CN1062014C - 编码人α－干扰素的重组基因、表达载体的制备方法及该干扰素的纯化 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种编码人α-干扰素，并能有效的在酵母菌中表达的重组基因，其核苷酸序列在图1A中列出；一种含所述基因的表达载体；用所述表达载体转染的酵母细胞；用所述的酵母转化体生产人α-干扰素的方法；高产纯化所述人α-干扰素的方法。

Description

编码人α-干扰素的重组基因、表达载体的制备方法及该干扰素的纯化

本发明涉及一个编码人α-干扰素的重组基因及在酵母细胞中的表达。尤其是本发明涉及一个用酵母大量生产人α-干扰素的编码人α-干扰素的重组基因，表达载体及用该载体转化的酵母细胞，使用所述的酵母转化体生产人α-干扰素的过程和以高收率在酵母细胞中生产的所涉及α-干扰素的纯化过程。

干扰素，一种细胞活素，它是在动物细胞对病毒感染应答中所产生的一种抗病毒活性的蛋白质。依其来源不同将干扰素分为：α-干扰素(IFN-α)，也称为淋巴细胞干扰素，它最多是由B淋巴细胞，裸淋巴细胞或巨噬细胞产生；β-干扰素(IFN-β)，也称为成纤维细胞干扰素，主要是由成纤维细胞或表皮细胞产生；γ-干扰素(IFN-γ)，又称为免疫干扰素，主要是由T淋巴细胞与巨噬细胞产生(Stanton，G.J.et a1.，Tex.Rep.Biol.Med.41，84-88(1981)；Kirchner.H.et al.，Tex Rep.Biol.Med.41，89-93(1981)。

到目前为止，已有20多种类型α-干扰素基因被鉴定出，它们中编码165或166个氨基酸。

在临床试验中最先使用的α-干扰素是由仙台病毒(Sendai virus)刺激淡黄层淋巴细胞所产生的。它的纯度仅约为1％(Cantell，K.and Hirvonen，Tex.Rep.Biol，Med.35，138-144(1977))。

最近，由重组DNA技术生产的人α-干扰素已经用于临床。结果，已经报告它们在治疗许多肿瘤疾病，特别是膀胱癌(Torti，F.M.et al.，J.Clin.Onco.3，506-512(1986))和肾癌(Vugrin，D.et al.，Cancer Treat.Rep.69，817-820(1985))进一步用于治疗丙型肝炎(Dayis，G.G.et al.，N.Engl.J.Med.321，1501-1506(1989)；Bisceglie，A.D.et al.，N.Engl.J.Med.321.1506-1510(1989))。

用重组DNA技术生产人α-干扰素通常已被限制到以使用大肠杆菌作为受体菌的那些过程(Nagata，S.et al.，Nature 284，316-320(1980)；Goeddel，D.V.et al.，Nature 287，411-416(1980)；Streuli，M.et al.，Science 209，1343-1347(1980)；Goeddel，D.V.et al.，NAR 8，4057-4074(1980)；Dreynck，R.et al.，Nature 287，193-197(1980))。这样生产的α-干扰素可能与天然的α-干扰素不相同，因为大肠杆菌不能使这样产生的蛋白质糖化。此外，在α-干扰素被纯化以后象大肠杆菌天然蛋白内毒素又仍然能残留在α-干扰素内。

在这种情况下，作为生产α-干扰素的受体菌，酵母菌比大肠杆菌有几个优点，即是说，在酵母菌中的糖化机制与在动物细胞中的糖化机制相似，进而，酵母菌还不产生对人体有害的任何物质相反酵母菌在几个世纪以来具有被用于食品发酵这样的事实。

尽管如此，当用重组DNA技术在酵母细胞中生产干扰素时，始终重要的仍然是从酵母天然产物中纯化出所需要的干扰素用于临床。

在大肠杆菌或酵母菌中生产的α-干扰素用反相高效液相色谱(Rubinstein，M.et al.，Arch.Biochem.Biophys.210，307-318(1981))或单克隆抗体亲和层折(Berg.K.and Heron，I.，Methods Enzymol.78，487-499(1981))已经纯化到高纯度水平。

不必说，为了在临床上能够有用，干扰素的生物活性是很重要的。在这方面天然的α-干扰素有二个二硫键，即第1和第98个氨基酸位上的二个胱氨酸之间的一个和第29及第138个氨基酸位上的另一对胱氨酸之间的一个。可是大多数用大肠杆菌或酵母菌生产的α-干扰素以一种还原型形式存在。这种形式不具备以上所述的二硫键，或作为一种不完全氧化型形式即只有所述的一个二硫键，所有这样的干扰素全部为变性状态。进而，它们常常在纯化过程中形成寡聚体，如相互间连键的双聚体。

因而，人们一直做了许多努力以企图获得活性好。纯度高的α-干扰素；

例如韩国第90-13450号专利申请披露的方法包含下述各步：用一个常规方法在溶液中溶解从受体菌纯化后获得的变性α-干扰素，而这种溶液中已加入了一种还原剂，如β-巯基乙醇或二硫羟丁醇；重新折叠(refolding)所说的还原型α-干扰素，然后用离子交换层析分离出重折叠的α-干扰素，以获得高纯度、高活性的α-干扰素。可是此种方法有一个重折叠方面的缺陷，无活性的α-干扰素蛋白，如不完全氧化的或二聚体类物质仍残存在最终产品里。

如果使用一种阳离子交换层析，所说的无活性α-干扰素蛋白可被除去。可是这种除去对提高活性α-干扰素的产量并无帮助。

本发明的目的是提供一个用在酵母细胞中有效地表达的编码人α-干扰素的重组基因(rhIFN-α基因)。

本发明的另一个目的是提供一个含有所述rhIFN-α基因的表达载体和用此载体转化的酵母细胞。

本发明的进一步目的是提供一种用酵母转化体生产α-干扰素(hIFN-α)的方法。

本发明另一个目的就是提供一个以高产酵母转体生产(hIFN-α)的方法。

因此，本发明在这里提供一个具有如图1所示的核苷酸序列rhIFN-α基因，它被设计成在酵母中生产成熟的hIFN-α。

另外，本发明提供一个能在酵母细胞中起作用的表达载体，以及包括所述的rhIFN-α基因和由此载体转化的酵母细胞。

再者，本发明提供一个在酵母细胞中生产hIFN-α的方法，包括在一个适合表达rhIFN-α基因的培养条件培养酵母转化体。

进一步，本发明提供一个高产量生产活性hIFN-α的方法，包括一种将无活性hIFN-α转化成活性形式的步骤，即：在含有一种还原剂的溶液中溶解由酵母细胞分离出的hIFN-α；在重折叠条件下，重折叠还原过的hIFN-α；进一步将含重折叠hIFN-α的溶液进行阴离子交换层析，洗脱出重折叠的hIFN-α；将这种洗脱液进行阳离子交换层析，从有活性hIFN-α中分离出无活性hIFN-α；以及用含有氧化硫醇残基和还原硫醇残基类的两性氧化还原剂处理无活性hIFN-α，使之转化为活性hIFN-α。

附图简要说明：

图1A和1B分别表示本发明rhIFN-α基因的核苷酸序列和由此编码的氨基酸序列，以及用一个分离的人mPRNA制备的hIFN-α cDNA的核苷酸序列和由此编码的氧基酸序列。

图2表示启动子AG885的核苷酸序列。

图3A和3B为组建含有rhIFN-α基因的两个表达载体的流程图。

图4A和4B给出在一个适合表达rhIFN-α基因的培养条件下培养的酵母转化体细胞抽提物电泳结果。

图5给出酵母转化体蛋白样品的CM-Sepharose柱层析结果。

图6表示非还原性十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳使用CM-Sepharose柱层析所获得的二聚体以及用两性氧化还原剂处理二聚体得到的单体的图谱。

图7提供RP-318反相高效液相色谱分析用CM-Sepharose柱层析获得的二聚体以及用两性氧化还原试验得到单体的结果。

所有在此引述的文献中的下列术语具有如下的含义：

“人α-干扰素的活性形式”或“活性hIFN-α”术语是指具有2个双硫键的单体人α-干扰素，即指第1和第98个氨基酸位上的两个胱氨酸间的一个双硫键和第29和第138个氨基酸位上的两个胱氨酸间的另一个双硫键。

