CN1295580A

CN1295580A - 制造鼠和人内源性血管生成抑制因子的方法

Info

Publication number: CN1295580A
Application number: CN99804642A
Authority: CN
Inventors: E·I·哈丁; B·N·维奥兰德
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1998-02-23
Filing date: 1999-02-19
Publication date: 2001-05-16
Also published as: CA2321958A1; KR20010034529A; US6653098B1; CZ20003058A3; IL137995A0; WO1999042486A1; RU2225728C2; NO20004170D0; AU766154B2; AU3294599A; NO20004170L; NZ506466A; PL342495A1; BR9908186A; EP1056780A1; JP2002504494A; AU766154C

Abstract

本发明公开了制造鼠和人内源性血管生成抑制因子的方法。也公开了从细菌内表达的包涵体中和编码全长和截断形式内源性血管生成抑制因子的核酸中再折叠和纯化内源性血管生成抑制因子的方法。

Description

制造鼠和人内源性血管生成抑制因子的方法

优先权

根据美国法典35条第119节，本申请要求以1998年2月23日提交的，申请号为60/075,587的专利申请为优先权。

发明领域

本发明公开了制造鼠和人内源性血管生成抑制因子(endostatin)的方法。本发明也公开了从细菌内表达的包涵体中和编码全长和截断形式内源性血管生成抑制因子的核酸中再折叠和纯化内源性血管生成抑制因子的方法。

发明背景血管生成

血管生成，即新血管的生长，在癌生长和转移中起重要作用。在人类，肿瘤中血管床的程度与多种癌症病人的预后相关(Folkman,J.,Seminars in Medicine of the Beth Israel Hospital,Boston 333(26)：1757-1763,1995；Gasparini,G.,European Journal of Cancer 32A(14)：2485-2493,1996；Pluda,J,M.,Seminars in Oncology 24(2)：203-218,1997；Norrby,K.,APMIS 105：417-437,1997)。在正常成人，血管生成被限制在良好控制状态，如在伤口愈合和女性生殖系统(Battegay,E.J.,J Mol Med73：-333-346,1995；Dvorak,H.F,New Engl J Med,315：1650-1659,1986)。

动物研究提示，肿瘤可以休眠状态存在，此时肿瘤生长被高速增殖和高速凋亡之间的平衡限制(Holmgren,L.等.,Nat.Med.(N.Y.)1(2)：149-153,1995；Hanahan，D.等.,Cell 86(3)：353-364,1996)。血管生成表现型的转变使肿瘤细胞脱离休眠而快速生长，估计是肿瘤细胞凋亡速度下降的结果(Bouk,Cancer Cells,2(6)：179-185,1990；Dameron等,Cold Spring Harb Symp Quant Biol,59：483-489,1994)。控制血管生成被认为是促进新血管形成的因子和抑制新血管床形成的抗血管生成因子之间的平衡(Bouck,N.等.,Advances in Cancer Research 69：135-173,1996；O′Reilly等.,Cell 79(2)：315-328,1994)。

多种血管生成前因子以被确定，包括碱性和酸性成纤维细胞生长因子(bFGF和aFGF)和血管通透性因子/血管内皮生长因子(VPF/VEGF)(Potgens,A.J.G.等.,Biol.Chem.Hoppe-Seyler 376：57-70,1995；Ferrara,N.,European Journal of Cancer 32A(14)：2413-2442,1996；Bikfalvi,A.等.,Endocdne Reviews 18：26-45,1997)。数种内源性抗血管生成因子也被确定，包括血管生成抑素(angiostatin)(O′Reilly等.,Cell79(2)：315-328,1994)、内源性血管生成抑制因子(O′Reilly等.,Cell88(2)：277-285,1997)、干扰素α(Ezekowitz等,N.Engl.J.Med.,5月28日,326(22)1456-1463,1992)、凝血栓蛋白(Good等,Proc Natl Acad SciUSA 87(17)：6624-6628,1990；Tolsma等.,J Cell Biol 122(2)：497-511,1993)，和血小板因子4(PF4)(Maione等,Science 247(4938)：77-79,1990)。

许多血管生成抑制剂正在临床研制中(见Shawver等，DrugDiscovery Today 2(2)：50-63,1997,和其中的参考文献)。多肽类如干扰素α和血小板因子4正在临床试验中。血管生成抑素、可溶性Flt-1受体和杀菌的/增加通透性的蛋白衍生物23正在临床前研究中。单克隆抗体如人源化的抗a_vb₃抗体(LM609)、抗VEGF和抗Flk-1单抗(DC101)也在临床前研究中。Tecogalan(DS4152)，一个硫酸盐化的多聚糖-肽聚糖复合物在临床试验中，bFGF碳水化合物抑制剂(GM1474)和bFGF的糖受体模拟抑制剂(GL14.2)在临床前研究中。抗体AGM1470(TNP470)，一个烟曲霉菌类似物和苏拉明，一个多聚阴离子化合物在临床试验中。小分子抑制剂如尿激酶受体拮抗剂、磷脂酸抑制剂、Flk-1抑制剂和VEGF-Fl1结合抑制剂均在临床前研究中。反应停及其类似物，和基质金属蛋白酶抑制剂如Batimastat/Marimastat，在临床试验中。寡核苷酸如作用于VEGF受体的核糖酶和VEGF反义寡核苷酸也在临床前试验中。

抗血管生成治疗癌症可较传统化疗提供一些益处。在临床前试验中抗血管生成治疗毒性低，且未发现形成耐药(Folkman,J.,Seminars inMedicine of the Beth Israel Hospital,Boston 333(26)：1757-1763,1995)。由于血管生成是一个复杂的过程，由许多步骤组成包括内皮细胞的侵入、增殖和迁移，因而可预期结合性治疗可能是最有效的。事实上，化疗和抗血管生成治疗结合已经在临床前模型中显示了有希望的结果(Teicher,B.A.等,Breast Cancer Research and Treatment 36：227-236,1995；Teicher,B.A.等,European Journal of Cancer 32A(14)：2461-2466,1996)。内源性血管生成抑制因子

内源性血管生成抑制因子是从α1型ⅩⅧ胶原的C末端片断衍生来的20kDa蛋白。从血管内皮瘤细胞系(EOMA)中得到的条件的细胞培养基显示，含有一种在体外抑制内皮细胞增殖的因子(O′Reilly等，Cell 88：277-285,1997)。对此抑制作用起作用的因子被称为内源性血管生成抑制因子。杆状病毒感染的昆虫细胞中表达的此蛋白的重组形式抑制Lewis肺癌模型中转移灶的生长，大肠杆菌衍生的此蛋白的一种不溶形式在数种肿瘤模型中显示有效地防止原发肿瘤的生长(O′Reilly等,Cell 88：277-285,1997；Boehm等,Nature 390：404-410,1997)。内源性血管生成抑制因子的纯化和再折叠

