстановительной буферной силе (БС) и буферному окислительно-восстановительному потенциалу
Концентрация восстановленного редокс компонента = (Vбуферное _ ТДС2 + 8 * буферное __ ТДС *БС ) - буферное _ ТДС
Уравнение 4.
Расчет окисленных окислительно-восстановительных соединений в отношении к определенной окислительно-восстановительной буферной силе (БС) и буферному окислительно-восстановительному потенциалу
Концентрация окисленного редокс компонента = (Концентрация _ восстановленного _ редокс _ компонента)2 ТДС
Используемый здесь термин окислительно-восстановительный компонент означает любой содержащий тиоловую группу химический препарат или раствор, содержащий такой химический препарат, который способен к двустороннему обмену с другим тиолом или цистеиновым остатком белка. Примеры таких соединений включают, не ограничиваясь, окисленный глутатион, восстановленный глутатион, цистеин, цистин, цистеамин, цистамин, β-меркаптоэтанол и их комбинации.
Используемый здесь термин солюбилизация означает процесс, в котором соли, ионы, денатуранты, детергенты, восстановители и/или другие органические молекулы добавляются к раствору, содержащему целевой белок, таким образом, удаляя в некоторой степени или целиком вторичную и/или третичную структуру белка и растворяют белок в растворителе. Этот процесс может включать использование повышенной температуры, обычно 10-50°С, но более обычно 15-25°С, и/или щелочной рН, такой как рН 7-12. Солюбилизация может быть также достигнута добавлением кислот, таких как 70% муравьиная кислота (см., например, Со\у1су & Маскш (1997) ΡΕΒδ Ьей 402:124-130).
Солюбилизованный белок представляет собой белок, в котором в некоторой степени или полностью удалены вторичная и/или третичная структуры.
Солюбилизационный пул представляет собой объем раствора, содержащего в себе солюбилизованный целевой белок, а также соли, ионы, денатуранты, детергенты, восстановители и/или другие органические молекулы, выбранные для солюбилизации белка.
Используемый здесь термин неаэробные условия означает любые условия реакции или культивирования, которые осуществляются в отсутствие интенсивной аэрации смеси механическими или химическими способами. При неаэробных условиях может присутствовать кислород, поскольку он присутствует естественным образом, и не добавлялся в систему целенаправленно. Неаэробные условия могут быть достигнуты, например, путем ограничения переноса кислорода в реакционный раствор, путем ограничения давления в свободном пространстве над продуктом, отсутствием или ограниченным контактом с воздухом или кислородом, содержащимся в емкости для выдержки, воздушным или кислородным поверхностным слоем, отсутствием специальных приспособлений для учета массопереноса при масштабировании процесса или отсутствием обработки газом или перемешивания для усиления присутствия кислорода в системе. Неаэробные условия могут также быть достигнуты путем интенсивного ограничения или удаления кислорода из системы путем химических обработок, поверхностного наложения или подачи под давлением инертного газа, наложением вакуума или впрыскиванием газов, таких как аргон или азот, в результате чего уменьшается концентрация кислорода в реакционной смеси.
Используемые здесь, термины ненативный и ненативная форма используются взаимозаменяемо, и когда используются в контексте целевого белка, такого как белок, содержащий домен Рс, означают, что
- 5 020621 белок не имеет по меньшей мере одного из признаков, формирующих его структуру, обнаруженного у формы белка, которая является биологически активной в соответствующей пробе ίη νίνο или ίη νίίτο, предназначенной, чтобы проанализировать биологическую активность белка. Примеры структурных особенностей, которые могут отсутствовать в ненативной форме белка, могут включать, не ограничиваясь, дисульфидную связь, четвертичную структуру, разорванную вторичную или третичную структуру или состояние, которое делает белок биологически неактивным в соответствующей пробе. Белок в ненативной форме может, но не обязательно, формировать агрегаты.
Используемый здесь термин ненативная форма, имеющая ограниченную растворимость, когда используется в контексте целевого белка, такого как белок, содержащий домен Рс, означает любую форму или состояние, в которых белок не имеет по меньшей мере одной структурной особенности, найденной в форме белка, которая а) биологически активна в соответствующей пробе ίη νίνο или ίη νίίτο, предназначенной, чтобы проанализировать биологическую активность белка, и/или б) формирует агрегаты, которые требуют обработки, такой как химическая обработка, чтобы стать растворимыми. Термин специфически включает белки, которые существуют в тельцах включения, тех, которые иногда обнаруживаются, когда рекомбинантный белок вырабатывается в экспрессионных системах организмов, не относящихся к млекопитающим.
II. Теория.
Рефолдинг молекул микробного происхождения, присутствующих в объеме в концентрациях 2 г/л и выше, является выгодным по целому ряду соображений, преимущественно из-за уменьшения реакционных объемов и усиления процесса во всех отношениях. Точки зрения масштабирования процесса выгодно осуществлять рефолдинг при обстоятельствах, когда не требуются аэробные условия; такие условия могут быть достигнуты постоянным или периодическим добавлением кислорода или воздуха в свободное пространство над реакционной смесью, нагнетанием парогазовой фазы или путем высокоэффективного перемешивания. Поскольку концентрация кислорода в системе связана с массопереносом, масштабирование реакции рефолдинга становится существенно более трудным из-за влияния таких факторов, как геометрия реакционного сосуда, объем и изменения, связанные с перемешиванием. Кроме того, кислород может не участвовать непосредственно в формировании дисульфидных связей в белке, делая прямую связь с коэффициентом массопереноса недостоверной. Это дополнительно осложняет масштабирование реакции. Следовательно, неаэробные, химически контролируемые окислительновосстановительные системы предпочтительны для рефолдинга белков. Примеры таких условий предусмотрены настоящим документом.
Оптимальная химия рефолдинга для данного белка представляет собой точный баланс, который максимизирует свернутое/окисленное состояние и одновременно минимизирует нежелательные продукты реакции, такие как агрегаты, несформированные дисульфидные связи (например, восстановленные цистеиновые пары), некорректное образование дисульфидных связей (которое приводит к неправильному сворачиванию белка), окисление аминокислотных остатков, деамидацию аминокислотных остатков, некорректную вторичную структуру, и связанные с продуктом аддукты (например, цистеиновые или цитеаминовые аддукты). Одним фактором, который является важным в достижении этого баланса, является окислительно-восстановительное состояние системы рефолдинга. Окислительно-восстановительное состояние подвержено влиянию многих факторов, включая, не ограничиваясь, количество остатков цистеина, содержащихся в белке, соотношение и концентрацию окислительно-восстановительных пар химических препаратов, содержащихся в растворе для рефолдинга (например, цистеина, цистина, цистамина, цистеамина, восстановленного глутатиона или окисленного глутатиона), концентрацию восстановителей, переносимых из солюбилизационного буфера (например, ДТТ, глутатиона и βмеркаптоэтанола), содержание тяжелых металлов в смеси и концентрацию кислорода в растворе.
Тиол-дисульфидное соотношение и буферная сила тиол-дисульфидной системы определены в уравнениях 1 и 2, используя цистеин и цистамин как примеры окислителя и восстановителя соответственно. Эти величины, соединенные с концентрацией белка и восстановителя, переносимого из процесса солюбилизации, могут быть факторами в достижении баланса между тиол-дисульфидным соотношением и буферной силой тиол-дисульфидной системы.
Фиг. 1 показывает влияние тиол-дисульфидного соотношения и буферной силы тиол-дисульфидной системы на распределение связанных с продуктом соединений, визуализированное посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой, для сложных димерных белков. На фиг. 1А-1Р точечные линии представляют белковые соединения с окисленными аминокислотными остатками, виды с единичной цепью и стабильную смесь дисульфидных промежуточных продуктов, пунктирные линии представляют неспаренные, некорректно сформированные дисульфидные белковые соединения и белковые соединения с частично несформированным дисульфидными связями. Сплошные линии представляют правильно свернутые белки. Фиг. 1А-1Р демонстрируют, что при постоянной концентрации 6 г/л, по мере увеличения силы тиол-дисульфидного буфера, тиол-дисульфидное соотношение, требуемое для сопоставимого распределения компонентов реакции, также должно быть увеличено. Например, как показано на фиг. 1, если буферная сила увеличивается с 5 до 10 мМ, то сбалансированное тиол-дисульфидное соотношение должно быть примерно в 2 раза выше, чтобы достичь сопоставимого
- 6 020621 распределения соединений. Это происходит в основном из-за увеличения буферного эффекта восстановителя, перенесенного из реакции солюбилизации на тиол-дисульфидное соотношение системы в целом. При более низкой восстановительной силе буфера систему в целом становится труднее контролировать. Концентрация белка и число цистеинов, содержащихся в белковой последовательности, также связаны с минимально необходимой буферной силой, требуемой для контроля системы. Ниже определенной точки, которая от белка к белку будет меняться, концентрация тиолов в белке подавляет химию окислительновосстановительных пар и ведет к невоспроизводимым результатам.
