CN1366551A - 分泌人粒细胞集落刺激因子(g－csf)的大肠杆菌菌株 - Google Patents

分泌人粒细胞集落刺激因子(g－csf)的大肠杆菌菌株 Download PDF

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Abstract

本发明提供了含有卡那霉素抗性基因、启动子、木聚糖内切酶信号序列、编码由含6个连续组氨酸残基的13个氨基酸组成的寡肽的核苷酸序列和人粒细胞集落刺激因子(hG－CSF)基因的重组质粒载体;以及用所述载体转化的大肠杆菌;以及以高纯度从所述微生物分泌的蛋白库中生产完整hG－CSF蛋白的方法。根据本发明,通过促进大量hG－CSF融合蛋白分泌到周质中的相当简单的方法可以高纯度制备hG－CSF蛋白,所述方法不需要复杂的加工过程例如对于通过常规技术分离胞质中产生的作为不溶性包函体的hG－CSF所需的溶解和随后再折叠,因此,在开发用于抗癌治疗的补充药物的过程中可用hG－CSF蛋白广泛地作为活性成分。

Description

分泌人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的大肠杆菌菌株
发明背景
发明领域
本发明涉及生产和分泌人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)的大肠杆菌，更具体地说，涉及构建的在大肠杆菌中表达分泌性hG-CSF的重组质粒，用所述质粒转化的分泌hG-CSF的大肠杆菌以及用所述转化的大肠杆菌制备hG-CSF的方法。
现有技术的描述
在正常人体的多个部分均可发现已知可通过各种细胞例如单核巨噬细胞、T淋巴细胞以及成纤维细胞合成的集落刺激因子(CSF)。将CSF分成三类，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)和粒细胞/巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)，其中G-CSF是在通过促进造血干细胞的增殖和分化来生产血细胞中的一种必需蛋白质，并可促进粒细胞数量的增加，特别是促进保护身体免于感染的嗜中性粒细胞的增加。广泛用于治疗生长性肿瘤的化疗不仅抑制了肿瘤的生长，而且也抑制了嗜中性粒细胞的产生，由于嗜中性粒细胞的保护功能降低而产生严重副作用。已知给进行所述化疗的患者施用G-CSF促进嗜中性粒细胞数量的增加是一种治疗和预防所述传染性疾病的有效方法。
在1986年，由Nagata等(参见Nagata等，Nature 319：415(1986))从人鳞状细胞癌细胞系CHU-II中分离了hG-CSF基因，首次确定了其核苷酸序列并在COS细胞中表达。hG-CSF是一种由174个氨基酸残基组成的含30种信号肽的糖蛋白。hG-CSF包括5个半胱氨酸残基，其中4个半胱氨酸残基，在Cys-36与Cys-64和Cys-64与Cys-74间形成2个二硫键，它们有助于所表达蛋白质的折叠及其活性(参见：Hill等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90：5167-5171(1993))。hG-CSF没有用于N-糖基化的共有序列(Asn-X-Thr/Ser)，但在Thr-133发生O-糖基化。但是已知在大肠杆菌中产生的G-CSF与天然G-CSF具有几乎相同的生物学活性，这意味着糖基化对于G-CSF活性是非必需的。
利用重组DNA技术的最新进展，可以在细菌、植物细胞和动物细胞中生产G-CSF，在此描述一些以前报告的结果：Souza等从人膀胱癌细胞系5637中分离了cDNA，确定了其序列并报告了其在大肠杆菌中的表达(Souza等，Science，232：61(1986))。此外，已报告了对在大肠杆菌、植物细胞和动物细胞中生产hG-CSF以及对于构建和生产hG-CSF衍生物的研究。但是，迄今为止已知的用于在大肠杆菌中生产hG-CSF的技术就蛋白质产率或生产成本而言有许多缺点，因为hG-CSF是在胞质中以不溶性包函体的形式生产的，这需要随后溶解并复性以得到hG-CSF蛋白质的生物活性形式。尽管可以直接分离少量可溶性hG-CSF，但所述方法在一定意义上仍有限制：hG-CSF蛋白质的活性级分不得不从大量大肠杆菌蛋白质的库中分离。
