CN116769055A - 一种在哺乳表达系统中表达的融合蛋白及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种在哺乳表达系统中表达的融合蛋白及其制备方法，所述融合蛋白至少包括两种肽：第一种肽，具体为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或为与SEQ ID NO.1所示序列具有至少85％同源性且功能相同的氨基酸序列；第二种肽，具体为目标肽。第一种肽能够有效促进目标肽在哺乳表达系统中的表达，使得目标肽从不表达到表达或从低表达到高表达，为目标肽(尤其是小片段肽)在哺乳表达系统中的表达提供了一种新策略。

Description

一种在哺乳表达系统中表达的融合蛋白及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种在哺乳表达系统中表达的融合蛋白及其制备方法，所述融合蛋白包含一个能够促进外源蛋白高表达的多肽。
背景技术
蛋白需要经过转录、翻译、以及翻译后的加工和修饰并折叠成正确构象，才能成为有活性的功能蛋白，其中翻译后的修饰包括磷酸化、糖基化、二硫键的形成以及蛋白酶的加工等过程。原核以及低级的真核生物表达系统缺少复杂的翻译后修饰，或者修饰方式和天然蛋白的修饰方式不尽相同。哺乳表达系统制备重组蛋白正确折叠的概率更高，并且经过了翻译后修饰和加工更接近天然蛋白的结构从而具有功能活性。
哺乳表达系统被广泛应用于各种生物制品的研发中，比如单克隆抗体、细胞因子、干扰素、病毒抗原的稳定表达与纯化。目前市场上约70％的治疗性蛋白是由哺乳表达系统制备的。此外，在抗体药物的研发过程中，也需要大量的天然结构类似的哺乳表达系统表达的功能性重组蛋白。哺乳动物细胞生长慢、培养基成分复杂、细胞生长条件严格，重组蛋白表达水平低、产品纯度低、技术复杂等因素，使得哺乳表达系统制备重组蛋白成本高、周期长。虽然随着分子生物学、细胞生物学的发展，对增强重组蛋白的表达也进行了一系列的研究，包括载体设计(启动子、增强子、加尾信号、信号肽的选择)、细胞株改造、培养基优化、转染方式优化、补料方式优化等，但已知的哺乳表达系统生产的外源分泌目的蛋白常常不能达到所需程度，因此建立高效表达的哺乳表达系统是亟待解决的问题之一。
另外，对于具有特殊结构或氨基酸序列相对较短的多肽，往往难以表达或表达量低；而且，通过合成多肽的方式制备，其蛋白不具有正确的折叠或活性低，无法满足商业化使用需求。因此，增加一段促表达的肽，构建到哺乳表达系统中，增强融合蛋白表达量，是十分有必要的。但是，目前能够促进外源蛋白高表达的肽相对较少。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明旨在提供一种能够增强外源目的蛋白在哺乳表达系统中表达的多肽，并基于该多肽制备融合蛋白，所得融合蛋白具有表达量高、溶解性好、活性好等优点。
本发明的技术方案具体如下：
本发明第一方面提供了一种能够增强外源目的蛋白在哺乳表达系统中表达的多肽，该多肽的氨基酸序列为a1)或a2)：
a1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，具体为噬菌体MS2衣壳蛋白的2～130aa区间片段；
a2)与SEQ ID NO.1所示序列具有至少85％同源性且功能相同的氨基酸序列。该序列是在SEQ ID NO.1所示序列的基础上，进行一个或多个碱基的替换、缺失、改变或插入，或者在其N端或C端添加1至10个氨基酸残基，从而获得的氨基酸序列。
噬菌体MS2是由衣壳蛋白围绕单链RNA分子形成的二十面体病毒，衣壳蛋白自组装形成T＝3对称的病毒粒子，直径约26nm，由89个衣壳蛋白二聚体(178个衣壳蛋白质)组成。MS2蛋白外壳由130个氨基酸残基的外壳蛋白组成，其单体形式的分子量为13.8kDa。本发明首次发现该氨基酸序列与目的蛋白融合后，能够有效促进外源目的蛋白在哺乳表达系统中的表达，使得目的蛋白从不表达到表达，或从低纯度、低表达量到高纯度、高表达量。
基于上述多肽，本发明第二方面提供了一种在哺乳表达系统中具有高表达量的融合蛋白，该融合蛋白至少包括两种以下肽：
第一种肽，具体为本发明第一方面提供的多肽；
第二种肽，具体为目标肽。
在上述融合蛋白中，目标肽可以为全长目的蛋白，也可以为目的蛋白的活性片段或包含活性片段的截短序列，还可以为多次跨膜蛋白的胞外结构域片段。尤其是对于氨基酸序列相对较短的目标肽，不仅能够有效促进其在哺乳表达系统中的分泌表达，还能使其正确折叠，从而具有结构活性。数据表明，第二种肽(即目标肽)展示在颗粒表面，故该融合蛋白最大程度地确保了目标肽的活性。
优选地，在上述融合蛋白中，还包括连接肽；连接肽起到将第一种肽和第二种肽连接的作用，以便于两种肽各自具有足够的空间位点。如可采用GGGGS或更多的GGGGS重复作为连接肽，而且GGGGS的重复数需要根据实际情况确定。
