KR20030062854A

KR20030062854A - 분비형 벡터를 이용한 효모에서의 재조합 단백질의 제조방법

Info

Publication number: KR20030062854A
Application number: KR1020020003289A
Authority: KR
Inventors: 이승원; 이강문; 김형철; 문대봉; 정철호; 이영필; 이승주
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 2002-01-21
Filing date: 2002-01-21
Publication date: 2003-07-28
Also published as: WO2003060141A1; AU2003202817A1

Abstract

본 발명은 효모를 이용한 분비성 단백질의 생산방법 및 이에 사용되는 벡터 그리고 이러한 벡터를 포함하는 효모에 관한 것으로, 분비 발현을 촉진하는 신규한 복합분비신호를 갖는 효모 분비 발현 벡터를 제공하고, 특히 효모의 번역효율을 증가시키는 효모선호코돈을 이용한 인간 과립구-군체 자극인자(granulocyte-colony stimulating factor. 이하 G-CSF라 칭한다) 단백질의 신규한 유전자 서열을 제공하여 천연형 G-CSF를 포함하는 다양한 분비성 단백질의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

분비형 벡터를 이용한 효모에서의 재조합 단백질의 제조방법{Manufacturing method of recombinant protein in yeast by the use of secretory type vector}

특히 본 발명은 신규한 효모 분비형 발현 벡터를 이용하여 천연 효모로부터 천연형 인간 G-CSF 단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 효모에서 단백질 합성(translation)을 증진시키는 신규한 G-CSF 유전자 염기서열과, 효모에서 분비형 발현을 증진 시키는 신규한 복합분비신호(complex secretory signal)와, 분비된 G-CSF의 아미노 말단에 도입된 외래 아미노산의 제거방법에 관한 것이다.

G-CSF는 골수세포 분화증식을 촉진하는 군체자극인자 중 호중구 과립구의 생장 및 분화에 관여하는 것으로 알려져 있으며(Nicola 등, J. Biol. Chem. 252, 9017(1983)), 사람의 방광암 세포에서 G-CSF가 정제되었고(Welte 등, Proc. Natl. Sci., 82, 1526(1985)), 이후 cDNA의 천연형 유전자 염기서열이 밝혀졌다(Shigekazu 등, Nature, 319, 415(1986); Souza 등, Science, 232, 61(1986)).

G-CSF의 천연 형태는 분지량 19,600달톤(Da) 크기의 당단백질로 호중구 과립구와 결합하여 작용함으로써, 단기간 내에 호중구 과립구 분열을 촉진시키므로 항암 치료 화학요법 후 파괴된 면역계 세포의 복구에 사용할 수 있고, 골수이식, 심한 화상 및 백혈병 치료등에 사용되는 단백질 치료제로서 그 유용성이 있다.

기존의 G-CSF의 상업적 생산 방법은 대장균을 이용하는 미국 암젠(Amgen)사의 방법(미합중국 특허 제4,810,643호)과 중국 햄스터 난소유래(Chinese Hamster Ovary, CHO, 이하 'CHO'라 칭한다)동물세포를 이용하는 일본 쥬우가이(中外)사의 방법이 있었다(유럽 특허출원 공개번호 제0,215,126A1호).

대장균을 이용할 경우의 장점은 비당화 단백질 형태로 높은 발현량을 확보할 수 있다는 장점이 있으나, 아미노 말단에 천연형 단백질에는 없는 메티오닌(methionine)이 첨가된다는 점과 대장균 유래의 발열(endotoxin)물질 제거와 단백질 재구성(refolding)에 따른 정제공정이 복잡하다는 단점이 있었다.

CHO동물세포를 이용할 경우에는 천연형 G-CSF에 가까운 형태의 당화 단백질로 생산할 수 있다는 장점이 있으나, 생산비용이 매우 높으며 동물 유래 바이러스 또는 프라이온(prion)의 유입 위험을 감수해야 한다는 단점이 있었다.

G-CSF의 경우 당화 양상은 생물학적 역가에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 알려져 있는바, 상기 암젠사의 G-CSF의 비생리활성도는 약 100만IU/㎎이며, 쥬우가이사의 G-CSF의 비생리활성도는 약 128만IU/㎎이다. 따라서 상업적으로 대량생산하기 위해서는 생산비용이 저렴한 미생물의 응용이 유리하다.

그러나, 대장균을 이용한 방법은 상기에서 본 바와 같이 그 생산공정에 있어서, 후처리공정이 복잡하고 오염의 위험이 있었기 때문에 이를 해결하고자 하는 요구가 증대되고 있었다.

이에 본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하여, 대장균과 동물세포를 이용하지 않으며, 분비성 단백질의 N-말단에 불필요한 아미노산이 존재하지 않고, 분비 발현양이 증가되며, 발열물질(endotoxin) 또는 동물 유래의 외래 병원체의 오염 부담을 최소화하고, 정제공정이 단순한 비당화 천연형 외래 분비성 단백질들의 효모 분비 생산방법 및 효모 발현용 벡터를 제공하는 데 목적이 있다.

도 1은 효모에서의 발현이 최적화 되도록 염기서열이 고안되고 PCR(Polymerase Chain Reaction, 이하 'PCR'이라 칭한다)에 의해서 합성된 천연형 인간 G-CSF를 코딩하는 신규한 유전자 염기서열을 나타낸 도면이다.

