CN1072720C - 鸡生长激素基因及其在大肠杆菌中的表达 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了鸡生长激素基因和它的表达方法以及表达的鸡生长激素的纯化，特别是涉及了一个能在大肠杆菌中大规模生产激素的CGH基因，用所述表达载体转化的大肠杆菌的方法，以及用大肠杆菌转化细胞生产鸡生产激素的方法和纯化大肠杆菌细胞生产的鸡生产激素的方法。

Description

鸡生长激素基因及其 在大肠杆菌中的表达

本发明涉及一个鸡生长激素基因和它的表达以及表达的鸡生长激素的纯化。更具体的是指本发明涉及一个可用于在大肠杆菌中进行大量生产鸡生长激素的鸡生长激素基因，用此基因构建的表达载体，用此表达载体转化的大肠杆菌细胞，以及用此大肠杆菌转化体生产鸡生长激素的方法和纯化由大肠杆菌生产鸡生产激素的方法。

到目前为止，在家畜育种中，通过在常规饲料中混入高蛋白物质或类固醇激素而大大提高了饲料利用率并使家畜体重增加，然而，高蛋白物质的来源是有限的，使用类固醇激素由于其在动物体内长时期残留，可能会对人体产生一定的副作用，因而已被严格控制。

相比之下，近期已被开发出来的动物生长激素却不残留在动物体内，而且具有种特异性，因此被认为对人类是无害的。据此，动物生长激素被认为在促进动物快速生长方面是一种理想的材料。

动物生长激素是一种单股链球蛋白，大约由190至200个氨基酸组成(参见：Barrinton等，Academic Press,N.Y.,2(1979))，它是参与调节脂类和碳水化合物以及蛋白质新陈代谢从而促进动物组织生长的几种蛋白质激素之一。

在动物脑垂体前叶产生的生长激素是从在氨基端含有一段信号顺序的生长激素前体中成熟而得。生长激素前体当通过内质网时经切去一段信号序列就成为成熟的功能性生长激素(Davies等，Nature283,433-438(1980))。

生长激素通过促进氨基酸进人细胞内而加快动物的平衡生长，同时刺激mRNA的转译，促使细胞的分裂增殖，这对于生长是一个非常重要的因素。因而，注射生长激素的动物在没有增加饲料量作为提高组织蛋白质的手段时，体重仍提高得很快。

目前大多数动物生长激素的全序列氨其酸顺序已经确定，也有一些动物生长激素基因已经在大肠杆菌中克隆和表达，例如人、牛、猪和大鼠(Miller等，JBC255,7521-7524；Martial等，Science205,602-607(1979)；Seeburg等，Nature270,486-494(1977))。可是到目前为止仍不可能应用基因工程的方法在大肠杆菌中大规模地生产鸡生长激素。

在大肠杆菌转化体中生产的鸡生长激素常常形成一个包涵体，因而应将其包涵体溶解才能从大肠杆菌转化体中分离出鸡生长激素。然而，已知有几种溶解方法，例如，使用脲、胍盐或十二烷基硫酸钠(Sodium dodecylsulfate)等，但它们都有与如下因素有关的某些缺陷，如纯化费用高，纯化过程过于复杂以及产量低等。

此外，还有一些纯化方法，例如，单克隆抗体亲和层析法(B.Houston等.，J.Endocr.125,207-215(1990))和阴离子、阳离子交换层析的联合应用(L.M.Souza等，J.Exp.Zoology,232,465-474(1984))。可是，单克隆抗体亲和层析法因生产单克隆抗体成本费用很高，不适宜大规模纯化。Souza的方法高度复杂，还有要除去大肠杆菌源的热源物质的问题。

