EA020621B1 - Рефолдинг белков с использованием химически контролируемого окислительно-восстановительного состояния - Google Patents

Abstract

Раскрыт способ рефолдинга белка, экспрессия которого была осуществлена в экспрессионных системах организмов, не относящихся к млекопитающим, и присутствующего в концентрациях 2,0 г/л или выше. Способ включает идентификацию тиол-дисульфидного соотношения и окислительно-восстановительной силы буфера для достижения условий, при которых достижим эффективный фолдинг при концентрациях 2,0 г/л или выше, и может быть применен в диапазоне объемов, включая коммерческий масштаб.

Description

Данное изобретение относится в целом к рефолдингу белков при высоких концентрациях и более конкретно к рефолдингу белков при их концентрации в объемах 2,0 г/л и выше.

Уровень техники

Экспрессия рекомбинантных белков может производиться во множестве экспрессионных систем, включая клетки организмов, не являющихся млекопитающими, таких как бактерии и дрожжи. Трудность, связанная с экспрессией рекомбинантных белков в прокариотических клетках, таких как бактерии, - это осаждение продуцированных белков в виде внутриклеточных осадков с ограниченной растворимостью, в типичном случае относящихся к тельцам включения. Тельца включения формируются в результате неспособности бактериальной клетки-хозяина правильно сворачивать рекомбинантные белки при высоких уровнях экспрессии, вследствие чего белки становятся нерастворимыми. Это особенно справедливо в отношении прокариотической экспрессии больших, сложных или имеющих эукариотическое происхождение белковых последовательностей. Образование неправильно свернутых рекомбинантных белков в известной степени ограничивает коммерческое использование бактериальной ферментации для производства крупных, сложных рекомбинантных белков при высоком уровне эффективности.

С момента выхода на коммерческие уровни рекомбинантной экспрессии белков в экспрессионных системах организмов, не относящихся к млекопитающим, таких как бактерии, были разработаны различные способы для получения правильно свернутых белков из бактериальных телец включения. Эти способы обычно придерживаются процедуры экспрессии белка, который в типичном случае осаждается в тельцах включения, далее проводится лизинг клеток, сбор телец включения и затем солюбилизация телец включения в солюбилизационном буфере, содержащем денатурант или поверхностно-активное вещество и восстановитель (присутствие последнего необязательно), которые разворачивают белки и разделяют тельца включения на индивидуальные белковые цепи, почти лишенные структуры. Впоследствии белковые цепи промывают с помощью буфера для рефолдинга или разбавляют им, что поддерживает ренатурацию белка в биологически активную форму. Когда остатки цистеина присутствуют в первичной аминокислотной цепи белка, часто необходимо совершить рефолдинг в среде, которая обеспечивает правильное образование дисульфидных связей (например, в окислительно-восстановительной системе).

Типичная концентрация для осуществления рефолдинга сложных молекул, таких как молекулы, включающие две или более дисульфидные связи, составляет менее 2,0 г/л, а более обычно 0,01-0,5 г/л (Кибо1рЬ & ЬШе, (1996) РА8ЕВ 1. 10:49-56). Таким образом, рефолдинг больших масс сложных белков, таких как антитела, пептидные тела или другие гибридные Ре-белки, при производстве в промышленных масштабах ставит значительные ограничения, благодаря крупным объемам, которые требуются для рефолдинга белков при типичных концентрациях продукта, и это обычная проблема, стоящая перед индустрией. Одним из факторов, который ограничивает концентрацию этого типа белков, необходимую для рефолдинга, является некорректное формирование дисульфидных связей, которые могут последовательно увеличивать склонность этих форм белков к агрегации. Благодаря большим объемам материала и крупным размерам емкостей, предполагаемым при работе по производству белков в промышленных масштабах, значительное количество времени и ресурсов может быть сэкономлено путем устранения или упрощения одного или более этапов этого процесса.

Наряду с тем, что рефолдинг белков при более высоких концентрациях был показан и прежде, белки были либо значительно меньше по молекулярной массе, либо представляли собой менее сложные молекулы, содержащие только одну или две дисульфидные связи (см., например, Сте1дЬ1ои, (1974) 1. Мо1. Вю1. 87:563-577).

Кроме того, для рефолдинга таких белков использовали химические механизмы рефолдинга, основанные на применении детергентов (см., например, 81бске1 е! а1., (1997) Еиг. 1. ВюсЬет 248:684-691), или применяли стратегии фолдинга при высоком давлении (81 1оЬи е! а1., (2001) 1. Вю1. СЬет. 276(50):4685663). Более сложные молекулы, такие как антитела, пептидные тела или другие крупные белки, обычно не поддаются рефолдингу под действием детергентов и, как правило, подвергались рефолдингу в хаотропной среде. Эти более сложные молекулы часто имеют больше двух дисульфидных связей, часто количество дисульфидных связей лежит в интервале от 8 до 24, и могут быть многоцепочечными белками, которые образуют гомо- и гетеродимеры.

До настоящего открытия эти типы сложных молекул не могли подвергаться рефолдингу при высоких концентрациях, т.е. концентрациях 2,0 г/л и выше, со сколько-нибудь значимой степенью эффективности при малом масштабе и совершенно не подвергались ему в промышленном масштабе. Открытые способы, напротив, могут быть реализованы при высоких концентрациях в малом или большом (т.е. промышленном) масштабе, чтобы получить правильно свернутые сложные белки. Способность обеспечивать рефолдинг белков при высоких концентрациях и в больших масштабах может найти выражение не только в повышенной эффективности самой операции рефолдинга, но также означает экономию времени и себестоимости ввиду устранения нужды в дополнительном оборудовании и персонале. Следовательно, способ рефолдинга белков, присутствующих в высоких концентрациях, может быть претворен в

- 1 020621 повышенную эффективность и экономию затрат в процессе производства белка.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой серии графиков, изображающих влияние тиол-дисульфидного соотношения и окислительно-восстановительной силы буфера на распределение видов продукта;

фиг. 1А изображает влияние силы буфера величиной 5 мМ; фиг. 1В показывает влияние буфера силой 7,5 мМ; фиг. 1С показывает влияние буфера силой 10мМ; фиг. 1Ό показывает влияние буфера силой 12,5 мМ; фиг. 1Е показывает влияние буфера силой 15 мМ и фиг. 1Р показывает влияние буфера силой 20 мМ;

фиг. 2 представляет серию графиков, показывающих влияние степени аэрации на распределение видов при фиксированном тиол-дисульфидном соотношении и буферной силе тиол-дисульфидной системы;

фиг. 3 представляет аналитическое наложение химически контролируемого, неаэробного рефолдинга, осуществляемого при концентрации 6 г/л и оптимизированного путем осуществления описанного способа, в объемах от 1 до 2000 л.

Сущность изобретения

Способ рефолдинга белков, произведенных в экспрессионных системах организмов, не относящихся к млекопитающим, и присутствующих в объеме в концентрации 2,0 г/л или более, включает: (а) контакт белка с буфером для рефолдинга, содержащим окислительно-восстановительный компонент, окончательное тиол-дисульфидное соотношение находится в пределах от 0,001 до 100, и окислительновосстановительная сила буфера составляет 2 мМ или более и содержащим один или более компонентов из списка: (ί) денатурант; (ίί) супрессор агрегации и (ίίί) стабилизатор белка; для формирования смеси для рефолдинга; (Ь) инкубация смеси для рефолдинга и (с) выделение белка из смеси для проведения рефолдинга.

В различных вариантах окислительно-восстановительный компонент имеет окончательное тиолдисульфидное соотношение, большее или равное 0,001, но меньшее или равное 100, например в диапазоне от 0,05 до 50, от 0,1 до 50, от 0,25 до 50, от 0,5 до 50, от 0,75 до 40, от 1,0 до 50 или от 1,5 до 50, от 2 до 50, от 5 до 50, от 10 до 50, от 15 до 50, от 20 до 50, от 30 до 50 или от 40 до 50 и буферную силу тиолдисульфидной системы, равную или превышающую 2 мМ, например большую чем или равную 2,25, 2,5, 2,75, 3, 5, 7,5, 10 или 15 мМ, там, где буферная сила тиол-дисульфидной системы эффективно ограничена максимумом в 100 мМ. Переформулируя в терминах интервалов, сила тиолового буфера для формирования смеси может быть в интервале от 2 до 20 мМ, например между 2,25 и 20 мМ, 2,5 и 20 мМ, 2,75 и 20мМ, 3 и 20 мМ, 5 и 20 мМ, 7,5 и 20 мМ, 10 и 20 мМ или 15 и 20 мМ.

В одном из вариантов буфера для рефолдинга буфер включает мочевину, аргинин-НС1, цистеин и цистамин в Трис-буфере. В другом варианте компоненты присутствуют в буфере для рефолдинга, с учетом пропорций, описанных в примере 3.