总之，分泌到大肠杆菌周质中的蛋白质携带信号序列，在所有可运输出胞质的蛋白质中均发现了信号序列，然后由信号肽酶在周质中裂解所述信号序列。信号序列对于在大肠杆菌中分泌蛋白质是必要的。因此，通过将已知的信号序列(OmpA、OmpF、PelB、PhoA、SpA等)(就其本身或有稍微的修饰)与编码外源蛋白质之基因的N末端相连，可以将原本不由大肠杆菌基因编码的重组蛋白质分泌到周质中或者分泌到细胞外培养液中。
通过分泌到周质间隙而生产hG-CSF的方法比上述通过胞质生产的常规方法有如下优点：首先，容易分离和纯化重组蛋白，在周质中的纯度比在胞质中高，因为在周质中的蛋白质比在胞质中的少(Nossal，N.G.等，J.Biol.Chem.，241：3055-3062(1966))；第二，分泌到周质中的重组蛋白与其中发现有大多数蛋白酶的胞质分隔开，由于避免了胞质中蛋白酶对蛋白质的降解而可在重组蛋白质的生产中得到高产率(Meerman和Georgiou，Ann.N.Y.Acad.Sci.，721：292-302(1994))；第三，细菌周质比胞质的氧化环境更强，完成多肽的二硫键形成和正确折叠更容易，因此，可避免不溶性集聚物的形成(Hockney，TIBTECH，12：456-463(1994))。
由于具有所述优点，导致重组蛋白分泌到周质中的方法已被用于在大肠杆菌中生产hG-CSF，并有如下报告：Perez-Perez等已努力得到分泌形式的hG-CSF，使用大肠杆菌信号序列之一的OmpA，没有成功。为了解决该问题，他们使用两种分子侣伴蛋白DnaK和DnaJ的共表达系统，仅仅得到少量分泌的hG-CSF(Perez-Perez等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，210：524-529(1995))；另外，Chung等用另一种信号序列PelB试图得到分泌形式的hG-CSF，同样没有成功，但hG-CSF以不溶性包函体的形式在胞质中积累(Chung等，J.Fermen.Bioengin.，85：443-446(1998))。
就上述情况来看，仍需要继续开发通过不需要溶解不溶性包函体以及随后再折叠的相当简单的方法，促进hG-CSF以实质水平分泌到周质的技术。
发明概述
本发明人经过努力开发了用于促进hG-CSF分泌到周质中的技术，因此，他们已发现用含编码由13个氨基酸，芽孢杆菌衍生的木聚糖内切酶(endoxylanase)信号序列和6个组氨酸残基组成之寡肽的核苷酸序列的重组质粒转化的大肠杆菌可以有效分泌寡肽/hG-CSF融合蛋白，这样可以用所述转化的大肠杆菌生产hG-CSF蛋白质。
因此，本发明的第一个目的是提供构建的用于大肠杆菌的重组质粒以便从中表达和分泌hG-CSF融合蛋白。
本发明的第二个目的是提供用所述质粒转化的大肠杆菌。
本发明的第三个目的是提供用所述微生物生产hG-CSF蛋白质的方法。
附图简述
结合下列附图，本发明的上述目的、其他目的和特征对于本领域技术人员来说将是显而易见的，其中：
图1是插入到质粒p19CSF中的hG-CSF基因的核苷酸序列。
图2表示质粒p19CSFm的构建示意图和遗传图谱。
图3是插入到质粒p19CSFm中的hG-CSF基因的核苷酸序列和推断的氨基酸序列。
图4表示质粒pEDCSFm的构建示意图和遗传图谱。
图5是插入到质粒pEDCSFm中的hG-CSF基因的核苷酸序列和推断的氨基酸序列。
图6表示质粒pEDCSFmII的构建示意图和遗传图谱。
图7是插入到质粒pEDCSFmII中的hG-CSF基因的N-末端部分的核苷酸序列和推断的氨基酸序列。
图8表示质粒pTrcSCSFmII的构建示意图和遗传图谱。
图9是插入到质粒pTrcSCSFmII中的hG-CSF基因的N-末端部分的核苷酸序列和推断的氨基酸序列。
图10表示质粒pTrcKCSFmII的构建示意图和遗传图谱。
图11表示质粒pTHSCSFmII的构建示意图和遗传图谱。
图12是插入到质粒pTHSCSFmII中的hG-CSF基因的N-末端部分的核苷酸序列和推断的氨基酸序列。
图13表示质粒pTHKCSFmII的构建示意图和遗传图谱。
本发明详述