В результатах, показанных на фиг. 1, когда тиол-дисульфидное соотношение раствора для рефолдинга направлено в сторону усиления восстановительных свойств, распределение результирующих продуктов меняется в сторону образования более восстановленных соединений (пунктирные линии). Когда тиол-дисульфидное соотношение раствора для рефолдинга направленно снижается, или окислительные свойства усиливаются, распределение результирующих продуктов сдвигается в сторону образования более окисленных остатков, формирования одиночных цепей, стабильных смешанных дисульфидных промежуточных продуктов (точечные линии). Возможность выбирать оптимальное тиол-дисульфидное соотношение и буферную силу тиол-дисульфидной системы позволяет оптимизировать выход целевого белка в свернутой форме. Этот оптимизированный выход продукта может быть достигнут путем максимизации массы или производимого количества свернутого целевого белка в объеме, где осуществляется рефолдинг, или путем целенаправленного изменения выхода нежелательных сопутствующих продукту соединений, которые с большей легкостью удаляются при последующей очистке, и таким образом в целом приводит к возникновению преимуществ в смысле увеличения выхода продукта или его чистоты.
Оптимизация окислительно-восстановительного компонента тиол-дисульфидного соотношения и буферной силы тиол-дисульфидной системы может быть выполнена для каждого белка. Матрица или серия многофакторных матриц может быть рассчитана для оптимизации реакции рефолдинга, для условий, которые оптимизируют выход продукта или распределение целевых компонентов. Оптимизирующий отбор может быть основан на учете химии окислительно-восстановительных процессов, тиолдисульфидного соотношения и буферной силы тиол-дисульфидной системы, времени культивирования, концентрации белка и рН в полной или частичной факториальной матрице, где каждый компонент варьирует в пределах определенного диапазона, включающего по меньшей мере три уровня концентрации или рН, при условии, что все другие параметры остаются постоянными. Завершение реакций может быть оценено путем ОВ-ВЭЖХ или эксклюзионной ВЭЖХ для выхода продукта, а оценка качества - путем применения стандартных инструментов многомерной статистики.
III. Способ рефолдинга белка, произведенного в экспрессионной системе организмов, не относящихся к млекопитающим, и присутствующего в объеме в концентрации 2 г/л или более.
Раскрытый способ рефолдинга в особенности пригоден для рефолдинга белков, выработанных в экспрессионной системе организмов, не относящихся к млекопитающим. Как отмечено в настоящем документе, клетки организмов, не относящихся к млекопитающим, могут быть перестроены таким образом, чтобы производить рекомбинантные белки, экспрессия которых осуществляется внутриклеточно в растворимой или совершенно нерастворимой, или ненативной форме с ограниченной растворимостью. Часто клетки будут помещать рекомбинантные белки в крупные нерастворимые или ограниченно растворимые агрегаты, именуемые тельцами включения. Однако определенные условия роста клетки (т.е. температура или рН) могут быть модифицированы, чтобы побудить клетки производить рекомбинантный белок в форме внутриклеточных растворимых мономеров. В качестве альтернативы производству белков в виде нерастворимых телец включения, белки могут вырабатываться, как растворимые белки, включая белки, содержащие участок Рс, которые могут быть извлечены непосредственно из клеточного лизата, посредством аффинной хроматографии. Захват непосредственно из лизата позволяет использовать в процессе рефолдинга относительно чистый белок и избегать очень интенсивных процедур сбора и выделения, необходимых при обращении с тельцами включения. Способ рефолдинга не ограничен, однако, образцами, очищенными путем аффинной хроматографии, и может быть применен к любому образцу, включающему белки, продуцированные экспрессионной системой организмов, не относящихся к млекопитающим, такие как белки, находящиеся в объеме клеточного лизата (т.е. белки, которые не подвергались никакой очистке).
В одном аспекте настоящее раскрытие относится к способам рефолдинга белка, выработанного в экспрессионной системе организмов, не относящихся к млекопитающим, в растворимой форме и присутствующего в объеме в концентрации 2,0 г/л или более, такого как белок, который был очищен посредством аффинной хроматографии от продуктов лизиса клеток организмов, не относящихся к млекопитающим, в которых происходила его экспрессия. Хотя этот объем может быть получен на любой стадии процесса очистки, в одном примере он представлен объемом элюата, полученного при аффинной хроматографии (например, объем элюата белка А). В другом примере объем находится в потоке процесса. Способ не ограничивается белками, содержащими домен Рс, однако, может быть применен к любой разновидности пептида или белка, выработанного в растворимой форме и извлеченного из лизата клеток организмов, не относящихся к млекопитающим. Изолированный растворимый белок часто получают из клеток организмов, не относящихся к млекопитающим, в восстановленной форме, и затем он может быть
- 7 020621 подготовлен к рефолдингу путем добавления денатуранта, такого как хаотропное вещество. Дальнейшее сочетание со стабилизатором белка, супрессором агрегации и окислительно-восстановительные компоненты при оптимизированном тиол-дисульфидном соотношении и тиол-дисульфидной буферной силе дает возможность рефолдинга при концентрациях 1-40 г/л, например концентрациях 10-20 г/л.
В одном из вариантов способа белок был выработан в экспрессионной системе организма, не относящегося к млекопитающим, и извлечен из клетки, где проводилась экспрессия, путем лизиса под высоким давлением. Затем белок был захвачен из лизата путем аффинной хроматографии с белком А и присутствует в объеме в концентрации 10 г/л и более. Белок затем контактирует с буфером для рефолдинга, содержащим денатурант, супрессор агрегации, стабилизатор белка и окислительно-восстановительный компонент, где окислительно-восстановительный компонент имел окончательное тиол-дисульфидное соотношение (как определено здесь) в диапазоне от 0,001 до 100, например в диапазоне от 0,05 до 50, от 0,1 до 50, от 0,25 до 50, от 0,5 до 50, от 0,75 до 40, от 1,0 до 50 или от 1,5 до 50, от 2 до 50, от 5 до 50, от 10 до 50, от 15 до 50, от 20 до 50, от 30 до 50 или от 40 до 50 и буферную силу тиол-дисульфидной системы (как определено в настоящем документе), равную или более 2 мМ, например больше чем или равную 2,25, 2,5, 2,75, 3, 5, 7,5, 10 или 15 мМ, тогда как тиол-дисульфидная буферная сила эффективно ограничена максимумом 100 мМ. Формулируя в терминах диапазонов буферная сила тиолов лежит в диапазоне от 2 до 20 мМ, например между 2,25 и 20 мМ, 2,5 и 20 мМ, 2,75 и 20 мМ, 3 и 20 мМ, 5 и 20 мМ, 7,5 и 20 мМ, 10 и 20 мМ или 15 и 20 мМ.
В другом аспекте настоящее раскрытие относится к способу рефолдинга белка, выработанного в экспрессионной системе организма, не относящегося к млекопитающим, в нерастворимой или ограниченно растворимой форме, такой как тельца включения. Когда белок откладывается в тельцах включения, тельца включения могут быть собраны из лизированных клеток, отмыты, а затем подвергнуты концентрированию и рефолдингу.