优选地，在上述融合蛋白中，还包括标签；标签可用于辅助融合蛋白纯化、检测等，如在本发明一实施例中，选用了His标签。
在本发明的一个具体实施例中，提供了融合蛋白Hu-pSecTag2A-CD24-CP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；在该融合蛋白中，目标肽为CD24的活性片段(氨基酸序列具体如SEQ ID NO.3所示)，连接肽为GGGGS，标签为His标签。实施例数据表明，CD24活性片段在哺乳表达系统中不能表达，而融合蛋白Hu-pSecTag2A-CD24-CP在哺乳表达系统中能够表达，且具有结构活性。
CD24是一种低分子量高度糖基化的黏附分子，最初被认为是B细胞分化标记物，在淋巴细胞成熟、神经系统发育以及在器官组织新陈代谢中发挥关键作用。近年来的研究表明，其在肿瘤发生、发展过程中起关键作用，在多种肿瘤中高表达，且与患者的预后相关，但其作用机制仍然不清楚。而且，研究表明，应用抗CD24单克隆抗体去除、降低CD24表达可能是治疗表达CD24肿瘤的一种新方案。本发明提供的融合蛋白Hu-pSecTag2A-CD24-CP具有与CD24抗体特异性结合的活性，故可用于CD24蛋白的制备、纯化。
在本发明的另一实施例中，提供了融合蛋白Hu-pSecTag2A-CGRP-CP，且其氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；在该融合蛋白中，目标肽为CGRP(降钙素基因相关肽，Calcitonin gene related peptide)的活性片段(氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示)，连接肽为GGGGS，标签为His标签。实施例数据表明，CGRP活性片段在哺乳表达系统中不能表达，而融合蛋白Hu-pSecTag2A-CGRP-CP在哺乳表达系统中能够表达，且具有与CGRP抗体结合的活性。
CGRP是人类用分子生物学方法发现的第一个活性多肽，CGRP是神经组织中的主要产物，是在皮肤中表达最多的神经肽，α-CGRP主要存在于中枢及外周神经系统，包括脑干、高段颈髓、三叉神经节及背根神经节，而β-CGRP主要存在于肠道神经系统中。CGRP已被证明在偏头痛发病机制中起着相当大的作用，为发作性和慢性偏头痛的治疗选择提供了可期的前景。
在本发明的另一实施例中，提供了融合蛋白Hu-pSecTag2A-TSLP-CP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示的；在该融合蛋白中，目标肽为TSLP(胸腺基质淋巴细胞生成素)的部分片段，其氨基酸序列具体如SEQ ID NO.18所示，连接肽为GGGGS，标签为His标签。实施例数据表明，CGRP活性片段虽然能够在哺乳表达系统中表达，但产量低，融合蛋白Hu-pSecTag2A-TSLP-CP则显著提高了表达量和产物纯度，且仍保持了与CGRP抗体的结合活性。
TSLP是上皮细胞衍生的细胞因子，参与炎症性皮肤病的病理过程，并由上皮细胞广泛表达。人TSLP cDNA编码159个氨基酸(aa)残基的前体蛋白，信号序列为28aa。
本发明第三方面提供了在哺乳表达系统中表达上述融合蛋白的方法，具体为：将编码第一种肽的核苷酸序列与编码第二种肽的核苷酸序列串联，再将所得串联片段构建至表达载体中，转化至哺乳动物细胞中进行表达。
优选地，在上述方法中，编码第一种肽的核苷酸序列具体为b1)或b2)：
b1)如SEQ ID NO.2所示；
b2)与SEQ ID NO.2所示序列具有至少90％同源性的序列。
在上述方法中，可通过本领域常规方法，将编码融合蛋白的串联片段连接至表达载体中；且所用载体可以是本领域常规的各种表达载体，只要所得重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达相应的融合蛋白即可。所述哺乳动物细胞为本领域常规的哺乳动物表达用细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且编码融合蛋白的基因被有效表达即可。在本发明一实施例中，哺乳动物细胞具体为HEK293F细胞，表达载体为pSecTag2A载体。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明提供的来源于噬菌体MS2衣壳蛋白的多肽能够改善外源目的蛋白在哺乳表达系统中的分泌表达，尤其克服了氨基酸序列相对较短的多肽在哺乳表达系统中不表达或表达量低的缺点；而且，本发明提供的融合蛋白，可以将目标肽展示在颗粒表面，进而最大程度的确保了目标肽的活性，实施例数据表明本发明提供的融合蛋白具有和天然蛋白类似的结构，说明本发明同时解决了氨基酸序列相对较短的多肽在哺乳表达系统中不能正确折叠的问题。由此可见，本发明为目标肽(尤其是小片段肽)在哺乳表达系统中的表达提供了一种新策略。