В другом варианте буфер для рефолдинга содержит мочевину, аргинин-НС1, глицерин, цистеин и цистамин в Трис-буфере. В другом варианте компоненты присутствуют в буфере для рефолдинга с учетом пропорций, описанных в примере 4.

В некоторых вариантах белок изначально присутствует в объеме в ненативной форме с ограниченной растворимостью, такой как тельца включения. В альтернативном случае белок представлен в объеме в растворимой форме. Белок может быть рекомбинантным или эндогенным. Белок может быть сложным белком, таким как антитело, или многомерным белком. В другом варианте белок представляет собой конъюгат Ре-белка, такой как белок, сплавленный или сцепленный с доменом Рс.

Система экспрессии организмов, не являющихся млекопитающими, может быть бактериальной системой экспрессии или системой экспрессии дрожжей.

Денатурант в буфере для рефолдинга может быть выбран из группы, состоящей из мочевины, солей гуанидина, диметилмочевины, метилмочевины и этилмочевины. Стабилизатор белка в составе буфера для рефолдинга может быть выбран из группы, состоящей из аргинина, пролина, полиэтиленгликоля, неионных поверхностно-активных веществ, ионных поверхностно-активных веществ, многоатомных спиртов, глицерина, сахарозы, сорбита, глюкозы, Трис, натрия сульфата, калия сульфата и осмолитов. Супрессор агрегации может быть выбран из группы, состоящей из аргинина, пролина, полиэтиленгликоля, неионных поверхностно-активных веществ, ионных поверхностно-активных веществ, полигидрированных спиртов, глицерина, сукрозы, сорбита, глюкозы, Трис, натрия сульфата, калия сульфата и осмолитов. Тиол-дисульфидная система может содержать по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из восстановленного глутатиона, окисленного глутатиона, цистеина, цистина, цистеамина, цистемина и β-меркаптоэтанола.

В различных вариантах очистка может включать контакт смеси с аффинной сепарационной матрицей, такой как белок А или белок С. В альтернативном случае аффинная смола может быть представлена сепарационной матрицей смешанного типа или ионообменной сепарационной матрицей. В различных аспектах инкубация может быть произведена при аэробных условиях или при неаэробных условиях.

- 2 020621

Подробное описание изобретения

Соответствующая литература свидетельствует, что при оптимизации различных операций рефолдинга белка, тиол-дисульфидное отношение буфера для рефолдинга целенаправленно изменялось и, как результат, сила тиолового буфера неизвестным образом варьировала в широком диапазоне величин (см., например, ЬШе, 8сй\уаг/ & Кибо1рй (1998) Ситтей Θρίηίοη ίη Вю1есйпо1о§у 9(5):497-501, и Ттап-Мокетап, 8сйаиет & С1агк (1999) Рто1еш Ехртеккюп & Рипйсайоп 16(1): 181-189). В одном из исследований взаимосвязь между тиол-дисульфидным соотношением и буферной силой была изучена для лизоцима, простого одноцепочечного белка, который образует расплавленные глобулы (Эе Вегпагбе/ е1 а1., (1998) Вю1есйпо1. Ргод. 14:47-54). Работа Ое Ветагбе/ описывает концентрацию тиолов в терминах модели, учитывающей только кинетику реакции, идущей по единственному пути. Однако более сложные белки управляются обратимыми термодинамическими равновесиями, описать которые нелегко (см., например, ИатЪу е1 а1., (1995) 1. Мо1. Вю1. 249:463-477). Более сложное поведение ожидается в случае крупных мультицепочечных белков, содержащих много дисульфидных связей, таких как антитела, белковые антитела и другие гибридные Рс-белки. Вплоть до настоящего открытия не были исследованы специфические отношения между буферной силой тиол-дисульфидной системы, химией тиол-дисульфидного соотношения и концентрацией белка касательно сложных белков и в связи с эффективностью синтеза белка. Следовательно, способность к рефолдингу в высококонцентрированном объеме была в значительной степени неэффективной или недостижимой, что создавало критическое затруднение в производстве белка, особенно в промышленном масштабе.

До настоящего открытия специальные контролируемые исследования независимого влияния тиолдисульфидного соотношения и тиол-дисульфидной буферной силы не были раскрыты для сложных белков. Как описано в данном документе, путем контроля тиол-дисульфидной буферной силы вместе с тиолдисульфидным соотношением и концентрацией белка, эффективность операций сворачивания белка может быть оптимизирована и повышена и может быть достигнут рефолдинг белков при их высоких концентрациях, например 2 г/л и более.

Таким образом, в одном аспекте настоящее открытие относится к идентификации и контролю химии окислительно-восстановительного тиол-дисульфидного соотношения, что облегчает рефолдинг белка при высокой концентрации белка, такой как концентрация выше 2 г/л. Способ может быть применен к любому типу белка, включая простые белки и сложные белки (например, белки, включающие в себя от 2 до 23 дисульфидных связей или более 250 аминокислотных остатков или имеющие молекулярную массу свыше 20000 Да), включая белки, которые содержат домен Рс, такие как антитела, пептидные антитела и другие Рс-гибридные белки, и может быть выполнен в лабораторном масштабе (обычно в масштабе миллилитров и литров), в масштабе опытного завода (обычно сотни литров) или в промышленном масштабе (обычно тысячи литров). Примеры сложных молекул, известных как пептидные антитела, и других Рсгибридных белков описаны в патентах США №№ 6660843, 7138370 и 7511012.

Как описано в настоящем документе, взаимоотношения между силой тиолового буфера и окислительно-восстановительным тиол-дисульфидным соотношением изучены и оптимизированы, чтобы обеспечить воспроизводимый способ рефолдинга белков при концентрациях 2 г/л и выше в различных масштабах. Математическая формула была выведена для точного расчета соотношений и сил индивидуальных окислительно-восстановительных парных компонентов и получить матрицы буферного тиолдисульфидного соотношения и буферной тиоловой силы. Однажды установив эту взаимосвязь, стало возможно систематически демонстрировать, что силы тиолового буфера тиол-дисульфидного соотношения взаимодействуют, определяя распределение результирующих соединений, получаемых в реакции рефолдинга.

Буферное тиол-дисульфидное соотношение, однако, является только одним компонентом в определении тиол-дисульфидного соотношения всей системы в общей реакции. Так как остатки цистеина в развернутом белке также участвуют в реакции, буферная сила тиолов должна меняться пропорционально увеличению концентрации белка, чтобы достичь оптимального тиол-дисульфидного соотношения системы. Следовательно, дополнительно к демонстрации того, что буферная сила тиолов взаимодействует с тиол-дисульфидным соотношением, также показано, что эта буферная сила соотносится и с концентрацией белка в реакции в целом. Оптимизация буферной силы тиолов и тиол-дисульфидного соотношения системы может быть приспособлена к особенному белку, такому как сложный белок, чтобы минимизировать ошибочное спаривание цистеина и облегчить рефолдинг при высоких концентрациях.

I. Определения.

Используемое здесь выражение один означает одно или несколько, если специально не указано иное.

Используемый здесь термин экспрессионные системы организмов, не относящихся к млекопитающим означает системы для экспрессии белков в клетках, происходящих из организмов иных, чем млекопитающие, включая, не ограничиваясь, прокариоты, включая бактерии, такие как Е. сой, и дрожжи. Часто экспрессионные системы организмов, не относящихся к млекопитающим, используются для выработки интересующих рекомбинантных белков, тогда как в других случаях белок является эндогенным белком, экспрессия которого осуществляется клеткой организма, не относящегося к млекопитающим.

- 3 020621

Для целей настоящего открытия, безотносительно является ли целевой белок эндогенным или рекомбинантным, если экспрессия белка осуществляется в клетке организмов, не относящихся к млекопитающим, следовательно, эта клетка является экспрессионной системой организмов, не относящихся к млекопитающим. Сходным образом клетка организма, не относящегося к млекопитающим является клеткой, происходящей из организма иного, чем млекопитающие, примеры которых включают бактерии или дрожжи.

Используемый здесь термин денатурант означает любое соединение, имеющее способность удалять некоторые или все вторичные и третичные структуры белка при вступлении с этим белком в контакт. Термин денатурант относится к особым химическим соединениям, которые вызывают денатурацию, равно как и к растворам, содержащим особое вещество, вызывающее денатурацию. Примеры денатурантов, которые могут быть использованы в описываемом способе, включают, не ограничиваясь, мочевину, соли гуанидина, диметилмочевину, метилмочевину и их комбинации.

Используемый здесь термин супрессор агрегации означает любое соединение, имеющее способность разрывать и уменьшать или устранять взаимодействие между двумя или более белками. Примеры супрессоров агрегации могут включать, не ограничиваясь, аминокислоты, такие как аргинин, пролин и глицин; полиолы и сахара, такие как глицерин, сорбит, сахароза и трегалоза; поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат-20, СНАР8, Тритон Х-100 и додецил мальтозид и их комбинации.

