JP2016531551A

JP2016531551A - カスパーゼ阻害剤の存在下で真核細胞溶解物を用いた無細胞のタンパク質の合成方法及び装置、並びに該方法において合成されたタンパク質の収量及び／又は安定性を増加させるためのカスパーゼ阻害剤の使用

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Publication number: JP2016531551A
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Inventors: クービック、シュテファン; シュテヒ、マルリット; ヴュステンハーゲン、ドレーン; クヴァスト、ロベルト
Original assignee: フラウンホーファー−ゲゼルシャフトツールフエルデルングデアアンゲヴァンテンフォルシュングエー．ファオ．
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Abstract

本発明は、カスパーゼ阻害剤の存在下で真核細胞溶解物を用いた無細胞のタンパク質の合成のための改善された方法、この方法を行うための装置、並びに真核細胞溶解物を用いたタンパク質の合成のための無細胞の方法において、タンパク質の収量を増加させるための、及び／又は合成されたタンパク質の安定性を増加させるためのカスパーゼ阻害剤の使用に関する。本発明の好ましい実施態様において、該方法は、透析膜によって分離された少なくとも２つのコンパートメントを備える装置において行われ、翻訳反応は、少なくとも１つの第一のコンパートメント、反応コンパートメントにおいて行われ、翻訳反応の間、ｉ）反応物は、透析膜を通って、少なくとも１つのさらなるコンパートメント、給排コンパートメントから反応コンパートメントに拡散し、ｉｉ）反応副産物は、透析膜を通って、反応コンパートメントから給排コンパートメントに拡散する。本発明によれば、カスパーゼ阻害剤は好ましくは、反応コンパートメントに新鮮な阻害剤をさらに供給するために、給排コンパートメントにおいても存在し得るが、それは少なくとも反応コンパートメントに存在する。【選択図】なし

Description

本発明は、カスパーゼ阻害剤の存在下で真核細胞溶解物を用いた無細胞のタンパク質合成の改良された方法、並びにこの方法を実行するための装置及び真核細胞溶解物を用いたタンパク質合成のための無細胞の方法における合成されたタンパク質の収量を増加させるための、及び／又はその安定性を増加させるためのカスパーゼ阻害剤の使用に関する。

比較的最近、無細胞のタンパク質合成が、インビボでのタンパク質の発現に代わる効率的な方法として確立されてきた（非特許文献１）。ここで、細胞の内容物は、迅速で、信頼性が高く、コスト的に有用な方法で特定の標的タンパク質を製造するために使用される。得られた細胞抽出物は、細胞溶解物とも称されるが、タンパク質の無細胞合成のために必要とされる本質的な成分：リボソーム、翻訳因子および酵素を含む。今日では、選択された組換えタンパク質は、真核細胞溶解物だけでなく、原核生物溶解物でも機能的に活性な形態で製造され得る。真核細胞溶解物：小麦胚芽溶解物、網状赤血球溶解物、昆虫細胞溶解物並びにＨｅＬａ及びＨｅＬａハイブリドーマ細胞由来の細胞抽出物に基づく以下の翻訳系が、現在ますます使用されている。

大腸菌に基づく原核生物インビトロ翻訳系と比較して、大部分の真核生物の翻訳系を用いて達成されたタンパク質収量は、比較的低い（非特許文献１）。この点の例外は、非常に効率的な小麦胚芽溶解物の発現系である。タンパク質及び反応形式に応じて、反応容量のミリリットルあたり数百マクログラムのタンパク質が達成される（非特許文献２）。しかしながら、この細胞抽出物は、タンパク質をの合成に、例えば、グリコシル化などの翻訳後の修飾を伴うため、適切ではない。

昆虫細胞溶解物及び網状赤血球溶解物に基づく真核生物の翻訳系は、大腸菌では合??成することのできない、翻訳後の修飾を伴う複雑な構造化された真核生物のタンパク質合成を可能にする。しかし、網状赤血球溶解物は、他の種のミクロソーム膜を有するこの目的のため濃縮される必要がある（異種の翻訳系）。これに対して、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来の細胞溶解物は、含まれている細胞溶解物及び膜小胞が同種の細胞ラインから得られるため、同種の翻訳系として使用され得る。適切な細胞分解方法によって、真核細胞溶解物が得られ得、それは、重要な細胞分画の成分、特に小胞体を含む。細胞から排出され、細胞膜に組み込まれている全てのタンパク質は、糖残基を運び又はそれらの分子構造を安定化させるジスルフィド架橋を有し、細胞分画を通って移動する。ミクロソームまたは膜小胞と称されるＥＲの構造を含む細胞溶解物は、現在、機能的に活性な形態でこのようなタンパク質の候補を製造するために用いられ得る。このように、小胞と溶解物の細胞質ゾルタンパク質との間の非互換性が阻止され、その結果、比較的高いタンパク質収量（バッチモードで昆虫細胞溶解物中、最大２０μｇ／ｍｌ）、溶解物のミクロソームへの標的タンパク質の効率的な輸送がもたらされる。

無細胞タンパク質合成反応は、実験的にさまざまな方法で実現され得る。最も単純な反応ルートは、ワンポット合成（またはバッチ反応）における標的タンパク質の合成である。バッチベースの系はそれゆえ、標的タンパク質の単純かつ迅速な合成に適している。一方で、しかしながら、それらは、短い実行時間及び比較的低いタンパク質収量によって特徴づけられる。

一般的に、バッチベースの無細胞翻訳反応は、１−１．５時間後に合成された標的タンパク質の最大値に達する。これ以上のインキュベーション時間では、タンパク質収量増加につながらないが、標的タンパク質の濃度の低下を引き起こす可能性が高く、それはおそらくは、例えば、細胞抽出物中に存在するプロテアーゼによる、といった、標的タンパク質のタンパク質分解性の分解に起因する。しかし、翻訳溶液中で完全な形態で合成された標的タンパク質をより長いインキュベーション時間（＞２時間）で保存することは、特定の場合において、有利であろう。

高いタンパク質収量を得るために無細胞タンパク質合成反応の実行時間を延長する一つの可能性は、透析システムの使用である（連続的交換無細胞系、ＣＥＣＦ、非特許文献３）。これにおいては、ＡＴＰ及びＧＴＰといったエネルギーに富む物質が、膜を介した拡散によって、反応コンパートメント、翻訳の部位に移行する。同時に、反応は、遊離リン酸塩およびＡＤＰといった阻害物質により減弱される。

反応コンパートメントにおける無細胞反応の連続的な供給は、合成の実行時間を延長し、バッチ系と比較して有意にタンパク質収量増加をもたらす。もっぱら大腸菌由来の原核細胞溶解物との、又は小麦胚芽溶解物との組み合わせでの使用となるが、このタイプの透析システムは、すでに市販されている。

非連続的なバッチ系に比して収量は増加するが、真核生物の透析システムに対応するタンパク質収量は、大腸菌ベースの系に比して依然として比較的低い。

Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．ｅｔａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｄｖａｎｃｅｓ，２０１２，３０（５）：ｐｐ．１１８５−１１９４Ｍａｄｉｎ，Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００．９７（２）：ｐｐ．５５９−６４Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２４２（４８８２）：ｐｐ．１１６２−４