附图说明
图1为实施例1中的PCR菌检结果；
图2为实施例1中的SDS-PAGE检测结果图；
图3为实施例1中的Western Blot检测结果图；
图4为实施例1中融合蛋白Hu-pSecTag2A-CD24-CP和对照蛋白MS2-pSecTag2A-CP与CD24抗体结合作用对比图；
图5为实施例2中的PCR菌检结果；
图6为实施例2中的SDS-PAGE检测结果图；
图7为实施例2中的Western Blot检测结果图；
图8为实施例2中融合蛋白Hu-pSecTag2A-CGRP-CP和对照蛋白MS2-pSecTag2A-CP与CGRP抗体结合作用对比图；
图9为实施例3中的PCR菌检结果；
图10为实施例3中的SDS-PAGE检测结果图；
图11为实施例3中的Western Blot检测结果图；
图12为实施例3中Hu-pSecTag2A-TSLP与TSLP抗体的结合作用图；
图13为实施例3中融合蛋白Hu-pSecTag2A-TSLP-CP和对照蛋白MS2-pSecTag2A-CP与TSLP抗体结合作用对比图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例及其附图进一步阐明本发明的内容。应当理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
以下实施例所涉及到的仪器和材料包括：紫外仪(WD-9403F，北京六一)，台式高速离心机(H1650-W，湘仪)，恒温水浴锅(DK-S22，上海精宏)，恒温培养箱(GNP-P270，上海精宏)，洁净工作台(SW-CJ-1FD，苏州安泰)，PCR扩增仪(DL9700，北京东林昌盛)，恒温摇床(TS-100C，上海天呈)，-80℃冰箱(DW-86L628，青岛海尔特种电器有限公司)；氨苄青霉素钠Amresco分装，A8180限制性内切酶HindIII、NotI购于Fermentas公司，甲醇、琼脂粉、氯化钠、咪唑购于国药集团化学试剂有限公司，TSLP重组单克隆抗体(Cusabio，CSB-RA025141A1HU)，CGRP重组单克隆抗体(Cusabio，CSB-RA343460MA1HU)，CD24重组单克隆抗体(Cusabio，CSB-RA004902A0HU)，His单克隆抗体(Cusabio，CSB-MA160277)。
实施例1
本例以CD24蛋白的活性片段为目标肽，以GGGGS为连接肽，并使用C*10His标签，制备融合蛋白。具体过程如下：
(1)密码子优化和目的片段的获得。
根据Uniport信息，确定第一种肽(记为MS2-CP)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(具体为噬菌体MS2衣壳蛋白的2-130aa区间，Uniport:P03612)，目标肽(记为Hu-CD24)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示(具体为CD24的27～59aa区间，Uniport:P25063)。
考虑到不同表达系统进行外源蛋白表达时对密码子的偏爱性不同，对编码MS2-CP、Hu-CD24以及连接肽的密码子进行哺乳表达系统优化。优化后，编码MS2-CP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码Hu-CD24的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优化后的基因片段由武汉金开瑞生物工程有限公司进行基因合成，并根据优化后的核苷酸序列设计引物，具体如下所示：
MS2-CP-F：AGGCGCGCCGTACGAAGCTTGGCCAGCAACTTCACCCAGTT，
MS2-CP-R：GGCCCTCCTCGAGCGGCCGCTTAATGGTGGTGGTGATGGTGATG；
Hu-CD24-F：AGGCGCGCCGTACGAAGCTTGAGCGAGACAACCACAGGCA，
Hu-CD24-R：GGCCCTCCTCGAGCGGCCGCTTATCCGGCGGCTTTTGTGGTGGC；
Hu-CD24-CP-F：AGGCGCGCCGTACGAAGCTTGGCCAGCAACTTCACCCAGTT，
Hu-CD24-CP-R：GGCCCTCCTCGAGCGGCCGCTTAATGGTGGTGGTGATGGTGATG。
以合成基因为模板，进行PCR反应。预变性后经过30个循环(94℃变性，52℃退火，72℃延伸)后以1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。MS2-CP、Hu-CD24、Hu-CD24-CP目的片段长度分别为417bp、129bp、531bp，选择目的片段的大小切胶回收。