本发明的目的是提供一个被设计成能在大肠杆菌中有效表达和能用于大规模生产鸡生长激素(CGH)的鸡生长激素基因。

本发明的另一个目的是提供一种含有所说的CGH基因的表达载体和用该载体转化的大肠杆菌细胞。

本发明的进一步目的是提供一种用大肠杆菌转化体生产CGH的方法。

本发明的另一个目的是提供一种有效分离和纯化在大肠杆菌转化体上生产的CGH的方法，在该方法中主要采用了用碱试剂溶解在大肠杆菌细胞内产生的CGH包涵体。

相应地，与本发明的一个方面是在图1示出了CGH基因的核苷酸序列，该序列被设计成能在大肠杆菌中生产成熟CGH。

本发明的另一个方面是提供一个含有所述CGH基因的表达载体和用该载体转化的大肠杆菌细胞。

本发明还有一个方面是提供一个在大肠杆菌转化体上生产CGH的方法，这主要是在适合表达CGH基因的培养条件下培养大肠杆菌转化体而获得CGH。

为本发明另一个方面是提供一种纯化CGH的方法，它包括：从生产鸡生长激素的大肠杆菌转化体中分离不溶性包涵体；用含有表面活性剂和乙二胺四乙酸(EDTA)的溶液洗不溶性包涵体，然后，进一步用含有NaCl的缓冲液或蒸馏水洗；在一种碱性溶液中悬浮已洗过的包涵体以溶解集聚在包涵体内的CGH；离心该悬液收集上清液，进行超滤，滤液中即含有溶解的CGH；再通过一个阳离子交换树脂层析柱。

本发明的CGH基因是以L.M.Souza等(J.of Exp.Zoology232,465-473(1984))所描述的氨基酸序列为基础设计出来的，具体如下：

(ⅰ)在成熟CGH的N一末端氨基酸苏氨酸密码之前放人一个甲硫氨酸的起始密码。

(ⅱ)在成熟CGH的C-末端氨基酸异亮氨酸的密码后放人两个终止密码TAG和TAA以便转译时在异亮氨酸处终止。

(ⅲ)几种限制性内切酶的识别位点被引入该基因以便使修饰该基因方便些，这些位点为：SacⅠ(5′-GAGCTC-3′，含有第17位氨基酸精氨酸的密码)，EcoRⅠ(5′-GAATTC-3′；含有第31位氨基酸谷氨酸的密码)，BalⅡ(5′-GAGTCT-3′；含有第115位氨基酸天冬氨酸的密码)，和HindⅢ(5′-AAGCTT-3′；含有第121位氨基酸谷氨酰胺的密码)；以及，

(ⅳ)能够形成二级结构的核苷酸序列或亚序列通过替代某些核苷酸而加以修饰，这样可使CGH的表达在转录和转译水平达到最佳状态。

CGH基因的全部核苷酸序列可按已知的常规方法，如用DNA合成仪或聚合酶链反应(PCR)，进行合成而得。

本发明用于在大肠杆菌表达所述的CGH基因的表达载体可通过使用能够适应大肠杆菌的各种表达系统来制备。

例如，可使用ptrp322H-HGH载体来制备，该载体在韩国公开专利出版物No.91-457中有描述(含有所述的ptrp322H-HGH载体的宿主细胞大肠杆菌W3110已经保藏于韩国微生物菌种保藏中心，代号为KFCC-10667)。具体说就是该载体制备是用在图1中所示的CGH基因替换在ptrp322H-HGH中的人生长激素基因，这将在后面的实施例中加以描述。

这样获得的含有CGH基因的表达载体被命名为ptrp-CST。由此转化的大肠杆菌W3110(ATCC27325)为专利程序目的按国际微生物保藏布达佩斯条约于1991年6月26日保藏在韩国微生物菌种保藏中心，编号为KCCM-10005。

用含有CGH基因的表达载体转化的大肠杆菌细胞在能够使CGH基因表达的条件下培养，进一步按载体和大肠杆菌受体细胞的特征进行确定。

例如，用ptrp-CST表达载体转化的大肠杆菌W3110细胞在含有氨苄青霉素的M9培养基中培养，当在650nm下光密度值(OD)达到0.5时，加入吲哚丙烯酸继续培养。