设计用于从大肠杆菌中有效分泌hG-CSF融合蛋白的本发明重组质粒含有：卡那霉素抗性基因、木聚糖内切酶信号序列、编码由含6个连续组氨酸残基的13个氨基酸残基组成的寡肽的核苷酸序列、经修饰的hG-CSF基因和Trc启动子。通过用所述重组质粒转化大肠杆菌制备有效分泌hG-CSF蛋白质的本发明重组大肠杆菌。用Ni-柱和随后的蛋白酶处理，通过从由所转化大肠杆菌中得到的蛋白质库分离hG-CSF融合蛋白，可以制备高纯度hG-CSF蛋白。
下面详细说明本发明。
首先，构建含编码hG-CSF蛋白的cDNA、用于hG-CSF蛋白分泌的木聚糖内切酶信号序列、是强可诱导启动子的Trc启动子、编码非分泌蛋白的卡那霉素抗性基因以及编码寡肽的核苷酸序列组成的重组质粒载体pTHKCSFmII，所述寡肽由在木聚糖内切酶信号序列与hG-CSF多肽间含6个连续组氨酸残基的13个氨基酸残基组成，构建所述载体pTHKCSFmII用于制备表达hG-CSF融合蛋白并将其分泌到周质中的转化的大肠杆菌：其中通过将得自人乳腺癌cDNA文库的第3外显子缺失的hG-CSF cDNA与合成的第3外显子、用于促进从大肠杆菌分泌hG-CSF蛋白的由芽孢杆菌属衍生的木聚糖内切酶信号序列以及用作选择性标记的卡那霉素抗性基因相连来构建编码hG-CSF蛋白的cDNA。此外，为了防止在大肠杆菌分泌hG-CSF蛋白的过程中发生细胞溶解，在木聚糖内切酶信号序列的DNA与hG-CSF基因间加入编码含6个连续组氨酸残基的13个氨基酸残基组成的寡肽的核苷酸序列，所述寡肽的氨基酸序列是N’-Ala-Gly-Pro-His-His-His-His-His-His-Ile-Glu-Gly-Arg-C’(SEQ ID NO：1)。
随后，通过将上述构建的质粒pTHKCSFmII导入大肠杆菌来制备分泌hG-CSF融合蛋白的重组大肠杆菌：其中可以使用大肠杆菌菌株BL21(DE3)、HBi01、MC4100、W3110和XL1-Blue，优选MC4100。将用重组质粒pTHKCSFmII转化的大肠杆菌MC4100命名为大肠杆菌MC4100/pTHKCSFmII，于2000年3月13日该菌株已保藏在附属于韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，该保藏机构是国际保藏机构，该菌株的保藏号为KCTC0754BP。
最后，用Ni-柱和蛋白酶从得自转化大肠杆菌的蛋白质库制备完整的hG-CSF蛋白：所述大肠杆菌分泌hG-CSF融合蛋白，该蛋白的N末端与由含6个连续组氨酸残基的13个氨基酸残基组成的寡肽相连。用Ni-柱分离分泌的hG-CSF融合蛋白，所述融合蛋白的寡肽中存在的6个连续组氨酸残基可与该柱结合，然后通过蛋白酶处理除去所述寡肽，从上述分离的hG-CSF融合蛋白制备完整hG-CSF蛋白。由于hG-CSF对所用的蛋白酶不敏感，因此，通过其识别序列不存在于hG-CSF蛋白中的蛋白酶应该可以选择性地裂解掉所述寡肽的C末端序列。作为实例，在本发明中，选择所述寡肽的C末端氨基酸序列是Ile-Glu-Gly-Arg(见SEQ ID NO：1)，该序列被Xa因子识别和切割，在hG-CSF蛋白中没有该蛋白酶的识别序列。
进一步以下列实施例说明本发明，所述实施例不应限制本发明的范围。实施例1：制备人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)的cDNA
为了分离hG-CSF基因，通过PCR扩增人乳腺癌cDNA文库制备hG-CSF cDNA。在GenBank中检索hG-CSF基因的核苷酸序列，然后分别合成引物1：5’-GCGAATTCATGGCTGGACCTGCCACCCAG-3’(SEQ ID NO：2)和引物2：5’-GCGGATCCTTATTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3’(SEQ ID NO：3)。为了便于克隆PCR产物，分别在引物1和引物中导入EcoRI和BamHI限制位点。然后利用高保真度PCR系统(Boehringer Mannheim Co.，Germany)，在下列条件下完成PCR：一个循环的在94℃变性7分钟；30个循环的下列过程：94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸1分钟；然后一个循环的在72℃延伸7分钟。将通过PCR得到的DNA分子进行琼脂糖凝胶电泳以分离约530 bp的DNA片段，随后用EcoRI和BamHI消化该片段以得到所需的DNA片段。