Оптимизация буфера для рефолдинга может быть произведена для каждого белка и каждой конечной концентрации белка отдельно, используя новаторский способ, представляемый данным документом. Как показано в примерах, хорошие результаты могут быть получены при рефолдинге белка, содержащего участок Рс, если буфер содержит денатурант (например, мочевину или другой хаотропный агент, органический растворитель или сильный детергент), супрессор агрегации (например, мягкий детергент, аргинин или полиэтиленгликоль в низких концентрациях), стабилизатор белка (например, глицерин, сахароза или другой осмолит, соли) и окислительно-восстановительные компоненты (например, цистеин, цистамин, глутатион). Оптимальное тиол-дисульфидное соотношение и окислительно-восстановительная буферная сила могут быть определены, используя экспериментальную матрицу тиол-дисульфидного соотношения (которое может иметь диапазон от 0,001 до 100, например от 0,05 до 50, от 0,1 до 50, от 0,25 до 50, от 0,5 до 50, от 0,75 до 40, от 1,0 до 50 или от 1,5 до 50, от 2 до 50, от 5 до 50, от 10 до 50, от 15 до 50, от 20 до 50, от 30 до 50 или от 40 до 50) против тиол-дисульфидной буферной силы (которая может быть более 2 мМ, например более чем или равна 2,25, 2,5, 2,75, 3, 5, 7,5, 10 или 15 мМ, там, где тиолдисульфидная буферная сила эффективно ограничена максимумом 100 мМ. Переформулируя в терминах диапазонов буферная сила тиол-дисульфидной системы может находиться в диапазоне между 2 и 20 мМ, например между 2,25 и 20 мМ, 2,5 и 20 мМ, 2,75 и 20 мМ, 3 и 20 мМ, 5 и 20 мМ, 7,5 и 20 мМ, 10 и 20 мМ или 15 и 20 мМ, в зависимости от концентрации белка и концентрации восстановителя, использованного для солюбилизации телец включения). Условия могут быть оптимизированы, используя новаторские способы, описанные в примере 2.
В одном из частных вариантов способа белок выработан в экспрессионной системе организмов, не относящихся к млекопитающим, и присутствует в объеме в концентрации 2,0 г/л или более. Белок контактирует с буфером для рефолдинга, содержащим денатурант, супрессор агрегации, стабилизатор белка и окислительно-восстановительный компонент, где окислительно-восстановительный компонент имеет окончательное тиол-дисульфидное соотношение (как описано в настоящем документе), имеющее диапазон от 0,001 до 100, например от 0,05 до 50, от 0,1 до 50, от 0,25 до 50, от 0,5 до 50, от 0,75 до 40, от 1,0 до 50 или от 1,5 до 50, от 2 до 50, от 5 до 50, от 10 до 50, от 15 до 50, от 20 до 50, от 30 до 50 или от 40 до 50, и тиол-дисульфидную буферную силу (как описано в настоящем документе), равную или большую 2 мМ, например более чем или равную 2,25, 2,5, 2,75, 3, 5, 7,5, 10 или 15 мМ, где тиол-дисульфидная буферная сила эффективно ограничена максимумом 100 мМ. Переформулируя в терминах диапазонов тиол-дисульфидная буферная сила может находиться в диапазоне между 2 и 20 мМ, например между 2,25 и 20 мМ, 2,5 и 20 мМ, 2,75 и 20 мМ, 3 и 20 мМ, 5 и 20 мМ, 7,5 и 20 мМ, 10 и 20 мМ или 15 и 20 мМ для формирования смеси. Широкий диапазон типов денатурантов может быть использован в буфере для рефолдинга. Примерами некоторых обычных денатурантов, используемых в буфере для осуществления рефолдинга, являются мочевина, гуанидин, диметилмочевина, метилмочевина или этилмочевина. Специфическая концентрация денатуранта может быть определена установленным способом оптимизации, как описано в настоящем документе.
Широкий диапазон стабилизаторов или супрессоров агрегации может быть использован в буфере для рефолдинга. Примеры некоторых обычных супрессоров агрегации, используемых в буфере для осуществления рефолдинга, включают аргинин, пролин, полиэтиленгликоль, неионные поверхностно- 8 020621 активные вещества, ионные поверхностно-активные вещества, многоатомные спирты, глицерин, сукрозу, сорбитол, глюкозу, Трис, натрия сульфат, калия сульфат, другие осмолиты или сходные соединения. Специфическая концентрация супрессора агрегации может быть определена установленным способом оптимизации, как описано в настоящем документе.
Окислительно-восстановительный компонент буфера для рефолдинга может быть любого состава с учетом, что окончательное тиол-дисульфидное соотношение окислительно-восстановительного компонента должно лежать в диапазоне от 0,001 до 100, например от 0,05 до 50, от 0,1 до 50,от 0,25 до 50, от 0,5 до 50, от 0,75 до 40, от 1,0 до 50 или от 1,5 до 50, от 2 до 50, от 5 до 50, от 10 до 50, от 15 до 50, от 20 до 50, от 30 до 50 или от 40 до 50, а тиол-дисульфидная буферная сила быть равна или больше 2 мМ, например большей или равной 2,25, 2,5, 2,75, 3, 5, 7,5, 10 или 15 мМ, где тиол-дисульфидная буферная сила эффективно ограничена максимумом 100 мМ. Переформулируя в терминах диапазонов буферная сила тиол-дисульфидной системы может находиться в диапазоне между 2 и 20 мМ, например между 2,25 и 20 мМ, 2,5 и 20 мМ, 2,75 и 20 мМ, 3 и 20 мМ, 5 и 20 мМ, 7,5 и 20 мМ, 10 и 20 мМ или 15 и 20 мМ. Способы идентификации подходящего окислительно-восстановительного компонента, т.е. подходящих величин тиол-дисульфидного соотношения и буферной силы, известен и/или описан в настоящем документе. Примеры специфических тиольных пар, которые могут формировать окислительно-восстановительный компонент, могут включать одно или более из следующих веществ: восстановленный глутатион, окисленный глутатион, цистеин, цистин, цистеамин, цистемин и β-меркаптоэтанол. Окислительновосстановительный компонент может быть оптимизирован, как описано в настоящем документе.
После того как белок вступит в контакт с окислительно-восстановительным компонентом, имеющим перечисленные значения тиол-дисульфидного соотношения и окислительно-восстановительной буферной силы, чтобы сформировать смесь для рефолдинга, эта смесь должна быть затем инкубирована в течение желаемого промежутка времени. Инкубация может быть проведена в неаэробных условиях, как описано в настоящем документе. Неаэробные условия не требуют совершенно освободиться от присутствия кислорода, но только отказаться от целенаправленного введения его добавочных количеств по сравнению с тем, которое содержалось в начальной системе. Инкубационный период варьирует и выбирается таким образом, чтобы достичь стабильного состояния смеси для рефолдинга, с желаемыми аналитическими свойствами. Период инкубации может длиться, например, 1 ч, 4 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч или дольше. Благодаря чувствительности рефолдинга при высоких концентрациях к содержанию кислорода в системе и тенденции к усилению кислородного массопереноса при малом масштабе методология и/или техника могут быть усовершенствованы, чтобы контролировать содержание кислорода и поддерживать неаэробные условия на этапе инкубации. В одном варианте процедура может включать приготовление, распределение и смешивание всех компонентов рефолдинга под покровом из инертного газа, такого как азот или аргон, чтобы избежать поступления кислорода в реакцию. Этот подход особенно полезен при идентификации приемлемой величины тиол-дисульфидного соотношения. В другом варианте, полезном при работе в масштабах от 15 л или меньше, свободное пространство в реакторе для рефолдинга, содержащего белок и буфер, можно продувать смесью инертного газа и воздуха или кислорода, запечатать реакционный сосуд и проводить смешивание при низкой скорости ротации в течение инкубационного периода. После инкубации белок выделяют из смеси для рефолдинга. Извлечение может быть достигнуто с использованием любого известного способа очистки белка. Если белок содержит домен Ре, например, то подходящим способом для его выделения является взаимодействие с белком А. В других вариантах могут быть использованы различные стратегии колоночной хроматографии в зависимости от природы извлекаемого белка. Примеры включают Н1С, АЕХ, СЕХ и БЕС хроматографию. Также могут быть рассмотрены нехроматографические методы разделения, такие как осаждение с солью, кислотой или полимером, таким как полиэтиленгликоль (см., например, публикацию США 20080214795). Другой альтернативный способ выделения белка из компонентов рефолдинга может включать диализ или диафильтрацию в фильтрационной системе с тангенциальным потоком.