“人α-干扰素的无活性形式”或“无活性hIFN-α”术语系指所有上述描述中无双硫键的人α-干扰素，包括以寡聚形式未完全氧化的有一个双硫键一类不正确连接的双硫键类人α-干扰素。

所有测序过的酵母基因，特别是高表达基因，表明在61个可能的密码子中有25个密码子具有明显优势；以及在每个基因中这25个优势密码子倾向(bias)程度与它在细胞中的mRNA水平的相关性(Bennetzent J.L.and Hall B.D.，The Journal of Bio.Chem.257，3026-3031(1982))。强表达的基因比较低水平表达基因有更多的倾向性。

进而，通常已知一个基因的转录和转译的效率会因mRNA二级结构的存在而下降，因而表达一个基因，其效率是一个很重要的因素。

基于上述事实，本发明rhIFN-α基因被设计成有酵母优势的密码予以降低mRNA二级结构的形成，这一点是通过用新从人细胞分离出mRNA制备的hIFN-αcDNA5’一端区80个碱基对所对应的区域被替代达到的，这导致在酵母细胞中rhIFN-α基因转录和转译的效率。

为了基因操作的方便，将4个不同的限制性内切酶酶切识别位点引入到rhIFN-α基因：xbaⅠ位点(5’-TCTAGA-3’)位于第12和第13氨基酸(Ser和Arg)的密码区；HindⅢ位点(5’-AAGCTT-3’)位于第25到27氨基酸(Ile，Ser和Leu)的密码区；Bal  ⅠⅠ(5’-AGATCT-3’)位于第63到第65氨基酸(Glu，Ile和Phe)的密码区；SacⅠ(5’-GAGCTC-3’)位于第88和89氨基酸(Glu和Leu)的密码区。

起始密码子ATG正好放在成熟IFN-α N端氧基酸(Cys)前面：两个终止密码子5’-TAA-3’和5’-TAG-3’放在C端第166氨基酸(Glu)的后面。为方便克隆起见，限制性内切酶一个适当识别位点放在终止密码子下游的位置或/和在起始密码ATG之前。

按上述要求本发明制备的rhIFN-α基因有一个如图1A中所描述的核苷酸序列。图1A还显示出在所述基因编码多肽的氨基酸序列。

为表达所述rhIFN-α基因，本发明的表达载体可以用各种在酵母中起作用的系统来制备。

按照一种优选实施方案，在一个含有GAP启动子的载体中提供了一个由克隆rhIFN-α基因来制备的表达载体。更具体的是，用一个pYLBC-GAP-HGH质粒制备表达载体，在这个质粒中已含有GAP启动子。这个表达载体在下面所给的实施例中将加以描述，并命名为Luck-α-IFN-1Y。

按照另一个优选实施例方案，在一个含有按本发明所设计的AG885启动子的载体中提供一个由克隆rhIFN-α基因来制备的表达载体，具体如下：

酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的乙醇脱氢酶2(ADH2)活性是由乙醇和葡萄糖的存在而控制。亦已报告，当葡萄糖在培养基中被耗尽时，ADH2基因表达将提高约200倍，因为含有22个碱基对的上游激活序列(UAS)可通过ADR1-活性蛋白的结合得到刺激(Yu et al.，Molecular andCellular Biology 9，34-42(1989))。在上述基础上，本发明为在酵母菌上基因表达发育出一个新启动子，它有200个核苷酸碱基对，内含大量与GAPDH的TATA盒相同的DNA序列，并有90个核苷酸碱基对，内含大量与ADH2上游激活序列相对的DNA序列，这个新启动子称为AG885。

启动子AG885的核苷酸序列见图2。

使用启动子AG885的rhIFN-α基因的表达载体是按以下所述的实施例描述的方法制备的，命名为pYLBC-AG885-α-IFN。

本发明的表达载体，特别是pYLBC-AG885-α-IFN，可表达高产量的hIFN-α，至少约占总酵母菌蛋白的10％。

用Luck-α-IFN-1Y载体转化的酿酒酵母菌于1992年12月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M92043，另外该酵母菌于1990年12月12日保藏在韩国微生物培养保藏中心(KCCM)，编号为KFCC 10715。1992年12月12日又请求将原保藏转化为符合国际公认的用于专利程序目的的布达佩斯微生物保藏条约的保藏，保藏号为KCCM 10019。用pYLBC-AG885-α-IFN载体转化的酿酒酵母菌，于1992年12月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M92044。另外该酵母菌于1991年12月17日保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏号为KCTC 0028BP，该保藏符合布达佩斯条约的规定。

含有rhIFN-α-基因的、由表达载体转化的酵母细胞是在能表达rhIFN-α基因的条件下培养。这些培养条件是按载体的特性和受体酵母菌细胞来确定的。

转化酵母生产出的hIFN-α，可结合使用一些常规方法，例如，细胞破碎、离心、透析，盐析出、层析，凝胶过滤，电泳和电洗脱等进行分离和纯化。因此，和天然产品有相同生物活性的hIFN-α可按下述方法高产量获得：在一个含有还原剂的溶液里溶解从酵母细胞中分离出的hIFN-α；在重折叠条件下对还原过的hIFN-α进行重折叠；再将该溶液进行阴离子交换层析洗脱出重折叠rhIFN-α；将该洗脱液进一步进行阳离子交换层析从活性hIFN-α中分离出无活性hIFN-α，用含有氧化硫醇残基和还原硫醇残基的氧化还原剂处理无活性hIFN-α，使之转化为活性hIFN-α。

无活性型的hIFN-α通过用一种氧化还原剂，特别是以一种含有适当比例的氧化硫醇残基和还原硫醇残基的氧化还原剂处理后就能转变为活性型hIFN-α。

在所述的氧化还原剂中，还原硫醇残基的浓度最好约为1-10mM，氧化硫醇残基浓度最好约0.1-1mM。所述的氧化还原剂还包括半胱氨酸和胱氨酸，也包括氧化谷胱苷肽和还原谷胱苷肽。

按上述纯化方法，与人α-干扰素具有相同生物活性的多肽可以高产得以纯化。

下面的实施例企图特别地无限制范围地举例说明本发明；在实施例中使用的试验方法按下述参考例进行实施。

除非特别指出，在下面所给出的在固体混合物中的固体、液体混合物中的液体、液体混合物中的固体的百分数分别按wt/wt，vol/vol和wt/vol来表示。参考例1：用限制性内切酶消化DNA

在此例中使用的限制性内切酶和反应缓冲液均购自NEB(New England Biolabs，U.S.A.)。

这种反应通常在一个灭菌的Eppendorf管中进行，反应体积范围从50至100μl，37℃下进行1-2小时。最后，反应混合物在65℃热处理15分钟(或用酚抽提，乙醇沉淀以防热抗性内切酶)以灭活限制性内切酶。

10x限制性内切酶反应的反应缓冲液的组成如下：

10xNEB反应缓冲液1：100mM双Tris丙烷-HCL，100mM MgCl₂，10mM二硫苏醇(DTT)，pH7.0。

10xNEB反应缓冲液2：100mMTris-HCL，100mM MgCl₂，500mM NaCl，10mM DDT，pH7.0。10xNEB反应缓冲液3：100mMTris-HCL，100mM MgCl₂，100mM DTT，pH7.0。

10xNEB反应缓冲液4：200mM Tris乙酸，100mM乙酸镁，500mM乙酸钾，10mM DDT，pH7.0。参考例2：酚抽提和乙醇沉淀

在酶反应完成以后，反应混合物用酚抽提其目的是灭活酶以及从反应液中提出DNA。但是，抽提用的酚应事先用10mM Tris-HCl(pH 8.0)和1mM EDTA缓冲液预平衡成饱和。酚抽提可通过混合等体积样品和酚，然后剧烈振摇，在15000rpm的转速下离心5分钟，将水相移入一支新管中。上述过程应重复2-3次。

