CN102482321A - 使用化学控制的氧化还原态重折叠蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种将在非哺乳动物细胞中表达并以2.0g/L或更高的浓度存在的蛋白重折叠的方法。所述方法包括确定巯基对比率和氧化还原缓冲强度以获得以下条件，在该条件下实现以2.0g/L或更高的浓度有效折叠并且该条件可在包括商业规模在内的体积范围内使用。

Description

使用化学控制的氧化还原态重折叠蛋白质
本申请要求2009年6月22日提交的美国临时申请第61/219,257号的权益，其通过引用并入本文。
发明领域
本发明通常涉及将高浓度的蛋白重折叠，以及更特别地将在一定体积中2.0g/L及更高的浓度的蛋白重折叠。
发明背景
重组蛋白可在许多种表达系统中表达，包括非哺乳动物细胞，例如细菌和酵母。与重组蛋白在原核细胞例如细菌中的表达有关的一个难题是所表达的蛋白以通常被称作包涵体的有限溶解度的细胞内沉淀物沉淀。包涵体作为细菌宿主细胞在高水平表达时不能正确折叠重组蛋白的结果并作为蛋白变得不能溶解的后果而形成。这尤其符合真核来源的大的、复杂的或蛋白序列的原核表达。不正确折叠的重组蛋白的形成在某种程度上限制了细菌性发酵以高水平的效率生产重组的大的复杂蛋白的商业应用。
自以商业上可行的水平在非哺乳动物表达系统例如细菌中重组表达蛋白的出现以来，不同的方法已经被开发用于从细菌包涵体获得正确折叠的蛋白。这些方法通常遵循以下程序：表达通常以包涵体沉淀的蛋白、裂解细胞、收集包涵体然后将包涵体溶解在包含变性剂或表面活性剂以及任选还原剂的增溶缓冲液中，所述增溶缓冲液展开蛋白并且将包涵体分解为几乎没有结构的单独的蛋白链。随后，将蛋白链用帮助向生物学活性形式复性的重折叠缓冲液稀释或洗涤。当半胱氨酸残基在蛋白的一级氨基酸序列中存在时，其常常需要在允许正确形成二硫键的环境(例如氧化还原系统)中完成重折叠。
复杂分子(例如包含两个或更多个二硫键的分子)的典型重折叠浓度小于2.0g/L，以及更通常地为0.01-0.5g/L(Rudolph和Lilie，(1996)FASEB J.10：49-56)。因此，由于以这些通常的产物浓度重折叠蛋白所需要的大体积，故以工业生产规模将大量的复杂蛋白例如抗体、肽体(peptibody)或其他Fc融合蛋白重折叠具有显著的局限性，并且是面对工业时的常见问题。限制这些类型的蛋白的重折叠浓度的一个因素是不正确配对的二硫键的形成，这可反过来增加那些形式的蛋白聚集的倾向。由于以工业规模的蛋白生产运作时涉及大量材料和大的池尺寸，大量时间以及资源可通过将工艺中的一个或多个步骤排除或简化来节省。
尽管之前已经表明在较高浓度下的蛋白重折叠，但是被重折叠的蛋白是分子量上显著较小的、仅包含一个或两个二硫键的较不复杂的分子中的任一种(参见例如Creighton，(1974)J.MoI.Biol.87：563-577)。此外，这类蛋白的重折叠方法利用基于洗涤剂的重折叠化学(参见例如
Figure BPA00001482384100021
等人(1997)Eur J Biochem 248：684-691)或利用高压折叠策略(St John等人，(2001)J.Biol.Chem.276(50)：46856-63)。更复杂的分子例如抗体、肽体和其他大蛋白通常并不顺从洗涤剂重折叠条件并且通常在离液序列高的重折叠溶液中重折叠。这些更复杂的分子通常具有多于两个的二硫键，通常在8和24个二硫键之间，并且可以是形成同二聚体或异二聚体的多链蛋白。
在本公开内容之前，这些类型的复杂分子都不能在高浓度(即2.0g/L以及更高的浓度)和以对小规模(并且特别不是在工业规模上)来说有任何有意义的效率程度被重折叠。相反，本文公开的方法可以高浓度在小或大(例如工业)的规模上进行以提供正确重折叠的复杂蛋白。以高浓度和大规模重折叠蛋白的能力不仅可转化为重折叠操作自身增加的效率，而且还代表通过排除对另外的设备和人力的需要而节省的时间和成本。因此，重折叠以高浓度存在的蛋白的方法可转化为对蛋白生产工艺来说较高的效率和成本节省。
附图简述
图1是描述巯基对比率和氧化还原缓冲强度对产物物类(species)分布的影响的一系列曲线图；图1a描述5mM缓冲强度的影响；图1b描述7.5mM缓冲强度的影响；图1c描述10mM缓冲强度的影响；图1d描述12.5mM缓冲强度的影响；图1e描述15mM缓冲强度的影响；图1f描述20mM缓冲强度的影响。
图2是描述在固定的巯基对比率和巯基对缓冲强度下通气的程度对物类分布的影响的一系列曲线图。
图3是以6g/L进行并且使用在1L和2000L进行的所述方法的实施方案最优化的化学控制的非需氧重折叠的分析叠加。
发明概述
一种将在非哺乳动物表达系统中表达并且在一定体积中以2.0g/L或更高的浓度存在的蛋白重折叠的方法，包括(a)将所述蛋白与重折叠缓冲液接触以形成重折叠混合物，所述重折叠缓冲液包含氧化还原组分以及下列中的一种或多种：(i)变性剂；(ii)聚集抑制剂和(iii)蛋白稳定剂，所述氧化还原组分包含具有0.001至100的范围的最终巯基对比率和2mM或更高的氧化还原缓冲强度；(b)将所述重折叠混合物孵育；以及(c)将所述蛋白从所述重折叠混合物中分离。
在不同的实施方案中，所述氧化还原组分具有高于或等于0.001但是小于或等于100，例如在0.05至50、0.1至50、0.25至50、0.5至50、0.75至40、1.0至50或1.5至50、2至50、5至50、10至50、15至50、20至50、30至50或40至50的范围内的最终巯基对比率，以及等于或高于2mM例如高于或等于2.25mM、2.5mM、2.75mM、3mM、5mM、7.5mM、10mM或15mM的巯基对缓冲强度，其中所述巯基对缓冲强度被有效地界定在100mM的最大值。重申的是，就范围而言，巯基缓冲强度可在2mM和20mM之间，例如2.25mM和20mM、2.5mM和20mM、2.75mM和20mM、3mM和20mM、5mM和20mM、7.5mM和20mM、10mM和20mM、或15mM和20mM之间，以形成混合物。
在重折叠缓冲液的一个实施方案中，所述重折叠缓冲液包含在Tris缓冲液中的脲、精氨酸-HCl、半胱氨酸和胱胺。在另外的实施方案中，所述组分以实施例3中描述的比例存在于所述重折叠缓冲液中。
在重折叠缓冲液的另一个实施方案中，所述重折叠缓冲液包含在Tris缓冲液的脲、精氨酸-HCl、甘油、半胱氨酸和胱胺。在另外的实施方案中，所述组分以实施例4中描述的比例存在于所述重折叠缓冲液中。
在某些实施方案中，蛋白最初在一定体积中以非天然的有限溶解度形式例如包涵体存在。备选地，蛋白在所述体积中以可溶形式存在。蛋白可以是重组蛋白或其可以是内源性蛋白。所述蛋白可以是复杂蛋白例如抗体或多聚体蛋白。在另一个实施方案中，蛋白是Fc-蛋白缀合物，例如与Fc结构域融合或连接的蛋白。
非哺乳动物表达系统可以是细菌表达系统或酵母表达系统。
所述重折叠缓冲液中的所述变性剂可选自脲、胍盐、二甲基脲、甲基脲和乙基脲。所述重折叠缓冲液中的所述蛋白稳定剂可选自精氨酸、脯氨酸、聚乙二醇、非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、多元醇、甘油、蔗糖、山梨醇、葡萄糖、Tris、硫酸钠、硫酸钾和渗压剂。所述聚集抑制剂可选自精氨酸、脯氨酸、聚乙二醇、非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、多元醇、甘油、蔗糖、山梨醇、葡萄糖、Tris、硫酸钠、硫酸钾和渗压剂。所述巯基对可包含至少一种选自以下的组分：还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、半胱胺、胱胺和β-巯基乙醇。