在大肠杆菌转化体内生产的CGH可通过一系列步骤进行分离和纯化，这些步骤包括细胞破裂、离心、溶解，调pH至碱性，过滤和层析。

具体讲就是通过在培养好的细胞内加入溶菌酶再进行超声以破碎细胞。破碎的细胞离心沉淀，收集合有CGH包涵体的沉淀物。

该沉淀物用含用表面活性剂(如：0.1％-1％曲拉通(Triton)X-100)和EDTA的缓冲液洗一次，然后，再换用另外一种缓冲液(如：含有100-500mMNaCl或NH₄Cl的pH7.2溶液)或蒸馏水洗以除去细胞膜和其它杂蛋白。这样获得的CGH包涵体重新悬浮在蒸馏水中，然后缓慢加入碱溶液(NaOH或KOH溶液)、边加边搅，使pH调整到11.5至13.0之间，优选为11.8至12.3。将该悬液进一步离心以除去不溶性杂质。上清悬液用超滤过滤获得含有可溶性CGH的溶液，调滤液pH到8.5和10.5之间，优选为9.0至9.5。经调整后的滤液加入到阴离子交换层析柱，最好为DEAE(二乙氨乙基纤维素)柱进行层析以获得纯度为95％以上的高纯CGH和低于10单位/毫克浓度的内毒素。

本发明克服了现有技术中CGH生产方法的不足，得到了一种高纯度低内毒素含量的鸡生长激素。

下面的实施例将在不限于本发明的范围内具体说明本发明的内容。在实施例中使用的试验方法如果没有特别说明应按参考例所给的内容进行。

附图简要说明如下：

图1显示本发明CGH基因核苷酸序列和由此推衍的氨基酸序列；

图2描述了获得图1所示CGH基因的方案。

图3显示了构建含有用于在大肠杆菌中表达CGH基因的表达载体。

图4显示在适合CGH基因表达的条件下培养的大肠杆菌转化体SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)的结果。

图5提供了在适合CGH基因表达条件下培养的大肠杆菌内纯化后CGH的SDS-PAGE结果。

图6揭示了纯化CGH的HPLC(离效液相色谱)的结果。

除非特别提及、否则下述中出现的固体混合物中的固体成份，溶液中的液体成份以及液体中的固体成份均分别以重量/重量(wt/wt)，体积/体积(vol/vol)和重量/体积(wt/vol)为基础。

参考例1：限制性核酸内切酶消化DNA

这里使用的限制性核酸内切酶和反应缓冲液均购自NEB(New England Biolabs,Jolla,MA，U.S.A.)。

该反应通常在一个灭菌的Eppendorf管中进行，反应体积在50μl-100μl，在37℃反应1-24小时，之后，该反应混合物在65℃进行15分钟热处理(或用酚抽提、乙醇沉淀以防止热抗性内切酶的作用)用于灭活限制性核酸内切酶。

用于限制性核酸内切酶反应的10X反应缓冲液有下列组成：

10XNEB反应缓冲液1：100mM双Tris丙烷盐酸(bisTris propane-HCl)、100mM氯化镁(MgCl₂)、10mM二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT),pH7.0；

10XNEB反应缓冲液2：100mM Tris-HCl,100mMMgCl₂、500mM NaCl,10mM DTT,pH7.0；

10XNEB反应缓冲液3：100mM Tris-HCl,100mMMgCl₂,1000mM NaCl,10mM DTT,pH7.0；

10XNEB反应缓冲液4：200mM Tris-乙酸、100mM乙酸镁，500mM乙酸钾，10mM DTT,pH7.0。

参考例2：酚抽提和乙醇沉淀

在完成酶反应之后，反应混合物用酚抽提，其目的是要灭活限制性核酸内切酶的作用和获得反应混合物中的DNA。这里需要指出的是使用的酚需预先用含有10mMTris-HCl(pH8.0)和1mM EDTA(乙二胺四乙酸)缓冲液平衡。酚抽提过程按下步进行：混合等体积的酚溶液和样品液，剧烈震荡；以15000rpm离心混合物5分钟；再将水相转入一新管中，重复进行上述过程2-3次。

