JP6026608B2 - 化学的に制御されたレドックス状態を用いたタンパク質のリフォールディング - Google Patents
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Description
本明細書における「a」および「an」という用語は、他に明記されない限りは、1以上を意味する。
プール中に2.0g/L以上の濃度で存在する微生物由来分子をリフォールディングすることは、様々な理由で、主として反応容量が関連して減少し、そして工程の処理能力が上昇するため、有利となる。工程の規模調整の見地から、有酸素条件を必要としない条件下でリフォールディングすることが有利であり、そのような条件は、例えば、一定した、もしくは間欠的なスパージングにより、空気もしくは酸素のヘッドスペースのオーバーレイを実行すること、ヘッドスペースを加圧すること、または効率の高い混合を利用することにより、実現することができる。系の酸素濃度は、物質移動に関連するため、リフォールディング反応の規模調整は、タンクの幾何学的配置、容量、および混合変化などの因子のため、かなり困難となる。更に、酸素はタンパク質中のジスルフィド結合形成における直接の反応体でない場合があるため、物質移動係数に直接結びつく可能性は低い。これは、反応の規模調整を更に複雑にする。それゆえ、無酸素で化学的に制御されたレドックス系が、タンパク質をリフォールディングするのに好ましい。そのような条件の例を、本明細書に提供する。
開示されたリフォールディング方法は、非哺乳類発現系中で発現されたタンパク質をリフォールディングするのに特に有用である。本明細書に注記される通り、非哺乳類細胞は、可溶性または完全に不溶性または非天然の難溶性形態のいずれかで細胞内に発現される組換えタンパク質を生成するように設計することができる。多くの場合、その細胞は、組換えタンパク質を封入体と呼ばれる大型の不溶性または難溶性凝集体中に沈着させる。しかし、特定の細胞増殖条件(例えば、温度またはpH)を改変して、組換えタンパク質を細胞内の可溶性モノマー形態で生成するように細胞を操作することができる。不溶性の封入体中でタンパク質を生成する代わりに、Fc領域を含むタンパク質をはじめとする可溶性タンパク質としてタンパク質を発現させて、それをアフィニティークロマトグラフィーにより細胞溶解物から直接捕捉することができる。溶解物から直接捕捉することで、比較的純粋なタンパク質のリフォールディングが可能になり、封入体の処理で必要となる非常に徹底した回収および分離工程が回避される。しかし、リフォールディング方法は、アフィニティー精製されている試料に限られるわけではなく、多量の細胞溶解物中に見出されるタンパク質(即ち、任意の方法で精製されていないタンパク質)など、非哺乳類発現系中で発現されたタンパク質を含む任意の試料に適用することができる。
組換えタンパク質の発現
一実験において、Fc部分を含む組換えタンパク質を、非哺乳類発現系、即ち、大腸菌の中で発現させ、封入体の形態の細胞質沈着物を形成するように操作した。リフォールディングされた各タンパク質で、以下の手順に従った。
リフォールディング条件/レドックス成分の特定
多重複合体である細菌由来タンパク質を評価した。各タンパク質を、グアニジンおよび/または尿素を適切なレベルで、典型的にはグアニジン4〜6Mもしくは尿素4〜9Mに相当するレベルで、または両方の変性剤の混合物で可溶化して、タンパク質を完全に変性させた。タンパク質をpH8.5のDTT 5〜20mMで還元して、室温で約1時間インキュベートした。
細胞溶解物から捕捉された非天然型可溶性タンパク質形態の高濃度リフォールディング
一実験において、Fc部分に結合した多数のポリペプチドを含む組換えタンパク質を、細胞内可溶性ペプチド鎖として大腸菌中で発現させ、回収および洗浄した細胞から溶解し、溶解物からアフィニティークロマトグラフィーにより単離し、その後、本明細書に記載された通り、約12g/Lの濃度でリフォールディングした。
封入体からの高濃度リフォールディング
一実験において、リンカーを介してIgG1分子のFc部分のC末端に結合した生物活性ペプチドを含み、約57kDaの分子量を有し、そしてジスルフィド結合を8個含む組換えタンパク質を、封入体として大腸菌中で発現させ、回収、洗浄、濃縮、可溶化、そして本明細書に記載された通り、6g/Lの濃度でリフォールディングした。
ジスルフィド対合に対するチオール対酸化状態の影響
図1a〜1fで、チオール対比をより酸化状態(より低いチオール対比)にする程、より高い割合の生成物種が、酸化されたアミノ酸および混合されたジスルフィド形態を有する。チオール対比をより還元状態(より高いチオール対比)に操作すれば、酸化されたアミノ酸変種がより低レベルになり、間違ったジスルフィド対合または未形成のジスルフィド結合を有する生成物種がより高レベルになる。全体的なチオール対緩衝液強度が改変されれば、対応する最適なチオール対比がシフトする。この効果は、緩衝液強度が緩衝溶液への酸および塩基付加に対するpHの感受性を調整する様式に類似している。
リフォールディング効率に対する無酸素条件の影響
図2および3は、タンパク質濃度およびタンパク質中のシステイン残基の数を考慮して、チオール対緩衝液強度が適宜選択されると、酸素などの外部からの影響への感受性が大幅に低下することを実証している。これにより、無酸素リフォールディング条件が可能になり、規模と反応器の構成の間の転換が著しく容易になる。
Claims (32)
- 非哺乳類発現系中に発現されたタンパク質をリフォールディングする方法であって、
(a)タンパク質をリフォールディング緩衝液に接触させてリフォールディング混合物を形成する工程であって、前記タンパク質は前記リフォールディング混合物中に2.0g/L以上の濃度で存在し、および、前記リフォールディング緩衝液は、
(i)最終的なチオール対比を含むレドックス成分であって、前記最終的なチオール対比は0.001〜50の範囲を有し、および、前記チオール対比は、式1:
(ii)2mM以上のチオール対緩衝液強度であって、前記チオール対緩衝液強度は、式2:
(iii)変性剤、凝集抑制剤およびタンパク質安定化剤のうちの少なくとも1つを含む工程、ならびに、
(b)前記リフォールディング混合物をインキュベートする工程を含む、前記方法。 - タンパク質が、ジスルフィド結合を2個以上含む、請求項1に記載の方法。