在不同的实施方案中，纯化可包括将所述混合物与亲和分离基质例如A蛋白或G蛋白树脂接触。备选地，亲和树脂可以是混合型分离基质或离子交换分离基质。在不同的方面，孵育可在需氧条件或在非需氧条件下进行。
发明详述
相关文献表明当将不同的蛋白重折叠操作最优化时，重折叠缓冲液巯基对比率已经被有目的地改变了并且因此巯基缓冲强度不知不觉地在宽范围的强度内变化(参见例如Lilie，Schwarz&Rudolph，(1998)Current Opinion in Biotechnology 9(5)：497-501和Tran-Moseman，Schauer&Clark(1999)Protein Expression&Purification 16(1)：181-189)。在一项研究中，研究了溶菌酶(形成熔球的一种简单的单链蛋白)的巯基对比率和缓冲强度之间的关系。(DeBernardez等人，(1998)Biotechnol.Prog.14：47-54)。De Bernardez的工作在仅考虑单向反应模型的动力学的模型方面描述了巯基浓度。然而，最复杂的蛋白受不易描述的可逆的热力学平衡支配(参见例如Darby等人，(1995)J.MoI.Biol.249：463-477)。在含有许多二硫键的大的多链蛋白例如抗体、肽体和其他Fc融合蛋白的情况下预期有更复复杂的行为。在本公开内容之前，就与蛋白生产的效率有关的复杂蛋白而言，没有为巯基缓冲强度、巯基对比率化学和蛋白浓度提供具体关系。因此，以高度浓缩的体积重折叠蛋白的能力在很大程度上是低效或不可完成的目标，导致蛋白生产中的瓶颈，尤其是在工业规模上。
在本公开内容之前，对于复杂蛋白没有公开巯基对比率和巯基对缓冲强度的独立影响的具体控制的研究。如本文所描述的，通过与巯基对比率和蛋白浓度结合控制巯基对缓冲强度，蛋白折叠操作的效率可被最优化和提高，并且可在高浓度(例如2g/L或更高)完成蛋白的重折叠。
因此，在一个方面，本公开内容涉及促进在高蛋白浓度(例如高于2.0g/L的浓度)下的蛋白重折叠的氧化还原巯基对比率化学的鉴定和控制。所述方法可被用于任何类型的蛋白，包括简单蛋白和复杂蛋白(例如包含2-23个二硫键或多于250个氨基酸残基或具有大于20,000道尔顿的MW的蛋白)，包括含有Fc结构域的蛋白，例如抗体、肽体和其他Fc融合蛋白，并且可在实验室规模(通常毫升或升规模)、中试工厂规模(通常几百升)或工业规模(通常几千升)上进行。已知为肽体和其他Fc融合物的复杂分子的实例描述于美国专利第6,660,843号、美国专利第7,138,370号和美国专利第7,511,012号。
如本文所描述的，巯基缓冲强度和氧化还原巯基对比率之间的关系已经被研究并且优化以便提供在各种规模上以2.0g/L或更高的浓度将蛋白重折叠的可重现的方法。推导出数学公式以允许精确计算单独的氧化还原偶组分的比率和强度，从而获得缓冲液巯基对比率和缓冲液巯基强度的矩阵。一旦这一关系被建立，那么系统地证明巯基缓冲强度和巯基对比率相互作用以限定在重折叠反应中所产生的产物相关物类的分布是可能的。
然而缓冲液巯基对比率仅仅是在总反应中确定总系统巯基对比率的一个组分。由于未折叠的蛋白中的半胱氨酸残基同样是反应物，故缓冲液巯基强度需要随蛋白浓度的增加成比例变化以获得最佳的系统巯基对比率。因此，除了证明缓冲液巯基强度与巯基对比率相互作用之外，还显示缓冲液巯基强度还与总反应中的蛋白浓度相关。对缓冲液巯基强度和系统巯基对比率的优化可针对特定蛋白例如复杂蛋白定制以将半胱氨酸错配最小化但仍促进高浓度的重折叠。
I.定义
如本文所用的，术语“一个”和“一”意指一个或多个，除非以另外的方式特别说明。
如本文所用的，术语“非哺乳动物表达系统“意指用于在源自除了哺乳动物以外的生物体的细胞中表达蛋白的系统，所述生物体包括但不限于原核生物，包括细菌例如大肠杆菌(E.coli)，和酵母。通常非哺乳动物表达系统被用来表达目标重组蛋白，而在另外情况下，目标蛋白是通过非哺乳动物细胞表达的内源性蛋白。对于本公开内容的目的，不管目标蛋白是内源的还是重组的，如果蛋白在非哺乳动物细胞中表达，那么这一细胞是“非哺乳动物表达系统”。简单地说，“非哺乳动物细胞”是源自除了哺乳动物之外的生物体的细胞，其实例包括细菌或酵母。
如本文所用的，术语“变性剂”意指当被放置与蛋白接触时具有除去蛋白的二级和三级结构中的一些或全部的能力的任何化合物。术语变性剂是指影响变性的特别的化学化合物以及包含影响变性的特别的化合物的溶液。可在所公开的方法中使用的变性剂的实例包括但不限于脲、胍盐、二甲基脲、甲基脲、乙基脲及其组合。
如本文所用的，术语“聚集抑制剂”意指具有破坏并降低或消除两种或更多种蛋白之间的相互作用的能力的任何化合物。聚集抑制剂的实例可包括但不限于氨基酸，例如精氨酸、脯氨酸和甘氨酸；多元醇和糖，例如甘油、山梨醇、蔗糖和海藻糖；表面活性剂，例如聚山梨酯20、CHAPS、Triton X-100和十二烷基麦芽糖苷；及其组合。
如本文所用的，术语“蛋白稳定剂”意指具有改变蛋白的反应平衡状态使得改进或有利于蛋白的天然状态的能力的任何化合物。蛋白稳定剂的实例可包括但不限于糖和多元醇，例如甘油或山梨醇；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)和α-环糊精；氨基酸盐，例如精氨酸、脯氨酸和甘氨酸；渗压剂和某些Hoffmeister盐，例如Tris、硫酸钠和硫酸钾；及其组合。
如本文所用的，术语“Fc”和“Fc区”可互换使用并且意指包含人或非人(例如鼠)CH2和CH3免疫球蛋白结构域或包含两个邻接区的抗体的片段，所述邻接区与人或非人CH2和CH3免疫球蛋白结构域具有至少90％同一性。Fc可以但非必需具有与Fc受体相互作用的能力。参见例如Hasemann和Capra，“Immunoglobulins：Structure andFunction(免疫球蛋白：结构和功能)”，William E.Paul编辑，Fundamental Immunology，第二版，209，210-218(1989)，其通过引用以其整体并入本文。
如本文所用的，术语“蛋白”和“多肽”可互换使用并且意指通过肽键连接的至少五个天然或非天然存在的氨基酸的任何链。
如本文所用的，术语“分离的”和“纯化”可互换使用并且意指可存在于包含目标蛋白的样品中的异源成分的量减少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或者更多，所述异源成分为例如生物大分子例如蛋白或DNA。异源蛋白的存在可通过任何适当的方法包括高效液相层析(HPLC)、凝胶电泳和染色和/或ELISA测定法来测定。DNA和其他核酸的存在可通过任何适当的方法包括凝胶电泳和染色和/或使用聚合酶链式反应的测定法来测定。
如本文所用的，术语“复杂分子”意指(a)大于20,000MW或包含多于250个氨基酸残基和(b)在其天然形式中包含两个或更多个二硫键的任何蛋白。复杂分子可以但非必需形成多聚体。复杂分子的实例包括但不限于抗体、肽体和包含Fc结构域的其他嵌合分子以及其他大蛋白。已知为肽体和其他Fc融合物的复杂分子的实例描述于美国专利第6,660,843号、美国专利第7,138,370号和美国专利第7,511,012号。