然后，用等体积氯仿溶液(氯仿∶异丁醇=24∶1)抽提水相，再分离出水相，向内加入0.1体积的3M乙酸钠溶液和2.5体积的乙醇，置-70℃停留30分钟或在-20℃停留12小时以便使核酸析出，之后，在4℃，以15000rpm离心混合物20分钟，收集沉淀。

参考例3：连接反应

DNA连接反应是用购自NEB的T₄连接酶和10X连接酶缓冲液(pH7.8,0.5M Tris-HCl、0.1M MgCl₂,0.2MDTT,10mM ATP,0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA))来进行。反应体积通常为20μl,10单位的T₄连接酶被用于连接DNA的粘性末端，而100单位被用于连接钝端的DNA。

反应在16℃进行5小时或4℃进行14小时以上。反应结束后，该反应混合物在65℃加热15分钟以灭活T₄DNA连接酶。

参考例4：大肠杆菌的转化

下述实施例中使用的大肠杆菌菌株包括大肠杆菌HB101(ATCC33694)：大肠杆菌W3110(ATCC27325)和大肠杆菌JM105(ATCC47016)。大肠杆菌的转化使用了本领域公知的一种方法，即在Maniatis等，MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress,N.Y.(1982)或Cohen,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,69,2110(1972)上所介绍的转化大肠杆菌的方法。

参考例5：寡聚核苷酸片段的合成

寡聚核苷酸片段的合成是用一个自动固相磷胺化学法(automatic solid phase phosphoamidite chemistry)DNA合成仪(APPlied Biosystems InC.,3808,U.S.A.)完成的。

合成的寡聚核苷酸用变性聚丙烯酰胺凝胶(2M脲、12％丙烯酰胺和双叉丙烯酰胺(29∶1),50mMTris,50mM硼酸，1mMEDTA)电泳和SEP-PAK(Waters Inc.,U.S.A.)柱层析进行纯化的，通过在260nm处测定光密度(O.D.)值来确定其含量。

参考例6：聚合酶链反应(PCR)

给10-100ng的模板DNA混合物中加入以下物质：10μl 10X Taq聚合酶反应缓冲液(10mM Tris-HCl,500mM KCl,15mM MgCl₂,0.1％(w/v)明胶，pH8.3),10μl dNTP′s混合物(dGTP、dATP、dTTP和dCTP各1.25mM),2μg每一种引物(通常，反应使用2种引物，一旦使用4种引物，位于中间的引物使用量为0.02μg)和0.5μlAmpli Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus,U.S.A.)，用蒸馏水调至总体积为100μl，再加入50μl矿物油以防止混合反应蒸发。

PCR是在一个热循环仪(Perkin Elmer Cetus,U.S.A)中进行，按热循环程序适当重复多次，循环顺序为：95℃30秒钟→55℃30秒钟→72℃1分钟；最后一次循环时，反应在72℃进行10分钟。

在反应完成后，混合物用酚抽提，PCR产品用乙醇沉淀出，再将该沉淀物溶解在20μlTE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA pH7.5)中。

实施例1：鸡生长激素基因的制备

(1-A)：构建CGH基因的寡聚核苷酸的设计和合成

为了准备含在5′-端有限制性内切酶NdeⅠ识别位点和2个终止密码和限制性内切酶SalⅠ的识别位点，用参考例5描述的相同方法合成下列10种寡聚核苷酸片段。CGH 1：5′-CCCCATATGACTTTCCCAGCTATGCCATTGTCTAACTTGTTCGCTAACGCTG