В других примерах проведения рефолдинга тельца включения, полученные из экспрессионных систем организмов, не относящихся к млекопитающим, солюбилизуют в диапазоне содержания белка от 10 до 100 г/л и более, обычно 20-40 г/л примерно в течение 10-300 мин. Солюбилизованные тельца включения затем разбавляют, чтобы добиться восстановления денатурантов и восстановителей в растворе до уровня, который позволяет осуществление рефолдинга. В результате разбавления концентрация белка в буфере для рефолдинга, содержащем мочевину, глицерин или сахарозу, аргинин и окислительновосстановительную пару (например, цистеин и цистамин), находится в диапазоне от 1 до 15 г/л. В одном варианте окончательный состав включает 1-4 М мочевины, 5-40% глицерина или сахарозы, 25-500 мМ аргинина, 0,1-10 мМ цистеина и 0,1-10 мМ цистамина. Затем раствор перемешивается в течение инкубации, которая продолжается от 1 ч до 4 дней.
Как отмечено в настоящем документе, открытый способ особенно полезен для белков, экспрессия которых осуществлялась в экспрессионных системах организмов, не относящихся к млекопитающим, и более конкретно в бактериальных системах, в которых белок продуцируется в форме телец включения внутри бактериальной клетки. Белок может быть сложным белком, т.е. белком, который а) имеет молекулярную массу свыше 20000 или содержит более 250 аминокислотных остатков и б) содержит две или
- 9 020621 более дисульфидных связи в нативной форме. Когда экспрессия белка осуществляется в форме телец включения, вероятно, что любая дисульфидная связь, найденная в нативной форме, будет деформирована или не образуется вообще. Открытый способ применим к этим и другим формам целевых белков. Специфические примеры белков, которые могут быть подвергнуты данному способу рефолдинга, включают антитела, которые традиционно очень трудно поддаются рефолдингу, выполняемому обычными способами, при высоких концентрациях из-за их относительно крупного размера и числа дисульфидных связей. Способ также может быть использован для рефолдинга других молекул, содержащих фрагмент Рс, таких как пептидные антитела, и более широко при рефолдинге любых гибридных белков на основе домена Рс.
Другим аспектом раскрытого способа является его масштабируемость, которая позволяет реализовать его при любых масштабах, от лабораторного масштаба до производственного или коммерческого масштаба. Действительно, раскрытый способ найдет особое применение в коммерческом масштабе, где он может быть использован для эффективного рефолдинга больших количеств белка.
Данное раскрытие будет теперь проиллюстрировано ссылками на следующие примеры, которые изложены в отдельных вариантах. Однако следует отметить, что эти варианты носят иллюстративный характер и их не следует рассматривать как ограничивающие изобретение тем или иным образом.
Примеры
Примеры, представленные здесь, демонстрируют, что тиол-дисульфидное соотношение и окислительно-восстановительная буферная сила имеют большое значение в достижении эффективной реакции рефолдинга, не чувствительной к влияниям окружающей среды и аэрации. Нечувствительность является преимуществом с точки зрения легкости масштабирования и на уровне промышленного и коммерческого масштаба, при переносе процесса с одного завода на другой.
Примеры также демонстрируют, что при типичных для реакции рефолдинга концентрациях (0,012,0 г/л) чувствительность к внешней аэрации относительно понижена. Однако при концентрациях от 2 г/л и выше чувствительность реакции рефолдинга к тиол-дисульфидному соотношению и окислительновосстановительной буферной силе увеличивается, и почти все химические компоненты, особенно окислительно-восстановительные компоненты, возможно, необходимо будет корректировать, с учетом изменений в концентрации белка в реакции.
Пример 1. Экспрессия рекомбинантного белка.
В одном из экспериментов была осуществлена экспрессия рекомбинантных белков, включающих фрагмент Рс в экспрессионной системе организмов, не относящихся к млекопитающим, а именно Е. сой, и доведена до формирования цитоплазматических отложений в форме телец включения. Для каждого белка, подвергаемого рефолдингу, последовала следующая процедура.
После завершения фазы экспрессии клеточный бульон был центрифугирован и жидкая фаза удалена, оставив клетки в виде пасты. Клетки были ресуспендированы в воде приблизительно до 60% исходного объема. Затем клетки лизировали путем троекратного пропускания через гомогенизатор высокого давления. После того как клетки были лизированы, лизат был центрифугирован в тарельчатом сепараторе, чтобы собрать в твердой фракции белок, который был получен в ограниченно растворимой ненативной форме, именно в виде телец включения. Белковую массу многократно отмывали путем многократного ресуспендирования собранной твердой фазы в воде в количестве 50-80% от исходного объема ферментационного бульона, смешивания и центрифугирования, чтобы собрать белок в твердой фракции. Окончательно отмытые тельца включения были собраны и хранились в замороженном виде.
Пример 2. Идентификация условий рефолдинга/окислительно-восстановительных компонентов.
Были произведены нескольких сложных белков микробного происхождения. Каждый белок был солюбилизован при соответствующем уровне гуанидина и/или мочевины, обычно при уровнях, эквивалентных 4-6 М гуанидина, или 4-9 М мочевины, или сочетания обоих денатуратов, которые полностью денатурировали белок. Белок был редуцирован в присутствии ДТТ, 5-20 мМ, при рН 8,5 и выдержан при комнатной температуре примерно в течение 1ч.
Идентификация буфера для рефолдинга была произведена для каждого белка. Многофакторная матрица или серия многофакторных матриц были рассчитаны, чтобы индивидуализировать реакцию рефолдинга для достижения условий, оптимизирующих выход продукта и минимизирующих образование агрегатов. Был установлен идентификационный экран, чтобы систематически оценивать содержание мочевины, аргинина, глицерина и рН в многофакторной матрице, в которой каждый компонент варьировал в диапазоне по меньшей мере трех значений концентрации или уровней рН, при условии сохранения постоянства остальных параметров. Завершенные реакции были оценены с точки зрения выхода продукта и его качества методами обращенно-фазовой ВЭЖХ и гель-хроматографии, используя стандартные инструменты многомерного статистического анализа.
Лучшие результаты, выявленные как методами хроматографии обращенной фазы, так и гельхроматографии, наблюдались при использовании буфера для рефолдинга, содержащего денатурант (например, мочевину, диметилмочевину или другой хаотропный агент в диапазоне от уровней, не вызывающих денатурации, до уровней между 1 и 4 М), супрессор агрегации (например, аргинин при уровнях содержания между 5 и 500 мМ), стабилизатор белка (например, глицерин или сахарозу при уровнях со- 10 020621 держания между 5 и 40% (мас./об.) и окислительно-восстановительный компонент (например, цистеин или цистамин). Тиол-дисульфидное соотношение и окислительно-восстановительная сила буфера определяются, используя экспериментальную матрицу тиол-дисульфидного соотношения (от 0, до 100, более типично от 1 до 25) против буферной силы (типично от 2 до 20 мМ в зависимости от концентрации белка, числа цистеиновых остатков в белке и концентрации восстановителя, использованного для солюбилизации телец включения).
Индивидуальные реакции, возникающие при различных уровнях цистеина и цистамина, допускаются контролируемой матрицей тиол-дисульфидного соотношения при различных значениях окислительно-восстановительной силы буфера. Взаимоотношения рассчитаны, используя уравнения 3 и 4. Каждое состояние было показано как при аэробных, так и при неаэробных условиях, используя методики, описанные здесь. Были выбраны оптимальные условия, чтобы получить стабильный баланс между выходом продукта и желательным распределением продуктов фолдинга, нечувствительность к окислителям, присутствующим в окружающей среде (например, воздуху) и к нормальному варьированию ДТТ, переносимого из этапа солюбилизации.
Пример 3. Рефолдинг при высокой концентрации ненативных растворимых белков, извлеченных из клеточного лизата.
В одном из экспериментов была осуществлена экспрессия рекомбинантного белка, включающего в себя множество полипептидов, присоединенных к фрагменту Рс, в Е. сой в качестве внутриклеточной растворимой пептидной цепи, белок был лизирован из собранных и отмытых клеток, изолирован из лизата посредством аффинной хроматографии и затем подвергнут рефолдингу при концентрации приблизительно 12 г/л, как описано здесь.