如本文所用的，术语“肽体”是指包含任选地经由接头与Fc结构域连接在一起的一种或多种生物活性肽的多肽。肽体的实例参见美国专利第6,660,843号、美国专利第7,138,370号和美国专利第7,511,012号
如本文所用的，术语“重折叠”意指将二级和三级结构再引入以下蛋白的过程，所述蛋白例如由于表达条件或有意变性和/或还原所致已在体外或体内除去其天然的二级或三级结构中的一些或全部。因此，重折叠的蛋白是已经将其天然的二级或三级结构中的一些或全部再引入的蛋白。
如本文所用的，术语“缓冲液巯基对比率”由重折叠缓冲液中所使用的还原型和氧化型氧化还原物类的关系来定义，其如方程1所定义：
方程1
缓冲液巯基对比率(TPR)的定义
Figure BPA00001482384100091
如本文所用的，术语“缓冲液巯基强度”、“巯基对缓冲强度”和“巯基对强度”可互换使用并且在方程2中定义，也称作总的单当量巯基浓度，其中总浓度是还原型物类与两倍的氧化型物类浓度的和。
方程2
缓冲液巯基对缓冲强度/巯基缓冲强度(BS)的定义
巯基对缓冲强度＝2[氧化剂]+[还原剂]＝2[胱胺]+[半胱氨酸]
巯基对比率和巯基对缓冲强度之间的关系描述于方程3和4中。
方程3
关于所定义的氧化还原缓冲强度(BS)和缓冲液氧化还原电势的还原型氧化还原物类的计算
Figure BPA00001482384100092
方程4
关于所定义的氧化还原缓冲强度(BS)和缓冲液氧化还原电势的氧化型氧化还原物类的计算
Figure BPA00001482384100093
如本文所用的，术语“氧化还原组分”意指促进与蛋白的另一个巯基或半胱氨酸残基的可逆巯基交换的任何巯基反应性化学品或包含这样的化学品的溶液。这类化合物的实例包括但不限于还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、半胱胺、胱胺、β-巯基乙醇及其组合。
如本文所用的，术语“增溶”意指以下方法，其中将盐、离子、变性剂、洗涤剂、还原剂和/或其他有机分子加至包含目标蛋白的溶液，籍此除去蛋白的二级和/或三级结构中的一些或全部，并将蛋白溶解于溶剂中。这一方法可包括使用升高的温度，通常10-50℃，但是更通常15-25℃，和/或碱性pH，例如pH7-12。增溶还可通过加入酸例如70％甲酸来完成(参见例如Cowley和Mackin(1997)FEBS Lett402：124-130)。
“增溶的蛋白”是其中蛋白的二级和/或三级结构中的一些或全部已经被除去的蛋白。
“增溶池(solublization pool)”是一定体积的包含增溶的目标蛋白以及被选择用于增溶蛋白的盐、离子、变性剂、洗涤剂、还原剂和/或其他有机分子的溶液。
如本文所用的，术语“非需氧条件”意指在没有通过机械或化学方式对混合物有意通气的情况下进行的任何反应或孵育条件。在非需氧条件下，氧气可以存在，只要其是天然存在的并且没有为了将氧气加至系统而被引入系统即可。非需氧条件可通过例如，通过限制顶部空间压力来限制氧气传递至反应溶液、不存在或限制对存贮容器中含有的空气或氧气的暴露、空气或氧气覆盖、不存在负责工艺缩放(process scaling)期间的质量传递的特殊装置或不存在促进反应系统中氧气的存在的气体喷射或混合。非需氧条件还可通过经由化学处理有意限制系统的氧气或从系统中除去氧气、使用惰性气体或真空进行顶部空间覆盖或增压或者通过用气体例如氩气或氮气喷射导致反应混合物中氧气浓度减少来完成。
如本文所用的，术语“非天然”和“非天然形式”可互换使用并且当用于目标蛋白例如包含Fc结构域的蛋白的语境中时，意指蛋白缺少至少一种形成的结构特性，所述特性存在于在设计以评估蛋白生物学活性的适当体内或体外测定中是生物学活性的蛋白形式中。在蛋白的非天然形式中可缺少的结构特征的实例可包括但不限于二硫键、四级结构、破坏的二级或三级结构或者使蛋白在适当的测定中生物学上无活性的状态。处于非天然形式的蛋白可以但非必需形成聚集体。
如本文所用的，术语“非天然的有限溶解度形式”当用于目标蛋白例如包含Fc结构域的蛋白的语境中时，意指其中蛋白缺少以下蛋白形式中存在的至少一种形成的结构特征的任何形式或状态，所述蛋白形式(a)在设计以评估蛋白的生物学活性的适当体内或体外测定中是生物学活性的和/或(b)形成需要处理例如化学处理以变得可溶的聚集体。所述术语特别地包括以包涵体存在的蛋白，例如当重组蛋白在非哺乳动物表达系统中表达时有时出现的那些。
II.理论
由于多种原因，主要因为伴随的反应体积上的减少和工艺通量上的增加，将于池中以2.0g/L或更高的浓度存在的微生物源分子重折叠是有利的。从工艺缩放的观点上看，在非需氧的条件下重折叠是有利的；这样的条件可通过例如持续或间断的喷射，实现空气或氧气顶部空间覆盖，通过将顶部空间加压或通过使用高效的混合来完成。因为系统中氧气的浓度与质量传递有关，重折叠反应的缩放由于诸如罐几何形状、体积和混合变化等因素而变得困难得多。而且，氧气可能不是蛋白中二硫键形成的直接反应物，使得与质量传递系数的直接关联不可靠。这还使得反应的缩放复杂化。因此，非需氧的、化学控制的氧化还原系统对于重折叠蛋白来说是优选的。本文提供了这类条件的实例。
对于给定蛋白的最佳重折叠化学代表小心的平衡，其将折叠的/氧化的状态最大化同时将不希望的产物物类例如聚集体、未形成的二硫桥(例如还原的半胱氨酸对)、不正确的二硫化物配对(其可导致错折叠)、氧化的氨基酸残基、脱酰胺基的氨基酸残基、不正确的二级结构和产物相关的加合物(例如半胱氨酸或半胱胺加合物)最小化。达到这一平衡的一个重要因素是重折叠系统的氧化还原状态。氧化还原状态受到许多因素的影响，包括但不限于蛋白中包含的半胱氨酸残基的数目、重折叠溶液中氧化还原偶化学品(例如半胱氨酸、胱氨酸、胱胺、半胱胺、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽)的比率和浓度、从增溶缓冲液遗留而来的还原剂(例如DTT、谷胱甘肽和β-巯基乙醇)的浓度、混合物中重金属的水平以及溶液中氧气的浓度。
巯基对比率和巯基对缓冲强度定义于方程1和2中，下文中，使用半胱氨酸和胱胺分别作为示例性的还原剂和氧化剂。与蛋白浓度和从增溶遗留而来的还原剂相联系的这些量可以是获得巯基对比率和巯基对缓冲强度之间的平衡的因数。
转向图1，这张图描述如通过反向HPLC分析显现的，对于复杂的二聚体蛋白来说，巯基对比率和巯基缓冲强度对产物相关物类的分布的影响。在图1a-1f中，点线代表具有氧化的氨基酸残基的蛋白物类、单链物类和稳定的混合型二硫化物中间体；短划线代表错配的或不正确形成的二硫化物蛋白物类和具有部分未形成的二硫键的蛋白物类。实线代表正确折叠的蛋白物类。图1a-1f证明在恒定的6g/L蛋白浓度，当巯基对缓冲强度增加时，获得相当的物类分布所需的巯基对比率必须也增加。例如，如图1中所示，如果缓冲强度从5mM增加至10mM，则为了获得相当的物类分布，平衡的巯基对比率将为约2倍高。这主要是因为从增溶遗留而来的还原剂对总的系统巯基对比率增加的缓冲作用。在较低的氧化还原缓冲强度，总系统变得难以控制得多。蛋白浓度和蛋白序列中包含的半胱氨酸的数目同样与控制系统所需的最小所需巯基对缓冲强度有关。在蛋白与蛋白之间不同的某一个点以下，蛋白巯基浓度可颠覆氧化还原偶化学并导致不能重现的结果。
在图1描述的结果中，当将重折叠溶液的巯基对比率有意设置为更还原化时，所得到的产物分布转变为产生更多的还原的产物物类(短划线)。当将重折叠溶液的巯基对比率有意设置为更低或更氧化时，所得到的产物分布转变为产生更多氧化的残基、单链形式和稳定的混合型二硫化物中间体物类(点线)。选择最佳的巯基对比率和巯基对缓冲强度的能力允许所期望的折叠蛋白形式的产率最优化。这一最佳的产率可通过将重折叠池中所期望的折叠蛋白物类的质量或产率最大化或通过有目的地将所获得的不期望的产物相关物类转变为以下形式来实现，所述形式在随后的纯化步骤中最容易除去，从而导致工艺产率或纯度的总体益处。
