CN1818068A - 重组人白细胞介素－2(125ser)表达载体的构建 - Google Patents

Abstract

本发明重组人白细胞介素－2(125ser)表达载体的构建，涉及生物技术领域。提供了一种表达人白细胞介素－2(125ser)的新型载体pVA，用该载体构建的重组人白细胞介素－2(125ser)工程菌具有表达量高，表达稳定等优点，具有很高的生产价值。

Description

重组人白细胞介素-2(125ser)表达载体的构建

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及重组人白细胞介素-2(125ser)表达载体的构建。

背景技术

人白细胞介素-2，又称T细胞生长因子，免疫系统重要的调节因子，有长期维持体外T细胞生长，促进T细胞B细胞和NK细胞增值以及刺激Γ干扰素产生等多种生物活性作用，一种免疫增强剂，具有抗病毒、抗肿瘤和提高机体免疫功能的作用。

天然人白细胞介素-2，分子量为15KD，是一个糖基化蛋白质，133个氨基酸组成，组成白细胞介素-2的氨基酸中，58，105和125为是三个半胱氨酸，天然状态下具有生物活性的白细胞介素-2分子中第58位与105位的半胱氨酸形成二硫键，维持白细胞介素-2空间构象的稳定，第125位上的半胱氨酸呈游离状态。对白细胞介素-2的结构研究表明，第58位、105位和125位的半胱氨酸对白细胞介素-2的构想和生物学活性影响很大。去除58位或105位的半胱氨酸时，会使白细胞介素-2的活性显著下降；当用丝氨酸取代125位半胱氨酸时，白细胞介素-2的生物活性非但不降低，反而有所增加，而且取代后的白细胞介素-2稳定性也大大提高。野生型的白细胞介素-2分子中，125位半胱氨酸是游离的，易于与58位或105位的半胱氨酸形成错配的二硫键，或分子间形成二硫键导致二聚体的形成，不利于白细胞介素-2的稳定。125位丝氨酸型白细胞介素-2则不存在二硫键错配的问题，稳定性提高。

白细胞介素-2的研究已多年，如何提高白细胞介素-2的表达量一直是本领域技术人员研究的热点所在。目前，白细胞介素-2的表达载体大多采用p^BV220载体，p^BV220是一种常用的原核表达载体，但外源性蛋白编码基因在该载体控制下的表达受到多种因素的制约。大肠杆菌表达系统中，外源基因的翻译效率并未达到最佳优化水平，外源基因上游的一个SD序列在很多情况下不足以提供高水平表达，表达量一般为30％左右。

发明内容

针对现有技术中白细胞介素-2表达量仍不能令人满意的缺陷，本发明提供了重组人白细胞介素-2(125ser)表达载体的构建，使白细胞介素-2表达量高达55％～65％。

本发明提供了一种用于重组人白细胞介素-2(125ser)的原核表达载体pVA。表达载体pVA是在p^BV220载体的SD序列上游5～10bp处插入一段原核翻译增强子序列UUAACUUUA。构建了新型的表达载体pVA，结构包括λP_RP_L温度诱导启动子、翻译增强子序列、SD序列、多酶切位点、转录终止序列rrnBT1T2，Amp抗性基因、复制起点Ori、编码热敏蛋白Cits857的基因。pVA特别适合人白细胞介素-2的高效表达。

用PCR方法插入目标序列，并用DNA测序证实，其增强功能在重组人白细胞介素-2(125ser)的表达中得到了证实。质粒pVA的核苷酸序列，全长3668bp，含有Clts857基因和λPRPL串联启动子，其核苷酸序列如下：