然后，水相用等体积氯仿溶液(氯仿∶异戊醇=24∶1)抽提，再次分离出水相，加入0.1体积的3M乙酸钠和2.5体积的乙醇，于-70℃放置30分钟或-20℃放置12小时后，再用15000rpm于4℃离心20分钟收集核酸。参考例3：连接反应

DNA连接反应是在从NEB购买的T4 DNA连接酶和10x连接反应缓冲液(0.5MTris-HCl，0.1M MgCl₂，0.2M DTT，10mM ATP，0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA))中进行的。反应体积通常为20μl，10单位T4连接酶被用于连接DNA粘性末端，而100单位T4连接酶被用于连接钝性端的DNA。

反应在16℃进行5小时，或在4℃进行14小时以上，反应完成后，反应混合物在65℃加热15分钟以灭活T4 DNA连接酶。参考例4：转化大肠杆菌

下面例子使用的大肠杆菌菌株包括大肠杆菌HB101(ATCC 33694)，大肠杆菌W3110(ATCC 27325)和大肠杆菌JM105(ATCC 47016)。

宿主细胞在100ml LB液体培养基(1％Bacto胰胨，0.5％Bacto酵母浸膏，0.5％NaCl)中37℃培养，直到在650nm处光密度(OD)值达到0.2 5到0.5范围为止。离心分离细胞培养物，然后用50ml 0.1M氯化镁(MgCl₂)溶液冼细胞。离心获得的沉淀细胞丸中加入50ml 0.1M CaCl₂和0.05MMgCl₂溶液，然后置冰浴30分钟。再离心分离细胞并将其悬浮在5ml 0.1M CaCl₂和0.05M MgCl₂溶液中。上述使用的试剂和材料在使用前需冷至0℃。

向上述获得的0.2ml细胞悬液中加入10μl连接反应混合液。这种反应混合液在4℃放置40分钟，然后在42℃加热1分钟。再加入2.0ml LB液体培养基，这样处理的细胞在37℃培养1小时。然后，将其覆盖到一陪替氏培养皿(Petri dish)，该培养皿内装有LB固体培养基和适当的抗生素，例如氨苄青霉素，37℃过夜以获得转化体菌落。

一旦用M13载体转化大肠杆菌，连接一个基因的M13载体DNA被加入到100μl JM105细胞悬液中，15μl 10mM异丙β-thioglactopyranoside，25μl 4％X-Gal和3ml经38℃预热的2x YT软固体培养基(1％NaCl， 1％酵母浸膏，1.6％Bacto胰胨，0.7％Bacto琼脂)。该混合物搅拌后加以2xYT固体培养基上(1％NaCl，1％酵母浸膏，1.6％Bacto胰胨，1.5％Bacto琼脂)，37℃培养过夜获得噬斑。参考例5：寡核苷酸的合成

寡核苷酸的合成可采用自动固相磷胺化学法DNA合成仪(Applied Biosystem Inc.，380B，U.S.A.)来完成。

合成后的寡核苷酸用变性聚丙烯酰胺凝胶(2M脲，12％丙烯酰胺和双叉丙烯酰胺(29∶1)，5omM Tris，50mM硼酸，1mMEDTA-Na₂)电泳和乙腈与水的混合物作为洗脱液的SEP-PAK(Waters Inc，.U.S.A)柱层析进行纯化。在260nm测量OD值确定冼脱液中寡核苷酸的量。参考例6：多聚酶链反应(PCR)

向10-100ng模板DNA混合物中加入10x Taq多聚酶反应缓冲液(10mMTris-HCl，500mM KCl，15mM MgCl₂，0.1％(W/V)明胶，pH8.3)，10μl dNTP混合物(其中每一种dGTP，dATP，dTTP和dCTP为1.25mM)，2μg引物(通常2个引物用于该反应，一旦用3种引物，则位于中间的引物量为0.02μg)和0.5μl Ampli Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，U.S.A.)。用蒸馏水加至总体积为100μl，再加入50μl矿物油以保护反应物免于蒸发。

PCR是用一个热循环仪来进行的，(Perkin Elmer Cetus，U.S.A.)热循环要重复进行25次或更多，循环是这样进行的：95℃1分钟→55℃1分钟→72℃2分钟。最后该反应在72℃进行10分钟。

在反应完成后，用酚抽提反应物，用乙醇沉淀出PCR扩增产物，沉淀物溶解在20μl TE缓冲液中(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5)。实施例1：制备人α-干扰素cDNA(1-A)：从人细胞中制备mRNA<第1步>：从人细胞系KG-1中抽提总RNA

人细胞系KG-1(ATCC CCL246)培养在RPMI 164培养液(Gibco，Cat.430-3400EB，Grand IsIand，New York 14072U.S.A.)2-3天；离心移去培养液(750xg，10分钟)。细胞沉淀丸(约5×10⁷细胞)，悬浮在新鲜RPMI164培养基中，浓度为10⁶细胞/毫升。向该悬浮细胞液中加入1/200体积的200mM J酸钠，混匀后37℃培养48小时，再离心，细胞沉淀丸重新悬浮在新鲜的RPMI 164培养基中。

为了诱导获得的细胞产生hIFN-α mrna，将新城疫病毒(NCD Virus-New Castle disease virus，ATCC VR0107)加入细胞悬液，混匀后于37℃培养12-20小时。上述诱导的约5×10⁷细胞离心沉淀(750xg，10分钟)，细胞沉淀丸用10mM RNAzolB(Cinna/Biotecs，U.S.A.)溶解。向细胞溶解液中加入1ml氯仿，混合物剧烈振荡15秒，在冰浴中放置5分钟，然后在4℃以1200xg离心15分钟，分成水/氯仿两相，上层水相吸出再加入等体积异丙醇。

混合物在4℃放置15分钟，并在4℃经1200xg离心15分钟沉淀出RNA。沉淀的RNA悬浮在200μl用二乙基焦碳酸盐(DEPC)处理过的蒸馏水中，之后立即从中分离出带有Poly(A)⁺尾巴的mRNA(Poly(A⁺)mRNA。<第2步>：Poly(A)⁺mRNA的分离

按下述方法用mRNA分离试剂盒(Stratagene Inc.，Cat.#200348，U.S.A.)进行Poly(A)⁺mRNA的分离。

取在<第1步>中获得的样品200μl在65℃加热5分钟，然后将其置于冰上加入20μl 10x样品缓冲液(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，5.0M NaCl，pH7.5)，将该混合物立即放在一个寡d(T)纤维素柱上以每秒1滴的速率洗脱。然后寡d(T)纤维素柱通过每次加入200μl高盐缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，0.5M NaCl)洗2次，洗脱速度每2秒1滴。用低盐缓冲液(10mMTris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，0.1M NaCl)200μl洗脱出Poly(A)⁺mRNA。被洗脱出的样品用乙醇沉淀，然后溶解在100μl  TE溶液中。(1-B)：cDNA文库的制备<第1步>：cDNA的制备

为了以Poly(A)+mRNA制备cDNA，使用了Zap-cDNA合成试剂盒(StRAtagene Ine.，U.S.A.，Cat.#200400)。以Poly(A)⁺mRNA为模板，含有5’-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCG AG(T)18-3’的核苷酸序列作为寡d(T)引物。

按下述方法制备cDNA的第一股链：取在实施例(1-A)中制备的mRNA液18μl与2μl 0.1 MCH₃HgOH混合，在室温下放置10分钟以使RNA二级结构折叠散开。然后加入2μl 1Mβ-巯基乙醇，进一步在室温下保存5分钟，依次加入5μl反转录酶反应缓冲液(500mMTris-HCl，pH8.3，750mM KCl，30mMMgCl₂ 10mM DTT)，10mM dATP，dGTP，dTTP和5-甲基dCTP各2.5μl，2μl寡-d(T)引物(1.4μg/μl)，15μl用DEPC处理过的蒸馏水和1.0μl RNA酶抑制剂(1单位/μl，Promega Inc.，U.S.A.)。上述混合物置室温中10分钟将引物连接到模板上，然后加入2.5μl Superscript RNA酶H^-反转录酶(180单位/μl，BRL Inc.，Cat.No.8853SA)，反应混合物在37℃培养1小时以合成cDNA的第一股链。

cDNA的第二股链接下述方法进行：在45μl上述第一股链溶液中按顺序加入40μl 10x第二股链缓冲液(188mM  Tris-HCl，pH6.9，906mM KCl，46mMMgCl₂，1.5mM β-NAD(尼酰胺腺嘌呤二核苷酸)，10mM(NH₄)₂SO₄)，分别加入10mM dATP，dCTP，dTTP，和dGTP各6.0μl，以及298μl蒸馏水。最后沿管壁滴入1.0μl RNA酶H(4单位/μl)和10.0μlDNA聚合酶Ⅰ(11单位/μl)。连续振摇后，反应物置16℃培养2.5小时。