尽管在过去的二十年里已经形成了许多类型表达系统，细菌系统，特别是以大肠杆菌为基础者广泛用于以工业规模生产蛋白。这些载体允许高水平表达的、具有在高细胞密度下进行发酵的能力以及低成本，有助于广泛发展和应用大肠杆菌为基础的表达系统。然而，一个突出的问题是大肠杆菌有形成含有所需重组蛋白包涵体的倾向。包涵体的形成有必要附加下游步骤，如在回收生物活性蛋白前的体外再折叠。形成不溶性聚合体的倾向看起来与诸如大小、疏水性、亚单位结构或融合区的应用等因素无关(Kane J.F.和Harley,D.L.,Tibtech 6：95,1988)。包涵体的形成看起来是由下述因素决定的，蛋白合成、折叠、聚合和蛋白水解降解的速度，折叠中间体和天然蛋白的溶解性和热动力学，以及它们与伴随蛋白间的相互作用(Rainer Rudolph,见蛋白工程：原理和实践，Jeffrey L.Cleland和Charles S.Craik编辑，p 283-298,Wiley-Liss,Inc.,纽约，纽约，1996)。

包涵体通常在高水平表达重组蛋白的细胞浆内形成。当用相差显微镜观察时，它们折射光，因此有时被称为折射体。包涵体以相对高的特殊密度为特征，能够通过离心从溶解的细胞中沉淀出来。包涵体的形成可保护重组蛋白不被蛋白水解，因为它们在生理溶剂条件下不易分解。高浓度变性剂如6M盐酸胍或6-8M尿素，通常用于溶解包涵体中的蛋白。各种包涵体溶解方法已进行了比较(Fisher,B.,Summer,L.和Goodenough,P.Biotechnol.Bioeng.1：3-13,1992)。

尽管所需的外源基因产物是包涵体的主要成分，这样的制剂中也富含其它宿主细胞蛋白，如小的热休克蛋白、外膜蛋白、延伸因子EF-Tu和RNA聚合酶(Allen,S.P.,Polazzi,J.O.,Gierse,J.K.和Easton,A.M.,J.Bacteriol.174：6938-6947,1992；Hart,R.A.,Rinas,U.和Bailey,J.E.,J.Biol.Chem.265：12728-12733,1990；Hartley,D.L.,和Kane,J.F.,Biochem.Soc.Trans.16：101,1988)。

世界专利申请WO 97/15666讲述了从大肠杆菌和杆状病毒感染的昆虫细胞中表达、纯化和定性内源性血管生成抑制因子的方法。细菌来源的内源性血管生成抑制因子没有再折叠成其天然状态，但以不溶解的悬液形式用于大多数研究中。本公告还讲述了从鼠血管内皮瘤细胞系EOMA的条件培养基中纯化天然内源性血管生成抑制因子的方法。内源性血管生成抑制因子通过经典的提纯方法从此条件培养基中纯化。

在再折叠内源性血管生成抑制因子方面没有成功经验的记录(O′Reilly等，Cell 88：277-285,1997)。这些作者定性的大肠杆菌来源的重组内源性血管生成抑制因子在用PBS透析后沉淀。这些沉淀(非再折叠的)物质不能在体外检测，因为其在培养基中的不溶解性。一小部分(未指明的)物质在透析过程中自发地在PBS中溶解。此物质在内皮细胞活性的抑制作用上与天然和杆状病毒来源的可溶性内源性血管生成抑制因子是相同的。当大肠杆菌来源的重组内源性血管生成抑制因子用0.1M磷酸钠，pH 7.5、150mM NaCl、0.6M尿素、2mM还原谷胱甘肽、0.02mM氧化谷胱甘肽和终浓度为0.1mg/ml的0.5M精氨酸再折叠时，超过99％的蛋白丢失了。这种大量丢失妨碍了此物质用于体内试验。取而代之，作者们采用非特征性的不溶解(非再折叠)形式的内源性血管生成抑制因子进行大多数体内研究。在雏鸡绒膜尿囊膜(CAM)试验中观察到，大肠杆菌来源的内源性血管生成抑制因子沉淀在5天时间内逐渐溶解并产生持续的抗血管生成作用。同样物质的悬液在小鼠的注射部位形成硬结并在24-48小时内缓慢再吸收。

同一组随后的研究表明，带有肺癌、T241纤维肉瘤或B16F10黑色素瘤的小鼠用鼠内源性血管生成抑制因子治疗时未形成耐药(Boehm，T.,等,Nature 390：404-407,1997)。大肠杆菌来源的重组鼠内源性血管生成抑制因子除用8M尿素、10mMβ巯基乙醇和10mM、pH8.0沉淀和再悬浮细菌，并孵育1～2小时外，制备方法同前所述(O′Reilly等，Cell 88：277-285,1997)。β巯基乙醇在随后的步骤中去除。重组鼠内源性血管生成抑制因子以PBS悬液的形式给予小鼠。带有三型肿瘤之一的小鼠在远离肿瘤接种部位的背部皮下注射纯化的但溶解性很差的内源性血管生成抑制因子悬液。当肿瘤逆转时停止治疗，然后让其再生长。当治疗结束时，肿瘤生长分别在6、4或2个内源性血管生成抑制因子治疗周期后不再发生。

最近，循环形式的人内源性血管生成抑制因子被分离和定性(Standker等，FEBS Letters 420：129-133,1997)。从慢性肾功能不全病人的2500升血液超滤物(血液过滤物，HF)中分离出来了高分子量肽(1-20kDa)。提取物结合到预备的阳离子柱上，并用pH梯度分馏法(pH从3.6升高到9.0的7份缓冲液)洗脱出来。高分子量肽在用水洗脱出的第8梯度中测到，随后用逆转相高压液相纯化。等份样品经过基质辅助的激光解吸电离质谱分析(MALDI-MS)，其实际分子量通过电喷质谱分析法(ES-MS)测定为18,494Da。发现分子内的1-3和2-4半胱氨酸残端通过二硫桥键连接。纯化中最终回收估计在20％范围内，使得血液过滤物中的浓度＞10^-11M。病人血浆中得到的内源性血管生成抑制因子浓度估计在10^-10M范围内或更高。不知是否如血管生成抑肽那样存在组织结合的内源性血管生成抑制因子库(Kost等,Eur J.Bioehem.236：682-688,1996)。天然的人内源性血管生成抑制因子(比鼠内源性血管生成抑制因子短12个氨基酸)的体外生物学特征显示对不同型内皮细胞没有抗增殖活性。重组型人内源性血管生成抑制因子的特性没有报告。作者们推测所报告的鼠和人型内源性血管生成抑制因子活性的差异可能是由于几个因素：(ⅰ)两者分离自不同的来源，可能在体外和体内试验中有不同的选择性、特异性、或有效性。(ⅱ)在肽上发现的转译后修饰的不同可造成所报告的活性差异。(ⅲ)人内源性血管生成抑制因子可能不必要抑制内皮细胞的增殖，但间接地影响仅在复杂的体内系统中观察到的其它细胞成分。