После завершения фазы экспрессии аликвота, взятая из общего объема ферментационного бульона, была центрифугирована, жидкая фаза удалена, оставив клетки в виде пасты. Клетки были ресуспендированы в воде приблизительно до 60% от исходного объема. Затем клетки лизировали путем троекратного пропускания через гомогенизатор высокого давления. После того как клетки были лизированы, объем лизата перемешивали в присутствии воздуха в течение 8-72 ч, чтобы могла произойти димеризация полипептидных цепей. После процесса димеризации целевая пептидная цепь была выделена из лизатного объема с использованием аффинной хроматографической колонки с белком А. Элюционный объем колонки с белком А был смешан с буфером для рефолдинга при отношении 8 ч. элюционного материала к 2 ч. буфера, состоящего из мочевины (10 М), аргинин- НС1 (2,5 М), Трис при рН 8,5 (1050 мМ) и цистеина (10, 5 или 4 мМ) и цистамина (4 мМ). Разбавленную смесь титровали до рН 8,5 и выдерживали при температуре 5°С в атмосфере азота до достижения стабильного объема (~24 ч). Выход целевого продукта составил приблизительно 30-80% в зависимости от рассчитанных окислительно-восстановительных условий.
Чтобы создать неаэробные условия, сходные с типичными для крупномасштабного производства белка, осуществляются несколько шагов. Когда реакционный объем был меньше чем приблизительно 15 л, свободное пространство в сосуде, где осуществлялся рефолдинг, продули азотом, чтобы ограничить влияние, которое кислород может оказывать на систему. Затем сосуд был запечатан и начата инкубация.
Когда реакционные объемы были больше чем приблизительно 15 л, но менее 500 л, буфер для рефолдинга был приготовлен и оставлен для достижения равновесного содержания кислорода в растворе приблизительно при 5°С (обычно от 50 до 70% растворенного кислорода, относительно насыщенности воздуха) После того как смесь для рефолдинга была сформирована, свободное пространство в сосуде продули азотом, чтобы ограничить любое дополнительное влияние, которое кислород может оказать на систему, сосуд запечатали и начали инкубционный период.
Пример 4. Рефолдинг из телец включения при высокой концентрации.
В одном из экспериментов была произведена экспрессия в Е. сой в виде телец включения рекомбинантного белка, включающего биологически активную пептидную цепь, соединенную с С-окончанием фрагмента Рс-молекулы 1§С1 через линкер, имеющую молекулярную массу около 57 кДа и содержащую 8 дисульфидных связей. Тельца включения собирали, отмывали, концентрировали, солюбилизовали и затем производили рефолдинг при концентрации 6 г/л, как описано в настоящем документе.
Аликвоте замороженных концентрированных телец включения давали оттаять при комнатной температуре и смешивали с соответствующим количеством гуанидина и/или мочевины, чтобы создать уровень денатурации, эквивалентный 4-6 М гуанидина, который полностью денатурирует белок. Затем белок был восстановлен с помощью ДТТ, при уровне 5-20 мМ и рН 8,5 и выдержан при комнатной температуре приблизительно в течение 1 ч. После того как тельца включения подверглись растворению, денатурации и восстановлению, они были растворены в буфере для рефолдинга, содержащем мочевину (1-5 М), аргинин-НС1 (5-500 мМ), глицерин (10-30% мас./об.) и идентифицированные уровни цистеина и цистамина, как определено методикой, описанной в примере 2.
Конечная концентрация компонентов составляет 4 М мочевины, 150 мМ аргинин-НС1, 20,9% (мас./об.) глицерина, 2,03 мМ цистеина и 2,75 мМ цистамина. Степень разбавления была выбрана, чтобы уравновесить разбавление денатурантов, оставшихся после солюбилизации, поддержать термодинамиче- 11 020621 скую стабильность молекулы во время рефолдинга и обеспечить максимально возможную концентрацию белка в смеси для рефолдинга. Разбавленная смесь была оттитрована до щелочного рН (между рН 8 и 10) и инкубирована при 5°С при неаэробных условиях, пока не было достигнуто стабильное состояние (1272 ч), как было определено соответствующими аналитическими измерениями. В результате процесса была продемонстрирована устойчивая масштабируемость от масштаба 1 до 2000 л (см. фиг. 3). Выходы целевого продукта составили приблизительно 27-35% при обоих масштабах. Отклонения в распределении продукта относительно примесей также поддерживались на сжатом уровне (см. фиг. 3).
При малом масштабе легко возникает кислородный массоперенос, который должен быть ингибирован, чтобы имитировать относительно слабый массоперенос, наблюдаемый при крупном масштабе, где объем раствора, в котором осуществляется рефолдинг, велик по сравнению с объемом воздуха и площадью поверхности крупномасштабного сосуда. Далее, чтобы создать неаэробные условия, сходные с теми, которые типичны для производства белка в очень крупном масштабе, было осуществлено несколько шагов. В случае, когда реакционные объемы были менее чем приблизительно 15 л, буфер для рефолдинга продували азотом, чтобы удалить из раствора кислород, компоненты дозировали под защитным слоем азота и, как только смесь была сформирована, свободное пространство над жидкостью в сосуде продули азотом, чтобы ограничить влияние, которое кислород мог оказать на систему. Сосуд запечатали, и началась инкубация.
Когда реакционные объемы были более чем приблизительно 15 л, но менее 500 л, буфер для рефолдинга был приготовлен и оставлен для достижения равновесного содержания кислорода в растворе приблизительно при 5°С (обычно от 50 до 70% растворенного кислорода, относительно насыщенности воздуха). После того как смесь для рефолдинга была сформирована, свободное пространство в сосуде продули азотом, чтобы ограничить любое дополнительное влияние, которое кислород может оказать на систему, сосуд запечатали, и начался инкубционный период.
При масштабах, превышающих 500 л, буфер для рефолдинга был приготовлен и оставлен для достижения равновесного содержания кислорода в растворе приблизительно при 5°С (обычно от 50 до 70% растворенного кислорода относительно насыщенности воздуха). После того как смесь для рефолдинга была сформирована, сосуд запечатали, и начался инкубационный период.
Концентрация белка в смеси для рефолдинга составляла 6 г/л, что четырехкратно превышало концентрацию 1,5 г/л, достигаемую при использовании других способов, чем способ, описанный в этом примере. Общая годовая продуктивность процесса в рамках одной конкретной производственной мощности, по расчетам, должна увеличиться на >930% благодаря увеличению объемной эффективности существующих производственных емкостей.
Пример 5. Влияние степени окисления тиол-дисульфидной системы на формирование дисульфидных связей.
Фиг. 1а-1£ демонстрируют, что сдвиг тиол-дисульфидного соотношения в сторону большего окисления (более низкое тиол-дисульфидное соотношение) повышает долю продукта с окисленными аминокислотными остатками и смешанными дисульфидными формами. Когда тиол-дисульфидное соотношение сдвигается в сторону более восстановленного состояния (более высокое тиол-дисульфидное соотношение), это проявляется в понижении уровней содержания соединений с окисленными аминокислотами и повышении уровней продуктов с некорректно сформированными дисульфидными связями или несформированными дисульфидными связями. При изменении общей буферной силы тиол-дисульфидной системы соответствующее тиол-дисульфидное соотношение сдвигается. Этот эффект обнаруживает сходство с тем, как буферная сила регулирует чувствительность рН к добавлению в буферный раствор кислоты или основания.
Была обеспечена достижимость оптимального баланса соединений. Как показано на фиг. 1а-1£, имеется ясная взаимосвязь между буферной силой тиол-дисульфидной системы и тиол-дисульфидным соотношением, которое можно идентифицировать для оптимального баланса соединений и, таким образом, способствовать эффективному рефолдингу белков с низкой растворимостью. Способность контролировать продукцию различных соединений, таких как соединения с некорректно сформированной дисульфидной связью и неправильно свернутых соединений, через модуляцию тиол-дисульфидного соотношения и буферной силы тиол-дисульфидной системы, дает возможность эффективно и надежно осуществлять последующие процессы очистки.
Пример 6. Влияние неаэробных условий на эффективность рефолдинга.
Фиг. 2 и 3 демонстрируют, что когда буферная сила тиол-дисульфидной системы подобрана правильно, принимая в расчет концентрацию белка и число цистеиновых остатков в белке, чувствительность к внешним влияниям, таким как кислород, заметно уменьшается. Это позволяет проводить рефолдинг в неаэробных условиях, что значительно облегчает переход между масштабами процесса и конфигурациями реактора.