在上述反应物中加入等体积的酚一氯仿混合液1∶1)(v/v)抽提3次，其中酚事先已用0.5MTris-HCl(pH7.5)和0.1％(v/v)β-巯基乙醇液饱和过。上部水相吸入另一管中加入0.1体积3M乙酸钠和2体积100％乙醇，-20℃过夜，进一步在4℃1200xg离心20分钟获得cDNA沉淀物。<第2步>：cDNA文库的制备

为了使双股cDNA成为一个钝性末端，在上述<第1步>中制备的cDNA沉淀物溶解在43.5μl蒸馏水中，并取出39μl与5.0μl T4 DNA聚合酶反应液(670mM Tris-HCl，pH8.8，166mM(NH₄)₂SO₄，67mMMgCl₂，100mMβ-巯基乙醇，67μMEDTA)，2.5μl 2.5mM dNTP混合物和3.5μl T4 DNA聚合酶(2.9单位/μl)混合，37℃放置30分钟，用酚-氯仿抽提产品，与<第1步>中相同的方法用乙醇沉淀。

为了分别在5’-末端和3’-末端提供限制性内切酶Eco RI和xho Ⅰ识别位点，钝性末端双股cDNA按下述方法处理：向上述获得的钝性末端cDNA沉淀物中加入7.0μl Eco RI接头(Stratagene Inc.，Zap-cDNA Synthesis Kit Cat.No.200400，U.S.A.)，1.0μl 10x连接缓冲液(500mM Tris-HCl，pH7.8，100mM MgCl₂，200mM DTT，500μg/ml BSA)，1.0μl T4 DNA连接酶(1000单位/μl)和1.0μl 10mMATP。上述混合物置4℃过夜，然后在70℃加热10分钟以灭活连接酶。

这样获得的产品用酚一氯仿抽提，用上述相同方法进行乙醇沉淀，然后将沉淀物溶解在16μl TE缓冲液中。

进一步在上述得到的溶液中加入2μl 10x缓冲液(0.5M NaCl，0.5MTris-HCl，50mM MgCl₂，5mM DTT，pH79)和1μl  EcoRI和1μl xho Ⅰ酶(New England Biolabs.I nc.，U.S.A.)。于37℃放置10分钟以部分消化cDNA。再用酚一氯仿抽提cDNA片段、用上述相同方法进行乙醇沉淀，然后溶解在10μl TE缓冲液中。

所得的cDNA片段按下述方法克隆到UNI-ZAPXR载体上：取10μl用Eco RI-XhoⅠ酶消化的cDNA片段溶液，加入2.0μl 10x连接缓冲液，2.0μl 10mM ATP，4.0μl已经用Eco RI/xhoⅠ酶消化过的载体UNI-ZAPXR溶液(1μg/μl，Stratagene Inc.，U.S.A.)以及2.0μlT₄ DNA连接酶(4Weiss单位/μl)，然后将反应混合物于16℃培养10小时。<第3步>：在体外将含有cDNA的载体装入噬菌体，并增殖cDNA文库。

为了将连接后的DNA装入噬菌体，在<第2步>获得的10μl溶液中加入GigapackⅡ Gold PackagingExtract(Stratagene Inc.，U.S.A.)在室温下静置2小时，然后加入500μl噬菌体稀释液(每1升中含有5.8g NaCl，2.0gMgSO₄·7H₂O，50ml 1M Tris-HCl，pH7.5，5ml 2％明胶)和20μl氯仿(参见Kretz et al.，Nucl. Acid. Res.17，5409(1989))。

按下述方法进行感染和增殖：在LB培养基中培养PLK-F’(Stratagene Inc.，Zap-cDNA合成试剂盒，Cat，#200400)，大肠杆菌merA^-，和merB^-菌株，直到于600nm处OD值(O.D.600)达到0.5为止，沉淀出培养的细胞，然后溶解在10mM MgSO₄中，调整O.D.₆₀₀值到1.0，取600μl这种菌液加入20μl装入的混合物，37℃静止15分钟以允许被装的噬菌体颗粒感染大肠杆菌。再在这种大肠杆菌菌液中加入6.5ml 0.7％溶化并保持在48℃的NZY琼脂(每升中有7g NZ 胺，5gNaCl，2gMgSO₄·7H₂O，5g酵母浸膏，7g Bacto琼脂)，混匀后倒入150mm直径的NZY琼脂平皿上(每升中含有7g NZ胺，5g NaCl，2gMgSO₄·7H₂O，5g酵母浸膏，16g Bacto琼脂)，然后于37℃培养5-8小时以产生噬斑。将10ml噬菌体稀释液倒入平皿中，于4℃轻摇该皿15小时以溶解噬菌体，该液经4000xg离心沉淀出大肠杆菌并弃去。这样获得的cDNA文库液中加入0.3％体积的氯仿，cDNA文库的滴度被检测为10¹⁰至10¹³PFU/ml(噬斑形成单位)，再加入100％二甲基亚砜(DMSO)使最终浓度为7％(v/v)，于-70℃保存cDNA文库。(1-C)：用免疫测定法筛选cDNA文库以及进行cDNA序列的定序。

用Huynh，T.V.et al.，DNA Cloning Techniques APractical Approach(D.M.Glover.ed.)，pp 49-78，IRL Press，Oxford(1985)介绍的免疫筛选法对cDNA文库进行筛选以选出含有IFN-αcDNA的噬菌体。

在实施例(1-B)中制备的cDNA文库液稀释到每150mm直径平皿上5万个PFU，这种被稀释的cDNA文库液与600μl大肠杆菌XL-1蓝(Stratagene Inc.，U.S.A.，Zap-cDNA合成试剂盒，Cat.No.200400)培养物(O.D.600=0.5)混合，该培养物是用同实施例(1-B)中的<第2步>相同的方法制备得到的，然后加入6.5ml 0.7％NYZ琼脂。每种混合液注入-40 NZY琼脂平皿上，于37℃培养12小时，以产生2×10⁶噬菌体噬斑。

进而，将132mm直径的硝酸纤维素滤膜浸在10mM IPTG(isopropyl β-D-thiogalactopyrano-side)溶液中，然后在Whatman 3MM滤纸上吸干，每张滤膜置于一每平皿中的琼脂上，37℃培养3.5小时，然后将印有噬菌斑的每一张滤膜用15ml洗液(10mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，0.05％吐温20)洗膜。将膜浸入15ml封闭液(1％牛血清白蛋白，20mMTris-HCl，pH7.5，150mM NaCl)中，室温下轻轻振荡培养1小时，再用15ml TBST缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，0.05％(v/v)吐温)在室温下5分钟内温和地洗膜5次。再放入15ml经TBS缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，内含1％(w/v)胎牛血清(FBS)100倍稀释过的抗IFN-α抗体液(Cat.#853569；Boehringer Mannheim，U.S.A.)中于室温下轻荡1小时。进一步在室温下用TBST缓冲液轻荡冲洗5次，每次5分钟。将每一张膜放入15ml经用TBS缓冲液(内含1％(w/v)FBS)2000倍稀释过的生物素化山羊抗鼠(biotinylated-goat anti-mouse)IgG和抗生物素蛋白碱性磷酸酶结合物(avidin conjugated-alkaline phosphatease(Pierce Inc.，U.S.A.))，，室温下轻轻振荡1小时。进一步在室温下用TBST缓冲液在5分钟内轻轻地振荡洗膜5次，每张膜用Whatman 3MM滤纸吸干。