도 2는 효모에서의 단백질 분비를 유도하기 위해 고안되고, PCR에 의해서 합성된 염기서열에 의해서 발현되는 신규 복합분비신호의 단백질서열을 나타낸 도면이다.

도 3은 pLES5 ADH2/GAPDH hG-CSF벡터의 구조를 나타낸 지도이다.

도 4는 각각 다른 복합분비신호를 가지는 pLES5 ADH2/GAPDH hG-CSF벡터로 형질 전환된 효모에서의 재조합 인간 G-CSF의 분비 발현을 SDS-PAGE를 통해 분석한 실험결과를 나타낸 사진이다.

도 5는 각각 다른 복합분비신호를 가지는 pLES5 ADH2/GAPDH hG-CSF벡터로 형질 전환된 효모에서 분비 발현된 G-CSF의 아미노 말단 서열 분석결과를 나타낸 도면이다.

도 6은 pLES5 ADH2/GAPDH hG-CSF벡터로 형질 전환된 효모에서 분비 발현된G-CSF의 말디-토프 매스 스펙트로포토미터 분석결과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 pLES5 ADH2/GAPDH hG-CSF벡터로 형질 전환된 효모에서 분비 발현된 G-CSF의 총질량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 pLES5 ADH2/GAPDH hG-CSF벡터로 형질 전환된 효모에서 분비 발현된 G-CSF의 당사슬 분석결과를 나타낸 사진이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효모에서 최적화된 분비 발현을 가능하게 하는 신규한 복합분비신호(complex secretory signal), 이를 포함하는 효모발현용 벡터, 효모선호코돈으로 치환된 단백질 유전자 서열, 이들을 포함하는 효모세포, 그리고 이들을 이용한 분비성 제조합 단백질의 생산방법을 제공한다.

이 때 사용된 효모선호코돈은 효모세포에서 각 아미노산을 코딩하는 tRNA에서 그 빈도가 가장 많은 상위 두 개의 코돈에서 채택하였다(The Molecular Biology of the Yeast saccharomyces, Metabolism and Gene Expression, p.490, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

보다 구체적으로 본 발명은 (1) hG-CSF 단백질의 생산방법에 있어서, hG-CSF 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 효모 발현용 벡터로 형질전환된 효모를 이용하여 생산하는 것을 특징으로 하는 hG-CSF 단백질의 생산방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (2) 상기 효모 발현용 벡터는 분비발현을 증가시키는 복합분비신호(complex secretory signal)서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (3) 상기 (2)에 있어서, 상기 효모 발현용 벡터가 단백질발현이 최적화 되도록 단백질 서열의 변화없이 효모선호코돈을 이용하여 염기서열을 치환하는 것을 특징으로 하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (4) 상기 (3)에 있어서, 상기 hG-CSF는 효모선호코돈으로 치환된 SEQ ID NO: 46의 염기서열을 가지는 합성 G-CSF 유전자에 의하여 발현됨을 특징으로 하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (5) 상기 (1)에 있어서, 상기 효모 발현용 벡터가 분비성 재조합 단백질의 분비 발현을 증가시키는 ADH2/GAPDH 혼합 프로모터,GAP 종료 서열,마커 유전자, URA3 유전자, 2μ ori 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (6) 상기 (2)에 있어서, 상기 복합분비신호가 SEQ ID NO: 7의 아미노산서열을 암호화하는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (7) 상기 (2)에 있어서, 상기 복합분비신호와 hG-CSF 단백질 사이의 연결 펩티드 서열은 Lys-Arg, Lys-Lys, Arg-Lys 또는 Arg-Arg 가운데 선택되어지는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (8) 상기 (7)에 있어서, 상기 복합분비신호의 C-말단과 연결되는 hG-CSF 단백질 서열의 N-말단 사이에 Glu, Ala로 이루어진 두개의 펩티드가 6번 이하로 반복되도록 구성되어지는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (9) 상기 (7)에 있어서, 복합분비신호의 C-말단과 연결되는 hG-CSF 단백질 서열의 N-말단 사이에 천연형 효모 α-인자(factor)(SEQ ID NO: 45)가 위치하도록 이를 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (10) 효모선호코돈으로 치환된 서열(SEQ ID NO:46)을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 G-CSF 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 (11) 상기 (2)의 상기 효모 발현용 벡터가 분비성 재조합 단백질의 분비 발현을 증가시키는 ADH2/GAPDH 혼합 프로모터, 복합분비신호, GAP 종료 서열, 마커 유전자, URA3 유전자, 2μ ori 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 효모 발현용 벡터(pLES 5)를 제공한다.

또한 본 발명은 (12) 상기 (11)에 있어서, 상기 복합분비신호는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 상기 효모 발현용 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 (13) 상기 (11)에 있어서, 상기 복합분비신호와 hG-CSF 단백질 사이의 연결 펩티드 서열은 Lys-Arg, Lys-Lys, Arg-Lys 또는 Arg-Arg 가운데 선택되어지는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 효모 발현용 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 (14) 상기 (11)에 있어서, 복합분비신호의 C-말단과 연결되는 hG-CSF 단백질 서열의 N-말단 사이에 Glu, Ala로 이루어진 두개의 펩티드가 6번 이하로 반복되도록 구성되어지는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 효모 발현용 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 (15) 상기 (11)에 있어서, 복합분비신호의 C-말단과 연결되는 hG-CSF 단백질 서열의 N-말단 사이에 천연형 효모 α-인자(factor)(SEQ ID NO: 45)가 위치하도록 이를 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 효모 발현용 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 (16) 상기 (11) 내지 (14)중 어느 하나에 있어서, 상기 효모 발현용 벡터가 SEQ ID NO: 46의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 hG-CSF발현용 벡터(pLES5 ADH2/GAPDH-hG-CSF)를 제공한다.