Используемый здесь термин стабилизатор белка означает любое соединение, имеющее способность менять состояние равновесия реакции, так что нативное состояние белка улучшается или поддерживается. Примеры стабилизаторов белка могут включать, не ограничиваясь, сахара и многоатомные спирты, такие как глицерин и сорбит; полимеры, такие как полиэтиленгликоль и α-циклодекстрин; соли аминокислот, таких как аргинин, пролин и глицин, осмолиты и отдельные соли Хоффмейстера, такие как Трис, натрия сульфат и калия сульфат и их комбинации.

Используемый здесь термин Рс и Рс регион используются взаимозаменяемо и означают фрагмент антитела, которое заключает в себе человеческие или нечеловеческие (например, мурены) С_Н2 и С_Н3 иммуноглобулиновые домены или которые заключают в себе две соприкасающихся области, которые по меньшей мере на 90% идентичны человеческим или нечеловеческим С_Н2 и С_Н3 иммуноглобулиновым доменам. Участки Рс могут, но не обязаны, иметь способность взаимодействовать с Рс рецептором. См., например, публикацию Накешаии & Сарга, Иммуноглобулины: структура и функции в издании под ред. ^Нйаш Е. Раи1, Фундаментальная иммунология, Второе издание, 209, 210-218 (1989), включенной в настоящую заявку путем ссылки в полном объеме.

Используемые здесь термины белок и полипептид используются взаимозаменяемо и означают любую цепь по меньшей мере из пяти природным или неприродным способом сочетающихся аминокислот, соединенных пептидными связями.

Используемые здесь термины разделить и очистить используются взаимозаменяемо и означают сократить на 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% или более количество гетерогенных элементов, например, биологических макромолекул, таких как белки или ДНК, которые могут быть представлены в образце, содержащем целевой белок. Присутствие гетерогенных белков может быть проанализировано любым подходящим способом, включая высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), гель-электрофорез и окрашивание и/или иммуноферментный анализ. Присутствие ДНК и других нуклеиновых кислот может быть проанализировано любым подходящим способом, включая гель-электрофорез и окрашивание и/или тесты, использующие реакцию полимеразной цепи.

Используемый здесь термин сложная молекула означает любой белок, который а) имеет молекулярную массу более 20000 или заключает в себе более 250 аминокислотных остатков и б) содержит 2 или более дисульфидные связи в своей нативной форме. Сложная молекула может, но не обязательно, образовывать мультимеры. Примеры сложных молекул включают, не ограничиваясь, антитела, пептидные антитела и другие химерические молекулы, содержащие Рс-домен и другие крупные белки. Примеры сложных молекул, известных как пептидные антитела, и других гибридных Рс-молекул описаны в патентах США №№ 6660843, 7138370 и 7511012.

Используемый здесь термин пептидное антитело относится к полипептидам, состоящим из одного или более биоактивных пептидов, соединенных вместе, необязательно посредством линкеров, с доменом Рс. См. патенты США №№ 6660843, 7138370 и 7511012, где приведены примеры пептидных антител.

Используемый здесь термин рефолдинг означает процесс возвращения вторичной и третичной структуры белку, вторичная или третичная структуры которого были частично или полностью утрачены, будь то ίη νίίτο или ίη νίνο, т.е. в результате условий экспрессии или преднамеренной денатурации и/или редукции. Следовательно, белок после рефолдинга представляет собой белок, у которого до некоторой степени или полностью восстановлена его нативная вторичная и третичная структура.

Используемый здесь, термин буферное тиол-дисульфидное соотношение определяется взаимоотношением восстановленных и окисленных редокс-соединений, используемых в буфере для рефолдинга, как показано в уравнении 1.

- 4 020621

Уравнение 1.

Определение буферного тиол-дисульфидного соотношения (ТДС) [восстановитель]³ _ [цистеин]² [окислитель] [цистамин]

Используемый здесь термин буферная сила тиолов, сила тиол-дисульфидного буфера и сила тиол-дисульфидной системы используются взаимозаменяемо и определены в уравнении 2, т.е. как полная моноэквивалентная концентрация тиола, где полная концентрация представляет сумму концентрации восстановленных и удвоенной концентрации окисленных соединений.

Уравнение 2.

Определение буферной силы тиол-дисульфидной системы/буферной силы (БС) тиолов Сила тиол-дисульфидной системы=2[окислитель]+[восстановитель]=2[цистамин]+[цистеин]

Взаимоотношение между тиол-дисульфидным соотношением и силой буферной тиолдисульфидной системы описаны в уравнениях 3 и 4.

Уравнение 3.

Расчет восстановленных окислительно-восстановительных соединений в отношении к определенной окислительно-восстановительной буферной силе (БС) и буферному окислительно-восстановительному потенциалу

Концентрация восстановленного редокс компонента = (Vбуферное _ ТДС² + 8 * буферное __ ТДС *БС ) - буферное _ ТДС

Уравнение 4.

Расчет окисленных окислительно-восстановительных соединений в отношении к определенной окислительно-восстановительной буферной силе (БС) и буферному окислительно-восстановительному потенциалу

Концентрация окисленного редокс компонента = (Концентрация _ восстановленного _ редокс _ компонента)² ТДС

Используемый здесь термин окислительно-восстановительный компонент означает любой содержащий тиоловую группу химический препарат или раствор, содержащий такой химический препарат, который способен к двустороннему обмену с другим тиолом или цистеиновым остатком белка. Примеры таких соединений включают, не ограничиваясь, окисленный глутатион, восстановленный глутатион, цистеин, цистин, цистеамин, цистамин, β-меркаптоэтанол и их комбинации.

Используемый здесь термин солюбилизация означает процесс, в котором соли, ионы, денатуранты, детергенты, восстановители и/или другие органические молекулы добавляются к раствору, содержащему целевой белок, таким образом, удаляя в некоторой степени или целиком вторичную и/или третичную структуру белка и растворяют белок в растворителе. Этот процесс может включать использование повышенной температуры, обычно 10-50°С, но более обычно 15-25°С, и/или щелочной рН, такой как рН 7-12. Солюбилизация может быть также достигнута добавлением кислот, таких как 70% муравьиная кислота (см., например, Со\у1су & Маскш (1997) ΡΕΒδ Ьей 402:124-130).

Солюбилизованный белок представляет собой белок, в котором в некоторой степени или полностью удалены вторичная и/или третичная структуры.

Солюбилизационный пул представляет собой объем раствора, содержащего в себе солюбилизованный целевой белок, а также соли, ионы, денатуранты, детергенты, восстановители и/или другие органические молекулы, выбранные для солюбилизации белка.

Используемый здесь термин неаэробные условия означает любые условия реакции или культивирования, которые осуществляются в отсутствие интенсивной аэрации смеси механическими или химическими способами. При неаэробных условиях может присутствовать кислород, поскольку он присутствует естественным образом, и не добавлялся в систему целенаправленно. Неаэробные условия могут быть достигнуты, например, путем ограничения переноса кислорода в реакционный раствор, путем ограничения давления в свободном пространстве над продуктом, отсутствием или ограниченным контактом с воздухом или кислородом, содержащимся в емкости для выдержки, воздушным или кислородным поверхностным слоем, отсутствием специальных приспособлений для учета массопереноса при масштабировании процесса или отсутствием обработки газом или перемешивания для усиления присутствия кислорода в системе. Неаэробные условия могут также быть достигнуты путем интенсивного ограничения или удаления кислорода из системы путем химических обработок, поверхностного наложения или подачи под давлением инертного газа, наложением вакуума или впрыскиванием газов, таких как аргон или азот, в результате чего уменьшается концентрация кислорода в реакционной смеси.

Используемые здесь, термины ненативный и ненативная форма используются взаимозаменяемо, и когда используются в контексте целевого белка, такого как белок, содержащий домен Рс, означают, что

- 5 020621 белок не имеет по меньшей мере одного из признаков, формирующих его структуру, обнаруженного у формы белка, которая является биологически активной в соответствующей пробе ίη νίνο или ίη νίίτο, предназначенной, чтобы проанализировать биологическую активность белка. Примеры структурных особенностей, которые могут отсутствовать в ненативной форме белка, могут включать, не ограничиваясь, дисульфидную связь, четвертичную структуру, разорванную вторичную или третичную структуру или состояние, которое делает белок биологически неактивным в соответствующей пробе. Белок в ненативной форме может, но не обязательно, формировать агрегаты.