发明概述

本发明的一个目的是讲述一种在细菌内高水平表达内源性血管生成抑制因子的方法。

本发明的另一个方面是讲述一种可使内源性血管生成抑制因子包涵体溶解、随后再折叠和纯化以产生生物学活性物质的有效方法。

溶解鼠或人内源性血管生成抑制因子包涵体的步骤优选地是在高pH下进行的。在溶解步骤中高pH优选范围是在大约pH9到pH11.5。更优选的高pH范围是从大约pH10到pH11。最优选地，高pH是大约10.5。

再折叠鼠或人内源性血管生成抑制因子包涵体的步骤优选在接近中性的pH值下进行的。在再折叠步骤中优选的接近中性的pH值是在从大约pH6到pH8.5的范围内。更优选的再折叠鼠内源性血管生成抑制因子的接近中性的pH值范围是从大约pH7.0到pH8.0。最优选地，再折叠鼠内源性血管生成抑制因子的接近中性的pH值是大约pH7.5。更优选的再折叠人内源性血管生成抑制因子的接近中性的pH值范围是从大约pH7.0到pH8.0。最优选地，再折叠人内源性血管生成抑制因子的接近中性的pH值是大约pH7.5。

在溶解阶段，内源性血管生成抑制因子基因产物的优选浓度是从大约0.2到20mg/ml。更优选的浓度是大约2.5mg/ml。

在再折叠阶段，内源性血管生成抑制因子基因产物的优选浓度是从大约0.02到2mg/ml。更优选的浓度是大约0.25mg/ml。

从尿素和盐酸胍中选择的变性剂优选地用于溶解和再折叠阶段，更优选的变性剂是尿素。

在溶解阶段优选的尿素浓度是从大约4M到10M。更优选的浓度是大约6M。

在再折叠阶段优选的尿素浓度是从大约2M到4M。更优选的浓度是大约3.5M。

在溶解阶段优选的盐酸胍浓度是从大约2M到8M。更优选的浓度是大约4M。

在再折叠阶段优选的盐酸胍浓度是从大约0.2M到2M。更优选的浓度是大约1.5M。

优选地，溶解和还原步骤是在存在可还原二硫键为巯基的还原剂的情况下进行的。优选的还原剂是从DTT、BME、半胱氨酸和还原型谷胱甘肽中选择的。更优选的还原剂是DTT或半胱氨酸。

在溶解步骤中DTT的优选浓度是从大约2mM到10mM。更优选的浓度是大约5mM。

在再折叠步骤中DTT的优选浓度是从大约0.5mM到2mM。更优选的浓度是大约0.5mM。

在溶解步骤中还原型谷胱甘肽的优选浓度是从大约5mM到20mM。更优选的浓度是大约10mM。

在再折叠步骤中还原型谷胱甘肽的优选浓度是从大约0.5mM到4mM。更优选的浓度是大约1mM。

在溶解步骤中半胱氨酸的优选浓度是从大约5mM到20mM。更优选的浓度是大约10mM。

优选地，在再折叠步骤中应用一种能够增进二硫键交换的试剂。该试剂优选地从半胱氨酸和氧化型谷胱甘肽中选择。更优选的试剂是半胱氨酸。

在再折叠步骤中优选使用的半胱氨酸浓度是从大约0.2mM到5mM。更优选的浓度是大约1mM。

在再折叠步骤中，二硫键优选地是通过空气氧化形成的。空气氧化步骤优选地进行大约12小时到96小时。更优选的空气氧化步骤进行大约24小时到72小时。最优选的空气氧化步骤进行大约60小时。

再折叠的内源性血管生成抑制因子优选地以如下方法进一步纯化，纯化方法选自但不限于离子交换层析法、疏水性交互层析法和RP-HPLC。

表达、溶解、再折叠和纯化方法优选地使用鼠或人内源性血管生成抑制因子基因。这些基因更优选地选自SEQ ID号5-9。

本发明的新蛋白是修饰的人或鼠内源性血管生成抑制因子氨基酸序列，所述的蛋白可随意地紧接在如下氨基酸之后，(蛋氨酸^-1)、(丙氨酸^-1)、(蛋氨酸^-2，丙氨酸^-1)、(丝氨酸^-1)，(蛋氨酸^-2，丝氨酸^{- 1})、(半胱氨酸^-1)或(蛋氨酸^-2、半胱氨酸^-1)。

此外，本发明涉及重组体表达载体，包括编码内源性血管生成抑制因子及其变异体和突变体的核苷，有关的微生物和真核表达系统和制造这些蛋白的过程(包括表达、溶解、再折叠、纯化步骤)。

编码这些蛋白的DNA序列克隆可通过使用中间载体完成。可选择地，一个基因可直接克隆进含其它基因的载体。连接体和接合体可被用于整合DNA序列，以及替换丢失的序列，其中一个限制性位点位于研究区内。于是编码一个多肽、肽连接体和其它多肽的基因物质(DNA)即插进适当的表达载体，它可用于转染细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳细胞。转染的生物体或细胞系生长，并用标准的技术分离蛋白质。因此得到的产物是一个新蛋白，它是一个蛋白的全部或一部分，通过一个连接体区域加入到另一个蛋白的全部或部分中。

本发明的另一个方面包括用于表达这些蛋白的质粒DNA载体。这些载体包括编码本发明的新多肽的上述新DNA序列。可转染能表达蛋白的微生物或细胞系的适当载体，包括含有编码加入到转录和转译调节序列中的蛋白的核苷序列的表达载体，这些调节序列是根据所用的宿主细胞选择的。

如上所述掺入修饰序列的载体包括在本发明中并用于蛋白生产。用于本方法的载体也含有选择性的调节序列，与编码本发明序列的DNA一起运行，使之可直接在选择的宿主细胞内复制和表达。

生产这些蛋白的方法是本发明的另一个方面。本发明的方法涉及培养已被载体转染的适当的细胞或细胞系，该载体含有编码表达新的多功能蛋白质的DNA序列。适当的细胞或细胞系可以是细菌细胞。例如，各种大肠杆菌株，在生物技术领域是熟知的宿主细胞。这些种系的实例包括大肠杆菌JM101菌株(Yanisch-Perron等,Gene 33：103-119,1985)和MON105菌株(Obukowicz等,Applied EnvironmentalMicrobiology 58：1511-1523,1992)。以噬菌体Mu为基础，对大肠杆菌采用染色体表达载体来表达多功能蛋白质也包括在本发明中(Weinberg等,Gene 126：25-33,1993)。各种B.subtilis也可用于本方法。本领域技术人员已知的许多种酵母细胞株也可用做表达本发明多肽的宿主细胞。

当在大肠杆菌细胞浆中表达时，编码本发明蛋白质的基因也可被构建成在基因密码子的5’末端添加基因，使之在蛋白N末端编码蛋^-2-丙^-1、蛋^-2-丝^-1、蛋^-2-半胱^-1或蛋^-1。大肠杆菌细胞浆内生产的蛋白质N末端，受通过蛋氨酸氨基肽酶(Ben Bassat等,J.Bacteriol.169：751-757,1987)和其它可能的肽酶进行的翻译后加工的影响，使得刚一表达出来，蛋氨酸就从N末端分裂掉。本发明的蛋白质可包括在N末端有蛋^-1、丙^-1、丝^-1、半胱^-1、蛋^-2-丙^-1、蛋^-2-丝^-1或蛋^-2-半胱^-1的多肽。这些变异体蛋白质可通过融合一分泌信号肽到N末端而在大肠杆菌内表达。此信号肽作为分泌过程的一部分从多肽上分裂掉。