또한 본 발명은 (17) 상기 (16)의 상기 hG-CSF 발현용 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-hG-CSF가 inu-α-proL-KR(EA)3-GCSF를 포함하는 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-G01인 것을 특징으로 하는 형질전환된 효모 세포(KCTC 10110BP)를 제공한다.

또한 본 발명은 (18) 상기 (16)의 상기 hG-CSF 발현용 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-hG-CSF가 inu-α-proL-KR-GCSF를 포함하는 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-G14인 것을 특징으로 하는 형질전환된 효모 세포(KCTC 10111BP)를 제공한다.

또한 본 발명은 (19) 상기 (16)의 hG-CSF 발현용 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-hG-CSF가 inu-α-proL-KR(EA)3-(α-인자(factor))-KR-GCSF를 포함하는 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-G25인 것을 특징으로 하는 형질전환된 효모 세포(KCTC 10112BP)를 제공한다.

또한 본 발명은 (20) 상기 (16)의 상기 hG-CSF 발현용 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-hG-CSF가 α-leader-KR-GCSF를 포함하는 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-G33인 것을 특징으로 하는 형질전환된 효모 세포(KCTC 10113BP)를 제공한다.

또한 본 발명은 (21) 상기 (17)의 효모세포를 이용하고, 추가로 아미노펩티데이즈를 처리하여 N 말단을 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법을 제공한다.

하기 실시예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

<실시예 1> 복합분비신호(complex secretory signal) 유전자의 제조

복합분비신호 유전자는 하기 표 1에 기재된 것과 같은 PCR 반응을 수행하여 얻어졌다.

	PCR 명칭	프라이머(primer)	템플레이트(template)
inu-α-proL	IA1	inu1/inu2	없음
	IA2	αLpro5'/αLpro3'	GMCSF/pYLBC 또는α-IFN/pYLBC
	IA3	inu3/αLpro3'	IA2
	IA4	inu4/αLpro3'	IA1/IA3
inu1: 5'-atgaagttcgcttactctttgttgttgcca-3'(SEQ ID NO: 1)inu2: 5'-gaagcagaaacaccagccaatggcaacaac-3'(SEQ ID NO: 2)inu3: 5'-tttctgcttctgttattaactacaagaga-3'(SEQ ID NO: 3)inu4(KpnI): 5'-aaaggtaccatgaagttcgcttactctttg-3'(SEQ ID NO: 4)αLpro5': 5'-attaactacaagagagctccagtcaacact-3'(SEQ ID NO: 5)αLpro3'KR(EA)3 reverse: 5'-agcttcagcttcagcttctctcttatctaaaga-3'(SEQ ID NO: 6)

α-IFN/pYLBC라 명명한 벡터는 자연상태의 α-인자(factor) 리더(leader) 아미노산 서열을 가지고 있으며 이를 주형으로 αLpro5'와 αLpro3'프라이머(primer)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때 생성된 DNA는 자연상태의 α-인자 리더 단백질에서 N-말단 19개의 아미노산이 제거된 총 66개의 아미노산을 코딩(coding)하는 염기서열을 가지게 되었다.

GMCSF/pYLBC라 명명한 벡터는 자연상태의 α-인자 리더 아미노산 서열에서 42번째 세린(Serine)이 류신(Leucine)으로 치환된 형태이며 이를 주형으로 αLpro5'와 αLpro3' 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때 생성된 DNA는 자연상태의 α-인자 리더 단백질에서 N-말단 19개의 아미노산이 제거된 총 66개의 아미노산을 코딩하는 염기서열을 가지게 되었다.

상기에서 얻어진 IA4유전자는 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus)의 이눌리네이즈(inulinase) 1A 시그날 단백질을 코딩하는 염기서열과 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 α-인자(factor) 리더(leader) 시그날의 일부분(이하 'pro-α리더'라 칭한다)을 코딩하는 염기서열을 포함하고 있으며, 이눌리네이즈 1A 단백질과 pro-α리더 단백질은 라이신(Lysine)-아르기닌(Arginine)의 두 아미노산으로 연결되도록 구성되어 있다.

상기 방법으로 만들어진 상기 복합분비신호의 단백질 서열은 다음과 같다.

Met-Lys-Phe-Ala-Tyr-Ser-Leu-Leu-Leu-Pro-Leu-Ala-Gly-Val-Ser-Ala-Ser-Val-Ile-Asn-Tyr-Lys-Arg-Ala-Pro-Val-Asn-Thr-Thr-Thr-Glu-Asp-Glu-Thr-Als-Gln-Ile-Pro-Ala-Glu-Ala-Val-Ile-Gly-Tyr-Leu(또는Ser)-Asp-Leu-Glu-Gly-Asp-Phe-Asp-Val-Ala-Val-Leu-Pro-Phe-Ser-Asn-Ser-Thr-Asn-Asn-Gly-Leu-Leu-Phe-Ile-Asn-Thr-Thr-Ile-Ala-Ser-Ile-Ala-Ala-Lys-Glu-Glu-Gly-Val-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg(SEQ ID NO: 7)

<실시예 2> 효모 분비형 발현 벡터의 제조

본 발명에서 사용된 벡터(이하 'pLES 5'라 칭한다)는 다음과 같은 방법으로 제조되었다.