可对每种蛋白进行氧化还原组分巯基对比率和巯基对缓冲强度的最优化。可评估一个矩阵或系列的多因数矩阵以将重折叠反应针对将所期望物类的产率和分布最优化的条件最优化。通过将每种组分在至少三种浓度或pH水平的范围内变化而所有其他参数保持恒定，可设立优化筛选以系统地评估全部或部分因数矩阵中的氧化还原化学、巯基对比率、巯基对缓冲强度、孵育时间、蛋白浓度和pH。完成的反应可使用标准的多元统计工具通过用于产率和产物质量的RP-HPLC和SE-HPLC分析来评估。
III.将在非哺乳动物表达系统中表达并且在一定体积中以2.0g/L或 更高的浓度存在的蛋白重折叠的方法
所公开的重折叠方法特别可用于将在非哺乳动物表达系统中表达的蛋白重折叠。如本文所记录的，可将非哺乳动物细胞工程改造以产生以可溶或完全不可溶或非天然的有限溶解度的形式细胞内表达的重组蛋白。通常细胞会将重组蛋白沉淀为称作包涵体的大的不溶或有限溶解度的聚集体。然而，某些细胞生长条件(例如温度或pH)可被修改以使得细胞以细胞内可溶的单体形式产生重组蛋白。作为以不溶解的包涵体产生蛋白的备选方案，蛋白可被表达为可溶的蛋白，包括包含Fc区的蛋白，其可通过亲和层析直接从细胞裂解物中捕获。从裂解物直接捕获允许相对纯的蛋白的重折叠并且避免了包涵体工艺中所需要的非常密集的收获和分离工艺。然而，重折叠方法不限于已经被亲和纯化的样品并且可被用于包含以下蛋白的任何样品，所述蛋白在非哺乳动物表达系统中表达，例如在一定体积的细胞裂解物中存在的蛋白(即没有以任何方式纯化的蛋白)。
在一个方面，本公开内容涉及将以下蛋白重折叠的方法，所述蛋白以可溶形式在非哺乳动物表达系统中表达并且在一定体积中以2.0g/L或更高的浓度存在，例如已经通过亲和层析从在其中表达蛋白的非哺乳动物细胞的细胞裂解物纯化的蛋白。尽管所述体积可来源于蛋白纯化工艺的任何阶段，但在一个实施例中，所述体积是亲和层析洗脱池(例如A蛋白洗脱池)。在另一个实例中，所述体积位于工艺流中。然而，所述方法并不限于含有Fc的蛋白并且可被用于以可溶形式表达并且从非哺乳动物来源的细胞裂解物捕获的任何类型的肽或蛋白质。分离的可溶蛋白常常以还原的形式从非哺乳动物细胞释放，因此可用于通过加入变性剂例如离液剂准备用于重折叠。以优化的巯基对比率和巯基对缓冲强度，与蛋白稳定剂、聚集抑制剂和氧化还原组分的进一步组合，允许在1-40g/L的浓度，例如10-20g/L的浓度重折叠。
在所述方法的一个特定的实施方案中，蛋白在非哺乳动物表达系统中表达并且通过高压裂解从表达细胞释放。之后蛋白通过A蛋白亲和层析从裂解物捕获并且在一定体积中以10g/L或更高的浓度存在。之后将蛋白与包含变性剂、聚集抑制剂、蛋白稳定剂和氧化还原组分的重折叠缓冲液接触，其中所述氧化还原组分具有范围为0.001至100(例如在0.05至50、0.1至50、0.25至50、0.5至50、0.75至40、1.0至50或1.5至50、2至50、5至50、10至50、15至50、20至50、30至50或40至50的范围内)的最终巯基对比率(如本文所定义)以及等于或大于2mM(例如大于或等于2.25mM、2.5、2.75mM、3mM、5mM、7.5mM、10mM或15mM)的巯基对缓冲强度(如本文所定义的)，其中巯基对缓冲强度有效界定在100mM的最大值。重申的是，关于范围，巯基缓冲强度在2mM和20mM之间，例如2.25mM和20mM、2.5mM和20mM、2.75mM和20mM、3mM和20mM、5mM和20mM、7.5mM和20mM、10mM和20mM或15mM和20mM之间。
在另一个方面，本公开内容涉及将以不可溶或有限溶解度形式(例如以包涵体形式)在非哺乳动物表达系统中表达的蛋白重折叠的方法。当所述蛋白置于包涵体中时，可从裂解的细胞收获包涵体、洗涤、浓缩并且重折叠。
可使用本文提供的新方法对每一种蛋白和每一种最终的蛋白浓度水平进行重折叠缓冲液的优化。如实施例中所示，当重折叠缓冲液包含变性剂(例如脲或其它离液剂、有机溶剂或强洗涤剂)、聚集抑制剂(例如温和洗涤剂、精氨酸或低浓度PEG)、蛋白稳定剂(例如甘油、蔗糖或其它渗压剂、盐)和氧化还原组分(例如半胱氨酸、胱胺、谷胱甘肽)时，将包含Fc区的蛋白重折叠时可获得好的结果。可使用巯基对比率(其可具有0.001至100的范围，例如在0.05至50、0.1至50、0.25至50、0.5至50、0.75至40、1.0至50或1.5至50、2至50、5至50、10至50、15至50、20至50、30至50或40至50的范围内)对比巯基对缓冲强度(其可大于2mM，例如大于或等于2.25mM、2.5、2.75mM、3mM、5mM、7.5mM、10mM或15mM，其中所述巯基对缓冲强度被有效界定在100mM的最大值。重申的是，就范围而言，巯基缓冲强度在2mM和20mM之间，例如2.25mM和20mM、2.5mM和20mM、2.75mM和20mM、3mM和20mM、5mM和20mM、7.5mM和20mM、10mM和20mM或15mM和20mM之间，这取决于蛋白浓度和用于增溶包涵体的还原剂的浓度)的实验性矩阵，来确定最优化的巯基对比率和氧化还原缓冲强度。可使用实施例2中描述的新方法来优化条件。
在所述方法的一个特定的实施方案中，蛋白在非哺乳动物表达系统中表达并且在一定体积中以2.0g/L或更高的浓度存在。将蛋白与包含变性剂、聚集抑制剂、蛋白稳定剂和氧化还原组分的重折叠缓冲液接触，其中所述氧化还原组分具有范围为0.001至100(例如在0.05至50、0.1至50、0.25至50、0.5至50、0.75至40、1.0至50或1.5至50、2至50、5至50、10至50、15至50、20至50、30至50或40至50的范围内)的最终巯基对比率(如本文所定义)以及等于或大于2mM(例如大于或等于2.25mM、2.5mM、2.75mM、3mM、5mM、7.5mM、10mM或15mM)的巯基对缓冲强度(如本文所定义)，其中巯基对缓冲强度有效界定在100mM的最大值。重申的是，关于范围，巯基缓冲强度在2mM和20mM之间，例如2.25mM和20mM、2.5mM和20mM、2.75mM和20mM、3mM和20mM、5mM和20mM、7.5mM和20mM、10mM和20mM或15mM和20mM之间，以形成混合物。各种不同的变性剂类型可被用于重折叠缓冲液中。可在重折叠缓冲液中使用的一些常用的变性剂的实例包括脲、胍
Figure BPA00001482384100151
、二甲基脲、甲基脲或乙基脲。如本文所描述的，变性剂的特定浓度可通过常规的优化来确定。
各种不同的蛋白稳定剂或聚集抑制剂可被用于重折叠缓冲液中。可在重折叠缓冲液中使用的一些常用的聚集抑制剂的实例包括精氨酸、脯氨酸、聚乙二醇、非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、多元醇、甘油、蔗糖、山梨醇、葡萄糖、Tris、硫酸钠、硫酸钾、其他渗压剂或相似的化合物。如本文所描述的，聚集抑制剂的特定浓度可通过常规的优化来确定。