为了克隆上述得到的DNA片段，用T4 DNA连接酶将所述DNA片段连接到用EcoRI和BamHI消化了的质粒pUC19(Yanisch-Perron等，Gene，33：109-119(1985))中，然后通过电穿孔技术将连接产物导入大肠杆菌XL1-Blue(supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi relA1lacF’(proAB+lacIqlacZΔM15Tn(tetr)))(Bullock，W.O.等，BioTechniques，5：376-378(1987))以得到转化的大肠杆菌。在含氨苄青霉素(50μg/l)的LB琼脂培养基上筛选转化体，由此得到重组质粒p19CSF。用自动DNA测序仪(ABI Prism 377型，Perkin Elmer Co.，USA)确定p19CSF中片段的核苷酸序列。已发现与公开的hG-CSF的核苷酸序列相比，在本发明克隆的片段的中部有108bp缺失，同时其余508bp的序列与公开的hG-CSF基因的序列相同(见图1)。与hG-CSF的基因组DNA序列相比，本发明片段中的108bp缺失对应于hG-CSF基因5个外显子中的第3个外显子。
为了得到完整的hG-CSF基因序列，制备对应于第3外显子的4个引物，即
引物3：5’-TCCTCGGGGTGGCACAGCTTGTAGGTGGCACACAGCTTCTCCTGGAGCGC-3’(SEQ ID NO：4)、
引物4：5’-GCTGTGCCACCCCGAGGAGCTGGTGCTGCTCGGACACTCTCTGGGCATCC-3’(SEQ ID NO：5)、
引物5：5’-TGGCTGGGGCAGCTGCTCAGGGGAGCCCAGGGGATGCCCAGAGAGTGTC-3’(SEQ IDNO：6)和引物6：5’-AGCAGCTGCCCCAGCCAGGCCCTGCAGCTGGCAGGCTGCTTGAGCCAA-3’(SEQID NO：7)，然后完成PCR。用上述引物1和得到的PCR产物，PCR扩增p19CSF，用引物2，以与用引物1相同的方式完成PCR。用这两个PCR产物，再完成一次PCR，将所得产物用两种限制酶EcoRI和BamHI消化，然后将所述片段克隆到与上述所用位点相同的pUC19的位点。将转化的大肠杆菌XL1-Blue在含氨苄青霉素(50μg/l)的LB琼脂培养基上筛选，由此得到重组质粒p19CSFm(图2)。确定p19CSFm中片段的核苷酸序列，发现与公开的hG-CSF基因的序列相同(图3)。实施例2：构建重组质粒pEDCSFm
为了从实施例1所得到的hG-CSF基因得到表达的hG-CSF蛋白，通过从p19CSFm中除去信号序列构建成熟hG-CSF基因(图5)。为了克隆成熟hG-CSF基因，制备引物7：5’-GCGAATTCATATGACCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3’(SEQ ID NO：8)。使用引物2和7，PCR扩增p19CSFm，将扩增的DNA分子用两种限制酶NdeI和BamHI消化。将所得DNA片段连接到用NdeI和BamHI消化的含T7启动子的质粒pET21c(Novagen Co.，USA)中。通过电穿孔用连接的产物转化大肠杆菌XL1-Blue后，在含氨苄青霉素(50微克/l)的LB琼脂培养基上筛选转化体，由此得到重组质粒pEDCSFm(图4)。
为了在大肠杆菌中生产hG-CSF蛋白质，将重组质粒pEDCSFm导入大肠杆菌BL21(DE3)(F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)携带T7 RNA聚合酶基因的原噬菌体)。将含重组质粒的转化的大肠杆菌接种到250毫升烧瓶中的50毫升液体LB培养基中，在37℃温育。当细胞浓度达到OD600为约0.7时，将1mM IPTG(异丙基-β-硫代半乳糖苷)加入培养物中以诱导hG-CSF基因的表达。诱导4小时后，取出分成1毫升的培养液。4℃将取出的培养液以6000rpm离心5分钟以收集细胞，然后洗涤，在4℃再以6000rpm离心5分钟，然后重悬在0.2ml TE缓冲液中。