상업용 효모 발현 벡터인 pYES 2(미합중국 소재 인비트로젠(Invitrogen)사 제품, 카탈로그 번호 V825-20)를 주형으로 하여 암피실린-콜E1(Ampicillin-ColE1)부위를 프라이머 세트1(primer set 1)을 이용하여 증폭하고, URA3 선택표지(selection marker)-2μ 오리진(origin)유전자 부위를 프라이머세트2(primer set 2)를 이용하여 증폭하고, 멀티클로닝 사이트(Multicloning site)를 포함하는 f1 오리진(origin)에서 터미네이터(terminator)까지의 부위를 프라이머 세트3(primer set 3)를 이용하여 증폭한 후, 각각의 증폭된 DNA단편을Sal1과SacII,SacII와BglII 그리고BglII 와SalI 제한 효소로 처리한 후 3개의 DNA단편을 라이게이즈(ligase)를 이용하여 일시에 접합시켜서 pYES 3라고 명명한 효모 발현 벡터로 재구성 하였다.

pYES 3는 pYES 2와 비교하여 대장균(E.coli) 선택표지(selection marker) 유전자, 효모 선택(selection)유전자, 프로모터(promoter), 그리고 터미네이터(terminator)등이 다른 것으로, 사용자의 편의에 따라 다른 종류로 손쉽게 치환할 수 있다는 점에서 그 우수성을 가진다.

ADH2/GAP 프로모터와 GAP 터미네이터는 대한민국 특허 제0154965호에 따른 G-CSF 발현 벡터를 주형으로 하여 각각 프라이머 세트(primer set) 4와 5를 이용하여 프로모터 부위와 터미네이터 부위를 증폭한 후 각각의 DNA단편을BglII 와HindIII 그리고XbaI 과SalI 제한효소로 처리한 후BglII 와SalI 으로 pYES 3을 처리하여 얻어진 4.5kb와 함꼐 라이게이션(ligation)하였다. 이렇게 만들어진 기능적인 효모발현 벡터를 pLES 5라고 명명하였다.

본 실시예 2에서 사용된 프라이머 세트(primer set)의 염기 서열은 다음의 표 2와 같다.

프라이머 세트 1(Primer set 1)
Forward	5'-tatatgagttattacccgcggaaaaaggaagagtat-3'(SEQ ID NO: 8)
Reverse	5'-cgaaggctttaatttgtcgacctgcattaatgaatc-3'(SEQ ID NO: 9)
프라이머 세트 2(Primer set 2)
Forward	5'-tatcaaccggggtggagatctccattgcgaataccg-3'(SEQ ID NO: 10)
Reverse	5'-atactcttcctttttccgcgggtaataactgatata-3'(SEQ ID NO: 11)
프라이머 세트 3(Primer set 3)
Forward	5'-gattcattaatgcaggtcgacaaattaaagccttcg-3'(SEQ ID NO: 12)
Reverse	5'-cggtattcgcaatggagatctccaccccggttgata-3'(SEQ ID NO: 13)
프라이머 세트 4(Primer set 4)
Forward	5'-aaaagatctttcaatatgcgcacatacgc-3'(SEQ ID NO: 14)
Reverse	5'-aaaaagcttggtgtttgtttatgtgtgtt-3'(SEQ ID NO: 15)
프라이머 세트 5(Primer set 5)
Forward	5'-aaatctagatcgacttggttgaacacgtt-3'(SEQ ID NO: 16)
Reverse	5'-aaagtcgactggtatggttttatcgtttt-3'(SEQ ID NO: 17)

<실시예 3> 인간 G-CSF 유전자의 제조

재조합 인간 G-CSF 유전자는 하기의 표 3에 기재된 것과 같은 PCR을 수행하여 얻었다. 이하 본 발명의 모든 PCR은 벤트(vent) DNA 중합효소(polymerase)(미합중국 소재, 뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolab)사 제품, 카탈로그 번호 제254L호)를 이용하여 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 45초에서 25번 반복하였다.

하기 표 3의 프라이머의 세트에 속하는 각각의 프라이머의 상보적인 서열은 밑줄로 표기하였다.

PCR 명칭	프라이머(Primers)	템플레이트(Template)
A	Primer 1 and 2	없음
B	Primer 3 and 4	없음
C	Primer 5 and 6	없음
D	Primer 7 and 8	없음
E	Primer 9 and 10	없음
F	Primer 1 and 4	A and B
G	Primer 5 and 8	C and D
H	Primer 7 and 10	D and E
I	Primer 3 and 6	B and C
J	Primer 1 and 8	F and G
K	Primer 5 and 10	G and H
L	Primer 1 and 10	J and K

Primer 1: 5'-actccacttggtcctgcttcttccttaccacaatctttcctccttaaatgtttagaacaagttcgta-3'(SEQ ID NO: 18)

Primer 2: 3'-atcttgttcaagcattttaggtcccactgccacggcgagaggttctctttaatacacggtggatgtttaa-5'(SEQ ID NO: 19)

Primer 3: 5'-tgccacctacaaattatgtcaccctgaagagctcgttcttttaggtcactccctcggtatcccatgggcc-3'(SEQ ID NO: 20)