この背景に反して、本発明の目的は、安定的かつ機能的に活性な形態において複雑な真核生物および原核生物のタンパク質、特に膜タンパク質または無細胞翻訳系における比較的大量の翻訳後修飾を伴うタンパク質の合成を可能にする方法を提供することである。

この課題は、真核細胞溶解物が用いられ、翻訳反応がカスパーゼ阻害剤の存在下で行われる、請求項１による無細胞のタンパク質の合成のための方法、請求項１３および１５によるカスパーゼ阻害剤の使用、並びに請求項１７による本発明の方法を行うための装置による本発明によって解決される。

図１は、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ２１）からの細胞抽出物に基づく無細胞真核生物の翻訳系におけるサイトゾルタンパク質ＳＩＩ−ｅＹＦＰの合成に対する、カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−［Ｏ−メチル］−フルオロメチルケトン）の影響を示す図である。図１Ａは、^１４Ｃ−ロイシンの取り込みにより確立されたＳＩＩ−ｅＹＦＰのタンパク質収量を示した図である。図１Ｂは、^１４Ｃ−ロイシンで標識されたＳＩＩ−ｅＹＦＰを表すオートラジオグラフである。タンパク質は、約２９ｋＤａの見かけの分子量を示す。図１Ｃは、無細胞で合成されたタンパク質ＳＩＩ−ｅＹＦＰの蛍光強度の解析の図である。図１Ｄは、図１Ｃで得られた蛍光強度を示した図である。ＴＭ＝総翻訳混合物、ＳＮ＝遠心分離後の上清液、ＶＦ＝小胞画分、Ｖ＝小胞。図２は、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ２１）昆虫細胞からの細胞抽出物に基づく無細胞真核生物の翻訳系における膜タンパク質の発現に対する、カスパーゼ阻害剤（ＣＩ）Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫの影響を示す図である。図２Ａは、バッチおよび透析システムにおいて得られたタンパク質収量を示す図である。図２Ｂは、バッチシステム（Ｂ）および透析システム（Ｄ）において合成されたタンパク質を示すオートラジオグラフである。Ｃｏｎｔｒｏｌ＝ＤＮＡ鋳型の添加無しでの翻訳混合物。図３は、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ２１）昆虫細胞からの細胞抽出物に基づく無細胞真核生物の翻訳系における異なるモデルタンパク質の発現に対する、還元剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の影響を示す図である。バッチシステムおよび透析システムにおいて合成されたタンパク質を示すオートラジオグラフである。Ｃｏｎｔｒｏｌ＝ＤＮＡ鋳型の添加無しでの翻訳混合物。図４は、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ２１）昆虫細胞からの細胞抽出物に基づく無細胞真核生物の翻訳系におけるＩ型膜貫通型タンパク質Ｍｅｌ−Ｈｂ−ＥＧＦ−ｅＹＦＰの発現を示す図である。図４Ａは、カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫの添加を伴う、ＤＴＴの非存在下（−）および存在下（＋）でのバッチ（左）および透析システム（右）におけるＭｅｌ−Ｈｂ−ＥＧＦ−ｅＹＦＰの合成を示す図である。図４Ｂは、バッチシステム（左）および透析システム（右）における４８時間にわたる翻訳混合物（ＴＭ）および小胞画分（ＶＦ）での^１４Ｃ−ロイシン取り込みにより確立されたＭｅｌ−Ｈｂ−ＥＧＦ−ｅＹＦＰのタンパク質収量を示すグラフ図である。図４Ｃは、^１４Ｃ−ロイシンで標識されたＭｅｌ−Ｈｂ−ＥＧＦ−ｅＹＦＰを表すオートラジオグラフの図である。タンパク質は、約５１ｋＤａの見かけの分子量を示す。Ｃｏｎｔｒｏｌ＝ＤＮＡ鋳型の添加無しでの翻訳混合物。図５は、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ２１）昆虫細胞からの細胞抽出物に基づく無細胞真核生物の翻訳系における蛍光タンパク質ＳＩＩ−ｅＹＦＰに対する、非可逆的なカスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、Ａｃ−ＶＡＤ−ＣＭＫ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＭＫ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）および可逆的なカスパーゼ阻害剤（Ａｃ−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＤＥＶＤ−ＣＨＯ）の影響を示す図である。Ａｃ−ＶＡＤ−ＣＭＫ＝アセチル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−クロロメチルケトン、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＭＫ＝アセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−クロロメチルケトン、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ＝Ｎ−（２−キノリル）−Ｖａｌ−Ａｓｐ−（２，６−ジフルオロフェノキシ）−メチルケトン、Ａｃ−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＤＥＶＤ−ＣＨＯ＝アセチル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−アルデヒド。図５Ａは、バッチ様式および透析様式におけるすべてのサンプルの相対的な蛍光強度を示す図である。図５Ｂは、バッチ様式および透析様式におけるＳＩＩ−ｅＹＦＰの相対的な蛍光強度の評価を示す図である。サンプルの蛍光強度は、正規化され、カスパーゼ阻害剤の添加無しでの透析混合物の蛍光強度は、１００％を示す。図６は、バッチ様式でのＳｆ２１昆虫細胞溶解物に基づく無細胞真核生物の翻訳系における新たに合成された膜タンパク質Ｍｅｌ−ｈＥＧＦＲ−ｅＹＦＰの安定性に対する、カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫの影響を示す図である。図７は、バッチ様式でのＳｆ２１昆虫細胞溶解物に基づく無細胞真核生物の翻訳系における新たに合成された膜タンパク質Ｍｅｌ−ｈＥＧＦＲ−ｅＹＦＰの安定性に対する、異なるカスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＭＫ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ、Ｚ−ＷＥＨＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫ）の影響を示す図である。図８は、カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫの存在下での昆虫細胞溶解物のミクロソームへの膜タンパク質Ｍｅｌ−ｈＥＧＦＲ−ｅＹＦＰの合成を示す図である。図８は、カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫの存在下での昆虫細胞溶解物のミクロソームへの膜タンパク質Ｍｅｌ−ｈＥＧＦＲ−ｅＹＦＰの合成を示す図である。

本発明の主な態様は、核酸鋳型及び真核細胞溶解物を用いたインビトロでの翻訳反応を含む無細胞タンパク質合成のための方法に関し、翻訳反応はカスパーゼ阻害剤の存在下で行われることを特徴とする。

使用される真核細胞溶解物は特に制限されず、核酸鋳型のインビトロでの翻訳に要する成分のすべてを含む細胞溶解物を主に含む。特に好ましいのは、翻訳後修飾を伴う複雑なタンパク質の合成をも可能にする細胞溶解物である。

より具体的な実施形態において、使用される真核細胞溶解物は、小麦胚芽溶解物、昆虫細胞溶解物、特にＳｆ２１細胞溶解物、網状赤血球溶解物、ケラチノサイト溶解物、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ハイブリドーマ細胞又は培養されたリンパ腫細胞由来の細胞抽出物からなる群より選択される。