Фиг. 2 сравнивает аналитическое распределение соединений по данным ВЭЖХ с обращенной фазой между 15 и 20 л масштабами рефолдинга, по нескольким условиям окружающей среды. Для варианта 1 (линия, обозначенная 1 на фиг. 1) солюбилизационные реактивы и растворы дозировались на воздухе,
- 12 020621 и смесь для рефолдинга была инкубирована на воздухе. В варианте 2 солюбилизационные реактивы и растворы дозировались на воздухе, а инкубация проводилась под защитным покровом азота. В вариантах 3-7 солюбилизационные реактивы и растворы дозировались под защитным покровом азота, и в условиях 3, 5, 6 и 7 солюбилизационные реактивы и растворы инкубировались в среде азота. В варианте 7 раствор для рефолдинга был также освобожден от азотного покрова до соединения с солюбилизационным раствором. В варианте 4 солюбилизационные реактивы и растворы были инкубированы в условиях окружающей атмосферы.
Результаты, показанные на фиг. 2, демонстрируют, что варианты, при которых солюбилизационные реактивы и растворы были распределены или инкубированы в присутствии воздуха (т.е. варианты 1, 2 и 4) не достигают результатов, сравнимых с крупномасштабным контролем. В вариантах 1, 2 и 4 наблюдается увеличение формирования окисленных соединений (пре-пики). Препики указаны стрелками на панели для вариантов 1, 2 и 4.
Фиг. 3 демонстрирует аналитические результаты, полученные при ВЭЖХ с обращенной фазой в идентифицированных условиях, полученных, как описано в примере 2, при масштабах в 1 л и в 2000 л. На этой фиг. отсутствуют существенные различия между обнаруживаемым распределением соединений. Взятые вместе фиг. 2 и 3 демонстрируют, что когда аэрация тщательно контролируется, реакции рефолдинга в малых масштабах позволяют лучше прогнозировать те результаты, которые ожидаются при росте масштаба, содействуя осуществлению крупномасштабных процессов рефолдинга белка.
Claims (22)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ рефолдинга сложного мультимерного белка, экспрессированного в экспрессионной системе организма, не относящегося к млекопитающим, и присутствующего в объеме в концентрации 2 г/л или более, включающий:(а) приведение белка в контакт с буфером для рефолдинга, содержащим окислительновосстановительный компонент с окончательным тиол-дисульфидным соотношением в диапазоне от 0,001 до 100 и окислительно-восстановительной силой буфера 2 мМ и более, и один или более из компонентов:(ί) денатурант, (ίί) супрессор агрегации и (ίίί) стабилизатор белка; для формирования смеси для рефолдинга;причем тиол-дисульфидное соотношение рассчитывают в соответствии с уравнением 1 [восстановитель]2 [окислитель] причем окислительно-восстановительную силу буфера рассчитывают в соответствии с уравнением 2 2[окислитель ]+[ восстановител ь];причем указанное тиол-дисульфидное соотношение и указанную окислительно-восстановительную силу буфера варьируют согласно полной или частичной факторной матрице, причем значение тиол-дисульфидного соотношения и значение окислительно-восстановительной силы буфера в указанном буфере для рефолдинга являются такими соответствующими значениям, которые приводят к более высокому выходу желаемой формы указанного сложного мультимерного белка, чем выход, получаемый до указанного варьирования указанного тиол-дисульфидного соотношения и указанной окислительно-восстановительной силы буфера, (б) инкубацию смеси для рефолдинга и (в) выделение белка из смеси для рефолдинга.
- 2. Способ по п.1, в котором окончательное тиол-дисульфидное соотношение выбирают из группы, состоящей из от 0,05 до 50, от 0,1 до 50, от 0,25 до 50, от 0,5 до 50, от 0,75 до 40, от 1,0 до 50 или от 1,5 до 50, от 2 до 50, от 5 до 50, от 10 до 50, от 15 до 50, от 20 до 50, от 30 до 50 или от 40 до 50.
- 3. Способ по п.1, в котором буферную силу тиол-дисульфидной системы выбирают из группы, состоящей из больше или равной 2,25, 2,5, 2,75, 3, 5, 7,5, 10 или 15 мМ.
- 4. Способ по п.1, в котором белок представлен в объеме в ненативной форме с ограниченной растворимостью.
- 5. Способ по п.4, в котором ненативная форма с ограниченной растворимостью представлена тельцем включения.
- 6. Способ по п.1, в котором белок представлен в объеме в растворимой форме.
- 7. Способ по п.1, в котором белок является рекомбинантным.
- 8. Способ по п.1, в котором белок является эндогенным.
- 9. Способ по п.1, в котором белок является антителом.
- 10. Способ по п.1, в котором белок является конъюгатом Рс-белка.
- 11. Способ по п.1, в котором экспрессионная система организма, не относящегося к млекопитаю- 13 020621 щим, является бактериальной экспрессионной системой или экспрессионной системой дрожжей.
- 12. Способ по п.1, в котором денатурант выбирают из группы, состоящей из мочевины, солей гуанидина, диметилмочевины, метилмочевины и этилмочевины.
- 13. Способ по п.1, в котором стабилизатор белка выбирают из группы, состоящей из аргинина, пролина, полиэтиленгликолей, неионных поверхностно-активных веществ, ионных поверхностно-активных веществ, многоатомных спиртов, глицерина, сахарозы, сорбитола, глюкозы, Трис, натрия сульфата, калия сульфата и осмолитов.
- 14. Способ по п.1, в котором супрессор агрегации выбирают из группы, состоящей из аргинина, пролина, полиэтиленгликолей, неионных поверхностно-активных веществ, ионных поверхностноактивных веществ, многоатомных спиртов, глицерина, сахарозы, сорбита, глюкозы, Трис, натрия сульфата, калия сульфата и осмолитов.
- 15. Способ по п.1, в котором тиол-дисульфидная система включает по меньшей мере один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из восстановленного глутатиона, окисленного глутатиона, цистеина, цистина, цистеамина, цистамина и β-меркаптоэтанола.
- 16. Способ по п.1, в котором инкубацию производят в неаэробных условиях.
- 17. Способ по п.1, в котором разделение включает контакт с аффинной разделительной матрицей.
- 18. Способ по п.17, в котором аффинная разделительная матрица представлена матрицей с белком А или разделительной матрицей смешанного типа.
- 19. Способ по п.1, в котором разделение включает контакт смеси с ионообменной разделительной матрицей.
- 20. Способ по п.1, в котором разделение дополнительно включает этап фильтрации.
- 21. Способ по п.20, в котором этап фильтрации включает глубинную фильтрацию.