重折叠缓冲液的氧化还原组分可具有任何组成，条件是氧化还原组分具有在0.001至100范围内(例如在0.05至50、0.1至50、0.25至50、0.5至50、0.75至40、1.0至50或1.5至50、2至50、5至50、10至50、15至50、20至50、30至50或40至50的范围内)的最终巯基对比率和大于或等于2mM(例如大于或等于2.25mM、2.5、2.75mM、3mM、5mM、7.5mM、10mM或15mM)的巯基对缓冲强度，其中巯基对缓冲强度有效界定在100mM的最大值。重申的是，关于范围，巯基缓冲强度在2mM和20mM之间，例如2.25mM和20mM、2.5mM和20mM、2.75mM和20mM、3mM和20mM、5mM和20mM、7.5mM和20mM、10mM和20mM或15mM和20mM之间。确定合适的氧化还原组分即确定适合的巯基对比率和氧化还原缓冲强度的方法是已知的和/或是本文提供的。可形成氧化还原组分的具体巯基对的实例可包括还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、半胱胺、胱胺和β-巯基乙醇中的一种或多种。因此，巯基对可包括例如还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽。巯基对的另一个实例是半胱氨酸和胱胺。可如本文所描述优化氧化还原组分。
将蛋白与具有所描述的巯基对比率和氧化还原缓冲强度的氧化还原组分接触以形成重折叠混合物之后，将所述重折叠混合物孵育期望的一段时间段。孵育可在如本文所定义的非需氧条件下进行。非需氧条件不必完全不含氧气，只是没有有意引入初始系统中存在的氧气之外的另外的氧气。孵育时间段是可变的并经选择使得可以获得具有所期望的分析特性的稳定的重折叠混合物。孵育时间段可以是例如1小时、4小时、12小时、24小时、48小时、72小时或更久。
由于高浓度重折叠对系统中存在的氧气水平的敏感性以及小规模时氧气质量传递的倾向更大，可开发方法和/或设备以控制孵育步骤的氧气水平并维持孵育步骤的非需氧条件。在一个实施方案中，程序可包括在惰性气体例如氮气或氩气的覆盖下制备、分散和混合所有重折叠组分，以避免将氧气水平带入反应中。这一方法在确定可接受的巯基对比率时特别有帮助。在于15升或更小的规模下有用的另一个实施方案中，含有蛋白和重折叠缓冲液的重折叠反应器的顶部空间可用惰性气体或惰性气体和空气或氧气的混合物净化，并且在孵育期期间将反应容器密封并以低转速混合。
孵育之后，将蛋白从重折叠混合物分离。分离可使用任何已知的蛋白纯化方法来实现。如果蛋白包含Fc结构域，那么例如，A蛋白柱提供了将蛋白与重折叠赋形剂分离的合适的方法。在其他的实施方案中，不同的柱层析策略可被使用并且取决于有待被分离的蛋白的性质。实例包括HIC、AEX、CEX和SEC层析。也可考虑非层析的分离，例如用盐、酸或用聚合物例如PEG沉淀(参见例如US20080214795)。用于将蛋白与重折叠组分分离的另一种备选方法可包括透析或使用切向流过滤系统的渗滤。
在另一个示例性的重折叠操作中，将从非哺乳动物表达系统获得的包涵体在10至100克蛋白每升以及更典型的20-40g/L的范围中增溶大约10-300分钟。之后将增溶的包涵体稀释以使溶液中的变性剂和还原剂减少至允许蛋白重折叠的水平。稀释产生在含有脲、甘油或蔗糖、精氨酸和氧化还原对(例如半胱氨酸和胱胺)的重折叠缓冲液中的1至15g/L的蛋白浓度。在一个实施方案中，最终的组成是1-4M脲、5-40％甘油或蔗糖、25-500mM精氨酸、0.1-10mM半胱氨酸和0.1-10mM胱胺。之后将溶液在孵育期间混合可从1小时跨越至4天的时间。
如本文所记录的，所公开的方法尤其可用于在细菌表达系统、更具体地其中在细菌细胞中以包涵体形式表达蛋白的细菌系统中表达的蛋白。蛋白可以是复杂蛋白，即(a)大于20,000MW或包含多于250个氨基酸残基和(b)在其天然形式中包含两个或更多个二硫键的蛋白。当蛋白以包涵体的形式表达时，可能的是在蛋白天然形式中存在的任何二硫键被错误形成或根本没形成。所公开的方法适用于这些和其他形式的目标蛋白。可考虑用所公开的方法重折叠的蛋白的具体实例包括抗体，其由于它们相对大的大小和多的二硫键数目所致而在传统上很难用典型的重折叠方法以高浓度重折叠。所述方法还可被用来重折叠其他的含Fc的分子例如肽体，并且更通常地用来重折叠包含与另一蛋白融合的Fc结构域的任何融合蛋白。
所公开的方法的另一个方面是其可缩放性，其允许所述方法在从实验室规模至工业或商业规模的任何规模上实行。事实上，所公开的方法尤其可用于商业规模，其中其可用于有效地重折叠大量的蛋白。
本公开内容现在将通过引用阐明了某些实施方案的下列实施例来说明。然而，应当注意的是，这些实施方案是说明性的而不应解释为以任何方式限制本发明。
实施例
本文给出的实施例证明巯基对比率和氧化还原缓冲强度是获得对环境影响和通气不敏感的有效重折叠反应中重要的考虑因素。这一不敏感性是易于缩放和在工业或商业规模上进行、不同工厂之间工艺的转移的考虑因素。
实施例还证实在典型的重折叠反应浓度(0.01-2.0g/L)，对外部通气的敏感性是相对温和的。然而在约2g/L及更高的浓度，重折叠反应对巯基对比率和氧化还原缓冲强度的敏感性增加并且几乎所有的化学组分尤其是氧化还原组分可能都需要调节以适应反应中蛋白浓度的变化。
实施例1
重组蛋白的表达
在一个实施方案中，包含Fc部分的重组蛋白在非哺乳动物表达系统即大肠杆菌中表达，并使之以包涵体形式形成细胞质沉淀。按照下列程序将每一种蛋白重折叠。
表达阶段结束后，将细胞培养液离心并除去液体部分，留下作为糊状物的细胞。将细胞在水中重悬至原始体积的约60％。之后通过三次通过高压匀浆器的方法将细胞裂解。细胞被裂解之后，将裂解物在叠盘式离心机(disc-stack centrifuge)中离心以收集固体部分中的以有限溶解度的非天然形式即包涵体表达的蛋白。将蛋白浆液如下洗涤多次：通过反复在水中将捕获的固体浆液重悬至原始发酵液体积的50％和80％之间，混合并离心以收集固体部分中的蛋白。将最后洗涤的包涵体捕获并冷冻贮存。
实施例2
重折叠条件/氧化还原组分的确定
评估了多种复杂的微生物来源的蛋白。将每种蛋白在完全将蛋白变性的适当的胍和/或脲水平(通常在4-6M胍或4-9M脲的当量水平)或两种变性剂的组合下增溶。将蛋白用DTT(5-20mM)于pH 8.5还原并在室温孵育约1小时。
对每种蛋白进行重折叠缓冲液的鉴定。评估多因数矩阵或一系列多因数矩阵以确定将产率最优化并且将聚集体形成最小化的重折叠反应条件。通过将每种组分在至少三种浓度或pH水平的范围内变化而所有其他参数保持恒定，设立鉴定筛选以在全部因数矩阵中系统地评估脲、精氨酸、甘油和pH。完成的反应可使用标准的多元统计工具通过用于产率和产物质量的RP-HPLC和SE-HPLC分析来评估。之后将具有所期望的表现的条件的子集在随后的筛选中进一步评估，所述筛选在因数筛选中评估一系列pH、巯基对比率、巯基对缓冲强度以及可能地另外的赋形剂水平。也使用标准的多元统计工具来评估次要相互作用。
如通过反相和尺寸排阻HPLC分析确定的，使用以下重折叠缓冲液观察到最好的结果，所述缓冲液含有变性剂(例如处于1和4M之间的水平的非变性水平的脲、二甲基脲或其它离液剂)、聚集抑制剂(例如5和500mM之间的水平的精氨酸)、蛋白稳定剂(例如5％w/v和40％w/v之间的水平的甘油或蔗糖)和氧化还原组分(例如半胱氨酸或胱胺)。使用巯基对比率(0.1至100，更通常1至25)对比缓冲强度(通常2mM至20mM，取决于蛋白浓度、蛋白中半胱氨酸残基的数目和用于增溶包涵体的还原剂的浓度)的实验性矩阵来确定巯基对比率和氧化还原缓冲强度。