Используемый здесь термин ненативная форма, имеющая ограниченную растворимость, когда используется в контексте целевого белка, такого как белок, содержащий домен Рс, означает любую форму или состояние, в которых белок не имеет по меньшей мере одной структурной особенности, найденной в форме белка, которая а) биологически активна в соответствующей пробе ίη νίνο или ίη νίίτο, предназначенной, чтобы проанализировать биологическую активность белка, и/или б) формирует агрегаты, которые требуют обработки, такой как химическая обработка, чтобы стать растворимыми. Термин специфически включает белки, которые существуют в тельцах включения, тех, которые иногда обнаруживаются, когда рекомбинантный белок вырабатывается в экспрессионных системах организмов, не относящихся к млекопитающим.

II. Теория.

Рефолдинг молекул микробного происхождения, присутствующих в объеме в концентрациях 2 г/л и выше, является выгодным по целому ряду соображений, преимущественно из-за уменьшения реакционных объемов и усиления процесса во всех отношениях. Точки зрения масштабирования процесса выгодно осуществлять рефолдинг при обстоятельствах, когда не требуются аэробные условия; такие условия могут быть достигнуты постоянным или периодическим добавлением кислорода или воздуха в свободное пространство над реакционной смесью, нагнетанием парогазовой фазы или путем высокоэффективного перемешивания. Поскольку концентрация кислорода в системе связана с массопереносом, масштабирование реакции рефолдинга становится существенно более трудным из-за влияния таких факторов, как геометрия реакционного сосуда, объем и изменения, связанные с перемешиванием. Кроме того, кислород может не участвовать непосредственно в формировании дисульфидных связей в белке, делая прямую связь с коэффициентом массопереноса недостоверной. Это дополнительно осложняет масштабирование реакции. Следовательно, неаэробные, химически контролируемые окислительновосстановительные системы предпочтительны для рефолдинга белков. Примеры таких условий предусмотрены настоящим документом.

Оптимальная химия рефолдинга для данного белка представляет собой точный баланс, который максимизирует свернутое/окисленное состояние и одновременно минимизирует нежелательные продукты реакции, такие как агрегаты, несформированные дисульфидные связи (например, восстановленные цистеиновые пары), некорректное образование дисульфидных связей (которое приводит к неправильному сворачиванию белка), окисление аминокислотных остатков, деамидацию аминокислотных остатков, некорректную вторичную структуру, и связанные с продуктом аддукты (например, цистеиновые или цитеаминовые аддукты). Одним фактором, который является важным в достижении этого баланса, является окислительно-восстановительное состояние системы рефолдинга. Окислительно-восстановительное состояние подвержено влиянию многих факторов, включая, не ограничиваясь, количество остатков цистеина, содержащихся в белке, соотношение и концентрацию окислительно-восстановительных пар химических препаратов, содержащихся в растворе для рефолдинга (например, цистеина, цистина, цистамина, цистеамина, восстановленного глутатиона или окисленного глутатиона), концентрацию восстановителей, переносимых из солюбилизационного буфера (например, ДТТ, глутатиона и βмеркаптоэтанола), содержание тяжелых металлов в смеси и концентрацию кислорода в растворе.

Тиол-дисульфидное соотношение и буферная сила тиол-дисульфидной системы определены в уравнениях 1 и 2, используя цистеин и цистамин как примеры окислителя и восстановителя соответственно. Эти величины, соединенные с концентрацией белка и восстановителя, переносимого из процесса солюбилизации, могут быть факторами в достижении баланса между тиол-дисульфидным соотношением и буферной силой тиол-дисульфидной системы.

Фиг. 1 показывает влияние тиол-дисульфидного соотношения и буферной силы тиол-дисульфидной системы на распределение связанных с продуктом соединений, визуализированное посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой, для сложных димерных белков. На фиг. 1А-1Р точечные линии представляют белковые соединения с окисленными аминокислотными остатками, виды с единичной цепью и стабильную смесь дисульфидных промежуточных продуктов, пунктирные линии представляют неспаренные, некорректно сформированные дисульфидные белковые соединения и белковые соединения с частично несформированным дисульфидными связями. Сплошные линии представляют правильно свернутые белки. Фиг. 1А-1Р демонстрируют, что при постоянной концентрации 6 г/л, по мере увеличения силы тиол-дисульфидного буфера, тиол-дисульфидное соотношение, требуемое для сопоставимого распределения компонентов реакции, также должно быть увеличено. Например, как показано на фиг. 1, если буферная сила увеличивается с 5 до 10 мМ, то сбалансированное тиол-дисульфидное соотношение должно быть примерно в 2 раза выше, чтобы достичь сопоставимого

- 6 020621 распределения соединений. Это происходит в основном из-за увеличения буферного эффекта восстановителя, перенесенного из реакции солюбилизации на тиол-дисульфидное соотношение системы в целом. При более низкой восстановительной силе буфера систему в целом становится труднее контролировать. Концентрация белка и число цистеинов, содержащихся в белковой последовательности, также связаны с минимально необходимой буферной силой, требуемой для контроля системы. Ниже определенной точки, которая от белка к белку будет меняться, концентрация тиолов в белке подавляет химию окислительновосстановительных пар и ведет к невоспроизводимым результатам.

В результатах, показанных на фиг. 1, когда тиол-дисульфидное соотношение раствора для рефолдинга направлено в сторону усиления восстановительных свойств, распределение результирующих продуктов меняется в сторону образования более восстановленных соединений (пунктирные линии). Когда тиол-дисульфидное соотношение раствора для рефолдинга направленно снижается, или окислительные свойства усиливаются, распределение результирующих продуктов сдвигается в сторону образования более окисленных остатков, формирования одиночных цепей, стабильных смешанных дисульфидных промежуточных продуктов (точечные линии). Возможность выбирать оптимальное тиол-дисульфидное соотношение и буферную силу тиол-дисульфидной системы позволяет оптимизировать выход целевого белка в свернутой форме. Этот оптимизированный выход продукта может быть достигнут путем максимизации массы или производимого количества свернутого целевого белка в объеме, где осуществляется рефолдинг, или путем целенаправленного изменения выхода нежелательных сопутствующих продукту соединений, которые с большей легкостью удаляются при последующей очистке, и таким образом в целом приводит к возникновению преимуществ в смысле увеличения выхода продукта или его чистоты.

Оптимизация окислительно-восстановительного компонента тиол-дисульфидного соотношения и буферной силы тиол-дисульфидной системы может быть выполнена для каждого белка. Матрица или серия многофакторных матриц может быть рассчитана для оптимизации реакции рефолдинга, для условий, которые оптимизируют выход продукта или распределение целевых компонентов. Оптимизирующий отбор может быть основан на учете химии окислительно-восстановительных процессов, тиолдисульфидного соотношения и буферной силы тиол-дисульфидной системы, времени культивирования, концентрации белка и рН в полной или частичной факториальной матрице, где каждый компонент варьирует в пределах определенного диапазона, включающего по меньшей мере три уровня концентрации или рН, при условии, что все другие параметры остаются постоянными. Завершение реакций может быть оценено путем ОВ-ВЭЖХ или эксклюзионной ВЭЖХ для выхода продукта, а оценка качества - путем применения стандартных инструментов многомерной статистики.

III. Способ рефолдинга белка, произведенного в экспрессионной системе организмов, не относящихся к млекопитающим, и присутствующего в объеме в концентрации 2 г/л или более.

Раскрытый способ рефолдинга в особенности пригоден для рефолдинга белков, выработанных в экспрессионной системе организмов, не относящихся к млекопитающим. Как отмечено в настоящем документе, клетки организмов, не относящихся к млекопитающим, могут быть перестроены таким образом, чтобы производить рекомбинантные белки, экспрессия которых осуществляется внутриклеточно в растворимой или совершенно нерастворимой, или ненативной форме с ограниченной растворимостью. Часто клетки будут помещать рекомбинантные белки в крупные нерастворимые или ограниченно растворимые агрегаты, именуемые тельцами включения. Однако определенные условия роста клетки (т.е. температура или рН) могут быть модифицированы, чтобы побудить клетки производить рекомбинантный белок в форме внутриклеточных растворимых мономеров. В качестве альтернативы производству белков в виде нерастворимых телец включения, белки могут вырабатываться, как растворимые белки, включая белки, содержащие участок Рс, которые могут быть извлечены непосредственно из клеточного лизата, посредством аффинной хроматографии. Захват непосредственно из лизата позволяет использовать в процессе рефолдинга относительно чистый белок и избегать очень интенсивных процедур сбора и выделения, необходимых при обращении с тельцами включения. Способ рефолдинга не ограничен, однако, образцами, очищенными путем аффинной хроматографии, и может быть применен к любому образцу, включающему белки, продуцированные экспрессионной системой организмов, не относящихся к млекопитающим, такие как белки, находящиеся в объеме клеточного лизата (т.е. белки, которые не подвергались никакой очистке).