- 22. Способ по п.1, в котором указанное варьирование дополнительно предусматривает систематическое варьирование времени инкубации, концентрации указанного сложного мультимерного белка и рН.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US21925709P | 2009-06-22 | 2009-06-22 | |
| PCT/US2010/039390 WO2011005488A1 (en) | 2009-06-22 | 2010-06-21 | Refolding proteins using a chemically controlled redox state |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201270015A1 EA201270015A1 (ru) | 2012-05-30 |
| EA020621B1 true EA020621B1 (ru) | 2014-12-30 |
Family
ID=42710673
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201270015A EA020621B1 (ru) | 2009-06-22 | 2010-06-21 | Рефолдинг белков с использованием химически контролируемого окислительно-восстановительного состояния |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US8952138B2 (ru) |
| EP (2) | EP3366692A1 (ru) |
| JP (2) | JP5808323B2 (ru) |
| KR (1) | KR101741859B1 (ru) |
| CN (1) | CN102482321B (ru) |
| AU (1) | AU2010270986B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI1011940B8 (ru) |
| CA (1) | CA2765881C (ru) |
| CL (1) | CL2011003278A1 (ru) |
| EA (1) | EA020621B1 (ru) |
| IL (1) | IL216954A (ru) |
| MX (1) | MX2011013898A (ru) |
| SG (1) | SG176963A1 (ru) |
| WO (1) | WO2011005488A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201200512B (ru) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3366692A1 (en) * | 2009-06-22 | 2018-08-29 | Amgen, Inc | Refolding proteins using a chemically controlled redox state |
| EP3660032A1 (en) | 2009-06-25 | 2020-06-03 | Amgen, Inc | Capture purification processes for proteins expressed in a non-mammalian system |
| EP2417982A1 (en) * | 2010-07-30 | 2012-02-15 | Ferring B.V. | Stabilization of gonadotropins |
| US20150376228A1 (en) * | 2013-02-22 | 2015-12-31 | Biogenomics Limited | Process for high efficiency refolding of recombinant proteins |
| WO2017019776A1 (en) * | 2015-07-27 | 2017-02-02 | Purdue Research Foundation | Tandem folding methods to improve protein folding yield |
| EP3344651B1 (en) | 2015-09-02 | 2022-03-02 | Merck Sharp & Dohme Corp. | A process for obtaining insulin with correctly formed disulfide bonds |
| MA45721A (fr) * | 2016-07-22 | 2019-05-29 | Amgen Inc | Procédés de purification de protéines contenant des fragments fc |
| CN108276470A (zh) * | 2017-01-06 | 2018-07-13 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 细胞裂解液、提取胞内蛋白的方法、制备弓形虫抗原的方法和试剂盒 |
| WO2018190301A1 (ja) * | 2017-04-10 | 2018-10-18 | 花王株式会社 | 角栓を除去する方法 |
| CN111902720B (zh) | 2018-03-21 | 2025-02-07 | 沃特世科技公司 | 基于非抗体高亲和力的样品制备、吸附剂、装置和方法 |
| PL3650037T3 (pl) * | 2018-11-07 | 2022-06-06 | Applied Molecular Transport Inc. | Konstrukty dostarczające do transcytozy i powiązane z nimi sposoby |
| AU2021399935A1 (en) | 2020-12-18 | 2023-06-29 | Richter Gedeon Nyrt. | Methods for the purification of refolded fc-peptide fusion protein |
| CN115894604B (zh) * | 2022-12-16 | 2024-01-23 | 康日百奥生物科技(苏州)有限公司 | 重组蛋白澄清纯化方法 |
Family Cites Families (82)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4237224A (en) | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
| US4468464A (en) | 1974-11-04 | 1984-08-28 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Biologically functional molecular chimeras |
| DE122080T1 (de) | 1983-03-25 | 1985-05-23 | Celltech Ltd., Slough, Berkshire | Verfahren zur herstellung eines proteins. |
| US4468454A (en) | 1983-06-10 | 1984-08-28 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Antifoggant process |
| US4572798A (en) * | 1984-12-06 | 1986-02-25 | Cetus Corporation | Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins |
| GB8508340D0 (en) | 1985-03-29 | 1985-05-09 | Creighton T E | Production of protein |
| US4810643A (en) | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| IL86090A (en) | 1987-04-16 | 1993-03-15 | Cetus Oncology Corp | Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1 |
| CA1339757C (en) | 1987-04-16 | 1998-03-17 | Robert F. Halenbeck | Production of purified biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1 |
| CA1329119C (en) | 1988-03-29 | 1994-05-03 | Milton David Goldenberg | Cytotoxic therapy |
| GB8807673D0 (en) | 1988-03-31 | 1988-05-05 | Lingner & Fischer Gmbh | Novel article |
| NZ229098A (en) | 1988-05-13 | 1992-10-28 | Amgen Inc | (bg-csf) bovine granulocyte colony stimulating factor, recombinant methods and pharmaceuticals |
| GB8927546D0 (en) * | 1989-12-06 | 1990-02-07 | Ciba Geigy | Process for the production of biologically active tgf-beta |
| US5986070A (en) | 1990-04-06 | 1999-11-16 | Amgen Inc. | Production of biologically active NGF proteins |
| WO1992004382A1 (en) * | 1990-09-05 | 1992-03-19 | Bunge (Australia) Pty. Ltd. | Solubilization of proteins in active forms |
| WO1993018136A1 (en) | 1992-03-05 | 1993-09-16 | Cytomed, Inc. | Process for supporting hematopoietic progenitor cells |
| US5663304A (en) | 1993-08-20 | 1997-09-02 | Genentech, Inc. | Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I |
| DE69401490T2 (de) | 1993-11-10 | 1997-04-30 | Pfizer | Prozess zur Rückfaltung von (pro-)Chymosin, unter Rückführung von Harnstoff |
| US5466377A (en) | 1994-01-19 | 1995-11-14 | Grandics; Peter | Chromatography media and their uses |
| IL113497A0 (en) | 1994-04-28 | 1995-07-31 | Amgen Inc | Method for controlling metallophosphate precipitation in high cell density fermentations |
| AU2603995A (en) * | 1994-05-25 | 1995-12-18 | University Of Nebraska Board Of Regents | Biologically active glycoprotein hormones produced in procaryotic cells |
| AU6028396A (en) | 1995-06-07 | 1996-12-30 | Amgen, Inc. | Ob protein compositions and method |
| WO1997027219A1 (en) | 1996-01-23 | 1997-07-31 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Methods for purification and use of erythropoietin binding protein |
| US5935824A (en) | 1996-01-31 | 1999-08-10 | Technologene, Inc. | Protein expression system |
| US20020052026A1 (en) | 1997-10-08 | 2002-05-02 | Steven M. Vicik | Methods of refolding proteins |
| US6180391B1 (en) | 1998-01-28 | 2001-01-30 | Amgen Inc. | Highly efficient controlled expression of exogenous genes in e. coli |
| US6653098B1 (en) * | 1998-02-23 | 2003-11-25 | G. D. Searle & Co. | Method of producing mouse and human endostatin |
| EE200000697A (et) | 1998-05-19 | 2002-06-17 | Avidex Limited | Lahustuv T-raku retseptor |
| US6660843B1 (en) | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
| AU783199B2 (en) | 1999-07-21 | 2005-10-06 | Amgen, Inc. | VGF polypeptides and methods of treating VGF-related disorders |
| US6808902B1 (en) | 1999-11-12 | 2004-10-26 | Amgen Inc. | Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules |
| ES2290142T3 (es) | 2000-05-16 | 2008-02-16 | Bolder Biotechnology, Inc. | Metodos para replegamiento de proteinas que contiene residuos de cisteina libre. |
| AU2001288812B2 (en) | 2000-09-05 | 2007-05-10 | Amgen Inc. | TNF receptor-like molecules and uses thereof |
| EP1366062B1 (en) | 2001-02-23 | 2011-07-27 | Immunex Corporation | Efficient recovery of correctly refolded proteins |
| US6972327B1 (en) | 2001-05-08 | 2005-12-06 | Immunex Corporation | Regeneration of chromatography material |
| US7138370B2 (en) * | 2001-10-11 | 2006-11-21 | Amgen Inc. | Specific binding agents of human angiopoietin-2 |
| ITMI20012345A1 (it) | 2001-11-08 | 2003-05-08 | Internat Ct For Genetic En Gin | Procedimento per la produzione di interferone alfa di grado terapeutico |
| SI21102A (sl) | 2001-12-19 | 2003-06-30 | LEK, tovarna farmacevtskih in kemi�nih izdelkov, d.d. | Postopek za izolacijo biološko aktivnega granulocitne kolonije stimulirajočega dejavnika |
| WO2004001056A1 (en) | 2002-06-24 | 2003-12-31 | Dr. Reddy's Laboratories Ltd. | Process for preparing g-csf |
| US7067279B1 (en) | 2002-08-23 | 2006-06-27 | Immunex Corporation | Cell culture performance with betaine |
| KR20120037517A (ko) | 2002-12-20 | 2012-04-19 | 암겐 인코포레이티드 | 미오스타틴을 저해하는 결합제 |