これらの細胞溶解物は、それらの天然の形態で、または特定の成分を追加または除去することによって変性されて使用され得る。

一つの細胞株から主に得られた細胞溶解物が、例えば無膜小胞（例えば、網状赤血球溶解物）を含む場合、これらは、翻訳後修飾を伴うタンパク質の合成をも可能にするために、他のソース、例えば他の細胞株の溶解物から加えられ得る。さらに、溶解液中の膜小胞の存在は、天然の脂質−タンパク質−マトリックスにおける膜タンパク質の組み込みのための前提条件であり、それは、その正しい折りたたみおよび構造を保証する。

反対に、特定のタンパク質の合成に対して、元来膜小胞を含まない、又は例えば遠心分離工程によって小胞を含まなくなった細胞溶解物を用いることは、有利であり得る。この「小胞枯渇」細胞溶解物は、特定のタンパク質に対して、収量の増加をもたらし得る（実施例１を参照、図１）。

「小胞枯渇」細胞溶解物はまた、翻訳活性を有し、翻訳後修飾無しでタンパク質の無細胞合成のために用いられ得る。

使用される細胞溶解物の成分はこのように、細胞株の細胞（同種の翻訳系）または異なる細胞株（異種の翻訳系）に由来し得る。１または２以上の成分が合成的に製造された人工的な細胞溶解物の使用もまた、原則として可能である。

真核細胞溶解物およびカスパーゼ阻害剤とは別に、本発明による方法を行うための反応混合物は、少なくとも１つの核酸鋳型、ポリメラーゼ、アミノ酸及びＡＴＰ、ＧＴＰなどといった高エネルギー物質を含む。原則として、インビトロ翻訳系として知られているすべての反応混合物および成分は、（カスパーゼ阻害剤の添加後に）使用され得る。反応混合物は場合によっては、特定の標的タンパク質の合成または安定性を促進させる添加剤をさらに含み得、それは例えば、ＤＴＴまたは他の還元剤、特に還元および酸化グルタチオンの混合物である。

記載された実施例と以下の試験データによって示されるように、特に連続的な透析システムを使用した、無細胞の真核生物の翻訳系へのカスパーゼ阻害剤の添加は、タンパク質収量の驚くべき増加を可能とし、翻訳後修飾を伴う複雑なタンパク質に対しても示されている。

無細胞のタンパク質合成反応の合成パフォーマンスに対するカスパーゼ阻害剤のこの影響の生化学的なメカニズムは、現在のところまだ不明である。細胞破壊の間、細胞は大きなストレスを受けており、場合によっては、それはアポトーシス過程を誘導する。アポトーシスは、「プログラム細胞死」とも呼ばれ、それは、タンパク質分解活性を有する種類の酵素、「カスパーゼ」によって実質的に制御される。カスパーゼ阻害剤によるカスパーゼの阻害は、溶解物中の特定の翻訳因子の寿命を延長すると予想され、それは、次に、細胞抽出物の全体の合成量に正の効果をもたらし得る。

真核細胞溶解物を用いた無細胞タンパク質合成系におけるカスパーゼ阻害剤の存在のさらなる利点は、特に、これらのタンパク質が翻訳混合物においてより長いままでいる（例えば＞１．５時間）条件下において、合成されたタンパク質の安定性への正の影響にある。これは、例えば、１又は２以上の標的タンパク質の無細胞合成が同じミクロソーム混合物において複数の連続的な合成で起こる反応にとって重要である。このタイプの反応経路は、「多数または反復的な合成」として知られ、ミクロソーム小胞の管腔または膜における新たに合成された標的タンパク質の濃縮に役立つ。

原則として、カスパーゼの不可逆的または可逆的な阻害剤、特に現在知られているカスパーゼタイプ１−１４の一つは、カスパーゼ阻害剤として適切である。カスパーゼ阻害剤は、例えば、以下の文献に記載されている：Ｃａｌｌｕｓ，Ｂ．Ａ．ａｎｄＤ．Ｌ．Ｖａｕｘ，Ｃａｓｐａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｖｉｒａｌ，ｃｅｌｌｕｌａｒａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌ．ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆｆｅｒ，２００６．１４（１）：ｐｐ．７３−７８；Ｅｋｅｒｔ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｉｌｋｅ，Ｊ．，Ｖａｕｘ，Ｄ．Ｌ．，Ｃａｓｐａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆｆｅｒ，１９９９，６：ｐｐ．１０８１−１０８６。

本発明による方法の特定の実施形態は、カスパーゼ阻害剤は、カスパーゼ、特にカスパーゼタイプ１−１４の１又は２以上の基質として機能するアミノ酸またはペプチド配列、およびカスパーゼ、特にカスパーゼタイプ１−１４の１又は２以上に不可逆的にまたは可逆的に結合する官能基を含むアミノ酸誘導体またはペプチド誘導体であるということにより特徴付けられ、カスパーゼ阻害剤は、本明細書において、競合的な阻害剤である。

より具体的には、本方法は、カスパーゼ阻害剤は、アミノ酸のアスパラギン酸またはアミノ酸のアスパラギン酸を含むペプチド配列を含むということにより特徴付けられる。カスパーゼ切断ペプチドは、アスパラギン酸（Ｄ）のＣ末端に結合する。したがって、アミノ酸のアスパラギン酸は、市販のペプチドベースのカスパーゼ阻害剤に含まれる。

さらにより具体的には、アミノ酸またはペプチド配列は、アスパラギン酸、バリン−アラニン−アスパラギン酸（ＶＡＤ）、アスパラギン酸−グルタミン酸−バリン−アスパラギン酸（ＤＥＶＤ；配列番号１）およびチロシン−バリン−アラニン−アスパラギン酸（ＹＶＡＤ；配列番号２）からなる群より選択される。配列ＶＡＤを有する阻害剤は、一般的なカスパーゼ阻害剤であるため、好ましい。

しかし、他のペプチド、例えば、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＭＫ（カスパーゼ３、６、７、８、１０を阻害する）、Ｚ−ＷＥＨＤ−ＦＭＫ（配列番号３；カスパーゼ１）、Ｚ−ＡＥＶＤ−ＦＭＫ（配列番号４；カスパーゼ１０）、Ｚ−ＬＥＥＤ−ＦＭＫ（配列番号５；カスパーゼ１３）、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ（配列番号６；カスパーゼ２）、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ３）、Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ４）、Ｚ−ＶＥＩＤ−ＦＭＫ（配列番号７；カスパーゼ６）、Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ（配列番号８；カスパーゼ８）、Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ（配列番号９；カスパーゼ９）も使用可能である。

官能基は、原則、カスパーゼの活性中心に可逆的または不可逆的に結合し、その活性を阻害するいかなる基であってもよい。種々のこのような基は、他の酵素に対して知られており、本技術分野の当業者は、所定の阻害実験を行わずともこれらの基の適切な典型例を容易に認識することができる。