В одном аспекте настоящее раскрытие относится к способам рефолдинга белка, выработанного в экспрессионной системе организмов, не относящихся к млекопитающим, в растворимой форме и присутствующего в объеме в концентрации 2,0 г/л или более, такого как белок, который был очищен посредством аффинной хроматографии от продуктов лизиса клеток организмов, не относящихся к млекопитающим, в которых происходила его экспрессия. Хотя этот объем может быть получен на любой стадии процесса очистки, в одном примере он представлен объемом элюата, полученного при аффинной хроматографии (например, объем элюата белка А). В другом примере объем находится в потоке процесса. Способ не ограничивается белками, содержащими домен Рс, однако, может быть применен к любой разновидности пептида или белка, выработанного в растворимой форме и извлеченного из лизата клеток организмов, не относящихся к млекопитающим. Изолированный растворимый белок часто получают из клеток организмов, не относящихся к млекопитающим, в восстановленной форме, и затем он может быть

- 7 020621 подготовлен к рефолдингу путем добавления денатуранта, такого как хаотропное вещество. Дальнейшее сочетание со стабилизатором белка, супрессором агрегации и окислительно-восстановительные компоненты при оптимизированном тиол-дисульфидном соотношении и тиол-дисульфидной буферной силе дает возможность рефолдинга при концентрациях 1-40 г/л, например концентрациях 10-20 г/л.

В одном из вариантов способа белок был выработан в экспрессионной системе организма, не относящегося к млекопитающим, и извлечен из клетки, где проводилась экспрессия, путем лизиса под высоким давлением. Затем белок был захвачен из лизата путем аффинной хроматографии с белком А и присутствует в объеме в концентрации 10 г/л и более. Белок затем контактирует с буфером для рефолдинга, содержащим денатурант, супрессор агрегации, стабилизатор белка и окислительно-восстановительный компонент, где окислительно-восстановительный компонент имел окончательное тиол-дисульфидное соотношение (как определено здесь) в диапазоне от 0,001 до 100, например в диапазоне от 0,05 до 50, от 0,1 до 50, от 0,25 до 50, от 0,5 до 50, от 0,75 до 40, от 1,0 до 50 или от 1,5 до 50, от 2 до 50, от 5 до 50, от 10 до 50, от 15 до 50, от 20 до 50, от 30 до 50 или от 40 до 50 и буферную силу тиол-дисульфидной системы (как определено в настоящем документе), равную или более 2 мМ, например больше чем или равную 2,25, 2,5, 2,75, 3, 5, 7,5, 10 или 15 мМ, тогда как тиол-дисульфидная буферная сила эффективно ограничена максимумом 100 мМ. Формулируя в терминах диапазонов буферная сила тиолов лежит в диапазоне от 2 до 20 мМ, например между 2,25 и 20 мМ, 2,5 и 20 мМ, 2,75 и 20 мМ, 3 и 20 мМ, 5 и 20 мМ, 7,5 и 20 мМ, 10 и 20 мМ или 15 и 20 мМ.

В другом аспекте настоящее раскрытие относится к способу рефолдинга белка, выработанного в экспрессионной системе организма, не относящегося к млекопитающим, в нерастворимой или ограниченно растворимой форме, такой как тельца включения. Когда белок откладывается в тельцах включения, тельца включения могут быть собраны из лизированных клеток, отмыты, а затем подвергнуты концентрированию и рефолдингу.

Оптимизация буфера для рефолдинга может быть произведена для каждого белка и каждой конечной концентрации белка отдельно, используя новаторский способ, представляемый данным документом. Как показано в примерах, хорошие результаты могут быть получены при рефолдинге белка, содержащего участок Рс, если буфер содержит денатурант (например, мочевину или другой хаотропный агент, органический растворитель или сильный детергент), супрессор агрегации (например, мягкий детергент, аргинин или полиэтиленгликоль в низких концентрациях), стабилизатор белка (например, глицерин, сахароза или другой осмолит, соли) и окислительно-восстановительные компоненты (например, цистеин, цистамин, глутатион). Оптимальное тиол-дисульфидное соотношение и окислительно-восстановительная буферная сила могут быть определены, используя экспериментальную матрицу тиол-дисульфидного соотношения (которое может иметь диапазон от 0,001 до 100, например от 0,05 до 50, от 0,1 до 50, от 0,25 до 50, от 0,5 до 50, от 0,75 до 40, от 1,0 до 50 или от 1,5 до 50, от 2 до 50, от 5 до 50, от 10 до 50, от 15 до 50, от 20 до 50, от 30 до 50 или от 40 до 50) против тиол-дисульфидной буферной силы (которая может быть более 2 мМ, например более чем или равна 2,25, 2,5, 2,75, 3, 5, 7,5, 10 или 15 мМ, там, где тиолдисульфидная буферная сила эффективно ограничена максимумом 100 мМ. Переформулируя в терминах диапазонов буферная сила тиол-дисульфидной системы может находиться в диапазоне между 2 и 20 мМ, например между 2,25 и 20 мМ, 2,5 и 20 мМ, 2,75 и 20 мМ, 3 и 20 мМ, 5 и 20 мМ, 7,5 и 20 мМ, 10 и 20 мМ или 15 и 20 мМ, в зависимости от концентрации белка и концентрации восстановителя, использованного для солюбилизации телец включения). Условия могут быть оптимизированы, используя новаторские способы, описанные в примере 2.

В одном из частных вариантов способа белок выработан в экспрессионной системе организмов, не относящихся к млекопитающим, и присутствует в объеме в концентрации 2,0 г/л или более. Белок контактирует с буфером для рефолдинга, содержащим денатурант, супрессор агрегации, стабилизатор белка и окислительно-восстановительный компонент, где окислительно-восстановительный компонент имеет окончательное тиол-дисульфидное соотношение (как описано в настоящем документе), имеющее диапазон от 0,001 до 100, например от 0,05 до 50, от 0,1 до 50, от 0,25 до 50, от 0,5 до 50, от 0,75 до 40, от 1,0 до 50 или от 1,5 до 50, от 2 до 50, от 5 до 50, от 10 до 50, от 15 до 50, от 20 до 50, от 30 до 50 или от 40 до 50, и тиол-дисульфидную буферную силу (как описано в настоящем документе), равную или большую 2 мМ, например более чем или равную 2,25, 2,5, 2,75, 3, 5, 7,5, 10 или 15 мМ, где тиол-дисульфидная буферная сила эффективно ограничена максимумом 100 мМ. Переформулируя в терминах диапазонов тиол-дисульфидная буферная сила может находиться в диапазоне между 2 и 20 мМ, например между 2,25 и 20 мМ, 2,5 и 20 мМ, 2,75 и 20 мМ, 3 и 20 мМ, 5 и 20 мМ, 7,5 и 20 мМ, 10 и 20 мМ или 15 и 20 мМ для формирования смеси. Широкий диапазон типов денатурантов может быть использован в буфере для рефолдинга. Примерами некоторых обычных денатурантов, используемых в буфере для осуществления рефолдинга, являются мочевина, гуанидин, диметилмочевина, метилмочевина или этилмочевина. Специфическая концентрация денатуранта может быть определена установленным способом оптимизации, как описано в настоящем документе.

Широкий диапазон стабилизаторов или супрессоров агрегации может быть использован в буфере для рефолдинга. Примеры некоторых обычных супрессоров агрегации, используемых в буфере для осуществления рефолдинга, включают аргинин, пролин, полиэтиленгликоль, неионные поверхностно- 8 020621 активные вещества, ионные поверхностно-активные вещества, многоатомные спирты, глицерин, сукрозу, сорбитол, глюкозу, Трис, натрия сульфат, калия сульфат, другие осмолиты или сходные соединения. Специфическая концентрация супрессора агрегации может быть определена установленным способом оптимизации, как описано в настоящем документе.

Окислительно-восстановительный компонент буфера для рефолдинга может быть любого состава с учетом, что окончательное тиол-дисульфидное соотношение окислительно-восстановительного компонента должно лежать в диапазоне от 0,001 до 100, например от 0,05 до 50, от 0,1 до 50,от 0,25 до 50, от 0,5 до 50, от 0,75 до 40, от 1,0 до 50 или от 1,5 до 50, от 2 до 50, от 5 до 50, от 10 до 50, от 15 до 50, от 20 до 50, от 30 до 50 или от 40 до 50, а тиол-дисульфидная буферная сила быть равна или больше 2 мМ, например большей или равной 2,25, 2,5, 2,75, 3, 5, 7,5, 10 или 15 мМ, где тиол-дисульфидная буферная сила эффективно ограничена максимумом 100 мМ. Переформулируя в терминах диапазонов буферная сила тиол-дисульфидной системы может находиться в диапазоне между 2 и 20 мМ, например между 2,25 и 20 мМ, 2,5 и 20 мМ, 2,75 и 20 мМ, 3 и 20 мМ, 5 и 20 мМ, 7,5 и 20 мМ, 10 и 20 мМ или 15 и 20 мМ. Способы идентификации подходящего окислительно-восстановительного компонента, т.е. подходящих величин тиол-дисульфидного соотношения и буферной силы, известен и/или описан в настоящем документе. Примеры специфических тиольных пар, которые могут формировать окислительно-восстановительный компонент, могут включать одно или более из следующих веществ: восстановленный глутатион, окисленный глутатион, цистеин, цистин, цистеамин, цистемин и β-меркаптоэтанол. Окислительновосстановительный компонент может быть оптимизирован, как описано в настоящем документе.