Primer 4: 3'-ccatagggtacccggggagaaagaaggacaggtagagtccgaaatgttgagcggccaacagaaagggtca-5'(SEQ ID NO: 21)

Primer 5: 5'-gttgtctttcccagttacactctggtctctttctttaccaaggtttactccaggctcttgaaggtatctc-3'(SEQ ID NO: 22)

Primer 6: 3'-agaacttccatagaggggactcaatccaggttgagagctatgggaggttgaactgcaacggctaaagcga-5'(SEQ ID NO: 23)

Primer 7: 5'-gttgccgatttcgctactaccatctggcagcaaatggaagagttaggtatggcccctgctctccagccaa-3'(SEQ ID NO: 24)

Primer 8: 3'-gacgagaggtcggttgagttccacggtacggacgaaaacggagacgaaaggtcgcagcacgaccaccaca-5'(SEQ ID NO: 25)

Primer 9: 5'-tcgtgctggtggtgttcttgttgcctcccacttacaatcttttctcgaagtttcctaccgtgttcttcgt-3'(SEQ ID NO: 26)

Primer 10: 3'-atggcacaagaagcagtgaatcgggtcggtattatc-5'(SEQ ID NO: 27)

<실시예 4> 효모 분비형 G-CSF 유전자의 제조

G-CSF의 효모 분비 발현에서, 상기 복합분비신호의 효과를 밝히기 위하여 다양한 종류의 분비신호 유전자와 G-CSF 유전자를 PCR방법을 이용하여 연결하였다.

	PCR 명칭	프라이머(Primers)	템플레이트(Template)
α-leader KR-GCSF	A1	rhGCSF12 / rhGCSF 14	hGCSF
	A2	GMCSF2-5'/ rhGCSF13	GMCSF/pYLBC
	A3	GMCSF2-5'/ rhGCSF14	A1 / A2
α-leader KR(EA)3 GCSF	B1	rhGCSF11 / rhGCSF 14	hGCSF
	B2	GMCSF2-5'/αLpro 3'	GMCSF/pYLBC
	B3	GMCSF2-5'/ rhGCSF 14	B1 /B2
inu-α-proL-KR(EA)3 GCSF	C	inu4 / rhGCSF 14	IA4 / B1
inu-α-proL-KR(EA)3KR-GCSF	D1	KREAKR5'/ rhGCSF 14	hGCSF
	D2	inu4 / KREAKR 3'	C
	D3	inu4 / rhGCSF 14	D1 /D2
inu-α-proL-(EA)3KR-GCSF	E1	EAKR5'/rhGCF 14	D3
	E2	inu4 / EAKR3'	C
	E3	inu4 / rhGCF 14	E1 / E2
inu-α-proL-KR-GCSF	F1	inu4 / α-leader3'	C
	F2	gcsf5'/ rhGCF 14	hGCSF
	F3	inu4 / αL-gcsf3'	F1
	F4	αL-gcsf5'/ rhGCF 14	F2
	F5	inu4 / rhGCF 14	F1 / F2
α-leader KR-GCSF	G1	αL-Kpn / α-leader3'	GMCSF/pYLBC
	G2	αL-Kpn / αL-gcsf3'	G1
	G3	αL-Kpn / rhG-CSF 14	G1 / F4
inu-α-proL-KR(EA)3-αFactor-KR- GCSF	H1	αfactor5'/ αfactor3'	없음
	H2	inu4 / αLpro 3'	C
	H3	gcsf5'/ rhG-CSF 14	hGCSF
	H4	inu4 / αfactor3'	H1 / H2
	H5	αfactor5'/ rhG-CSF 14	H1 / H3
	H6	inu4 / rhG-CSF 14	H4 / H5

rhG-CSF 11 : 5'-aagagagaagctgaagctgaagctactccacttggtcct-3'(SEQ ID NO: 28) KR(EA)3-GCSF-sense

rhG-CSF 12 : 5'-tctttagataagagaactccacctggtcct-3'(SEQ ID NO: 29) KR-GCSF-sense

rhG-CSF 13 : 5'-aggaccaggtggagttctcttatctaaaga-3'(SEQ ID NO: 30) KR-GCSF-reverse

rhG-CSF 14 : 5'-aaagaattcctattatggctgggctaagtg-3'(SEQ ID NO: 31) (EcoRI)hGCSF-reverse

αLpro3'KR(EA)3 reverse : 5'-agcttcagcttcagcttctctcttatctaaaga-3(SEQ IDNO: 32)

GMCSF2-5'(BamH I) : 5'-aaaggatccatgagatttccttcaatttttactgc-3'(SEQ ID NO: 33)

KREAKR5': 5'-gaagctgaagctaaacgtactccacttggtcct-3'(SEQ ID NO: 34)

KREAKR3': 5'-agtacgtttagcttcagcttcagcttctctctt-3'(SEQ ID NO: 35)

EAKR5': 5'-ggggtatctctagatgaagctgaagctgaagctaaacgt-3'(SEQ ID NO: 36)

EAKR3': 5'-acgtttagcttcagcttcagcttcatctagagatacccc-3'(SEQ ID NO: 37)

α-leader3': 5'-atctagagataccccttcttctttagcagc-3'(SEQ ID NO: 38)

gcsf5': 5'-actccacttggtcctgcttcttccttacca-3'(SEQ ID NO: 39)

αL-gcsf3': 5'-agaagcaggaccaagtggagttctcttatctagagatacccc-3'(SEQ ID NO: 40)