5’AATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCTTCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTCCCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGTTGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGCCAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATTCTTACGGATGGCCTTTTTGCTTTTCTACAAACTCTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCGGGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTTCGGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGATCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCTGCACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTGGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGAAAATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGCCCCCGTTCCACTGAGCGTCAGATTTTGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTAGCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCCGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTCTTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGCATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCTTATCTTTCCCTTTATTTTTGCTGCGGTAAGTCGCATAAAAACCATTCTTCATAATTCAATCCATTTACTATGTTATGTTCTGAGGGGATTGAAAATTCCCCTAATTCGATGAAGATTCTTGCTCAATTGTTATCAGCTATGCGCCGACCAGAACACCTTGCCGATCAGCCAAACGTCTCTTCAGGCCACTGACTAGCGATAACTTTCCCCACAACGGAACAACTCTCATTGCATGGGATCATTGGGTACTGTGGGTTTAGTGGTTGTAAAAACACCTGACCGCTATCCCTGATCAGTTTCTTGAAGGTAAACTCATCACCCCCAAGTCTGGCTATGCAGAAATCACCTGGCTCAACAGCCTGCTCAGGTTCAACGAGAATTAACATTCCGTCAGGAAAGCTTGGCTTGGAGCCTGTTGGTGCGGTCATGGAATTACCTTCAACCTCAAGCCAGAATGCAGAATCACTGGCTTTTTTGGTTGTGCTTACCCATCTCTCCCGCATCACCTTTGGTAAAGGTTCTAAGCTTAGGTGAGAACATCCCTGCCTGAACATGAGAAAAAACAGGGTACTCATACTCACTTCTAAGTGACGGCTGCATACTAACCGCTTCATACATCTCGTAGATTTCTCTGGCGATTGAAGGGCTAAATTCTTCAACGCTAACTTTGACAATTTTTGCAAGCAATGCGGCGTTATAAGCATTTAATGCATTGATGCCATTAAATAAACCACCAACGCCTGACTGCCCCATCCCCATCTTGTCTGCGACAGATTCCTTGGATAAGCCAAGTTCATTTTTCTTTTTTTCATAAATTGCTTTAAGGCGACGTGCGTCCTCAAGCTGCTCTTGTGTTAATGGTTTCTTTTTTGTGCTCATACGTTAAATCTATCACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTGTCATGTACTAAGGAGGTTGTATGGAACAACGCATAACCCTGAAAGATTATGCAATGCGCTTTGGGCAAACCAAGACAGCTAAAAGATCTCTCACCTACCAAACATTGCCCCCCTGCAAAAAATAAATTCATATAAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCACATCAGCAGGACGCACTGACCACCATGAAGGTGACGCTCTTAAAAATTAAGCCCTGAAGAAGGGCAGCATTCAAAGCAGAAGGCTTTGGGGTGTGTGATACGAAACGAAGCATTAACTTTAAAAATTAAGGAGG-3’3668bp