После того как белок вступит в контакт с окислительно-восстановительным компонентом, имеющим перечисленные значения тиол-дисульфидного соотношения и окислительно-восстановительной буферной силы, чтобы сформировать смесь для рефолдинга, эта смесь должна быть затем инкубирована в течение желаемого промежутка времени. Инкубация может быть проведена в неаэробных условиях, как описано в настоящем документе. Неаэробные условия не требуют совершенно освободиться от присутствия кислорода, но только отказаться от целенаправленного введения его добавочных количеств по сравнению с тем, которое содержалось в начальной системе. Инкубационный период варьирует и выбирается таким образом, чтобы достичь стабильного состояния смеси для рефолдинга, с желаемыми аналитическими свойствами. Период инкубации может длиться, например, 1 ч, 4 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч или дольше. Благодаря чувствительности рефолдинга при высоких концентрациях к содержанию кислорода в системе и тенденции к усилению кислородного массопереноса при малом масштабе методология и/или техника могут быть усовершенствованы, чтобы контролировать содержание кислорода и поддерживать неаэробные условия на этапе инкубации. В одном варианте процедура может включать приготовление, распределение и смешивание всех компонентов рефолдинга под покровом из инертного газа, такого как азот или аргон, чтобы избежать поступления кислорода в реакцию. Этот подход особенно полезен при идентификации приемлемой величины тиол-дисульфидного соотношения. В другом варианте, полезном при работе в масштабах от 15 л или меньше, свободное пространство в реакторе для рефолдинга, содержащего белок и буфер, можно продувать смесью инертного газа и воздуха или кислорода, запечатать реакционный сосуд и проводить смешивание при низкой скорости ротации в течение инкубационного периода. После инкубации белок выделяют из смеси для рефолдинга. Извлечение может быть достигнуто с использованием любого известного способа очистки белка. Если белок содержит домен Ре, например, то подходящим способом для его выделения является взаимодействие с белком А. В других вариантах могут быть использованы различные стратегии колоночной хроматографии в зависимости от природы извлекаемого белка. Примеры включают Н1С, АЕХ, СЕХ и БЕС хроматографию. Также могут быть рассмотрены нехроматографические методы разделения, такие как осаждение с солью, кислотой или полимером, таким как полиэтиленгликоль (см., например, публикацию США 20080214795). Другой альтернативный способ выделения белка из компонентов рефолдинга может включать диализ или диафильтрацию в фильтрационной системе с тангенциальным потоком.

В других примерах проведения рефолдинга тельца включения, полученные из экспрессионных систем организмов, не относящихся к млекопитающим, солюбилизуют в диапазоне содержания белка от 10 до 100 г/л и более, обычно 20-40 г/л примерно в течение 10-300 мин. Солюбилизованные тельца включения затем разбавляют, чтобы добиться восстановления денатурантов и восстановителей в растворе до уровня, который позволяет осуществление рефолдинга. В результате разбавления концентрация белка в буфере для рефолдинга, содержащем мочевину, глицерин или сахарозу, аргинин и окислительновосстановительную пару (например, цистеин и цистамин), находится в диапазоне от 1 до 15 г/л. В одном варианте окончательный состав включает 1-4 М мочевины, 5-40% глицерина или сахарозы, 25-500 мМ аргинина, 0,1-10 мМ цистеина и 0,1-10 мМ цистамина. Затем раствор перемешивается в течение инкубации, которая продолжается от 1 ч до 4 дней.

Как отмечено в настоящем документе, открытый способ особенно полезен для белков, экспрессия которых осуществлялась в экспрессионных системах организмов, не относящихся к млекопитающим, и более конкретно в бактериальных системах, в которых белок продуцируется в форме телец включения внутри бактериальной клетки. Белок может быть сложным белком, т.е. белком, который а) имеет молекулярную массу свыше 20000 или содержит более 250 аминокислотных остатков и б) содержит две или

- 9 020621 более дисульфидных связи в нативной форме. Когда экспрессия белка осуществляется в форме телец включения, вероятно, что любая дисульфидная связь, найденная в нативной форме, будет деформирована или не образуется вообще. Открытый способ применим к этим и другим формам целевых белков. Специфические примеры белков, которые могут быть подвергнуты данному способу рефолдинга, включают антитела, которые традиционно очень трудно поддаются рефолдингу, выполняемому обычными способами, при высоких концентрациях из-за их относительно крупного размера и числа дисульфидных связей. Способ также может быть использован для рефолдинга других молекул, содержащих фрагмент Рс, таких как пептидные антитела, и более широко при рефолдинге любых гибридных белков на основе домена Рс.

Другим аспектом раскрытого способа является его масштабируемость, которая позволяет реализовать его при любых масштабах, от лабораторного масштаба до производственного или коммерческого масштаба. Действительно, раскрытый способ найдет особое применение в коммерческом масштабе, где он может быть использован для эффективного рефолдинга больших количеств белка.

Данное раскрытие будет теперь проиллюстрировано ссылками на следующие примеры, которые изложены в отдельных вариантах. Однако следует отметить, что эти варианты носят иллюстративный характер и их не следует рассматривать как ограничивающие изобретение тем или иным образом.

Примеры

Примеры, представленные здесь, демонстрируют, что тиол-дисульфидное соотношение и окислительно-восстановительная буферная сила имеют большое значение в достижении эффективной реакции рефолдинга, не чувствительной к влияниям окружающей среды и аэрации. Нечувствительность является преимуществом с точки зрения легкости масштабирования и на уровне промышленного и коммерческого масштаба, при переносе процесса с одного завода на другой.

Примеры также демонстрируют, что при типичных для реакции рефолдинга концентрациях (0,012,0 г/л) чувствительность к внешней аэрации относительно понижена. Однако при концентрациях от 2 г/л и выше чувствительность реакции рефолдинга к тиол-дисульфидному соотношению и окислительновосстановительной буферной силе увеличивается, и почти все химические компоненты, особенно окислительно-восстановительные компоненты, возможно, необходимо будет корректировать, с учетом изменений в концентрации белка в реакции.

Пример 1. Экспрессия рекомбинантного белка.

В одном из экспериментов была осуществлена экспрессия рекомбинантных белков, включающих фрагмент Рс в экспрессионной системе организмов, не относящихся к млекопитающим, а именно Е. сой, и доведена до формирования цитоплазматических отложений в форме телец включения. Для каждого белка, подвергаемого рефолдингу, последовала следующая процедура.

После завершения фазы экспрессии клеточный бульон был центрифугирован и жидкая фаза удалена, оставив клетки в виде пасты. Клетки были ресуспендированы в воде приблизительно до 60% исходного объема. Затем клетки лизировали путем троекратного пропускания через гомогенизатор высокого давления. После того как клетки были лизированы, лизат был центрифугирован в тарельчатом сепараторе, чтобы собрать в твердой фракции белок, который был получен в ограниченно растворимой ненативной форме, именно в виде телец включения. Белковую массу многократно отмывали путем многократного ресуспендирования собранной твердой фазы в воде в количестве 50-80% от исходного объема ферментационного бульона, смешивания и центрифугирования, чтобы собрать белок в твердой фракции. Окончательно отмытые тельца включения были собраны и хранились в замороженном виде.

Пример 2. Идентификация условий рефолдинга/окислительно-восстановительных компонентов.

Были произведены нескольких сложных белков микробного происхождения. Каждый белок был солюбилизован при соответствующем уровне гуанидина и/или мочевины, обычно при уровнях, эквивалентных 4-6 М гуанидина, или 4-9 М мочевины, или сочетания обоих денатуратов, которые полностью денатурировали белок. Белок был редуцирован в присутствии ДТТ, 5-20 мМ, при рН 8,5 и выдержан при комнатной температуре примерно в течение 1ч.

Идентификация буфера для рефолдинга была произведена для каждого белка. Многофакторная матрица или серия многофакторных матриц были рассчитаны, чтобы индивидуализировать реакцию рефолдинга для достижения условий, оптимизирующих выход продукта и минимизирующих образование агрегатов. Был установлен идентификационный экран, чтобы систематически оценивать содержание мочевины, аргинина, глицерина и рН в многофакторной матрице, в которой каждый компонент варьировал в диапазоне по меньшей мере трех значений концентрации или уровней рН, при условии сохранения постоянства остальных параметров. Завершенные реакции были оценены с точки зрения выхода продукта и его качества методами обращенно-фазовой ВЭЖХ и гель-хроматографии, используя стандартные инструменты многомерного статистического анализа.