为了进行显色反应，每张膜和15ml显色液(100mM Tris-HCl，pH9.5，100mM NaCl，5mM MgCl₂，5mg硝基蓝-四氮唑(nitro blue-tetrazolium)，2.5mg5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐)在暗室中于室温下反应30分钟。可用肉眼确定紫色的阴性噬斑，这就是所期望的表达了编码IFN-αcDNA，每张膜用TBS缓冲液洗一次，加入显色终止液(20mMTris-HCl，pH2.9，1mMEDTA)终止显色过程，然后在室温下将膜干燥，用偏振光胶片记录结果。

分离阴性噬斑，室温下的噬斑置1ml噬菌体稀溶液(10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl₂)中培养1-2小时。重复上述免疫筛选试验以获得作为单一噬斑的菌落。

象获得编码hIFN-α基因一样确定的每一个噬斑放入一个无菌的微渗出管(microfuge tube)，该管中已装有500μl SM缓冲液(每升中含有5.8gNaCl，2.0g MgSO₄，50μl 1MTris-HCl，pH7.5，5ml 2％明胶)。然后加入20μl氯仿，在室温下振荡培养管中内容物1-2小时。将200μl这样获得的溶液(＞1×10⁵噬斑颗粒)，1μl辅助噬菌体R408(＞1×10⁶ PFU/ml)，Stratagene Inc.，U.S.A.)和20μl大肠杆菌XL-1蓝细胞悬液(O.D.₆₀₀=1.0)混合，然后于37℃培养15分钟，再加入5ml2xYT培养基(每升中有10g NaCl，10g酵母浸膏，16g Bacto胰胨)，37℃振荡培养3小时，再在70℃加热20分钟。最后将培养物稀释100倍，取稀释后的培养物200μl与200μl大肠杆菌XL1-蓝细胞(O.D.₆₀₀=1.0)混合，37℃培养1小时后，再由其中取100μl加到合有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养10小时以获得含有双股cDNA的pBluescript噬菌体转染菌落。

为了制备单股DNA，上述获得的pBluescript菌落进一步在含有四环素(12.5μg/ml)的LB琼脂培养基上培养，再次筛选获取阴性菌落，这样获得的单个阴性菌落在一个四环素⁺LB肉汤培养基(2-3ml)中培养过夜，然后再用0.3ml超级液体培养基(3.5g Bacto胰胨，20g酵母浸膏，5g NaCl，用NaOH调整pH至7.5)在37℃振荡培养，用辅助噬菌体R408感染培养物，进一步培养8小时，直至OD600达到0.3。

用Sambrook，J.等(Molecular Cloning，1，2.73-2.81，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))介绍的方法进行重组噬菌体核苷酸的分离和纯化。

用纯化的单股重组pBluescript噬菌体质粒或双股pBluescript噬菌体质粒作为模板，按照Sanger的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.74，5405(1977))使用M13-20聚体，T7引物，KS引物，SK引物或T3引物(Stratagene Inc.，U.S.A.)进行核酸序列测定。从这些序列中推出的氨基酸序列在图1B中。实施例2：用合成的寡核苷酸修饰hIFN-αcDNA的核苷酸序列。

设计和合成下列四个寡核苷酸以便于hIFN-αcDNA表达能够达到最佳程度。这主要是在不改变氨基酸序列的前提下用更适合酵母菌的密码子替代hIFN-αcDNA 5’-末端的密码，同时，以去除能够形成mRNA二级结构的问题，这样可以在转录和转译水平上提高hIFN-α在酵母菌中的表达效率。

用上述寡核苷酸进行PCR反应。在A管中加入2μg IFN1和2μg IFN2，在B管中加入2μg IFN3和2μgIFN4，每一个管中加入100ng在实施例(1-C)中所得到的含hIFN-αcDNA的DNA，10μl 10xTaq聚合酶缓冲液，10μl 10mM dNTP和2.5单位Taq聚合酶；加入蒸馏水调整总体积到100μl。按参考例6的方法进行第1次PCR之后，从每一个A管和B管中有大约250bp的PCR产物(PCR产物A和产物B)用乙醇沉淀出。

进一步，在上述相同条件下用PCR产物A和产物进行第2次PCR，可获得大约510bp核酸片段，称为IFN-Y。实施例3：rhIFN-α基因克隆到M13mp18载体及其核苷酸序列的测定。

在实施例2中获得的含有IFN-Y的TE缓冲液10μl(约2μg核酸)中加入3μl 10xNEB缓冲液3，16μl蒸馏水和1μl限制性内切酶SalⅠ(20单位/μl)；混合物在37℃反应一个多小时，在5％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离出510bp消化片段，该分离片段用Elutip-D(Schleicher＆Schuell，U.S.A.)进行纯化。纯化片段称为IFN-L，并在用于连接之前溶于10μl蒸馏水中。

另一方面，双股M13mp 18 DNA(New England Biolabs，U.S.A.)用限制性内切酶SmaⅠ和SalⅠ消化，在纯化状态下分离片段，在2μl 10x连接缓冲液(660mM/M Tris-HCl，pH7.6，66mM MgCl₂，100mM DTT)，2μl100mM ATP，2μl(0.2μg)IFN-L，1μl(约0.1μg)M13mp 18 DNA(已用SmaⅠ和SalⅠ消化)和12μl蒸馏水混合物中加入1μl T4 DNA连接酶；16℃反应5小时，然后，将上述反应物10μl与大肠杆菌JM105(ATCC 47016)反应，使大肠杆菌被转化，采用的方法是Hanahan法(刊载在J.Mol.Biol.116，557(1983))。

向上述处理过的大肠杆菌细胞混合物中再加入7.5μl 0.2 M IPTG，再与3ml 2xYT软琼脂培养基(每升中有16g Bacto胰胨，10g酵母浸膏，5g NaCl，6g Bacto琼脂)和25μl 4％X-gal溶液混合，平辅在Min A固体培养基上(每升中含有10.5gK₂HPO₄，4.5g KH₂PO₄，1g(NH₄)₂SO₄，0.5g柠檬酸钠，12g Bacto琼脂，1ml 20％MgSO₄，0.5ml 1％维生素B和10ml葡萄糖)，37℃培养过夜。

这样获得的噬斑，按照Sambrook，J.等人的方法(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor，N.Y. (1989))挑选出来并用来得到一个单股核酸。重组hIFN-α基因的核苷酸序列用双脱氧DNA测序方法(Sanger，F et al.，P.N.A.S.，84 4767(1987))来确定；在图1A中有这段序列的rhIFNA-α基因被选出；含有所述核苷酸序列的M13mp18，被命名为M13mp18-IFN-α。实施例4：表达载体的制备(4-A)：Luck-α-IFN-1Y载体的制备

用限制性内切酶PstⅠ和SalⅠ在NEB缓冲液3中将约2μg pYLBC-GAP-HGH质粒(韩国公开的专利第90-9975号)完全消化，用限制性内切酶PstⅠ和Bst BⅠ在NEB缓冲液4中完全消化另外2μg所述的质粒。每一种被消化的质粒都通过0.7％琼脂糖凝胶分离出约9.8Kb和3.4Kb的片段，并分别被称为PL和PB片段。

含有在实施例3中获得的rhIFN-α基因的M13mp18-IFN-α载体约5μg用限制性内切酶XbaⅠ和SalⅠ在NEB缓冲液3中完全消化，然后用氯仿-酚抽提，乙醇沉淀。沉淀出的核酸(这里称为IFN-X/L)溶解在10μlTE液中。

用上述获得的片段进行连接反应；同时使用一个合成的连接子。(5’-TCGAATAAACACACATAAACAAACACCATGTGTGATCTGCCTCAAACTCACAGCCT

3’-TATTTGTGTGTATTTGTTTGTGGTACACACTAGACGGAGTTTGAGTGTCGGA-GGGTT-3’-CCCAAGATC-5’)。

给一支试管中加入200ng IFN-X/L片段，50ng连接子，100ng PL片段，100ngPB片段，2μl 10x连接反应缓冲液，10单位T4 DNA连接酶，再加入蒸馏水使总体积为20μl，置16℃培养12小时。这样获得的含有rhIFN-α的表达载体称为Luck-α-IFN-1Y。上述过程在图3A中表示出。(4-B)：pYLBC-AG885-α-IFN表达载体的制备<第1步>：合成引物和进行PCR