(2)表达载体的构建。
将pSecTag2A载体酶切后，使用试剂盒回收。将步骤(1)制备的外源目的片段分别与载体pSecTag2A的酶切产物进行连接反应，冰上15min转化后得到MS2-pSecTag2A-CP重组载体、Hu-pSecTag2A-CD24重组载体和Hu-pSecTag2A-CD24-CP重组载体。
(3)转化和阳性克隆筛选。
从-80℃冰箱中取出3管Top10感受态细胞，分别加入重组载体MS2-pSecTag2A-CP、Hu-pSecTag2A-CD24、Hu-pSecTag2A-CD24-CP各自10μL，充分混匀后42℃热击90s。各加入800μL预热的LB培养基，置37℃摇床中158r/120min。6000r离心4min，弃上清，剩余菌液混匀，涂至含有氨苄抗生素的平板上。过夜后挑斑并通过PCR进行菌检。
菌检结果如图1(图中Marker从大到小依次为：5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp)所示：目的片段大小分别为417bp、129bp、531bp，片段大小与预期一致。
呈阳性结果的单克隆菌液委托武汉金开瑞生物工程有限公司测序，测序正确后，使用试剂盒提取质粒。测序显示质粒MS2-pSecTag2A-CP、Hu-pSecTag2A-CD24、Hu-pSecTag2A-CD24-CP的序列分别为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，对应编码的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11。
(4)蛋白的表达和纯化。
使用生长处于指数期、存活率大于98％的HEK293F转染，将细胞密度稀释成2×106个/mL，摇瓶置于5％的CO2恒温摇床中，37℃、120rpm恒温震荡培养10min后开始转染。准备两支15mL的无菌离心管，在其中一支中加入5mL质粒稀释缓冲和100μg无菌质粒DNA，轻轻吹打混匀；取另一支离心管，加入5mL转染试剂稀释缓冲和0.5mL转染试剂，轻轻吹打混匀；将含有转染试剂的离心管中所有液体转移至含质粒的离心管中，轻轻吹打混匀，室温下静置10min制备出质粒-载体复合物。从恒温摇床中取出细胞，边摇边加入制备好的质粒-载体复合物，放回CO2恒温摇床中震荡培养；转染24h后可加入2mL补料，以增加产物表达量。转染后第4天，收集细胞培养基，4℃，1000g离心15min，取上清使用镍离子亲和层析纯化，进行SDS-PAGE检测以及Western Blot检测(使用His标签单克隆抗体CSB-MA160277)。
SDS-PAGE检测结果如图2(图中Marker从上到下依次为116kD、66.2kD、45kD、35kD、25kD、18kD、14.4kD)所示，Western Blot检测结果如图3所示，从检测结果可计算各蛋白的分子量、产量和纯度，具体见表1：
表1
靶点 理论分子量 实际分子量 是否表达 产量 纯度
MS2-pSecTag2A-CP 15.1KDa 20KDa 表达 19mg/L 97％
Hu-pSecTag2A-CD24 4.5KDa - 不表达 0 -
Hu-pSecTag2A-CD24-CP 18.5Kda 40Kda 表达 5mg/L 89％
从上述结果可知，实际蛋白分子量偏大，这主要是由哺乳表达系统中的修饰作用引起的，而且Western Blot检测结果显示纯化得到的各蛋白与SDS-PAGE检测分子量相一致。
(5)ELISA检测蛋白活性。
将步骤(4)制备的融合蛋白Hu-pSecTag2A-CD24-CP以及对照蛋白(MS2-pSecTag2A-CP)分别使用CB缓冲稀释成2μg/ml后包板。包板时，设置空白对照组，阴性对照组，阳性对照组，18个实验组。其中，空白对照组直接加入不含蛋白的CB缓冲液，阴性对照组与18个实验组均包被蛋白(Hu-pSecTag2A-CD24-CP)以及对照蛋白，阳性对照组则包被CD24抗体(1mg/mL)。4℃包被过夜使用封闭液(4％脱脂奶粉)在37℃温箱孵育2h封闭。然后使用CD24抗体孵育后加入二抗检测，使用TMB显色15min后加入终止液终止实验。吸光度值读出后，在Graphpad软件里面进行数据分析，读取EC50数据，并绘制曲线图。
融合蛋白Hu-pSecTag2A-CD24-CP和对照蛋白MS2-pSecTag2A-CP的检测结果见表2～3和图4。
表2
表3
从检测结果可知：融合蛋白Hu-pSecTag2A-CD24-CP和CD24抗体具有较强的结合作用，但是对照蛋白和CD24抗体不具有结合阳性反应，说明融合蛋白中的目标肽具有和天然蛋白类似的折叠和修饰，即具有结构活性。