将64微升细胞悬浮液与16微升样品缓冲液(Tris-HCl 60mM：25％甘油(v/v)：2％SDS(v/v)：2-巯基乙醇14.4mM：0.1％溴酚蓝)的混合物在100C加热10分钟，然后在分离的凝胶中进行SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)。SDS-PAGE后，用染色溶液(考马斯亮蓝R 0.25g/l：甲醇40％(v/v)、乙酸7％(v/v))将凝胶染色2小时，然后用脱色溶液(甲醇40％(v/v)、乙酸7％(v/v))脱色两次，每次2小时。SDS-PAGE没有显示对应于hG-CSF蛋白质的带。实施例3：构建重组质粒pEDCSFmII
基于Devlin等的报告，在hG-CSF基因N末端部分的高G+C含量对该基因的转录和翻译有抑制作用(Devlin等，Gene，65：13-22(1988))，制备引物8：5’-GCGAATTCATATGACTCCGTTAGGTCCAGCCAGC-3’(SEQ ID NO：9)以得到具有较低G+C含量的基因，以便可在大肠杆菌中有效转录和翻译。
用引物8和引物2通过PCR扩增质粒p19CSFm。将所得的PCR产物用NdeI和BamHI消化，克隆到pET21c的相同位点，然后转化到大肠杆菌XL1-Blue中。在含氨苄青霉素(50微克/l)的LB琼脂培养基筛选转化的大肠杆菌XL1-Blue，由此得到重组质粒pEDCSFmII(图6)。与pEDCSFm中片段的序列相比，发现pEDCSFmII中片段的核苷酸序列与该基因的N末端部分相同，同时总共有6个核苷酸残基的差异，有5个密码子发生改变(ACC CCC CTG GGC CCT→ACTCCG TTA GGT CCA)。
将质粒pEDCSFmII转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，分析其表达。培养转化的大肠杆菌，按实施例2所述完成总蛋白质的生产和分析，按下列方法完成不溶性集聚物的分级分离。将通过离心1毫升培养液得到的细胞悬浮在0.5ml TE缓冲液(Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM，pH8.0)中，然后在4℃再以3000xg离心5分钟，然后重悬在0.2ml TE缓冲液中。用超声仪(Branson Ultrsonics Co.，USA)破碎细胞，然后在4℃以10000xg离心10分钟。将上清液分类成可溶性蛋白，将沉淀溶解在0.2ml TE缓冲液中，并分类成不溶性蛋白。鉴定出在用质粒pEDCSFmII转化的大肠杆菌BL21(DE3)中表达的hG-CSF蛋白的含量占总蛋白质的约40％，发现所产生的大部分hG-CSF蛋白是没有生物活性的不溶性集聚物。实施例4：构建重组质粒pTrcSCSFmII
将衍生于芽孢杆菌属菌种的木聚糖内切酶的信号序列用于从大肠杆菌中分泌hG-CSF蛋白。为了通过PCR将木聚糖内切酶的信号序列与hG-CSF多肽的N末端相连，分别制备引物9：5’-GGAATTCACATGTTTAAGTTTAAAAAGAAATTC-3’(SEQ ID NO：10)、引物10：5’-GGCTGGACCTAACGGAGTTGCAGAGGCGG-3’(SEQ ID NO：11)和引物11：5’-GCAACCGCCTCTGCAACTCCGTTAGGTCCAGCC-3’(SEQ ID NO：12)。从用引物9和10、携带木聚糖内切酶基因的质粒pKJX4(Jeong等，Enzyme Microb Technol.22(7)：599-605(1998))为靶DNA完成的PCR，得到含木聚糖内切酶信号序列的PCR产物，从用引物2和11完成的PCR，得到含hG-CSF基因的PCR产物。另外，用上述得到的两种PCR产物和引物2和9完成PCR以得到含木聚糖内切酶信号序列-融合的hG-CSF基因的PCR产物，然后用两种限制酶AflIII和BamHI消化该产物。另外，用NcoI和BamHI消化携带强可诱导启动子trc启动子的质粒pTrc99A(Pharmacia Biotech Co.，USA)，然后与上述两种PCR产物相连。将连接混合物转化到大肠杆菌XL1-Blue中。在含氨苄青霉素(50微克/l)的LB琼脂培养基筛选转化体，由此得到重组质粒pTrcSCSFmII(图8)。用自动DNA测序仪(ABI Prism 377型，Perkin Elmer Co.，USA)确定hG-CSF基因N末端部分的核苷酸序列(图9)。