ADH2(5’-TCTCCAACTTATAAGTTGGAGA-3’)启动子的UAS，GAPDH启动子的TATA盒和含有在hIFN-α基因5’-端核序列的111bp DNA，连同下述的二个启动子ADHGAP和GAPIFN用PCR。

合成如下引物：

1、ADHGAP引物

     5’-AGACGGATCCTCCTCTGCCGGAACACCGGGCATCTCCAACTTATAATGTTGGAGAAATAAGAGAATTTCAGATTGAGAGAATGAAAAAAAAAAACTGAAAAAAAAGGTTGAAAC-3’

2、GAPIFN引物

     5’-TTCTTCTAGAACCCAGGCTGTGAGTTTGAGGCAGATCACACATGGTGTTTGTTTATGTGTG-3’

ADHGAP引物由114个碱基组成，在5’-端第94个碱基含有一个Bam-HI识别位点和ADH2启动子的UAS，其余部分序列能够被连接到GAPDH启动子上(GAPDH的第198至第178个碱基上)。

GAPIFN引物含有一个限制性内切酶的XbaⅠ的识别位点，一个hIFN-α基因的启始密码子以及在3’-端处的一段GAPDH启动子序列(含有18个碱基，从第1至第18位)(Holland，et al.，J.Biol.Chem.254，9839-9845(1979)；Bitter et al.，Gene 32，263-274(1984)。

这两种引物的结构如下：

ADHGAP引物

GAPIFN引物

使用所述的两种引物和含有GAPDH启动子(ATCC 74119，参见韩国专利申请号91-25882)的pYLBC5质粒作为模板，按下述方法进行PCR。

给10ng至100ng作为模板的pYLBC5质粒DNA，10μl 10xTaq多聚酶缓冲缓(10mM Tris-HCl，pH8.3，500mMKCl，15mM MgCl₂，0.1％(w/v)明胶)，10μl dNTP混合物(1.25mMdGTP，dATP，dTTP和dCTP)，2μgADHGAP引物，2μg GAP IFN引物和0.5μl Amp li Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，U.S.A.)组成的混合液中加入蒸馏水，使终体积达到100μl，另再加50μl矿物油防止蒸发。用热循环仪进行最初的PCR(Perkin Elmer Cetus，U.S.A.)，按下列热循环程序重复进行25次：90℃1分钟，55℃1分钟，70℃2分钟，最后于70℃放置10分钟。

向上述反应液中加入等体积酚/氯仿，离心除去聚合酶。上清液被移入一支新试管，然后加入1/10体积3M乙酸钠和2.5体积100％乙醇。离心分离混合物以获得320bpDNA片段，称为AG885。将该核酸溶解在20μl TE缓冲液(10mMTris-HCl，pH7.5，1mM EDTA)待下步使用。<第2步>：消化pYLBC5质粒

用限制性内切酶PstⅠ和SalⅠ在NEB缓冲液3完全消化2μg pYLBC5质粒。用同样方法再完全消化另外2μg pYLBC5质粒。消化后，每一种质粒片段用0.7％琼脂糖凝胶电泳分离出约9.84kb和3.0kb片段，分别称为PK和PS。<第3步>：分离rhIFN-α基因片段

由实施例3中获得的含有rhIFN-α基因的M13mp 18-IFN-α载体约5μg用限制性内切酶XbaⅠ和SalⅠ在NEB缓冲液3中进行完全消化再行琼脂糖凝胶电泳，从而获得约450bp rhIFN-α基因片段，称为IFN-XL。

在上述<第1步>获得的AG885片段约2μg用限制性内切酶XbaⅠ和BamHⅠ在NEB缓冲液3中完全消化后，进一步用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。将沉淀所得的核酸片段(这里称为AG885-X/B)溶解在10μl TE液中。<第4步>：制备pYLBC-AG885-α-IFN质粒

对<第2步>和<第3步>获得的片段按下述方法进行连接。在一支试管中加入200ng IFN-X/L片段，200ng AG885-X/B片段，100ng PK片段，100ng PS片段，2μl10x连接缓冲液和10单位T4 DNA连接酶。然后加蒸馏水至终体积20μl，混合物在16℃反应12小时。上述过程在图3B中给出。实施例5：用表达载体转化酵母菌，从而进行rhIFN-α基因的表达(5-A)：用Luck-α-IFN-1Y转化酵母菌并表达rhIFN-α基因

在实施例(4-A)中获得的重组质粒Luck-α-Y用碱溶法(Ish-Horowicz，D.，et al.，Nucl.Acid Res.9，2989(1981))大量抽提以用于下列转化过程。用质粒转化酵母菌是用Veges(Nature 275，104(1978)和Hinnen(P.N.A.S.75 1929(1978))介绍的方法进行。

用已经过夜培养的S.cerevisiae酵母菌DCO4(Yeast Genetic Stock Center，Department of Biophysics and Medical Physics，University of California，，CA 94720，U.S.A.)接种到50ml新鲜YEPD培养基，在30℃下振荡培养直到于650nm处O.D值达到0.8到1.0为止。然后以5000rpm离心5分钟分离出细胞。沉淀细胞悬液在20ml水中，离心，再悬浮在20ml 1M山梨醇溶液中，进一步重新离心分离。

沉淀细胞丸溶解在5ml SP(1M山梨醇，50mM磷酸钠，pH7.5)和5μl 1M DTT；然后加入50μl xymolase(10mg/ml溶于50％甘油/50％SP中)。30℃以150rpm的转速振荡培养30分钟。在培养期间可取出少量培养物用1/10体积的0.1％SDS处理；在光学显微镜下检查原生质球(Spheroplast)形成的程度，直到至少大约90％酵母细胞转为原生质球，通常30分钟就停止培养。在完成培养后，该培养物用Dynac离心机以1500rpm离心3分钟以获得原生质球。这样得到的原生质球用5ml 1M山梨醇和5mlSTC(1M山梨酵，10mM CaCl₂，10mM Tris-HCl，pH7.5)洗涤，最后溶解在1ml STC以备Luck-α-IFN-1Y转化用。

在12.5μl 5-10μg质粒核酸与12.5μl 2x STC的混合液中加入50μl原生质球，然后在室温下培养10分钟，再往其中加入500μlPEG/TC溶液(40％PEG-4000，10mM CaCl₂，10mM Tris-HCl，pH7.5)静置10分钟后，用Dynac离心机以1500rpm离心13分钟分离出原生质球。沉淀的原生质球再溶解在200μl 1M山梨醇溶液中。

含有原生质球的溶液与7ml再生琼脂(每100ml中含有3g Bacto琼脂，50ml 2M山梨醇，0.67g无氨基酸的酵母氮碱基，0.1g无亮氨酸的氨基酸混合物，0．4ml 50％葡萄糖，45ml水)，将该混合液倒入一个缺乏亮氨酸的琼脂平皿中(1.82g山梨醇，20g Bacto琼脂，6.7g无氨基酸的酵母氮碱基(Difco，U.S.A.)，0.25g Leu-补充剂，4ml 5％苏氨酸，40ml 50％葡萄糖和820ml水)，于30℃培养3-5天以得到用重组质粒Luck-IFN-α-1Y转化的酵母菌落。

每一个转化的酵母菌菌落应在3ml缺乏亮氨酸的培养基中(每升中含6.7g无氨基酸的酵母氮碱基，0.25g无亮氨酸的氨基酸混合物和6％葡萄糖)于37℃培养24小时，然后将培养物接种到100mlYEPD培养基(2％胰胨，1％酵母浸膏，2％葡萄糖)进一步在30℃培养24小时。