阻害剤の官能基は、活性のそのメカニズムを定義する。官能基のメチルケトン（例えば、フルオロメチルケトン（ＦＭＫ）、クロロメチルケトン（ＣＭＫ）、アシルメチルケトンおよび（ホスフィニルオキシ）−（メチルケトン））に結合されたペプチドは、不可逆的な阻害剤として機能する（例えば、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、Ａｃ−ＶＡＤ−ＣＭＫ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＭＫ）。アルデヒド（またはニトリルおよびケトン）に結合されたペプチドは、可逆的な阻害剤（例えば、Ａｃ−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＤＥＶＤ−ＣＨＯ（配列番号１０））またはアミノ酸のアスパラギン酸もしくはＤＥＶＤまたはＶＡＤの配列を有する他の可逆的な阻害剤として機能する。

本発明の特定の実施形態では、カスパーゼ阻害剤は、官能基のフルオロメチルケトン（ＦＭＫ）、クロロメチル（ＣＭＫ）またはジフルオロフェノキシ−メチルケトンを含み、それはカスパーゼタイプ１−１４のすべてに不可逆的に結合する。

本発明の別の特定の実施形態において、カスパーゼ阻害剤は、少なくとも一つのアルデヒド基に結合され、カスパーゼを可逆的に阻害するペプチドである（例えば、Ａｃ−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＤＥＶＤ−ＣＨＯ）。ペプチドは、好ましくは、上記の配列の一つを有している。

カスパーゼ阻害剤の濃度は、使用される細胞溶解物のタイプ及び使用される阻害剤のタイプ及び作用様式に応じて大きく変化し得る。しかし、最適な濃度は、日常的な実験を通して本技術分野の当業者により容易に決定され得る。

典型的には、カスパーゼ阻害剤は、反応混合物において、２０μＭから１００μＭ、好ましくは２５μＭから５０μＭ、例えば約３０μＭの濃度で存在する。

特に好ましい実施形態において、本発明による方法は、それ自体公知の透析システムにおいて連続的に実施される。

典型的には、該方法は、透析膜によって分離された少なくとも２つのコンパートメントを含む装置において行われ、それにおいて、翻訳反応は少なくとも１つの第一のコンパートメント、反応コンパートメントにおいて行われ、翻訳反応の間、ｉ）反応物は、透析膜を介して、少なくとも１つのさらなるコンパートメント、給排コンパートメントから反応コンパートメントに拡散し、ｉｉ）反応副産物は、透析膜を介して、反応コンパートメントから給排コンパートメントに拡散する。

カスパーゼ阻害剤は、さらなる新鮮な阻害剤を反応コンパートメントに供給するために給排コンパートメントにも存在するが、本明細書おいて、少なくとも反応コンパートメントに存在する。

反応混合物中のカスパーゼ阻害剤の存在は、反応に対する実質的により長い実行時間を可能にし（例えば、４８時間までまたはさらに長い時間）、それによってタンパク質収量の顕著な増加がもたらされる。

このタイプの連続的な工程に伴い、本発明によるカスパーゼ阻害剤の使用において、翻訳後修飾を伴う複雑なタンパク質に対するものも含めて、反応媒体中、少なくとも３０μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１００μｇ／ｍｌまたは１５０μｇ／ｍｌの最大タンパク質収量が達成され得る。

したがって、本発明の密接に関連した態様は、真核生物の細胞溶解物を使用したタンパク質合成のための無細胞連続的工程におけるタンパク質収量を増加させるためのカスパーゼ阻害剤の使用に関する。

このカスパーゼ阻害剤は、上記で定義されるように、好ましくは、阻害剤である。

より具体的には、この使用は、反応媒体のμｇ／ｍｌで測定される最大タンパク質収量が、カスパーゼ阻害剤の非存在下におけるアナログ系に比して、少なくとも２倍、具体的には少なくとも５倍又は１０倍増加することによって特徴付けられる。ここで、翻訳後修飾を伴う複雑なタンパク質であっても、反応媒体中、少なくとも３０μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１００μｇ／ｍｌまたは１５０μｇ／ｍｌのタンパク質収量が達成される。

本発明のさらなる関連した態様は、特に、これらのタンパク質が翻訳混合物において比較的長時間（例えば＞１．５時間）存在する条件下で、真核細胞溶解物を使用して、タンパク質合成のための無細胞法での合成されたタンパク質の安定性を増加させるカスパーゼ阻害剤の使用に関する。

好ましくは、このカスパーゼ阻害剤は、上記で定義されるように、阻害剤であり、上記で定義されるように、特に好ましくは不可逆的な阻害剤である。

特定の実施形態において、この使用は、タンパク質合成のための無細胞法が少なくとも以下の工程を含むことを特徴とする。
ａ）標的タンパク質をコードする核酸鋳型、膜小胞を含む細胞溶解物およびカスパーゼ阻害剤を含む反応媒体中でのインビトロでの翻訳反応によって標的タンパク質を合成する工程、
ｂ）媒体から、合成された標的タンパク質を含む膜小胞を分離する工程、
ｃ）分離された膜小胞を、標的タンパク質をコードする核酸鋳型、膜小胞を含まない細胞溶解物及びカスパーゼ阻害剤を含む第二の反応媒体に移し、第二の反応媒体においてカスパーゼ阻害剤の存在下でインビトロ翻訳反応を行い、第二の反応媒体から、増加した量の合成された標的タンパク質を含む膜小胞を分離する工程。
工程ｃ）は、１回または複数回反復され得る。

本発明のさらなる態様は、無細胞のタンパク質合成のための本発明による方法を実施するための装置に関する。

典型的に、無細胞のタンパク質合成を行うための本発明による装置は、
インビトロ翻訳反応が行われ、少なくとも１つの真核細胞溶解物、ポリメラーゼ、核酸鋳型、アミノ酸およびＡＴＰ、ＧＰＴ等といった高エネルギー物質を含む反応混合物を含む少なくとも１つの反応コンパートメント；
前記反応コンパートメントから半透過性透析膜によって分離され、アミノ酸、高エネルギー物質及び反応副産物を含む少なくとも１つの給排コンパートメント；
の少なくとも２つの異なる分離したコンパートメントを含み、反応コンパートメント、好ましくは給排コンパートメントもまた、上記のようなカスパーゼ阻害剤を含むことを特徴とする。

本発明による方法で合成されたタンパク質は、原核生物または真核生物のいずれかのタンパク質であり得る。特に好ましくは、それらは、膜タンパク質または翻訳後修飾を伴う複雑なタンパク質である。このような修飾は、例えば、ジスルフィド架橋、グリコシル化、脂質修飾および他の公知の修飾であり得る。

真核細胞溶解物を使用しカスパーゼ阻害剤を加えた本明細書に記載の翻訳系は、組換えタンパク質発現の分野において顕著な利点を示す。製造されたタンパク質の調製用途及び分析用途のいずれにおいても、顕著に簡便に行われ、収量増加によってより有用性が高く、改善された安定性が得られる。これは、タンパク質の構造を解明するための膜タンパク質の発現の領域において、特に興味深いものである。

本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。実施例は、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

（実施例１）
ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）からの真核細胞溶解物を使用した、無細胞翻訳系における細胞質タンパク質の発現へのカスパーゼ阻害剤の影響