- 方法が(c)工程(b)からリフォールディングされたタンパク質を単離する工程をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- タンパク質が、リフォールディング混合物中に2〜40g/Lの濃度で存在する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質が、リフォールディング混合物中に10〜20g/Lの濃度で存在する、請求項4に記載の方法。
- リフォールディング緩衝液が、変性剤、凝集抑制剤およびタンパク質安定化剤を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質が抗体である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質がFcドメインを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 最終的なチオール対比が1〜25の範囲を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- チオール対緩衝液強度が5mM以上である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)におけるタンパク質が、リフォールディング緩衝液と接触する際、非天然の難溶性形態で存在する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 非天然の難溶性形態が封入体である、請求項11に記載の方法。
- インキュベーションを無酸素条件下で実施する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 非哺乳類発現系が細菌発現系または酵母発現系である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 非哺乳類発現系が細菌発現系である、請求項14に記載の方法。
- 細菌発現系が大腸菌(E.coli)発現系である、請求項15に記載の方法。
- 大腸菌(E.coli)発現系中に発現されたタンパク質をリフォールディングする方法であって、
(a)タンパク質をリフォールディング緩衝液に接触させてリフォールディング混合物を形成する工程であって、前記タンパク質は前記リフォールディング混合物中に2〜40g/Lの濃度で存在し、および、前記リフォールディング緩衝液は、
(i)最終的なチオール対比を含むレドックス成分であって、前記最終的なチオール対比は1〜50の範囲を有し、および、前記チオール対比は、式1:
(ii)2mM〜20mMのチオール対緩衝液強度であって、前記チオール対緩衝液強度は、式2:
(iii)変性剤、凝集抑制剤およびタンパク質安定化剤のうちの少なくとも1つを含む工程、ならびに、
(b)前記リフォールディング混合物を無酸素条件下でインキュベートする工程を含む、前記方法。 - タンパク質が、ジスルフィド結合を2個以上含む、請求項17に記載の方法。
- 方法が(c)工程(b)からリフォールディングされたタンパク質を単離する工程をさらに含む、請求項17または18に記載の方法
- リフォールディング緩衝液が、変性剤、凝集抑制剤およびタンパク質安定化剤を含む、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質が、リフォールディング混合物中に10〜20g/Lの濃度で存在する、請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質が抗体である、請求項17〜21のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質がFcドメインを含む、請求項17〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 最終的なチオール対比が1〜25の範囲を有する、請求項17〜23のいずれか一項に記載の方法。
- チオール対緩衝液強度が5mM〜20mMである、請求項17〜24のいずれか一項に記載の方法。
- チオール対緩衝液強度が10mM〜20mMである、請求項25に記載の方法。
- 工程(a)におけるタンパク質が、リフォールディング緩衝液と接触する際、非天然の難溶性形態で存在する、請求項17〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 非天然の難溶性形態が封入体である、請求項27に記載の方法。
- 変性剤が、尿素、グアニジニウム塩、ジメチル尿素、メチル尿素およびエチル尿素からなる群より選択される、請求項17〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 凝集抑制剤が、アルギニン、プロリン、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、多価アルコール、グリセロール、スクロース、ソルビトール、グルコース、トリス、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムおよびオスモライトからなる群より選択される、請求項17〜29のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質安定化剤が、アルギニン、プロリン、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、多価アルコール、グリセロール、スクロース、ソルビトール、グルコース、トリス、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムおよびオスモライトからなる群より選択される、請求項17〜30のいずれか一項に記載の方法。
- チオール対が、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、システイン、シスチン、システアミン、シスタミンおよびβ−メルカプトエタノールからなる群より選択されるチオール対を少なくとも1種含む、請求項17〜31のいずれか一項に記載の方法。
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