实施例2
与实施例1不同的是，本例以CGRP的活性片段为目标肽制备融合蛋白。具体过程如下：
(1)密码子优化和目的片段的制备。
根据Uniport信息，确定目标肽(记为Hu-CGRP)的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示(具体为CGRP的83～119aa区间，Uniport:P06881)。对其密码子进行优化，优化后编码Hu-CGRP的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。根据优化后的核苷酸序列设计以下引物：
Hu-CGRP-F：AGGCGCGCCGTACGAAGCTTGGCCTGTGATACCGCCACCTG，
Hu-CGRP-R：GGCCCTCCTCGAGCGGCCGCTTAATGGTGGTGGTGATGGTGATG；
Hu-CGRP-CP-F：AGGCGCGCCGTACGAAGCTTGGCCAGCAACTTCACCCAGTT，
Hu-CGRP-CP-R：GGCCCTCCTCGAGCGGCCGCTTAATGGTGGTGGTGATGGTGATG。
以合成基因为模板，进行PCR反应，反应与检测条件同实施例1。Hu-CGRP、Hu-CGRP-CP目的片段长度分别为141bp、543bp，选择目的片段的大小切胶回收。
(2)表达载体的具体构建过程参考实施例1，得到重组载体Hu-pSecTag2A-CGRP和重组载体Hu-pSecTag2A-CGRP-CP。
(3)转化和阳性克隆筛选，具体过程参考实施例1。
所得菌检结果如图5所示：目的片段大小分别为141bp、543bp，片段大小与预期一致。
测序显示质粒Hu-pSecTag2A-CGRP、Hu-pSecTag2A-CGRP-CP的序列分别为SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.15所示，对应编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示。
(4)蛋白的表达和纯化过程同实施例1。
SDS-PAGE检测结果如图6所示，Western Blot检测结果如图7所示，从检测结果计算蛋白的分子量、产量和纯度，所得结果见表4。
表4
靶点 理论分子量 实际分子量 是否表达 产量 纯度
Hu-pSecTag2A-CGRP 5.2KDa - 不表达 0 -
Hu-pSecTag2A-CGRP-CP 19.2Kda 32Kda 表达 9.8mg/L 95％
从上述结果可知，融合蛋白的实际分子量偏大，主要是由于哺乳表达系统中的修饰作用引起的，Western Blot检测结果与SDS-PAGE检测结果相一致。
(5)以MS2-pSecTag2A-CP为对照蛋白，ELISA检测融合蛋白Hu-pSecTag2A-CGRP-CP的活性，具体过程参考实施例1。检测结果见表5～6和图8。
表5
表6
从检测结果可知：融合蛋白Hu-pSecTag2A-CGRP-CP和CGRP抗体具有较强的结合作用，但是对照蛋白和CGRP抗体不具有结合阳性反应。
实施例3
与实施例1不同的是，本例以TSLP的部分片段为目标肽制备融合蛋白。具体过程如下：
(1)密码子优化和目的片段的制备。
根据Uniport信息，选择目标肽(记为Hu-TSLP)的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示(具体为TSLP的29～159aa区间，Uniport:Q969D9)。对其密码子进行优化，优化后编码Hu-TSLP的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。根据优化后的核苷酸序列设计引物，具体如下所示：
Hu-TSLP-F：AGGCGCGCCGTACGAAGCTTGTACGACTTCACCAACTGC，
Hu-TSLP-CP-R：GGCCCTCCTCGAGCGGCCGCTTAATGGTGGTGGTGATGGTGATG；
Hu-TSLP-CP-F：AGGCGCGCCGTACGAAGCTTGGCCAGCAACTTCACCCAGTT，
Hu-TSLP-CP-R：GGCCCTCCTCGAGCGGCCGCTTAATGGTGGTGGTGATGGTGATG。
以合成基因为模板，进行PCR反应，反应与检测条件同实施例1。Hu-TSLP、Hu-TSLP-CP目的片段长度分别为423bp、825bp，选择目的片段的大小切胶回收。
(2)表达载体的构建过程参考实施例1，得到重组载体Hu-pSecTag2A-TSLP和重组载体Hu-pSecTag2A-TSLP-CP。
(3)转化和阳性克隆筛选的具体过程参考实施例1。
所得菌检结果如图9所示：目的片段大小分别为423bp、825bp，片段大小与预期一致。