はじめに、最大達成可能タンパク質収量へのカスパーゼ阻害剤の影響を、細胞質タンパク質ＳＩＩ−ｅＹＦＰの発現に基づき調べた。このモデルタンパク質は、アフィニティタグ（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ、ＳＩＩ−Ｔａｇ）でＮ末端に結合され、ベクターｐＩＸ３．０（キアゲン）に存在する強化黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）である。

モデルタンパク質の発現を、４８時間にわたって、バッチシステムおよび透析システム（５０μｌの反応チャンバー；１０００μｌの供給チャンバー；膜のカットオフ＝１０ｋＤａ）において分析した。翻訳混合物をバッチシステムおよび透析システムにおいて、各々、昆虫細胞小胞（Ｖ）有り（＋）及び無し（−）、並びにカスパーゼ阻害剤（ＣＩ）有り（＋）及び無し（−）で、各々インキュベートした（２７℃、６００ｒｐｍ）。高温ＴＣＡ沈殿及びシンチレーション測定による新たに合成された標的タンパク質の量を決定ことができるように、タンパク質合成を放射性標識されたアミノ酸^１４Ｃ−ロイシンの存在下で実施した。

翻訳反応は、特定の時点で中断し（０時間、２時間、４時間、２４時間および４８時間）、以下のように分析した：５μｌの混合物を、各ケースで高温ＴＣＡ又は氷冷アセトンにおいて沈殿させた。さらに５μｌを、２５μｌのＰＢＳに再懸濁させた。残ったサンプルを、上清液（ＳＮ）および小胞画分（ＶＦ）に、遠心分離工程によって、分離した。これらの画分の５μｌの分量を、各々、２５μｌのＰＢＳで希釈した。

ＴＣＡ沈殿後、サンプルを、真空駆動ろ過システムにより、遊離の放射性アミノ酸から分離し、シンチレーション測定を行った。乾燥させた後、アセトン中で沈殿したタンパク質を、還元サンプル緩衝液中に回収し、電気泳動で分離した。

ＰＢＳ中に再懸濁させたサンプルを、蛍光強度のためのｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒｓｙｓｔｅｍ（ＴｙｐｈｏｏｎＴＲＩＯ＋ｉｍａｇｅｒ、ＧＥヘルスケア社）において調べた。この目的のために、２５μｌのサンプルをＩｂｉｄｉスライドの各孔にピペットで移して測定し、サンプルの励起は４８８ｎｍで行い、発光は５２６ｎｍで測定された。

図１に示された結果は、カスパーゼ阻害剤の添加無しでは、バッチシステムと比較して、透析システムでは、タンパク質量の中程度の増加（約５０％）が達成された（４８時間後のバッチシステム、−Ｖ、−ＣＩ＝１７．５μｇ／ｍｌ；４８時間後の透析システム、−Ｖ、−ＣＩ＝２７．１μｇ／ｍｌ）。これに対して、翻訳混合物へのカスパーゼ阻害剤の添加は、標的タンパク質の１７．３μｇ／ｍｌ（４８時間後のバッチシステム、−Ｖ、＋ＣＩ）から９０．８μｇ／ｍｌに達成された、非常に大きく増加した（約４００％）最大タンパク質収量をもたらした（図１Ａ）。サンプルの蛍光の記録は、同じような傾向を示した。カスパーゼ阻害剤の存在下で透析システムにおいて合成された翻訳混合物から検出された蛍光シグナルは、他のサンプルと異なっていた（図１Ｃ）。これらのサンプルの濃度測定において、透析システム＋ＣＩ（４８時間後、−Ｖ）と比較して、透析システム−ＣＩ（４８時間後、−Ｖ）において発現されたサンプルでは、３．７倍以上の強度の蛍光がみられた（図１Ｄ）。

（実施例２）
ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）から真核細胞の抽出物を使用した、無細胞翻訳系における膜タンパク質の発現に対するカスパーゼ阻害剤の影響

ここでは、真核生物の翻訳系における異なる膜タンパク質の発現に対するカスパーゼ阻害剤の影響を、より詳しく検証した。この目的のため、３つの異なるモデルタンパク質を選択した：エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢ）は、７つの膜貫通領域を有するＧタンパク質共役受容体であり、それはベクターｐＩＸ３．０（キアゲン社）にクローンされている。さらに、Ｎ末端がメリチンシグナル配列に結合され、Ｃ末端がｅＹＦＰに結合され、ベクターｐＩＸ３．０に存在するＩ型膜貫通タンパク質のヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）を発現に用いた。加えて、７つの膜貫通領域を有し、ベクターｐＭＡ（ジーンアート社）に存在する膜タンパク質バクテリオロドプシンの発現を調べた。

３つのタンパク質を、４８時間、^１４Ｃ−ロイシンの存在下で、カスパーゼ阻害剤（ＣＩ）の添加無し（−）および有り（＋）で、バッチおよび透析システムにおいて各々発現させ（２７℃、６００ｒｐｍ、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒＣｏｍｆｏｒｔ）、実施例１と同様に分析した。シンチレーション測定により達成されたタンパク質収量の決定は、最大達成可能タンパク質収量に対するカスパーゼ阻害剤の明確な影響を示した。３つの膜タンパク質（ＥＴＢ、４９．３ｋＤａ；Ｈｂ−ＥＧＦ、５１ｋＤａ；バクテリオロドプシン、２６．９ｋＤａ）の各々の発現は、カスパーゼ阻害剤の添加によって、透析システムにおいて約１００％増加し得た（透析バッチ＋ＣＩおよび−ＣＩの比較）。

（実施例３）
真核細胞抽出物を使用し、カスパーゼ阻害剤を添加した、最大達成可能タンパク質収量に対する還元剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の影響

細胞抽出物および翻訳バッファーにＤＴＴといった還元剤を添加することは、従来、保存可能期間を延長するのに役立っていた。しかしながら、ジスルフィド架橋を有するタンパク質の無細胞発現に対する調査は、還元剤が標的タンパク質においてジスルフィド架橋の形成を阻害し得ることを明らかにした（Ｋａｔｚｅｎ，Ｆ．，Ｇ．ＣｈａｎｇａｎｄＷ．Ｋｕｄｌｉｃｋｉ，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００５，２３（３）：ｐｐ．１５０−１５６）。ジスルフィド架橋が多くのタンパク質において、タンパク質に安定性を与えタンパク質の折り畳みに重要な貢献をする、重要な翻訳後修飾を代表するため、種々の実験が所定の酸化還元電位を用いた翻訳系を開発するために行われてきた。この目的のために、ほとんどの場合、溶解物または翻訳バッファーへの還元剤の添加が省略されている。

ここに記載された無細胞翻訳系は、複雑な真核生物のタンパク質が合成され得るプラットフォームを提供するように意図されている。したがって、本発明の方法がジスルフィド架橋を有するタンパク質の合成に有利に用いられ得るかを決定し、最適化の可能性を明らかにすることは、特に関心のあることであった。