定义

下面是缩写及其可在这里互换的相应意义的目录：

g=克

HPLC=高效液相色谱

mg=毫克

ml=毫升

DTT=二硫苏糖醇

RT=室温

PBS=磷酸缓冲盐水

下面是这里所用的各种术语定义的目录：

术语“抗肿瘤”是指在体内具有减慢或消除肿瘤生长的活性，或具有杀死或要么杀伤肿瘤的活性。

术语“天然序列”是指与野生型或天然型基因或蛋白质相同的氨基酸或核苷酸序列。

术语“突变体氨基酸序列”、“突变体蛋白”、“变异体蛋白”、“突变型蛋白”或“突变体多肽”是指氨基酸序列不同于天然序列的多肽，其原因是氨基酸增加、缺失、取代或它们的任意组合，或者是由衍生自天然序列或化学合成的、故意制造的变异体的核苷酸序列编码而来的。

术语“内源性血管生成抑制因子”是指具有抗血管生成活性的ⅩⅧ胶原的蛋白片断。所述片断的活性可通过血管生成的鼠角膜微团试验或体外抑制内皮细胞生长和迁移来确定。优选地，鼠内源性血管生成抑制因子是指SEQ ID 10中所描写的序列，而人内源性血管生成抑制因子是指SEQID 11号中所描写的序列。

附图的简单说明图1显示了克隆的内源性血管生成抑制因子片断的示意图

显示ⅩⅧ胶原的C末端片断。质粒pMON24345(SEQ ID 8号)编码鼠ⅩⅧ胶原的C末端片断。质粒pMON20440(SEQ ID 9号)编码人ⅩⅧ胶原的C末端片断。图2显示了内源性血管生成抑制因子再折叠过程的示意图

概述有尿素和DTT或半胱氨酸时最佳的溶解条件，和有半胱氨酸时的再折叠。图3显示在不同pH条件下鼠内源性血管生成抑制因子的再折叠产物

在3.5M尿素中，在pH7.5、pH8.0和pH8.5时鼠内源性血管生成抑制因子再折叠产物的RP-HPLC示踪。图4显示在不同尿素浓度下鼠内源性血管生成抑制因子的再折叠产物

pH7.5时，在3.0M、3.5M和4.0M尿素条件下，鼠内源性血管生成抑制因子再折叠产物的RP-HPLC示踪。图5显示在不同pH条件下人内源性血管生成抑制因子的再折叠产物

在3.5M尿素中，在pH7.5、pH8.0和pH8.5时人内源性血管生成抑制因子再折叠产物的RP-HPLC示踪。图6显示在不同尿素浓度下人内源性血管生成抑制因子的再折叠产物

pH7.5时，在3.0M、3.5M和4.0M尿素条件下，人内源性血管生成抑制因子再折叠产物的RP-HPLC示踪。图7显示鼠内源性血管生成抑制因子对HMEC迁移的抑制

纯化的鼠内源性血管生成抑制因子以15和30□g/ml进行HMEC细胞迁移试验中检测。在两个浓度下均观察到对迁移的抑制。图8显示鼠内源性血管生成抑制因子对CPAE迁移的抑制

纯化的鼠内源性血管生成抑制因子以5和30□g/ml进行HMEC细胞迁移试验中检测。在两个浓度下均观察到对迁移的抑制。图9显示鼠内源性血管生成抑制因子对内皮细胞增殖的抑制

鼠内源性血管生成抑制因子对内皮细胞增殖的抑制。在20μg/ml时观察到显著的抑制。图10显示人内源性血管生成抑制因子对内皮细胞增殖的抑制

人内源性血管生成抑制因子对内皮细胞增殖的抑制。在10μg/ml内源性血管生成抑制因子时观察到显著的抑制。

发明的详细说明

尽管可以理解本发明并不限于这些特殊的实例，下面的实例将更详细地说明本发明。对于本领域的技术人员来说，读了本公开之后，在不背离本发明精神和范畴的情况下，其它各种实例是显而易见的。所有这些其它实例应当包括在所附权利要求的范围内。总的方法

克隆、表达和鉴定蛋白质的总方法见T.Maniatis等，分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory,1982，及其中引用的文献，按引用合并于此；和见J.Sambrook等，分子克隆，实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory,1989，及其中引用的文献，这些文献已被引入本发明作为参考。

除非另外注明，所有的专业化学药品从Sigma公司(St.Louis,MO)获得。限制性核酸内切酶和T₄ DNA连接酶从New EnglandBiolabs(Beverly,MA)或Boehringer Mannheim(Indianapolis,IN)或Promega(Madison,WI)获得。菌株和质粒

用于这些研究的细菌菌株列于表1中。本研究所用或构建的质粒列于表2中。大肠杆菌种系的转换

大肠杆菌菌株(表1)如DH5α和DH10B(Life Technologies,Rockville,MD),和TG1(Amersham公司,Arlington Heights,IL)用于结合反应的转化，并且是用于制备转染哺乳细胞的质粒DNA的宿主。大肠杆菌菌株如JM101(Yanisch-Perron等，Gene,33：103-119,1985)和MON105(Obukowicz等，Appl.and Envir.Micr.,58：1511-1523,1992)可被用于在细胞浆内或胞周间隙内表达本发明的蛋白质。

DH5α和DH10B亚克隆有效细胞作为感受态细胞购进，并准备采用说明书的方法进行转化。大肠杆菌菌株JM101和MON105采用CaCl₂方法成为可吸纳DNA的感受态。典型地，20-50mL细胞在LB培养基(1％Bacto-胰蛋白胨，0.5％Bacto-酵母提取物，150mMNaCl)中生长，直至用Baush & Lomb Spctronic分光光度计(Rocheste,NY)在600纳米(OD600)处测得大约1.0吸收单位的密度。细胞通过离心收集，并在五分之一培养容积的CaCl₂溶液中重悬浮[50mMCaCl₂,10mM Tris-Cl(10mM 2-氨基-2-(羟甲基)1,3-丙烷盐酸盐)，pH7.4]并在4℃保存30分钟。细胞通过离心再次收集，用五分之一培养容积的CaCl₂溶液重悬浮。要导入的DNA加入0.2mL此细胞中，并将样本在4℃保存30-60分钟。样本转移到42℃ 2分钟，加入1.0mLLB，然后在37℃振摇1小时。这些样本的细胞铺在平板上(LB培养基加1.5％Bacto-琼脂)，在筛选氨比西林耐药的转化细胞时平板内含有氨比西林(100mg/mL,μg/mL)，或在筛选放线菌素耐药的转化细胞时平板内含有放线菌素(75μg/mL)。平板在37℃孵育过夜。

克隆被挑选出来，接种进加适当抗生素(100μg/mL氨比西林或75μg/mL放线菌素)的LB，并在37℃振摇中生长。DNA分离和鉴定

质粒DNA可通过数种不同的方法分离，或采用本领域技术人员已知的商业销售试剂盒。质粒DNA用Promega Wizard^TM Miniprep试剂盒(Madison,WI)、Qiagen ALAwell质粒提取试剂盒(Chatsworth,CA)或Qiagen Plasmid Midi或Mini试剂盒分离。这些试剂盒对质粒DNA的提取采用相同的总体步骤。简单地说，细胞通过离心(5000×g)沉淀，质粒DNA在随后的NaOH/酸处理中释放出来，再通过离心(10000×g)去除细胞碎片。上清(含DNA质粒)加进含DNA结合树脂的柱子，冲洗柱子将质粒DNA洗脱出来。在筛选出有研究质粒的克隆株后，大肠杆菌细胞接种进50-100mL含适当抗生素的LB中，在空气孵育器内37℃振摇过夜生长。纯化的质粒DNA用于DNA测序、进一步限制酶消化、补充DNA片断亚克隆和转染进大肠杆菌、哺乳细胞或其它类型细胞。序列确定

纯化的质粒DNA在去离子水中重悬浮，其浓度用Bausch & LombSpectronic 601紫外分光光度计在260/280nm处测量吸光率来确定。DNA样本的测序采用ABI PRISM^TM DyeDeoxy^TM的终端测序化学(Perkin Elmer公司应用生物系统部，Lincoln City,CA)试剂盒(零件号401388或402078)，按照说明书建议的方法，通常改良为在测序混合物中加入5％DMSO。测序反应按照推荐的扩增条件在DNA热循环仪(Perkin Elmer公司,Norwalk,CT)中进行。样本用Centri-Sep^TM旋转柱(Princeton Separations,Adelphia,NJ)纯化以去除过剩的染料终止物并冻干。荧光染料标记的测序试剂在去离子甲酰胺中重悬浮，用ABI373A型和377型自动DNA测序仪在变性的4.75％聚丙烯酰胺-8M尿素凝胶上测序。交联的DNA序列片断用Sequecher DNA分析软件(Gene Codes公司,Ann Arbor,MI)进行分析并汇编入主DNA结构中。大肠杆菌内内源性血管生成抑制因子的小规模表达

在New Brunswick Scientific(Edison,NJ)的G25型空气孵育器内，带有研究质粒的大肠杆菌菌株MON105或JM101在M9添加酪蛋白水解物的培养基内，37℃振摇生长。在OD₆₀₀处监测生长情况，直至该值达到1.0，此时加入溶于0.1N NaOH的萘啶酸(10mg/mL)，其终浓度为50μg/mL。然后，培养物在37℃继续振摇3-4小时。在培养过程中保持高度通风以获得最大产量的所需基因产物。细胞在光镜下观察其包涵体(IB)的存在情况。取出1mL培养试样用于蛋白含量分析，煮沸沉淀的细胞，用还原缓冲液处理并经SDS-PAGE电泳(见Maniatis等，“分子克隆：实验室手册”，1982)。培养物离心(5000×g)以沉淀细胞。大肠杆菌内内源性血管生成抑制因子的大规模(10L)表达

内源性血管生成抑制因子分子在10L Biostat E^TM发酵罐(B.BraunBiotech有限公司，Allentown PA)中全部按比例放大。所用的发酵培养基是添加了2％酪蛋白水解物(Difco Laboratories,Detroit MI)和葡萄糖的M9盐类。大约1毫升融化的培养物转进装有1.0L培养基的3.8LFernbach振荡烧瓶内，然后在振荡器上以250rpm的速度37℃孵育12小时。此振荡烧瓶培养物然后接种于含9.0L培养基的10L发酵罐中。发酵条件为：搅拌=1000rpm，喷射气流速度=15L/min，通过添加NH₄OH控制pH=7.0，背压=10psi，溶解的氧控制＞30％，温度=37℃。葡萄糖最初一次给予15g/l，通过添加50％葡萄糖原料控制在2-5g/l。发酵培养物生长到最初OD(550nm)=12-15，并用50mg/l萘啶酸诱导。通过持续流动离心诱后4小时完成发酵作用。10L规模包涵体的分离

来自10L发酵系统的细胞糊重悬浮在大约6.0L 50mM Tris/150mMEDTA缓冲液中。重悬浮液以10,000psi经过一微型流化床^_(Newton,MA)一次，保持温度在8℃以下。然后获得的匀浆以15,000×G离心25分钟，并用Ultr-Turrax混合器混匀。接着，细胞糊重悬浮液以10,000psi压力经过一微型流化床^TM(Newton,MA)两次进行匀浆。通过将匀浆收集到一置于冰浴中的不锈钢容器内，使温度保持在不超过6℃。然后以15,000×g离心细胞匀浆30分钟，去除上清以分离包涵体。随后用冷的D.I.重悬浮，并以15,000×g离心30分钟洗涤包涵体，总共两次。然后内源性血管生成抑制因子包涵体在-70℃冷冻。包涵体的小规模分离

从330毫升大肠杆菌培养物中分离的细胞沉淀重新悬浮在15毫升超声破碎缓冲液中(50mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTA)。这些悬浮的细胞采用超声细胞破碎仪(W-375型，Heat Systems-Ultrasonics有限公司，Farmingdale，纽约)的微型探头进行超声破碎。在超声破碎缓冲液中进行三轮超声破碎处理后，进行离心以破碎细胞并清洗出包涵体(IB)。第一轮超声作用是3分钟进发接着1分钟进发，最后进行的两轮超声作用是每次1分钟。从包涵体沉淀中提取和再折叠人和鼠蛋白

所有步骤在4℃下进行。鼠的内源性血管生成抑制因子包涵体以2.5mg/ml内源性血管生成抑制因子的浓度溶解于6M尿素、5mMDTT、50mM Bis-Tris丙烷，pH8.0中。该溶液搅拌2小时，然后添加胱氨酸(贮存液0.2M,pH10.5)至10mM。混合5分钟，然后在3.5M尿素、100mM Bis-Tris丙烷，pH7.0中稀释至0.25mg/ml内源性血管生成抑制因子。然后搅拌60小时以完成蛋白的再折叠，如反相HPLC所检测的那样。

人内源性血管生成抑制因子包涵体以2.5mg/ml溶解于10mM半胱氨酸、6M尿素，50mM Bis-Tris丙烷，pH10.8中。搅拌2小时，然后添加10mM胱氨酸(贮存液0.2M，pH10.5)并混合5分钟。此溶液然后在3.0M尿素、100mM Bis-Tris丙烷，pH7.5中稀释至0.25mg/ml内源性血管生成抑制因子，然后搅拌60小时以完成再折叠步骤。纯化