      TTTTGAG AGCTCAACATTTGCACTTGTTAGCTGC-3′CGH 2：5′-TTGTTAGTGTATCTTTGGTCTTCTGGAATGTAAGTTCTTTCGAATTCCTTGT

      AAGTTTCAGCAGCTAACAAGTGCAAATG-3′CGH 3：5′-GACCAAAGATACACTAACAAGAACTCTCAAGCTGCTTTCTGTTACTCTGAAA

      CTATTCCAGCTCCAACTGGTAAGGACGA-3′OGH 4：5′-CAAGATTGAATCAAAACCAAAGAGAATCTCAACAATTCCATATCAGACTTTT

      GTTGAGCGTCGTCCTTACCAGTTGGAGC-3′CGH 5：5′-TTGGTTTTGATTCAATCTTGGTTGACTCCAGTTCAATACTTGTCTAAGGTT

      TTCACTAACAACTTGGTTTTCGGTACTTC-3′CGH 6：5′-TCTCTCATCAAAGCTTGAATACCTTCTTCTAGATCTTTCAACTTTTCGAAA

      ACTCTGTCAGAAGTACCGAAAACCAAGTT-3′CGH 7：5′-ATTCAAGCTTTGATGAGAGAATTGGAAGACAGATCCCCAAGAGGTCCTCAAT

      TGTTGAGACCAACTTACGACAAGTTCGA-3′CGH 8：5′-TTGAAACAAGACAACAAACCGTAGTTCTTCAACAAAGCGTCTTCGTTTCTCA

      AGTGAATGTCGAACTTGTCGTAAGTTGG-3′CGH 9：5′-GGTTTGTTGTCTTGTTTCAAGAAGGACTTGCACAAGGTTGAAACTTACTTGA

      AGGTTATG-3′CGH 10：5′-GGGGTCGACTATTAAATAGTACAGTTAGATTCACCGAATCTTCTACACTTC

       ATAACCTTCAAGTAAGTTT-3′

寡聚核苷酸CGH1在5′-端含有一个限制性内切酶NdeⅠ的识别位点：5′-CATATG-3′和在3′-端有20个核苷酸残基与CGH2的5′-端互补。

CGH3的5′-端有20个核苷酸残基与CGH43′-端互补，CGH5的5′-端有20个核苷酸残基与CGH6的3′-端互补，CGH7的5′-端有20个核苷酸残基与CGH8的3′-端互补，CGH9的5′-端有20个核苷酸残基与CGH10的3′-端互补。

(1-B)：全CGH基因的制备

<第一步>

按参考例6进行如下的第一次PCR反应：给反应管A中加入2μg CGH1,0.02μg CGH2,0.02μg CGH3和2μgCGH4；给反应管B中加入2μg CGH5,0.02μg CGH6,0.02μg CGH7和2μg CGH8；给反应管C中加入2μgCGH9和2μg CGH10。分别再给上述3管中加入10μl10X Taq聚合酶缓冲液(100mM Tris-HCl,pH8.3,500mM KCl,15mM MgCl₂,0.1％(w/v)明胶)、10μldNTP′s混合物(dGTP,dATP,dTTP,dCTP各1.25mM),0.5μl(5单位/μl)Ampli Taq DNA聚合酶和67μl蒸馏水。热循环顺序为：95℃30秒钟→55℃30秒钟→72℃1分钟，重复该顺序4次后，该后应进一步在72℃10分钟进行。最后的反应混合物加样于聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离出第一次PCR产品。该产品进一步用Elutip-D(Schleicher & Schuell,U.S.A.)纯化，溶解在20μlTE缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.5,1mM EDTA)中。