为了分析在不同大肠杆菌菌株中hG-CSF蛋白的分泌，将重组质粒pTrcSCSFmII转化到大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌HB101(F-hsdS20(rk-，mk-)recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20(strr)xyl1-5mtl-1 supE44λ-)、大肠杆菌MC4100(F-araD139Δ(argF-lac)U169rpsL150(strr)relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR)和大肠杆菌W3110(衍生自大肠杆菌K-12，λ-，F-，原养型)中。分别将各转化体接种到含氨苄青霉素(50微克/l)的50毫升LB培养基上以便通过实施例2所述方法测定表达水平和进行蛋白质分析。但是，用1mM IPTG诱导后，细胞突然开始溶解，在2小时内大部分细胞溶解。将培养物离心以得到转化的大肠杆菌细胞，用SDS-PAGE分析蛋白质，发现没有对应于hG-CSF蛋白的蛋白质。实施例5：构建重组质粒pTrcKCSFmII
考虑到质粒pTrcSCSFmII中的氨苄青霉素抗性基因(Apr)编码分泌到大肠杆菌周质中的β-内酰胺酶，因此推测在β-内酰胺酶与hG-CSF蛋白的分泌之间存在竞争，所述竞争产生实施例4中观察到的细胞溶解。基于所述假设，用卡那霉素抗性基因(Kmr)代替氨苄青霉素抗性基因(Apr)作为选择性标记，因为卡那霉素抗性基因编码非分泌性蛋白，仍可用作选择压力。为了用卡那霉素抗性基因(Kmr)取代质粒pTrcSCSFmII中的氨苄青霉素抗性基因(Apr)，用引物12：5’-GCGAATTCTTTAAAGCCACGTTGTGTCCTCAAA-3’(SEQ ID NO：13)和引物13：5’-GCGAATTCTTTAAATTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3’(SEQ ID NO：14)，质粒pACYC177作为靶DNA完成PCR。将所得的含卡那霉素抗性基因的PCR产物用DraI消化，然后连接到用DraI部分消化以除去氨苄青霉素抗性基因的质粒pTrcSCSFmII中。将连接产物转化到大肠杆菌XL1-Blue中。将转化体在含卡那霉素(25微克/l)的LB琼脂培养基上筛选，由此，得到重组质粒pTrcKCSFmII(图10)。
为了分析hG-CSF蛋白的分泌，将重组质粒pTrcKCSFmII转化到大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌HB101、大肠杆菌MC4100和大肠杆菌W3110中。将各转化体分别接种到50毫升含卡那霉素(25微克/l)LB培养基中以便按实施例2所述方法完成测定表达水平和蛋白质分析的试验，得到与使用pTrcSCSFmII的实施例4相同的结果。即用pTrcKCSFmII也在用1mM IPTG诱导后细胞过量溶解，所回收蛋白质的SDS-PAGE分析表明没有对应于hG-CSF的蛋白质。从上述研究发现用卡那霉素抗性基因取代氨苄青霉素抗性基因没有发挥避免细胞溶解的作用，因此，需要另一种可解决因hG-CSF蛋白分泌引起的细胞溶解这一内在问题的遗传操作方式。实施例6：构建重组质粒pTHSCSFmII和pTHKCSFmII
为了促进大肠杆菌分泌hG-CSF蛋白而不会产生细胞溶解，使用在木聚糖内切酶信号序列与hG-CSF蛋白间插入小寡肽的策略。为了达到该目的，用引物14：5’-CACCATCACCATATCGAAGGCCGTACTCCGTTAGGTCCA-3’(SEQ ID NO：15)和引物15：5’-GATATGGTGATGGTGATGGTGCGGGCCAGCTGCAGAGGCGG-3’(SEQ ID NO：16)和pEDSCSFmII作为靶DNA完成PCR。首先，用引物14和2、引物15与9分别完成PCR。然后将两种PCR产物混合，用引物2和9完成另一PCR，将所得产物用AflIII和BamHI消化以便连接到质粒pTrc99A的NcoI/BamHI位点。将连接产物导入大肠杆菌XL1-Blue后，在含氨苄青霉素(50微克/升)的LB琼脂培养基上筛选转化体，由此得到重组质粒pTHSCSFmII(图11)。图12表明插入到质粒pTHSCSFmII中的DNA的核苷酸序列和推断的氨基酸序列，其中斜体表示木聚糖内切酶信号序列，黑体表示插入的寡肽序列。