本发明采用用pVA载体表达重组人白细胞介素-2(125ser)基因，并转化至大肠杆菌DH5a。

通过本发明的方法，实现了高效表达，表达量达菌体总蛋白的55％～65％，具有很高的生产价值，并证明工程菌是稳定的。该工程菌表达量高，稳定性好，具有很高的生产价值。

附图说明

图1、重组人白细胞介素-2(125ser)表达载体构建示意图

图2、重组质粒酶切鉴定图谱

1、λDNA/EcoR I-HindIII 2、EcoR I-HindIII酶切图3、EcoR I酶切图4、BamH

I酶切图5、HindIII酶切图6、PVA HindIII酶切图7、PVA EcoR I酶切图8、PVA BamH I酶切图

图3、重组人白细胞介素-2(125ser)基因工程菌表达电泳图谱1、重组人白细胞介素-2(125ser)菌种表达量2、阴性对照3、蛋白分子量标准

图4重组人白细胞介素-2(125ser)基因工程菌表达电泳扫描图谱

图5重组人白细胞介素-2(125ser)传代质粒稳定性检测

DNA Mark

2～7：F1、F10、F20、F40、F80、F100代质粒用EcoR I/BamH

I双酶切

图6、重组人白细胞介素-2(125ser)表达稳定性检查

2、4、10：标准蛋白

1：工程菌未发酵前

3：F1 5：F10 6：F20 7：F40 8：F80 9：F100

图7：重组人白细胞介素-2(125ser)测序图谱

具体实施方式

实施例1、引物的设计、合成。

根据人白细胞介素-2核苷酸序列和表达载体pVA克隆位点的要求，在5’端和3’引物中分别设计EcoR I和BamH I两个酶切位点，另在5’端引物上加有翻译起始信号ATG，在3’端引物上加有定点诱变信号，将人白细胞介素-2基因第125位的半胱氨酸编码改为丝氨酸编码。具体序列如下：

5’-GGGAATTCATTATGGCTCCTACTTCAAGTTCT-3’

3’-ACCTAGTGGAAAAGAGTTTCGTAGTAGAGTTGTGACTGAACTATTACCTAGGG-5’

实施例2、PCR扩增目的基因片断

以人白细胞介素-2cDNA为模板，5’端和3’端合成引物，用PCR扩增仪扩增目的基因。反应条件为：

ddH₂O                          21.0微升

10×PCR缓冲液                    5.0微升

4×dNTPs                         4.0微升

5’-端引物                       3.5微升

3’-端引物                       6.0微升

人白细胞介素-2cDNA为模板         10微升

Taq酶                            0.5微升

变性温度为95℃，复性温度为45℃，反应温度为72℃，变性时间设定为45妙，复性时间为120秒，共循环30个周期。取5μl反应产物用1.5％琼脂糖电泳进行分析。DNA片断回收采用玻璃奶方法。

实施例3

测序载体的构建和序列分析：PCR产物用EcoR I和BamH I消化，同时将测序载体p^GEM-T也用EcoR I和BamH I消化，载体和目的基因酶切片断回收采用玻璃奶方法，将载体和目的基因按1∶3的比例14℃连接12-16小时，然后转化到E.coli JM109，采用蓝白斑筛选阳性克隆。提取重组克隆的质粒DNA，进行酶切鉴定。操作过程中涉及到方法如质粒的提取、连接反应、感受态的制备及转化等均参照《分子克隆》有关章节。提取重组质粒，通过DNA自动测序仪进行序列分析，测序图谱见图7。测序结果表明第125位的半胱氨酸转变为丝氨酸。根据测序结果推导的核苷酸序列，如下可见。

测序结果(417bp)及由此推测的氨基酸序列(133aa)

GAA TTC ATT ATG GCT CCT ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA ACA

                ALA PRO THR SER SER SER THR LYS LYS THR

                CAG CTA CAA CTG GAG CAT TTA CTG CTG GAT

                GLN LEU GLN LEU GLU HIS LEU LEU LEU ASP

                TTA CAG ATG ATT TTG AAT GGA ATT AAT AAT

                LEU GLN MET RLE LEU ASN GLY ILE ASN ASN

                TAC AAG AAT CCC AAA CTC ACC AGG ATG CTC

                TYR LYS ASN PRO LYS LEU THR ARG MET LEU

                ACA TTT AAG TTT TAC ATG CCC AAG AAG GCC

                THR PHE LYS PHE TYR MET PRO LYS LYS ALA

                ACA GAA CTG AAA CAT CTT CAG TGT CTA GAA

                THR GLU LEU LYS HIS LEU GLN CYS LEU GLU

                GAA GAA CTC AAA CCT CTG GAG GAA GTG CTA

                GLU GLU LEU LYS PRO LEU GLU GLU VAL LEU

                AAT TTA GCT CAA AGC AAA AAC TTT CAC TTA

                ASN LEU ALA GLN SER LYS ASN PHE HIS LEU

                AGA CCC AGG GAC TTA ATC AGC AAT ATC AAC

                ARG PRO ARG ASP LEU ILE SER ASN ILE ASN

                GTA ATA GTT CTG GAA CTA AAG GGA TCT GAA

                VAL ILE VAL LEU GLU LEU LYS GTY LER GLU

                ACA ACA TTC ATG TGT GAA TAT GCT GAT GAG

                THR THR PHE MET CYS GLU TYR ALA ASP GLU

                ACA GCA ACC ATT GTA GAA TTT CTG AAC AGA

                THR ALA THR ILE VAL GLU PHE LEU ASN ARG

                TGG ATC ACC TTT TCT CAA AGC ATC ATC TCA

                TRP ILE THR PHE SER GLN SER ILE ILE SER

                ACA CTG ACT TGA TAA

                THR LEU THR …  …

结果表明：5’端EcoR I酶切位点后第四个核苷酸起为翻译起始信号ATG，随后即为成熟人工L-2的第一个氨基酸残基Ala，至双终止信号TGATAA共有133个氨基酸残基的编码，其中第58位和第105位为两个半胱氨酸的密码，第125位原编码半胱氨酸的TGT被定点诱变改换为编码Ser的TCT，3’端由BamH I内切酶切点结尾，序列全长399bp.

实施例4、为了获得高效表达人白细胞介素-2(125ser)的表达质粒，在表达载体p^BV220的基础上进行了改建，通过定点突变的方法，在p^BV220载体的SD序列上游5～10bp处插入一段原核翻译增强子序列UUAACUUUA。构建了新型的表达载体，命名为pVA。

p^BV220：AGCA TTGGTTAAAAATTAAGGAGG

pVA：AGCA TTAACTTTAAAAATTAAGGAGG

实施例5、pVA-IL-2(125ser)表达质粒的构建、筛选及鉴定

将通过PCR扩增得到的人白细胞介素-2片断及表达载体pVA均采用EcoR I和BamH I双酶切，用玻璃奶方法分别分离纯化所需DNA片断并进行回收。回收后的外源基因片段与载体用T₄DNA连接酶进行连接，连接温度16℃，连接时间为3小时。取5μl连接物，转化感受态大肠杆菌E.coli DH5a，均匀涂在含氨苄青霉素的LB培养平板上。挑取单个菌落于LB培养基中培养，碱裂解法小提质粒，将重组质粒用EcoR I和BamH进行酶切鉴定。pVA-IL-2(125ser)表达载体构建示意图见图1，重组质粒酶切鉴定图谱见图2

实施例6、重组人白细胞介素-2(125ser)基因工程菌的表达分析

将工程菌培养过夜，按1∶10接种到ALB培养基中，30℃振荡培养至OD600＝0.4-0.6，升温至42℃诱导表达4hr，离心收菌，取样裂解后作SDS---PAGE电泳，在分子量约15KD处可见明显的重组人白细胞介素-2(125ser)的蛋白条带，经光密度扫描计算，表达的重组人白细胞介素-2(125ser)约占菌体总蛋白的55％-65％左右，表明我们获得了重组人白细胞介素-2(125ser)的高效表达。电泳图谱见图3，扫描图谱见图4。

实施例7、重组人白细胞介素-2(125ser)工程菌稳定性

1.质粒遗传稳定性的检查

取连续传代1、10、20、40、80、100代的工程菌，接种含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振荡培养12h，用碱裂解法提取质粒，用EcoR I/BamH I双酶切质粒，0.8％琼脂糖电泳，紫外灯下观察DNA片断的大小。见图5。结果表明：各代次菌种的质粒经限制性内切酶EcoR I/BamH I双酶切后，做0.8％的琼脂糖电泳，在可见各有一条电泳带，与原代质粒相符。由于原始质粒构建过程中：人白细胞介素基因经EcoR I/BamH I重组于表达质粒pVA，人的白细胞介素-2基因为399bp，质粒为3.6Kb，所以酶切初步鉴定结果为质粒片断与目的基因片断的大小没有发生变化，即经传代后的工程菌保留原重组质粒，质粒内携带全部人白细胞介素-2编码基因片断，与构建时酶切图谱一致，说明本工程菌可稳定携带外源基因至100次，质粒稳定存在。

利用重组质粒含有氨苄抗性基因的特点，在不含氨苄青霉素的LB培养基中连续培养，检测工程菌传代过程中的质粒丢失情况。具体操作如下：

取连续传代1、10、20、40、80、100代的工程菌，用LB培养基稀释至10^-4，取20μl均匀涂布于不含氨苄青霉素的LB琼脂平板，30℃培养过夜，随机挑100个菌落对应接种于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，30℃培养过夜，统计长出的单菌落数，计算不含质粒细菌的比率。

代次	F1	F10	F20	F40	F80	F100
							未丢失质粒的百分数	100％	100％	99％	98％	97％	97％

由表可见，工程菌在LB培养基中传代100代后，未丢失质粒的占95％以上，说明工程菌的质粒遗传是稳定的。

2、重组人白细胞介素-2(125ser)质粒表达稳定性的检查

取连续传代10、20、40、80、100代的工程菌，接种含氨苄青霉素的LB液体培养基，30℃振荡培养，当培养液OD₆₀₀约为0.4-0.6时，迅速升温至42℃诱导，培养4小时。经6000r/min，4℃离心5min，弃上清，菌体沉淀加入蛋白质电泳上样缓冲液，100℃水浴5min，离心后上清用15％分离胶进行SDS-PAGE电泳，银染，用薄层扫描仪扫描并计算出表达量。见图6。结果表明：各代次菌在相对分子质量为处可见表达带，各代次间无明显差异，由此可见工程菌在传代100代次过程中，重组人干扰素表达稳定，从基因表达上说明质粒稳定存在。

Claims (5)

1.一种用于重组人白细胞介素-2(125ser)的原核表达载体，其特征在于载体是pVA。

2.如权利要求1所述一种用于重组人白细胞介素-2(125ser)的原核表达载体pVA，其特征在于，在p^BV220载体的SD序列上游5～10bp处插入一段原核翻译增强子序列UUAACUUUA。

3.如权利要求2所述一种用于重组人白细胞介素-2(125ser)的原核表达载体pVA，其特征在于，引物的设计、合成：根据人白细胞介素-2核苷酸序列和表达载体pVA克隆位点的要求，在5’端和3’引物中分别设计EcoR I和BamH I两个酶切位点，另在5’端引物上加有翻译起始信号ATG，在3’端引物上加有定点诱变信号，将人白细胞介素-2基因第125位的半胱氨酸编码改为丝氨酸编码，具体序列如下：

5’-GGGAATTCATTATGGCTCCTACTTCAAGTTCT-3’

3’-ACCTAGTGGAAAAGAGTTTCGTAGTAGAGTTGTGACTGAACTATTACCTAGGG-5’。

4.如权利要求2所述一种用于重组人白细胞介素-2(125ser)的原核表达载体pVA，其特征在于，PCR扩增目的基因片断：以人白细胞介素-2cDNA为模板，5’端和3’端合成引物，用PCR扩增仪扩增目的基因，反应条件为：

ddH₂O                       21.0微升

10×PCR缓冲液                5.0微升

4×dNTPs                     4.0微升

5’-端引物                   3.5微升

3’-端引物                   6.0微升

人白细胞介素-2cDNA为模板     10微升

Taq酶                        0.5微升

变性温度为95℃，复性温度为45℃，反应温度为72℃，变性时间设定为45妙，复性时间为120秒，共循环30个周期，取5μl反应产物用1.5％琼脂糖电泳进行分析，DNA片断回收采用玻璃奶方法。

5.一种用于重组人白细胞介素-2(125ser)的原核表达载体pVA，其特征在于，用pVA载体表达重组人白细胞介素-2(125ser)基因，并转化至大肠杆菌DH5a。

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