用允许巯基对比率在不同巯基对缓冲强度下的受控矩阵的不同半胱氨酸和胱胺水平形成各个反应。使用方程3和4计算关系。使用本文描述的技术，在需氧和非需氧两种条件下筛选每种条件。选出最佳的条件以满足稳定平衡产率、所期望的折叠物类的分布、对环境氧化剂(例如空气)的不敏感性和对从增溶步骤遗留来的DTT的正常变化的不敏感性。
实施例3
从细胞裂解物捕获的非天然的可溶蛋白形式的高浓度重折叠
在一个实验中，如本文所描述的，将包含多个与Fc部分结合的多肽的重组蛋白作为细胞内可溶的肽链在大肠杆菌中表达，从收获并洗涤的细胞裂解，通过亲和层析从裂解物中分离，之后以约12g/L的浓度重折叠。
表达阶段结束后，将全部发酵液的等分样离心并除去液体部分，留下作为糊状物的细胞。将细胞在水中重悬至原始体积的约60％。之后通过三次通过高压匀浆器的方法将细胞裂解。细胞被裂解之后，将裂解物池在空气存在的情况下混合8-72小时以允许肽链的二聚化。二聚化工艺之后，用A蛋白亲和层析柱将目标肽链从裂解物池中分离。以8份A蛋白洗脱材料对2份含有脲(10M)、精氨酸-HCl(2.5M)、pH 8.5的Tris(1050mM)以及半胱氨酸(10mM、5mM或4mM)和胱胺(4mM)的重折叠缓冲液的比率，将A蛋白柱洗脱池混合。将稀释的混合物滴定至pH 8.5并在氮气下于约5℃孵育直到获得稳定的池(约24小时)。取决于所评估的氧化还原条件，获得约30％-80％的所期望产物的产率。
为了模拟与在非常大规模的蛋白生产工艺中通常存在的那些相似的非厌氧条件，采取了几个步骤。当反应体积小于约15L时，将重折叠容器的顶部空间用氮气净化以限制系统中氧气可具有的作用。之后将容器密封并开始孵育。
当反应体积大于约15L但小于500L时，制备重折叠缓冲液并允许在约5℃平衡以获得溶液中稳定的氧气水平(相对于空气饱和，通常50％至70％的溶解氧)。一旦形成重折叠混合物，就将容器顶部空间用氮气净化以限制系统中氧气可具有的任何其它作用，将容器密封并开始孵育期。
实施例4
自包涵体的高浓度重折叠
在一个实验中，将包含与IgG1的Fc部分的C-末端经由接头连接的生物学活性肽并且具有约57kDa的分子量和包含8个二硫键的重组蛋白，如本文所描述的作为包涵体在大肠杆菌中表达、收获、洗涤、浓缩、增溶和以6g/L的浓度重折叠。
将冷冻浓缩的包涵体的等分样解冻至室温，并与产生将蛋白完全变性的相当于4-6M胍的变性剂水平的适量胍和/或脲混合。之后将蛋白用DTT(以5-20mM)于pH 8.5还原并在室温孵育约1小时。包涵体溶解、变性和还原之后，将它们稀释至如通过实施例2中描述的程序确定的含有脲(1-5M)、精氨酸-HCl(5-500m M)、甘油(10-30％w/v)以及确定水平的半胱氨酸和胱胺的重折叠缓冲液中。最终的组分浓度是4M脲、150mM精氨酸HCl、20.9％(w/v)甘油、2.03mM半胱氨酸和2.75mM胱胺。选择稀释度水平以平衡来自增溶的变性剂的稀释度，维持重折叠期间分子的热力学稳定性并且维持重折叠混合物中最高的可能蛋白浓度。如通过相关的分析测量确定的，将稀释混合物滴定至碱性pH(pH 8和10之间)并在非需氧条件下于5℃孵育直到获得稳定的池(12-72小时)。所得工艺被证明显示出从1L规模至2000L规模的稳定的可缩放性(参见图3)。在两个规模都观察到约27-35％的所期望产物的产率。产物相关杂质的分布也维持在很小的方差内(参见图3)。
小规模时的氧气质量传递容易实现并且应该被抑制以便模拟在大规模观察到的相对较差的质量传递，其中重折叠溶液的体积相对于大规模容器表面存在的空气的体积和表面积来说是大的。因此，为了模拟与非常大规模的蛋白生产工艺中通常存在的那些相似的非厌氧条件，采取了几个步骤。当反应体积小于约15L时，将重折叠缓冲液用氮气净化以将氧气从溶液中脱去，将组分在氮气层下配制并且一旦形成重折叠混合物，就将容器顶部空间用氮气净化以限制系统中氧气可具有的作用。之后将容器密封并开始孵育。
当反应体积大于约15L但小于500L时，制备重折叠缓冲液并允许在约5℃平衡以获得溶液中稳定的氧气水平(相对于空气饱和，通常50％至70％的溶解氧)。一旦形成重折叠混合物，就将容器顶部空间用氮气净化以限制系统中氧气可具有的任何其它作用，将容器密封并开始孵育期。
以大于500L的规模制备重折叠缓冲液并允许在约5℃平衡以获得溶液中稳定的氧气水平(相对于空气饱和，通常50％至70％的溶解氧)。一旦形成重折叠混合物，就将容器密封并开始孵育期。
重折叠混合物的蛋白浓度是6g/L，其是使用除了这一实施例中描述的方法以外的方法获得的1.5g/L的回收物的四倍高。在一个的具体生产设备中，由于在现有的设备罐中容积效率增加，整整一年的工艺生产力据计算增加＞930％。
实施例5
巯基对氧化状态对二硫化物配对的影响
图1a-1f证明当使得巯基对比率处于更加氧化性的状态(较低的巯基对比率)时，更高比例的产物物类具有氧化的氨基酸残基和混合的二硫化物形式。当使得巯基对比率处于更加还原性的状态(较高的巯基对比率)时，这导致较低水平的氧化的氨基酸变体物类和较高水平的具有不正确二硫化物配对或未形成二硫键的产物物类。当改变整个巯基对缓冲强度时，相应的最优化的巯基对比率也变化了。这一影响与缓冲强度如何调节pH对缓冲溶液中酸和碱的加入的敏感性类似。
物类的优化的平衡是可获得的。如图1a-1f中所示，在巯基对缓冲强度和巯基对比率之间具有清楚的关系，其可被确定以维持优化的物类平衡，从而促进低溶解度蛋白的有效重折叠。经由巯基对比率和巯基对缓冲强度的调节，控制产物变体物类例如不正确二硫化物键合的物类和错折叠的物类的能力使得高效、有效并且可靠的随后的纯化工艺可行。
实施例6
非需氧条件对重折叠效率的影响
图2和3证明当考虑蛋白浓度和蛋白中半胱氨酸残基的数目，适当选择巯基对缓冲强度时，对外部影响例如氧气的敏感性显著降低。这允许明显更容易在不同规模和反应器构造之间转移的非需氧重折叠条件。
图2比较了在几种环境条件下15L规模重折叠和20mL规模重折叠之间的RP-HPLC分析的物类分布。对于条件1(图1中标记“1”的迹线)，将增溶化学品和溶液在空气中配制并且将重折叠混合物在空气中孵育。在条件2中，将增溶化学品和溶液在空气中配制并且在氮气顶部空间下孵育。在条件3-7中，将增溶化学品和溶液在氮气覆盖条件下配制并且在条件3、5、6、7中将增溶化学品和溶液在氮气下孵育。在条件7中，还将重折叠溶液在与增溶溶液混合前脱去氮气。在条件4中，将增溶化学品和溶液在大气条件下孵育。
图2中所示的结果证明：于其下在空气存在下配制或孵育增溶化学品和溶液的条件(即条件1、2和4)，没有获得可与较大规模对照相比拟的结果。在条件1、2和4中，观察到氧化物类(前峰)的形成增加。在条件1、2和4的组中，前峰由箭头指示。
图3比较了在1L规模和2000L规模下如实施例2中所述获得的确定的条件的RP-HPLC分析结果。在这一图中，基本上没有物类分布上的差异可检测到。总之，图2和3证明当小心控制通气时，小规模重折叠反应对在重折叠反应放大时所期望的那些更具有预测性，促进大规模蛋白重折叠工艺的实现。

Claims (24)

1.一种将在非哺乳动物表达系统中表达并且在一定体积中以2.0g/L或更高的浓度存在的蛋白重折叠的方法，包括：
(a)将所述蛋白与重折叠缓冲液接触以形成重折叠混合物，所述重折叠缓冲液包含氧化还原组分以及下列中的一种或多种：
(i)变性剂；
(ii)聚集抑制剂；和
(iii)蛋白稳定剂；
所述氧化还原组分包含具有0.001至100的范围的最终巯基对比率和2mM或更高的氧化还原缓冲强度；
(b)将所述重折叠混合物孵育；以及
(c)将所述蛋白自所述重折叠混合物分离。