| US7083948B1 (en) | 2002-12-24 | 2006-08-01 | Immunex Corporation | Polypeptide purification reagents and methods for their use |
| EP1449848A1 (en) | 2003-02-20 | 2004-08-25 | GBF German Research Centre for Biotechnology | Method for the production of cystine-knot proteins |
| GB0304068D0 (en) | 2003-02-22 | 2003-03-26 | Avidex Ltd | Substances |
| ES2342539T3 (es) | 2003-10-24 | 2010-07-08 | Amgen, Inc. | Proceso para la purificacion de proteinas en una fraccion de flujo-directo de cromatografia de interaccion hidrofobica. |
| AU2004315196B2 (en) | 2004-01-30 | 2008-10-02 | Amgen Inc. | Process for purifying proteins |
| CA2555109C (en) | 2004-02-04 | 2016-12-06 | Neose Technologies, Inc. | Methods of refolding mammalian glycosyltransferases |
| US20050209441A1 (en) | 2004-03-22 | 2005-09-22 | Lile Jackson D | Process for promoting proper folding of human serum albumin using a human serum albumin ligand |
| FR2874318B1 (fr) | 2004-08-19 | 2006-11-24 | Oreal | Utilisation en cosmetique de composes polysaccharidiques amphoteres a chaine(s) polymerique(s) cationique(s) |
| ATE472333T1 (de) | 2004-08-19 | 2010-07-15 | Biogen Idec Inc | Rückfaltung von proteinen der transforming-growth-factor-beta-familie |
| DE102004041639A1 (de) | 2004-08-27 | 2006-03-02 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktivem humanen G-CSF aus Inclusion Bodies |
| WO2006036834A2 (en) | 2004-09-24 | 2006-04-06 | Amgen Inc. | MODIFIED Fc MOLECULES |
| US7435804B2 (en) | 2004-10-19 | 2008-10-14 | Phage Biotechnology, Inc. | Method for obtaining single chain antibodies to human interferon α2b |
| SG156672A1 (en) | 2004-10-22 | 2009-11-26 | Amgen Inc | Methods for refolding of recombinant antibodies |
| EP1828239B1 (en) | 2004-12-10 | 2011-08-24 | ZymoGenetics, Inc. | Fgf18 production in prokaryotic hosts |
| EP1848737B1 (en) | 2005-01-28 | 2016-05-18 | ZymoGenetics, Inc. | Homogeneous preparations of il-31 |
| WO2006097944A2 (en) | 2005-03-17 | 2006-09-21 | Zenotech Laboratories Limited | Process for the purification of recombinant granulocyte-colony stimulating factor |
| US7344962B2 (en) | 2005-06-21 | 2008-03-18 | International Business Machines Corporation | Method of manufacturing dual orientation wafers |
| DE102005033250A1 (de) | 2005-07-15 | 2007-01-18 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | Verfahren zur Reinigung von G-CSF |
| US8008453B2 (en) | 2005-08-12 | 2011-08-30 | Amgen Inc. | Modified Fc molecules |
| WO2007059494A2 (en) | 2005-11-14 | 2007-05-24 | Amgen, Inc. | Thermally insulated apparatus for liquid chromatographic analysis |
| US7662930B2 (en) | 2005-12-06 | 2010-02-16 | Amgen Inc. | Polishing steps used in multi-step protein purification processes |
| KR101067525B1 (ko) | 2005-12-22 | 2011-09-27 | 제넨테크, 인크. | 헤파린 결합 단백질의 재조합 생산 |
| US7612273B2 (en) * | 2006-03-20 | 2009-11-03 | Roland Corporation | Electronic percussion instrument |
| EP1845103B1 (en) * | 2006-04-10 | 2015-02-25 | Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG | Method for refolding a protein |
| JP2009540018A (ja) | 2006-06-13 | 2009-11-19 | ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド | Ｉｌ−１７およびｉｌ−２３アンタゴニストならびにその使用方法 |
| RU2439076C2 (ru) | 2006-07-14 | 2012-01-10 | Дженентек, Инк. | Способ выделения повторно свернутого рекомбинантного белка из культуры прокариотических клеток (варианты) |
| EP2049821A4 (en) | 2006-07-21 | 2013-09-04 | Amgen Inc | BREAKING VALVE |
| WO2008097829A2 (en) | 2007-02-02 | 2008-08-14 | Neose Technologies, Inc. | Large scale production of eukaryotic n-acetylglucosaminyltransferase i in bacteria |
| TW201307390A (zh) | 2007-02-02 | 2013-02-16 | Amgen Inc | 海帕西啶（ｈｅｐｃｉｄｉｎ）、海帕西啶拮抗劑及使用方法 |
| WO2008096370A2 (en) | 2007-02-05 | 2008-08-14 | Natco Pharma Limited | An efficient and novel purification method of recombinant hg-csf |
| WO2008100578A2 (en) | 2007-02-14 | 2008-08-21 | Amgen Inc. | Method of isolating antibodies by precipitation |
| AU2008287340A1 (en) | 2007-08-15 | 2009-02-19 | Amunix, Inc. | Compositions and methods for modifying properties of biologically active polypeptides |
| US20110003337A1 (en) | 2008-02-29 | 2011-01-06 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Immunoglobulin compositions and methods of producing same |
| CN102143976B (zh) | 2008-06-25 | 2015-11-25 | 艾斯巴技术-诺华有限责任公司 | 抑制vegf的稳定和可溶的抗体 |
| EP3366692A1 (en) * | 2009-06-22 | 2018-08-29 | Amgen, Inc | Refolding proteins using a chemically controlled redox state |
| EP3660032A1 (en) * | 2009-06-25 | 2020-06-03 | Amgen, Inc | Capture purification processes for proteins expressed in a non-mammalian system |
| TWI772897B (zh) | 2011-08-29 | 2022-08-01 | 美商安美基公司 | 用於非破壞性檢測-流體中未溶解粒子之方法及裝置 |
| US8945872B2 (en) | 2013-01-25 | 2015-02-03 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Methods of purifying human recombinant growth and differentiation factor-5 (rhGDF-5) protein |
| JP2016516064A (ja) | 2013-03-15 | 2016-06-02 | アムジェン インコーポレイテッド | ヒト対象におけるミオスタチンの拮抗 |
| US9632095B2 (en) | 2014-12-01 | 2017-04-25 | University Of Delaware | Device and method for determining reaction kinetics |
| US9704239B1 (en) | 2016-09-02 | 2017-07-11 | Amgen Inc. | Video trigger synchronization for improved particle detection in a vessel |
-
2010
- 2010-06-21 EP EP18167168.6A patent/EP3366692A1/en active Pending
- 2010-06-21 MX MX2011013898A patent/MX2011013898A/es active IP Right Grant
- 2010-06-21 EA EA201270015A patent/EA020621B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2010-06-21 KR KR1020127001716A patent/KR101741859B1/ko active Active
- 2010-06-21 CN CN201080028756.7A patent/CN102482321B/zh active Active
- 2010-06-21 AU AU2010270986A patent/AU2010270986B2/en active Active
- 2010-06-21 US US12/820,087 patent/US8952138B2/en active Active
- 2010-06-21 WO PCT/US2010/039390 patent/WO2011005488A1/en active Application Filing
- 2010-06-21 JP JP2012517634A patent/JP5808323B2/ja active Active
- 2010-06-21 BR BRPI1011940A patent/BRPI1011940B8/pt active IP Right Grant
- 2010-06-21 CA CA2765881A patent/CA2765881C/en active Active
- 2010-06-21 EP EP10747092.4A patent/EP2445923B1/en active Active
- 2010-06-21 SG SG2011095411A patent/SG176963A1/en unknown
-
2011
- 2011-12-13 IL IL216954A patent/IL216954A/en active IP Right Grant
- 2011-12-22 CL CL2011003278A patent/CL2011003278A1/es unknown
-
2012
- 2012-01-20 ZA ZA2012/00512A patent/ZA201200512B/en unknown
-
2015
- 2015-01-30 US US14/611,037 patent/US20150315232A1/en not_active Abandoned
- 2015-07-07 US US14/793,590 patent/US20150329586A1/en not_active Abandoned
- 2015-09-07 JP JP2015175422A patent/JP6026608B2/ja active Active
-
2017
- 2017-02-01 US US15/422,327 patent/US9856287B2/en active Active
-
2018
- 2018-02-06 US US15/889,559 patent/US12269843B2/en active Active
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA020621B1 (ru) | Рефолдинг белков с использованием химически контролируемого окислительно-восстановительного состояния | |
| EP0714406B1 (en) | Refolding of polypeptides like recombinant insulin-like growth factor igf-i | |
| Burgess | Refolding solubilized inclusion body proteins | |
| Yamaguchi et al. | Protein refolding using chemical refolding additives | |
| Guise et al. | Protein folding in vivo and renaturation of recombinant proteins from inclusion bodies | |
| EP3337820B1 (en) | An improved refolding process for antibody's fragments | |
| US10065987B2 (en) | High pH protein refolding methods | |
| US20150376228A1 (en) | Process for high efficiency refolding of recombinant proteins | |
| KR101873815B1 (ko) | 재조합 단백질의 가용화를 위한 조성물, 그 방법 및 이를 이용한 재조합 항원의 생산 방법 | |
| JP3930051B2 (ja) | 正しく折畳まれた生物学的に活性の組換えタンパク質の製造方法 | |
| HK1259915A1 (en) | Refolding proteins using a chemically controlled redox state | |
| HK1170245A (en) | Refolding proteins using a chemically controlled redox state | |
| HK1170245B (en) | Refolding proteins using a chemically controlled redox state | |
| Liu et al. | DsbA-DsbAmut fusion chaperon improved soluble expression of human trypsinogen-1 in Escherichia coli |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |