RU2760578C2 - Слитый белок, содержащий модифицированный безметиониновый белок GroEL и димер полипептида полифемузина I - Google Patents
Слитый белок, содержащий модифицированный безметиониновый белок GroEL и димер полипептида полифемузина I Download PDFInfo
- Publication number
- RU2760578C2 RU2760578C2 RU2019143623A RU2019143623A RU2760578C2 RU 2760578 C2 RU2760578 C2 RU 2760578C2 RU 2019143623 A RU2019143623 A RU 2019143623A RU 2019143623 A RU2019143623 A RU 2019143623A RU 2760578 C2 RU2760578 C2 RU 2760578C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- groel
- polylinker
- polyphemusine
- free
- Prior art date
Links
- 108010058432 Chaperonin 60 Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 102000006303 Chaperonin 60 Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 35
- 239000000539 dimer Substances 0.000 title claims description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title abstract description 27
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title abstract description 21
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title abstract description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- 108010065174 polyphemusin I Proteins 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 241001302191 Polyphemus Species 0.000 abstract 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 15
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 11
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 7
- 241000039733 Thermoproteus thermophilus Species 0.000 description 7
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 7
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 5
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- FBHQJAVRQRGPNG-UHFFFAOYSA-N N#CBr.[Na] Chemical compound N#CBr.[Na] FBHQJAVRQRGPNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100024341 10 kDa heat shock protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- 108010059013 Chaperonin 10 Proteins 0.000 description 3
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 3
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 3
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108050001186 Chaperonin Cpn60 Proteins 0.000 description 2
- 102000052603 Chaperonins Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000239220 Limulus polyphemus Species 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical group C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 229920006227 ethylene-grafted-maleic anhydride Polymers 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 125000003345 AMP group Chemical group 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101001012451 Homo sapiens Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710142009 Protein insensitive Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000006432 protein unfolding Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к созданию нового слитого белка, содержащего полипептид полифемузина I из L Polyphemus и модифицированный шаперон GroEL из микроорганизма T.thermophilys. Новый белок может быть использован в фармацевтической промышленности для получения изолированных стабилизированных белков, биосинтез которых затруднен или невозможен, либо их физико-химические свойства не позволяют выделить и получить синтезированые белки в очищенном и активном виде. Новый белок представляет собой модифицированный безметиониновый белок GroEL, стабильный, не подвергающийся протеолизу, содержащий в кодирующей части между кодонами Ser199 и Tyr201 полилинкер, и слитый с ним в области полилинкера полипептид полифемузина I, высокоэкспрессируемый в клетке-хозяине. 3 ил., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области биохимии, а именно, к получению димера полипептида полифемузина из организма L. polyphemus слитого с модифицированным белком GroEL из микроорганизма Т. thermophilus. Может быть использовано в фармакологической промышленности с целью получения изолированных стабилизированных белков, биосинтез которых затруднен или невозможен, либо их физико-химические свойства не позволяют выделить и получить синтезированные белки в очищенном и активном виде.
Создание слитых белков - распространенный метод, часто использующийся для биосинтетического получения целевых рекомбинантных пептидов и белков. Его суть заключается в создании конструкции, содержащей белок-носитель (например, тиоредоксин, мальтоза-связывающий белок, глютотион-S-трансфераза и многие другие [2, 5, 6, 8]) и целевой белок.
Если есть необходимость получить целевой белок в чистом виде, без белка-носителя, применяют дополнительные стадии обработки полученного конечного белкового конструкта: обработка высокоспецифичными протеазами (например, энтерокиназой человека или TEV-протеазой), либо химическое расщепление, специфичное к определенной аминокислоте (как обработка бромцианом натрия, специфичного к остаткам метионина).
Семейство белков-шаперонов GroEL выглядит привлекательным как белок-носитель для системы слитых белков [1]. Данный шаперон представляет собой большую частицу, состоящую из двух гептамеров. Полость, образованная протомером, вмещает белковый субстрат. GroEL является хорошо изученным шапероном, его структура и функционирование подробно описаны [3, 4]. Обычно одна молекула белкового субстрата связывается с одним протомером GroEL; что касается всей частицы, обычно между двумя протомерами при связывании субстратного белка наблюдается отрицательная кооперативность. Общая полость, образованная внутри гептамера, достаточна для размещения достаточно большого субстратного белка [7, 9]. Кроме того, молекулярные шапероны семейства GroEL являются необходимыми для выживания любого организма, в том числе и микроорганизмов, и присутствуют также у микроорганизмов, адаптированных к экстремальным условиям функционирования, в частности к высоким температурам. GroEL таких микроорганизмов отличается чрезвычайно высокой термостабильностью структуры и функциональностью при повышенных температурах. Термостабильный GroEL может быть использован в качестве белка-носителя в слитых системах с целью упрощения очистки целевых пептидов от внутриклеточных белков.
Присоединение дополнительных аминокислотных последовательностей к N- или С-концу молекулы GroEL, погруженных в белковую глобулу, может повлиять и сильно дестабилизировать третичную и четвертичную структуры. Так, например, некоторые результаты исследований показывают, что размещение 6His-tag дестабилизирует исходную структуру частиц GroEL и что очистка His-tagged GroEL происходит с низкой эффективностью. Анализ кристаллической структуры мономера GroEL с разрешением 2,8 
показывает, что каждая субъединица имеет три домена. В большинстве организмов GroEL имеет сложную четвертичную структуру, состоящую из двух колец по семь мономеров в каждом, и стабилизированную кольцом из семи мономеров кофактора GroES (фиг. 1).
Для успешного использования шаперонов в качестве белков-носителей должны быть разработаны их формы, которые могли бы адекватно функционировать в качестве белков-носителей. Для точечного расщепления белков возможно использованием бромциана натрия, специфичного к остаткам метионина. При наличии метионина между белком-носителем и целевым полипептидом, такая связь гидролизуется бромцианом, что позволяет выделять целевой полипептид. Как правило, в любом белке присутствуют остатки метионина в составе полипептидной цепи, поэтому при наличии в белке-носителе остатков метионина он также будет гидролизоваться бромцианом, давая набор полипептидов, которые будут затруднять выделение целевого продукта. Замена остатков метионина в белке-носителе на другие аминокислотные остатки, позволяет избежать действия на него бромциана натрия, и таким образом упростить процедуру очистки целевых пептидов. В состав полипептидной цепи мономера GroEL входит 6 остатков метионина [6], достаточно равномерно распределенных вдоль полипептидной цепи. Это делает затруднительным использование бромциана натрия, в силу того, что пришлось бы выделять целевой полипептид среди большого числа пептидов, близких по размерам и физико-химическим свойствам. Привлекательным подходом является замена остатков метионина на другие аминокислотные остатки, что делает белок нечувствительным к указанному химическому реагенту. Необходимым условием использования такого подхода, т.е. замены остатков метионина, является сохранение структуры и функциональности белка-носителя, в данном случае частицы GroEL.
Полипептид полифемузин I, выделенный из гемоцитов краба вида L. polyphemus, является одним из наиболее активных пептидов с антимикробной активностью (АМП), применяющихся в качестве антибиотиков. Данный пептид длинной 18 аминокислот стабилен в виде структуры с двумя амфифильными антипаралельными β-структурами, соединенными дисульфидным мостиком (фиг. 2). Он обладает высоким сродством к липосахаридам, и его минимальная ингибирующая концентрация составляет 2 мкг/мл. Предполагается, что свои антибиотические свойства АМП наиболее активно проявляют в олигомерных формах. В связи с этим создание димера полипептида полифемузина представляется перспективным вариантом для увеличения его антибиотической активности.
Задача изобретения состоит в том, чтобы получить модифицированный безметиониновый белок GroEL, стабильный и высокоэкспрессируемый в клетке-хозяине, не подвергающийся протеолизу и содержащий в кодирующей части полилинкер, и слитый с ним в области полилинкера димер полипептида полифемузина.
Технический результат изобретения достигается тем, что на первом этапе работы создается безметиониновый конструкт шаперона GroEL микроорганизма Т. thermophilus, с помощью изменения кодирующей последовательности ДНК GroEL. Все триплеты последовательности ATG, кодирующие остатки метионина в положениях Met164, Met209, Met286, Met314, Met489, Met541, заменяли на последовательности CTG, кодирующие остатки лейцина. Частица GroELS обладает высокой молекулярной массой (более 850 кДа), что технологически упрощает выделение конструкта из клеточного лизата методами гель-фильтрации и ультрафильтрации. Использование шаперона термофильного микроорганизма, кроме того, позволяет проводить первую стадию очистки с помощью тепловой денатурации эндогенных белков мезофильной бактерии.
На втором этапе работы создается конструкт на основе безметиониновой версии шаперона GroEL, с помощью изменения кодирующей последовательности ДНК GroEL - между кодонами по положениям Ser199 и Tyr201 интегрировали полилинкер с последовательностью GGATCCAAGCTTGAATTC. Эта последовательность содержит рестрикционные сайты BamHI, HindIII и EcoRI и соответствует транскрипции Gly-Ser-Lys-Leu-Glu-Phe. Анализ третичной структуры мономера GroEL показывает, что аминокислотные остатки Ser199 и Tyr201 расположены на субстрат-связывающей поверхности апикального домена GroEL, но не входят в состав жестких структур, образующих субстрат-связывающую поверхность. В стабильной частице GroELS аминокислотные остатки Ser199 и Tyr201 находятся на поверхности, обращенной внутрь полости частицы (фиг. 3), что делает возможным последующее использование модифицированного белка в качестве белка-носителя в слитых конструктах с целевым пептидом.
На третьем этапе создается конструкт на основе модифицированной безметиониновой версии шаперона GroEL с интеграцией последовательности димера полифемузина, содержащей между мономерами короткий линкер GGTAGCGGC, в область полилинкера по сайтам BamHI / EcoRI. Последовательность полифемузина была оптимизирована для использования в E.coli. В последовательность димера были введены кодоны для двух остатков Met, непосредственно фланкирующих вставку, чтобы сделать возможным химическое отщепление целевого пептида: ATGCGTCGCTGGTGCTTTCGTGTGTGCTATCGCGGCTTTTGCTATCGTAAATGCCGCGGTAGCGGCCGTCGCTGGTGCTTTCGTGTGTGCTATCGCGGCTTTTGCTATCGTAAATGCCGCATG. Нуклеотидная последовательность димера была получена методом секвенирования. Праймеры для клонирования были сконструированы таким образом, что полученная опследовательность димера имел готовые липкие концы для клонирования по сайтам BamHI / EcoRI полилинкера, введенного в ген GroEL.
Полученный слитый белок после всех проведенных этапов не должен изменять нативную конформацию, должен оставаться стабильным и хорошо растворимым.
Существенными признаками, характеризующими изобретение, в отличие от исходной версии белка, является использование модифицированной термостабильной, безметиониновой версии шаперона GroEL микроорганизма Т. thermophilus. с наличием полилинкера; и использование в качестве целевого пептида - димера полифемузина. Экспрессия конечного слитого белка была высокоэкспрессивной, не подверженной протеолизу, с нейтрализацией любой пептидной цитотоксичности.
Предложенный способ поясняется следующими материалами:
В качестве первого шага все кодоны, кодирующие остатки метионина, были заменены теми, которые кодируют остатки лейцина. GroEL из Т. thermophilus (RefSeq assembly: GCF_000091545.1; GenBank: AP008226.1) имеет шесть остатков Met в своей последовательности в положениях Met164, Met209, Met286, Met314, Met489, Met541 (инициаторный Met отщепляется во время полипептидного синтеза, как это происходит почти для всех белков); ген, кодирующий GroEL, со всеми кодонами ATG, кодирующими Met, замененными на кодоны CTG, кодирующие Leu, получали методом ПЦР пар праймеров SeqID №1-10.
Реакцию проводили в следующих условиях: Pfu-буфер 1×(20mM Tris-HCl рН=8.8; 10mM (NH4)SO4, 10mM KCl, 0.1% Triton Х-100 v/v, 0.1mg/ml BSA), 1.2u Pfu-полимеразы, 10пкмоль каждого праймера, по следующей схеме ПЦР: 94° 3 минуты, 40 циклов (94° 40 сек, 60° 40 сек, 72° 2 минуты), 72° 3 минуты.
Комбинационную ПЦР проводили со праймерами SeqID№11-12. Реакцию проводили в следующих условиях: Pfu-буфер 1×(20mM Tris-HCl рН=8.8; 10mM (NH4)SO4, 10mM KCl, 0.1% Triton Х-100 v/v, 0.1mg/ml BSA), 1.2u Pfu-полимеразы, 10пкмоль каждого праймера, по следующей схеме ПЦР: 94° 3 минуты, 40 циклов (94° 40 сек, 60° 40 сек, 72° 2 минуты), 72° 3 минуты. Схема метода представлена на фиг. 3. В результате получали ген безметионинового варианта GroEL, заканчивающийся стоп-кодоном ТАА и фланкированный рестрикционными сайтами NdeI и BglII.
На втором шаге проводили введение полилинкера в конструкцию гена GroEL. Небольшой полилинкер, содержащий BamHI, HindIII и EcoRI, вводили для клонирования в ген между триплетами, кодирующими аминокислоты Ser199 и Tyr201. На первой стадии два сегмента желаемой генной конструкции отдельно амплифицировали с использованием в качестве матрицы не содержащей метионина последовательности GroEL. Первый фрагмент амплифицировали с использованием праймеров SeqID№15-16, второй с использованием праймеров SeqID№17-18. Реакции проводили в следующих условиях: Pfu buffer 1×(20mM Tris-HCl рН=8.8; 10mM (NH4)SO4, 10mM KCl, 0.1% Triton X-100 v/v, 0.1mg/ml BSA), 1.2u Pfu-polymerase, 10pmol each primers, по следующей схеме ПЦР: 94° 3 минуты, 40 циклов (94° 40 сек, 60° 40 сек, 72° 2 минуты), 72° 3 минуты.
Фрагменты очищали методом агарозного гель-электрофореза в 1% агарозном геле в 1× буфере ТБЕ, очищали фрагмент с помощью набора для очистки ДНК из геля «QIAEX II Gel Extraction Kit».
Комбинационная амплификация с использованием очищенных фрагментов, полученных на предыдущей стадии, в виде матриц и двух праймеров SeqID№15 и SeqID№18, продуцировала нуклеотидную последовательность гена, кодирующую GroEL с полилинкером. Реакцию проводили в следующих условиях: Pfu buffer 1×(20mM Tris-HCl pH=8.8; 10mM (NH4)SO4, 10mM KCl, 0.1% Triton X-100 v/v, 0.1mg/ml BSA), 1.2u Pfu-polymerase, 10pmol each primers, по следующей схеме ПЦР: 94° 3 минуты, 40 циклов (94° 40 сек, 60° 40 сек, 72° 2 минуты), 72° 3 минуты.
Фрагмент очищали методом агарозного гель-электрофореза в 1% агарозном геле в 1× буфере ТБЕ с помощью набора для очистки ДНК из геля «QIAEX II Gel Extraction Kit».
Далее клонировали полученный фрагмент GroEL с интегрированным целевым полилинкером в полилинкер экспрессирующего бицистронного вектора pETDuet™-1 Novagen, Merck Millipore вместе с геном, кодирующим Т. thermophilus GroES. Лигирование проводили в следующих условиях: Ligation buffer 1×(40mM Tris-HCl pH=7.9, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 0.5mM ATP), 20нг плазмиды, 1:5 молярном соотношении вектор-вставка, 2ед.а. лигазы по Вейсу. Лигирование проводили при 22° в течение 1 часа, что дает экспрессирующий вектор ploop/ES.
На третьей стадии последовательность димера полифемузина с линкером между двумя мономерами была оптимизирована для использования в E.coli, и в нее были введены кодоны для двух остатков Met, непосредственно фланкирующих вставку, чтобы сделать возможным химическое отщепление целевого пептида: ATGCGTCGCTGGTGCTTTCGTGTGTGCTATCGCGGCTTTTGCTATCGTAAATGCCGCGGTAGCGGCCGTCGCTGGTGCTTTCGTGTGTGCTATCGCGGCTTTTGCTATCGTAAATGCCGCATG. Нуклеотидная последовательность димера была получена методом секвенирования.
Данная нуклеотидная подследовательность, кодирующая димер полипептида полифемузина, была клонирована в полученную плазмиду ploop/ES в область полилинкера по сайтам BamHI / EcoRI. Гибридизация проводилась при 94°С с использованием двух олигонуклеотидов: Di-phemu-for: 5'GATCCATGCGTCGCTGGTGCTTTCGTGTGTGCTATCGCGGCTTTTGCTATCGTAAATGCCGCGGTAGCGGCCGTCGCTGGTGCTTTCGTGTGTGCTAT CGCGGCTTTTGCTATCGTAAATGCCGCATGG3' и Di-phemu-rev: 5'AATTCCATGCGGCATTTACGATAGCAAAAGCCGCGATAGCACACACGAAAGCACCAGCGACGGCCGCTACCGCGGCATTTACGATAGCAAAAGCC GCGATAGCACACACGAAAGCACCAGCGACGCATG3'. Праймеры были сконструированы таким образом, что полученный димер полифемузина имел готовые липкие концы для клонирования по сайтам BamHI / EcoRI полилинкера, введенного в ген GroEL. Бицистронный векторный конструкт был расщеплен рестрикционными ферментами BamHI и EcoRI, и в него клонирован полученный фрагмент димера полифемузина по сайтам BamHI / EcoRI. Рестрикцию вектора ploop/ES проводили в следующих условиях: 1× буфер для BamHI и EcoRI (50mM Tris-HCl рН=7.5, 10mM MgCl2, 100mM NaCl, 0.1 mg/ml BSA), по 5 ед.а. каждого фермента BamHI и EcoRI, 50нг ДНК. Рестрикцию проводили при 37° в течение 16 часов. Лигирование полученного линейного вектора ploop/ES и последовательности димера полифемузина проводили в следующих условиях: Ligation buffer 1×(40mM Tris-HCl pH=7.9, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 0.5mM ATP), 20нг плазмиды, 1:5 молярном соотношении вектор-вставка, 2ед.а. лигазы по Вейсу. Лигирование проводили при 22° в течение 1 часа.
Все результаты процедур клонирования были подтверждены секвенированием.
Экспрессия генов в экспрессионном штамме E.coli pLysE осуществлялась в среде LB, при 37°С в течение 3 часов; селективный агент - ампициллин 200 мкг / мл (фиг. 4).
Для очистки целевого белка проводили лизис с помощью френчпресса в буфере PBS(0.137M NaCl, 0.0027М KCl, 0.01М Na2HPO4, 0.0018M KH2PO4) при 4°. Далее разбавляли в 5 раз буфером PBS с последующим прогреванием клеточного лизата при 62°С в течение 5 мин на водяной бане, и далее центрифугировали при 13000g в течение 15 мин (фиг. 5).
Очистку в обращенных фазах проводили на колонке Symmetry300 С4 (3,9 × 150 мм, 5 мкм, Waters) в системе вода / ацетонитрил в присутствии 0,1% TFA. Белки элюировались в градиенте ацетонитрила. Фракции, содержащие GroEL с димером полифемузина лиофилизировали перед обработкой CNBr.
Реакцию химического расщепления проводили в течение ночи при комнатной температуре в 70% муравьиной кислоте в воде, концентрация CNBr составляла 50 мг / мл. Реакцию терминировали путем замораживания при -70°С; образцы лиофилизировали и повторно растворяли в подходящих растворах для хроматографии в обращенных фазах на колонке С18 или для электрофореза.
Отделение димера полифемузина проводили на колонке Symmetry 300 С18 (4,6 × 150 мм, 5 мкм, Waters), градиент ацетонитрила от 0 до 60% (в присутствии 0,1% TFA) в течение 30 мин, скорость потока 1 мл / мин. Фракции, содержащие димер, лиофилизировали перед использованием для масс-спектрометрии и теста на антибактериальную активность.
Гель-фильтрационную хроматографию для определения размера комплекса GroELS проводили на колонке Tricorn 10/300, заполненной Sephacryl S-400, в PBS, скорость потока составляла 1 мл / мин. Колонку калибровали с помощью набора для калибровки гель-фильтрационных колонок HMW (GE Healthcare). Голубой декстран (около 2000 кДа, исключенный объем), который по размеру соответствует нашим ожиданиям 14-mer GroELS, элюируется через 16 минут, BSA (MW 67 кДа, соответствует мономеру GroEL) в 19,5 мин, а соли через 22 мин.
Лиофилизированный димер полифемузина повторно растворяли в PBS в разных концентрациях. Концентрацию измеряли по оптической плотности при 280 нм. Клетки МС1061 (не экспрессионный штамм E.coli) выращивали при 37°С до OD600 0,4, затем разбавляли до 106 клеток / мл в среде LB и добавляли различные количества полифемузина. Затем клетки выращивали в течение ночи при 37°С и устанавливали минимальную концентрацию полифемузина, которая полностью ингибировала рост клеток.
Пример 1 - получение высокоэкспрессируемого в клетке-хозяине модифицированного безметионинового белка GroEL, не подвергающегося протеолизу и содержащего в кодирующей части полилинкер, и слитый с ним в области полилинкера белок полифемузин.
Стадия 1
Получение безметионинового белка GroEL.
Провести ПЦР с использованием пар праймеров SeqID№l-10 в следующих условиях: Pfu-буфер 1×(20mM Tris-HCl рН=8.8; 10mM (NH4)SO4, 10mM KCl, 0.1% Triton Х-100 v/v, 0.1mg/ml BSA), 1.2u Pfu-полимеразы, 10пкмоль каждого праймера, 10нг геномной ДНК Т. thermophilus по следующей схеме ПЦР: 94° 3 минуты, 40 циклов (94° 40 сек, 60° 40 сек, 72° 2 минуты), 72° 3 минуты.
Провести комбинационную ПЦР с праймерами SeqID№11-12 в следующих условиях: Pfu-буфер 1x(20mM Tris-HCl рН=8.8; 10тМ (NH4)SO4, 10mM KCl, 0.1% Triton Х-100 v/v, 0.1mg/ml BSA), 1.2u Pfu-полимеразы, 10пкмоль каждого праймера, по следующей схеме ПЦР: 94° 3 минуты, 40 циклов (94° 40 сек, 60° 40 сек, 72° 2 минуты), 72° 3 минуты.