2.权利要求1的方法，其中所述最终巯基对比率选自0.05至50、0.1至50、0.25至50、0.5至50、0.75至40、1.0至50或1.5至50、2至50、5至50、10至50、15至50、20至50、30至50或40至50。
3.权利要求1的方法，其中所述巯基对缓冲强度选自大于或等于2.25mM、2.5mM、2.75mM、3mM、5mM、7.5mM、10mM或15mM。
4.权利要求1的方法，其中所述蛋白在所述体积中以非天然的有限溶解度形式存在。
5.权利要求4的方法，其中所述非天然的有限溶解度形式是包涵体。
6.权利要求1的方法，其中所述蛋白在所述体积中以可溶的形式存在。
7.权利要求1的方法，其中所述蛋白是重组的。
8.权利要求1的方法，其中所述蛋白是内源蛋白。
9.权利要求1的方法，其中所述蛋白是抗体。
10.权利要求1的方法，其中所述蛋白是复杂蛋白。
11.权利要求1的方法，其中所述蛋白是多聚体蛋白。
12.权利要求1的方法，其中所述蛋白是Fc-蛋白缀合物。
13.权利要求1的方法，其中所述非哺乳动物表达系统是细菌表达系统和酵母表达系统中的一种。
14.权利要求1的方法，其中所述变性剂选自脲、胍盐、二甲基脲、甲基脲和乙基脲。
15.权利要求1的方法，其中所述蛋白稳定剂选自精氨酸、脯氨酸、聚乙二醇、非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、多元醇、甘油、蔗糖、山梨醇、葡萄糖、Tris、硫酸钠、硫酸钾和渗压剂。
16.权利要求1的方法，其中所述聚集抑制剂选自精氨酸、脯氨酸、聚乙二醇、非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、多元醇、甘油、蔗糖、山梨醇、葡萄糖、Tris、硫酸钠、硫酸钾和渗压剂。
17.权利要求1的方法，其中所述巯基对包括至少一种选自以下的组分：还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、半胱胺、胱胺和β-巯基乙醇。
18.权利要求1的方法，其中所述孵育在非需氧条件下进行。
19.权利要求1的方法，其中所述分离包括将所述混合物与亲和分离基质接触。
20.权利要求19的方法，其中所述亲和分离基质是A蛋白树脂。
21.权利要求19的方法，其中所述亲和树脂是混合型分离基质。
22.权利要求1的方法，其中所述分离包括将所述混合物与离子交换分离基质接触。
23.权利要求1的方法，其中所述分离还包括过滤步骤。
24.权利要求23的方法，其中所述过滤步骤包括深层过滤。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108276470A (zh) * 2017-01-06 2018-07-13 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 细胞裂解液、提取胞内蛋白的方法、制备弓形虫抗原的方法和试剂盒

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011005488A1 (en) * 2009-06-22 2011-01-13 Amgen Inc. Refolding proteins using a chemically controlled redox state
JP2012531428A (ja) 2009-06-25 2012-12-10 アムジエン・インコーポレーテツド 哺乳類以外の系で発現されるタンパク質の捕獲精製プロセス
EP2417982A1 (en) * 2010-07-30 2012-02-15 Ferring B.V. Stabilization of gonadotropins
US20150376228A1 (en) * 2013-02-22 2015-12-31 Biogenomics Limited Process for high efficiency refolding of recombinant proteins
US10633414B2 (en) * 2015-07-27 2020-04-28 Purdue Research Foundation Tandem folding methods to improve protein folding yield
EP3344651B1 (en) 2015-09-02 2022-03-02 Merck Sharp & Dohme Corp. A process for obtaining insulin with correctly formed disulfide bonds
CN115925780A (zh) * 2016-07-22 2023-04-07 美国安进公司 含有Fc的蛋白的纯化方法
WO2018190301A1 (ja) * 2017-04-10 2018-10-18 花王株式会社 角栓を除去する方法
CN111902720A (zh) 2018-03-21 2020-11-06 沃特世科技公司 基于非抗体高亲和力的样品制备、吸附剂、装置和方法
JP7516369B2 (ja) * 2018-11-07 2024-07-16 アプライド モレキュラー トランスポート インコーポレイテッド トランスサイトーシスのための送達構築物および関連する方法
WO2022129460A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Richter Gedeon Nyrt. Methods for the purification of refolded fc-peptide fusion protein
CN115894604B (zh) * 2022-12-16 2024-01-23 康日百奥生物科技(苏州)有限公司 重组蛋白澄清纯化方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992004382A1 (en) * 1990-09-05 1992-03-19 Bunge (Australia) Pty. Ltd. Solubilization of proteins in active forms
CN1295580A (zh) * 1998-02-23 2001-05-16 G·D·西尔公司 制造鼠和人内源性血管生成抑制因子的方法
EP1845103A1 (en) * 2006-04-10 2007-10-17 Boehringer Ingelheim Austria GmbH Method for refolding a protein

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4237224A (en) 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
US4468464A (en) 1974-11-04 1984-08-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biologically functional molecular chimeras
DE122080T1 (de) 1983-03-25 1985-05-23 Celltech Ltd., Slough, Berkshire Verfahren zur herstellung eines proteins.