培养物的最终OD值(650nm处)约为25，对应于10个OD值的培养物量进行离心，溶解在400μl缓冲液中(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，2mM PMSF，8M脲)。再向该溶液中加入等体积0.4mm直径大小的玻璃珠，剧烈搅拌以破坏细胞壁。10μl这样获得的酵母提取物按Laemmli等介绍的方法(Nature 277，680(1970)在15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并用考马斯亮兰(Coomassie Brilliant Blue)R250染色以确定基因产品的表达情况。结果显示在图4A中。

在图4A中，第1和第2行均显示含有Luck-α-IFN-1Y表达载体的酵母细胞的提取物；第3行显示不含有表达载体的酵母细胞提取物；第4行表示出标准蛋白大小标志，从上至下分子量分别为43kd，29kd，18.4kd，6.5kd和3.8kd。(5-B)：用pYLBC-AG885-α-IFN表达载体转化酵母菌和rhIFN-α基因表达

在实施例(4-B)中获得的重组质粒pYLBC-AG885-α-IFN可通过碱溶法(Ish-Horowicz，D，et al.，Nucl，Acid Res9，2989(1981)大量制备以用于转化。

实施例(5-A)的转化过程可用pYLBC-AG885-α-IFN质粒替代Luck-α-IFN-1Y质粒重复进行以获得用pYLBC-AG885-α-IFN重组质量转化的酵母菌落。

转化的酵母菌在3ml缺乏亮氨酸的培养基中(每升中含6.7g无氨基酸的酵母氮碱基，0.25g无亮氨酸的氨基酸混合物和6％葡萄糖)30℃培养24小时。然后，该培养物接种到100ml YEPD培养基中(2％胰胨，1％酵母浸膏，2％葡萄糖)并在30℃培养24小时。

该培养物最终OD值(650nm处)大约是25，对应于10个OD值的培养物量离心后溶解在400μl缓冲液中(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，2mM PMS F，8M脲)。向该培养液中加入等体积的直径为0.4 mm的玻璃珠，剧烈搅拌破碎细胞壁。取这样获得的酵母抽提物10μl按Laemmli等介绍的方法(Lature 277，680(1970))进行15％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，再用考马斯亮兰R250染色，以确定基因产品的表达，结果显示在图4B中。

在图4B中，第1行表示不含有pYLBC-AG885-α-IFN表达载体的酵母细胞提取物，第2行和3行表示含有pYLBC-AG885-α-IFN表达载体的酵母菌在培养4小时后的菌体提取物，第4和第5行表示含有pYLBC-AG885-α-IFN在培养48小时后的菌体提取物，第6行表示标准蛋白大小标志，从上至下分子量分别为43kd，29kd，18.4kd，14.3kd，6.5kd和3.3kd。实施例6：纯化酵母菌生产的hIFN-α(6-A)：破碎酵母转化体培养物

在实施例(5-B)中获得的用重组质粒Luck-α-IFN-1Y转化的能表达hIFN-α酵母菌1kg悬浮在缓冲液(20mM Tris-HCl，1M脲，1mM EDTA，1mM PMSF，pH8.0)匀浆器(Beckman)混匀，然后以每分钟750ml的速度用装有0.5-0.75mm直径玻璃珠的珠磨破碎仪(Biospec Product，U.S.A.)处理。将含有破碎的酵母菌溶液在4℃以12000rpm离心50分钟(Beckman JA-14，Rotor)，上清液弃去，收集沉淀物并悬浮在2升缓冲液(20mMTris-HCl，1M脲，1mM EDTA，0.1％Triton X-100，pH 8.0)中，用匀浆器(Beckman)混匀，悬液进一步用离心机(BeckmanJA-14，Rotor)以12000rpm离心50分钟，分离出沉淀，收集的沉淀物再悬浮在2升1M盐酸胍溶液(Amresco)用匀浆器混匀后以12000rpm离心30分钟，分离出大约600g沉淀物。(6-B)：溶解在胍溶液中的蛋白沉淀物在实施例(6-A)中获得的600g沉淀物溶于1.8升6M胍溶液(6M盐酸胍，20mMTris-HCl，100mM β-巯基乙醇，pH8.0)中，4℃搅拌过夜。该溶液用离心机(Beckman JA-14Rotor)在4℃以12000rpm离心除去沉淀定，大约收集到2.1升深棕色上清液，用缓冲液(20mMTris-HCl，0.1mM PMSF，pH 8.0)稀释4倍，离心得到上清液，该上清液用超滤膜浓缩到2升。然后，将该浓缩液对50升缓冲液(20mMTris-HCl，0.12 M NaCl，0.1mMPMSF，pH8.0)在4℃透析3次。(6-C)：DEAE-纤维素柱层析

将实施例(6-B)获得的溶液在4℃以12000rpm离心30分钟(Beckman JA-14 Rotor)以弃去沉淀物，收集的上清液上样到DEAE-纤维素基质柱(Whatman)上，该柱事先已用缓冲液(20mM Tris-HCl，0.12M NaCl，0.1mMPMSF，pH8.0)以10cm/hr速度平衡过。将通过该柱而没有吸附到柱内基质上的蛋白溶液用50升缓冲液(50mM乙酸钠，pH4.5)透析3次。

透析过的蛋白溶液在4℃以12000rpm离心30分钟(Beckman JA-14 Rotor)除去沉淀。(6-D)：CM-葡萄糖柱层析

将实施例(6-C)中获得的透析过的蛋白溶液(pH4.5)加样到事先以15cm/hr速率用缓冲液(50mM乙酸钠，pH4.5)平衡过的CM-Sepharose基质柱中。该柱用相同缓冲液洗到未结合到基质上的蛋白峰降到足够低时，用另一种缓冲液(50mM乙酸钠，0.13M NaCl，pH4.5)进行洗脱结合在基质上的蛋白质。当这时出现的蛋白峰降低时，可改用另一种缓冲液(50mM乙酸钠，0.5MNaCl，p-H4.5)进一步进行洗脱过程。CM-Sepharose层析的结果以280nm处的OD值来表示，已列在图5中。

在图5中，暗杠(a)表明含有部分氧化的hIFN-α洗脱组份；暗杠(b)表明主要含活性型的与天然hIFN-α的单体hIFN-α洗脱组份；暗杠(c)表示主要含有双聚体hIFN-α的洗脱组份。部分氧化的hIFN-α，活化型hIFN-α和双聚体hIFN-α按顺序依次洗脱出。为了完全从hIFN-α中移出部分氧化的hIFN-α和双聚体hIFN-α，对应于杠(b)洗脱组分液加样到CM-Sepharose柱层析，从而获得高纯活性型单体hIFN-α。

如果必要，用凝胶渗透层析可进一步进行纯化。

上述获得的蛋白溶液以3cm/hr的流速通过S-300(Pharmacia)柱，该柱事先已用缓冲液(20mM乙酸铵，0.12MNaCl，pH4.5)平衡过。洗脱出的各种收集组份加样进行非还原SDS-PAGE，只有含活性型单体hIFN-α的，量并不大的寡聚hIFN-α组分被收集到。该收集的蛋白溶解液对20升PBS缓冲液透析3次。(6-E)：将无活性的hIFN-α转化为活性型

在实施例(6-D)中所得到的双聚体hIFN-α(图5(C))经15％非还原SDS-PAGE鉴定后，收集并对20mM Tris-HCl(pH8.0)透析。

在上述透析过的溶液中加入半胱氨酸(Sigma)和胱氨酸(Sigma)使终浓度分别为5mM和0.5mM，搅拌后在4℃或室温下静置5个多小时。将该溶液上样进行SDS-PAGE以确定二聚体转化为单体。结果，将溶液对缓冲液(50mM乙酸钠，pH 4.5)进行透析。图6显示15％非还原SDS-PAGE在未转化前二聚体hIFN-α(a)和转化成单体hIFN-α(b)的结果。