Фрагмент очистить методом агарозного гель-электрофореза в 1% агарозном геле в 1× буфере ТБЕ с помощью набора для очистки ДНК из геля «QIAEX II Gel Extraction Kit».
Стадия 2
Клонирование полилинкера внутрь последовательности безметионинового белка GroEL.
Отдельно амплифицировать с использованием в качестве матрицы ДНК полученный фрагмент с использованием двух пар праймеров: SeqID№15-16 и SeqID№17-18. Реакцию провести в следующих условиях: Pfu buffer 1×(20mM Tris-HCl рН=8.8; 10mM (NH4)SO4, 10mM KCl, 0.1% Triton X-100 v/v, 0.1mg/ml BSA), 1.2u Pfu-polymerase, 10pmol each primers, по следующей схеме ПЦР: 94° 3 минуты, 40 циклов (94° 40 сек, 60° 40 сек, 72° 2 минуты), 72° 3 минуты.
Фрагменты очистить методом агарозного гель-электрофореза в 1% агарозном геле в 1× буфере ТБЕ с помощью набора для очистки ДНК из геля «QIAEX II Gel Extraction Kit».
Провести комбинационная амплификацию с использованием очищенных фрагментов, полученных на предыдущей стадии, в виде матриц и двух праймеров SeqID№15 и SeqID№18 в следующих условиях: Pfu buffer 1×(20mM Tris-HCl рН=8.8; 10mM (NH4)SO4, 10mM KCl, 0.1% TritonX-100 v/v, 0.1mg/ml BSA), 1.2u Pfu-polymerase, 10pmol each primers, по следующей схеме ПЦР: 94° 3 минуты, 40 циклов (94° 40 сек, 60° 40 сек, 72° 2 минуты), 72° 3 минуты.
Фрагмент очистить методом агарозного гель-электрофореза в 1% агарозном геле в 1× буфере ТБЕ с помощью набора для очистки ДНК из геля «QIAEX II Gel Extraction Kit».
Стадия 3
Клонирование безметионинового белка GroEL с целевым полилинкером в бицистронный вектор pETDuet™-1 Novagen, Merck Millipore.
Клонировать фрагмент GroEL с интегрированным целевым полилинкером, полученным на стадии 2, в полилинкер экспрессирующего бицистронного вектора pETDuet™-1 Novagen, Merck Millipore вместе с геном, кодирующим Т. thermophilus GroES. Лигирование проводить в следующих условиях: Ligation buffer 1×(40mM Tris-HCl pH=7.9, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 0.5mM ATP), 20нг плазмиды, 1:5 молярном соотношении вектор-вставка, 2ед.а. лигазы по Вейсу. Лигирование проводить при 22° в течение 1 часа.
Стадия 4
Клонирование димера полифемузина в вектор pETDuet™-1 Novagen, Merck Millipore, содержащий фрагмент GroEL с интегрированным целевым полилинкером, по сайтам BamHI и EcoRI, находящимся в целевом полилинкере.
Рестрикцию вектора провести в следующих условиях: 1× буфер для BamHI и EcoRI (50mM Tris-HCl рН=7.5, 10mM MgCl2, 100mM NaCl, 0.1 mg/ml BSA), по 5 ед.а. каждого фермента BamHI и EcoRI, 50нг ДНК, при 37° в течение 16 часов.
Лигирование полученного линейного вектора и последовательности димера полифемузина провести в следующих условиях: Ligation buffer 1×(40mM Tris-HCl pH=7.9, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 0.5mM ATP), 20нг плазмиды, 1:5 молярном соотношении вектор-вставка, 2ед.а. лигазы по Вейсу, при 22° в течение 1 часа.
Стадия 5
Получение клеток-продуцентов, синтезирующих целевой слитый белок.
Химически компетентные клетки штамма E.coli pLysE в объеме 50 мкл разморозить на льду, затем добавить 5 мкл лигазной смеси, полученной на стадии 7, и инкубировать 30 минут на льду. Затем провести термический шок при 42°в течение 30 сек с последующим инкубированием на льду в течение 5 минут. Далее к трансформантам добавить 1 мл среды SOC, предварительно нагретой до 37°, и инкубировать в течение 1 часа при постоянном покачивании в термостате-качалке. Далее 20 мкл проинкубированной смеси рассеить на чашки с твердой питательной средой LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Выращивать колонии в течение ночи при 37°. Далее провести аналитическую экспрессию по индивидуальным клонам, с индуктором 0.4 мМ ИПТГ.
Пример 2 - обработка бромцианом и получение целевого белка - димера полифемузина
Стадия 1
Осадить клетки центрифугированием в течение 15 минут при 4000 g. К осадку клеток добавить летучий буфер (10мМ ацетат аммония рН 7,5). Лизировать клетки ультразвуком (мощность 20%, 6 раз по 10 сек с перерывом 20 сек), полученный раствор центрифугировать 15 мин при 4° и 15000g.
Стадия 2.
Супернатант после стадии 1 подвергнуть ультрафильтрации. Собрать с фильтра целевой белок (задержится благодаря большой молекулярной массе). Полученный раствор высушить до состояния порошка с использованием лиофильной сушилки.
Стадия 3.
К сухому осадку добавить 700 мкл муравьиной кислоты, затем 50 мг CNBr и 300 мкл воды, проводить реакцию в течение 8 ч в фольге при комнатной температуре. Для остановки реакции заморозить пробу при -70°. После заморозки лиофилизировать с использованием лиофильной сушилки.
Стадия 4.
Для идентификации белка провести масс-спектрометрию полученного сухого осадка.
Пример 3 - установка минимальной ингибирующей концентрации
Стадия 1
Нарастить жидкую культуры клеток E.coli неэкспрессионного штамма МС1061 в 1 л питательной среды LB при 37°С до OD600 0,4. Рассчитать количество клеток по оптической плотность, развести до концентрации 1*106 клеток в 1 мл, разлить в пробирки по 1 мл полученной культуры.
Стадия 2
Приготовить последовательные двукратные разведения димера полифемузина со следующими конечными концентрациями (мкг на мл культуральной жидкости, содержащей 1*106 клеток): 40 мкг/мл, 20 мкг/мл, 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 1,25 мкг/мл, 0,6 мкг/мл, 0,3 мкг/мл. Внести в пробирки с культуральной жидкостью образец разведения в соответствующей концентрации (по три повтора на каждое разведение), для контроля реакции в три пробирки с культуральной жидкостью не вносить ничего.
Стадия 3
Инкубировать полученные образцы в течение ночи при 37°. Провести оценку наименьшей концентрации, при которой не наблюдался рост микроорганизмов (минимальная ингибирующая концентрация).
1. Alexey N. Fedorov*, and Maria S. Yurkova Molecular Chaperone GroEL - toward a Nano Toolkit in Protein Engineering, Production and Pharmacy // NanoWorld Journal. 2018. №1 (4). C. 8-15.
2. Bell M.R. [и др.]. To fuse or not to fuse: what is your purpose? // Protein Science: A Publication of the Protein Society. 2013. №11 (22). C. 1466-1477.
3. Horwich A.L. [и др.]. Two families of chaperonin: physiology and mechanism // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2007. (23). С. 115-145.
4. Horwich A.L., Fair G.W., Fenton W.A. GroEL-GroES-mediated protein folding // Chemical Reviews. 2006. №5 (106). C. 1917-1930.
5. Kapust R.B., Waugh D.S. Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused // Protein Science: A Publication of the Protein Society. 1999. №8 (8). C. 1668-1674.
6. Riggs P., La Vallie E.R., McCoy J.M. Introduction to expression by fusion protein vectors // Current Protocols in Molecular Biology / Edited by Frederick M. Ausubel … [et Al.]. 2001. (Chapter 16). C. Unit 16.4A.
7. Saibil H. Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation//Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2013. №10 (14). C. 630-642.
8. Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems // Applied Microbiology and Biotechnology. 2003. №5 (60). C. 523-533.
9. Thirumalai D., Lorimer G.H. Chaperonin-mediated protein folding // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 2001. (30). C. 245-269.
Claims (1)
- Слитый белок для биосинтеза изолированного стабилизированного белка, содержащий модифицированный безметиониновый белок GroEL, имеющий в кодирующей части полилинкер и слитый с ним в области полилинкера димер полипептида полифемузина I, имеющего 39 аминокислот, в котором два полипептида полифемузина I, имеющего 18 аминокислот следующей последовательности RRWCFRVCYRGFCYRKCR, связаны линкером GSG, высокоэкспресируемый в клетке-хозяине.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019143623A RU2760578C2 (ru) | 2019-12-25 | 2019-12-25 | Слитый белок, содержащий модифицированный безметиониновый белок GroEL и димер полипептида полифемузина I |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019143623A RU2760578C2 (ru) | 2019-12-25 | 2019-12-25 | Слитый белок, содержащий модифицированный безметиониновый белок GroEL и димер полипептида полифемузина I |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019143623A3 RU2019143623A3 (ru) | 2021-06-25 |
| RU2019143623A RU2019143623A (ru) | 2021-06-25 |
| RU2760578C2 true RU2760578C2 (ru) | 2021-11-29 |
Family
ID=76504450
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019143623A RU2760578C2 (ru) | 2019-12-25 | 2019-12-25 | Слитый белок, содержащий модифицированный безметиониновый белок GroEL и димер полипептида полифемузина I |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2760578C2 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2506275C2 (ru) * | 2007-11-01 | 2014-02-10 | Астеллас Фарма Инк. | Иммуносупрессорные полипептиды и нуклеиновые кислоты |
-
2019
- 2019-12-25 RU RU2019143623A patent/RU2760578C2/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2506275C2 (ru) * | 2007-11-01 | 2014-02-10 | Астеллас Фарма Инк. | Иммуносупрессорные полипептиды и нуклеиновые кислоты |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Alexey N. Fedorov* and al, Molecular Chaperone GroEL - toward a Nano Toolkit in Protein Engineering, Production and Pharmacy // NanoWorld Journal. 2018. N1 (4). C. 8-15. * |
| RIGGS P., et al, Introduction to expression by fusion protein vectors, Current Protocols in Molecular Biology, 2001. (Chapter 16). C. Unit 16.4A. * |
| RIGGS P., et al, Introduction to expression by fusion protein vectors, Current Protocols in Molecular Biology, 2001. (Chapter 16). C. Unit 16.4A. Alexey N. Fedorov* and al, Molecular Chaperone GroEL - toward a Nano Toolkit in Protein Engineering, Production and Pharmacy // NanoWorld Journal. 2018. N1 (4). C. 8-15. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2019143623A3 (ru) | 2021-06-25 |
| RU2019143623A (ru) | 2021-06-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102481388B1 (ko) | 내열성의 역전사 효소 돌연변이체 | |
| JP4871960B2 (ja) | 優れたシャペロン活性およびフォールディング活性を有するキメラ融合タンパク質 | |
| Garinot-Schneider et al. | Identification of putative active-site residues in the DNase domain of colicin E9 by random mutagenesis | |
| Ozaki et al. | UncI protein can mediate ring-assembly of c-subunits of FoF1-ATP synthase in vitro | |
| CA2376062A1 (en) | Fusion proteins comprising a fragment of a chaperon polypeptide | |
| King et al. | A conserved zinc binding domain in the largest subunit of DNA-dependent RNA polymerase modulates intrinsic transcription termination and antitermination but does not stabilize the elongation complex | |
| US6664386B1 (en) | System for efficient secretion of recombinant proteins | |
| RU2760578C2 (ru) | Слитый белок, содержащий модифицированный безметиониновый белок GroEL и димер полипептида полифемузина I | |
| Siebold et al. | Intein-mediated cyclization of a soluble and a membrane protein in vivo: function and stability | |
| US11697809B2 (en) | Biological synthesis of amino acid chains for preparation of peptides and proteins | |
| Greimann et al. | Reconstitution of RNA exosomes from human and Saccharomyces cerevisiae: cloning, expression, purification, and activity assays | |
| Maier et al. | Mixed reconstitution of mutated subunits of HIV‐1 reverse transcriptase coexpressed in Escherichia coli–two tags tie it up | |
| Minuth et al. | The recombinant thermosome from the hyperthermophilic archaeon Methanopyrus kandleri: in vitro analysis of its chaperone activity | |
| US9139619B2 (en) | Fusion protein containing a single-stranded DNA binding protein and methods for expression and purification of the same | |
| RU2731895C2 (ru) | Белок GroEL микроорганизма Thermus thermophilus с измененной аминокислотной последовательностью | |
| WO2002066669A1 (en) | Method for purification of soluble ssao | |
| US7879578B2 (en) | Self-assembled proteins and related methods and protein structures | |
| RU2740715C2 (ru) | Модифицированный белок GroEL микроорганизма Thermus thermophilus | |
| Borra et al. | Protein chemical modification inside living cells using split inteins | |
| EP4079845A1 (en) | Method for enhancing water solubility of target protein by whep domain fusion | |
| JP4252299B2 (ja) | 新規ジスルフィド酸化還元酵素、および、該酵素を用いたタンパク質の活性化方法 | |
| RU2604796C1 (ru) | СИСТЕМА ЭКСПРЕССИИ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В Escherichia coli С ЕЁ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ | |
| Venkatesh et al. | GroEL chaperone binding to beetle luciferases and the implications for refolding when co-expressed | |
| Sannikova et al. | Properties and Biotechnological Application of Mutant Derivatives of the Mini-Intein PRP8 from Penicillium chrysogenu m with Improved Control of C-Terminal Processing | |
| Miozzi | Column-free Purification Method for Recombinant Proteins Using a Self-Cleaving Aggregating tag |