鼠或人内源性血管生成抑制因子的纯化是采用相同步骤的方法达到的，即与酸沉淀，然后在一个硫代-丙烷基柱上行柱层析。再折叠的样品通过超滤作用浓缩大约10倍，并用乙酸将pH降至pH5.0。然后用pH5.0的5mM乙酸大量透析。通过过滤去除沉淀物，滤出液加到Pharmacia S-琼脂糖HP柱上。用1倍柱体积的平衡缓冲液清洗柱，用20倍柱体积的梯度液洗脱出蛋白，此梯度液由pH6.5的50mM磷酸盐，和含有0.4M氯化钠的相同缓冲液组成。各馏份用SDS-凝胶电泳和RP-HPLC进行分析，收集，经过PBS透析并冷冻。

在某些情况下，折叠的蛋白质可采用附着在合适基质上的亲和试剂如单克隆抗体或受体亚单位进行亲和纯化。纯化也可采用多种层析方法如：离子交换、凝胶过滤或疏水交互色谱或反相HPLC。这些和其他蛋白质纯化方法在酶学方法第182卷“蛋白质纯化指南”中有详细描述，该指南由Murray Deutscher编辑，加利福尼亚圣地亚哥学院出版社1990年出版。蛋白质定性

纯化的蛋白质由RP-HPLC、氨基酸测序和SDS-PAGE进行分析。蛋白质定量是通过氨基酸组成、RP-HPLC和布雷得福蛋白质测定法进行的。在某些情况下采用胰酶分解肽段图谱与电子喷射质谱分析结合证实蛋白质的同一性。内皮细胞增殖试验

进行内皮细胞增殖试验的方法如Cao等所述(J.Biol.Chem.271：29461-29467,1996)。简言之，人真皮微血管内皮细胞(HdMVEC,克隆系)或牛肾上腺皮质微血管内皮细胞(BacEnd,Incell,San Antonio,TX)保存在含有5％热灭活的胎牛血清(FBS,Hyclone)、抗生素、100μg/ml肝素(Sigma)、100μg/ml内皮细胞分裂原(Biomedical Technologies)的MCDB131中。第2-5代汇合的单层以0.05％胰蛋白酶分散，重悬在完全培养基中。含有1.25×10⁴细胞的完全培养基500μl注入包被有0.1％明胶(Sigma)的24孔组织培养板的孔中。细胞在37℃/5％CO₂孵育过夜，此时用含有5％FBS和多种浓度抑制剂的培养基250μl进行换液。孵育30分钟后，再加入含有1ng/ml bFGF(R&D系统)的培养基250μl，继续孵育72小时，然后被胰酶消化并在Coulter计数仪上计数。内皮细胞移行试验

进行内皮细胞移行试验主要如前所述(Gately等,CancerRes.56：4887-4890,1996)。为确定内源性血管生长抑制因子抑制内皮细胞移行的能力，移行试验是在一个含有8毫米孔径的聚碳酸酯膜的跨孔室(Transwell chamber)(Costar)中进行的。试验中使用的细胞可以是人微血管内皮细胞(Emory大学,Altanta,GA)，或者是牛肺动脉内皮细胞(Monsanto,St.Louis,MO)。使用前，细胞在MCDB131+0.1％牛血清白蛋白(人细胞)或DMEM+0.1％牛血清白蛋白(牛细胞)中过夜饥饿，消化收集，并以同样的培养基重新悬浮为10⁶细胞/ml。在向上室中加入2×10⁵细胞前，Transwell的下方以0.1％明胶37℃30分钟包被。Transwell移到下室中含有化学趋化剂(bFGF或VEGF)的孔中。在37℃过夜使移行进行。然后固定膜并染色，移行至膜下方的细胞数量可在3个高倍视野中计数。实例1：pMON24345(SEQ ID NO：8)的构建和产生高水平鼠内源性血管生成抑制因子菌株的选择

总鼠RNA(Clontech Laboratories有限公司，Palo Alto,CA)5μg与500ng随机六聚体引物(Promega公司,Madison,WI)混合，65℃加热10分钟，然后在冰上冷却2分钟。在RNA/引物混合物中加入20单位Rnasin(Progmega)、SuperScript Ⅱ缓冲液、终浓度为0.01M的DTT、终浓度为0.005M的dNTP混合物(Boehringer)和200单位SuperScriptⅡ转录酶(生命技术公司)。反应体系在42℃孵育1.5小时，通过70℃孵育5分钟灭活酶。通过加入2单位大肠杆菌核糖核酸酶H(生命技术公司)并在37℃孵育反应体系20分钟去除RNA。添加终浓度为1.6mM的dNTPs、50pmol鼠内源性血管生成抑制因子5’端引物(SEQ IDNO：1)、50pmol鼠内源性血管生成抑制因子3’端引物(SEQ ID NO：2)、高保真PCR缓冲液和高保真酶2.5单位(宝灵曼)，通过聚合酶链式反应获得双链DNA。反应混合物在95℃孵育3分钟，然后经过94℃孵育15秒、50℃孵育30秒、72℃孵育4分钟循环10次，再经过94℃孵育15秒、50℃孵育30秒、每循环72℃延伸孵育4分20秒循环15次。最后反应在72℃中孵育7分钟。

通过向25ng载体中加入1ul PCR反应体系，在连接缓冲液中加入1单位T4连接酶，将双链DNA亚克隆入pCRⅡ载体(体外合成的)中。连接反应在12℃孵育过夜。连接的DNA导入DH5α感受态细胞(生命技术公司,Rockville,MD)并在LB氨苄培养皿中生长。通过EcoRⅠ消化确定的两个具有插入物的隔离种群被进一步定性。两个隔离种群的cDNA插入物，pMON24342(SEQ ID NO：5)和pMON24343(SEQ IDNO：6)，通过采用标准双脱氧技术的DNA测序进行分析。为构建正确编码的DNA序列，pMON24342和pMON24343均用ApaⅠ消化。ApaⅠ鼠内源性血管生长抑制因子DNA片断和连接有鼠内源性血管生长抑制因子编码DNA序列5’端引物的pMON24342载体用QiaexⅡ凝胶提取试剂盒(Qiagen，德国)分离。片断在PH7.5的50mM Tris-HCl，10mMMgCl₂，50μg/ml BSA和1单位T4连接酶中被连接在一起。重新构建的质粒被转化进DH5α感受态细胞中以产生pMON24344(SEQ IDNO：7)。质粒pMON24344以NcoⅠ和HindⅢ消化，片断用QiaexⅡ凝胶提取试剂盒分离。PMON24344 NcoⅠ/HindⅢ片断在PH7.5的50mMTris、10mM MgCl₂、50□g/ml BSA和1单位T4连接酶中连接进NcoⅠ/HindⅢ消化的去磷酸化的pMON5723大肠杆菌表达载体中。连接的DNA转化入MON105和在Spec LB上选择的隔离种群中以产生pMON24345(SEQ ID NO：8)。包含pMON24345的大肠杆菌菌株MON105用10mg/ml萘啶酸诱导，在这些细胞中表达的鼠内源性血管生长抑制因子用SDS-PAGE进行监测。实例2：编码人内源性血管生长抑制因子的pMON20440(SEQ ID NO：9)的构建

总人RNA(Clontech Laboratories有限公司，Palo Alto，CA)5μg与500ng随机六聚体引物混合，65℃加热10分钟，然后在冰上冷却2分钟。向RNA/引物混合物中加入20单位Rnasin(Promega)、SuperscrriptⅡ缓冲液、终浓度0.01M的DTT、终浓度0.005M的dNTP混合物(宝灵曼)和20单位Superscript Ⅱ转录酶。反应体系在42℃孵育1.5小时，通过70℃孵育反应体系5分钟灭活酶。通过加入2单位大肠杆菌核糖核酸酶H并在37℃孵育反应体系20分钟去除RNA。添加终浓度为1.6mM的dNTPs、50pmol人内源性血管生成抑制因子5’端引物(SEQID NO：3)、50pmol人内源性血管生成抑制因子3’端引物(SEQ IDNO：4)、高保真PCR缓冲液和高保真酶2.5单位(宝灵曼)，通过聚合酶链式反应获得双链DNA。反应混合物在95℃孵育3分钟，然后经过94℃孵育15秒、50℃孵育30秒、72℃孵育4分钟循环10次，再经过94℃孵育15秒、50℃孵育30秒、每循环72℃延伸孵育4分20秒循环15次。最后反应在72℃中孵育7分钟。

双链DNA用NcoⅠ和HindⅢ消化，在PH7.5的50mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、50□g/ml BSA和1单位T4连接酶中连接入NcoⅠ/HindⅢ消化的去磷酸化的pMON2341大肠杆菌表达载体内。连接的DNA转化入大肠杆菌菌株MON105和在Amp LB培养板上选择的隔离种系中以产生pMON20440(SEQ ID NO：9)。包含pMON20440的大肠杆菌菌株MON105用10mg/ml萘啶酸诱导，在这些细胞中表达的人内源性血管生长抑制因子用SDS-PAGE进行监测。实例3：再折叠鼠内源性血管生成抑制因子的方法

所有步骤均在4℃进行。鼠内源性血管生成抑制因子包涵体以2.5mg/ml溶解于6M尿素、5mM DTT、50mM Bis-Tris丙烷，pH8.0中。该溶液搅拌2小时，然后加入胱氨酸(贮存液0.2M，pH10.5)至10mM。混合5分钟，然后在3.5M尿素，100mM Bis-Tris丙烷，pH7.0中稀释至0.25mg/ml内源性血管生成抑制因子。然后搅拌60小时以完成蛋白的再折叠，如反相HPLC所检测的那样。其他pH条件和尿素浓度也可使用，但效率较低。图3和图4分别显示了在不同pH条件和尿素浓度下，鼠内源性血管生成抑制因子再折叠产物的HPLC示踪图。图7、8和9显示了纯化的鼠内源性血管生成抑制因子在内皮细胞增殖和细胞移行试验中的抑制活性。实例4：再折叠人内源性血管生成抑制因子的方法

所有步骤均在4℃进行。人内源性血管生成抑制因子包涵体以2.5mg/ml内源性血管生成抑制因子浓度溶解于10mM半胱氨酸、6M尿素、50mM Bis-Tris丙烷，pH8.0中。搅拌2小时，然后加入10mM胱氨酸(贮存液0.2M，pH10.5)并混合5分钟。然后在3.0M尿素、100mMBis-Tris丙烷，pH7.5中稀释至0.25mg/ml内源性血管生成抑制因子并搅拌60小时以完成蛋白的再折叠步骤。其他pH条件和尿素浓度也可使用，但效率较低。图5和图6分别显示了不同pH条件和尿素浓度下人内源性血管生成抑制因子再折叠产物的HPLC示踪图。图10显示了纯化的人内源性血管生成抑制因子在内皮细胞增殖试验中的抑制活性。

本领域技术人员可发现，上面概述的溶解、再折叠和纯化条件提供了对已发表从细菌中纯化内源性血管生成抑制因子方法的惊人改进。用于临床前研究和临床试验的商业规模内源性血管生成抑制因子产品，将需要可溶性的、适当再折叠的、具有所期望生物学特性的大量原料。内源性血管生成抑制因子作为一个治疗性产品的商业开发需要经充分鉴定的原料，使之在所有应用中表现一致。因此可溶的、适当再折叠的内源性血管生成抑制因子，在体外试验和体内研究该蛋白的效用、效力、药物动力学和药效学中，较不溶性物质的悬液更为理想。在此公开的文件中概述的这种物质表达、溶解、再折叠、纯化和定性的很大改进的方法，将极大促进随后的研究，以开发内源性血管生成抑制因子、内源性血管生成抑制因子片断、突变体蛋白质、插入体蛋白质(inseryrins)、超突变体蛋白质(permuteins)、或它们的嵌合体，或者是这些蛋白与其它抗血管生成蛋白、或可用作治疗血管生成异常包括癌症的小分子化合物的结合物。

如果在文中提到，本文引用的所有参考文献、专利或专利申请均被引入本发明作为参考。

图表

表1：菌株

表2：质粒

表3：SEQ ID 相关表

序列表

<110>Harding，E.I.

Violand，B.N.

<120>制造鼠和人内源性血管生成抑制因子的方法

<130>c_3071-0

<150>60/075.587

<151>1998-02-23

<160>11

<170>FastSEQ for Windows Version 3.0

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>人类

<400>1gcgcgcccat ggctcatact catcaggac 29

<210>2

<211>38

<212>DNA

<213>人类

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<210>3

<211>71

<212>DNA

<213>人类

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<210>4

<211>79

<212>DNA

<213>人类

<400>4gcgcgcaagc ttattacttg gaggcagtca tgaagctgtt ctcaatgcag agcacgatgt 60aggcgtgacg gcagctcgc 79

<210>5

<211>620

<212>DNA

<213>人类

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<211>582

<212>DNA

<213>人类

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<210>7

<211>580

<212>DNA

<213>人类

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<210>8

<211>568

<212>DNA

<213>人类

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<210>9

<211>563

<212>DNA

<213>人类

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<210>10

<211>124

<212>PRT

<213>人类

<400>10Ala His Thr His Asp Val His Val Ala Asn Thr Ser Gly Gly Met Arg1 5 10 15Gly Arg Gly Ala Asp Cys Ala Arg Ala Val Gly Ser Gly Thr Arg Ala

20 25 30Ser Ser Arg Asp Tyr Ser Val Arg Arg Ala Asp Arg Gly Ser Val Val

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85 90 95Gly Ala Thr Gly Ala Ser Ser Ser Gly Arg Lys Ala Ala Ser Cys His

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115 120

<210>11

<211>123

<212>PRT

<213>人类

<400> 11Ala His Ser His Arg Asp Val His Val Ala Asn Ser Ser Gly Gly Met1 5 10 15Arg Gly Arg Gly Ala Asp Cys Ala Arg Ala Val Gly Ala Gly Thr Arg

20 25 30Ala Ser Ser Arg Asp Tyr Ser Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val