相同的结果也通过用氧化谷胱甘肽和还原谷胱甘肽获得过。

透析样品，采用与实施例(6-D)相同的方法加样到CM-Sepharose柱层析和凝胶渗透层析可获得高纯活性型单体hIFN-α。

在实施例(6-D)中获得的部分氧化hIFN-α(图5中的(a))可采用上述相同的转化步骤而获得活性型hIFN-α。(6-F)：hIFN-α的生物活性测定

纯化的hIFN-α的生物活性可以通过hIFN-α抗病毒的抗致细胞病变活性来确定。

雄牛犊肾细胞悬液(MDBK，3.5×10⁵细胞/ml)在T75瓶中培养后，分别以每孔100μl加入到96孔平底板孔中，在5％CO₂培养箱中于37℃培养18-24小时。100μl水泡性口膜炎病毒(1×10⁵至4×10⁵PFU/ml)接种到用PBS缓冲液(pH7.0)洗过的板孔中，进一步在5％CO₂培养箱中37℃培养18-24小时以形成细胞单层。在实施例(6-D)和(6-E)中获得的hIFN-α样品，每一种100μl按顺序稀释后加入板孔内，在5％CO₂培养箱中37℃培养48小时。最后，每孔中加入结晶紫染液，测定其O.D.600值。

用Lowry方法测定hIFN-α中的蛋白浓度，从美国国立卫生研究院(NIH)获得的hIFN-α标准品(Gxa-01-901-535)特异性活性为2.0×10⁸IU/mg。

活性测定结果表明在实施例(6-D)和(6-E)中获得的单体hIFN-α都有1.8×10⁸IU/mg或更高的特异性活性。据此，从双聚体hIFN-α和部分氧化hIFN-α转化的hIFN-α具有与开始从CM-Sepharose层析中获得的活性型单体hIFN-α相等的生物学活性。(6-G)：反相HPLC

进行反相HPLC主要是确定在实施例(6-D)和(6-E)中获得的hIFN-α之间的同一性。

每种蛋白样品通过预先以0.8毫升/分的速度用16％(v/v)乙腈(16％乙腈/0.05％三氟乙酸/H₂O)平衡过的RP-318柱(Hi-Pore，Bio-kad)，并用相同溶液洗涤5分钟。加样后分别在5分钟和50分钟后洗脱液的快速线性梯度达到44％(v/v)乙腈，缓慢线性梯度达到60％(v/v)乙腈。图7显示该结果，在同一位置洗脱出每个蛋白峰，据此可以证实，用上述两种方法获得所述的hIFN-α从生理化学角度讲与天然hIFN-α是相同的。

虽然按上述特别具体化的说明了本发明，但还应该认识到可能作了各种修饰和改变。这些可能对那些本领域普通技术人员来说是明显的，也可能落入像权利要求所限定的本发明范围之中。

Claims (13)

1、制备具有如下核苷酸序列的用于在酵母中生产人α-干扰素的重组人α-干扰素基因的方法，包括如下步骤：用由酵母优选的密码子组成并使二级mRNA结构的形成最小化的序列替换用从人细胞分离的mRNA制备的人α-干扰素cDNA的5′-末端区80bp；并在编码第12-13、25-27、63-65和88-89位氨基酸的密码子中引入XbaⅠ、HindⅢ、BalⅡ和SacⅠ识别位点，在N-末端氨基酸的密码子之前引入起始密码子ATG，以及在成熟野生型人α-干扰素的C-末端氨基酸之后引入两个终止密码子TAA和TAG：

                                     30

ATG TGT GAT CTG CCT CAA ACT CAC AGC CTG

                                     60

GGT TCT AGA AGA ACC TTG ATG TTG CTA GCT

                                     90

CAA ATG AGA AAG ATA AGC TTG TTC TCC TGC

                                    120

TTG AAG GAC AGA CAT GAC TTT GGA TTT CCC

                                    150

CAG GAG GAG TTT GGC AAC CAG TTC CAA AAG

                                    180

GCT GAA ACC ATC CCT GTC CTC CAT GAG ATG

                                    210

ATC CAG CAG ATC TTC AAT CTC TTC AGC ACA

                                    240

AAG GAC TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC

                                    270

CTC CTA GAC AAA TTC TAC ACT GAG CTC TAC

                                    300

CAG CAA CTG AAT GAC CTG GAA GCC TGT GTG

                                    330

ATA CAG GGG GTG GGG GTG ACA GAG ACT CCC

                                    360

CTG ATG AAG GAG GAC TCC ATT CTG GCT GTG

                                    390

AGG AAA TAC TTC CAA AGA ATC ACT CTC TAT

                                    420

CTG AAA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC

                                    450

TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA

                                    480

TCC TTT TCT TTG TCA ACA AAC TTG CAA GAA

AGT TTA AGA AGT AAG GAA TAA TAG

2、制备用于在酵母中表达根据权利要求1的方法制备的重组人α-干扰素基因的表达载体的方法，包括：将包含所述基因的DNA片段插入在酵母中可操作的载体中，从而该片段可在酵母中表达。

3、如权利要求2所述的方法，其中所述的表达载体是Luck-α-IFN-1Y，其包含在CCTCC No.M92043的保藏物中。

4、如权利要求2所述的方法，其中所述的表达载体是pYLBC-AG885-α-IFN，其包含在CCTCC No.M92044的保藏物中。

5、制备用根据权利要求2的方法制备的表达载体转化的酵母细胞的方法，包括将所述表达载体导入酵母细胞，并在合适的选择培养基上选择转化子。

6、如权利要求5所述的方法，其中表达载体是Luck-α-IFN-1Y，酵母是酿酒酵母。

7、如权利要求5所述的方法，其中表达载体是pYLBC-AG885-α-IFN，酵母是酿酒酵母。

8、生产由下述核苷酸序列编码的人α-干扰素的方法，包括培养根据权利要求5的方法制备的酵母细胞：

                                     30

ATG TGT GAT CTG CCT CAA ACT CAC AGC CTG

                                     60

GGT TCT AGA AGA ACC TTG ATG TTG CTA GCT

                                     90

CAA ATG AGA AAG ATA AGC TTG TTC TCC TGC

                                    120

TTG AAG GAC AGA CAT GAC TTT GGA TTT CCC

                                    150

CAG GAG GAG TTT GGC AAC CAG TTC CAA AAG

                                    180

GCT GAA ACC ATC CCT GTC CTC CAT GAG ATG

                                    210

ATC CAG CAG ATC TTC AAT CTC TTC AGC ACA

                                    240

AAG GAC TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC

                                    270

CTC CTA GAC AAA TTC TAC ACT GAG CTC TAC

                                    300

CAG CAA CTG AAT GAC CTG GAA GCC TGT GTG

                                    330

ATA CAG GGG GTG GGG GTG ACA GAG ACT CCC

                                    360

CTG ATG AAG GAG GAC TCC ATT CTG GCT GTG

                                    390

AGG AAA TAC TTC CAA AGA ATC ACT CTC TAT

                                    420

CTG AAA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC

                                    450

TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA

                                    480

TCC TTT TCT TTG TCA ACA AAC TTG CAA GAA

AGT TTA AGA AGT AAG GAA TAA TAG

9、如权利要求8所述的方法，其中所述的酵母细胞是保藏号为CCTCC NO：M92043的酿酒酵母DC04 Luck-α-IFN-1Y或保藏号为CCTCC NO：M92044的酿酒酵母DC04 pYLBC-AG885-α-IFN。

10、一种纯化酵母细胞生产的人α-干扰素的方法，包括将无活性形式的人α-干扰素转化为活性形式的人α-干扰素的步骤，该方法包括：

(A)溶解酵母细胞产生的人α-干扰素，溶液中含有一种还原剂，然后在重新折叠条件下控制已还原的人α-干扰素；

(B)将上述含有重折叠的人α-干扰素的溶液进行阴离子交换层析以分离出已重折叠的人α-干扰素；

(C)将上述已重折叠的人α-干扰素进行阳离子交换层析，从有活性的人α-干扰素分离出无活性的人α-干扰素；

(D)用含有氧化巯基和还原巯基的氧化还原试剂处理无活性人α-干扰素，使其转化为活性型。

11、如权利要求10所述的方法，其中所述的氧化还原试剂含有1-10mM还原巯基和0.1-1mM氧化巯基。

12、如权利要求10所述的方法，其中所述的氧化还原试剂包括胱氨酸和半胱氨酸。

13、如权利要求10所述的方法，其中所述的氧化还原试剂包括氧化谷胱甘肽和还原谷胱甘肽。

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