この目的のために、還元剤ＤＴＴの、異なるモデルタンパク質を有するバッチおよび透析システムの合成パフォーマンスに対する影響を調べた。

糖タンパク質のエリスロポエチン（Ｎ末端がメリチンのシグナル配列に結合されている；Ｍｅｌ−ＥＰＯ；２０．９ｋＤａ、非グリコシル化）ならびにＥＴＢ（４９．３ｋＤａ）、ルシフェラーゼ（６０．６ｋＤａ）、Ｍｅｌ−Ｈｂ−ＥＧＦ−ｅＹＦＰ（５１ｋＤａ）およびバクテリオロドプシン（２６．９ｋＤａ）の合成を、４８時間、２７℃、６００ｒｐｍで、^１４Ｃ−ロイシンの存在下で、翻訳バッファーにおいて、ＤＴＴの添加無し（−）および有り（＋）で、カスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）を添加して、バッチ（Ｂ）および透析システム（Ｄ）で行った。

図３は、バッチシステムおよび透析システムで合成されたタンパク質のオートラジオグラフを示す。コントロール＝ＤＮＡ鋳型の添加無しでの翻訳混合物。

ＤＴＴの非存在下では、サイトゾルタンパク質（ルシフェラーゼ、ＳＩＩ−ｅＹＦＰ；両方とも発現ベクターｐＩＸ３．０（キアゲン社）に存在する）および膜タンパク質（ＥＴＢ、Ｍｅｌ−Ｈｂ−ＥＧＦ−ｅＹＦＰ、バクテリオロドプシン）を含む、異なるモデルタンパク質の発現に負の影響を与えないことは明らかである。

グリコシル化タンパク質のエリスロポエチン（Ｎ末端がメリチンシグナル配列に結合されている；Ｍｅｌ−ＥＰＯ）の場合、しかし、標的タンパク質の完全なグリコシル化がＤＴＴの存在下のみで達成されたことが見出された。

（実施例４）
真核細胞抽出物を使用し、カスパーゼ阻害剤を添加した、Ｉ型膜貫通型タンパク質Ｍｅｌ−Ｈｂ−ＥＧＦ−ｅＹＦＰの発現の検証

タンパク質合成反応にカスパーゼ阻害剤を添加すると、平均で約１００％、透析システムにおいて膜タンパク質の最大達成可能収量を増加させることは、上記のデータから明らかである。膜タンパク質Ｍｅｌ−Ｈｂ−ＥＧＦ−ｅＹＦＰに対して、２０．５μｇ／ｍｌ（透析４８時間、−ＣＩ）から４７．６μｇ／ｍｌ（透析４８時間、＋ＣＩ）の総タンパク量の増加が達成された（＝１３０％）。バッチシステムの透析システムとの比較において、１２．１μｇ／ｍｌ（透析４８時間、＋ＣＩ）から４７．６μｇ／ｍｌ（透析４８時間、＋ＣＩ）の総タンパク量の増加が達成された（＝３００％）（図２）。

ここでは、その意図は、総タンパク量の増加がまた、小胞の脂質層に移行され組み入れられた膜タンパク質量の増加に関連するかどうかを調査することである。この目的のため、Ｍｅｌ−Ｈｂ−ＥＧＦ−ｅＹＦＰの翻訳混合物を、遠心分離工程によって、上清液（ＳＮ）および小胞画分（ＶＦ）に分離した。これらのサンプル（５μｌ）を、新たに合成されたタンパク質の量を決定するために使用し、蛍光特性に関して調べた（図４）。

図４Ａ：Ｍｅｌ−Ｈｂ−ＥＧＦ−ｅＹＦＰの合成を、４８時間、２７℃、６００ｒｐｍで、カスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）を添加して、ＤＴＴの添加無し（−）および有り（＋）で、バッチ（左）および透析システム（右）で行った。合成後、混合物を、上清液（ＳＮ）および小胞画分（ＶＦ）に、遠心工程によって分離した。サンプルの蛍光強度の分析のために、画分（５μｌ）を２５μｌのＰＢＳ中に各々希釈し、この混合物の２５μｌをＩｂｉｄｉスライドの各孔にピペットで移して測定した。サンプルの励起は、ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（ＴｙｐｈｏｏｎＴＲＩＯ＋ｉｍａｇｅｒ、ＧＥヘルスケア社）を用いて４８８ｎｍで行い、発光は５２６ｎｍで測定された。

図４Ｂは、バッチシステム（左）および透析システムにおいて分析された、４８時間にわたる、翻訳混合物（ＴＭ）および小胞画分（ＶＦ）における、^１４Ｃ−ロイシンの取り込みにより確立された、Ｍｅｌ−Ｈｂ−ＥＧＦ−ｅＹＦＰのタンパク質収量のグラフ表示を示す。

図４Ｃは、^１４Ｃ−ロイシンで標識されたＭｅｌ−Ｈｂ−ＥＧＦ−ｅＹＦＰを表すオートラジオグラフを示す。タンパク質は、約５１ｋＤａの分子量を有する。

これらのデータは、カスパーゼ阻害剤を含み、ＤＴＴを使用しない透析システムの使用は、溶解物の小胞画分中のＭｅｌ−Ｈｂ−ＥＧＦ−ｅＹＦＰの割合の大幅な増加を引き起こすことを示す（バッチ４８時間−ＤＴＴ＋ＣＩ＝６．５μｇ／ｍｌ；透析４８時間−ＤＴＴ＋ＣＩ＝３１．４μｇ／ｍｌ）。さらに、透析システムにおける小胞画分のサンプルの時間依存的な解析は、２４時間以上にわたって、タンパク質の量の継続的な増加を示し、一方、バッチシステムにおいて、最大値に２時間後に到達した（図４Ｂ、４Ｃ）。

（実施例５）
ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ２１）の昆虫細胞からの細胞抽出物を基礎とする真核生物翻訳系における合成パフォーマンスに対する不可逆的および可逆的カスパーゼ阻害剤の影響

蛍光タンパク質ＳＩＩ−ｅＹＦＰの例を使用して、異なる不可逆的カスパーゼ阻害剤（ＺＶＡＤ−ＦＭＫ、Ａｃ−ＶＡＤ−ＣＭＫ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＭＫ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）および可逆的カスパーゼ阻害剤（Ａｃ−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＤＥＶＤ−ＣＨＯ）の合成に対する影響を、真核生物の透析の翻訳系において調べた。

ＳＩＩ−ｅＹＦＰの翻訳は、異なる不可逆的および可逆的カスパーゼ阻害剤の存在下で、バッチおよび透析の方式において、６００ｒｐｍ、２７°Ｃで、４８時間にわたって、ＤＮＡ鋳型ｐｉＸ３．０−ＳＩＩ−ｅＹＦＰを用いておこなわれた。すべて阻害剤は、３０μＭの濃度で使用された。翻訳完了後、異なる混合物を、蛍光強度のためのｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒｓｙｓｔｅｍ（ＴｙｐｈｏｏｎＴＲＩＯ＋ｉｍａｇｅｒ、ＧＥヘルスケア社）において調べた。この目的のため、５μｌの各々の翻訳混合物を、２５μｌのＰＢＳに再懸濁させた。続いて、このサンプルの２５μｌをＩｂｉｄｉスライドの各孔にピペットで移して測定し、サンプルの励起は、４８８ｎｍで行い、発光は５２６ｎｍで測定された。