αL-gcsf5': 5'-ggggtatctctagataagagaactccacttggtcctgcttct-3'(SEQ ID NO: 41)

αL-Kpn (Kpn I) : 5'-aaaggtaccatgagatttccttcaatttttactgct-3'(SEQ ID NO: 42)

αfactor5': 5'-aagagagaagctgaagctgaagcttggcactggttgcaattgaagccaggtcaaccaatg-3'(SEQ ID NO: 43)

αfactor3':

5'-agcaggaccaagtggagttctcttgtacattggttgacctggcttcaattgcaacca-3'(SEQ IDNO: 44)

상기 방법에 의해서 만들어진 분비신호와 G-CSF 유전자의 연결 형태는 α-리더(leader) KR(EA)3 GCSF의 경우 자연상태의 α-인자(factor) 리더(leader)(총 85개의 단백질을 코딩(coding)하며 42 번째 아미노산이 세린(Ser) 또는 류신(Leu)으로 이루어져 있다)에 Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala 연결 단백질을 통해 G-CSF가 연결되어있으며, inu-α-proL-KR(EA)3GCSF의 경우 복합분비신호에 Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala 연결 단백질을 통해 G-CSF가 연결되어 있다.

또한 inu-α-proL-KR(EA)3KR-GCSF 의 경우 복합분비신호에 Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys-Arg 연결 단백질을 통해 G-CSF가 연결되어 있으며, inu-α-proL-(EA)3KR-GCSF의 경우 복합분비신호에서 카르복시 말단의 Lys-Arg (아미노산 84번 85번)이 제거되고 Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys-Arg 연결 단백질을 통해 G-CSF가 연결되어 있으며, inu-α-proL-KR-GCSF의 경우 복합분비신호가 직접 G-CSF에 연결되어 있으며, inu-α-proL-KR(EA)3-(α-인자(Factor))-KR-G-CSF의 경우 복합분비신호 단백질에 Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys-Arg-(α-인자(factor))-Lys-Arg 의 연결 단백질을 통해 G-CSF가 연결되어 있는 형태이다.

이때 사용된 α-인자(factor) 코딩 유전자는 자연상태의 사카로마이세스 세에비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 α인자(factor) 단백질을 발현하는 염기서열을 가지며, α-인자(factor)의 단백질 서열은 다음과 같다

Trp-His-Trp-Leu-Gln-Leu-Lys-Pro-Gly-Gln-Pro-Met-Tyr(SEQ ID NO: 45)

<실시예 5> G-CSF 분비 발현 벡터의 완성

상기 실시예 4에서 열거한 효모 분비형 G-CSF 유전자들을 pLES 5에 적절한 제한효소(KpnI과EcoR I 또는BamH I과EcoR I)와 라이게이즈(ligase)를 이용하여 G-CSF 분비 발현 벡터의 구성을 완성하였다(도 3).

<실시예 6> G-CSF의 효모 분비 발현

상기의 G-CSF 발현 벡터들은 각각 효모에 형질 전환되어 hG-CSF의 분비 발현이 유도 되었다. 형질 전환된 효모는 30℃에서 48시간 배양 후 원심분리 하여 제거하였고, 배양액 내의 G-CSF 발현은 SDS-PAGE를 통해서 분석하였다. 분석결과 다양한 종류의 복합분비신호를 가지는 발현 벡터에서 G-CSF가 과량 발현되었음을 알 수 있었다.

재조합 인간 G-CSF의 발현이 확인된 복합분비신호의 구조는 inu-α-proL-KR(EA)3-GCSF(이를 포함하는 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-G01을 포함하는 효모를 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10110BP로 기탁하였다), inu-α-proL-KR-GCSF(이를 포함하는 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-G14를 포함하는 효모를 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10111BP로 기탁하였다), α-leader-KR-GCSF(이를 포함하는 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-G33을 포함하는 효모를 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10113BP로 기탁하였다) 그리고 inu-α-proL-KR(EA)3-(α-인자(factor))-KR-GCSF(이를 포함하는 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-G25를 포함하는 효모를 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10112BP로 기탁하였다)들 이었다(도 4).

이들 중 inu-α-proL-KR-GCSF, α-leader-KR-GCSF 그리고 inu-α-proL-KR(EA)3-(α-factor)-KR-GCSF의 복합분비신호 구조를 가지는 G-CSF 발현 벡터는 자연상태의 분자량과 동일한 크기의 G-CSF를 생산하는 것으로 확인 되었으며, 아미노 말단 서열 분석 결과 천연형과 동일한 서열을 가지고 있는 것으로 확인되어 단백질 번역 후 리더 펩타이드의 제거가 성공적으로 이루어진 것을 알 수 있었다(도 5).

또한 자연상태의 분자량과 동일한 크기의 G-CSF를 성공적으로 생산하는 것으로 확인된 벡터 구조물 중 inu 서열이 첨가된 복합분비신호 구조를 가지는 inu-α-proL-KR-GCSF 와 inu-α-proL-KR(EA)3-(α-factor)-KR-GCSF가 inu 서열을 포함하지 않는 α-leader-KR-GCSF 보다 재조합 G-CSF의 발현 및 분비가 더욱 효과적인 것으로 확인되었다(도 4).