US4468454A (en) 1983-06-10 1984-08-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Antifoggant process
US4572798A (en) * 1984-12-06 1986-02-25 Cetus Corporation Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins
US4810643A (en) 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
IL86090A (en) 1987-04-16 1993-03-15 Cetus Oncology Corp Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1
GB8807673D0 (en) 1988-03-31 1988-05-05 Lingner & Fischer Gmbh Novel article
EP0719860B1 (en) 1988-05-13 2009-12-16 Amgen Inc. Process for isolating and purifying G-CSF
GB8927546D0 (en) * 1989-12-06 1990-02-07 Ciba Geigy Process for the production of biologically active tgf-beta
WO1993018136A1 (en) 1992-03-05 1993-09-16 Cytomed, Inc. Process for supporting hematopoietic progenitor cells
US5663304A (en) 1993-08-20 1997-09-02 Genentech, Inc. Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I
DK0657466T3 (da) 1993-11-10 1997-07-14 Pfizer Fremgangsmåde til refoldning af (pro-)chymosin, som omfatter recirkulering af urea
US5466377A (en) 1994-01-19 1995-11-14 Grandics; Peter Chromatography media and their uses
WO1995032216A1 (en) 1994-05-25 1995-11-30 University Of Nebraska Board Of Regents Biologically active glycoprotein hormones produced in procaryotic cells
WO1996040912A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Amgen Inc. Ob protein compositions and method
US5935824A (en) 1996-01-31 1999-08-10 Technologene, Inc. Protein expression system
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
DK1196442T3 (da) 1999-07-21 2006-05-08 Amgen Inc VGF-polypeptider og fremgangsmåder til behandling af VGF-relaterede lidelser
US6808902B1 (en) 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
EP1284987B1 (en) 2000-05-16 2007-07-18 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
EP1317536B1 (en) 2000-09-05 2009-05-13 Amgen Inc. Tnf receptor-like molecules and uses thereof
CZ20032208A3 (cs) 2001-02-23 2004-01-14 Immunex Corporation Zvýšený výtěžek aktivních proteinů
US6972327B1 (en) 2001-05-08 2005-12-06 Immunex Corporation Regeneration of chromatography material
US7138370B2 (en) * 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
AU2002345829A1 (en) 2002-06-24 2004-01-06 Dr. Reddy's Laboratories Ltd. Process for preparing g-csf
CA2510893C (en) 2002-12-20 2012-07-10 Amgen, Inc. Binding agents which inhibit myostatin
EP1449848A1 (en) 2003-02-20 2004-08-25 GBF German Research Centre for Biotechnology Method for the production of cystine-knot proteins
US20050209441A1 (en) 2004-03-22 2005-09-22 Lile Jackson D Process for promoting proper folding of human serum albumin using a human serum albumin ligand
FR2874318B1 (fr) 2004-08-19 2006-11-24 Oreal Utilisation en cosmetique de composes polysaccharidiques amphoteres a chaine(s) polymerique(s) cationique(s)
CA2580796C (en) 2004-09-24 2013-03-26 Amgen Inc. Modified fc molecules having peptides inserted in internal loop regions
US7435804B2 (en) 2004-10-19 2008-10-14 Phage Biotechnology, Inc. Method for obtaining single chain antibodies to human interferon α2b
KR101370253B1 (ko) 2004-10-22 2014-03-05 암젠 인크 재조합 항체의 재접힘 방법
EP1848737B1 (en) 2005-01-28 2016-05-18 ZymoGenetics, Inc. Homogeneous preparations of il-31
DE102005033250A1 (de) 2005-07-15 2007-01-18 Bioceuticals Arzneimittel Ag Verfahren zur Reinigung von G-CSF
US20080032343A1 (en) 2005-12-22 2008-02-07 Genentech, Inc. Recombinant Production of Heparin Binding Proteins
US7612273B2 (en) * 2006-03-20 2009-11-03 Roland Corporation Electronic percussion instrument
AU2007272412B2 (en) 2006-07-14 2013-11-07 Genentech, Inc. Refolding of recombinant proteins
WO2008096370A2 (en) 2007-02-05 2008-08-14 Natco Pharma Limited An efficient and novel purification method of recombinant hg-csf
EP2121753A2 (en) 2007-02-14 2009-11-25 Amgen, Inc Method of isolating antibodies by precipitation
AU2008287340A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Amunix, Inc. Compositions and methods for modifying properties of biologically active polypeptides
EP3216803B1 (en) 2008-06-25 2020-03-11 Novartis Ag Stable and soluble antibodies inhibiting vegf
WO2011005488A1 (en) 2009-06-22 2011-01-13 Amgen Inc. Refolding proteins using a chemically controlled redox state
JP2012531428A (ja) * 2009-06-25 2012-12-10 アムジエン・インコーポレーテツド 哺乳類以外の系で発現されるタンパク質の捕獲精製プロセス
SG11201507413XA (en) 2013-03-15 2015-10-29 Amgen Inc Myostatin antagonism in human subjects

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992004382A1 (en) * 1990-09-05 1992-03-19 Bunge (Australia) Pty. Ltd. Solubilization of proteins in active forms
CN1295580A (zh) * 1998-02-23 2001-05-16 G·D·西尔公司 制造鼠和人内源性血管生成抑制因子的方法
EP1845103A1 (en) * 2006-04-10 2007-10-17 Boehringer Ingelheim Austria GmbH Method for refolding a protein

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DE BERNARDEZ CLARK等: "Oxidative Renaturation of Hen Egg-White Lysozyme. Folding vs Aggregation", 《BIOTECHNOL. PROG》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108276470A (zh) * 2017-01-06 2018-07-13 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 细胞裂解液、提取胞内蛋白的方法、制备弓形虫抗原的方法和试剂盒

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