図５に示される結果は、すべての試験された不可逆的なカスパーゼ阻害剤は、阻害剤無しのコントロールの透析混合物に比して、１２２％の最大値まで（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＭＫ）、少なくとも７７％（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）、合成収率を増加させることができたことを示す。試験された可逆的なカスパーゼ阻害剤Ａｃ−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＤＥＶＤ−ＣＨＯは、阻害剤無しの透析溶液に比して５３％、蛍光を発するタンパク質の収量の増加を引き起こした。

記述されたデータに基づいて、原理的に、不可逆的および可逆的阻害剤の両方を伴うと、合成収率の増加が真核生物の透析システムで可能であると結論づけられる。

（実施例６）
真核生物の翻訳系における新たに合成された膜タンパク質の安定性に対するカスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫの影響

ここに、無細胞で合成されたタンパク質の安定性に対するカスパーゼ阻害剤の正の影響が、内因性のチロシンキナーゼ活性を有し、ヒトのタンパク質であり、高分子量の膜貫通タンパク質である（上皮成長因子受容体）、ＥＧＦ受容体の発現に基づき示される。ＥＧＦ受容体をコードする配列を、メリチンシグナル配列（Ｍｅｌ）でＮ末端に結合させ、黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）でＣ末端に結合させ、ベクターｐＩＸ３．０（キアゲン社）にクローニングした。モデルタンパク質は、Ｍｅｌ−ｈＥＧＦＲ−ｅＹＦＰ（＝１６３ｋＤａ）として以下に示される。メリチンシグナル配列は、膜タンパク質の真核細胞抽出物のミクロソームへの移行およびミクロソームの膜への実質的な取り込みを可能にする。Ｍｅｌ−ｈＥＧＦＲ−ｅＹＦＰは、９個の潜在的なＮ−グリコシル化部位を有し、それゆえ、標的タンパク質の移行に起因して、標的タンパク質のＮ−グリコシル化もまた無細胞系において可能となる。

図６は、^１４Ｃ−ロイシンの存在下でのＳｆ２１の昆虫細胞溶解物に基づくバッチベースの真核生物翻訳系におけるＭｅｌ−ｈＥＧＦＲ−ｅＹＦＰの無細胞発現を示す。翻訳反応を、カスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、プロメガ社、３０μＭ）およびプロテアーゼ阻害剤混合物（「完全プロテアーゼ阻害剤カクテル」、ロシュ社）の非存在下および存在下で行い、各々、液体窒素中で翻訳反応の凍結によって示されたインキュベーション時間（１．５時間、５時間および２４時間）で停止させた。新たに合成された標的タンパク質の分析を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーを用いて行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの実行のために、５μＬの翻訳混合物を氷冷アセトン中に沈殿させた。乾燥後、タンパク質のペレットを還元サンプルバッファー中に回収し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。無細胞で合成され^１４Ｃ−ロイシンで標識されたタンパク質の可視化を、ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒｓｙｓｔｅｍ（ＴｙｐｈｏｏｎＴＲＩＯ＋ｉｍａｇｅｒ、ＧＥヘルスケア社）を用いて行った。

オートラジオグラフは、１．５時間のインキュベーション時間後の標的タンパク質の２つの別個のバンドを示す。標的タンパク質の配列における多数の潜在的なＮ−グリコシル化部位に起因して、より大きい分子量を有するバンドは、１または２以上の付加されたグリコシル化を有するタンパク質であると考えられる。したがって、低分子量を有するタンパク質のバンドは、糖基を有しない標的タンパク質に対応するであろう。カスパーゼ阻害剤の添加無しでは、５時間のインキュベーション時間後のＭｅｌ−ｈＥＧＦＲ−ｅＹＦＰに対して、オートラジオグラフにおける標的タンパク質のバンドの強度が減弱するのが見られ得、低分子分解生成物が可視化される。それに対して、カスパーゼ阻害剤の存在下で合成されたタンパク質は、タンパク質分解のサインの減弱を示す。２４時間のインキュベーション時間後でさえも、膜タンパク質のＭｅｌ−ｈＥＧＦＲ−ｅＹＦＰは、オートラジオグラフにおいて完全な形で検出可能である。そのため、カスパーゼ阻害剤の特定の効果は、市販のプロテアーゼ阻害剤混合物（コンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル、ロシュ社）がカスパーゼ阻害剤の効果の安定化を達成できなかった点において、明らかにされている。

（実施例７）
真核生物翻訳系における新たに合成された膜タンパク質の安定性に対する異なる種類のカスパーゼ阻害剤の正の影響

以下の実験において、異なる官能基（メチルケトン、フルオロメチルケトン、ＦＭＫまたはクロロメチルケトン、ＣＭＫ）およびペプチド基を有する異なるカスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、プロメガ社；Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＭＫ、サンタクルーズバイオテクノロジー社；Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ、Ｚ−ＷＥＨＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｒ＆Ｄシステムズ社；すべて３０μＭ）の、^１４Ｃ−ロイシンの存在下、バッチの様式での、Ｓｆ２１昆虫細胞溶解物に基づく無細胞の真核生物翻訳系における標的タンパク質Ｍｅｌ−ｈＥＧＦＲ−ｅＹＦＰの合成に対する影響を調べた。合成は、図７において与えられるインキュベーション時間で停止された（１．５時間、２４時間）。

得られた結果は、使用されたすべての阻害剤が、長いインキュベーション時間（２４時間）後でさえも、翻訳溶液における標的タンパク質の安定性を保証することを示す（図７）。

（実施例８）
ミクロソーム小胞における標的タンパク質の複数の合成を伴うカスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫの使用

昆虫細胞の小胞の管腔または膜における特定の標的タンパク質の濃度を増加させるための適切な方法は、複数の合成を行うことにある。この手順は、翻訳混合物中で新たに合成された標的タンパク質の滞留時間の延長をもたらす。成功した変換のために、それゆえ、翻訳混合物における比較的長いインキュベーション時間（＞１．５時間）の後でさえも標的タンパク質の安定性を保証することが絶対に必要である。この目的のために、カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫを翻訳反応に添加した。標的タンパク質の複数の合成を次のように行った：標準条件（２７℃、１．５時間）下でインキュベートした翻訳混合物のミクロソームを、１６，０００ｇでの遠心分離工程によりペレット化し、ミクロソームを含まない翻訳活性のある細胞溶解物に再懸濁させて、カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫの存在下で、２７°Ｃで、１．５時間、再びインキュベートした。本実験では、合成を４回繰り返した。各々の合成工程の後、翻訳混合物、上清および小胞画分における放射性標識されたタンパク質の収量を測定した。加えて、５μｌの翻訳混合物をアセトン中で沈殿させ、その後に電気泳動的に分離した。関連するオートラジオグラフ（図８Ａ）は、翻訳混合物および翻訳混合物の小胞画分におけるＭｅｌ−ｈＥＧＦＲ−ｅＹＦＰのタンパク質のバンドを示す。翻訳反応にカスパーゼ阻害剤を添加することで、合計６時間以上の標的タンパク質の合成が可能となった。