아울러 inu-α-proL-KR(EA)3-GCSF를 포함하는 벡터에서도 G-CSF의 발현 및 분비가 inu 서열을 포함하지 않는 구조물에 비해서 월등히 뛰어남을 알수 있었으며. 이들 벡터의 재조합 G-CSF 발현양은 리터당 30 내지 50mg에 이를 정도로 매우 발현양이 큰 것을 알 수 있었다.

재조합 인간 G-CSF의 발현이 확인된 복합분비신호 구조중 inu-α-proL-KR (EA)3-GCSF를 가지는 발현 벡터는 천연형의 G-CSF 보다 큰 크기의 단백질을 생산하는 것이 확인 되었다(도 4). 생산된 단백질의 N-말단 서열 분석 결과 천연형 G-CSF의 아미노 말단에 추가로 EAEAEA 아미노산 서열을 가지고 있는 것으로 확인 되었다(도 5).

N-말단에 추가된 6개의 아미노산들은 하기의 아미노펩티데이즈를 이용한 공정에 의해서 제거 될 수 있다.

<실시예 7> 아미노펩티데이즈를 이용한 외래 아미노 말단 아미노산의 제거

재조합 인간 G-CSF의 발현이 확인된 복합분비신호 구조중 inu-α-proL-KR (EA)3-GCSF를 가지는 발현 벡터로부터 생산된 G-CSF의 N-말단에 추가된 6개의 아미노산들을 제거하기 위해서 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)로부터 분리 정제된 아미노펩티데이즈를 이용하였다. 이 공정에 사용된 아미노펩티데이즈의 역가와 농도는 각각 1171 U/mg과 2.13mg/ml 이었다.

N-말단의 외래 펩티드의 제거는 배양액을 농축하고 pH 와 염 농도를 각각 pH 8.2와 50mM Tris가 되도록 한 후 100ml의 농축 배양액 당 2ml의 아미노펩티데이즈를 첨가하고 37℃에서 23시간 반응시킴으로써 이루어졌다. 반응이 완료된 후 반응용액은 100mM NaCl, 50mM Tris, pH 7.0 버퍼를 이용하여 37℃에서 23시간 동안 일차로 투석 되었으며, 다시 100mM NaCl, 50mM Tris, pH 8.5 버퍼를 이용하여 37℃에서 23시간 동안 이차로 투석 되었다.

아미노펩티데이즈를 이용한 N-말단의 제거공정을 거친 EAEAEA-G-CSF를 가지고 다시 N-말단 분석을 시행하였다. 분석 결과 아미노펩티데이즈는 N-말단쪽 여분의 6개 아미노산만을 제거하여 천연형의 인간 G-CSF를 생산하는 것으로 확인되었다. 천연형의 G-CSF를 이용한 기준 실험에서 아미노펩티데이즈는 천연형 G-CSF의 N-말단은 분해하지 않았다.

<실시예 8> 효모 분비형 인간 G-CSF의 동정 및 특성 분석

상기된 효모 분비형 재조합 인간 G-CSF의 동정을 위해서 배양 배지로 부터 분리 정제된 단백질을 트립신으로 완전 분해한 후 말디-토프 매스 스펙트로포토메터(MALDI-TOF mass spectrophotometer)분석을 통해서 피크의 형태를 분석하였다.분석결과를 NCBI의 트립신 분해 단백질 양태 데이터와 전산망을 통하여 비교 하여 인간의 G-CSF와 동일함을 확인하였다(도 6).

또한 질량 분석기를 통한 총질량의 측정을 통하여 본 발명의 효모 분비형 재조합 인간 G-CSF의 당사슬 포함 여부를 조사 하였다. 측정 결과 본 발명의 효모 분비형 재조합 인 G-CSF의 총질량은 18667.7로 당사슬이 포함되지 않은 인간 G-CSF의 이론적인 총질량과 정확하게 일치하였다(도 7).

본 특허의 효모 분비형 재조합 인간 G-CSF가 당사슬을 포함하지 않는다는 사실은 글리칸 디텍션 키트(Glycan Detection Kit, Roche사 제품, 카타로그번호 제1142372호)을 이용한 실험에서 재확인 되었다(도 8).

<실시예 9> 생체 외 분석을 통한 효모 분비형 인간 G-CSF의 역가측정

상기된 효모 분비형 재조합 인간 G-CSF의 역가가 인간의 프로미엘로사이틱 에이취엘-60(promyelocytic HL-60)세포를 이용한 생체외 분석법에 위해서 측정 되었다(biol. Pharm. Bull. 20(9) 943-947(1997)). 측정결과 상기 효모 분비형 재조합 인간 G-CSF의 역가는 8.85E+07 IU/mg 이상인 것으로 확인되어 종래의 방법에 의하여 만들어진 G-CSF에 비하여 월등히 우수하다는 것을 알 수 있었다.

이상에서 살펴 본 바와 같이 본 발명의 효모 분비형 인간 과립구-군체 자극인자 발현벡터 pLES 5 ADH2/GAPDH-hG-CSF로 형질전환된 효모 세포를 이용하여 발현된 분비형 재조합 인간 G-CSF 단백질은 천연형과 동일한 아미노산 서열을 가지며, 대장균 생산 단백질에 비하여 정제과정에서 발열물질의 오염 가능성이 희박하고,동물세포 생산시 문제가 되는 바이러스나 프라이온의 유입우려가 없을 뿐 아니라 의약품으로의 활용이 가능한 높은 역가를 가지므로 상업화에 적합하며 질병치료에 응용할 수 있으며, 또한 inu 서열을 포함하는 효모의 복합 분비 서열을 가지는 G-CSF 발현벡터가 기존의 효모 분비 서열만을 가지는 G-CSF 발현 벡터보다 발현 및 분비가 월등히 뛰어난 것으로 확인되어 G-CSF의 대량 생산이 용이하며 전체 생산 공정의 효율을 높이는데 크게 장점이 있는 분비성 재조합단백질의 생산방법, 이에 이용되는 효모 발현용 벡터 및 형질전환 효모세포를 제공하는 유용한 발명인 것이다.