<第2步>

用第1次PCR产品按下述进行第2次聚合酶链反应(PCR)过程。

在反应管A中的约100ng PCR产品与在反应管B中的约100ng PCR产品混合在反应管D中，再加入2μg CGH1,2μg CGH8,10μl 10X Taq聚合酶缓冲液、10μldNTP′s混合物、0.5μl(5单位/μl)Ampli Taq DNA聚合酶和67μl蒸馏水。该混合物进行20次PCR循环。这样获得的PCR产品按<第1步>相同的方法处理，最后将产品溶解在20μlTE缓冲液之中。

<第3步>

用第2次PCR产品按下述介绍的程序进行第3次PCR反应。

在反应管E中加入以下各反应物：大约100ng反应管D中的PCR的产品、大约100ng反应管C中的PCR产品，2μgCGH1,2μg CGH10,10μl 10X Taq聚合酶缓冲液，10μl dNTP′s混合物、0.5μl(5单位/μl)Ampli TaqDNA聚合酶和67μl蒸馏水。该混合物进行20次PCR循环。这样获得的第3个PCR产品按<第1步>相同的方法处理，最后获得一个片段(这里称为CGH片段)含有完整CGH基因或全长CGH基因.也同样溶解在20μlTE缓冲液中。制备CGH片段的全部过程在图2中已经说明。

实施例2：表达载体的制备

(2-A):CGH-N/L、PL和PN片段的制备

大约2μg在实施例1中获得的CGH片段在50μl 10XNEB反应缓冲液4中用限制性核酸内切酶NdeⅠ(10单位)于37℃消化，之后进行酚抽提和乙醇沉淀。含有核酸的沉淀物溶解在5μl 10X NEB反应缓冲液3中进一步用限制性内切酶SalⅠ(10单位)在37℃处理2小时。

另一方面，2μg以大肠杆菌W3110(KFCC-10667)分离出的质粒ptrp322H-HGH与上述相同方式用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ消化，另外2μg质粒ptrp322H-HGH用限制性核酸内切酶PstⅠ和NdeⅠ消化。消化后的质粒均在0.7％琼脂糖凝胶上电泳分离出0.6Kb,1.5Kb和0.8Kb片段，分别命名为CGH-N/L片段，PL片段和PN片段。(2-B):CGH-N/L,PL和PN片段的连接

给大约100ng CGH-N/L片段，大约100ng PL片段和大约100ng PN片段的混合液中加入2μl 10X连接酶缓冲液和10单位的T₄ DNA连接酶；然后，加蒸馏水调整到总体积为20μl，将这种混合物溶液在16℃反应12小时。在完成该反应后，用反应混合物转化大肠杆菌HB101(ATCC33694)；筛选出用含有CGH基因片段的ptrp-CST转化的大肠杆菌菌落。从转化菌体中分离出质粒ptrp-CST，再用引物2090(5′-CATCACCGAAACGCGCGAG-3′)和引物ptrp1(5′-GACAATTAATCATCGAACTA-3′)对ptrp-CST进行双脱氧DNA序列分析(Sanger,F.et al,P.N.A.S.74,5463(1977))以确定全长CGH基因的核苷酸序列。

实施例3：用表达载体转化大肠杆菌和表达CGH基因

在实施例2中获得的ptrp-CST质粒转化大肠杆菌W3110(ATCC27325)，使用的方法与参考例4的方法相同；转化菌在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(每升含10g Bacto-胰蛋白胨(Bacto-triptone)、15g酵母浸膏、5g氯化钠)中37℃震荡培养12小时。取5ml培养液转移至11个容量为5升含有1L40μg/ml氨苄青霉素M₉培养基(40mMK₂HPO₄,22mM KH₂PO₄,8.5mM NaCl,18.7mMNH₄Cl,1％葡萄糖，O.1mM MgSO₄,0.1mM CaCl₂,0.4％酪蛋白氨基酸，10μg/ml维生素B₁)培养瓶中在37℃下荡培养3-4小时。当每一个培养中培养物的光密度值(O.D.)在650nm处达到0.5时，以各种浓度的吲哚丙烯酸(IAA)加入使CGH基因表达(IAA以每次提高0.1mM的浓度使培养液中的IAA浓度从0mM到1.0mM)。在加入IAA5小时后(未加IAA的、可增加培养时间至12-24小时)，用离心机(Beckman J₆-B，转头JS4.2)3000rpm离心培养物25分钟，获得大肠杆菌细胞沉淀物。将细胞沉淀物悬浮在样品缓冲液中，按Laemmli方法(Laemmli,Nature227,680(1970))在12％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳以确定该基因的表达，结果参见图4。