与实施例5相似，为了用卡那霉素抗性基因(Kmr)取代氨苄青霉素抗性基因(Apr)，用DraI部分消化质粒pTHSCSFmII以除去氨苄青霉素抗性基因，然后与携带通过用DraI消化pTrcKCSFmII得到的卡那霉素抗性基因的DNA片段相连。用连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue，在含卡那霉素(50微克/l)的LB琼脂培养基上筛选转化体，由此得到重组质粒pTHKCSFmII(图13)。实施例7：从携带重组质粒pTHKCSFmII的转化的大肠杆菌中分泌hG-CSF融合蛋白
为了分析从pTHKCSFmII的hG-CSF融合蛋白的表达和分泌，将重组质粒pTHKCSFmII分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌HB101、大肠杆菌MC4100和大肠杆菌W3110中。分别在37℃和30℃在50毫升LB培养基中培养各转化体，然后按实施例2所述分析hG-CSF融合蛋白的分泌。用1mM IPTG诱导hG-CSF基因表达4小时后，取1毫升培养液离心得到细胞，然后用SDS-PAGE分析hG-CSF融合蛋白的表达，表明从所有转化的大肠杆菌中都分泌hG-CSF融合蛋白。在表1中列出了从各转化的大肠杆菌分泌的hG-CSF融合蛋白的含量和分泌效率。
表1比较重组大肠杆菌中hG-CSF的生产和分泌
    宿主细胞 总蛋白中hG-CSF含量(％) hG-CSF分泌(％)
培养期     30℃     37℃   30℃   37℃
大肠杆菌BL21(DE3)     22.7     22.1   ＞98   ＞98
大肠杆菌HB101     13.5     12.8     81     75
大肠杆菌MC4100     22.1     20.8   ＞98   ＞98
大肠杆菌W3110     10.5     10.0     77     66
大肠杆菌XL1-Blue     9.4     8.8     56     51
为了检测分泌的hG-CSF蛋白是否已被正确加工，即是否正确地除去了信号序列，从凝胶中分离hG-CSF融合蛋白，确定其N末端氨基酸序列为N’-Ala-Gly-Pro-His-His-His-His-His-His-Ile-Glu-Gly-Arg-Thr-C’，该序列与hG-CSF融合蛋白的N末端部分推断的氨基酸序列一致，表明在两个温度条件下从大肠杆菌中成功地分泌了hG-CSF融合蛋白，所有转化体均有较高的分泌效率，而且在30℃的hG-CSF蛋白含量比在37℃的高。转化的5个大肠杆菌菌株中，BL21(DE3)和MC4100的产率最高。因此，将用重组质粒pTHKCSFmII转化的大肠杆菌MC4100命名为大肠杆菌MC4100/pTHKCSFmII，于2000年3月13日该菌株已保藏在附属于韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，该保藏机构是国际保藏机构，该菌株的保藏号为KCTC 0754BP。
在经内膜分泌到周质的过程中对在转化的大肠杆菌MC4100/pTHKCSFmII中表达的hG-CSF融合多肽进行了加工以除去木聚糖内切酶分泌序列，导致分泌寡肽/hG-CSF融合蛋白。由于融合蛋白N末端部分的6个组氨酸残基，用镍柱很容易分离hG-CSF融合蛋白，Xa因子可识别所述融合蛋白中寡肽的C末端，因此，可切割掉所述寡肽以得到完整的hG-CSF蛋白。