Claims

hG-CSF 단백질의 생산방법에 있어서,

hG-CSF 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 효모 발현용 벡터로 형질전환된 효모를 이용하여 생산하는 것을 특징으로 하는 hG-CSF 단백질의 생산방법.
제 1항에 있어서,

상기 효모발현용벡터는 분비발현을 증가시키는 복합분비신호(complex secretory signal)서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법.
제 2항에 있어서,

상기 효모 발현용 벡터가 단백질발현이 최적화 되도록 단백질 서열의 변화없이 효모선호코돈을 이용하여 염기서열을 치환하는 것을 특징으로 하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법.
제 3항에 있어서,

상기 hG-CSF는 효모선호코돈으로 치환된 SEQ ID NO: 46의 염기서열을 가지는 합성 G-CSF 유전자에 의하여 발현됨을 특징으로 하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법.
제 1항에 있어서,

상기 효모 발현용 벡터가 분비성 재조합 단백질의 분비 발현을 증가시키는 ADH2/GAPDH 혼합 프로모터,GAP 종료 서열, 마커 유전자, URA3 유전자, 2μ ori 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법.
제 2항에 있어서,

상기 복합분비신호가 SEQ ID NO: 7의 아미노산서열을 암호화하는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법.
제 2항에 있어서,

상기 복합분비신호와 hG-CSF 단백질 사이의 연결 펩티드 서열은 Lys-Arg, Lys-Lys, Arg-Lys 또는 Arg-Arg 가운데 선택되어지는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법.
제 7항에 있어서,

상기 복합분비신호의 C-말단과 연결되는 hG-CSF 단백질 서열의 N-말단 사이에 Glu, Ala로 이루어진 두개의 펩티드가 6번 이하로 반복되도록 구성되어지는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법.
제 7항에 있어서,

복합분비신호의 C-말단과 연결되는 hG-CSF 단백질 서열의 N-말단 사이에 천연형 효모 α-인자(factor)(SEQ ID NO: 45)가 위치하도록 이를 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법.
효모선호코돈으로 치환된 서열(SEQ ID NO:46)을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 G-CSF 유전자.
제 2항의 상기 효모 발현용 벡터가 분비성 재조합 단백질의 분비 발현을 증가시키는 ADH2/GAPDH 혼합 프로모터, 복합분비신호, GAP 종료 서열, 마커 유전자, URA3 유전자, 2μ ori 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 효모 발현용 벡터(pLES 5).
제 11항에 있어서,

상기 복합분비신호는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 상기 효모 발현용 벡터.
제 11항에 있어서,

상기 복합분비신호와 hG-CSF 단백질 사이의 연결 펩티드 서열은 Lys-Arg, Lys-Lys, Arg-Lys 또는 Arg-Arg 가운데 선택되어지는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 효모 발현용 벡터.
제 11항에 있어서,

복합분비신호의 C-말단과 연결되는 hG-CSF 단백질 서열의 N-말단 사이에 Glu, Ala로 이루어진 두개의 펩티드가 6번 이하로 반복되도록 구성되어지는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 효모 발현용 벡터.
제 11항에 있어서,

복합분비신호의 C-말단과 연결되는 hG-CSF 단백질 서열의 N-말단 사이에 천연형 효모 α-인자(factor)(SEQ ID NO: 45)가 위치하도록 이를 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 효모 발현용 벡터.
제 11항 내지 14항중 어느 한 항에 있어서,

상기 효모 발현용 벡터가 SEQ ID NO: 46의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 hG-CSF 발현용 벡터(pLES5 ADH2/GAPDH-hG-CSF).
제 16항의 상기 hG-CSF 발현용 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-hG-CSF가 inu-α-proL-KR(EA)3-GCSF를 포함하는 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-G01인 것을 특징으로 하는 형질전환된 효모 세포(KCTC 10110BP).
제 16항의 상기 hG-CSF 발현용 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-hG-CSF가 inu-α-proL-KR-GCSF를 포함하는 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-G14인 것을 특징으로 하는 형질전환된 효모 세포(KCTC 10111BP).
제 16항의 hG-CSF 발현용 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-hG-CSF가 inu-α-proL-KR(EA)3-(α-인자(factor))-KR-GCSF를 포함하는 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-G25인 것을 특징으로 하는 형질전환된 효모 세포(KCTC 10112BP).
제 16항의 상기 hG-CSF 발현용 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-hG-CSF가 α-leader-KR-GCSF를 포함하는 벡터 pLES5 ADH2/GAPDH-G33인 것을 특징으로 하는 형질전환된 효모 세포(KCTC 10113BP).
제 17항 내지 제 20 항들 중 어느 한 항에 따른 효모세포를 이용하고, 추가로 아미노펩티데이즈를 처리하여 N 말단을 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로하는 상기 hG-CSF 단백질의 생산방법.