图4中第1和第4行表明了不含CGH基因大肠杆菌细胞样品蛋白质凝胶图谱；第2和3行为含CGH基因大肠杆菌在未加IAA时培养12-24小时后细胞样品蛋白质凝胶图谱，第5行表示在加入IAA浓度达0.1mM时培养含CGH基因大肠杆菌5小时细胞样品蛋白质凝胶图谱。

正如在图4中所见，可以发现CGH在第2,3和5行22Kd位置上可出现清晰的蛋白带谱，表达量至少占整个大肠杆菌菌体蛋白量的30％。

实施例4：大肠杆菌生产出的CGH纯化

(4-A)：从大肠杆菌培养物中分离CGH包涵体

给1公斤大肠杆菌培养物中加入4升缓冲液(50mMTris,50mM EDTA,pH7.4)，然后用Polytron搅拌器(Lightnin,Model TS1515)搅拌3分钟。将该液用超声波发生仪(Cole-Pamer,Model4720)处理3分钟，再加入0.4g溶菌酶(该品来自鸡蛋蛋清部分)使在溶液中浓度达到0.1g/L，然后37℃搅拌30分钟。

向该溶液中加入200ml20％曲拉通X-100，剧烈搅拌约5分钟，用离心机(Beckman JM-21)离心30分钟，弃去上清，收集沉淀。用2升缓冲液(100mM NaCl,10mMTris,pH7.2)洗沉淀物，重新离心分离出CGH包涵体。

(4-B)：CGH包涵体的溶解

在上述(4-A)中获得的CGH包涵体悬浮在8升蒸馏水中；然后向其内分批加入1NNaOH溶液使pH达到约12.3，进一步搅3小时，最后离心除去不溶性杂质。

(4-C)：超滤和阴离子交换层析

在上述(4-B)中获得8升上清液用分子量截流大小为3×10⁵的滤膜进行超滤，浓缩至1升剩余液。将该剩余液用8升蒸馏水稀释，再进行超滤，浓缩至1升剩余液。这个过程重复4-5次以获得大约40升分子量为3×10⁵或低于3×10⁵的滤出液，该滤出液再以分子量载流大小为1×10⁴的滤膜浓缩至20升或20升以下，用1NHCl溶液调pH至9.0。含有CGH的浓缩液上样于DEAE-Sepharose层析柱。该柱事先用10mM甘氨酸缓冲液(pH9.0)平衡洗柱，洗脱流速约10升/小时，洗5个柱体积10mM甘氨酸缓冲液后，再换用含有90mMNaCl的甘氨酸缓冲液洗脱。这样获得的洗脱液(pH9.0)用分子量载流大小为1×10⁴或低于1×10⁴的滤膜超滤浓缩以获得约3.6g93％纯单体CGH(纯度为99.7％)，内毒素含量为10单位/毫克或低于该值。

图5显示表达CGH大肠杆菌转化体细胞抽提物和纯化CGH的SDS-PAGE结果。

在图5中，A行为标准蛋白分子量标志蛋白；B行为未表达CGH大肠杆菌转化体全细胞蛋白；C行为表达CGH大肠杆菌转化体全细胞蛋白；D行为纯化CGH，表现为一条清晰的约为23.5Kd带。