Лучшие результаты, выявленные как методами хроматографии обращенной фазы, так и гельхроматографии, наблюдались при использовании буфера для рефолдинга, содержащего денатурант (например, мочевину, диметилмочевину или другой хаотропный агент в диапазоне от уровней, не вызывающих денатурации, до уровней между 1 и 4 М), супрессор агрегации (например, аргинин при уровнях содержания между 5 и 500 мМ), стабилизатор белка (например, глицерин или сахарозу при уровнях со- 10 020621 держания между 5 и 40% (мас./об.) и окислительно-восстановительный компонент (например, цистеин или цистамин). Тиол-дисульфидное соотношение и окислительно-восстановительная сила буфера определяются, используя экспериментальную матрицу тиол-дисульфидного соотношения (от 0, до 100, более типично от 1 до 25) против буферной силы (типично от 2 до 20 мМ в зависимости от концентрации белка, числа цистеиновых остатков в белке и концентрации восстановителя, использованного для солюбилизации телец включения).

Индивидуальные реакции, возникающие при различных уровнях цистеина и цистамина, допускаются контролируемой матрицей тиол-дисульфидного соотношения при различных значениях окислительно-восстановительной силы буфера. Взаимоотношения рассчитаны, используя уравнения 3 и 4. Каждое состояние было показано как при аэробных, так и при неаэробных условиях, используя методики, описанные здесь. Были выбраны оптимальные условия, чтобы получить стабильный баланс между выходом продукта и желательным распределением продуктов фолдинга, нечувствительность к окислителям, присутствующим в окружающей среде (например, воздуху) и к нормальному варьированию ДТТ, переносимого из этапа солюбилизации.

Пример 3. Рефолдинг при высокой концентрации ненативных растворимых белков, извлеченных из клеточного лизата.

В одном из экспериментов была осуществлена экспрессия рекомбинантного белка, включающего в себя множество полипептидов, присоединенных к фрагменту Рс, в Е. сой в качестве внутриклеточной растворимой пептидной цепи, белок был лизирован из собранных и отмытых клеток, изолирован из лизата посредством аффинной хроматографии и затем подвергнут рефолдингу при концентрации приблизительно 12 г/л, как описано здесь.

После завершения фазы экспрессии аликвота, взятая из общего объема ферментационного бульона, была центрифугирована, жидкая фаза удалена, оставив клетки в виде пасты. Клетки были ресуспендированы в воде приблизительно до 60% от исходного объема. Затем клетки лизировали путем троекратного пропускания через гомогенизатор высокого давления. После того как клетки были лизированы, объем лизата перемешивали в присутствии воздуха в течение 8-72 ч, чтобы могла произойти димеризация полипептидных цепей. После процесса димеризации целевая пептидная цепь была выделена из лизатного объема с использованием аффинной хроматографической колонки с белком А. Элюционный объем колонки с белком А был смешан с буфером для рефолдинга при отношении 8 ч. элюционного материала к 2 ч. буфера, состоящего из мочевины (10 М), аргинин- НС1 (2,5 М), Трис при рН 8,5 (1050 мМ) и цистеина (10, 5 или 4 мМ) и цистамина (4 мМ). Разбавленную смесь титровали до рН 8,5 и выдерживали при температуре 5°С в атмосфере азота до достижения стабильного объема (~24 ч). Выход целевого продукта составил приблизительно 30-80% в зависимости от рассчитанных окислительно-восстановительных условий.

Чтобы создать неаэробные условия, сходные с типичными для крупномасштабного производства белка, осуществляются несколько шагов. Когда реакционный объем был меньше чем приблизительно 15 л, свободное пространство в сосуде, где осуществлялся рефолдинг, продули азотом, чтобы ограничить влияние, которое кислород может оказывать на систему. Затем сосуд был запечатан и начата инкубация.

Когда реакционные объемы были больше чем приблизительно 15 л, но менее 500 л, буфер для рефолдинга был приготовлен и оставлен для достижения равновесного содержания кислорода в растворе приблизительно при 5°С (обычно от 50 до 70% растворенного кислорода, относительно насыщенности воздуха) После того как смесь для рефолдинга была сформирована, свободное пространство в сосуде продули азотом, чтобы ограничить любое дополнительное влияние, которое кислород может оказать на систему, сосуд запечатали и начали инкубционный период.

Пример 4. Рефолдинг из телец включения при высокой концентрации.

В одном из экспериментов была произведена экспрессия в Е. сой в виде телец включения рекомбинантного белка, включающего биологически активную пептидную цепь, соединенную с С-окончанием фрагмента Рс-молекулы 1§С1 через линкер, имеющую молекулярную массу около 57 кДа и содержащую 8 дисульфидных связей. Тельца включения собирали, отмывали, концентрировали, солюбилизовали и затем производили рефолдинг при концентрации 6 г/л, как описано в настоящем документе.

Аликвоте замороженных концентрированных телец включения давали оттаять при комнатной температуре и смешивали с соответствующим количеством гуанидина и/или мочевины, чтобы создать уровень денатурации, эквивалентный 4-6 М гуанидина, который полностью денатурирует белок. Затем белок был восстановлен с помощью ДТТ, при уровне 5-20 мМ и рН 8,5 и выдержан при комнатной температуре приблизительно в течение 1 ч. После того как тельца включения подверглись растворению, денатурации и восстановлению, они были растворены в буфере для рефолдинга, содержащем мочевину (1-5 М), аргинин-НС1 (5-500 мМ), глицерин (10-30% мас./об.) и идентифицированные уровни цистеина и цистамина, как определено методикой, описанной в примере 2.

Конечная концентрация компонентов составляет 4 М мочевины, 150 мМ аргинин-НС1, 20,9% (мас./об.) глицерина, 2,03 мМ цистеина и 2,75 мМ цистамина. Степень разбавления была выбрана, чтобы уравновесить разбавление денатурантов, оставшихся после солюбилизации, поддержать термодинамиче- 11 020621 скую стабильность молекулы во время рефолдинга и обеспечить максимально возможную концентрацию белка в смеси для рефолдинга. Разбавленная смесь была оттитрована до щелочного рН (между рН 8 и 10) и инкубирована при 5°С при неаэробных условиях, пока не было достигнуто стабильное состояние (1272 ч), как было определено соответствующими аналитическими измерениями. В результате процесса была продемонстрирована устойчивая масштабируемость от масштаба 1 до 2000 л (см. фиг. 3). Выходы целевого продукта составили приблизительно 27-35% при обоих масштабах. Отклонения в распределении продукта относительно примесей также поддерживались на сжатом уровне (см. фиг. 3).

При малом масштабе легко возникает кислородный массоперенос, который должен быть ингибирован, чтобы имитировать относительно слабый массоперенос, наблюдаемый при крупном масштабе, где объем раствора, в котором осуществляется рефолдинг, велик по сравнению с объемом воздуха и площадью поверхности крупномасштабного сосуда. Далее, чтобы создать неаэробные условия, сходные с теми, которые типичны для производства белка в очень крупном масштабе, было осуществлено несколько шагов. В случае, когда реакционные объемы были менее чем приблизительно 15 л, буфер для рефолдинга продували азотом, чтобы удалить из раствора кислород, компоненты дозировали под защитным слоем азота и, как только смесь была сформирована, свободное пространство над жидкостью в сосуде продули азотом, чтобы ограничить влияние, которое кислород мог оказать на систему. Сосуд запечатали, и началась инкубация.

Когда реакционные объемы были более чем приблизительно 15 л, но менее 500 л, буфер для рефолдинга был приготовлен и оставлен для достижения равновесного содержания кислорода в растворе приблизительно при 5°С (обычно от 50 до 70% растворенного кислорода, относительно насыщенности воздуха). После того как смесь для рефолдинга была сформирована, свободное пространство в сосуде продули азотом, чтобы ограничить любое дополнительное влияние, которое кислород может оказать на систему, сосуд запечатали, и начался инкубционный период.

При масштабах, превышающих 500 л, буфер для рефолдинга был приготовлен и оставлен для достижения равновесного содержания кислорода в растворе приблизительно при 5°С (обычно от 50 до 70% растворенного кислорода относительно насыщенности воздуха). После того как смесь для рефолдинга была сформирована, сосуд запечатали, и начался инкубационный период.

Концентрация белка в смеси для рефолдинга составляла 6 г/л, что четырехкратно превышало концентрацию 1,5 г/л, достигаемую при использовании других способов, чем способ, описанный в этом примере. Общая годовая продуктивность процесса в рамках одной конкретной производственной мощности, по расчетам, должна увеличиться на >930% благодаря увеличению объемной эффективности существующих производственных емкостей.