测序显示质粒Hu-pSecTag2A-TSLP、Hu-pSecTag2A-TSLP-CP的序列分别为SEQ IDNO.20和SEQ ID NO.21所示，对应编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示。
(4)蛋白表达和纯化的具体过程参考实施例1。
SDS-PAGE检测结果如图10所示，Western Blot检测结果如图11所示，从检测结果可计算蛋白的分子量、产量和纯度，具体结果见表7。
表7
靶点 理论分子量 实际分子量 是否表达 产量 纯度
Hu-pSecTag2A-TSLP 16.3KDa 24KDa 表达 3.2mg/L 85％
Hu-pSecTag2A-TSLP-CP 30.3Kda 45Kda 表达 28.2mg/L 98％
从上述结果可知，实际蛋白分子量偏大，这主要是由于哺乳表达系统的修饰作用引起的，Western Blot检测结果与SDS-PAGE检测结果相一致。相对于Hu-pSecTag2A-TSLP，融合蛋白Hu-pSecTag2A-TSLP-CP的产量和纯度都有极显著提升。
(5)以MS2-pSecTag2A-CP和Hu-pSecTag2A-TSLP为对照蛋白，ELISA检测融合蛋白Hu-pSecTag2A-TSLP-CP的活性。检测过程参考实施例1，检测结果见表8～10和图12～13。
表8
表9
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表10
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从检测结果可知：Hu-pSecTag2A-TSLP和融合蛋白Hu-pSecTag2A-TSLP-CP均具有与TSLP抗体的结合作用，而对照蛋白MS2-pSecTag2A-CP和TSLP抗体不具有结合阳性反应；不过Hu-pSecTag2A-TSLP的EC50为16.60to 22.40，融合蛋白Hu-pSecTag2A-TSLP-CP的EC50为4.908to 6.004。
综上所述，本发明提供的来源于噬菌体MS2衣壳蛋白的多肽实现了Hu-CD24、Hu-CGRP由不表达到高纯度的表达，以及Hu-TSLP蛋白的高产量、高纯度表达，且ELISA实验验证了由哺乳细胞表达系统制备的Hu-CD24、Hu-CGRP以及Hu-TSLP蛋白具有和天然蛋白类似的结构。由此可见，本发明为哺乳表达系统制备目标片段蛋白提供了一种新的方法。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种在哺乳表达系统中表达的融合蛋白，其特征在于，至少包括两种以下肽：
第一种肽，具体为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或为与SEQ ID NO.1所示序列具有至少85％同源性且功能相同的氨基酸序列；
第二种肽，具体为目标肽。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括连接肽。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括标签。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述目标肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述目标肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示。
6.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述目标肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.18所示。
7.如权利要求1所述的融合蛋白在哺乳表达系统中的制备方法，其特征在于，将编码第一种肽的核苷酸序列与编码第二种肽的核苷酸序列串联，再将所得串联片段构建至表达载体中，转化至哺乳动物细胞中进行表达。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，编码第一种肽的核苷酸序列具体为如SEQ ID NO.2所示，或为与SEQ ID NO.2所示序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为HEK293F细胞。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pSecTag2A。
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