以上清楚地表明本发明提供了生产和分泌人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)的大肠杆菌、用于其的质粒载体，以高纯度从所述微生物所分泌的蛋白库中生产完整hG-CSF蛋白的方法。根据本发明，通过促进大量hG-CSF融合蛋白分泌到周质中的相当简单的方法可以高纯度制备hG-CSF蛋白，所述方法不需要复杂的加工过程例如对于通过常规技术分离胞质中产生的作为不溶性包函体的hG-CSF蛋白所需的溶解和随后再折叠，因此，在开发用于抗癌治疗的补充药物的过程中可用hG-CSF广泛地作为活性成分。
应理解上述描述仅仅是优选实施方案的说明，它不是为了将本发明的范围限制到所列的具体形式，但相反，是用来覆盖由所附权利要求定义的本发明精神和范围内的所述改变、修饰和等同物。有关保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则13bis)
A.下列标注是关于本说明书第7页第18-25行中所指的已保藏的微生物或其它生物材料
  B.保藏物的识别    另外的保藏物在另外的纸页上标明□
    保藏单位的名称韩国典型培养物保藏中心(KCTC)
    保藏单位的地位(包括邮编和国别)韩国生物科学和生物技术研究院(KRIBB)#52，Oun-dong，儒城区大田广域市305-333，韩国
    保藏日                             保藏编号2000年3月13日                          KCTC 0754BP
    C.其它说明(如不适用，则为空白)    此项信息接续在另附的纸页上□
    D.所做说明针对的指定国(如果所做的说明并不是针对所有指定国的话)
    E.说明的另外附送(如不适用，则为空白)
    下列说明将随后提交给国际局(请具体指出所述说明的一般性质，例如，“保藏编号”)
    仅供受理局使用
    □此页随国际申请一同收到
    签字官员：
    仅供国际局使用
    □此页由国际局于  日收到
    签字官员：
  PCT/RO/134(1998年7月)

Claims (10)

1.重组质粒载体，包括：
卡那霉素抗性基因；
启动子；
木聚糖内切酶信号序列；
编码由含6个连续组氨酸残基的13个氨基酸组成的寡肽的核苷酸序列；和
人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)基因。
2.权利要求1的重组质粒载体，其中所述寡肽在C末端含有氨基酸序列异亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸(Ile-Glu-Gly-Arg)。
3.图13所示的重组质粒载体pTHKCSFmII，包括：
卡那霉素抗性基因；
Trc启动子；
衍生自芽孢杆菌属菌种的木聚糖内切酶信号序列；
编码SEQ ID NO：1所示的寡肽的核苷酸序列；和
编码人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)的经修饰的基因，该基因在N末端含有SEQ ID NO：26的核苷酸序列。
4.一种大肠杆菌微生物，其是用权利要求3的质粒载体pTHKCSFmII转化了的。
5.权利要求4的微生物，其中所述大肠杆菌选自大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌MC4100、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌HB101和大肠杆菌W3110。
6.大肠杆菌MC4100/pTHKCSFmII(KCTC 0754BP)，其是用权利要求3的质粒载体pTHKCSFmII转化了的。
7.制备人粒细胞集落刺激因子的方法，该方法包括下列步骤：
培养用权利要求1的质粒载体转化的大肠杆菌以得到人粒细胞集落刺激因子融合蛋白；和
用蛋白酶处理人粒细胞集落刺激因子融合蛋白以得到人粒细胞集落刺激因子。
8.权利要求7的制备人粒细胞集落刺激因子的方法，其中所述权利要求1的质粒载体是pTHKCSFmII。
9.权利要求7的制备人粒细胞集落刺激因子的方法，其中用Ni-柱从培养物中得到所述人粒细胞集落刺激因子融合蛋白。
10.权利要求7的制备人粒细胞集落刺激因子的方法，其中所述蛋白酶是Xa因子。
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