Пример 5. Влияние степени окисления тиол-дисульфидной системы на формирование дисульфидных связей.

Фиг. 1а-1£ демонстрируют, что сдвиг тиол-дисульфидного соотношения в сторону большего окисления (более низкое тиол-дисульфидное соотношение) повышает долю продукта с окисленными аминокислотными остатками и смешанными дисульфидными формами. Когда тиол-дисульфидное соотношение сдвигается в сторону более восстановленного состояния (более высокое тиол-дисульфидное соотношение), это проявляется в понижении уровней содержания соединений с окисленными аминокислотами и повышении уровней продуктов с некорректно сформированными дисульфидными связями или несформированными дисульфидными связями. При изменении общей буферной силы тиол-дисульфидной системы соответствующее тиол-дисульфидное соотношение сдвигается. Этот эффект обнаруживает сходство с тем, как буферная сила регулирует чувствительность рН к добавлению в буферный раствор кислоты или основания.

Была обеспечена достижимость оптимального баланса соединений. Как показано на фиг. 1а-1£, имеется ясная взаимосвязь между буферной силой тиол-дисульфидной системы и тиол-дисульфидным соотношением, которое можно идентифицировать для оптимального баланса соединений и, таким образом, способствовать эффективному рефолдингу белков с низкой растворимостью. Способность контролировать продукцию различных соединений, таких как соединения с некорректно сформированной дисульфидной связью и неправильно свернутых соединений, через модуляцию тиол-дисульфидного соотношения и буферной силы тиол-дисульфидной системы, дает возможность эффективно и надежно осуществлять последующие процессы очистки.

Пример 6. Влияние неаэробных условий на эффективность рефолдинга.

Фиг. 2 и 3 демонстрируют, что когда буферная сила тиол-дисульфидной системы подобрана правильно, принимая в расчет концентрацию белка и число цистеиновых остатков в белке, чувствительность к внешним влияниям, таким как кислород, заметно уменьшается. Это позволяет проводить рефолдинг в неаэробных условиях, что значительно облегчает переход между масштабами процесса и конфигурациями реактора.

Фиг. 2 сравнивает аналитическое распределение соединений по данным ВЭЖХ с обращенной фазой между 15 и 20 л масштабами рефолдинга, по нескольким условиям окружающей среды. Для варианта 1 (линия, обозначенная 1 на фиг. 1) солюбилизационные реактивы и растворы дозировались на воздухе,

- 12 020621 и смесь для рефолдинга была инкубирована на воздухе. В варианте 2 солюбилизационные реактивы и растворы дозировались на воздухе, а инкубация проводилась под защитным покровом азота. В вариантах 3-7 солюбилизационные реактивы и растворы дозировались под защитным покровом азота, и в условиях 3, 5, 6 и 7 солюбилизационные реактивы и растворы инкубировались в среде азота. В варианте 7 раствор для рефолдинга был также освобожден от азотного покрова до соединения с солюбилизационным раствором. В варианте 4 солюбилизационные реактивы и растворы были инкубированы в условиях окружающей атмосферы.

Результаты, показанные на фиг. 2, демонстрируют, что варианты, при которых солюбилизационные реактивы и растворы были распределены или инкубированы в присутствии воздуха (т.е. варианты 1, 2 и 4) не достигают результатов, сравнимых с крупномасштабным контролем. В вариантах 1, 2 и 4 наблюдается увеличение формирования окисленных соединений (пре-пики). Препики указаны стрелками на панели для вариантов 1, 2 и 4.

Фиг. 3 демонстрирует аналитические результаты, полученные при ВЭЖХ с обращенной фазой в идентифицированных условиях, полученных, как описано в примере 2, при масштабах в 1 л и в 2000 л. На этой фиг. отсутствуют существенные различия между обнаруживаемым распределением соединений. Взятые вместе фиг. 2 и 3 демонстрируют, что когда аэрация тщательно контролируется, реакции рефолдинга в малых масштабах позволяют лучше прогнозировать те результаты, которые ожидаются при росте масштаба, содействуя осуществлению крупномасштабных процессов рефолдинга белка.

Claims (22)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ рефолдинга сложного мультимерного белка, экспрессированного в экспрессионной системе организма, не относящегося к млекопитающим, и присутствующего в объеме в концентрации 2 г/л или более, включающий:

   (а) приведение белка в контакт с буфером для рефолдинга, содержащим окислительновосстановительный компонент с окончательным тиол-дисульфидным соотношением в диапазоне от 0,001 до 100 и окислительно-восстановительной силой буфера 2 мМ и более, и один или более из компонентов:

   (ί) денатурант, (ίί) супрессор агрегации и (ίίί) стабилизатор белка; для формирования смеси для рефолдинга;

   причем тиол-дисульфидное соотношение рассчитывают в соответствии с уравнением 1 [восстановитель]² [окислитель] причем окислительно-восстановительную силу буфера рассчитывают в соответствии с уравнением 2 2[окислитель ]+[ восстановител ь];

   причем указанное тиол-дисульфидное соотношение и указанную окислительно-восстановительную силу буфера варьируют согласно полной или частичной факторной матрице, причем значение тиол-дисульфидного соотношения и значение окислительно-восстановительной силы буфера в указанном буфере для рефолдинга являются такими соответствующими значениям, которые приводят к более высокому выходу желаемой формы указанного сложного мультимерного белка, чем выход, получаемый до указанного варьирования указанного тиол-дисульфидного соотношения и указанной окислительно-восстановительной силы буфера, (б) инкубацию смеси для рефолдинга и (в) выделение белка из смеси для рефолдинга.
2. 2. Способ по п.1, в котором окончательное тиол-дисульфидное соотношение выбирают из группы, состоящей из от 0,05 до 50, от 0,1 до 50, от 0,25 до 50, от 0,5 до 50, от 0,75 до 40, от 1,0 до 50 или от 1,5 до 50, от 2 до 50, от 5 до 50, от 10 до 50, от 15 до 50, от 20 до 50, от 30 до 50 или от 40 до 50.
3. 3. Способ по п.1, в котором буферную силу тиол-дисульфидной системы выбирают из группы, состоящей из больше или равной 2,25, 2,5, 2,75, 3, 5, 7,5, 10 или 15 мМ.
4. 4. Способ по п.1, в котором белок представлен в объеме в ненативной форме с ограниченной растворимостью.
5. 5. Способ по п.4, в котором ненативная форма с ограниченной растворимостью представлена тельцем включения.
6. 6. Способ по п.1, в котором белок представлен в объеме в растворимой форме.
7. 7. Способ по п.1, в котором белок является рекомбинантным.
8. 8. Способ по п.1, в котором белок является эндогенным.
9. 9. Способ по п.1, в котором белок является антителом.
10. 10. Способ по п.1, в котором белок является конъюгатом Рс-белка.
11. 11. Способ по п.1, в котором экспрессионная система организма, не относящегося к млекопитаю- 13 020621 щим, является бактериальной экспрессионной системой или экспрессионной системой дрожжей.
12. 12. Способ по п.1, в котором денатурант выбирают из группы, состоящей из мочевины, солей гуанидина, диметилмочевины, метилмочевины и этилмочевины.
13. 13. Способ по п.1, в котором стабилизатор белка выбирают из группы, состоящей из аргинина, пролина, полиэтиленгликолей, неионных поверхностно-активных веществ, ионных поверхностно-активных веществ, многоатомных спиртов, глицерина, сахарозы, сорбитола, глюкозы, Трис, натрия сульфата, калия сульфата и осмолитов.
14. 14. Способ по п.1, в котором супрессор агрегации выбирают из группы, состоящей из аргинина, пролина, полиэтиленгликолей, неионных поверхностно-активных веществ, ионных поверхностноактивных веществ, многоатомных спиртов, глицерина, сахарозы, сорбита, глюкозы, Трис, натрия сульфата, калия сульфата и осмолитов.
15. 15. Способ по п.1, в котором тиол-дисульфидная система включает по меньшей мере один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из восстановленного глутатиона, окисленного глутатиона, цистеина, цистина, цистеамина, цистамина и β-меркаптоэтанола.
16. 16. Способ по п.1, в котором инкубацию производят в неаэробных условиях.
17. 17. Способ по п.1, в котором разделение включает контакт с аффинной разделительной матрицей.
18. 18. Способ по п.17, в котором аффинная разделительная матрица представлена матрицей с белком А или разделительной матрицей смешанного типа.
19. 19. Способ по п.1, в котором разделение включает контакт смеси с ионообменной разделительной матрицей.
20. 20. Способ по п.1, в котором разделение дополнительно включает этап фильтрации.
21. 21. Способ по п.20, в котором этап фильтрации включает глубинную фильтрацию.
22. 22. Способ по п.1, в котором указанное варьирование дополнительно предусматривает систематическое варьирование времени инкубации, концентрации указанного сложного мультимерного белка и рН.