纯化CGH进一步用高效液相色谱分析，结果表明纯度达99.7％,HPLC的结果在图6和表1中。

表1峰数目            1        2          3        总计保留时间       4.656     9.278      11.284组份波浓度(ng/ml)    0.0000    0.0000     0.0000    0.0000水平化浓度     0.0000    0.0000     0.0000    0.0000峰面积         0.05533   124.30640  0.32342   124.68514峰高           0.00038   0.18592    0.00157   0.18787基质码         BCB       BCB        BCB应答系数       0.0000    0.0000     0.0000    0.0000相对保留时间   0.0000    0.0000     0.0000    0.0000峰面积百分值   0.044     99.697     0.259     100.000峰高百分值     0.205     98.959     0.836     100.000

虽然本发明通过上述具体的实施例已得到描述，同时也应该认识到，本领域熟练的技术人员还可做各种各样明显与本发明有关的操作上的技术改动和变化。这些改动和变化也属于本发明的范畴，将在权利要求中加以明确。

Claims (6)

1、具有下列核苷酸序列的鸡生长激素基因：

                                   30                                   605′-ATG  ACT  TTC  CCA  GCT  ATG  CCA  TTG  TCT  AAC  TTG  TTC  GCT   AAC   GCT  GTT  TTG  AGA  GCT  CAA

                                   90                                   120

CAT  TTG  CAC  TTG  TTA  GCT  GCT  GAA  ACT  TAC  AAG  GAA  TTC   GAA   AGA  ACT  TAC  ATT  CCA  GAA

                                   150                                  180

GAC  CAA  AGA  TAC  ACT  AAC  AAG  AAC  TCT  CAA  GCT  GCT  TTC   TGT   TAC  TCT  GAA  ACT  ATT  CCA

                                   210                                  240

GCT  CCA  ACT  GGT  AAG  GAC  GAC  GCT  CAA  CAA  AAG  TCT  GAT   ATG   GAA  TTG  TTG  AGA  TTC  TCT

                                   270                                  300

TTG  GTT  TTG  ATT  CAA  TCT  TGG  TTG  ACT  CCA  GTT  CAA  TAC   TTG   TCT  AAG  GTT  TTC  ACT  AAC

                                   330                                  360

AAC  TTG  GTT  TTC  GGT  ACT  TCT  GAC  AGA  GTT  TTC  GAA  AAG   TTG   AAA  GAT  CTA  GAA  GAA  GGT

                                   390                                  420

ATT  CAA  GCT  TTG  ATG  AGA  GAA  TTG  GAA  GAC  AGA  TCC  CCA   AGA   GGT  CCT  CAA  TTG  TTG  AGA

                                   450                                  480

CCA  ACT  TAC  GAC  AAG  TTC  GAC  ATT  CAC  TTG  AGA  AAC  GAA   GAC   GCT  TTG  TTG  AAG  AAC  TAC

                                   510                                  540

GGT  TTG  TTG  TCT  TGT  TTC  AAG  AAG  GAC  TTG  CAC  AAG  GTT   GAA   ACT  TAC  TTG  AAG  GTT  ATG

                                   570

AAG  TGT  AGA  AGA  TTC  GGT  GAA  TCT  AAC  TGT  ACT  ATT  TAA   TAG-3 ′

2、含有权利要求1的鸡生长激素基因的表达载体，其中鸡生长激素基因被放置在能够在大肠杆菌细胞中表达的位置。

3、如权利要求2的表达载体，其是质粒ptrp-CST，该质粒包括trp启动子和权利要求1的鸡生长激素基因，所述质粒包含于大肠杆菌W3110(ptrp-CST)中，该大肠杆菌于1992年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No:M92045。

4、用权利要求2所述的表达载体转化的大肠杆菌细胞。

5、如权利要求4的大肠杆菌细胞，其是用ptrp-CST转化的大肠杆菌W3110，其于1992年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No:M92045。

6、一种生产鸡生长激素的方法，包括培养如权利要求4或5的大肠杆菌，并从培养物中分离和纯化鸡生长激素。

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