35 40 45Val Asn Lys Asp Ser Trp Ala Ser Gly Ser Gly Lys Gly Ala Arg Ser

50 55 60Asp Gly Lys Asp Val Arg His Thr Trp Lys Ser Val Trp His Gly Ser65 70 75 80Asp Asn Gly Arg Arg Thr Ser Tyr Cys Thr Trp Arg Thr Ala Ser Ala

85 90 95Thr Gly Ala Ser Ser Gly Gly Arg Gly Ser Ala Ala Ser Cys His His

100 105 110Ala Tyr Val Cys Asn Ser Met Thr Ala Ser Lys

115 120

Claims

1．一种产生内源性血管生成抑制因子的方法，包括以下步骤：(a)培养表达内源性血管生成抑制因子基因的宿主细胞；(b)回收所说的基因表达产物；(c)在高pH下溶解所说的基因产物；(d)在接近中性的pH下再折叠所说的溶解的基因产物；和(e)分离适当折叠形式的所说的基因产物。

2．一种产生内源性血管生成抑制因子的方法，包括以下步骤：(a)培养表达内源性血管生成抑制因子基因的宿主细胞；(b)回收所说的基因表达产物；(c)在接近中性的pH条件下再折叠所说的溶解的基因产物；和(d)分离适当折叠形式的所说的基因产物。

3．权利要求1所述的方法，其中在溶解步骤中所说的高pH为从大约pH9到大约pH11.5。

4．权利要求3所述的方法，其中所说的高pH为从大约pH10到大约pH11。

5．权利要求4所述的方法，其中所说的高pH为大约pH10.5。

6．权利要求1或2所述的方法，其中再折叠步骤中所说的接近中性的pH为从大约pH6到大约pH8.5。

7．权利要求6所述的方法，其中再折叠步骤中所说的接近中性的pH为从大约pH7.0到大约pH8.0。

8．权利要求7所述的方法，其中再折叠步骤中所说的接近中性的pH为大约pH7.5。

9．权利要求6所述的方法，其中再折叠步骤中所说的接近中性的pH为从大约pH7.0到大约pH8.0。

10．权利要求9所述的方法，其中再折叠步骤中所说的接近中性的pH为大约pH7.5。

11．权利要求1或2所述的方法，其中在所说的溶解步骤中尿素存在的浓度为大约4M到大约10M。

12．权利要求11所述的方法，其中在所说的溶解步骤中尿素存在的浓度为大约6M。

13．权利要求1或2所述的方法，其中在所说的再折叠步骤中尿素存在的浓度为大约0.5M到大约5M。

14．权利要求13所述的方法，其中在所说的再折叠步骤中尿素存在的浓度为大约3.5M。

15．权利要求1或2所述的方法，其中在所说的溶解步骤中盐酸胍存在的浓度为大约2M到大约8M。

16．权利要求15所述的方法，其中在所说的溶解步骤中盐酸胍存在的浓度为大约4M。

17．权利要求1或2所述的方法，其中在所说的再折叠步骤中盐酸胍存在的浓度为大约0.2M到大约2M。

18．权利要求17所述的方法，其中在所说的再折叠步骤中盐酸胍存在的浓度为大约1.5M。

19．权利要求1或2的方法是在有还原剂的条件下进行的，所述还原剂能够将二硫键还原成巯基。

20．权利要求19所述的方法，其中所说的还原剂选自DTT、BME、半胱氨酸和还原型谷胱甘肽。

21．权利要求20所述的方法，其中在所说的溶解步骤中DTT存在的浓度是大约2mM到大约10mM。

22．权利要求21所述的方法，其中在所说的溶解步骤中DTT存在的浓度是大约5mM。

23．权利要求20所述的方法，其中在所说的再折叠步骤中DTT存在的浓度是大约0.2mM到大约2mM。

24．权利要求23所述的方法，其中在所说的再折叠步骤中DTT存在的浓度是大约0.5mM。

25．权利要求20所述的方法，其中在所说的溶解步骤中还原型谷胱甘肽存在的浓度是大约5mM到大约20mM。

26．权利要求25所述的方法，其中在所说的溶解步骤中还原型谷胱甘肽存在的浓度是大约10mM。

27．权利要求20所述的方法，其中在所说的再折叠步骤中还原型谷胱甘肽存在的浓度是大约1mM到大约4mM。

28．权利要求27所述的方法，其中在所说的再折叠步骤中还原型谷胱甘肽存在的浓度是大约2mM。

29．权利要求20所述的方法，其中在所说的溶解步骤中半胱氨酸存在的浓度是大约5mM到大约20mM。

30．权利要求29所述的方法，其中在所说的溶解步骤中半胱氨酸存在的浓度是大约10mM。

31．权利要求20所述的方法，其中在所说的再折叠步骤中半胱氨酸存在的浓度是大约0.5mM到大约4mM。

32．权利要求31所述的方法，其中在所说的再折叠步骤中半胱氨酸存在的浓度是大约1mM。

33．权利要求1或2所述的方法，其中在所说的再折叠步骤中存在一种试剂，它能够增强二硫键的互换。

34．权利要求33所述的方法，其中所说的试剂选自胱氨酸和氧化型谷胱甘肽。

35．权利要求34所述的方法，其中在所说的再折叠步骤中胱氨酸存在的浓度是大约0.2mM到大约5mM。

36．权利要求35所述的方法，其中在所说的再折叠步骤中胱氨酸存在的浓度是大约1mM。

37．权利要求1或2所述的方法，其中在所说的再折叠步骤中二硫键是通过空气氧化形成的。

38．权利要求37所述的方法，其中所说的空气氧化步骤进行大约12到大约96小时。

39．权利要求38所述的方法，其中所说的空气氧化步骤进行大约24到大约72小时。

40．权利要求39所述的方法，其中所说的空气氧化步骤进行大约60小时。

41．权利要求1或2方法中，在所说的溶解步骤中所说的基因产物存在的浓度是大约1到大约20mg/ml。

42．权利要求41所述的方法，其中在所说的溶解步骤中所说的基因产物存在的浓度为大约2.5mg/ml。

43．权利要求1或2所述的方法，其中在所说的再折叠步骤中所说的基因产物存在的浓度为大约0.1到大约5mg/ml。

44．权利要求43所述的方法，其中在所说的再折叠步骤中所说的基因产物存在的浓度为大约0.25mg/ml。

45．权利要求1或2所述的方法，进一步包括通过选自离子交换层析、疏水性交互层析和RP-HPLC的方法，纯化内源性血管生成抑制因子的步骤。

46．权利要求1或2所述的方法，其中所说的内源性血管生成抑制因子基因由编码非人的、动物内源性血管生成抑制因子的DNA组成。

47．权利要求1或2的所述的方法，其中所说的内源性血管生成抑制因子基因选自SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8。

48．权利要求1或2所述的方法，其中所说的内源性血管生成抑制因子基因由编码人内源性血管生成抑制因子的DNA组成。

49．权利要求1或2所述的方法，其中所说的内源性血管生成抑制因子基因由SEQ ID NO：9组成。