得られたデータは、標的タンパク質の収量が、合成工程１から４に、各々、１１０％（翻訳混合物中の総タンパク質）および１８０％（小胞画分）増加したことを示す。

Claims

核酸鋳型及び真核細胞溶解物を用いたインビトロ翻訳反応を含む、無細胞のタンパク質の合成方法であって、
前記翻訳反応は、カスパーゼ阻害剤の存在下で行われる、
ことを特徴とする方法。
前記カスパーゼ阻害剤は、カスパーゼ、特に１又は２以上のカスパーゼタイプ１−１４に対する基質として機能するアミノ酸又はペプチド配列と、カスパーゼ、特に１又は２以上のカスパーゼタイプ１−１４に不可逆的又は可逆的に結合する官能基と、含むアミノ酸誘導体又はペプチド誘導体である、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記カスパーゼ阻害剤は、アミノ酸のアスパラギン酸塩を含む、アミノ酸のアスパラギン酸塩又はペプチド配列を含む、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
前記アミノ酸又はペプチド配列は、アスパラギン酸塩、バリン−アラニン−アスパラギン酸塩（ＶＡＤ）、アスパラギン酸−グルタミン酸−バリン−アスパラギン酸塩（ＤＥＶＤ；配列番号１）およびチロシン−バリン−アラニン−アスパラギン酸塩（ＹＶＡＤ；配列番号２）からなる群より選択される、
ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
前記カスパーゼ阻害剤は、官能基として、メチルケトン基、例えば、カスパーゼタイプ１−１４のすべてに不可逆的に結合するフルオロメチルケトン（ＦＭＫ）又はクロロメチルケトン（ＣＭＫ）を含む、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
前記カスパーゼ阻害剤は、少なくとも１つのアルデヒド基に結合したペプチドを表す、
ことを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１項に記載の方法。
前記カスパーゼ阻害剤は、反応混合物において、２０μＭから１００μＭ、好ましくは２５μＭから５０μＭの濃度で存在する、
ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
前記真核細胞溶解物は、コムギ胚芽溶解物と、昆虫細胞溶解物、特に、Ｓｆ２ｌ細胞溶解物と、網状赤血球溶解物と、ケラチノサイト溶解物と、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ハイブリドーマ細胞又は培養リンパ腫細胞からの細胞抽出物と、を含む群から選択される、
ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞溶解物は、膜小胞を含む、
ことを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
前記膜小胞は、前記細胞溶解物として、同じ細胞株に由来する、
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
透析膜により分離された少なくとも２つのコンパートメントを備える装置において行われ、
前記翻訳反応は、少なくとも１つの第一のコンパートメント、反応コンパートメントにおいて行われ、前記翻訳反応の間、ｉ）反応物は、前記透析膜を通って、少なくとも１つのさらなるコンパートメント、給排コンパートメントから、反応コンパートメントに拡散し、ｉｉ）反応生成物は、前記透析膜を通って、反応コンパートメントから給排コンパートメントに拡散する、
ことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
最大タンパク質収量は、少なくとも３０μｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ又は１５０μｇ／ｍＬである、
ことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
真核細胞溶解物を用いたタンパク質の合成のための無細胞の一連のプロセスにおけるタンパク質収量を増加させるためのカスパーゼ阻害剤の使用。
反応培地のμｇ／ｍＬで測定された最大タンパク質収量は、少なくとも２倍、特に少なくとも５または１０倍増加する、
ことを特徴とする請求項１３に記載の使用。
真核細胞溶解物を用いたタンパク質の合成のための無細胞の方法における合成されたタンパク質の安定性を増加させるカスパーゼ阻害剤の使用。
タンパク質合成のための無細胞の方法は、少なくとも下記の工程：
ａ）標的タンパク質をコードする核酸鋳型、膜小胞及びカスパーゼ阻害剤を含有する細胞溶解物を含む反応媒体においてインビトロ翻訳反応によって標的タンパク質を合成する工程、
ｂ）媒体から合成された標的タンパク質を含む膜小胞を分離する工程、
ｃ）標的タンパク質をコードする核酸鋳型、膜小胞及びカスパーゼ阻害剤を含有しない細胞溶解物を含む第二の反応媒体に、分離された膜小胞を移し、第二の反応媒体においてカスパーゼ阻害剤の存在下、インビトロ翻訳を行い、第二の反応媒体から、増加した量の合成された標的タンパク質を含む膜小胞を分離する工程であって、１回又は複数回繰り返され得る工程、
を含む、
ことを特徴とする請求項１５に記載の使用。
インビトロ翻訳反応が行われ、少なくとも１つの真核細胞溶解物と、ポリメラーゼと、核酸鋳型と、アミノ酸と、ＡＴＰ、ＧＰＴ等といった高エネルギー物質と、を含む反応混合物を含む少なくとも１つの反応コンパートメント；及び
前記反応コンパートメントから半透過性透析膜によって分離され、アミノ酸、高エネルギー物質及び反応副産物を含む少なくとも１つの給排コンパートメント、
の少なくとも２つの異なる分離したコンパートメントを含み、
少なくとも前記反応コンパートメントはまた、カスパーゼ阻害剤を含む、
ことを特徴とする無細胞のタンパク質合成を行うための装置。
前記カスパーゼ阻害剤は、カスパーゼ、特に１又は２以上のカスパーゼタイプ１−１４に対する基質として機能するアミノ酸又はペプチド配列と、カスパーゼ、特に１又は２以上のカスパーゼタイプ１−１４に不可逆的又は可逆的に結合する官能基と、を含むアミノ酸誘導体又はペプチド誘導体である、
ことを特徴とする請求項１３乃至１６のいずれか１項に記載の使用又は請求項１７に記載の装置。
前記カスパーゼ阻害剤は、アミノ酸のアスパラギン酸塩を含む、アミノ酸のアスパラギン酸塩又はペプチド配列を含む、
ことを特徴とする請求項１８に記載の使用又は装置。
前記アミノ酸又はペプチド配列は、アスパラギン酸塩、バリン−アラニン−アスパラギン酸塩（ＶＡＤ）、アスパラギン酸−グルタミン酸−バリン−アスパラギン酸塩（ＤＥＶＤ）およびチロシン−バリン−アラニン−アスパラギン酸塩（ＹＶＡＤ）からなる群より選択される、
ことを特徴とする請求項１９に記載の使用又は装置。
前記カスパーゼ阻害剤は、官能基として、メチルケトン基、例えば、カスパーゼタイプ１−１４のすべてに不可逆的に結合するフルオロメチルケトン（ＦＭＫ）又はクロロメチルケトン（ＣＭＫ）を含む、
ことを特徴とする請求項１８乃至２０のいずれか１項に記載の使用又は装置。
前記カスパーゼ阻害剤は、少なくとも１つのアルデヒド基に結合したペプチドを表す、
ことを特徴とする請求項１８乃至２０のいずれか１項に記載の使用又は装置。
前記カスパーゼ阻害剤は、反応混合物において、２０μＭから１００μＭ、好ましくは２５μＭから５０μＭ、特に好ましくは約３０μＭの濃度で存在する、
ことを特徴とする請求項１８乃至２２のいずれか１項に記載の使用又は装置。